Исследование структуры белков P-выступа большой субчастицы архейной рибосомы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Митрошин, Иван Владимирович

• Митрошин, Иван Владимирович
• кандидат наук
• 2015

Оглавление диссертации кандидат наук Митрошин, Иван Владимирович

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ Ы2/Р-ВЫСТУПА РИБОСОМЫ

1. Компоненты Ы2/Р-выступа рибосомы

1.1. Бактериальные белки L10, LI 1 и LI2

1.2. Белки эукариотического и архейного Р-выступа

2. Взаимозаменяемость бокового выступа бактерий, архей и эукариот

3. Кристаллографические исследования L12/P-BbicTyna в составе рибосом

Заключение

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

1. Материалы

1.1. Химические материалы

1.1.1. Реактивы и ферменты

1.1.2. Буферы

1.1.3. Питательные среды

1.2. Биологические материалы

1.2.1. Бактериальные штаммы

1.2.2. Плазмиды

1.3. Принадлежности

1.4. Приборы

2. Методы

2.1. Методы генной инженерии

2.1.1. Полимеразная цепная реакция

2.1.2. Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.1.3. Обработка фрагментов ДНК сайт-специфическими эндонуклеазами рестрикции

2.1.4. Очистка фрагментов ДНК

2.1.5. Лигирование фрагментов ДНК

2.1.6. Получение компетентных клеток Е. coli

2.1.7. Трансформация компетентных клеток Е. coli лигазной смесью («Бело-голубой тест»)

2.1.8. Анализ клонов клеток методом ПЦР

2.1.9. Трансформация компетентных клеток Е. coli плазмидной ДНК

2.1.10. Выделение плазмидной ДНК

2

2.1.11. Рестрикция и очистка плазмидной ДНК для транскрипции

2.1.12. Фенольная депротеинизация нуклеиновых кислот

2.1.13. Экспрессия рекомбинантных генов белков Г^аРОШТ, М|аЫ 1

2.1.14. Экспрессия гена белка М]аЫ 1 для получения селенометионинового производного белка

2.2. Биохимические методы при работе с белками

2.2.1. Выделение белков ГфРОШТ, М]аЫ 1 и Бе-Ме! М]аЫ 1

2.2.2. Хроматографическая очистка белка 1УЦаР0МТР

2.2.3. Хроматографическая очистка белка М^аЫ 1 и его селенометионинового производного

2.2.4. Электрофорез в ПААГ в денатурирующих условиях

2.2.5. Электрофорез в ПААГ в неденатурирующих условиях рН 4.5

2.3. Биохимические методы при работе с РНК

2.3.1. Получение специфических фрагментов рРНК

2.3.2. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях с мочевиной

2.3.3. Электрофорез белка, РНК, РНК-белковых комплексов в ПААГ в неденатурирующих условиях

2.3.4. Получение РНК-белковых комплексов

2.3.4.1. Образование комплексов М]аР0МТР с фрагментами 238 рРНК разной длины

2.3.4.2. Образование комплекса Т^аРОЫТР-Г^аЫ 1-238рРНК(74)

2.3.4.3. Образование комплекса МЗаРОТ^ТР-МЗаЫ 1-238рРНК(74)-тиострептон

2.4. Кристаллизация белка и РНК-белковых комплексов

2.5. Кристаллографичекие методы

2.5.1. Съемка и обработка дифракционных данных

2.5.2. Анализ содержания ячейки

2.5.3. Определение и уточнение структур

2.5.3.1. Переуточнение структуры Р0*(Р1ЪГШ)б из Р. ИопкояИИ

2.5.3.2. Определение и уточнение структуры М]аЫ 1

2.5.3.3. Определение и уточнение структуры М]аР0ЫТГ-238рРНК(74)

2.5.3.4. Определение и уточнение структуры М]аР0МТР-М)аЫ 1-238рРНК(74)

2.5.3.5. Определение и уточнение структуры 1УуаР0ЫТР-М]аЬ11-238рРНК(74)-тиострептон

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Кристаллизация и определение структур компонентов Р-выступа архейной рибосомы

3

1.1. Изолированный рибосомный белок Ы1 из археи М. ]аппа$ски

1.2. Фрагмент белка РО, РОЫТР, в комплексе со специфичным фрагментом 23в рРНК

1.3. Тройной комплекс МУаРОШТ-М]аЫ 1-238рРНК(74)

1.4. Комплекс М]аРОШТ-М]аЫ 1-238рРНК(74) с тиострептоном

1.5. Переуточнение структуры комплекса Р0*(Р1>ЛЮ)б из археи Р. койсоьки

2. Анализ структур компонентов архейного рибосомного Р-выступа

2.1. Структура изолированного рибосомного белка 1

2.2. Анализ структур комплексов муаР01ЧТР со специфичным фрагментом 23в рРНК в отсутствии и присутствии М]а1Л 1

2.3. Взаимодействие белков архейного рибосомного Р-выступа с 23Б рРНК

2.4. Взаимодействие архейного рибосомного Р-выступа с антибиотиком тиострептоном

2.5. Подвижность компонентов основания Р-выступа архейной рибосомы

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а. о. - аминокислотные остатки

БСА - бычий сывороточный альбумин

БФС - бромфеноловый синий

ДМЭ ПЭГ - диметиловый эфир полиэтиленгликоля

ДСН - додецилсульфат натрия

ДТТ - дитиотрейтол

ИПТГ - изопропил-р-О-тиогалактозид

н. о. - нуклеотидные остатки

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭГ - полиэтиленгликоль

ТЕМЕД - тетраметилэтилендиамин

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

ЭДТА — этилендиаминтетрауксусная кислота

СТАВ - цетилтриметиламмоний бромид

CTD - С-концевой домен

Есо - Escherichia coli

GDPCP - гуанозин-5'-(Р,у-метилен)-трифосфат

Hepes - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота

II та - Haloarcula marismortui

MPD - 2-метил-2,4-пентадиол

NTD - N-концевой домен

NTF - N-концевой фрагмент

Pipes - пиперазин-бис(2-этансульфоновая кислота) PMSF - фенилметилсульфонилфторид ТСЕР - трис(2-карбоксиэтил)фосфин Tina - Thermotoga maritima

X-gal - 5-бромо-4-хлоро-3-индоил-бета-Б-галактопиранозид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование структуры белков P-выступа большой субчастицы архейной рибосомы»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Рибосома - сложный макромолекулярный комплекс белков и рибонуклеиновых кислот, ответственный за биосинтез белка в клетках всех живых организмов. Начиная с середины прошлого века большое число работ было посвящено исследованию структуры рибосом и их компонентов, рибосомных белков и рибосомных РНК. Накопление знаний о структуре рибосом и развитие методической базы привело в начале двадцать первого века к прорыву в определении пространственных структур рибосом, сначала из прокариот, а затем и из эукариот. Эти достижения вносят огромный вклад в исследования механизма работы аппарата трансляции. Однако, несмотря на колоссальный прогресс в структурных исследованиях рибосом, имеются ещё «белые пятна» в их структуре. Это связано с высокой подвижностью некоторых участков рибосомы, что затрудняет определение структуры этих участков в составе рибосомы. В ряде случаев исследования структуры изолированных компонентов, входящих в состав подвижных рибосомных участков, вносят существенный вклад в дополнение и уточнение имеющихся моделей рибосом.

В 2000 году появилась первая структура 50S субчастицы архейной рибосомы с высоким разрешением, но Р-выступ в этой модели отсутствовал полностью. Затем были определены структуры малой субчастицы бактериальной рибосомы и целой бактериальной рибосомы. Определение структур бактериального рибосомного белка Ll 1 в комплексе с фрагментом 23S рРНК и комплекса бактериальных рибосомных белков L10-L12NTD позволило интерпретировать электронную плотность в районе Ы2-выступа в модели бактериальной рибосомы с фактором элонгации G, а также частично визуализировать основание Р-выступа большой субчастицы архейной рибосомы. Знание структур двухдоменного фрагмента архейного рибосомного белка Р0 и комплекса архейных рибосомных белков P0-P1NTD позволило частично определить структуру Р-выступа в составе эукариотической рибосомы и дополнить модель 50S субчастицы архейной рибосомы в районе Р-выступа. Таким образом, определение структур отдельных элементов Ы2/Р-выступа способствовало визуализации этого выступа в составе рибосом. Настоящая работа является продолжением этих исследований.

Цель п задачи работы. Основной целью представленной диссертационной работы является исследование структуры компонентов бокового Р-выступа большой рибосомной субчастицы архейной рибосомы, чтобы использовать эти структурные данные для дальнейшего уточнения структуры архейной рибосомы. Для достижения этой цели были поставлены следующие основные задачи:

1. Кристаллизация и определение структуры изолированного рибосомного белка Ы 1 из археи МеШапососсш ]аппа5сЫ1 (М]аЫ 1).

2. Кристаллизация и определение структуры комплекса двухдоменного фрагмента архейного рибосомного белка МЗаРО со специфичным фрагментом 238 рРНК.

3. Кристаллизация и определение структуры тройного комплекса, состоящего из фрагмента рибосомного белка М]аР0, рибосомного белка М]аЫ1 и специфичного фрагмента 23Б рРЫК (с антибиотиком тиострептоном и без антибиотика).

4. Анализ пространственных структур данных РНК-белковых комплексов и изолированного белка М]аЫ 1.

Научная новизна. Получены кристаллы изолированного полноразмерного архейного рибосомного белка М]аЫ 1 и определена его структура. Впервые была визуализирована структура М-концевого домена этого белка. Получены кристаллы комплекса К-концевого двухдоменного фрагмента архейного рибосомного белка М]аР0 (М]аР0МТР) со специфическим фрагментом 238 рРНК в присутствии и отсутствии белка М]аЫ 1 и определены структуры этих комплексов. С помощью наложения всех известных структур архейного белка РО было продемонстрировано, что специфичный для архей и эукариот домен 2 белка РО чрезвычайно подвижен, но, несмотря на высокую подвижность, этот домен не взаимодействует с рРНК. Сравнительный анализ структур МуаР0МТР-238рРНК и ¡УЦаРОШТ-Г^аЫ 1-238рРНК показал, что при связывании белка М]аЫ I с комплексом М|'аР0МТР-238рРНК не происходит конформационных изменений в пространственной структуре фрагмента 238 рРНК. Анализ пространственных структур архейных рибосомных белков М]аЫ 1 и М^аРОЫТР в комплексе с фрагментом 238 рРНК позволил выявить структурные особенности поверхностей контакта данных белков с рРНК. Также впервые закристаллизован тройной комплекс М]аР0>ПТ-М]а1Л 1-238рРНК с антибиотиком тиострептоном и определена его структура. Показано, что сайт связывания тиострептона в данном тройственном комплексе расположен между 238 рРНК и 1Ч-концевым доменом белка Ы 1, как и в бактериальной рибосоме.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Результаты данной работы имеют фундаментальное значение и вносят существенный вклад в понимание структурных основ функционирования Р-выступа в архейных и эукариотических рибосомах. Эти данные способствуют уточнению структуры большой субчастицы архейной и эукариотической рибосом.

В методическом аспекте данная работа будет полезна для специалистов, работающих в области препаративной биохимии и кристаллизации макромолекул, как в нашей стране, так и за рубежом.

Апробация работы и публикации. Основные результаты работы неоднократно докладывались на Российских и Международных конференциях. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них статей в рецензируемых научных изданиях - 4, материалов конференций - 11. В банк белковых структур РОВ депонировано 5 пространственных структур (3.18У, 5СОЦ 5Б6С, 508Н, 50АЯ).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ИССЛЕДОВАНИЯ СТРУКТУРЫ LI 2/Р-ВЫСТУПА РИБОСОМЫ

В 1950-х годах были открыты клеточные органеллы, которые ответственны за биосинтез белка в клетке. Эти органеллы были названы рибосомами. Строение рибосом исследовалось методами ультрацентрифугирования и электронной микроскопии. Эти исследования показали, что в определенных условиях (например, низкая концентрация ионов магния) рибосома диссоциирует на малую и большую субчастицы. С помощью электронной микроскопии были получены фотографии целой рибосомы и её большой и малой субчастиц в разных проекциях (Рис. 1). Большая субчастица рибосомы содержит тело и три характерных периферических выступа. На рисунке 1В представлена большая субчастица бактериальной рибосомы Escherichia coli в коронообразной проекции (частица обращена своей внешней выпуклой стороной): с левой стороны субчастицы расположен боковой пальцеобразный выступ (Ы2-выступ), посередине - центральный протуберанец, который можно назвать головкой большой субчастицы и справа - боковой LI-выступ (Boublik et al., 1976; Lake, 1976).

Рис. 1. Электронные микрофотографии индивидуальной 70S рибосомы Е. coli (А), индивидуальной 30S субчастицы (Б) и индивидуальной 50S субчастицы (В). Рибосомные частицы негативно контрастированы уранилацетатом. Рисунки с небольшими изменениями взяты из Спирин, 2011.

Рибосома представляет собой макромолекулярный рибонуклеопротеидный комплекс. Рибосомная РНК (рРНК) определяет основные структурные и функциональные свойства рибосомы, но для нормального функционирования рибосомы необходимо наличие как рРНК (в малой субчастице - одна высокополимерная молекула РНК, в большой субчастице одна высокополимерная РНК и одна или две низкомолекулярные), так и рибосомных белков (более 50 индивидуальных рибосомных белков в бактериальной 70S рибосоме).

В процессе биосинтеза белка рибосома взаимодействует с матричной РНК (мРНК), транспортными РНК (тРНК), трансляционными факторами инициации, элонгации и терминации и с другими лигандами (Спирин, 2011).

Рабочий цикл рибосомы состоит из трех этапов: инициации, элонгации и терминации. Факторы трансляции способствуют белковому синтезу на каждом этапе рабочего цикла рибосомы. Боковой Ы2/Р-выступ рибосомы способствует взаимодействию рибосомы с факторами элонгации и терминации трансляции. Ы2-выступ бактерий участвует еще и в инициации трансляции: этот боковой выступ взаимодействует с преинициаторным комплексом, увеличивая скорость ассоциации малой и большой субчастиц рибосомы (Huang et al., 2010). С помощью криоэлектронной микроскопии и последующей реконструкции структуры рибосомы показано, что в процессе элонгационного цикла рибосомы Ы2-выступ подвергается различным конформационным перестройкам (Рис. 2).

Малая и большая рибосомные субчастицы содержат большое число индивидуальных белков. Практически все они представлены одной копией на рибосоме. Первая попытка систематизировать рибосомные белки была основана на стандартном экспериментальном методе, в качестве которого использовался двумерный электрофорез в геле. Этот наиболее удобный метод позволил полностью разделить рибосомные белки по заряду и размеру молекул. Было предложено называть рибосомные белки, нумеруя их сверху вниз и слева направо относительно стартовой точки на электрофореграмме (Рис. 3) (Kaltschmidt and Wittmann, 1970). Белки малой субчастицы рибосомы обозначены буквой S (от английского "Small"), а белки большой субчастицы - буквой L (от английского "Large").

Выяснилось, что малая субчастица рибосомы Е. coli содержит 21 белок (S1-S21), а большая субчастица 34 белка (L1-L36). Пятна маленьких белков L34, L35 и L36 плохо выявляются электрофорезом в стандартных условиях. Белок S20 идентичен белку L26, а белок L7, который обнаружен не во всех бактериях, представляет собой N-ацетилированное производное белка L12 (Terhorst et al., 1972). Пятно, обозначенное как белок L8, соответствует не индивидуальному белку, а прочному комплексу белков L10-L12 (Pettersson etal., 1976).

Рис. 2. Структуры рибосом Е. coli, полученные методом криоэлектронной микроскопии: (А) фрагмент 70S рибосомы в комплексе с EF1 А«ГТФ*тРНК*кирромицин; (Б) фрагмент 70S рибосомы в А/Р-претранслокационном состоянии; (В) 70S pH6ocoMa*EF2*GDPCP; (Г) 70S рибосома*ЕР2*ГДФ*фусидовая кислота. Рисунки с небольшими изменениями взяты из работ Stark et al., 1997 и Agrawal et al., 1999. Желтым/голубым цветом окрашена 70S рибосома, рыжим - фактор EF1 А, красным - фактор EF2, зеленым - тРНК.

Первоначально рибосомные белки каждого вида организмов имели собственное обозначение, соответствующее их электрофоретическому разделению. Рибосомные белки стали обозначать с приставками, например, белки бактерии Е. coli с приставкой Ее, белки археи Haloarcula marismortui - Hm, эукариотические белки Saccharomyces cerevisiae - Y. В возникшей номенклатуре один и тот же номер мог принадлежать негомологичным белкам различных видов. При сравнении аминокислотных последовательностей рибосомных белков была найдена гомология между белками разных видов, а также было обнаружено, что большая часть рибосомных белков эволюционно консервативна (Liao and Dennis, 1994). Это позволило создать первоначальную номенклатуру для консервативных гомологичных белков бактерий, архей и эукариот.

Рис. 3. Разделение рибосомных белков 30S (А) и 50S (Б) субчастиц рибосомы Escherichia coli с помощью двумерного электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях и номенклатура этих белков. Первое направление - горизонтальное, второе направление - вертикальное (сверху вниз). Рисунки с небольшими изменениями взяты из работы Kaltschmidt and Wittmann, 1970.

С появлением полученных методами кристаллографии или криоэлектронной микроскопии моделей бактериальных (Agrawal et al., 1998; Harms et al., 2001; Stark et al., 1997), архейных (Armache et al., 2013; Ban et al., 2000) и эукариотических (Ben-Shem et al., 2010; Klinge et al., 2011; Spahn et al., 2001) рибосом отсутствие единого обозначения рибосомных белков стало затруднять сравнительный анализ структур. Для решения этой проблемы в 2014 году была создана единая номенклатура рибосомных белков всех доменов жизни (Таблица 1) (Ban et al., 2014). В основу новой номенклатуры легло обозначение рибосомных белков Е. coli, поскольку впервые рибосомные белки были выделены именно из этого организма, их аминокислотные последовательности стали известны раньше последовательностей других рибосомных белков, а также эти белки были наиболее подробно описаны в литературе. Белкам, которые обнаружены в рибосомах всех доменов жизни, была присвоена приставка "и" (от английского "univesal") и нумерация белков Е. coli. Бактериальные белки, у которых не обнаружено гомологов среди архей и эукариот, были обозначены приставкой "Ь" (от английского "bacterial"). Архейным рибосомным белкам, которые не имеют гомологов в бактериальной и эукариотической рибосомах, была приписана приставка "а" (от английского "archaeal"). Приставка "е" (от английского "eukaryotic") была добавлена не только для обозначения

эукариотичсских рибосомных белков, для которых не найдены бактериальные и архейные гомологи, но также и для гомологичных uní архейных белков.

В предложенной номенклатуре рибосомные белки Ы2/Р-выступа приобрели новое обозначение. Бактериальный белок L10 и его архейный и эукариотический гомологи РО было предложено обозначать как uLIO, а бактериальный белок L12 - как bL12. В археях и эукариотах не обнаружено гомологов бактериального белка LI2, но имеются его функциональные аналоги, называемые белками Р1/Р2 в эукариотах и PI в археях. Соответственно, этот боковой выступ у архей и эукариот обозначается теперь как Р-выступ. Бактериальный и архейный белки L11 и их эукариотический аналог, белок L12e, предложено обозначать как uLl I.

Поскольку новая номенклатура была принята относительно недавно и еще не получила широкого распространения, во избежание недоразумений в данной работе будет использовано старое обозначение рибосомных белков L12/P-BbicTyna (Таблица 1).

1. Компоненты Ы2/Р-выступа рибосомы

1.1. Бактериальные белки LIO, L11 и L12

Рибосомные белки LIO, L11 и L12 вместе с фрагментом домена II 23S рРНК образуют характерный морфологический выступ бактериальной рибосомы, называемый L12-BbiCTynoM. Двух-стадийная обработка большой рибосомной субъединицы Е. coli 1 М NH4CI и 50% этанолом при 0°С и 37°С позволяет полностью удалить эти белки из рибосомы (Highland and Howard, 1975).

Рибосомный белок LI2 является одним из первых белков, выделенных из рибосомы. Это единственный белок большой субчастицы рибосомы, который представлен в нескольких копиях (Hardy, 1975). В рибосомах Е. coli присутствует дополнительный рибосомный белок - белок L7 (Kaltschmidt and Wittmann, 1970). L7 является точной копией рибосомного белка LI2, единственным отличием является то, что L7 ацетилирован по N-концевому остатку серина (Terhorst et al., 1972). Из-за близкого сходства эти белки ранее в литературе упоминались как белок L7/L12. Соотношение белков L7 : LI2 в клетке не постоянно и зависит от фазы роста клеток. В ранней логарифмической фазе роста клеток Е. coli в рибосомах присутствие белка L7 минимально. Увеличение его количества наблюдается при переходе из логарифмической фазы роста клеток в стационарную фазу (Gordiyenko et al., 2008; Ramagopal and Subramanian, 1974).

Таблица 1. Старая и новая номенклатуры рибосомных белков. Таблица взята с изменениями из работ Armache et al., 2013 и Ban et al., 2014.

Рибосомные белки малой субчастицы

Рибосомные белки большой субчастицы

Новое Домены Старое название Новое Домены Старое название

название" жизни* Бактерии Археи Эукариоты название* жизни* Бактерии Археи Эукариоты

bS1 Б S1 — — uL1 БАЭ L1 L1 L1/L10A

eS1 АЭ — S3ae S1/S3A" uL2 БАЭ L2 L2 L2/L8"

uS2 БАЭ S2 S2 so/sa" uL3 БАЭ L3 L3 L3

uS3 БАЭ S3 S3 S3 uL4 БАЭ L4 L4 L4

uS4 лО/ БАЭ ДО S4 S4 C/IQ s9 OA uL5 1 ll fy БАЭ L5 f к L5 f fi L11 I Q

ем uS5 пО БАЭ с- s5 ос S5 оч S2 ULD eL6 — I О DnJ э LA> LD 1 fla L6 1 Qli "7 л

boo eS6 ,.07 D АЭ OD С7 S6e 07 S6 eLö bL9 irl 1П r\\j — Б l9 ело I m Loe РП Lo/L f A PO

uo 1 eS7 DnJ э О/ О/ S8 Ov> S7 COO/C4 СЛ UL I U UL11 hl 19 БАЭ с L11 1 19 ru L11 L12e

UO<5 aS8 DnJ А оо L7ae oZ^/o »OA DL l-C uL13 о БАЭ l iz L13 L13 L16/L13A*

eS8 АЭ — S8e SB eL13 АЭ — L13e L13

uS9 1 .o-fn БАЭ ело S9 S9 o-in s16 сол uL14 Л А БАЭ ДО L14 L14 1 Л Acs L23 f 1A

UbiU eS10 nQ1 1 ЬАо э КЛО о lu Q11 olU Q11 ozu S10 eL »4 ul15 Аа БАЭ ло L15 Li4e L15 f Л Rq L 14 L28/L27A" I 1<R

UO I I uS12 ЬАо БАЭ Л*} Ol I S12 Ol 1 S12 Q19« 0 14 S23 eL ID uL16 hl 17 tA-J БАЭ k L16 1 17 l 10e ив L IО L10

CO I uS13 1 iQ1 И МО БАЭ СЛО S13 Q1Л О l ¿.KS S13 О \c. S18 çtq DL 1 ( uL18 al 1 Й БАЭ ЛО i_ t / L18 lie I i ЙО L5 1 1Я

Uo 14 uS15 БАЭ Б о 14 S15 О »4 S15 04у S13 ÖL io bL19 öl 1Q Б до L19 L 10e 1 1 Qp L IO I 1Q

DO ID uS17 БАЭ ДО О ID S17 S17 S11 Q17 cl 1 v7 bL20 ol 9П nu Б ло L20 L iye l X L la 1 on/i 40A

eo 11 bS18 i iQIQ АС? Б ело S18 ею ol/c C4Q 0 I f C1 R cLZU bL21 /al Ol Б ЛО L21 LA 1 O-IÛ L^U/LloA 1 OA

UO »У eS19 ЬАс> АЭ с ЫУ öl» S19e О ID S19 UL22 Ао БАЭ L22 le L22 LZ I L17

bS20 bS21 О Б о 520 521 — <591 eL22 uL23 nl 9л а БАЭ ело L23 1 OA L23 1 94 L22 L25/L23AA 1 9 fi

eoz i eS24 о АЭ ло — S24e 0/ i S24 00c eL24 L—, I ЛС DnO АЭ Г" 1 oc L24e Lau L24

eozo eS26 Ао Э до — S25e S26 DLzo bL27 Ы 97 ь Б rs L27 — 1 97

eoc/ eS28 АС АЭ — О*. /e S28e О £./ S28 gl*, t bL28 Б L28 — lx I

eS30 АЭ «м S30e S30 uL29 БАЭ 129 L29 L35

eS31 АЭ — S27ae s31/s27a" eL29 Э — — L29

Hi

с'лйа

Si

üSSB

шшшшшшм ■ .....— ■■

' 11 I ш

- -

UL30 eL30 Ы31 eL31 bL32 eL32 bL33 eL33 bL34 eL34 bL35 bL36 eL36 eL37 eL38 eL39 eL40 eL41 eL42 eL43 P1/P2

БАЭ

АЭ

L30

L30

L30e

Б

АЭ Б

АЭ Б

АЭ Б

АЭ Б Б Э

АЭ АЭ АЭ АЭ АЭ АЭ АЭ АЭ

L31 L32 L33 L34

L35

L36

L31e L32e L33e L34e

L37e L38e

L7

L30

L31 L32

L39e L40e L41e L44e L43e P1

L33/L35 L34

L36 L37 L38 L39 L40 L41 L42/L36A" L43/L27A" P1/P2

b - бактериальный, e - эукариотический, а - архейный, u - универсальный. * Б - бактерии, А - археи, Э - эукариоты.

обозначены дрожжевые/человеческие эукариотические рибосомные белки

Скорость трансляции и уровень ошибок в процессе биосинтеза белка на рибосомах зависит от наличия белка L12 (Kirsebom and Isaksson, 1985; Pettersson and Kurland, 1980). Этот белок вовлечен во взаимодействие рибосомы с факторами трансляции (Fakunding et al., 1973; McCaughan et al., 1984; Sander et al., 1972), a также влияет на уровень фактор-зависимого гидролиза ГТФ на рибосоме (Möller et al., 1983). Удаление рибосомного белка L12 из рибосомы затрудняет связывание факторов элонгации EF1A и EF2 с рибосомой (Sander et al., 1975) и затрагивает другие фактор-зависимые функции, например, связывание аминоацил-тРНК с А-сайтом рибосомы, транслокацию, и, как следствие, гидролиз ГТФ (Donner et al., 1978; Koteliansky et al., 1978). С помощью данных гетероядерной ЯМР-спектроскопии было показано, что белок L12 взаимодействует напрямую с трансляционными факторами с помощью консервативного связывающего участка, который расположен в С-концевом домене белка (I lelgstrand et al., 2007).

В процессе инициации трансляции белок LI2 необходим для узнавания фактора инициации трансляции 2 (IF2) в комплексе с ГТФ в составе 30S преинициаторного комплекса. Результатом такого взаимодействия становится увеличение скорости ассоциации малой и большой субчастиц. Удаление белка LI2 из рибосомы приводит к резкому снижению скорости ассоциации рибосомных субъединиц, но при этом скорость гидролиза ГТФ на 1F2 и скорость освобождения неорганического фосфата не изменяются. Из этого следует, что белок LI2 не является ГТФаза-активирующим белком для фактора инициации трансляции 2 (Huang et al., 2010).

Копформационные изменения белка LI 2 могут отражать функциональные состояния рибосомы (Gudkov, 1997). При взаимодействии факторов элонгации EF1A и EF2 с рибосомой можно выделить два основных состояния белка LI2: до и после гидролиза ГТФ. Когда рибосома связана с EF2 и еще не произошел гидролиз ГТФ, белок LI2 доступен для расщепления протеазой. После гидролиза ГТФ белок L12 становится нечувствительным к действию протеазы (Gudkov and Gongadze, 1984). При связывании EF1A с рибосомой белок L12 сохраняет устойчивость к протеолитическому расщеплению, как и в свободной рибосоме. После EFlA-зависимого гидролиза ГТФ белок изменяет конформацию и становится доступным для расщепления протеазой (Gudkov and Bubunenko, 1989).

Белок LI2 обладает уникальными свойствами среди бактериальных рибосомных белков. Помимо того, что LI2 является мультикопийным белком, его изоэлектрическая точка находится в кислой области (pH 4.8) (Brot and Weissbach, 1981). В водном растворе изолированный белок LI 2 существует только в виде димера (Wong and Paradies, 1974) или тетрамера (Kar and Aune, 1981).

Рибосомный белок L12 состоит из двух доменов и длинной гибкой перетяжки (Gudkov and Behlke, 1978; Gudkov et al., 1980, 1982). С-концевой домен белка L12 (L12CTD) ответственен за взаимодействие с факторами трансляции (Oleinikov et al., 1998; Olson et al., 1986), a N-концевой домен белка L12 (L12NTD) - за димеризацию и связывание с рибосомным белком L10 (Gudkov and Behlke, 1978). N- и С-концевые домены L12 соединены между собой гибкой перетяжкой, которая обеспечивает подвижность молекулы белка (Bocharov et al., 2004). Длина перетяжки влияет не только на подвижность двух доменов друг относительно друга, но и на связывание факторов элонгации, гидролиз ГТФ на рибосоме, скорость и точность трансляции (Bubunenko et al., 1992; Dey et al., 1995). Удаление этого участка приводит к инактивации белка L12 (Bubunenko et al., 1992).

В 1980 году был закристаллизован С-концевой домен белка L12 из Е. coli и определена его структура с разрешением 2.6 A (Leijonmarck et al., 1980). Это была первая кристаллическая структура рибосомного белка. В 1987 году было улучшено разрешение этой структуры до 1.7 Â (Рис. 4А) (Leijonmarck and Liljas, 1987).

N

Рис. 4. (А) Пространственная структура С-концевого домена рибосомного белка L12 из Е. coli, PDB код 1CTF. Красным цветом окрашены а-спирали, голубым - ß-тяжи. (Б) Пространственная структура полноразмерного рибосомного белка L12 из Thermotoga maritima, PDB код 1DD3. Зеленым цветом окрашен С-концевой домен, желтым цветом - перетяжка, оранжевым цветом - N-концевой домен.

Позднее появилась пространственная структура полноразмерного белка LI2 из Thermotoga maritima с разрешением 2.0 А (Рис. 4Б) (Wahl et al., 2000). L12NTD содержит две коротких спирали al и а2. Длинная шарнирная спираль аЗ представляет собой перетяжку, которая отделяет N-концевой домен от глобулярного С-концевого домена. Эта

16

С-концевой домен

N-концевой домен

спираль образована 20 аминокислотными остатками, преимущественно гидрофобными. С-концевой домен белка LI 2 имеет плотную упаковку и состоит из трех-тяжевого анитипараллельного ß-листа, окруженного с одной стороны тремя а-спиралями. Две спирали а4 и аб расположены практически параллельно направлению ß-листа (Wahl et al.,

В 2004 году определена пространственная структура димера белка L7, N-ацетилированного варианта белка LI2 из Е. coli, методом ядерного магнитного резонанса в растворе (ЯМР) (Рис. 5А) (Bocharov et al., 2004). Белок L7 находится в вытянутой конформации. Данная структура димера белка L7 сильно отличается от кристаллической структуры белка L12 из Т. maritima в области перетяжки. Гибкая перетяжка в структуре каждого мономера белка L7 не имеет определенной структурной укладки. Определенная методом ЯМР структура димера белка L7 позволила определить способ димеризации белка в растворе. Димеризация белка L7 происходит за счет контакта двух антипараллельных V-образных а-а-шпилек N-концевого домена, которые образуют симметричный четырех-спиральный узел (Рис. 5Б). В результате гидрофобного взаимодействия спиралей al и a2 и двух солевых мостиков между остатками Glull и Lys28, Asp4 и Lys24 поддерживается плотный и специфический контакт между двумя мономерами белка L7.

Рис. 5. (А) Пространственная структура димера рибосомного белка L7 из Е. coli, PDB код 1RQU; (Б) димер N-концевого домена белка L7 из Е. coli. Рисунок (Б) с изменениями взят из работы Bocharov et al., 2004. Серым и зеленым цветами окрашены разные мономеры белка.

2000).

А

аТ

На основании полученных структур белка LI2 из Т. maritima и димера белка L7 из Е. coli была предложена модель молекулярного переключения между двумя состояниями белка (Рис. 6). Данная модель предполагает, что участок в области перетяжки белка LI2 может выполнять роль молекулярного переключателя: молекула принимает или «закрытую», компактную конформацию, когда фактор элонгации связан с рибосомой, или «открытую», вытянутую конформацию после гидролиза ГТФ и освобождения фактора элонгации из рибосомы (Bocharov et al., 2004).

Рис. 6. Модель молекулярного переключения между двумя состояниями белка Ы2. Рисунок с небольшими изменениями взят из работы ВосЬагоу е/ а1., 2004.

освобождение

NTI)

Факторы ллонгацнм связывание

освобождение

NTD

Факторы нотации

СПЯ 11.1 IUI i иг

Димеры белка LI2 связываются с рибосомным белком L10, образуя в растворе прочный комплекс рибосомных белков L10-L12. Термостабильность белков L10 и L12 в комплексе повышается по сравнению с индивидуальным состоянием (Gudkov et al., 1978). Комплекс L10-L12 из Е. coli остается стабильным в присутствии 6 М мочевины при значении pH 4.6. В связи с этим при систематизации рибосомных белков методом двумерного электрофореза сохранившийся в денатурирующих условиях комплекс белков L10-L12 был ошибочно принят за индивидуальный белок, которому было присвоено название L8 (Pettersson et al., 1976).

Для рибосомного комплекса белков L10-L12 из Е. coli было установлено соотношение белков L10 и L12 как 1 :4 методами изотопного разведения (Pettersson and Liljas, 1979), равновестного ультрацентрифугирования и количественного анализа пятен белков на электрофореграмме (Gudkov et al., 1978). Поэтому долгое время считалось, что бактериальный комплекс рибосомных белков L10-L12 может существовать только в виде пентамера. Появление кристаллической структуры рибосомного комплекса L10-L12NTD из Т. maritima изменило представление о соотношении белков L10 и LI 2. В данной

18

структуре комплекса шесть молекул N-концевого домена белка LI 2 образовали с одной молекулой белка L10 гептамерный комплекс (Diaconu et al., 2005). В связи с этим было выдвинуто предположение, что разница между соотношением белков в L10-L12 комплексе из Е, coli и термофильной бактерии Т. maritima зависит от природы организма, из которого выделены белки, и дополнительная аминокислотная последовательность в С-концевом домене белка L10 термофильных бактерий может быть местом связывания для третьего димера белка L12 (Ilag et al., 2005). Результаты, полученные методом масс-спектрометрии, подтвердили это предположение. Было показано, что комплексы L10-L12 из мезофильных бактерий являются пентамерными, а из термофильных бактерий - исключительно гептамерными (Gordiyenko et al., 2010; Ilag et al., 2005).

Рибосомный белок L10 играет роль моста между димерами белка L12 и рибосомой. С-концевая часть белка L10 мезофильных бактерий содержит два независимых сайта связывания для димеров белка L12, тогда как N-концевой частью белок L10 взаимодействует с 23S рРНК (Gudkov et al., 1980). Показано, что при удалении последних десяти С-концевых аминокислотных остатков белка L10 из Е. coli белок L10 может связать только один из двух димеров белка L12, а удаление последних 20-33 остатков приводит к неспособности белка L10 связывать димеры LI2 (Griaznova and Traut, 2000).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Митрошин, Иван Владимирович, 2015 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Спирин, А.С. (2011). Молекулярная биология: рибосомы и биосинтез белка. Москва: Издательский центр «Академия». -496 с.

2. Adams, P.D., Afonine, P. V., Bunkoczi, G., Chen, V.B., Davis, I.W., Echols, N., 1 Jeadd, J.J., Hung, L.W., Kapral, G.J., Grosse-Kunstleve, R.W., et al. (2010). PHENIX: A comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 66, 213-221.

3. Afonine, P. V., Grosse-Kunstleve, R.W., Echols, N., Headd, J.J., Moriarty, N.W., Mustyakimov, M., Terwilliger, T.C., Urzhumtsev, A., Zwart, P.M., and Adams, P.D. (2012). Towards automated crystallographic structure refinement with phenix.refine. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 68, 352-367.

4. Agrawal, R.K., Penczek, P., Grassucci, R.A., and Frank, J. (1998). Visualization of elongation factor G on the Escherichia coli 70S ribosome: The mechanism of translocation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 6134-6138.

5. Agrawal, R.K., Heagle, A.B., Grassucci, R.A., and Frank, J. (1999). EF-G-dependent GTP hydrolysis induces translocation accompanied by large conformational changes in the 70S ribosome. Nat. Struct. Mol. Biol. 6, 643-647.

6. Van Agthoven, A., Kriek, J., Amons, R., and Moller, W. (1978). Isolation and characterization of the acidic phosphoprotcins of 60S ribosomes from Artemia salina and rat liver. Eur. J. Biochem. 91, 553-565.

7. Armache, J.-P., Anger, A.M., Marquez, V., Franckenberg, S., Frohlich, Т., Villa, E., Berninghausen, O., Thomm, M., Arnold, G.J., Beckmann, R., et al. (2013). Promiscuous behaviour of archaeal ribosomal proteins: implications for eukaryotic ribosome evolution. Nucleic Acids Res. 41, 1284-1293.

8. Baba, K., Tumuraya, K., Tanaka, I., Yao, M., and Uchiumi, T. (2013). Molecular dissection of the silkworm ribosomal stalk complex: the role of multiple copies of the stalk proteins. Nucleic Acids Res. 41, 3635-3643.

9. Bailey-Serres, J., Vangala, S., Szick, K., and Lee, C.-H.K. (1997). Acidic phosphoprotein complex of the 60S ribosomal subunit of maize seedling roots. Plant Physiol. 114, 1293-1305.

10. Ballesta, J.P.G., and Remacha, M. (1996). The large ribosomal subunit stalk as a regulatory element of the eukaryotic translational machinery. Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 55, 157-193.

11. Ballesta, J.P.G., Rodriguez-Gabriel, M.A., Bou, G., Briones, E., Zambrano, R., and Remacha, M. (1999). Phosphorylation of the yeast ribosomal stalk. Functional effects and enzymes involved in the process. FEMS Microbiol. Rev. 23, 537-550.

12. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Capel, M., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (1999). Placement of protein and RNA structures into a 5 A-resolution map of the 50S ribosomal subunit. Nature 400, 841-847.

13. Ban, N., Nissen, P., Hansen, J., Moore, P.В., and Steitz, T.A. (2000). The complete atomic structure of the large ribosomal subunit at 2.4 A resolution. Science 289, 905-920.

14. Ban, N., Beckmann, R., Cate, J.H.D., Dinman, J.D., Dragon, F., Ellis, S.R., Lafontaine, D.L.J., Lindahl, L., Liljas, A., Lipton, J.M., et al. (2014). A new system for naming ribosomal proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 24, 165-169.

15. Bausch, S.L., Poliakova, E., and Draper, D.E. (2005). Interactions of the N-terminal domain of ribosomal protein LI 1 with thiostrepton and rRNA. J. Biol. Chem. 280, 29956-29963.

16. Beauclerk, A.A.D., Hummel, I I., Holmes, D.J., Bock, A., and Cundliffe, E. (1985). Studies of the GTPase domain of archaebacterial ribosomes. FEBS J. 151, 245-255.

17. Ben-Shem, A., Jenner, L., Yusupova, G., and Yusupov, M. (2010). Crystal structure of the eukaryotic ribosome. Science 330, 1203-1209.

18. Ben-Shem, A., de Loubresse, Nicolas Garreau Melnikov, S., Jenner, L., Yusupova, G., and Yusupov, M. (2011). The structure of the eukaryotic ribosome at 3.0 A resolution. Science 334, 1524-1529.

19. Bocharov, E. V, Sobol, A.G., Pavlov, K. V, Korzhnev, D.M., Jaravine, V.A., Gudkov, A.T., and Arseniev, A.S. (2004). From structure and dynamics of protein L7/L12 to molecular switching in ribosome. J. Biol. Chem. 279, 17697-17706.

20. Boublik, M., Hellmann, W., and Roth, H.E. (1976). Localization of ribosomal proteins L7L12 in the 50S subunit of Escherichia coli ribosomes by electron microscopy. J. Mol. Biol. 107, 479-490.

21. Briones, E., Briones, C., Remacha, M., and Ballesta, J.P.G. (1998). The GTPase center protein L12 is required for correct ribosomal stalk assembly but not for Saccharomyces cerevisiae viability. J. Biol. Chem. 273, 31956-31961.

22. Brot, N., and Weissbach, II. (1981). Chemistry and biology of E. coli ribosomal protein LI2. Mol. Cell. Biochem. 63, 47-63.

23. Bubunenko, M.G., Chuikov, S.V., and Gudkov, A.T. (1992). The length of the interdomain region of the L7/L12 protein is important for its function. FEBS J. 313, 232-234.

24. Casiano, C., and Traut, R.R. (1991). Protein topography of Salfolobus solfatariciis ribosomes by cross-linking with 2-iminothiolane. J. Biol. Chem. 266, 21578-21583.

25. Casiano, C., Matheson, A.T., and Traut, R.R. (1990). Occurrence in the archaebacterium Sulfolobus solfatariciis ribosomal protein complex corresponding to Escherichia coli (L7/L12)4-L10 and eukaryotic (P1)2/(P2)2-P0. J. Biol. Chem. 265, 18757-18761.

26. Choi, A., Wong, E., Lee, K.-M., and Wong, K.-B. (2015). Structures of eukaryotic ribosomal stalk proteins and its complex with trichosanthin, and their implications in recruiting ribosome-inactivating proteins to the ribosomes. Toxins 7, 638-647.

27. Climie, S.C., and Friesen, J.D. (1987). Feedback regulation of the rplJL-rpoBC ribosomal protein operon of Escherichia coli requires a region of mRNA secondary structure. J. Mol. Biol. 198, 371-381.

28. Computational Project Collaborative, N. 4 (1994). The CCP4 suite: programs for protein crystallography. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. D50, 760-763.

29. Cundliffe, E., Dixon, P., Stark, M., Stoffler, G„ Ehrlich, R., Stoffler-Meilicke, M„ and Cannon, M. (1979). Ribosomes in thiostrepton-resistant mutants of Bacillus megaterium lacking a single 50S subunit protein. J. Mol. Biol. 132, 235-252.

30. Davies, D.R., and Segal, D.M. (1971). Protein crystallization: Micro techniques involving vapor diffusion. Methods Enzymol. 22, 266-269.

31. Dey, D., Oleinikov, D., Dey, A. V, and Traut, R.R. (1995). The hinge region of Escherichia coli ribosomai protein L7/L12 is required for factor binding and GTP hydrolysis. Biochimie 77, 925-930.

32. Diaconu, M., Kothe, U., Schliinzen, F., Fischer, N., Harms, J.M., Tonevitsky, A.G., Stark, II., Rodnina, M. V, and Wahl, M.C. (2005). Structural basis for the function of the ribosomal L7/12 stalk in factor binding and GTPase activation. Cell 121, 991-1004.

33. Dijk, J., Garrett, R.A., and Muller, R. (1979). Studues on the binding of the ribosomal protein complex L7/12-L10 and protein LI 1 to the 5'-one third of 23S RNA: a functional centre of the 50S subunit. Nucleic Acids Res. 6, 2717-2729.

34. Donner, D., Villems, R., Liljas, A., and Kurland, C.G. (1978). Guanosinetriphosphatase activity dependent on elongation factor Tu and ribosomal protein L7/L12. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75, 3192-3195.

35. Egebjerg, J., Douthwaite, S., and Garrett, R.A. (1989). Antibiotic interactions at the GTPase-associated centre within Escherichia coli 23S rRNA. EMBO J. 8, 607-611.

36. El-Baradi, T.T.A.L., de Regt, V.C.H.F., Einerhand, S.W.C., Teixido, J., Planta, R.J., Ballesta, J.P.G., and Raué, H.A. (1987). Ribosomal proteins EL11 from Escherichia coli and LI5 from Saccharomyces cerevisiae bind to the same site in both yeast 26S and mouse 28S rRNA. J. Mol. Biol. 195, 909-917.

37. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G., and Cowtan, K. (2010). Features and development of Coot. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 66, 486-501.

38. Evers, U., Franceschi, F., Boeddeker, N., and Yonath, A. (1994). Crystallography of halophilic ribosome: the isolation of an internal ribonucleoprotein complex. Biophys. Chem. 50, 3-16.

39. Fakunding, J.L., Traut, R.R., and Hershey, W.B. (1973). Dependence of initiation factor IF-2 activity on proteins L7 and L12 from Escherichia coli 50S ribosomes. J. Biol. Chem. 248, 8555-8559.

40. Gabdulkhakov, A., Nikonov, S., and Garber, M. (2013). Revisiting the Haloarcula marismortui 50S ribosomal subunit model. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 69, 997— 1004.

41. Gao, Y.-G., Selmer, M., Dunham, C.M., Weixlbaumer, A., Kelley, A.C., and Ramakrishnan, V. (2009). The structure of the ribosome with elongation factor G trapped in the posttranslocational state. Science 326, 694-699.

42. García-Marcos, A., Morreale, A., Guarinos, E., Briones, E., Remacha, M., Ortiz, A.R., and Ballesta, J.P.G. (2007). In vivo assembling of bacterial ribosomal protein LI 1 into yeast ribosomes makes the particles sensitive to the prokaryotic specific antibiotic thiostrepton. Nucleic Acids Res. 35, 7109-7117.

43. Glotz, C., Müssig, J., Gewitz, H.S., Makowski, I., Arad, T., Yonath, A., and Wittmann, II.G. (1987). Three-dimensional crystals of ribosomes and their subunits from eu- and archaebacteria. Biochem. Int. 15, 953-960.

44. Gonzalo, P., and Reboud, J.-P. (2003). The puzzling lateral flexible stalk of the ribosome. Biol. Cell 95, 179-193.

45. Gordiyenko, Y., Deroo, S., Zhou, M., Videler, H., and Robinson, C. V (2008). Acetylation of L12 increases interactions in the Escherichia coli ribosomal stalk complex. J. Mol. Biol. 380, 404-414.

46. Gordiyenko, Y., Videler, I I., Zhou, M., McKay, A.R., Fucini, P., Biegel, E., Miiller, V., and Robinson, C. V (2010). Mass spectrometry defines the stoichiometry of ribosomal stalk complexes across the phylogenetic tree. Mol. Cell. Proteomics 9, 1774-1783.

47. Grela, P., Sawa-Makarska, J., Gordiyenko, Y., Robinson, C. V, Grankowski, N., and Tchórzewski, M. (2008a). Structural properties of the human acidic ribosomal P proteins forming the P1-P2 heterocomplex. J. Biochem. 143, 169-177.

48. Grcla, P., Bernado, P., Svcrgun, D., Kwiatowski, J., Abramczyk, D., Grankowski, N., arid Tchorzewski, M. (2008b). Structural relationships among the ribosomal stalk proteins from the three domains of life. J. Mol. Evol. 67, 154-167.

49. Grela, P., Krokowski, D., Gordiyenko, Y., Krowarsch, D., Robinson, C. V, Otlewski, J., Grankowski, N.. and Tchorzewski, M. (2010). Biophysical properties of the eukaryotic ribosomal stalk. Biochemistry 49, 924-933.

50. Griaznova, O., and Traut, R.R. (2000). Deletion of C-terminal residues of Escherichia coli ribosomal protein L10 causes the loss of binding of one L7/L12 dimer: ribosomes with one L7/L12 dimer are active. Biochemistry 39, 4075-4081.

51. Gudkov, A.T. (1997). The L7/L12 ribosomal domain of the ribosome: structural and functional studies. FEBS Lett. 407, 253-256.

52. Gudkov, A.T., and Behlke, J. (1978). The N-terminal sequence protein of L7/L12 is responsible for its dimerization. FEBS J. 90, 309-312.

53. Gudkov, A.T., and Bubunenko, M.G. (1989). Conformational changes in ribosomes upon interaction with elongation factors. Biochimie 71, 779-785.

54. Gudkov, A.T., and Gongadze, G.M. (1984). The L7/L12 proteins change their conformation upon interaction of EF-G with ribosomes. FEBS Lett. 176, 32-36.

55. Gudkov, A.T., Tumanova, L.G., Venyaminov, S.Y., and Khechinashvilli, N.N. (1978). Stoichiometry and properties of the complex between ribosomal proteins L7 and L10 in solution. FEBS Lett. 93, 215-218.

56. Gudkov, A.T., Tumanova, L.G., Gongadze, G.M., and Bushuev, V.N. (1980). Role of different regions of ribosomal proteins L7 and L10 in their complex formation and in the interaction with the ribosomal 50S subunit. FEBS Lett. 109, 34-38.

57. Gudkov, A.T., Gongadze, G.M., Bushuev, V.N., and Okon, M.S. (1982). Proton nuclcar magnetic resonance study of the ribosomal protein L7/L12 in situ. FEBS Lett. 138, 229-232.

58. Hagiya, A., Naganuma, T., Maki, Y., Ohta, J., Tohkairin, Y., Shimizu, T., Nomura, T., Hachimori, A., and Uchiumi, T. (2005). A mode of assembly of P0, PI, and P2 proteins at the GTPase-associated center in animal ribosome: in vitro analyses with P0 truncation mutants. J. Biol. Chem. 280, 39193-39199.

59. Han, M.-J., Cimen, H„ Miller-Lee, J.L., Koc, H., and Koc, E.C. (2011). Purification of human mitochondrial ribosomal L7/L12 stalk proteins and reconstitution of functional hybrid ribosomes in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 78, 48-54.

60. Hardy, S.J.S. (1975). The stoichiometry of the ribosomal proteins of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 140, 253-274.

61. Harms, J., Schluenzen, F., Zarivach, R., Bashan, A., Gat, S., Agmon, I., Bartels, H., and Yonath, A. (2001). High resolution structure of the large ribosomal subunit from a mesophilic eubacterium. Cell 107, 679-688.

62. Harms, J.M., Wilson, D.N., Schluenzen, F., Connell, S.R., Stachelhaus, T., Zaborowska, Z., Spahn, C.M.T., and Fucini, P. (2008). Translational regulation via LI 1: molecular switches on the ribosome turned on and off by thiostrepton and micrococcin. Mol. Cell 30, 26-38.

63. Helgstrand, M., Mandava, C.S., Mulder, F.A.A., Liljas, A., Sanyal, S., and Akke, M. (2007). The ribosomal stalk binds to translation factors IF2, EF-Tu, EF-G and RF3 via a conserved region of the L12 C-terminal domain. J. Mol. Biol. 365, 468-479.

64. Highland, J.II., and Howard, G.A. (1975). Assembly of ribosomal proteins L7, L10, LI 1, and LI2 on the 50S subunit of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 250, 831-834.

65. Hiroaki, I., Hiroshi, N., and Hiroto, O. (1990). High efficiency transformation of Escherihia coli with plasmids. Gene 96, 23-28.

66. Hooft, R.W.W., Vriend, G., Sander, C., and Abola, E.E. (1996). Errors in protein structures. Nature 381, 272.

67. Huang, C., Mandava, C.S., and Sanyal, S. (2010). The ribosomal stalk plays a key role in IF2-mediated association of the ribosomal subunits. J. Mol. Biol. 399, 145-153.

68. Iben, J.R., and Draper, D.E. (2008). Specific interactions of the L10-(L12)4 ribosomal protein complex with mRNA, rRNA, and LI 1. Biochemistry 10, 2721-2731.

69. Ilag, L.L., Videler, H., McKay, A.R., Sobott, F., Fucini, P., Nierhaus, K.H., and Robinson, C. V (2005). Heptameric (L1 2)g/L 10 rather than canonical pentameric complexes are found by tandem MS of intact ribosomes from thermophilic bacteria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 8192-8197.

70. Ilin, S., Hoskins, A., Ohlenschlager, O., Jonker, H.R.A., Schwalbe, H., and Wohnert, J. (2005). Domain reorientation and induced fit upon RNA binding: solution structure and dynamics of ribosomal protein LI 1 from Thermotoga maritima. ChemBioChem 6, 1611—1618.

71. Ito, K., Honda, T., Suzuki, T., Miyoshi, T., Murakami, R., Yao, M., and Uchiumi, T. (2014). Molecular insights into the interaction of the ribosomal stalk protein with elongation factor la. Nucleic Acids Res. 42, 14042-14052.

72. Johnsen, M., Christensen, T., Dennis, P.P., and Fiil, N.P. (1982). Autogenous control: ribosomal protein L10-L12 complex binds to the leader sequence of its mRNA. EMBO J. 1, 999-1004.

73. Jonker, H.R.A., Ilin, S., Grimm, S.K., Wohnert, J., and Schwalbe, II. (2007). LI 1 domain rearrangement upon binding to RNA and thiostrepton studied by NMR spectroscopy. Nucleic Acids Res. 35, 441^54.

74. Kabsch, W. (2010). XDS. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 66, 125-132.

75. Kaltschmidt, E., and Wittmann, H.G. (1970). Ribosomal proteins, XII. Number of proteins in small and large ribosomal subunits of Escherichia coli as determined by two-dimensional gel electrophoresis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 67, 1276-1282.

76. Kar, E.G., and Aune, K.C. (1981). Solution behavior of proteins L7/L12 from the 50S ribosomal subunit of Escherichia coli. Biochemistry 20, 4638-4646.

77. Kavran, J.M., and Steitz, T.A. (2007). Structure of the base of the L7/L12 stalk of the Haloarcula marismortui large ribosomal subunit: analysis of LI 1 movements. J. Mol. Biol. 371, 1047-1059.

78. Kazemie, M. (1976). Binding of aminoacyl-tRNA to reconstituted subparticles of Escherichia coli large ribosomal subunits. Eur. J. Biochem. 67, 373-378.

79. Kirsebom, L.A., and Isaksson, L.A. (1985). Involvement of ribosomal protein L7/L12 in control of translational accuracy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 717-721.

80. Klein, D.J., Schmeing, T.M., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2001). The kink-turn: A new RNA secondary structure motif. EMBO J. 20, 4214-4221.

81. Klein, D.J., Moore, P.B., and Steitz, T.A. (2004). The roles of ribosomal proteins in the structure assembly, and evolution of the large ribosomal subunit. J. Mol. Biol. 340, 141-177.

82. Klinge, S., Voigts-Hoffmann, F., Leibundgut, M., Arpagaus, S., and Ban, N. (2011). Crystal structure of the eukaryotic 60S ribosomal subunit in complex with initiation factor. Science 334, 941-948.

83. Koteliansky, V.E., Domogatsky, S.P., and Gudkov, A.T. (1978). Dimer state of protein L7/L12 and EF-G-dependent reactions on ribosomes. FEBS J. 90, 319-323.

84. Kravchenko, O., Mitroshin, I., Nikonov, S., Piendl, W., and Garber, M. (2010). Structure of a two-domain N-terminal fragment of ribosomal protein L10 from Methanococcus jannaschii reveals a specific piece of the archaeal ribosomal stalk. J. Mol. Biol. 399, 214—220.

85. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

86. Lake, J.A. (1976). Ribosome structure determined by electron microscopy of Escherichia coli small subunits, large subunits and monomeric ribosomes. J. Mol. Biol. 105, 131-159.

87. Lalioti, V.S., Remacha, M., and Ballesta, J.P.G. (2002). Characterization of interaction sites in the Saccharomyces cerevisiae ribosomal stalk components. Mol. Microbiol. 46, 719-729.

88. Laskowski, R.A., MacArthur, M.W., Moss, D.S., and Thornton, J.M. (1993). PROCHECK: A program to check the stereochemical quality of protein structures. J. Appl. Crystallogr. 26, 283-291.

89. Lee, K.-M., Yu, C.W.-H., Chan, D.S.-B., Chiu, T.Y.-H., Zhu, G., Sze, K.-H., Shaw, P.-C., and Wong, K.-B. (2010). Solution structure of the dimerization domain of ribosomal protein P2 provides insights for the structural organization of eukaryotic stalk. Nucleic Acids Res. 38, 5206-5216.

90. Lee, K.-M., Yu, C.W.-IL, Chiu, T.Y.-H., Sze, K.-II., Shaw, P.-C., and Wong, K.-B. (2012). Solution structure of the dimerization domain of the eukaryotic stalk P1/P2 complex reveals the structural organization of eukaryotic stalk complex. Nucleic Acids Res. 40, 31723182.

91. Lee, K.-M., Yusa, K., Chu, L.-O., Yu, C.W.-H., Oono, M., Miyoshi, T., Ito, K., Shaw, P.C., Wong, K.-B., and Uchiumi, T. (2013). Solution structure of human P1-P2 heterodimer provides insights into the role of eukaryotic stalk in recruiting the ribosome-inactivating protein trichosanthin to the ribosome. Nucleic Acids Res. 41, 8776-8787.

92. Leijonmarck, M., and Liljas, A. (1987). Structure of the C-terminal domain of the ribosomal protein L7/L12 from Escherichia coli at 1.7 A. J. Mol. Biol. 195, 555-580.

93. Leijonmarck, M., Eriksson, S., and Liljas, A. (1980). Crystal structure of a ribosomal component at 2.6 A resolution. Nature 286, 824-826.

94. Liao, D., and Dennis, P.P. (1994). Molecular phylogenies based on ribosomal protein LI 1, LI, L10, and L12 sequences. J. Mol. Evol. 38, 405^119.

95. Maki, Y., Hashimoto, T., Zhou, M., Naganuma, T., Ohta, J., Nomura, T., Robinson, C. V, and Uchiumi, T. (2007). Three binding sites for stalk protein dimers are generally present in ribosomes from archaeal organism. J. Biol. Chem. 282, 32827-32833.

96. Matthews, B.W. (1968). Solvent content of protein crystals. J. Mol. Biol. 33, 491^197.

97. McCaughan, K.K., Ward, C.D., Trotman, C.N.A., and Tate, W.P. (1984). The ribosomal binding domain for the bacterial release factors RF-1, RF-2 and RF-3. FEBS J. 175, 90-94.

98. Mochizuki, M., Kitamyo, M., Miyoshi, T., Ito, K., and Uchiumi, T. (2012). Analysis of chimeric ribosomal stalk complexes from eukaryotic and bacterial sources: structural features responsible for specificity of translation factors. Genes to Cells 77, 273-284.

99. Moller, W., Schrier, P.I., Maassen, J.A., Zantema, A., Schop, E., Reinalda, II., Cremers, A.F.M., and Mellema, J.E. (1983). Ribosomal proteins of Escherichia coli localization and possible molecular mechanism in translation. J. Mol. Biol. 163, 553-573.

100. Murshudov, G.N., Vagin, A.A., and Dodson, EJ. (1997). Refinement of macromolecular structures by the maximum-likelihood method. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. D53, 240255.

101. Murshudov, G.N., Skubak, P., Lebedev, A.A., Pannu, N.S., Steiner, R.A., Nicholls, R.A., Winn, M.D., Long, F., and Vagin, A.A. (2011). REFMAC5 for the refinement of macromolecular crystal structures. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 67, 355-367.

102. Naganuma, T., Shiogama, K., and Uchiumi, T. (2007). The N-terminal regions of eukaryotic acidic phosphoproteins PI and P2 are crucial for heterodimerization and assembly into the ribosomal GTPase-associated center. Genes to Cells 12, 501-510.

103. Naganuma, T., Nomura, N., Yao, M., Mochizuki, M., Uchiumi, T., and Tanaka, I. (2010). Structural basis for translation factor recruitment to the eukaryotic/archaeal ribosomes. J. Biol. Chem. 285, 4747-4756.

104. Nomura, N., Honda, T., Baba, K., Naganuma, T., Tanzawa, T., Arisaka, F., Noda, M., Uchiyama, S., Tanaka, I., Yao, M., el al. (2012). Archaeal ribosomal stalk protein interacts with translation factors in a nucleotide-independent manner via its conserved C terminus. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, 3748-3753.

105. Nomura, T., Nakano, K., Maki, Y., Naganuma, T., Nakashima, T., Tanaka, I., Kimura, M., Hachimori, A., and Uchiumi, T. (2006). In vitro reconstitution of the GTPase-associated centre of the archaebacterial ribosome: the functional features observed in a hybrid form with Escherichia coli 50S subunits. Biochem. J. 396, 565-571.

106. Nusspaumer, G., Remacha, M., and Ballesta, J.P. (2000). Phosphorylation and N-terminal region of yeast ribosomal protein PI mediate its degradation, which is prevented by protein P2. EMBO J. 19, 6075-6084.

107. Oleinikov, A.V., Jokhadze, G.G., and Traut, R.R. (1998). A single-headed dimer of Escherichia coli ribosomal protein L7/L12 supports protein synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 4215—4218.

108. Olson, H.M., Tewari, D.S., Traut, R.R., and Glitz, D.G. (1986). Localization of two epitopes of protein L7/L12 to both the body and stalk of the large ribosomal subunit. J. Biol. Chem. 261, 6924-6932.

109. Pettersson, I., and Kurland, C.G. (1980). Ribosomal protein L7/L12 is required for optimal translation. Biochemistry 77, 4007-4010.

110. Pettersson, I., and Liljas, A. (1979). The stoichiometry and reconstruction of a stable protein complex from Escherichia coli ribosomes. FEBS Lett. 98, 139-144.

111. Pettersson, I., Hardy, S.J.S., and Liljas, A. (1976). The ribosomal protein L8 is a complex of L7/L12 and L10. FEBS Lett. 64, 135-138.

112. Ramagopal, S., and Subramanian, A.R. (1974). Alteration in the acetylation level of ribosomal protein LI 2 during growth cycle of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 2136-2140.

113. Rosendahl, G., and Douthwaite, S. (1993). Ribosomal proteins LI 1 and L10 (L12)4 and the antibiotic thiostrepton interact with overlapping regions of the 23S rRNA backbone in the ribosomal GTPase centre. J. Mol. Biol. 234, 1013-1020.

114. Sanchez-Madrid, F., Vidales, F.J., and Ballesta, J.P.G. (1981). Functional role of acidic ribosomal poteins. Interchangeability of proteins from bacterial and cukaryotic cells. Biochemistry 20, 3263-3266.

115. Sander, G., Marsh, R.C., and Parmeggiani, A. (1972). Isolation and characterization of two acidic proteins from the 50S subunit required for GTPase activities of both EF-G and EF-Tu. Biochem. Biophys. Res. Commun. 47, 866-873.

116. Sander, G., Marsh, R.C., Voigt, J., and Parmeggiani, A. (1975). A comparative study of the 50S ribosomal subunit and several 50S subparticles in EF-T-and EF-G-dependent activities. Biochemistry 14, 1805-1814.

117. Santos, C., and Ballesta, J.P.G. (1994). Ribosomal protein P0, contrary to phosphoproteins PI and P2, is required for ribosome activity and Saccharomyces cerevisiae viability. J. Biol. Chem .269, 15689-15696.

118. Santos, C., Remacha, M., and Ballesta, J.P.G. (2004). Ribosomal P0 protein domain involved in selectivity of antifungal sordarin derivatives. Antimicrob. Agents Chemother. 48, 2930-2936.

119. Schmidt, F.J., Thompson, J., Lee, K., Dijk, J., and Cundliffe, E. (1981). The binding site for ribosomal protein LI 1 within 23S ribosomal RNA of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 256, 12301-12305.

120. Schrier, P.I., and Moller, W. (1975). The involvement of 50S ribosomal protein LI 1 in the EF-G dependent GTP hydrolysis of E. coli ribosomes. FEBS Lett. 54, 130-134.

121. Shcherbakov, D„ Dontsova, M., Tribus, M., Garber, M„ and Piendl, W. (2006). Stability of the "LI2 stalk" in ribosomes from mesophilic and (hyper)thermophilic Archaea and Bacteria. Nucleic Acids Res. 34, 5800-5814.

122. Shimizu, T., Nakagaki, M., Nishi, Y., Kobayashi, Y., Hachimori, A., and Uchiumi, T. (2002). Interaction among silkworm ribosomal proteins PI, P2 and P0 required for functional protein binding to the GTPase-associated domain of 28S rRNA. Nucleic Acids Res. 30, 26202627.

123. Spahn, C.M.T., Beckmann, R., Eswar, N., Penczek, P.A., Sali, A., Blobel, G., and Frank, J. (2001). Structure of the 80S ribosome from Saccharomyces cerevisiae — tRNA-ribosome and subunit-subunit interactions. Cell 107, 373-386.

124. Stark, H., Rodnina, M. V, Rinke-appel, J., and Heel, M. Van (1997). Visualization of elongation factor Tu on the Escherichia coli ribosome. Nature 389, 403-406.

125. Stark, M.J.R., Cundliffe, E., Dijk, J., and Stoeffler, G. (1980). Functional homology between E. coli ribosomal protein LI 1 and B. megaterium protein BM-L11. Mol. Gen. Genet. 15, 11-15.

126. Stoffler-Meilicke, M., and Stoffler, G. (1991). The binding site of ribosomal protein L10 in Eubacteria and Archaebacteria is conserved: Reconstitution of chimeric 50S subunits. Biochimie 73, 797-804.

127. Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., and Dubendorff, J.W. (1990). Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89.

128. Szick, K., Springer, M., and Bailey-Serres, J. (1998). Evolutionary analyses of the 12-kDa acidic ribosomal P-proteins reveal a distinct protein of higher plant ribosomes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95, 2378-2383.

129. Tate, W.P., Dognin, M.J., Noah, M., Stoffler-Meilicke, M., and Stoffler, G. (1984). The NH2-terminal domain of Escherichia coli ribosomal protein Lll. J. Biol. Chem. 259, 73177324.

130. Tchorzewski, M., Boldyreff, B., Issinger, O.G., and Grankowski, N. (2000a). Analysis of the protein-protein interactions between the human acidic ribosomal P-proteins: Evaluation by the two hybrid system. Int. J. Biochem. Cell Biol. 32, 737-746.

131. Tchorzewski, M., Boguszewska, A., Dukowski, P., and Grankowski, N. (2000b). Oligomerization properties of the acidic ribosomal P-proteins from Saccharomyces cerevisiae: Effect of PI A protein phosphorylation on the formation of the PIA-P2B hetero-complex. Biochim. Biophys. Acta - Mol. Cell Res. 1499, 63-73.

132. Terhorst, C., Moller, W., Laursen, R., and Wittmann-Liebold, B. (1972). Amino acid sequence of a 50S ribosomal protein involved in both EF-G and EF-T dependent GTP-hydrolysis. FEBS Lett. 28, 325-328.

133. Terwilliger, T.C., Adams, P.D., Read, R.J., McCoy, A.J., Moriarty, N.W., Grosse-Kunstleve, R.W., Afonine, P. V., Zwart, P.H., and Hung, LAV. (2009). Decision-making in structure solution using Bayesian estimates of map quality: The PHENIX AutoSol wizard. Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr. 65, 582-601.

134. Thompson, J., Cundliffe, E., and Stark, M. (1979). Binding of thiostrepton to a complex of 23S rRNA with ribosomal protein LI 1. FEBS J. 98, 261-265.

135. Thompson, J., Musters, W., Cundliffe, E., and Dahlberg, A.E. (1993). Replacement of the Lll binding region within E. coli 23S ribosomal RNA with its homologue from yeast: in vivo and in vitro analysis of hybrid ribosomes altered in the GTPase centre. EMBO J. 12, 1499-1504.

136. Trakhanov, S., Yusupov, M., Shirokov, V., Garber, M., Mitschler, A., Ruff, M., Thierry, J.C., and Moras, D. (1989). Preliminary X-ray investigation of 70S ribosome crystals from Thermus thermophilus. J. Mol. Biol. 209, 327-328.

137. Uchiumi, T., and Kominami, R. (1997). Binding of mammalian ribosomal protein complex P0*P1*P2 and protein L12 to the GTPase-associated domain of 28S ribosomal RNA and effect on the accessibility to anti-28S RNA autoantibody. J. Biol. Chem. 272, 3302-3308.

138. Uchiumi, T., Kikuchi, M., Terao, K., Iwasaki, K., and Ogata, K. (1986). Cross-linking of elongation factor 2 to rat-liver ribosomal proteins by 2-iminothiolane. Eur. J. Biochem. 156, 3748.

139. Uchiumi, T., Albert, J.W., and Traut, R.R. (1987). Topography and stoichiometry of acidic proteins in large ribosomal subunits from Artemia salina as determined by crosslinking. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84, 5580-5584.

140. Uchiumi, T., Traut, R.R., and Kominami, R. (1990). Monoclonal antibodies against acidic phosphoproteins P0, PI, and P2 of eukaryotic ribosomes as functional probes. J. Biol. Chem. 265, 89-95.

141. Uchiumi, T., Mori, K., Nomura, T., and Hachimori, A. (1999). Replacement of L7/L12-L10 protein complex in Escherichia coli ribosomes with the eukaryotic counterpart changes the specificity of elongation factor binding. J. Biol. Chem. 274, 27578-27582.

142. Uchiumi, T., Honma, S., Endo, Y., and Hachimori, A. (2002a). Ribosomal proteins at the stalk region modulate functional rRNA structures in the GTPase center. J. Biol. Chem. 277, 41401—41409.

143. Uchiumi, T., Honma, S., Nomura, T., Dabbs, E.R., and Hachimori, A. (2002b). Translation elongation by a hybrid ribosome in which proteins at the GTPase center of the Escherichia coli ribosome are replaced with rat counterparts. J. Biol. Chem. 277, 3857-3862.

144. Wahl, M.C., Bourenkov, G.P., Bartunik, H.D., and Huber, R. (2000). Flexibility, conformational diversity and two dimerization modes in complexes of ribosomal protein LI 2. EMBO J. 19, 174-186.

145. Wimberly, B.T., Guymon, R., McCutcheon, J.P., White, S.W., and Ramakrishnan, V. (1999). A detailed view of a ribosomal active site: The structure of the LI 1-RNA complex. Cell 97, 491-502.

146. Wong, K.-P., and Paradies, H.H. (1974). Shape properties of proteins L7 and L12 from E. coli ribosomes. Biochem. Biophys. Res. Commun. 61, 178-184.

147. Xing, Y., and Draper, D.E. (1996). Cooperative interactions of RNA and thiostrepton antibiotic with two domains of ribosomal protein LI 1. Biochemistry 35, 1581-1588.

148. Yonath, A., and Wittmann, H.G. (1988). Approaching the molecular structure of ribosomes. Biophys. Chem. 29, 17-29.

149. Yonath, A., Harms, J., Hansen, H.A.S., Bashan, A., Schluenzen, F., Levin, I., Koelln, I., Tocilj, A., Agmon, I., Peretz, ML, et al. (1998). Crystallographic studies on the ribosome, a large macromolecular assembly exhibiting severe nonisomorphism, extreme beam sensitivity and no internal symmetry. Acta Crystallogr. A A54, 945-955.

150. Yusupov, M.M., Yusupova, G.Z., Baucom, A., Lieberman, K., Earnest, T.N., Cate, J.H.D., and Noller, H.F. (2001). Crystal structure of the ribosome at 5.5 A resolution. Science 292, 883896.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность своим научным руководителям, Марине Борисовне Гарбер и Азату Габдрахмановичу Габдулхакову, за чуткое руководство, нескончаемый интерес к работе, за ценнейшие советы и рекомендации, сделанные как во время выполнения, так и в процессе подготовки настоящей диссертационной работы.

Искренне признателен своему первому учителю, Олесе Кравченко, которая помогла мне в освоении биохимических методов.

Хочу поблагодарить всех сотрудников лаборатории структурных исследований аппарата трансляции и группы структурных исследований рибосомных белков за помощь в совместной работе и доброжелательную атмосферу.

Безмерно благодарен своим родителям и своей жене Валентине за любовь, поддержку и понимание.