Изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе молекулярно-биологического метода T-RFLP с целью разработки способов ее оптимизации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Ильина, Лариса Александровна

• Ильина, Лариса Александровна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ильина, Лариса Александровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности пищеварения у жвачных животных

1.2. Экосистема рубца

1.2.1. Симбиоз между микроорганизмами рубца и животным

1.2.2. Условия, необходимые для роста и размножения микроорганизмов в рубце

1.2.3. Микроорганизмы рубца

1.2.4. Взаимодействие между микроорганизмами в рубце

1.3. Возможность управления процессами ферментации в рубце

1.4. Методы изучения микробиоценоза рубца жвачных животных

1.4.1. Традиционные микробиологические методы

1.4.2. Метагеномный анализ микробных сообществ

1.4.3. Проблемы получения качественной ДНК для метагеномных исследований

1.4.4. Молекулярно-генетические методы для изучения рубца жвачных

1.4.5. Т-БО^ЬР-анализ

1.5. Заключение по обзору литературы

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Методики проведения научно-хозяйственных экспериментов

2.1.1. Изучение суточной динамики микробного сообщества рубца бычков

2.1.2. Исследование возрастных изменений микробного сообщества рубца телят

2.1.3. Анализ микробиоценоза рубца коров в производственных условиях

2.2. Методики лабораторных исследований

2.2.1. Химический анализ кормов, кала и мочи

2.2.2. Химический анализ проб рубцового содержимого

2.3. Методы культивирования и количественного учета микроорганизмов

2.4. Молекулярно-генетические методы

2.4.1. Т-ЯБЬР-анализ

2.4.2. Секвенирование

2.5. Статистическая обработка материалов исследований

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.'

3.1. Модификация Т-КБЬР-анализа для изучения микробиоценоза рубца жвачных животных

3.1.1. Выбор метода выделения и очистки геномной ДНК

3.1.2. Подбор условий амплификации микроорганизмов рубца жвачных

3.1.3. Выбор эндонуклеаз рестрикции для Т-КТЪР-анализа

3.1.4. Анализ воспроизводимости методики Т-КРЬР

3.1.5. Анализ результатов Т-ЫБЪР

3.1.6. Сравнительный анализ результатов исследования микробного сообщества рубца бычков с помощью традиционных методов микробиологии и Т-КРЬР

3.2. Результаты исследования динамики микробного сообщества рубца жвачных животных в течение суток и влияния на нее пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобактерин-8

3.2.1. Интенсивность течения ферментативных процессов в рубце бычков

3.2.2. Результаты анализа суточной динамики микробиоценоза рубца бычков

3.3. Исследование возрастных изменений микробного сообщества рубца жвачных животных

3.4. Анализ микробиоценоза рубца коров в производственных условиях

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БЭВ - безазотистые экстрактивные вещества; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; л - литр; M - моль;

ME - массовые эксиваленты;

мг - миллиграм;

мин - минуты;

мкг - микрограм;

мкл - микролитр;

мл - миллилитр;

КАА - крахмало-аммииачный агар;

ЛЖЕС - летучие жирные кислоты;

МПА - мясопептонный агар;

нг - нанограмм;

об/мин - оборотов в минуту;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

ПЭГ - полиэтиленгликоль;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

САМ - сусло-агар с мелом;

DGGE - денатурирующий градиентный гель-электрофорез; FISH - флуоресцентная гибридизация «ш situ»;

T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism) - полиморфизм длин терминальных рестрикционных фрагментов; TGGE - температурный градиентный гель-электрофорез.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе молекулярно-биологического метода T-RFLP с целью разработки способов ее оптимизации»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. На протяжении последних десятилетий изучение микроорганизмов рубца, их роли в пищеварении и обмене веществ в многокамерном желудке жвачных вызывает повышенный интерес, как ученых, так и практиков - животноводов, поскольку результаты этих исследований способствуют организации более рационального и полноценного кормления животных и эффективного использования кормов для повышения продуктивности (Пивняк, Тараканов, 1982; Георгиевский, 1990; Прохоренко, 2006; Стреко-зов и др., 2006; Романенко, 2007; Эрнст, Зиновьева, 2008; Hungate, 1966).

Основные знания о микрофлоре рубца и ее функциях были получены с помощью классических методов микробиологии (Bryant, 1959; Hungate, 1966; Dehority, Orpin, 1988; Hespell et al., 1997). В настоящее время исследователями (Dehority, 2003) описан ряд ограничений и недостатков данных методов, в том числе невозможность правильного подсчета микробов ввиду их роста на питательных средах культивирования не из одной клетки, а из их скопления (Wells, Russell, 1996), разного количества микроорганизмов, выявляемых при микроскопировании и культивировании на искусственных средах (Leedle et al, 1982; Wells, Russell, 1996; Zoetendal et al., 2004). Классификация бактерий рубца, основанная на изучении фенотипических характеристик и биохимических тестов, также не является достаточно точной. Кроме того, зарубежными специалистами недавно было показано, что значительная часть микроорганизмов рубца представлена некультивируемыми видами (нежизнеспособными при культивировании на существующих питательных средах), однако активными в процессах рубцовой ферментации. Установлено, что в настоящее время не существует ни одной среды, на которой возможно поддержание роста всех жизнеспособных бактерий рубца. Кроме того, известны виды микроорганизмов, для которых применяемые условия культивирования не подходят или которые вступили в некультивируемое состояние или никогда ранее не культивируемые виды вследствие отсутствия подходящих методов (Amann et al.,

1995). Поэтому многие ученые считают, что представления, основанные на традиционных микробиологических методах, не отражают всей полноты процессов ферментации, происходящих в рубце и взаимодействия микроорганизмов (Amann et al., 1992; Wintzingerode et al., 1997; Zoetendal et al., 1998; Krause et al., 2003; Shin, 2004).

Развитие метагеномных методов делает возможным дальнейшее изучение разнообразия микроорганизмов без ограничений традиционных методов микробиологии - т.е. минуя стадию культивирования. Метагеномные методы изучения микробных сообществ основаны на анализе разнообразия консервативных элементов генома микроорганизмов и часто включают в себя стадии клонирования общей (тотальной) ДНК всех микроорганизмов, выделенной из образца, в вектор и затем анализ полученных библиотек клонов (Эрнст, Зиновьева, 2008; Handelsman, 2004). Для определения вида микроорганизма нук-леотидная последовательность сравнивается с последовательностями из баз данных (Stackebrandt, Goebel, 1994; Amann et al., 1995; Madden et al., 1996; Ta-jima et al., 1999; Nelson et al., 2003). Наиболее распространенным является анализ, основанный на изучении вариабельных фрагментов консервативных элементов генов 16S/18S рРНК. Выбор генов 16S/18S рРНК в качестве маркеров в филогенетических исследованиях обусловлен, прежде всего, их повсеместной распространенностью во всем живом мире и доступностью огромных массивов данных о структуре генов рРНК у самых разнообразных микроорганизмов.

Несмотря на широкий спектр возможностей, составление и анализ библиотек клонированных фрагментов генов 16S/18S рРНК микроорганизмов является достаточно трудоемким и дорогостоящим. Кроме того, часто перед исследователем стоит задача не просто описать структуру микробного сообщества, но и проследить, как изменяется эта структура с течением времени в результате какого-либо воздействия. Одним из наиболее перспективных на сегодняшний день является T-RFLP (Terminal restriction fragment length polymorphism) - молекулярно-биологический метод для

изучения структуры микробной экосистемы, основанный на анализе полиморфизма длин амплифицированных рестрикционных фрагментов ДНК микроорганизмов. Сущность данного метода заключается в амплификации целевого гена (например, гена 16S рРНК) с определенным набором праймеров, один из которых мечен флуоресцентной меткой, рестрикции полученного продукта с помощью частощепящих рестриктаз, с последующим определением количества терминальных рестрикционных фрагментов. Интенсивность флюоресценции каждого пика отражает относительное количество (долю) каждого филотипа в микробном сообществе. Для анализа бактериальных сообществ созданы компьютерные программы, позволяющие детальную расшифровку T-RFLP - профилей, результатом которых является не только установление количества и относительной численности доминирующих групп микроорганизмов, но и их таксономической принадлежности, например, программа FragSort или другие (March et al., 2000). Таким образом, метод T-RFLP является удобным методом мониторинга динамики структуры микробного сообщества. В результате возможно выявление групп микроорганизмов, оказывающих непосредственное влияние на продуктивность животных, а также выявлять патогенные микроорганизмы.

Цель исследований. Изучить состав микрофлоры рубца крупного рогатого скота, его изменения в течение суток, в процессе роста и развития животных, а также под действием пробиотических препаратов на основе молеку-лярно-биологического метода T-RFLP для оценки возможности использования данного подхода в разработке способов его оптимизации.

Задачи исследований:

- модифицировать методику T-RFLP для изучения микрофлоры рубца крупного рогатого скота;

- сравнить результаты классических методов микробиологии и T-RFLP-анализа при изучении микрофлоры рубца жвачных животных;

- изучить закономерности суточной и возрастной динамики микробного сообщества рубца бычков с помощью T-RFLP-анализа;

- установить особенности микробиоценоза рубца дойных коров в зависимости от уровня продуктивности и состояния здоровья;

- оценить влияние пробиотических препаратов на микрофлору рубца крупного рогатого скота.

Научная новизна исследований. Впервые проведен комплексный анализ таксономической структуры микробного сообщества рубца крупного рогатого скота на основе модифицированного молекулярно-биологического метода Т-РРЪР, в результате чего было выявлено более 200 филотипов бактерий, архей и грибов, в том числе некультивируемых, а также установлена возможная роль данных микроорганизмов в процессах пищеварения и обмена веществ в рубце жвачных. Изучены изменения во всех компонентах микробного сообщества (бактерии, археи, грибы), происходящие в течение суток, связанные с кормлением животных. Установлено, что рост и развитие пищеварительной системы животных сопровождается сменой доминирующих таксономических групп в составе бактерий, архей и грибов. В условиях рубцовой экосистемы проанализировано действие пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобактерин-Б на разные физиологические группы микроорганизмов.

Выявлена связь между физиолого-биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных и количеством микроорганизмов в рубце крупного рогатого скота.

Практическая значимость работы. С использованием модифицированного метода Т-КРЪР в рубце крупного рогатого скота выявлено более 200 филотипов микроорганизмов (бактерий, архей и грибов), установлена их связь с физиолого-биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных, что позволяет разработать способы регулирования микробиологических процессов в рубце, направленных на повышение эффективности использования корма жвачными животными, снижение заболеваемости и увеличение продуктивности животных.

Материалы исследований были использованы при разработке методических рекомендаций «Использование пробиотика Целлобактерин-Т в кормлении жвачных животных» (Дубровицы, ВИЖ, 2011).

Предложения производству.

Данные комплексного исследования микробиоценоза рубца крупного рогатого скота с помощью Т-КРЪР-анализа позволяют рекомендовать использование данного метода для разработки оптимальных методов повышения эффективности мероприятий, направленных на снижение заболеваемости животных и на увеличение продуктивности животных.

Результаты, полученные в данной работе позволяют рекомендовать про-биотики Целлобактерин-Т и Целлобактерин-Б для включения в рационы бычков на откорме по 10 г. на голову в сутки.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлены:

- на Международной конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства и пути их решения» (Дубровицы, октябрь 2008 г.);

- на 13 и 14 Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука 21 века» (Пущино, 2008-2009 г.),

- на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы заготовки, хранения и рационального использования кормов» (Москва, 19-20 августа 2009 г.);

- на пятой Международной научной конференции «Актуальные проблемы биологии в животноводстве» (Боровск, 14-16 сентября 2010 г.);

- на пятой Международной конференции «Современное производство комбикормов «Комбикорма - 2010» (Москва, 22-24 ноября 2010).

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 13 научных статей, в том числе три в изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ.

Положения, выносимые на защиту:

- изучение микрофлоры рубца крупного рогатого скота на основе модифицированного метода Т-КБЬР позволяет идентифицировать более 200 фило-типов микроорганизмов (бактерий, архей и грибов), в том числе некультиви-руемых, а также установить их возможную роль в процессах пищеварения и обмена веществ в рубце жвачных;

- установлена связь между физиолого-биохимическими показателями пищеварения (рН, количество ЛЖК, аммиака), продуктивностью, состоянием здоровья животных и содержанием микроорганизмов в рубце крупного рогатого скота.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 197 страницах компьютерной верстки, содержит 40 таблиц, 18 рисунков, структурно включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, предложения производству и список использованной литературы, включающий 342 источника, в том числе 303 на иностранном языке.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Особенности пищеварения у жвачных животных

Жвачные животные занимают особое место среди других растительноядных. Это, прежде всего, связано с их огромной хозяйственной важностью. Кроме того, жвачные отличаются уникальными особенностями функционирования пищеварительного аппарата. Огромную роль в пищеварении жвачных играют микроорганизмы-симбионты (бактерии, грибы, метаногенные ар-хеи, простейшие, бактериофаги) (Георгиевский, 1996; Rüssel, 2002, Church, 1993). Только знание особенностей пищеварения жвачных животных может ориентировать на решение прикладных задач, связанных с их рациональным кормлением (Пивняк, 1982; Hungate, 1996).

К жвачным животным относят крупный рогатый скот, овец, коз, лосей, антилоп, жираф, а также мозоленогих (верблюдов, лам, альпак, гуанако). Жвачные животные имеют самый сложный желудок среди растительноядных млекопитающих, который морфологически и функционально состоит из четырех отделов: рубца, сетки, книжки и сычуга (рис. 1) (Геогиевский, 1990; Russell, Rychlik, 2001). Три первых отдела не имеют желез и составляют в совокупности так называемый преджелудок, где пища подвергается механической и бактериальной обработке (Тараканов, 2006; Weimer et ah, 2009). Сычуг устроен как типичный однокамерный желудок, слизистая оболочка которого содержит железы, выделяющие желудочный (сычужный) сок. У коров массой в 550-650 кг желудок весит 75-125 кг (Георгиевский, 1996; Church, 1993). У взрослой коровы на долю рубца приходится 57%, книжки - 20%, сетки - 7%, сычуга - 11% от общего объема желудка (Георгиевский, 1996; Hungate, 1966).

Тонкая кишка

Прямая кишка

Рис. 1. Пищеварительная система дойной коровы

Двусторонний обмен и транспорт метаболитов между кровью и содержимым преджелудков осуществляется через рубцовую жидкость. В состав рубцовой жидкости входит вода, слюна, аминокислоты, липиды, мочевина, ЛЖК, грубый остаток корма, микроорганизмы. Благодаря постоянному поступлению органических и минеральных веществ с кормами и со слюной, процессам микробиальной ферментации органических соединений, транспорту веществ через стенку преджелудков в содержимом рубца сохраняется слабокислая среда с рН от 6,1 до 6,9 и общая ионная концентрация от 150 до 190 мэкв/л. (Broberg, 1956). На долю жидкой части приходится 67-78% объема, грубого остатка корма - 19 - 30%, бактерий - 1,2 - 3,4%, инфузорий - 1,1 -2,9% (Hungate, 1966).

Соотношение различных частей рубцового содержимого непостоянно и зависит от структуры и характера рациона. Содержимое располагается в рубце послойно и зависит от физических свойств корма, а не от очередности их поступления. В верхней части рубца располагаются газы, в средней - плотные частицы, причем, чем они мельче, тем ниже находятся. Внизу располагается жидкость с небольшой взвесью плотных частиц. Такое трехслойное размеще-

ние рубцового содержимого характерно при регулярном включении в рацион сена. В зависимости от наполненности рубца и промежутков времени между кормлениями соотношение между слоями изменяется, но примерное их расположение всегда сохраняется (Георгиевский, 1990).

Образование у жвачных функциональной связи системы пищеварительного тракта с определенными видами симбионтов требует соответствующей специфики секретируемых пищеварительных соков, и, в первую очередь, слюны (Hungate, 1988). Значение слюны состоит в обеспечении микроорганизмов жидкостью и электролитами, регуляции кислотно-щелочного равновесия рубца, смачивании корма при жевании, обеспечении процессов всасывания и поддержания водного баланса организма, выполнении защитной роли при отравлениях. Количество слюны, ее состав определяются структурой корма, моторикой рубца, интенсивностью жвачки и особенно характером бродильных процессов в рубце, в первую очередь, pH содержимого рубца (оптимум pH в рубце около 6,8) (Preston and Leng, 1987). У коровы в сутки отделяется 90-190 л слюны.

Корм, попадая в рубец, перемешивается с его содержимым благодаря сокращениям стенок и подвергается анаэробной ферментации микроорганизмами. В зависимости от вида корма в нем может содержаться от 40 до 80% углеводов, значительная часть которых представлена нерастворимыми полисахаридами, способных расщепляться до более простых соединений только под действием ферментов, синтезируемых микроорганизмами рубца (Дубинин и др., 1987; Отава, Скорохид, 1992).

В процессе рубцовой ферментации переваривается до 95% простых Сахаров и крахмала, до 54% переваримой клетчатки корма, при этом до 40% потребленной клетчатки переходит в нижние отделы пищеварительного тракта (Медведев, Материкин, 1995; Алиев, 1997). Поступившие в рубец сложные углеводы подвергаются ферментативному гидролизу до ди- и моносахаров, которые в дальнейшем сбраживаются до ЛЖК - уксусной, пропионовой, масляной, молочной, янтарной (Савченко, Мусинко, 1994; Георгиевский, 1990),

при этом образуются аминокислоты, некоторые высшие жирные кислоты, газы (NH3, С02, СН4) и другие вещества (Отава, Скорохид, 1992; Алиев, 1997; Stevenson, Weimer, 2007; Weimer et al., 2009). Ежесуточно в рубце крупного рогатого скота при участии ферментов микробиоты метаболизируется и усваивается до 10 кг. органических веществ (около 6 кг ЛЖК, 2 кг микробиаль-ного белка и др.).

Установлено, что вид корма оказывает существенное влияние на биохимический состав содержимого рубца. Показано, что при концентратном типе кормления наряду с общим повышением концентрации ЛЖК образуется также молочная кислота, которая вызывает резкое уменьшение pH (до 5,3), что сопровождается снижением целлюлозолитической микрофлоры и как следствие - снижением общей численности инфузорий (Hungate, 1966). Снижение pH ниже физиологического порога приводит к нарушению адсорбции Рубцовых метаболитов вследствие гипоксии эпителиальных тканей слизистой оболочки рубца жвачных (Dragulici, 1986). Физиологически оптимальное содержание грубых волокнистых кормов стимулирует процессы пережевывания и слюноотделения, что в свою очередь, нормализует pH рубцового содержимого. На основе этого Аллен (Allen, 1997) предложил создать индекс грубых кормов, который будет соответствовать физиологическим нормам. Следовательно, появляется возможность контролировать рубцовую экосистему и регулировать процессы брожения с целью улучшения продуктивности животных.

Из рубца пища попадает в сетку или отрыгивается в ротовую полость, откуда пища, измельчённая дополнительным разжёвыванием, снова поступает в рубец или направляется в книжку. В сетке пища подвергается механической и химической обработке под действием микроорганизмов. Вследствие энергичного сокращения мускулатуры стенок сетки и движений складок слизистой оболочки измельченный корм отделяется от крупных его частиц и поступает в книжку, а грубые частицы — обратно в рубец. В книжке корм, вторично проглоченный животным после жвачки, окончательно перетирается и

превращается в кашицу, поступающую в сычуг (собственно желудок), который выполняет секреторную функцию. В сычуге под влиянием непрерывно выделяющегося сычужного сока белки расщепляются до пептидов. У телят и ягнят липаза сока расщепляет молочный жир. В сычуге телят содержится про-теолитический фермент — реннин (химозин), вызывающий створаживание казеина, который впоследствии расщепляется. Интенсивность сокоотделения и переваривающая сила сока меняются в зависимости от функциональной нагрузки и вида корма. В сычуг непрерывно поступают и микроорганизмы, которые здесь частично перевариваются, а освободившиеся питательные вещества (белки, аминокислоты, жирные кислоты, углеводы и другие вещества) затем всасываются в кишечнике (Георгиевский, 1990; Шевелев, 2003).

Пищеварительные процессы в желудочно-кишечном тракте новорожденных телят значительно отличаются от аналогичных процессов у взрослых животных. У новорожденных жвачных преджелудки недостаточно развиты в морфологическом и функциональном отношении (по объему рубец, сетка и книжка составляют около половины сычуга). Интенсивный рост преджелуд-ков наблюдается в первые месяцы жизни телят. В годовалом возрасте рубец уже составляет 80% объема сложного желудка.

У новорожденных телят, питающихся молоком, рубец недостаточно заселен микроорганизмами и не принимает участия в процессе гидролиза и сбраживания питательных субстратов. В связи с этим содержание глюкозы и ЛЖК в крови молодняка жвачных, питающихся молоком, аналогично таковому у животных с однокамерным желудком. По мере развития рубца содержание глюкозы в крови жвачных падает более чем в два раза. Параллельно повышается содержание ЛЖК в крови. В процессе развития рубца в нем появляется микрофлора, попадающая в него с водой и кормом. Важным фактором, участвующим в этом процессе, является контакт телят с взрослыми животными и с растительными кормами. При этом анаэробная микрофлора в рубце молодняка обнаруживается уже в первые недели жизни животных, но конкретные сроки зависят от рациона кормления. Так, у телят, которым скармли-

вали заменитель цельного молока, анаэробные грибы практически не находили в течение четырех месяцев после рождения. Развитие микрофлоры отмечалось только после того, как в рацион вводили грубые корма (Тараканов, 1986). По данным Георгиевского (Георгиевский, 1990) достаточно высокая целлюло-золитическая активность отмечается в рубце 2-3 месячных животных, а в 13 недель микрофлора рубца телят похожа на микрофлору взрослого животного.

1.2. Экосистема рубца 1.2.1. Симбиоз между микроорганизмами рубца и животным

Рубец является сложной симбиотической экосистемой, которая включает огромное количество видов различных микроорганизмов - бактерий, грибов, простейших, метаногенных архей, бактериофагов (Hungate, 1966; Church, 1993; Hespell et al., 1997). Биологическая сущность данного симбиоза заключается в том, что микроорганизмы за счет деятельности своих энзиматических систем обеспечивают переработку таких составных частей корма, которые организм хозяина не способен расщеплять (например, клетчатку) и обеспечивают животное питательными веществами, ЛЖК и микробным белком (Rüssel, 2002; Church, 1993). В свою очередь, организм хозяина создает оптимальные условия для жизнедеятельности микроорганизмов, т.е. для их роста и размножения (питательными веществами, температурой окужающей среды и буферный состав окружающей среды) (Rüssel, 2002). В процессе сопряженной эволюции жвачные получили возможность широкого использования энзиматических систем микроорганизмов. При этом функции преджелудков организма-хозяина сводятся в основном к всасыванию питательных веществ и секреции субстанций, регулирующих рост и размножение микроорганизмов (Rüssel, 2002; Church, 1993). Таким образом, микроорганизмы, обитающие в рубце животных, играют важную роль в ферментации углеводов кормов и обеспечивают животное-хозяина питательными веществами (Георгиевский, 1990; Та-

раканов, 2006; Hungate, 1966; Chalupa, 1980; Church, 1993; Owens et al, 1998; Tajima et al, 2001; Rüssel, 2002; Edwards et al, 2004; Mrazek et al, 2006; Skillman et al, 2006; Fernando et al., 2008).

Установлено, что микроорганизмы в рубце разделены на три фракции (Георгиевский, 1990).

• Первая фракция - свободноживущая взвесь микроорганизмов. Эта фракция очень активна в обменном отношении и имеет важное значение в осуществлении связи с внешней средой. Потребленный корм попадает именно в эту фракцию.

• Вторая фракция - микроорганизмы, связанные с частицами корма. Именно в этой фракции происходит интенсивное переваривание клетчатки.

• Третья фракция - популяция микроорганизмов, связанная со стенкой рубца.

Прикрепление микробов к частицам корма играет важную роль, поскольку обеспечивает тесный контакт с субстратом и увеличивает время пребывания микробов в рубце и благодаря этому способствует их выживанию. Ченг и соавторы (Cheng et al., 1979) установили, что между фракциями микроорганизмов существует постоянный обмен.

1.2.2. Условия, необходимые для роста и размножения микроорганизмов в рубце

Микробное сообщество рубца является достаточно хрупкой экосистемой со сложными трофическими связями, адаптированное к условиям рубца и функционирующее по принципу саморегулирующейся системы. В рубце поддерживаются постоянные параметры температуры и pH, осуществляется периодическое поступление питательных веществ, перемешивание субстрата и отток непереваренных остатков корма и метаболитов в нижележащие отделы пищеварительного тракта. Таким образом, рубец можно рассматривать как природный ферментер, в котором за многие тысячелетия существования и эволюции жвачных происходили эволюция и отбор микроорганизмов, спо-

собных не только существовать в нем, но и эффективно сбраживать поступающий в преджелудки корм.

Рост и размножение биомассы микроорганизмов происходит лишь при оптимальных условиях. В результате многочисленных исследований чистых культур микроорганизмов рубца был выделен ряд основных экологических факторов, наиболее важных для их роста и размножения (Russell, Baldwin, 1978; Russell, Hiño, 1985; Kotarski et al., 1992; Goad et al., 1998).

• Температура среды в рубце - +38 - 40°С.

• pH среды - близкая к нейтральной - 6,0 - 7,3.

• Анаэробные условия - основной фактор, ограничивающий рост посторонней микрофлоры в рубце. Анаэробные процессы в рубце поддерживаются с помощью газов, образующихся в процессе брожения, например, двуокиси углерода, метана и следов водорода. При этом некоторое количество кислорода, поступающего в рубец, потребляется факультативными анаэробами.

• Толерантность к большому количеству ЛЖК (около 100-150 мм).

• Высокое осмотическое давление (Warner, Stacy, 1965; Bergen, 1972; Bennink et al., 1978). У жвачных существует механизм поддержания постоянного состава жидкости и электролитов, реагирующий на изменение в осмотическом давлении и объема плазмы во время кормления. Микроорганизмы рубца приспосабливаются к кратковременным изменениям в осмолярности рубцовой жидкости, но скорость их роста in vitro снижается, когда осмоляр-ность культуральной среды увеличивается сверх физиологической нормы.

• Низкий окислительно-восстановительный потенциал. Только микроорганизмы, толерантные к условиям (350 mV) способны существовать в рубце.

• Низкие затраты энергии для поддержания функций.

Считается, что данные свойства микроорганизмов рубца исключают размножение многих аэробных и факультативно-аэробных микроорганизмов. Таким образом, несмотря на постоянное поступление транзитной микрофлоры с кормом, питьевой водой и воздухом, в рубце здоровых животных контаминации микробной экосистемы не происходит, поэтому количество прокариотов

и эукариот, обитающих в рубце здоровых животных, достаточно постоянно (Church, 1993). Всего в рубцовой жидкости обнаружено 1О10-1Ои бактерий, 107-109 архей, 106 простейших, 104-105 анаэробных грибов.

Установлено, что всякое отклонение от оптимальных условий нарушает экосистему рубца, изменяет активность или состав микроорганизмов, что приводит к нарушению функции преджелудков, всего пищеварительного аппарата и отрицательно отражается на продуктивности животных.

Так, снижение pH в рубце (ацидоз рубца), которое наблюдается при высокой доле концентратов (кормов, богатых сахаром и крахмалом) и кислого силоса в рационе животных, приводит к угнетению деятельности целлюлозо-литических микроорганизмов (бактерий семейств Lachnospiraceae и Ruminococcaceae, грибов - хитридиомицетов, простейших) и бактерий, утилизирующих молочную кислоту (семейства Veillonellaceae). При этом увеличивается количество бактерий рода Lactobacillus (Slyter, 1976; Strobel, Russell, 1986, Nocek, 1997; Klieve et al., 2003), продуцирующих молочную кислоту. Так как бактерия Fusobacterium necrophorum, вызывающая некробактериоз жвачных, использует лактат в качестве энергетического субстрата, число этих микроорганизмов в рубцовом содержимом при ацидозе значительно возрастает. При этом проникновение их через слизистую в кровь обуславливает дальнейшее инфицирование организма животного - абсцессы печени и других внутренних органов, поражения копыт, кожи или слизистых (Nagaraja, 1998). Таким образом, неправильное кормление жвачных животных неизбежно приводит к изменению микробиоценоза рубца, что, в конце концов, может вывести животное из стада (Bevans et al., 2005; Rotger et al., 2006).

Таким образом, состав микрофлоры в рубце не является стабильным и колеблется в зависимости от изменения различных факторов: типа кормления, перемешивания содержимого рубца, слюноотделения и жевания, диффузии или секреции в рубце и прохождения частиц корма далее по пищеварительному тракту (Counotte et al., 1981; Dehority, Orpin, 1988; Biavati, Mattarelli, 1991; Kotarski et al., 1992; Goad et al., 1998; Fernando et al., 2008; Tajima et al., 1999;

Tajima et al., 2000). Учеными показано, что направленная регуляция метаболических процессов в преджелудках вполне возможна. Однако исследований в данном направлении очень мало. Поэтому несомненный интерес представляет изучение влияния рационов жвачных, различающихся уровнем энергии и протеина, соотношениями различных источников энергии и форм азота, включенными добавками и биологически активными веществами на состав микроорганизмов в рубце.

1.2.3. Микроорганизмы рубца

Микробное сообщество рубца включает множество различных микроорганизмов - бактерий, грибов, простейших, метаногенных архей, бактериофагов (Hungate, 1966; Church, 1993; Hespell et al., 1997).

По данным Орскова (Орсков, 1985) анаэробные бактерии - самая большая по численности группа микроорганизмов, населяющих рубец. Общая бактериальная масса рубца коровы составляет 4-7 кг, это примерно 10% содержимого рубца. По мнению Георгиевского (Георгиевский, 1990) в одном миллилитре рубцового содержимого находится от 6 до 40 миллиардов бактерий.

Несмотря на то, что жвачные животные рождаются со стерильным желудочно-кишечным трактом (Cushnie et al., 1981), колонизация его бактериями происходит достаточно быстро. У ягнят и телят палочки Escherichia можно обнаружить во всех областях пищеварительного тракта через 8 часов после рождения, а лактобактерии и стрептококки 24 ч после рождения (Smith, 1965). Фонти с соавторами (Fonty et al., 1987) установили, что микробная колонизация происходит быстро с созданием большого числа строго анаэробных бактерий через 48 ч после рождения. При этом Дехорити и Орпин (Dehor-ity, Orpin, 1988) показали, что наличие целлюлозолитических бактерий в рубце теленка выявлено на 4-5 день жизни.

Стюарт с коллегами (Stewart et al., 1988) показали, что в рубце жвачных содержится широкий спектр аэробных, факультативных и анаэробных бакте-

рий. При этом видовой состав бактерий в рубце достаточно обширен - обнаружено около 150 видов, которые классифицируются по форме (палочки, кокки, спирохеты, вибрионы и др.); по используемому субстрату (клетчатка, ли-пиды, мочевина); по конечному продукту (молочная кислота, янтарная кислота, аммиак, метан) (Георгиевский, 1990; Church, 1993). Некоторые виды данных микроорганизмов были выделены исследователями в чистые культуры и изучены.

Наиболее важную функциональную роль в рубце игают микроорганизмы, ферментирующие углеводы кормов в ЛЖК, обеспечивая при этом значительную часть энергии жвачных животных (Yu, Hungate, 1979; Church, 1993; Weimer, 1996; Weimer et al., 1999; Bera-Maillet et al., 2004). В состав растительной клетчатки входят целлюлоза, гемицеллюлоза, лигнин и другие соединения. Основной углеродосодержащей составной частью растений является целлюлоза. В рубце жвачных находятся специфические анаэробные целлюлозолити-ческие бактерии. В настоящее время среди целлюлозолитических бактерии наиболее изучены Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus albus, Butyrivibrio fibriosolvens, Bacteroides succinogenes, а среди бактерий, обладающих геми-целлюлазной активностью - Butyrivibrio fibriosolvens, Prevotella ruminicola и Ruminococcus sp. Исследователями установлено, что данные бактерии исключительно анаэробны и чувствительны к подкислению pH среды: их развитие существенно подавляется при pH ниже 6,2; оптимум - pH - 6,3 - 7,0. Ингиби-рование ферментации клетчатки происходит в результате повышения содержания крахмала и простых Сахаров при снижении pH до 5,8.

Амилолитические бактерии, гидролирующие крахмал, которым особенно богаты зерновые корма, включают следующие виды: Bacteroides amylophilus, Bacteroides succinogenes, Succinovibrio dextrinosolvens, Streptococcus bovis, Succinimonas amylolytica и Prevotella ruminicola (Aurangzeb et al., 1992; Church, 1993; Martin et al., 1999). Установлено, что данные микроорганизмы менее, чем целлюлозолитические, чувствительны к понижению pH (оптимум 5,6 -7,0). Амилолитические бактерии преимущественно были выявлены в рубце

животных с высоким содержанием крахмала в рационе (Aurangzeb et al., 1992; Fernando et al., 2010; Martin et al., 1999;. Tajima et al., 2000).

Пектинолитические бактерии рубца включают следующие виды: Butyrivibrio fibriosolvens, Prevotella ruminicola, Lachnospira multiparus, Succinovibrio dextrinosolvens, Streptococcus bovis. Эти виды бактерий выделяют вне- и внутриклеточные пектиназы, которые помогают ферментации пектина в рубце жвачных (Dehority, 1969; Wojciechowicz et al., 1982; Wojciechowicz, Ziolecki, 1984).

В результате бактериальной ферментации в преджелудках жвачных содержится значительное количество ЛЖК, которые используются организмом животного в качестве источников энергии. Однако при скармливании жвачным рационов с высоким содержанием зерна в рубце могут накапливаться большие количества лактата, который метаболизируется далее бактериями семейства Veillonellaceae - Megasphaera elsdenii и Selenomonas ruminantium, использующими органические кислоты (Schwartz, Gilchrist, 1974; Church, 1993). Таким образом, данные бактерии играют важную роль в контроле pH рубца, сбраживая молочную кислоту до ацетата, пропионата или других жирных кислот (Russell, Dombrowski, 1980; Counotte et al., 1981; Stewart et al., 1997; Russell, 2002).

Среди протеолитических бактерий были выделены виды Bacteroides ату-lophilus, Prevotella ruminicola, Butyrivibrio fibrosolvens и Streptococcus bovis (Owens et al., 1998; Nagaraja and Titgemeyer, 2007). Установлено, что количество протеолитических бактерий в рубце достигает 109/мл содержимого и составляет 38% общего количества микроорганизмов (Church, 1993).

Огромный вклад бактерий в пищеварительные процессы в рубце обусловлен их быстрой адгезией на растительных тканях. Установлено, что бактериальная колонизация на растительные волокна происходит в течение 5 мин (Bauchop, 1980; Latham, 1980).

В настоящее время широко известно, что анаэробные грибы также являются одними из наиболее значимых групп микроорганизмов рубца (Trinci et

al., 1994; Orpin et al., 1997) - главными инициаторами колонизации лигноцел-люлозных материалов в рубце (Bauchop, 1979; Akin et al., 1990).

Начало интенсивному изучению анаэробной микофлоры положили работы Орпина, доказавшего, что жгутиковые организмы рубца {Neocallimastix frontalis, Sphaeromonas communis, Piromonas communis) являются зооспорами анаэробных грибов - хитридиомицетов (Orpin, 1975, 1976, 1977). Установлено, что оптимальные условия для роста всех трех грибов (строгий анаэробиоз, рН 6,5-7,0 и температура 39°С) соответствуют таковым в преджелудках жвачных (Hungate, 1966). В дальнейшем анаэробные грибы были обнаружены в пищеварительном тракте многих поли- и моногастричных травоядных млекопитающих (Bauchop, 1979, Orpin, 1981).

В настоящее времян не вызывает сомнения, что анаэробные грибы являются истинными обитателями пищеварительного тракта травоядных животных, о чем свидетельствуют особенности физиологии хитридиомицетов рубца и безуспешность попыток их выделения из кормов и воды (Bauchop, 1979). Описано 23 вида грибов, которые обладают целлюлозолитической активностью, участвуют в синтезе аминокислот и гликогена, в синтезе липидов, сбраживают простые сахара, синтезируют витамины и вырабатывают антибиотики (Георгиевский, 1990). По сообщениям многих авторов, анаэробные хитридио-мицеты проявляют лигноцеллюлазную, целлюлазную, ксиланазную, амилаз-ную и различные полисахаразные активности, а также обладают протеазами (Williams, Orpin, 1987; Paul et al., 2003). Все это облегчает грибному мицелию быстрое проникновение внутрь растительных тканей и быструю колонизацию на них (Mounfort, 1985, 1989; Lowe et al., 1987; Williams, Orpin, 1987; Hebraud, Ferve, 1988; Fonty, Joblin, 1990).

Камра (Kamra et al., 2003) установил, что корма с высоким содержанием волокон в рационах стимулируют рост и размножение анаэробных грибов в рубце буйвола, в отличие от кормов, содержащих большое количество легко-сбраживаемых углеводов. При этом большое количество гранулированных корма растворимых Сахаров ингибируют прорастание зооспор (Roger et al.,

1990), что может объясняться снижением pH в рубцовой жидкости (Orpin, 1977).

В рубце молодняка анаэробная микрофлора обнаруживается уже в первые недели жизни животных, но конкретные сроки зависят от рациона кормления. Так, у телят, которым скармливали заменитель цельного молока, анаэробные грибы практически не находили в течение четырех месяцев после рождения. Развитие микофлоры отмечалось только после того, как в рацион вводили грубые корма (Тараканов, 1986). У других 11 ягнят, получавших с рождения грубые корма, анаэробные грибы обнаруживались уже на 8 день после рождения, а у остальных животных - на 10-20-е сутки (Fonty et al., 1987). Популяция хитридиомицетов при этом была представлена Neocallimastix sp., у некоторых ягнят встречались также грибы рода Sphaeromonas.

В связи с тем, что в рубце жвачных животных обеспечиваются условия, оптимальные для роста и размножения метаногенных архей, данные микроорганизмы являются неотъемлемой частью микробного сообщества рубца (Hun-gate, 1988; Yokoyama, Johnson, 1988; Johnson et al., 2000; Russell, 2002). Установлено, что метаногены находятся в рубце в больших количествах - от 107 до 109 клеток/мл рубцовой жидкости в зависимости от типа рациона, особенно в зависимости от содержания волокон в рационе.

В настоящее время установлено, что метаногенные археи утилизируют С02 и Н2, синтезируемые простейшими и бактериями путем катаболизма гек-соз, при этом осуществляя синтез метана СН4 и образуя АТФ (Ferry, Kastead, 2007; Albers et al., 2007). Метаногены играют жизненно важную роль в рубце очистки от молекулярного водорода, образующихся при ферментации в рубце, тем самым обеспечивая непрерывный процесс брожения (Wright et al., 2006).

Вследствие сложности культивирования метаногенов не удивительно, что использование молекулярных методов привело к открытию ряда некуль-тивируемых видов. Истинное разнообразие метаногенов, присутствующих в рубце, было показано при использовании таких методов, как ДНК-

гибридизация, анализа генетической структуры микробного сообщества с помощью библиотек клонированных фрагментов ДНК 16S рРНЕС, количественной ПЦР в реальном времени, метода температурного градиентного гель-электрофореза (TTGE) (Lin et al., 1997; Sharp et al., 1998; Tokura et al., 1999; Jarvis et al., 2000; Yanagita et al., 2000; Whitford et al., 2001; Tajima et al., 2001; Wright et al., 2004; Skillman et al., 2006; Nicholson et al., 2007; Wright et al., 2007).

В настоящее время исследователями описано семь разных видов, представляющих пять родов метаногенов в рубце различных животных Methanobacterium formicicum, Methanobacterium bryanti, Methanobrevibacter ruminantium, Methanobrevibacter smithii, Methanomicrobium mobile, Methano-sarcina barkeri и Methanoculleus olentangyi (Joblin et et al., 1990; Jarvis et al, 2000). Однако до сих пор не существует сведений об истинном количестве данных видов в рубце жвачных. Одни исследователи сообщали, что наиболее распространенными видами в рубце являются метаногены порядка Methanobacteriales (Sharp et al., 1998; Tokura et al., 1999; Skillman et al., 2006; Nicholson et al., 2007; Wright et al., 2007), другие - виды порядка Methanomicrobiales (Sharp et al., 1998; Yanagita et al., 2000; Tajima et al., 2001; Wright et al., 2007).

Кроме того, исследователями показано, что некоторые метаногены находятся в симбиотической связи с бактериями (Wolin, Miller, 1988) и простейшими (Lange et al., 2005) в рубце. Установлено, что археи порядка Methanbac-teriales связаны с инфузориями в рубце (Sharp et al., 1998; Tokura et al., 1999), a метаногены порядка Methanomicrobiales являются свободно живущими (Sharp et al., 1998). В настоящее время известно об ассоциации некоторых простейших (Entodinium longinucleatum, Eudiplodinium maggii, Entodinium bursa и Eremoplastron bovis) и метаногенных архей. Метаногены прикрепляются на реснитчатых простейших, для получения постоянного снабжения водородом (Stumm et al., 1982; Boadi et al., 2004, Martin et al., 2010).

Простейшие были обнаружены в рубце животных еще в 19 веке (Gruby, Delafond, 1843). В настоящее время установлено, что в преджелудках жвачных встречается до 120 видов инфузорий, у коров - около 60 видов, у овец -30 видов, у козы и северного оленя - 20 видов. Обычно в рубце конкретного животного обнаруживается 14-16 видов инфузорий. Все инфузории рубца -анаэробы. Они составляют 106 клеток/мл рубцового содержимого - т.е. 40 до 80% микробной биомассы рубца (Harrison, Mac Allan, 1980).

Исследователями установлено, что передача простейших между животными происходит путем физического контакта через слюну, во время пережевывания или с водой и кормом. Простейшие рубца не образуют цист, но устойчивы к кратковременному снижению температуры в анаэробных условиях (Bonhomme, 1990).

Простейшие рубца классифицируются на две группы в зависимости от их морфологических характеристик, т.е. голотрихи и энтодиниоморфы (Hungate, 1966). Голотрихи представлены 15 родами в рубце различных животных. Среди этих родов Isotricha, Dasytricha, Buetschlia и Charonina, широкораспространенные в рубце домашних и диких жвачных животных (Dehority, 1986). Ферментативный профиль голотрихов указывает на их высокую ами-лазную, инвертазную, пектиназную, эстеразную и полигалактуроназную активности, необходимые для использования крахмала, пектина и растворимых Сахаров в качестве энергетического ресурса (Mould, Thomas, 1958; Abou et al., 1961). О геллюлазной и гемицеллюлазной активностях голотрихов также сообщалось, но на достаточно низком уровне по сравнению с энтодиниоморф-ными простейшими.

Показано, что количество и видовой состав инфузорий рубца в значительной степени зависит от состава рациона и схемы кормления. При этом на вторые сутки голодания животных численность инфузорий снижалась на 42%, а при более длительном голодании они исчезают практически полностью (Долгов, Долгова, 2002). Простейшие рубца прикрепляются к частичкам корма. Кроме того, процент инфузорий увеличивается при повышении в рационе

доли грубых кормов. Однако высокий уровень измельченности кормов (более 50%) и большое количество концентрированных кормов резко снижают количество инфузорий (Орсков, 1985).

1.2.4. Взаимодействие между микроорганизмами в рубце

Взаимоотношения между симбионтами рубца (бактериями, грибами, инфузориями) являются достаточно сложными и привлекают внимание многих исследователей (Hungate, 1975; Wolin, Miller, 1988; Dehority, 2003), так как понимание характера взаимодействий между составляющими микробной экосистемы в рубце позволит определить вклад отдельных микроорганизмов в переваривание кормов и, следовательно, позволит повысить продуктивность животных.

В настоящее время с помощью методов на основе культивирования микроорганизмов и микроскопических исследований выявлены основные типы взаимодействий между микроорганизмами рубца: синергизм (при этом часто метаболиты одних микроорганизмов являются источниками энергии для других), антагонизм, хищничество, конкуренция за субстраты и питательные вещества (Wolin, Miller, 1988; Dehority, 2003).

Наиболее часто явление синергизма прослеживается в рубце между бактериями. При этом бактерии ассоциируются с родственными видами и функционируют как консорциум (Dehority, 1993). Другим примером взаимодействия бактерий является потребление метаболитов одних бактерий другими (ферментация клетчатки растительных кормов в ЛЖК) (Wolin, 1979).

Так, Стюарт с соавторами (Stewart et al., 1986) показали, что в присутствии бактерий Megasphaera elsdenii и Veillonella parvula ферментация целлюлозы в рубце была дополнена анаэробными грибами Neocallimastix frontalis. Подобное взаимодействие может быть основано на синтезе лактата и сукцината грибами, которые могут использоваться лактат-утилизирующими бактериями.

Другие исследователи (Joblin et al., 1990; Teunissen et al., 1992) показали, что в результате совместного культивирования метаногенов и анаэробных грибов с рубца с R. albus или F. succinogenes с P. ruminicola (Gradel, Dehority, 1972) наблюдалось увеличение целлюлазной и ксиланазной активности, а также увеличение скорости ферментации целлюлозы (Bauchop, Mountfort, 1981; Mountfort et al., 1982).

Другой тип взаимодействия микроорганизмов в рубце - антагонизм, т.е. одни микроорганизмы могут быть подавлены за счет выделения антимикробных веществ другими. Так, некоторые целлюлозолитические бактерии Ruminococcus albus и Ruminococcus flavefaciens продуцируют растворимый белок, который ингибирует деградацию целлюлозы анаэробными грибами (Fonty, Joblin, 1990; Stewart et al., 1992; Bernalier et al., 1993). Также, межродовые и межвидовые антагонистические взаимоотношения отмечены и среди простейших, показано, что это служит фактором регуляции состава инфузорий в преджелудках жвачных (Догель, 1951).

Кроме того, исследователями показано, что некоторые метаногены находятся в симбиотической связи с бактериями (Wolin, Miller, 1988) и простейшими (Lange et al., 2005) в рубце. Установлено, что археи порядка Methanbac-teriales связаны с инфузориями в рубце (Sharp et al., 1998; Tokura et al., 1999), а метаногены порядка Methanomicrobiales являются свободно живущими (Sharp et al., 1998). В настоящее время известно об ассоциации некоторых простейших {Entodinium longinucleatum, Eudiplodinium maggii, Entodinium bursa и Eremoplastron bovis) и метаногенных архей. Метаногены прикрепляются на реснитчатых простейших, для получения постоянного снабжения водородом (Stumm et al., 1982; Boadi et al., 2004, Martin et al., 2010).

Данные типы взаимодействий (синергизм и антагонизм) между различными микроорганизмами в экосистеме имеют большое значение для поддержания стабильности и равновесия, а также способствуют поддержанию оптимальной ферментативной активности в рубце и не позволяют размножаться посторонним микроорганизмам в рубце.

Наиболее явные взаимодействия сложились в преджелудках между простейшими и бактериями. В рубце животных, лишенных простейших (дефау-низированных), количество бактерий увеличивается, и наоборот, она уменьшается после введения простейших в рубец через фистулу или другим путем. В настоящее время считается, что существует конкуренция между простейшими и бактериями из-за корма, а сами бактерии являются абсолютно необходимыми источниками питания для инфузорий и уменьшение численности бактерий в преджелудках связано с их поглощением простейшими (Hungate, 1966; Williams, Coleman, 1988). На основании опытов in vitro установлено, что некоторые простейшие проявляют селективное хищничество в отношении различных видов бактерий (Dehority, 2003), в том числе целлюлозолитических (Koenig et al., 2000).

Вильяме (Williams, Coleman, 1992) установил факт синергических отношений простейших с метаногенными археями. Хегарти (Hegarty, 1999) показал, что уровень метаногенеза при дефаунации животных снижается примерно на 15%. Дальнейшее расширение знаний о разнообразии метаногенных архей и простейших, а также их взаимодействии в рубце позволит регулировать выбросы метана жвачными животных и повысить эффективность синтеза микробного белка (Hegarty, 1999; Machmuller et al., 2003).

Таким образом, взаимодействия между микроорганизмами в рубце являются достаточно сложными, при этом далеко не всегда они способствуют увеличению продуктивности животного.

Стоит подчеркнуть, что большинство данных о взаимодействии микроорганизмов в рубце были получены при помощи классических методов микробиологии в процессе искусственного культивирования чистых культур микроорганизмов или их комбинаций, что может не отражать реальной ситуации в рубце, в котором содержатся сотни различных видов. Кроме того, многие микроорганизмы в рубце обладают одновременно несколькими свойствами (например, целлюлозолитической и протеолитической активностями), деятельность микроорганизмов может меняться в зависимости от вида корма. Та-

ким образом, взаимодействие между микробами в рубце в естественных условиях может быть гораздо более сложным, чем выявленное путем культивирования в пробирке.

Таким образом, в настоящее время необходим качественно новый подход для оценки составляющих микробной экосистемы в рубце для проведения более полных исследований в данном направлении.

1.3. Возможность управления процессами ферментации в рубце

Как было указано выше, процессы ферментации в рубце играют ключевую роль в питании жвачных. Именно симбиотическая связь между животным-хозяином и микрофлорой рубца дает жвачным животным ряд преимуществ в пищеварительных и метаболических процессах перед нежвачными животными.

Концепция возможности управления некоторыми обменными процессами в рубце с целью достижения более эффективного использования питательных веществ за счет изменения микробного сообщества в рубце не является новой. В течение нескольких десятилетий ученые пытались разработать различные подходы для изменения направленности процессов ферментации в рубце, воздействуя различными способами на рост или метаболизм различных микроорганизмов в рубце.

Так, Ван Невель (Van Nevel at al., 1988) описал пять возможных способов повышения эффективности использования питательных веществ жвачными животными:

• повышение усвояемости структурных углеводов,

• защита белка кормов против микробной деградации в рубце,

• изменение конечных продуктов брожения,

• снижение уровня патогенной микрофлоры,

• сокращение темпов освобожения аммиака белка.

Кроме этого, учеными установлена способность различных химических соединений изменять направленность процессов ферментации в рубце. Также хорошо известным является факт того, что дефаунация (устранение простейших из рубца), оказывает влияние на процессы ферментации в рубце (Orskov, 1975).

Еще одним из направлений изменения направленности процессов ферментации в рубце является использование генетически модифицированных микроорганизмов (Armstrong, Gilbert, 1985; Russell, Wilson, 1988; Patterson, 1989; Flint, Thomson, 1991).

Несмотря на большое количество известных методов изменения микробной ферментации в рубце, успех практически всех подобных исследований был довольно минимален. Вероятно, это связано с недостатком знаний и недооценкой сложности особенностей физико-химической структуры растительных кормов, физиологии животных (например, регулирование потребления корма, слюноотделения, моторики рубца) и в микробной физиологии (биохимических свойств микробных ферментов, гидролизующих растительные корма, механизмов присоединения микроорганизмов к растительным тканям, метаболических взаимодействий между микроорганизмами). Степень сложности взаимодействий между различными группами микроорганизмов, обитающих в рубце, такова, что даже в наше время, многое не известно.

В последние годы, в связи с быстрым развитием новых разработок в области молекулярной биологии и рекомбинантной ДНК-технологии, наблюдается возрождение интереса к исследованиям экологии рубца и возможности моделирования ферментативных процессов в рубце (Irskov, Flint, 1989; Martin et al., 1999; Wanapat, 2000; Dann, 2005; Khampa et al., 2006, 2006a).

Общие цели регуляции процессов ферментации в рубце можно заключить следующим образом (Nagaraja et al., 1997): повышение положительных процессов; сведение к минимуму, а также изменение или устранив неэффективных и вредных для животного процессов.

Современные методы для регуляции процессов ферментации в рубце включают добавление в рацион ионофоров, антибиотиков и микробных кормовых добавок. Целью добавления данных препаратов является: изменение концентраций ЛЖК в рубце, снижение риска развития лактатного ацидоза, повышение усвояемости питательных веществ кормов.

Рассмотрим эффективность некоторых добавок, использование которых может оказать значительное влияние на кормление жвачных.

Проблема увеличения мясной продуктивности скота за счет увеличения молярной доли пропионата (за счет понижения доли ацетата и бутирата) в процессе ферментации кормов в рубце привлекала внимание многих ученых на протяжении десятилетий. Для достижения этой цели наиболее часто использовали ионофоры. Действие ионофоров связано с их липофильной природой и их способностью изменять градиент ионного обмена бактериальной мембраны (Bergen, Bates, 1984; Russell, Strobel, 1989), воздействуя, таким образом, на грамположительные бактерии в рубце (Chen, Wolin, 1979; Henderson, Stewart, 1981; Nagaraja, Taylor, 1987; Russell, Strobel, 1989; Сое et al., 1999). Эта селективность является центральным действием ионофоров - понижения количества грамположительных бактерий, продуцирующих лактат, и увеличения содержания грам-отрицательных бактерий, продуцирующих про-пионат (Nagaraja et al., 1997). Установлено, что повышение количества пропионата в рубце способствует повышению мясной продуктивности животных. Кроме того, за счет ингибирования лактат-продуцирующих бактерий, ионофоры, как правило, снижают риск возникновения лактатного ацидоза (Owens et al., 1998). Помимо этого, ионофоры могут снижать синтез аммиака в рубце, что, в свою очередь, может привести к более эффективному использованию белка кормов и сокращению количества метана (Russell et al., 1981; Dennis et al., 1986; Russell, Strobel, 1989; Guan et al., 2006). Так же установлено, что ионофоры оказывают воздействие и на анаэробные грибы рубца (Elliott et al., 1987; Newbold et al., 1988,). Эллиот с соавторами (Elliott et al., 1987) предположили, что увеличение концентрации пропионовой кислоты в рубце может

быть связано в первую очередь, с антифунгальным действием ионофоров, а не с антибактериальным.

В связи с запретом использования антибиотиков в животноводстве в ЕС в январе 2006 года, внимание ученых привлекли альтернативные им кормовые добавки, в том числе пробиотики, ферменты, эфирные масла и органические кислоты. Эфирные масла представляют собой кормовые добавки растительного происхождения, которые обычно оказывают антимикробное действие, что приводит к изменению процессов ферментации в рубце (Calsamiglia et al., 2007). По антимикробным свойствам большинство эфирных масел напоминает ионофоры, при этом они избирательно ингибируют грамположительные бактерии (Busquet et al., 2006; Calsamiglia et al., 2007). Причины их избирательности аналогичны ионофорам - гидрофобный характер эфирных масел позволяет им взаимодействовать с бактериальной мембраной, изменяя транспорт ионов через мембрану (Busquet et al., 2006;. Calsamiglia et al., 2007). Учитывая сходство эфирных масел и ионофоров с точки зрения избирательности и механизма действия, можно было ожидать, что одним из главных эффектов эфирных масел на рубце брожения будет сдвиг в пропорций ЛЖК в рубце. Тем не менее, ряд исследователей сообщили, что это не всегда так. При этом исследователи наблюдали, что эфирные масла или не имели воздействия на количество ЛЖК в рубце (Benchaar et al., 2006, 2007; Meyer et al., 2009), или способствовали увеличению количества пропионата (Castillejos et al., 2007), или наоборот - понижению его уровня (Busquet et al., 2006; Cardozo et al., 2006.). При этом степень влияния эфирных масел на концентрацию отдельных ЛЖК в рубце в значительной степени зависела от рациона, количества и вида эфирных масел (Busquet et al., 2006). Несмотря на неоднозначные результаты исследований, эфирные масла в настоящее время являются одной из лучших альтернатив использованию антибиотиков.

Добавки, применяемые для снижения риска развития лактатного ацидоза, направлены на сокращение количества лактат-продуцирующих бактерий (Owens et al., 1998; Сое et al., 1999). В исследованиях Нагараджи (Nagaraja,

Titgemeyer, 2007) показано, что изучение эффектов добавок для профилактики лактатного ацидоза является достаточно сложной задачей, т.к. это часто требует экспериментальной индукции ацидоза.

Как было показано выше, контроль количества лактат-продуцирующих бактерий можно осуществлять при добавлении в рацион антибиотиков (Сое et al., 1999; Ives et al., 2002). Помимо этого, для профилактики лактатного ацидоза и повышения продуктивности животных, в рацион крупного рогатого скота часто включают пробиотики. В настоящее время описан широкий ряд пробиотических препаратов, имеющих различные механизмы действия. Часто в качестве пробиотиков используют микроорганизмы, стимулирующие рост лактат-утилизирующих бактерий, бактерии, направленные на подавление бактерий, синтезирующих лактат (Beauchemin et al., 2003; Krehbiel et al., 2003). Положительные результаты при использовании в качестве пробиотика бактерий Megasphaera elsdenii, утилизирующих лактат, были описаны Элам с соавторами (Elam et al., 2003). Скармливание данных бактерий приводило к повышению pH содержимого рубца и снижению концентрации молочной кислоты во время быстрого перехода на высококонцентратный рацион (Henning et al., 2010а, б). Основным ограничением к использованию в качестве пробиотика лактат-утилизирующих бактерий Megasphaera elsdenii - необходимость поддержания строгого анаэробиоза для поддержания жизнеспособной культуры. Тем не менее, многообещающие результаты в профилактике лактатного ацидоза могут использоваться для дальнейших исследований.

Кроме пробиотических препаратов, действие которых основано на прямом воздействии на лактат-продуцирующие бактерии и бактерии, потребляющие лактат, создан ряд других добавок, в том числе на основе дрожжей (Dawson et al., 1990; Dawson, 1992; Martin, Nisbet, 1992; Wallace, Newbold, 1992). Опубликованные результаты исследований показывают, что штаммы дрожжей оказывают положительное влияние на продуктивность жвачных животных (Wallace, Newbold, 1993; Williams, Newbold, 1990). Установлено, что данные пробиотики способствуют увеличению количестсва целлюлолитиче-

ских бактерий (Martin, Nisbet, 1992; Wallace, Newbold, 1993), бактерий, утилизирующих лактат (Nisbet, Martin, 1990, 1991, 1993; Martin, Nisbet, 1992). Помимо этого, Доусон (Dawson, 1992) выделил штаммы дрожжей, которые стимулируют рост конкретных видов бактерий, в зависимости от решения необходимых задач, которые можно применять в различных условиях.

Повышение переваримости питательных веществ в рубце жвачных оказалось одний из самых сложных задач для исследователей. Несмотря на успешные достижения в области изменения концентраций отдельных ЛЖК в процессе ферментации кормов, улучшение усвояемости питательных веществ наблюдается в редких случаях. При этом наибольший эффект в этом направлении был установлен при использовании ферментных препаратов в рацонах жвачных. Так, включение экзогенной амилазы в рацион телят на откорме позволило увеличить потребление сухого вещества корма, и, соответственно, повысить продуктивность животных (Tricarico et al., 2007).

Несмотря на современные достижения, позволяющие воздействовать на ферментативные процессы в рубце, способствующие повышению продуктивности животных (Cotta, Russell, 1997; Weimer, 1998), необходимо более тщательное понимание взаимодействия между микроорганизмами в экосистеме рубца (Firkins, Hristov, 2006). Способность идентифицировать микроорганизмы, входящие в состав микробного сообщества дает возможность понимания механизмов взаимодействия микробов между собой, а также метаболических процессов, происходящих данных сообществах.

1.4. Методы изучения микробиоценоза рубца жвачных животных 1.4.1. Традиционные микробиологические методы

В настоящее время существует множество методов для изучения микроорганизмов рубца: выращивание их на искусственных питательных средах или выделение ДНК и дальнейшая их идентификация, т.е. минуя стадию

культивирования (Nottingham, Hungate, 1968; Ladapo, Barlaz, 1997; Wise et al., 1999; Hopkins, et al., 2001; Elshahed, et al., 2004; Dedysh, et al., 2006; Spieck et al., 2006).

Основные знания о микрофлоре рубца и ее функциях были получены с помощью классических методов микробиологии - культивировании микроорганизмов на искусственных питательных средах и изучении их метаболической активности. В результате многочисленных исследований был описан широкий спектр аэробных, факультативных и анаэробных бактериальных штаммов из рубца жвачных животных разного возраста, состояния здоровья, географического местоположения, сезона и рационов (Bryant, 1959; Dehority, Orpin, 1988; Hungate, 1966, Hespell et al, 1997). Тем не менее, изучение анаэробных грибов и простейших с помощью классических методов микробиологии до сих пор трудно осуществить. Так, определение количества биомассы анаэробной микофлоры наталкивается на трудности методического характера. Дело в том, что грибной мицелий глубоко проникает в растительные субстраты, поэтому даже in vitro собрать биомассу практически невозможно. По мнению Орпина (Orpin, 1981), in vivo микофлора может оставлять до 8% общей биомассы, однако отсутствие достоверных прямых методов количественной оценки биомассы анаэробных грибов в рубце жвачных не позволяет сегодня определить ее истинный размер. Определение количества и видовой принадлежности простейших в содержимом рубца также проблематично (Dehority, 2003). Так, Ито и др. (Ito et al., 2001) для определения 6 видов инфузорий Ostracodinium использовал 44 диаграммы, а для определения вида инфузорий рода Entodinium подобных диаграмм требуется намного больше (Dehority, 1994). Кроме того, показано, что разведение образцов для определения количество клеток бактерий и простейших также может привести к получению неточных данных и отсутствию статистических закономерностей (Dehority, 1994; Wells, Russell, 1996).

Использование современных молекулярно-генетических методов выявило ряд недостатков классических методов (Dunbar et al., 1997). Одной из наи-

более важных проблем использования методов культивирования для изучения микробных сообществ является то, что не все микроорганизмы возможно культивировать на искусственных питательных средах. Установлено, что в настоящее время не существует ни одной среды, на которой возможно поддержание роста всех жизнеспособных бактерий рубца. Поэтому микробное разнообразие значительно занижено (Amann, 1992; Wintzingerode, 1997) от 1050% (Zoetendal, 1998) до 5-15% (Krause, 2003; Shin, 2004) от общего количества микроорганизмов. Кроме того, известны виды микроорганизмов, для которых применяемые условия культивирования не подходят или которые вступили в некультивируемое состояние или никогда ранее не культивируемые виды вследствие отсутствия подходящих методов (Amann, 1995). В связи с этим невозможно не только изучение данных микроорганизмов, но и исследование их роли в переваривании кормов в рубце и даже установление их присутствия в микробном сообществе (Zoetendal et al., 2004).

Данбар с соавторами (Dunbar et al., 1997), указывают на то, что даже при успешном подборе условий культивирования для конкретного микроорганизма, изучение его реальной роли в сообществе практически невозможно ввиду того, что изолированный микроорганизм зачастую изменяет свою морфологию и метаболические функции, т.к. больше не подвергается воздействию естественной среды обитания, взаимодействию с другими микроорганизмами и питательными веществами. Кроме того, в отличие от реальных условий, микроорганизм может быть успешно культивирован ввиду отсутствия конкуренции за питательные вещества, либо он может быть ингибирован за счет отсутствия доступа к метаболитам других микроорганизмов.

Установлено, что классификация микроорганизмов рубца, основанная на изучении фенотипических характеристик и биохимических тестов, также не является достаточно точной для изучения различий между культивируемыми микроорганизмами. Так, исследования известных родов бактерий рубца с помощью методов молекулярной биологии показали, что Prevotella ruminicola, Butyrivibrio fibrisolvens и Ruminococcus sp. представляют филогенетически

различные группы бактерий, несмотря на тот факт, что виды этих родов фено-типически и биохимически сходны (Forster et al., 1996). В настоящее время общепризнанным является факт, что наиболее желательной является схема классификации микроорганизмов, отражающая естественные эволюционные отношения и классификация, основанная полностью на фенотипических характеристиках, этих отношений не показывает.

Помимо этого, Данбар с соавторами (Dunbar et al., 1997) отмечает следующую проблему культивирования микроорганизмов на жидких питательных средах - более быстро растущие микроорганизмы могут тормозить рост медленнорастущих микробов.

Поэтому многие ученые считают, что представления, основанные на традиционных микробиологических методах, не отражают всей полноты процессов ферментации, происходящих в рубце и взаимодействия микроорганизмов (Amann et al., 1992; Wintzingerode et al., 1997; Zoetendal et al., 1998; Krause et al., 2003; Shin, 2004).

1.4.2. Метагеномный анализ микробных сообществ

Развитие метагеномных подходов позволило изучать микробиоценоз рубца жвачных без ограничений традиционных методов микробиологии - т.е. минуя стадию культивирования. Метагеномные методы изучения микробных сообществ основаны на анализе разнообразия консервативных элементов генома микроорганизмов и часто включают в себя стадии клонирования общей (тотальной) ДНК всех микроорганизмов, выделенной из образца, в вектор и затем анализ полученных библиотек клонов (Эрнст, Зиновьева, 2008; Нап-delsman, 2004). Наиболее распространенным является анализ, основанный на вариабельных фрагментах консервативных элементов генов 16S/18S рРНК. Использование генов 16S рРНК в качестве маркеров в филогенетических исследованиях вследствие их повсеместного распространения, а также наличия постоянных и гетерогенных участков является прорывом в области микроб-

ной экологии. Выбор именно этих генов обусловлен, прежде всего, их повсеместной распространенностью во всем живом мире и доступностью огромных массивов данных о структуре генов рРНК у самых разнообразных микроорганизмов. Для определения вида микроорганизма нуклеотидная последовательность сравнивается с нуклеотидными последовательностями из баз данных (Stackebrandt, Goebel, 1994; Amann et al., 1995; Madden et al., 1996; Tajima et al., 1999; Nelson et al., 2003). При этом многие метагеномные подходы (пиро-секвенирование, T-RFLP-анализ) не нуждаются в стадии клонирования. ПЦР-амплификация генов 16S рРНК обычно используется для изучения филогенетического разнообразия микробных консорциумов в изучении структуры микробных сообществ с помощью таких методов, как анализ структуры межгенных спейсеров рибосомной ДНК, метод T-RFLP (анализ полиморфизма длин терминальных рестрикционных фрагментов). Последовательности 16S рРНК также используются для синтеза универсальных или таксон-специфических зондов и праймеров для идентификации фрагментов генома в экологической библиотеке ДНК (Stein et al., 1996; Quaiser et al., 2002; Liles et al., 2003), а также в методе гибридизации «in situ» с использованием 16S рДНК олигонуклеотидных зондов (Xu et al., 2007; Lucker et al., 2007; Olsen et al., 2008; Rowe et al., 2008). Кроме того, гетерогенные 16S рДНК ампликоны, полученные с помощью ПЦР из ДНК исследуемых микробных сообществ могут быть использованы для построения библиотек клонов, которые могут быть упорядочены и проанализированы с помощью инструментов биоинформатики. Альтернативой методам филогенетического анализа микробиоценоза на основе метода ПЦР-амплификации генов микроорганизмов является метод глобального секвенирования (пиросеквенирование) (Venter et al., 2004), который показывает разнообразие внутри сообщества, однако при этом не выявляет новые обнаруженные вновь гены (Hess et al., 2011). Анализ трех метагено-мов рубца, полученных с помощью данного метода, представлен в базе данных MG-RAST. Результаты данного метода показали, что доминирующее положение в рубце занимают бактерии фил Bacteroidetes, Firmicutes, Actinobac-

teria. Помимо этого, среди микроорганизмов выявлены бактерии родов Bacillus, Lactobacillus, Fusobacterium.

Метагеномный анализ обеспечивает получение обширной информации о структуре, составе микробиоценозов, а также позволяет предсказать функции микроорганизмов в различных экологических микробных экосистемах (табл.1). Каждая среда обитания микроорганизмов представляет собой индивидуальный объект для метагеномных исследований и требует специально разработанных подходов для наиболее полной характеристики функционального и генетического разнообразия его микробного сообщества. Многие исследователи использовали метагеномный анализ для характеристики микробного разнообразия в ряде различных объектов окружающей среды, таких как почва (Rondon et al., 2000; Tringe et al., 2005; Voget et al., 2003), рубец жвачных животных (Dinsdale et al., 2008), морских микробных ассоциаций (Beja et al, 2000; Breitbart et al., 2002), микробиоценоза моря (Venter et al., 2004). Одним из основных преимуществ метагеномного анализа микробиоценоза состоит в том, что он позволяет исследовать некультивируемые до сих пор микроорганизмы и изучать их гены (Amann, et al. 1995; Hill, et al. 2002).

Таблица 1

Сравнение методов изучения микробной экосистемы

Метод Возможности использования Ограничения

Культивирование Возможность изучения свойств микроорганизмов. Медленный и трудоемкий.

Секвенирование последовательностей ДНК Филогенетическая идентификация. Трудоемкость, зависимость полученных результатов от условий ПЦР.

DGGE, TGGE, TTGE Мониторинг сообщества, быстрый сравнительный анализ. Полуколичественный метод, зависимость полученных результатов от условий ПЦР, для филогенетической идентификации требуется дальнейшее клонирование и секвенирование микробного сообщества.

T-RFLP Монитбринг изменений микробного сообщества, быстрый сравнительный анализ, высокая чувствительность метода, высокая воспроизводимость результатов, возможность филогенетической идентификации. Полуколичественный метод, зависимость полученных результатов от условий ПЦР.

SSCP Мониторинг изменений микробного сообщества, полуколичественный метод, быстрый сравнительный анализ. Полуколичественный метод, зависимость полученных результатов от условий ПЦР, для филогенетической идентификации требуется дальнейшее клонирование и секвенирование микробного сообщества.

FISH Детекция, установление количества микроорганизмов, возможна автоматизация сравнительного анализа микробных сообществ. Необходима информация о филогенетическом составе сообщества, является трудоемким для исследования видового состава микробного сообщества.

Dot-blot hybridization Детекция, определение относительного количества микроорганизмов. Необходима информация о филогенетическом составе сообщества, является трудоемким для исследования-видового состава микробного сообщества.

Количественная ПЦР Детекция, определение относительного количества микроорганизмов Трудоемкий. 5!' ■ V

О --i S1

7Z — >

jlj

Несмотря на то, что метагеномные методы изучения микробного сообщества не зависят от стадии культивирования микроорганизмов, а также позволяют изучить большое количество микроорганизмов из проб окружающей среды, зачастую до сих пор невозможно выявить некоторых членов микробного сообщества из-за ряда ограничений, связанных с методами выделения ДНК и ПЦР-амплификации (Axelrood et al., 2002).

1.4.3. Проблемы получения качественной ДНК для метагеномных

исследований

Экологические метагеномные исследования являются перспективными, однако существуют проблемы изучения микробных сообществ. Зачастую ДНК микробиоценозов может быть загрязнена различными органическими соединениями, которые могут препятствовать использованию таких метагеномных методов, как ПНР и получение метагеномных библиотек. В зависимости от физико-химического состава окружающей среды, эти загрязнения могут включать в себя гуминовые кислоты, полифенолы, полисахариды и нуклеазы, которые также могут ухудшить качество ДНК (Tebbe, Vahjen, 1993; Zhou et al., 1996; Frostegard et al., 1999; Sylvia, 2005). Удаление этих загрязнений из выделяемой ДНК имеет решающее значение для дальнейших исследований. Таким образом, для изучения того или иного микробного сообщества необходим подбор методов экстракции и очистки ДНК, пригодной для дальнейших метагеномных исследований. Кроме того, при экстракции ДНК для исследования любого объекта необходимо изолировать ДНК всех микроорганизмов, которые находятся в данном микробном сообществе, иначе последующие метагеномные методы могут характеризовать микробное сообщество неправильно или неполностью (Liles et al., 2003). Поэтому одним из основных вопросов, которые необходимо учитывать при экстрации ДНК относится к выбору метода, который будет эффективно выделять ДНК из

большинства микробов, насколько это возможно (например, грамположи-тельных и грамотрицательных бактерий).

Существует два основных подхода для выделения ДНК:

1) прямая экстракция - непосредственное выделение ДНК из образца,

2) «непрямая» экстракция - отделение бактериальных клеток от образца для лизиса и очистки ДНК.

Прямая экстракция ДНК имеет множество преимуществ, в том числе снижение времени выделения нуклеиновых кислот, а также более высокий выход ДНК по сравнению с другими методами (Ogram et al., 1987). К сожалению, данный метод зачастую приводит к выделению значительного количества загрязняющих веществ из проб и высокого количества небактериальной ДНК (Ogram et al., 1987; Tsai, Olson, 1991; Tebbe, Vahjen, 1993). «Непрямой» способ выделения ДНК позволяет избежать некоторых ограничений прямой экстракции, т.к. он позволяет выделить большее количество бактериальной ДНК (Osborn, Smith, 2005) и способствует экстракции ДНК различных филогенетических групп бактерий (Gabor et al., 2003). Тем не менее, «непрямые» методы экстракции ДНК являются более трудоемкими, приводя к выделению меньшего количества ДНК, а также возможно снижение количества ДНК бактерий, трудноотделимых от субстрата.

Выбор метод экстрации ДНК зависит от цели исследования. Так, прямой метод выделения ДНК наиболее часто используется для ПЦР или пиро-секвенирования. Кроме того, необходимо обратить внимание на выбор методов очистки ДНК, т.к. часто требуется избегать ее фрагментации. Уменьшение размера фрагмента ДНК в результате метода прямой экстракции и методов очистки ДНК, как правило, не играет роли для использования метаге-номных исследований на основе ПЦР или пиросеквенирования, т.к. целевые гены сравнительно небольших размеров. При этом косвенный метод экстракции используют, как правило, когда размер фрагментов ДНК должен быть сохранен для построения больших метагеномных библиотек и/или для ис-

пользования молекулярно-генетического метода требуется высокая доля ДНК-матрицы.

Выбор способа лизиса клеток является еще одна важной проблемой, так как при этом определяется, из какой группы микроорганизмов выделится преимущественно ДНК. В большинстве случаев, успешный лизис клеток должен экстрагировать геномную ДНК из грамположительных и грам - отрицательных бактерий. Как правило, это достигается за счет использования сочетания механического (например, ультразвуком, шариками) и химического (например, лизоцим, SDS) воздействий на образец, что создает условия, достаточные для лизиса грамположительных клеток. Многие исследователи оценивали эффективность такого подход «комбинированного лизиса» и установили, что при том, что данный метод позволяет выделить ДНК из различных бактерий, при этом он также приводит к дроблению ДНК, и, таким образом, невозможности ее использования для некоторых методов метаге-номного анализа, а также приводить к накоплению во время амплификации ДНК ПЦР-артефарктов (Smalla et al., 1993; More et al., 1994; Duarte et al., 1998).

В последнее время предлагается множество коммерческих наборов для экстракции ДНК. Данные комплекты часто включают в себя одну или несколько стадий очистки, которые удаляют загрязнения окружающей среды без необходимости для экстракции органических соединений фенолом и хлороформом. Еще одно преимущество использования коммерческих наборов состоит в том, что процедура экстракции была стандартизирована, т.е. позволяет получать одинаковые результаты и снизить время экстракции. Тем не менее, есть два основных ограничения использования коммерческие наборов: количество выделяемой ДНК и ее размер. При выделении ДНК непосредственно из объектов окружающей среды, может понадобиться большое количество этих образцов для выделения необходимого количества ДНК (Webster et al., 2003).

Независимо того, какой метод экстракции ДНК используется, вполне вероятно, что будет необходима ее дальнейшая очистка для проведения ПЦР-амплификации, хотя степень очистки необходимости может быть сокращена в зависимости от выбранного метода выделения ДНК. Для очистки ДНК от ингибиторов ПЦР-амплификации было разработано множество методов очистки: очистка смесью фенол/хлороформ, растворами СТАВ и PYPP, а также центрифугирование с CsCl, очистка в колонках (Steffan, et al., 1988; Selenska, et al., 1991; Holben et al., 1998; Knaebel, Crawford, 1995; Lee et al., 1996; Roose-Amsaleg et al., 2001). Тем не менее, было показано, что многие из этих методов приводят к снижению количества ДНК (Harry et al., 1999). Также распространенными методами очистки является также осаждение ДНК с этанолом, изопропанолом или полиэтиленгликоля (ПЭГ) (Porteous et al., 1997). К сожалению, многие образцы требуют сочетания этих стадий очистки, что значительно увеличивает время обработки и может привести к еще большей потере ДНК. Наоборот, если количество загрязняющих веществ мало, можно использовать альтернативные методы, которые могут быть достаточны для ПЦР-амплификации, такие, как разбавление ДНК-матрицы или очистка ДНК в агарозном геле до ПЦР (Zhen, Swank, 1993; Moreira, 1998).

1.4.4. Молекулярно-генетические методы для изучения рубца

жвачных

Впервые для изучения микробного сообщества рубца данные методы начали использовать несколько групп исследователей в качестве альтернативы методам на основе культивирования микроорганизмов. Так, 16S рРНК зонды были использованы для изучения эффекта действия антибиотика мо-нензима (Stahl et al., 1988) и других биологически-активных добавок на бактерии рубца (Briesacher et al., 1992). 16S рДНК библиотеки и ПЦР в реальном времени - для исследования возможных бактериальных изменений в от-

вет на смену рациона (Whitford et al., 1998; Tajima, et al., 1999; Tajima, et al., 2000).

Метод секвенирования библиотек клонированных фрагментов ДНК включает в себя стадии экстракции ДНК из образцов содержимого рубца, ПЦР-амплификации генов 16S рДНК, клонирование ампликонов в небольшие векторные молекулы и анализ последовательностей клонированных фрагментов ДНК. Данный метод позволяет получить полное представление о составе микробных сообществ, поскольку не зависит от стадии культивирования микроорганизмов, однако имеет ряд недостатков.

Первым недостатком метода является то, что наборы праймеров, которые используются для амплификации генов 16S рДНК микроорганизмов, созданные как «универсальные», не позволяют проанализировать все микроорганизмы, находящиеся в микробном сообществе.

Кроме того, большинство "универсальных" 16S рРНК наборов праймеров не в состоянии амплифицировать гены архей, что приводит к необходимости использования праймеров для каждой конкретной группы микроорганизмов.

Следующим недостатком данной методики является различие в эффективности ПЦР-амплификации генов микроорганизмов в связи с разницей в содержании GC в последовательностях (Polz and Cavanaugh, 1998, Suzuki and Giovannoni, 1996), количестве оперонов РНК (Acinas, et al. 2004, Polz and Cavanaugh 1998, Suzuki and Giovannoni 1996), а также последовательностей амплифицируемых генов (Suzuki and Giovannoni, 1996).

Кроме того, установлено, что не все последовательности ДНК встраиваются в векторные молекулы в клетки Е. coli, а также то, что на данном этапе не все бактерии вырастают на селективных средах.

Помимо этого, многие библиотеки клонированных фрагментов создаются из небольшого числа последовательностей в связи с высокой стоимостью метода. Получение хороших данных о последовательностях, как правило, требует двунаправленного анализа последовательностей вставки для по-

лучения более полной информации, что также является дорогостоящим (Olsen, et al. 1986).

Несмотря на перечисленные недостатки, данный метод позволил более полно изучить микробиоценоз рубца жвачных, чем классические методы микробиологии, а также позволил идентифицировать микроорганизмы, которые не удавалось обнаружить с помощью традиционных методов. Анализ генетической структуры микробного сообщества с помощью библиотек клонированных фрагментов ДНК 16S рРНК последовательностей впервые был использован Уитфордом с коллегами (Whitford et al, 1998) для изучения микроорганизмов в рубце коровы. Анализ полученных клонированных фрагментов ДНК бактерий показал, что большинство последовательнойстей микроорганизмов относятся к роду Prevotella. Снижение количества циклов ПЦР-амплификации способствовало получению более полных результатов. Помимо этого, при использовании метода клонирования генов исследователями в рубце были выявлены неизвестные ранее микроорганизмы (Tajima et al., 2000). Авторы построили три библиотеки клонов для изучения изменений в микробиоценозе рубца в ответ на изменение рациона. Результаты исследований показали, что данные, полученные в процессе филогенетического анализа, согласуются с предыдущей работой, основанной на классических методах микробологии (Tajima et al., 2000). Эдварде и его коллеги (Edwards et al., 2004) объединили данные из трех библиотек клонированных фрагментов 16S рРНК последовательностей и баз данных последовательностей микроорганизмов для анализа результатов микробиоценоза рубца, полученных с помощью данного метода. Ученые показали, что отдельные библиотеки клонов, в отличие от их комплекса, не в состоянии отразить реального разнообразия микроорганизмов в рубце.

Несмотря на широкий спектр возможностей, показано, что составление и анализ библиотек требует больших временных и материальных затрат. Кроме того, часто перед исследователем стоит задача не просто описать

структуру микробного сообщества, но и проследить, как изменяется эта структура с течением времени в результате какого-либо воздействия.

В связи с этим был разработан ряд альтернативных методов анализа, не включающих стадию клонирования и секвенирования продуктов ПЦР, позволяющих исследовать структуру микробных сообществ. Наиболее применимыми в настоящее время являются следующие методы - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов (T-RFLP - terminal restriction fragment length polymorphism) и градиентный гель-электрофорез (DGGE, TGGE). Показано, что с помощью данных методов возможна достаточно быстрая оценка структуры микробного сообщества, что позволяет изучать действие различных факторов на микробиоценоз.

Метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза (DGGE) включает комбинацию амплификации фрагментов генов (например, 16S рДНК) и разделения полученных индивидуальных фрагментов 16S рДНК в градиенте денатурирующего агента (например, мочевины). Толщина полос может быть показателем суммы этой последовательности рДНК в исследуемом образце. Затем полученные ПЦР-полосы (фрагменты генов) могут быть выделены и просеквенированы (Muyzer et al., 1993). Метод градиентного гель-электрофореза (DGGE) в микробной экологии впервые был применен для изучения бактериального разнообразия в морской экосистеме (Muyzer et al., 1993). Положительные результаты этого исследования позволили разработать аналогичные методы, в том числе метод температурного градиентного гель-электрофореза (TGGE), временного температурного градиентного гель-электрофореза (TTGE), анализ вторичной структуры одноцепочечной ДНК (SSCP). Хотя принципы и технические процедуры меняются, все методы фингерпринтинга позволяют на основе ПЦР и создания профилей микробиоценоза представлять разнообразие и структуру микробного сообщества в рамках выбранной экосистемы. Интересно, что все данные методы были успешно использованы в области клинических исследований, прежде чем были применены к исследованию экологии микробных сообществ (Gafan et al.,

2005). Кроме того, благодаря усовершенствованиям статистического программного обеспечения, для сравнения микробных сообществ могут быть рассчитаны индексы сходства могут и проведен кластерный анализ. Таким образом, методы фингерпринтинга являются очень полезными для анализа и мониторинга микробных сообществ в динамике или в ответ на изменение факторов окружающей среды (например, тип кормления животного) (Muyzer, Smalla, 1998; Vaughan et al., 2000; Konstantinov et al., 2002). Методы DGGE, TGGE и TTGE были успешно использованы для описания и мониторинга бактериальных сообществ в организме человека (Zoetendal et al., 1998; Zoe-tendal et al., 2001), свиней (Leser et al., 2000; Simpson et al., 2000), крупного рогатого скота (Kocherginskaya et al., 2001), собак, грызунов и кур (Zhu et al., 2002). Все данные исследования показали, что методы DGGE или TGGE позволяют выявить лишь 1% от общего числа бактерий сообщества (Muyzer et al., 1993; Zoetendal et al., 1998). Это означает, что только доминирующие бактерии будут показаны с помощью данных методов. Кроме того, рассмотренные методы имеют ряд других технических недостатков: например, в методе DGGE один и тот же вид микроорганизма может иметь несколько полос в геле или наоборот, когда фрагменты молекулы ДНК двух разных видов оказываются в одной полосе вследствие одинакового процентного содержания в них пар G / С (Nannipieri, 2003).

1.4.5. T-RFLP-анализ

В 1997 году Лью с коллегами (Liu et al., 1997) был описан новый подход для характеристики микробных сообществ - T-RFLP-анализ (Terminal restriction fragment length polymorphism). Данный метод включает амплификацию фрагментов генов микроорганизмов (например, 16S рДНК) с флуоресцентно-мечеными праймерами (обычно с 5'-конца), рестрикцию амплификата с помощью частощепящих эндонуклеаз рестрикции (обычно используют эн-донуклеазы, узнающие последовательности из 4 нуклеотидов) и разделение

полученных фрагментов ДНК в полиакриламидном геле в секвенаторе вместе с флуоресцентно-меченым ДНК-маркером известного размера (рис. 2). Интенсивность флюоресценции каждого пика на T-RFLP-граммах отражает относительное количество филотипа в микробном сообществе.

Для анализа бактериальных сообществ созданы компьютерные программы, позволяющие детальную расшифровку T-RFLP - профилей, результатом которых является не только установление количества и относительной численности (доли) доминирующих групп микроорганизмов, но и их таксономической принадлежности, например, программа FragSort или другие (Marsh, et al., 2000; Kent, et al., 2003; Ricke, et al., 2005; Junier, et al., 2008; Shyu, et al., 2007).

_«*

(T)/

lyi^.

(Ю

ВЫДЕЛЕНИЕ ТОТАЛЬНОЙ ДНК

III IUI

TT

4

Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Ильина, Лариса Александровна

выводы

1. Метод Т-ЫБЬР модифицирован для анализа микрофлоры рубца крупного рогатого скота, в том числе выбраны методы экстракции и очистки ДНК, условия ПЦР-амплификации универсальных фрагментов генов микроорганизмов, эндонуклеазы рестрикции, что позволило получить высоковос-производимые результаты. Индексы сходства Брея-Кертиса для бактериального сообщества составляют 0,84-0,92, для грибного - 0,89-0,91, для архей-ного-0,90-0,91.

2. В рубце крупного рогатого скота с использованием модифицированного молекулярно-биологического метода Т-КБЪР выявлено более 200 филоти-пов бактерий, архей и грибов, в том числе некультивируемых видов. Результаты Т-Ш^ЪР-анализа бактериального сообщества рубца крупного рогатого скота сопоставимы с данными традиционных микробиологических методов.

3. Во всех компонентах микробного сообщества рубца крупного рогатого скота зафиксированы изменения, связанные с кормлением животных: через два-три часа после кормления животных в рубце увеличивается доля сахаро-литических (семейств аояпсИасеае, ЕиЬаМепасеае), лактат-утилизирующих (семейства УеШопеИасеае) и амилолитических бактерий (филы Bacteroidetes).

4. Введение в рацион бычков пробиотиков Целлобактерин-Т и Целлобак-терин-Б оказывает регулирующее действие на состав бактериального сообщества в рубце и показатели рубцового пищеварения: увеличивается доля амилолитических (в 2,22 и 4,08 раз соответственно) и лактатферментирую-щих бактерий (в 3,77 и 7,33 раза), а также измененяется соотношение ЛЖК в рубце в сторону увеличения доли пропионата (на 9,4 и 1,4%) по сравнению с контрольным вариантом.

5. Изучен процесс формирования состава микробного сообщества в рубце в процессе роста и развития животных на основе молекулярно-биологического метода Т-Ш^ЬР. Показано, что смена рациона в процессе роста бычков сопровождается сменой доминирующих таксономических единиц в составе бактерий, архей и грибов.

6. Содержание в рубце бычков микроорганизмов, ферментирующих растительные корма, к 2-3-месячному возрасту достигает уровня, характерного для взрослого животного. Введение в рацион пробиотика Целлобактерин-Т способствует более раннему увеличению количества целлюлозолитических, амилолитических и лактат-ферментирующих микроорганизмов в рубце животных.

7. Установлена достоверная положительная связь между содержанием в рубце бычков разного возраста бактерий, обладающих способностью ферментировать углеводы растительных кормов (семейств ВаЫего1<1асеае, С1о-БМсИасеае, ЕиЪаШпасеае, Ьаскпоярггасеае, Киттососсасеае) с долей в рационе сена, силоса и концентратов, а также с увеличением продуктивности животных.

8. Снижение продуктивности у исследованных коров сопровождалось значительными нарушениями в таксономической структуре микробного сообщества: выявлено низкое количество целлюлозолитических (0,93±0,26-7,03±0,6%), лактат-ферментирующих бактерий (0,5±0,16 - 1,87±0,56%), а также высокое содержание молочнокислых бактерий (до 6,7±0,60) и фузо-бактерий (до 4,08±1,07%).

9. Установлена достоверная положительная связь между уровнем молочной продуктивности коров и долей бактерий семейств ЬаскпоБрггасеае и УеШопеИасеае (г=0,76 и г=0,60 соответственно) и достоверная отрицательная - с содержанием бактерий рода ЕшоЬа^епит (г=-0.78).

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Научным учреждениям рекомендуем проводить комплексный анализ микробного сообщества рубца крупного рогатого скота на основе модифицированного метода Т-КРЬР для разработки методов направленной регуляции микробиологических процессов в преджелудках, позволяющих повысить эффективность использования корма, увеличить продуктивность и снизить заболеваемость животных.

Сельскохозяйственным предприятиям рекомендуем применение про-биотиков на основе бацилл и дрожжей для регуляции состава микробного сообщества в рубце крупного рогатого скота для увеличения продуктивности бычков на откорме и дойных коров.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты T-RFLP-анализа позволили подтвердить мнение ряда ученых, показавших, что рубец жвачных животных - уникальная симбиотиче-ская экосистема, в которой множество микроорганизмов (бактерий, грибов, простейших, метаногенных архей) взаимосвязаны между собой и за счет деятельности собственных энзиматических систем обеспечивают животное питательными веществами (Георгиевский, 1990; Тараканов, 2006; Hungate, 1966; Chalupa, 1980; Church, 1993; Owens et al, 1998; Tajima et al, 2001; Rüssel, 2002; Edwards et al, 2004; Mrazek et al, 2006; Skillman et al, 2006; Fernando et al., 2008). В свою очередь, организм хозяина создает оптимальные условия для жизнедеятельности микроорганизмов, т.е. для их роста и размножения (питательными веществами, температурой окужающей среды и буферный состав окружающей среды) (VanNevel, Demeyer, 1988; Rüssel, 2002).

Данные, полученные в физиологических и научно-хозяйственных экспериментах с помощью микробиологических, молекулярно-биологических, физиологических, биохимических и зоотехнических методов показали, что микробное сообщество рубца является достаточно хрупкой экосистемой. Установлено, что молекулярно-биологический метод T-RFLP позволяет зафиксировать более 200 филотипов микроорганизмов рубца крупного рогатого скота (бактерий, архей, грибов), в том числе значительное количество не-культивируемых видов, которые ранее с помощью традиционных методов микробиологии не удавалось выявить а, следовательно, установить роль данных микроорганизмов в процессах ферментации. Показано, что применение данного подхода позволяет фиксировать детальные изменения в экосистеме рубца под действием таких факторов, как рацион, возраст, состояние здоровья животных.

Установлено, что смена рациона животных, добавление пробиотиче-ских препаратов, приводит к изменению микробиоценоза, что ведет за собой изменение параметров рубцового пищеварения, направленности ферментативных процессов, изменение показателей переваримости питательных веществ и, в конечном счете, оказывает влияние на продуктивность животных.

При анализе суточных изменений в микробиоценозе рубца бычков были выявлены колебания в составе бактерий, участвующих в процессах ферментации углеводов растительных кормов - бактерий фил Вас1его1с1е1е8 (семейств Вас1его1с1асеае, Е1ауоЪас1епасеае, ПехЛаМегасеаё) и Е1гт1сШея (семейств аояМсИасеае, ЕиЪаМепасеае, Ьаскпозрггасеае, Яиттососсасеае), а также в составе грибов и архей. Кроме того, анализ микробного сообщества рубца бычков показал, что введение в рацион бычков пробиотиков Целло-бактерин-Т и Целлобактерин-8 оказывает выраженное регулирующее действие на состав микрофлоры в преджелудках, при этом наблюдается увеличение доли амилолитических (семейства ВаМегогйасеаё) и лактатферменти-рующих бактерий (семейства УеШопеНасеаё), а также изменение соотношения ЛЖК в сторону образования пропионата.

При изучении формирования микробного сообщества рубца бычков был показано, что содержание микроорганизмов, участвующих в ферментации углеводов растительных кормов (бактерии семейств ВаМегогйасеае, ПауоЬаМепасеае, ПехЛаМегасеае, СЬяМсИасеае, ЕиЬаМепасеае, ЬасИпозрг-гасеае, Яиттососсасеаё) уже к 2-3-месячному возрасту достигает уровня, характерного для взрослого животного. Показано, что добавление в рацион бычков пробиотика Целлобактерин-Т способствовало более раннему (2-месячные телята), по сравнению с контрольным вариантом, увеличению количества целлюлозолитиков практически до уровня взрослого животного. Таким образом, результаты исследований свидетельствуют о возможности регулирования количества и увеличения содержания определенных целлюло-золитических микроорганизмов в рубце телят с помощью пробиотика Целло-бактерин-Т.

Продемонстрировано, что отклонение от оптимальных условий -скармливание большой доли концентратов - приводит к нарушению экосистемы рубца, что в результате отрицательно отражается на продуктивности животных. В рубце выбракованных животных выявлено низкое содержание целлюлозолитических бактерий семейств Ьаскпозрггасеае и Яиттососсасеае, лактат-утилизирующих - семейства УеШопеИасеае, высокий уровень молочнокислых бактерий семейства ЬаМоЬасШасеае, ферментирующих моносахара до лактата в рубце, и бактерий рода ГтоЪаМегшт. Кроме того, была установлена достоверная положительная связь доли целлюлозолитических бактерий семейств ЬаскпоБр1гасеае и Яиттососсасеае в рубце коров и достоверная отрицательная бактерий рода ЕтоЬаМегшт с уровнем молочной продуктивности. Подобная ситуация обычно наблюдается при ацидозе рубца, что дает возможность предположить, что снижение удоев у выбракованных животных, вероятно, произошло в результате лактатного ацидоза (Мосек, 1997).

Таким образом, в результате комплексных исследований получены экспериментальные данные, которые существенно дополняют знания о микрофлоре преджелудков и ее роли в питании жвачных, что открывает новые перспективные направления поиска способов направленной регуляции микробиологических процессов в преджелудках. Полученные результаты показывают необходимость использования Т-КБЪР-анализа для регистрации нарушений в микробной экосистеме рубца крупного рогатого скота. Важным плюсом данного метода является возможность комплексного изучения микробиоценоза рубца с рассмотрением трех основных групп микроорганизмов - бактерий, архей и грибов. Это является крайне актуальным в связи с тем, что здоровье животных не столько зависят от какого-то одного компонента сообщества, сколько представляют собой результат взаимодействия различных групп микроорганизмов. В связи с этим, проведение Т-КТЪР-анализа микрофлоры коров позволит диагностировать причины снижения продуктивности животных, скорректировать нежелательные изменения «нормальной» микрофлоры за счет изменения рациона, что позволит повысить эффективность использования корма жвачными животными, снизить заболеваемость и увеличить их продуктивность.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ильина, Лариса Александровна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Алиев, A.A. Липидный обмен и продуктивность жвачных животных. / A.A. Алиев-М: Колос. 1980. - 380с.

2. Алиев A.A. Обмен веществ у жвачных животных. М., 1997.

3. Бусловская Л.К. Кислотно-щелочной баланс в организме особей крупного рогатого скота в зависимости от возраста животных / Л.К. Бусловская // Сельскохозяйственная биология. 2002. - № 2. - С. 82-85.

4. Георгиевский В.И. Физиология сельскохозяйтвенных животных. - М.: Агропромиздат, 1990. - 511 с.

5. Горлов, И.Ф. Исследование селена при производстве продукции животноводства и БАДов: монография / И.Ф.Горлов; ВолгГТУ, ГУ Волгогр. НИТИ ММС и ППЖ РАСХН. - М.; Волгоград: Вестник РАСХН, 2005. - 189 с.

6. Догель В.А. Общая протистология // М.: Сов. наука, 1951. - 603 с.

7. Долгов И.А., Долгова С.И. Микрофауна рубца и ее роль в питании жвачных. В сб.: Сельскохозяйственные животные, физиологические и биохимические параметры организма. Боровск, 2002: 335-347.

8. Дубинин А.В, Ардатская М.Д., Кондракова O.A. и др. Клиническая медицина, 1987, №7: 140-144.

9. Кальницкий Б.Д. Современные подходы к разработке системы питания животных и реализации биологического потенциала их продуктивности / Б.Д. Кальницкий, В.В. Калашников // Вестник РАСХН. — 2006. — №2.

10. Калюжный, И. И. Ацидоз рубца / И. И. Калюжный // Ветеринария. -1988,-№7.-С. 42-47.

11. Курилов Н.В., Кроткова" А.П. Физиология и биохимия пищеварения жвачных. М.: Колос, 1971. - 432 с.

12. Курилов Н.В., Кошаров А.Н. Использование протеина корма животными. -М.: Колос, 1979.

13. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. - М.: Высшая школа, 1990. -352 с.

14. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М. Мир, 1984.-480 с.

15. Медведев А.Ю., Материкин A.M. Процессы рубцового метаболизма при введении в рацион коров крахмала и глюкозы. Тр. Свердловской научно-исследовательской и ветеринарной станции. Свердловск, 1995, 10: 193-196.

16. Отава A.M., Скорохид В.И. Биологическая роль короткоцепочечных кислот в организме жвачных животных. С.-х. биол., 1992, 2: 122-129.

17. Орсков Э.Р. Протеиновое питание жвачных животных. М., 1985: 31-53.

18. Молочное скотоводство России / Под ред. Н.И. Стрекозова и Х.А.Амерханова. - Москва. 2006. - 604 с.

19. Пивняк И.Г., Тараканов Б.В. Микробиология пищеварения жвачных. 1982.

20. Попов И.С. Протеиновое питание животных. /И.С. Попов, И.П. Дмитроченко, В.М. Крылов М.: Колос, 1975. - 339с

21. Прохоренко П.Н., Волгин В.И., Романенко JI.B., Бибикова A.C., Федорова З.Л., Стеценко Н.П. Реализация генетического потенциала продуктивности в молочном скотоводстве на основе оптимизации системы кормления (Рекомендации). — М.: ФГНУ «Росинформагротех», 2006. — 36 с.

22. Раецкая Ю.И. Методика зоотехнического и биохимического анализа кормов, продуктов обмена и животноводческой продукции. // Раецкая Ю.И., Сухарева В.Н. и др. Дубровицы. ОНТИ. 1970. 128 с.

23. Романенко JI.B. Особенности кормления и система рационов для высокопродуктивных коров / JI.B. Романенко, В.И. Волгин // Сельскохозяйственная биология, 2007. - № 4. - С. 20-27.

24. Рыбина И.И. Особенности рубцового пищеварения у каракульских ягнят подсосного периода. Материалы второй Всесоюзной конференции по физиологическим и биохимическим основам повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. Боровск, 1963.

25. Савченко Ю.И., Мусинко Н.В. Рубцовый метаболизм и углеводно-жировой обмен у коров при скармливании различных углеводистых кормов. Вест. Агарной науки, 1994, 4: 65-74.

26. Севастьянова H.A. Развитие рубцового пищеварения у молодняка жвачных животных. Материалы третьей Всесоюзной конференции по физиологическим и биохимическим основам повышения продуктивности сельскохозяйственных животных. Боровск, 1965. с.222.

27. Синещеков А.Д. Биология питания сельскохозяйственных животных /А.Д. Синещеков // Биологические основы рационального использования кормов. М.: Колос, 1965. - 399с.

28. Синещеков А.Д. Методика комплексного изучения физиологических процессов питания / А.Д. Синещеков, З.М. Шеремет// Физиология питания сельскохозяйственных животных. —М.: Сельхозиздат, 1953. с.24-58.

29. Солун A.C. Физиологическая функция рубца при раннем приучении телят к растительным кормам, / А.С Солун. // Вестник с.-х. науки.- 1970.-№6.-с.69-73.

30. Стрекозов Н.И., Дедов М.Д., Тимофеев Ю.П. Основные направления племенной работы с симментальской породой. Зоотехния. 1995. № 3. С. 4. 1

31. Тараканов Б.В., Николичева Т.А. Целлюлозолитическая микрофлора и метаболические функции в рубце молодняка крупного рогатого скота при раннем включении в рацион растительных кормов. Сельскохозяйственная биология. 1986. №4. с. 89-94.

32. Тараканов Б.В. Методы исследования микрофлоры пищеварительного тракта сельскохозяйственных животных и птицы - М.: Научный мир, 2006. -188 с.

33. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии / Е.З. Теппер, В.К. Шильнико-ва, Г.И. Переверзева. - М.: Колос, 1975. - 216 с.

34. Томмэ. М.Ф. Методика взятия образцов для химического анализа.- М., 1969.- 34 с.

35. Увеличение продолжительности хозяйственного использования коров и повышение экономической эффективности и конкурентоспособности молочного животноводства в хозяйствах Ленинградской области. Рекомендации. Спб, 2007.

36. Фишер P.A. Статистические методы для исследователей. - М.: Госстатиз-дат, 1958. - 267 с.

37. Шевелев Н.С., Грушкин А.Г. // Сельскохозяйственная биология. Сер .'Биология животных. - 2003. - N6.-C.15-22. - С. 2003

38. Эрнст J1.K., Зиновьева Н.А. Биологические проблемы животноводства в XXI веке. М.: РАСХН, 2008, 501 с.

39. Abou Akkada, A. R. and Howard, В. Н., The biochemistry of rumen protozoa. 4. Decomposition ofpectic substances // Biochem. J. - 1961. Vol.78. P.512-517.

40. Akin D.E., Ames Gottferd N., Hartly R.D., Fulcher R.G., Rigsby C.L.,. Micro-spectrometry of phenolic compounds in Bermuda grass cell walls in relation to microbial digestion // Crop. Science. - 1990. - Vol.30. P.396.

41. Albers S.V., W.N. Konings, and J. M. Driessen. Solute Transport, in Archaea: Molecular and Cellular Biology // ASM Press, Washington, DC. 2007. - P. 354-368.

42. Allen M.S. Relationship between fermentation acid production in the rumen and the regulirement for physically effective fiber // J. Dairy Sci. - 1997. - Vol.80. №7. P.l447-1462.

43. Amann R.I., Lin C., Key R., Montgomergy L., Stahl D.A. Diversity among Fi-brobacter isolates: towards a phylogenetic classification // Syst. Appl. Microbiol. -1992,-Vol.15. P.23-31.

44. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation // Microbiol. Rev. - 1995. -Vol.59. P.143-169

45. Armstrong D.G., Gilbert, H.J.. Biotechnology and the rumen: a mini review // J. Sci. Food Agric.- 1985,-Vol.36. P. 1039-1046.

46. Aurungzeb M., Oadeer M., Iqbal J. Production of raw starch hydrolyzing amy-lolytic enzymes by Streptococcus bovis PCSIR-7B // Pakistan Journal of Scientific and Industrial Research. - 1992. - Vol.35. P.520-523.

47. Axelrood P.E., M.L. Chow, C.C. Radomski, J.M. McDermott, and J. Davies. Molecular characterization of bacterial diversity from British Columbia forest soils subjected to disturbance // Can. J. Microbiol. - 2002. - Vol.48. P.655-74.

48. Ayala-del-Rio H. L., Callister, S. J., Criddle, C. S., and Tiedje, J.M. Correspondence between Community Structure and Function during Succession in Phenol-

and Phenol-plus-Trichloroethene-Fed Sequencing Batch Reactors // Applied and Environmental Microbiology - 2004. - Vol.70(8). P.4950-4960.

49. Bauchop T., D.O. Mountfort. Cellulose fermentation by a rumen anaerobic fungus in both the absence and the presence of rumen methanogens // Appl. Environ. Microbiol. - 1981. - Vol.42. P.l 103-1110.

50. Bauchop T. Rumen anaerobic fungi of cattle and sheep // Journal of Applied Environmental Microbiology. - 1979. - Vol.38. P.148-158.

51. Bauchop T. Scanning electron microscopy in the study of microbial digestion of plant fragments in the gut. In "Contemporary Microbial Ecology". D.C. Ellwood, J.N. Hedger, M.J. Latham, J.M. Lynch and J.H. Stater (eds.). // Academic Press London. - 1980. - P.305-326,

52. Beauchemin, K.A., W.Z. Yang, D.P. Morgavi, G.R. Ghorbani, W. Kautz, and J.A.Z. Leedle. Effects of bacterial direct-fed microbials and yeast on site and extent of digestion, blood chemistry, and subclinical ruminal acidosis in feedlot cattle // J. Anim. Sci. - 2003. - Vol. 81. P.1628-1640.

53. Beja O., M. T. Suzuki, E.V. Koohin, L. Aravind, A. Hadd, L.P. Nguyen* R. Villacorta, M. Amjadi, C. Garrigues, S.B. Jovanovich, R.A. Feldman, and E.F. De-Long. Construction and analysis of bacterial artificial chromosome libraries from a marine microbial assemblage // Environ. Microbiol. - 2000. - Vol.2. P.516-29.

54. Benchaar C., H.V. Petit, R. Berthiaume, T.D. Whyte, and P.Y. Chouinard. Effects of dietary addition of essential oils and monensin premix on digestion, ruminal fermentation characteristics, milk production, and milk composition in dairy cows // J. Dairy Sci. - 2006. - Vol.89. P.4352-4364.

55. Benchaar C., H.V. Petit, R. Berthiaume, D.R. Ouellet, J. Chiquette, and P. Chouinard. Effects of essential oils on digestion, ruminal fermentation, rumen microbial populations, milk production, and milk composition in dairy cows fed alfalfa silage or corn silage // J. Dairy Sci. - 2007. - Vol.90. P.886-897.

56. Bennink M.R., T.R. Tyler, G.M. Ward, and D.E. Johnson. Ionic milieu of bovine and ovine rumen as affected by diet//J. Dairy Sci. - 1978. - Vol.61. P.315.

57. Bera-Maillet C., Ribot Y., Forano E. Fiber-degrading systems of different strains of the genus Fibrobacter // Applied and Environmental Microbiology. - 2004. -Vol.70. P.2172-2179.

58. Bergen, W.G., D.B. Bates. Ionophores: Their effect on production efficiency and mode of action // J. Anim. Sci. - 1984 - Vol.58. P. 1465.

59. Bernalier A., G. Fonty, F. Bonnemoy and P. Gouet. Inhibition of the cellulolyt-ic activity of Neocallimastix frontalis by Ruminococcus flavefaciens // J. Gen. Microbiol. - 1993. -Vol.139. P.873-880.

60. Bevans D.W., Beauchemin K.A., Schwartzkopf-Genswein K.S., Mc-Kinnon J.J., and Mcallister T.A.. Effect of rapid or gradual grain adaptation on subacute acidosis and feed intake by feedlot cattle // J. Anim. Sci. - 2005. - Vol.83. P.l 116-1132.

61. Biavati B., Mattarelli P. Bifidobacterium-Ruminantium Sp-Nov and Bifidobac-terium-Merycicum Sp Nov from the Rumens of cattle // International Journal of Systematic Bacteriology. - 1991. - Vol.41. P. 163-168.

62. Boadi D., C. Benchaar, J. Chiquette, D. Massé. Mitigation strategies to reduce enteric methane emissions from dairy cows: update review // Can. J. Anim. Sci. -2004.-Vol.84. P.319-335.

63. Bonhomme A. Rumen ciliates: their metabolism and relationships with bacteria and their hosts // Anim. Feed and Technol. - 1990. - Vol.30. P. 203-266.

64. Breitbar M., P. Salamon, B. Andresen, J.M. Mahaffy, A.M. Segall, D. Mead, F. Azam, and F. Rohwer. Genomic analysis of uncultured marine viral communities // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -2002. - Vol.99. P. 14250-14255.

65. Briesacher S. L., T. May, K. N. Grigsby, M. S. Kerley, R. V. Anthony, and J. A. Paterson. Use of DNA probes to monitor nutritional effects on ruminai prokaryotes and Fibrobacter succinogenes S85 // J. Anim. Sci. - 1992. - Vol.70. №1. P.289-295.

66. Broberg G. Putrefaction in the rumen as aprimary cause of disease Nordisk Ve-terinaermedicin. 1956. - Vol.8. P.935-952.

67. Bryant M.P. Bacterial species of the rumen // Bact. Rev. - 1959. - Vol.23, P.125

68. Busquet M., S. Calsamiglia, A. Ferret, and C. Kamel. Plant extracts affect in vitro rumen microbial fermentation // J. Dairy Sci. - 2006. - Vol.89. P.761-771.

69. Calsamiglia S., M. Busquet, P. W. Cardozo, L. Castillejos, and A. Ferret. Invited Review: Essential oils as modifiers of rumen microbial fermentation // J. Dairy Sci. - 2007. - Vol.90. P.2580-2595.

70. Castillejos L., S. Calsamiglia, A. Ferret, and R. Losa. Effects of dose and adaptation time of a specific blend of essential oils compounds on rumen fermentation// Anim. Feed Sci. Technol. - 2007. - Vol.132. P. 186-201.

71. Cardozo P. W., Calsamiglia, S., Ferret, A. and Kamel, C. Effects of natural plant extracts at different pH on in vitro rumen microbial fermentation of a highcon-centrate diet for beef cattle // J. Anim. Sci. - 2006. - Vol.84. P.2801-2808.

72. Chalupa W. Chemical control of rumen microbial metabolism. In Digestive Physiology and Metabolism in Ruminants. Ruckebush Y and Thvend P. (eds). Westport, CT: AVI Publishing Co., Inc. 1980.

73. Chen M., and M. J. Wolin. Effect of monensin and lasalocidsodium on the growth of methanogenic and rumen saccharolytic bacteria // Appl. Environ. Microbiol. - 1979.-Vol.38. P.72.

74. Cheng K.J., McCowan R.P., Costerton J.W. Adherent epithelial bacteria in ruminants and their roles in digestive tract function // Am. J. Clin. Nutr. - 1979. -Vol.32. P.139-148.

75. Church D.C. Ruminant Animal: Digestive Phisiology and nutrition. New Jersey: Prentice Hall. 1993.

76. Clement B.G. and C.L. Kitts. Isolating PCR-quality DNA from human feces with a soil DNA kit // BioTechniques. - 2000. - Vol.28. P.640-646.

77. Coe M.L., T.G. Nagaraja, Y.D. Sun, N. Wallace, E.G. Towne, K.E. Kemp, and J.P. Hutcheson. Effect of virginiamycin on ruminal fermentation in cattle during adaptation to a high concentration diet and during an induced acidosis // J. Anim. Sci. - 1999. - Vol. 77. P.2259-2268.

78. Cordova-Kreylos A.L., Cao, Y., Green, P.G., Hwang, H., Kuivila, K.M., La-Montagne, M.G., Van De Werfhorst, L.C., Holden, P. A., and Scow, K.M. Diversity, Compostion, and Geographic Distribution of Microbial Communities in California

Salt Marsh Sediments // Applied and Environmental Microbiology. - 2006. - Vol.72. №5. P.3357-3366.

79. Cotta M.A., and J.B. Russell. Digestion of nitrogen in the rumen: A model for metabolism of nitrogen compounds in gastrointestinal environments, in Gastrointestinal Ecosystems and Fermentations // ed. Chapman and Hall, New York, NY. - 1997. - Vol.1. P.3 80-423

80. Counotte G.H.M., Prins R.A., Janssen R.H. and Debie M.J. Role Megasphaera-Elsdenii in the Fermentation of Lactate-2-C-13 in the Rumen of Dairy-Cattle // Applied and Environmental Microbiology. - 1981. - Vol.42. P.649-655.

81. Cushnie G.H., Richardson A.J., Sharman, G.A.M. Procedures and equipment for the production and reraring of gnobiotic lambs // Laboratory Animals. - 1981. -Vol.15. P. 199-204.

82. Dann H.M. Manipulating ruminal fermentation using organic acids. In: Cornell Nutrition Conference, Department of Dairy Science, Cornell University, Ithaca, N.Y.. U.S.A. 2005.

83. Dawson K.A. Current and future role of yeast culture in animal production: A review of research over the last six years. In: T. P. Lyons (Ed.) Biotechnology in the Feed Industry, p 1. Alltech Technical Publications, Nicholasville, KY. 1992.

84. Dawson K.A., K.E. Newman, and J.A. Boling. Effects of microbial supplements containing yeast and lactobacilli on roughage-fed ruminal microbial activities// J. him. Sci. - 1990.-Vol.68. P.3392

85. Dehority B.A., Orpin C.G. Development of, and natural fluctuations in, rumen microbial population. In "The Rumen Microbial Ecosystem", P.N. Hobson (ed.). -1988.P 151-183.

86. Dehority B. A. 1969. Pectin-Fermenting Bacteria Isolated from Bovine Rumen. Journal of Bacreiology 99: 189-190.

87. Dehority B.A.. Protozoa of the digestive tract of herbivorous mammals. Insect Sci. Appl., 1986, 7, 279-296.

88. Dehority B.A. Rumen ciliate protozoa of the blue duiker (Cephalophus monticola), with observations on morphological variation lines within the species Entodi-nium dubardi // Journal ofEukaryotic Microbiology. - 1994. - Vol.41. P. 103-111.

89. Dehority B.A. Rumen Microbiology. Nottingham University Press, Nottingham, UK. 2003.

90. Dennis S. M., T. G. Nagaraja, and A. D. Dayton. Effect of lasalocid, monensin and thiopeptin on rumen protozoa.// Res. Vet. Sci. - 1986. - Vol.41. P.251.

91. Dinsdale E.A., R.A. Edwards, D. Hall, F. Angly, M. Breitbart, J.M. Brule, M. Furlan, C. Desnues, M. Haynes, L.L. Li, L. McDaniel, M.A. Moran, K.E. Nelson, C. Nilsson, R. Olson, J. Paul, B.R. Brito, Y.J. Ruan, B.K. Swan, R. Stevens, D.L. Valentine, R.V. Thurber, L. Wegley, B.A. White, and F. Rohwer. Functional metagenomic profiling of nine biomes // Nature. - 2008. - Vol.455. P.830-830.

92. Dragulici V. Modificari histophatilogice in mucoasa rumenului la mieii ingra-sati cu concentrate. Seminarul «Ameliorarea, tehnologia si patologia rumegatoarelor» // Cluj-Napoca. - 1986. - Vol.11. P.245-247.

93. Duarte G.F., A.S. Rosado, L. Seldin, A.C. Keijzer-Wolters, and J.D. van Elsas. Extraction of ribosomal RNA and genomic DNA from soil for studying the diversity of the indigenous bacterial community // Journal of Microbiological Methods. - 1998.

Vol.32. P.21-29.

94. Dunbar J., Ticknor, L.O., and Kuske, C.R. Phylogenetic specificity and reproducibility and new method for analysis of terminal restriction fragment profiles of 16S rRNA genes from bacterial communities // Appl. Envir. Microbiol. - 2001. - Vol.67. P.190-197.

95. Dunbar J., S. White, and L. Forney. Genetic diversity through the looking glass: effect of enrichment bias // Appl Environ Microbiol. - 1997. - Vol.63. №4. P.1326-1331.

96. Gabor E.M., E. J. Vries, and D. B. Janssen. Efficient recovery of environmental DNA for expression cloning by indirect extraction methods.// FEMS Microbiol. Ecol. -2003,-Vol.44. P.153-63.

97. Gafan G.P., Lucas V.S., Roberts G.J., Petrie A., Wilson M., Spratt D.A. Statistical analyses of complex Denaturing Gradient Gel Electrophoresis profiles // J. Clin. Microbiol. - 2005. - Vol.43. №8. P.3971-3978.

98. Goad D.W. Goad C.L. and Nagaraja T.G. 1998. Ruminal microbial and fermentative changes associated with experimentally indiced subacute acidosis in steers. Journal of Animal Science 76: 234-241

99. Gradel C.M., B.A. Dehority. Fermentation of isolated pectin and pectin from intact forage by pure cultures of rumen bacteria // Appl. Microbiol. - 1972. - Vol.23. P.332-340.

100. Grant R.J., Muckian, L.M., Clipson, N.J.W., and Doyle, E.M. Microbial community changes during the bioremediation of creosote-contaminated soil // Letters in Applied Microbiology. - 2007. - Vol.44. P.293-300.

101. Gruby D. and Delafond, H.M.O. Recherches sue des animalcules se devello-pant en grand nombre dans l'estomac et dans les intestines pendant la digestion des animaux herbivores et carnivores // C. R. Hebd. Seances Acad. Sci., Paris. - 1843. -Vol.17. P.1304-1308.

102. Guan H., K.M. Wittenberg, K.H. Ominski, and D.O. Krause. Efficacy of iono-phores in cattle diets for mitigation of enteric methane // J. Anim. Sci. - 2006. -Vol.84. P.1896-1906.

103. Edwards J.E., Mcewan N.R., Travis A.J. and Wallace R.J. 16S rDNA library-based analysis of ruminal bacterial diversity // Antonie Van Leeuwenhoek International Journal of General and Molecular Microbiology. - 2004. - Vol.86. P.263-281.

104. Elam N.A., J.F. Gleghorn, J.D. Rivera, M.L. Galyean, P.J. Defoor, M.M. Bra-shears, and S.M. Younts-Dahl. Effects of live cultures of Lactobacillus acidophilus (strains NP45 and NP51) and Propionibacterium freudenreichii on performance, carcass, and intestinal characteristics, and Escherichia coli 0157 shedding of finishing beef steers// J. Anim. Sci. - 2003. - Vol.81. P.2686-2698

105. Elliott R., A. J. Ash, F. Colderon-Cortes, B. W. Norton, and T. Rauchop. The influence of anaerobic fungi on rumen volatile fatty acid concentrations in uiuo // J. Agric. Sci. - 1987. -Vol.109 P.13.

106. Engebreston J., J. and Moyer, C. L. Fidelity of Select Restriction Endonucleas-es in Determining Microbial Diversity by Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism // Applied and Environmental Microbiology. - 2003. - Vol.69. №8. P.4823-4829.

107. Fernando S.C., Purvis H.T., Najar F.Z., Sukharnikov L.O., Krehbiel C.R., Na-garaja T.G., Roe B.A., and DeSilval U.. Rumen Microbial Population Dynamics during Adaptation to a High-Grain Diet // Applied and Environmental Microbiology. -2010. - Vol.76. P.7482-7490.

108. Ferry J.G., K.A. Kastead. Methanogenesis. Molecular and Cellular Biology // R. Cavicchioli, ed. ASM Press, Washington, DC. - 2007. P.288-314

109. Firkins J.L., A.N. Hristov, M.B. Hall, G .A. Varga, and N.R. St-Pierre. Integration of ruminai metabolism in dairy cattle // J. Dairy Sci. - 2006. - Vol.89.

110. Flint H.J., A.M. Thomson. Deoxyribonuclease activity in isolated rumen bacteria and rumen fluid // Lett. Appl. Microbiol. - 1990. - Vol.11. P. 18-21.

111. Flint H., Thomson, A.M. Genetic manipulation of rumen bacteria with special reference to fibre digestion // Anim. Feed Sci. Technol. - 1991. - Vol.32. P. 123-129.

112. Fonty G., Gouet P., Jouany J.P., Senaud, J. Establishment of the microflora and anaerobic fungi in the rumen of lambs // J. Gen. Microbiol. - 1987. - Vol.13. P. 18351843.

113. Fonty G., K.N. Joblin. Rumen anaerobic fungi: their role and interactions with other rumen microorganisms in relation to fiber digestion. In: Physiological Aspects of Digestion and Metabolism in Ruminants (Ed. T. Tsuda, Y. Sasaki and R. Kawa-shima) // Academic Press, Toronto, ON. - 1990. P/665-680

114. Forster R., J. Gong, and R. Teather. Group-specific 16S rRNA hybridization probes for determinative and community structure studies of Butyrivibrio fibrisolvens in the rumen // Appl. Environ. Microbiol. - 1997. - Vol.63. P. 1256-1260.

115. Forster R.J., Teather, R. M., Gong, J. and Deng, S. J. 16S rDNA analysis of Butyrivibrio fibrisolvens: Phylogenetic position and relation to butyrate producing anaerobic bacteria from the rumen of white tailed deer // Lett. Appl. Microbiol. -1996.-Vol.23. P.218-222.

116. Friedrich M.W., Schmitt-Wagner, D., Lueders, T., and Brune, A. Axial Differences in Community Structure of Crenarchaeota and Euryarchaeota in the Highly Compartmentalized Gut of the Soil-Feeding Termite Cubitermes orthognathus // Applied and Environmental Microbiology. - 2001. - Vol.67. №10. P.4880-4890.

117. Frostegard A., S. Courtois, V. Ramisse, S. Clerc, D. Bernillon, F. Le Gall, P. Jeannin, X. Nesme, and P. Simonet. Quantification of bias related to the extraction of DNA directly from soils // Appl. Environ. Microbiol. - 1999. - Vol.65. P.5409-20.

118. Handelsman J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms // Microbiol. Mol. Biol. Rev. - 2004. - Vol.68. P.669-85.

119. Harrison D.G., Mc Allan, A.B. Factors affecting microbial growth yields in the reticulo-rumen. In "Digestive Physiology and Metabolism in Ruminants". Y. Ruckebusch & P. Thivend (eds.), MTP Press, Lancaster. - 1980. P.205-226,

120. Harry M., B. Gambier, Y. Bourezgui, and E. Garnier-Sillam. Evaluation of purification procedures for DNA extracted from organic rich samples: interference with humic substances // Analysis. - 1999. - Vol.27. P.439-442.

121. Hebraud M., and M. Fevre. Characterization of glycoside and polysaccharide hydrolases secreted by the rumen anaerobic fungi Neocallimastix frontalis, Sphaero-monas communis and Piromonas communis // J. Gen. Microbiol. - 1988. - Vol.134. P. 1123-1129.

122. Hegarty R. S, Reducing rumen methane emissions through, elimination of rumen protozoa // Australian Journal of Agricultural Research. - 1999. - Vol.50. P.1321-1327.

123. Henderson C., C.S. Stewart, and F.V. Nekrep. The effect of monensin on pure and mixed cultures of rumen bacteria // J. Appl. Bacteriol. - 1981. - Vol.51. P. 159

124. Handelsman, J. Metagenomics: application of genomics to uncultured microorganisms. Microbiol // Mol. Biol. Rev. - 2004. - Vol.68. P.669-85.

125. Henning P.H., C.H. Horn, D.G. Steyn, H.H. Meissner, and F.M. Hagg. The potential of Megasphaera elsdenii isolates to control ruminal acidosis. Anim. Feed Sei. Technol. 2010a.l57:13-19.

126. Henning, P.H., C.H. Horn, K.J. Leeuw, H.H. Meissner, and F.M. Hagg. Effect of ruminal administration of the lactate-utilizing strain Megasphaera elsdenii (Me) NCIMB 41125 on abrupt or gradual transition from forage to concentrate diets // Anim. Feed Sei. Technol. - 2010b. - Vol.157. P.20-29.

127. Hespell R.B., D.E. Akin, B.A. Dehority. Bacteria, fungi, and protozoa of the rumen. In: Mackie, R. I., B. A. White & R. E. Isaacson (eds) Gastrointestinal Microbiology, vol. 2. Chapman and Hall, New York, - 1997. P.59-141.

128. Hess, et al. Metagenomic Discovery of Biomass-Degrading Genes and Genomes From Cow Rumen // Science. - 2011. Vol.331. P.463-467.

129. Holben W.E., J.K. Jansson, B.K. Chelm, and J.M. Tiedje. DNA Probe Method for the Detection of Specific Microorganisms in the Soil Bacterial Community // Appl. Environ. Microbiol. - 1988. - Vol.54. P.703-711.

130. Hullar M.A.J., Kaplan, L.A., and Stahl, D.A. Recurring Seasonal Dynamics of Microbial Communities in Stream Habitats // Applied and Environmental Microbiology. - 2006. - Vol.72. №1. P.713-722.

131. Hungate R.E. The anaerobic mesophilic cellulolytic bacteria // Bacteriol. Rev. -1950,-Vol.14. P.l.

132. Hungate R.E. Introduction: The ruminant and the rumen. In "The Rumen Microbial Ecosystem". P.N. Hobson (ed.). - 1988. P.l-19.

133. Hungate R.E. The Rumen and its Microbes. Academic Press, New York. -1966.

134. Hungate R.E. The rumen microbial ecosystem // Annual Review of Ecology and Systematics. - 1975. - Vol.6. P.39-66.

135. Irskov E.R., H.J. Flint. Manipulation of rumen microbes or feed resources as methods of improving feed utilization. In: The Biotechnology in Livestock in Developing Countries (Ed. A. G. Hunter). Rkitchie of Edinburgh Ltd, United Kingdom. 1989.

136. Ito A., Y. Miyazaki, S. Mai. Light microscopic observation of infraciliature and morphogenesis in six species of rumen Ostracodinium ciliates // Journal of Eukaryotic Microbiology. - 2001. - Vol.48. P.440-448.

137. Ives W., B. Torrey and C. Gordon. Knowledge Sharing is a Human Behavior. In: Knowledge Management: Classic and Contemporary Works, Morey, D., M. May-bury and B. Thuraisingham (Eds.). MIT Press. Cambridge. 2002. P.99-129.

138. Jarvis G.N., Strompl, C., Burgess, D.M., Skillman, L.C., Moore, E. R. B. and Joblin, K.N. Isolation and identification of ruminal methanogens from grazing cattle // Curr. Microbiol. - 2000. - Vol.40. P.327-332.

139. Joblin K.N., G.E. Naylor and A.G. Williams. Effect of Methanobrevibacter smithii on xylanolytic activity of anaerobic ruminal fungi // Appl. Environ. Microbiol. - 1990. - Vol.56. P.2287-2295.

140. Johnson D.E., K.A. Johnson, G.M. Ward, and M.E. Branine. Ruminants and other animals, ed. Springer-Verlag, Berlin, Heidelberg, Germany. - 2000. P. 112-133

141. Junier P, Junier, T., and Witzel, K. TRiFLe, a Program for In Silico Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis with User-Defines Sequence Sets // Applied and Environmental Microbiology. - 2008. -Vol.74. №20. P.6452-6456.

142. Kamra D.N., Saha, S., Bhatt, N., Chaudhary, L.C. and Agarwal, N. Effect of diet on enzyme profile, biochemical changes and in sacco degradability of feeds in the rumen of buffalo // Asian. Aust. J. Anim. Sci. - 2003. - Vol.16. P.374-379.

143. Kennedy M. J., Clarke R., Milligan Z. Influences of dietary sucrose and urea on transfer of endogenous urea to the rumen sheep and numbers of epithelia bacteria // Brit.J.Nutrit. 1981. Vol. 46, №3. P.533-541.

144. Kent A.D., Smith D.J., Benson B.J., and Triplett E.W. Web-Based Phylogenet-ic Assignment Tool for Analysis of Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Profiles of Microbial Communities // Applied and Environmental Microbiology. - 2003. - Vol.69. №11. P.6768-6776.

145. Khampa S., M. Wanapat, C. Wachirapakorn, N. Nontaso and M. Wattiaux, Effects of urea level and sodium dl-malate in concentrate containing high cassava chip on ruminal fermentation efficiency, microbial protein synthesis in lactating dairy cows raised under tropical condition // Asian-Aust. J. Anim. Sci. - 2006a. - Vol.19. P.837-844.

146. Khampa S., M. Wanapat, C. Wachirapakorn, N. Nontaso and M. Wattiaux. Effect of levels of sodium dl-malate supplementation on ruminal fermentation efficiency in concentrates containing high levels of cassava chip in dairy steers // Asian-Aust. J. Anim. Sci. - 2006. - Vol.3. P.368-375.

147. Khafipour Ehsan, Li, Shucong, Plaizier, Jan C., Krause, Denis O. Rumen Mi-crobiome Composition Determined Using Two Nutritional Models of Subacute Ru-minal Acidosis // Applied and Environmental Microbiology. - 2009. - Vol.75. P.7115-7124

148. Klieve A.V., Hennessy D., Ouwerkerk D., Forster R.J., Mackie R.I., Attwood G.T. Establishing populations of Megasphaera elsdenii YE 34 and Butyrivibrio fibri-solvens YE 44 in the rumen of cattle fed high grain diets // J. Appl. Microbiol. - 2003. - Vol.9. P.621-630.

149. Knaebel D. B., and R. L. Crawford. Extraction and purification of microbial DNA from petroleum-contaminated soils and detection of low numbers of toluene, octane and pesticide degraders by multiplex polymerase chain reaction and Southern analysis //Mol. Ecol. - 1995. - Vol.4. P.579-91.

150. Kocherginskaya S., Aminov, R. I. and White, B. A. Analysis of the rumen bacterial diversity under two different diet conditions using denaturing gradient gel electrophoresis, random sequencing, and statistical ecology approaches // Anaerobe. -

2001. -Vol.7. P.l 19-134. .

151. Koenig K. M., C. J. Newbold, F. M. Mcintosh, L. M. Rode. Effects of protozoa on bacterial nitrogen recycling in the rumen // Journal of Animal Science. - 2000. -Vol.78. P.2431-2445.

152. Koike S., S. Yoshitanib, Y. Kobayashi, and K. Tanaka. Phylogenetic analysis of fiber-associated rumen bacterial community and PCR detection of uncultured bacteria // FEMS Microbiol. Lett. - 2003. - Vol.229. P.23-30.

153. Konstantinov S. R., Fitzsimons, N., Vaughan, E. E. & Akkermans, A.D.L.

2002. From composition to functionality of the intestinal microbial communities. Tannock, G. W. eds. Probiotics and Prebiotics: Where Are We Going? // Caister Academic Press London, UK. - 2002. - P.59-84.

154. Kotarski S.F., Wanishka R.D. and Thurn K.K. Starch Hydrolysis by the Ru-minal Micro flor // Journal of Nutrition. - 1992. - Vol.122. P.178-190

155. Kraigher B., Kosjek, T., Heath, E., Kompare, B., and Mandic-Mulec, I. Influence of pharmaceutical residues on the structure of activated sludge bacterial com-

munities in wastewater treatment bioreactors // Water Research. - 2008. - Vol.42. P.4578-4588.

156. Krause D.O., Denman S.E., Mackie R.I., Morrison M., Rae A.L., Attwood G.T., McSweeney C.S. Opportunities to improve fiber degradation in the rumen: microbiology, ecology, and genomics // FEMS Microbiol. Rev. - 2003. - Vol.27. P.663-693.

157. Krehbiel C.R., S.R. Rust, G. Zhang, and S.E. Gilliland. Bacterial direct-fed microbials in ruminant diets: Performance response and mode of action // J. Anim. Sci. - 2003.-Vol.81. P.120-132.

158. Lana R.P., Russel J.B., Van Amburgh M.E. The role of pH in regulating ru-minal methane and ammonia production. J. Anim. Sci., 1998, 76, 8: 2190-2196

159. Lange M., P. Westermann and B. K. Ahring. Archaea in protozoa and metazoa // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2005. - Vol.66. P.465-474.

160. Larue R. et al. Novel microbial diversity adherent to plant biomass in the herbivore gastrointestinal tract, as revealed by ribosomal intergenic spacer analysis and rrs gene sequencing // Environ. Microbiol. - 2005. - Vol.7. P.530-543.

161. Latham M.J. Adhesion of rumen bacteria to plant cell wall. In "Microbial Adhesion to Surfaces". R.C.W. Berkeley, J.M. Lyn., J. Melling, P.R. Rutter, B. Vincent (eds.). Elio Howood, Child ter.- 1980. P.339-350.

162. Lee S.Y., J. Bollinger, D. Bezdicek, and A. Ogram. Estimation of the abundance of an uncultured soil bacterial strain by a competitive quantitative PCR method // Appl. Environ. Microbiol. - 1996. - Vol.62. P.3787-3793.

163. Leedle J.A.Z., M.P. Bryant and R.B. Hespell. Diurnal variations in bacterial numbers and fluid parameters in ruminal contents of animals fed low- or high-forage diets // Applied and Environmental Microbiology. - 1982. - Vol.44. P.402-412.

164. Leng R.A. Modification of rumen fermentation. In: Nutritional Limits to Animal Production from Pastures. [J B Hacker, Ed.] Commonwealth Agricultural Bureaux, Farnham Royal, UK. 1982. P.427-453.

165. Leser T.D., J.Z. Amenuvor, T.K. Jensen, R.H. Lindecrona, M. Boye, and K. Moller. Culture-independent analysis of gut bacteria: the pig gastrointestinal tract mi-crobiota revisited // Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - Vol.68. P.673-690.

166. Leser T., Lindecrona, R., Jensen, T. and M0ller, K. Changes in bacterial community structure in the colon of pigs fed different experimental diets and after infection with Brachyspira hyodysenteriae II Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - Vol.66. P.3290.

167. Li F., Hullar, M. A.J., and Lampe, J.W. Optimization of terminal restriction fragment polymorphism (T-RFLP) analysis of human gut microbiota // Journal of Microbiological Methods. - 2007. - Vol.68. P.303-311.

168. Li M., J. Gong, M. Cottrill, H. Yu, C. de Lange, J. Burton and E. Topp. Evaluation of QIAGEN® DNA Stool Mini Kit for ecological studies of gut microbiota // J. Microbiol. Methods. - 2003. - Vol.54. P.13-20.

169. Leiva E., M. B. Hall, and H. H. Van Horn. Performance of dairy cattle fed citrus pulp or corn products as sources of neutral detergent-soluble carbohydrates // J. Dairy Sci. - 2000. - Vol.83. P.2866.

170. Liles M. R., B. F. Manske, S. B. Bintrim, J. Handelsman, and R. M. Goodman. A census of rRNA genes and linked genomic sequences within a soil metagenomic library // Appl. Environ. Microbiol. - 2003. Vol.69. P;2684-2691.

171. Lin C., L. Raskin, and D. A. Stahl. Microbial community structure in gastrointestinal tracts of domestic animals: comparative analyses using rRNAtargeted oligonucleotide probes // FEMS Micriobiology Ecology. - 1997. - Vol.22. P.281-294.

172. Liolios K., Mavromatis K., Tavanarakis N and Kyrpides N.C. The Genomes on Line Database (GOLD) in 2007: status of genomic and metagenomic project and their associated metadata // Nuckeic Acids Research. - 2008. - Vol.36. P.475-479.

173. Liu W., Marsh, T., L., Cheng, H., and Forney, L.J. Characterization of Microbial Diversity by Determining Terminal Restriction Fragment Length Polymoprhisms of Genes Encoding 16S rRNA // Applied and Environmental Microbiology. - 1997. -Vol.63. №11. P.4516-4522.

174. Lowe S.E., Theodorou M.K., Trinci A.P.J. Cellulases and xylanase of anaerobic rumen fungus grown on wheat straw, wheat straw holocellulose, Cellulose and Xylan//Appl. Environ. Microbiol. - 1987. - Vol.53. P.1216-1223.

175. Lucker S., D. Steger, K. U. Kjeldsen, B. J. MacGregor, M. Wagner, and A. Loy. Improved 16S rRNA-targeted probe set for analysis of sulfate-reducing bacteria

by fluorescence in situ hybridization // J. Microbiol. Methods. - 2007. - Vol. 69. P.523-528.

176. Machmiiller A., C. R. Soliva and M. Kreuzer. Effect of coconut oil and defau-nation treatment on methanogenesis in sheep // Reproduction Nutrition and Development. - 2003. - Vol.43. P.41-55.

177. Mackie R., R. Aminov, B.A. White, and C. McSweeney. Molecular ecology and diversity of gut microbial ecosystems, p. 61-77. In P.B. Cronje (Ed.), Ruminant: Physiology, Digestion, Metabolisms, Growth and Reproduction. ACABI Publishing, New York. 2000.

178. Madden T.L., Tatusov R.L., Zhang J. Application of network BLAST server // Methods Enzymol. - 1996. - Vol.266. P.131-141.

179. Maniatas T., Fritsch E.F., Sambrook J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory; Cold Spring Harbor, New York: 1991.

180. Marsh T. L., Saxman, P., Cole, J., and Tiedje, J. Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis Program, a Web-Based Research Tool for Microbial Community Analysis // Applied and Environmental Microbiology. - 2000. - Vol.66. №8. P.3616-3620.

181. Martin S. A., and D. J. Nisbet. Effect of direct-fed microbials on rumen microbial fermentation // J. Dairy Sci. - 1992. - Vol.75. P. 1736.

182. Martin C., Devillard E. and Michalet-Doreau B. Influence of sampling site on concentrations and carbohydrate-degrading enzyme activities of protozoa and bacteria in the rumen // Journal Animal Science. - 1999. - Vol.77. P.979-983.

183. Martin C., D.P. Morgavi, M. Doreau. Methane mitigation in ruminants: from microbe to the farm scale // Animal. - 2010. - Vol.4. P.351-365.

184. Meyer N.F., G.E. Erickson, T.J. Klopfenstein, M.A. Greenquist, M.K. Luebbe, P. Williams and M.A. Engstrom. Effect of essential oils, tylosin, and monensin on finishing steer performance, carcass characteristics, liver abscesses, ruminal fermentation, and digestibility // J. Anim. Sci. - 2009. Vol.87. P.2346-2354.

185. Mertens D. R. Creating a system for meeting the fiber requirements of dairy cows // J. Dairy Sci. - 1997. - Vol.80. P.1463-1481.

186. McOrist A.L., M. Jackson and A.R. Bird. A comparison of five methods for extraction of bacterial DNA from human fecal samples // J. Microbiol. Methods. -2002.-Vol.50. P.131-139.

187. More M.I., J.B. Herrick, M.C. Silva, W.C. Ghiorse, and E.L. Madsen. Quantitative cell lysis of indigenous microorganisms and rapid extraction of microbial DNA from sediment // Appl. Environ. Microbiol. - 1994. - Vol.60. P. 1572-80.

188. Moreira D. Efficient removal of PCR inhibitors using agarose-embedded DNA preparations // Nucleic Acids Res. - 1998. - Vol.26. P.3309-10.

189. Mould D.L. and Thomas, G.J., The enzymic degradation of starch by holotrich protozoa from sheep rumen // Biochem. J. - 1958. - Vol.69. P.327-337.

190. Mountfort D.O., Asher, R.A. Production and regulation of cellulose by two strains of the rumen anaerobic fungus Neocallimastix frontalis // Appl. Environ. Microbiol. - 1985,- Vol.49. P.1314-1322.

191. Mountfort D.O., R.A. Asher and T. Bauchop. Fermentation of cellulose to methane and carbon dioxide by a rumen anaerobic fungus in triculture with Methano-brevibacter sp. Strain RA1 and Methanosarcina barkeri // Appl. Environ. Microbiol. - 1982.-Vol.44. P.128-134.

192. Mounfort D.O., R.A. Asher. Production of xylanase by the ruminal anaerobic fungus Neocallimastix frontalis // Appl. Environ. Microbiol. - 1989. - Vol.55. P. 10161022.

193. Mrazek J., Tepsic K., Avgustin G. and Kopecny J. Diet-depended shifts in ruminal butyrate-producing bacteria // Folia Microbilogica. - 2006. - Vol.51. P.294-298.

194. Muyzer G., de Waal, E. C. and Uitterlinden, G. A. Profiling of complex populations by denaturating gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction-amplified genes coding for 16S rRNA // Appl. Environ. Microbiol. - 1993. -Vol.59. P.695-700.

195. Muyzer G., Smalla, K. Application of denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) and temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) in microbial ecology // Antonie Leeuwenhoek. - 1998. - Vol.73. P. 127-141.

196. Nagaraja T.G., and M.B. Taylor. Susceptibility and resistance of ruminal bacteria to antimicrobial feed additives // Appl. Env/. Microbiol. - 1987. - Vol.53. P. 1620.

197. Nagaraja T.G., C.J. Newbold, C.J. Van Nevel, and D.I. Demeyer. Manipulation of ruminal fermentation, in The Rumen Microbial Ecosystem. P.N. Hobson and C.S. Stewart, ed. Chapman and Hall, London, UK. 1997. P.523-632

198. Nagaraja T.G. and M. M. Chengappa. Liver abscesses in feedlot cattle: A review// J. Anim. Sci. - 1998. - Vol.76. P.287-298.

199. Nagaraja T.G., Titgemeyer E.C. Ruminal acidosia in beef cattle: The current microbiological and nutritional outlook // Journal of Dairy Science. - 2007. - Vol.90. P.17-38.

200. Nagashima K., Hisada, T., Sato, M., and Mochizuki J. Application of New Primer-Enzyme Combinations to Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Profiling of Bacterial Populations in Human Feces // Applied and Environmental Microbiology. - 2003. - Vol.69. №2. P.1251-1262.

201. Nannipieri P., J. Ascher, M.T. Ceccherini, L. Landi, G. Pietramellara, G. Renella. Microbial diversity and soil functions // Eur. J. Soil Sci. - 2003. - Vol.54. P.655-670.

202. Nelson K.E., Zinder S.H., Hance I., Burr P., Odongo D,, Wasawo D., Odenyo A., Bishop R. Phylogenetic analysis of the microbial populations in the wild herbivore gastrointestinal tract: insights into an unexplored niche // Environ. Microbiol. - 2003. -Vol.5. P.1212-1220.

203. Newbold C. J., R. J. Wallace, N. D. Watt, and A. J. Richardson. The effect of the novel ionophore tetronasin (IC1 139603) on ruminal microorganisms // Appl. Environ. Microbiol. - 1988. - Vol.54. P.544.

204. Nicholson M. J., P. N. Evans, and K. N. Joblin. Analysis of Methanogen Diversity in the Rumen Using Temporal Temperature Gradient Gel Electrophoresis: Identification of Uncultured Methanogens // Microb. Ecol. - 2007. - Vol.54. P. 141-150.

205. Nisbet D. J. and S. A. Martin. Effect of dicarboxylic acids and Aspergillus ory-zae fermentation extract on lactate uptake by the ruminal bacterium Selenomonas ru-minantium // Appl. Environ. Microbiol. - 1990. - Vol.56. P.3515.

206. Nisbet D.J. and S.A. Martin. Effect of a Saccharomyces cereuisiae culture on lactate utilization by the ruminal bacterium Selenomonas ruminantium // J. Anim. Sci. - 1991.-Vol.69. P.4628.

207. Nisbet D.J. and S.A. Martin. Effects of fumarate, L-malate and Aspergillus oryzae fermentation extract on D-lactate utilization by the ruminal bacterium Seleno-monas ruminantiurn // Curr. Microbiol. - 1993. - Vol.26. P.133.

208. Nocek J. E. Bovine acidosis: implications on laminitis // J. Dairy Sei. - 1997. -Vol.80. P.1005-1028.

209. Preston T.R., Leng R.A. In Matching ruminant production systems with available resources in the tropics and sub-tropics. Stanthape, Queensland 4380, Australia. 1987. P.21-82.

210. Ogram A., G.S. Sayler, and T. J. Barkay. DNA extraction and purification from sediments // J. Microbiol. Methods. - 1987. - Vol.7. P.57-66.

211. Olsen G.J., Lane, D.J., Giovannoni S.J. and Pace N.R. Microbial Ecology and Evolution: A Ribosomal RNA Approach // Annual Reviews in Microbiology. - 1986. -Vol.40. P.337-365.

212. Olsen K.N., M. Henriksen, M. Bisgaard, O.L. Nielsen and H. Christensen. Investigation of chicken intestinal bacterial communities by 16S rRNA targeted fluorescence in situ hybridization // Antonie Van Leeuwenhoek. - 2008. - Vol.94. P423-437.

213. Orpin C.G. Isolation of cellulolytic phycomycete fungi from the caecum of the horse// Journal of General Microbiology. - 1981. - Vol.123. P.287-296.

214. Orpin C.G. Studies on the rumen flagellate Neocallimastix frontalis // Journal of General Microbiology. - 1975. - Vol.91. P.249-269.

215. Orpin C.G. Studies on the rumen flagellate Sphaeromonas communis // Journal of General Microbiology. - 1976. - Vol.94. P.270.

216. Orpin C.G. The rumen flagellate Piromyces communis: Its life history and invasion of plant material in rumen // Journal of General Microbiology. - 1977. -Vol.99. P.107-117.

217. Orpin C.G., Joblin, K.N. The Rumen Microbial Ecosystem, 2nd edn. Chapman & Hall, New York, NY. 1997. P. 140-195

218. Orskov E.R. Manipulation of rumen fermentation for maximum food utilization // World Rev. Nutr. Diet. - 1975. - Vol.22. P.153-182.

219. Osborn A.M. and C.J. Smith. Molecular microbial ecology. Taylor and Francis, New York; Abingdon [England]. 2005.

220. Osborn A.M., Moore, E.R.B., and Timmis, K.N. An evaluation of terminal-restriction fragment length polymorphism (T-RFLP) analysis for the study of microbial community structure and dymanics // Environmental Microbiology. - 2000. -Vol.2. №1. P.39-50.

221. Owens F.N. Secrist D.S., Hill W J. and Gill D.R. Acidosis in cattle: A review // Journal of Animal Science. - 1998. Vol.76. P.275-286.

222. Pace N.R. A molecular view of microbial diversity and biosphere // Science. -1997.-Vol. 276. P.734-740.

223. Patterson J. A. Prospects for the establishment of genetically engineered microorganisms in the rumen // Enzyme Microbiol. Technol. - 1989. - Vol.11. 187-189.

224. Paul S.S., Kamra, D.N., Sastry, V.R.B., Sahu, N.P. and Kumar, A. Effect of phenolic monomers on growth and hydrolytic enzyme activities of an anaerobic fungus isolated from wild nilgai (Boselaphus tragocamelus) // Lett. Appl. Microbiol. -2003,-Vol.36. P.377-381.

225. Pereira M. N., and L. E. Armentano. Partial replacement of forage with nonfo-rage fiber sources in lactating cow diets. II. Digestion and rumen function // J. Dairy Sci. - 2000. - Vol.83. P.2876-2887.

226. Preston T.R. and Leng R.A. Matching Ruminant Production Systems with Available Resources in the Tropics and Sub-Tropics. Pernambul Books, Australia. 1987. P. 245.

227. Quaiser A., T. Ochsenreiter, H.P. Klenk, A. Kletzin, A.H. Treusch, G. Meurer, J. Eck, C. W. Sensen, and C. Schleper. First insight into the genome of an uncultivated crenarchaeote from soil // Environ. Microbiol. - 2002. - Vol.4. P.603-611.

228. Ricke S.C., S.A. Martin, D.J. Nisbet. Ecology, metabolism, and genetics of ruminal selenomonads // Crit. Rev. Microbiol. - 1996. - Vol.22. P.27-65

229. Ricke P., Kolb, S., and Braker, G. Application of a Newly Developed ARB Software-Integrated Tool for In Silico Terminal Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis Reveals the Dominance of a Novel pmoA Cluster in Forest Soil // Applied and Environmental Microbiology. - 2005. - Vol.71. №3. P. 1671-1673.

230. Roger V., Fonty, G., Komisarczuk, S. and Gouet, Ph., Effects of physicochemi-cal factors on the adhesion to cellulose Avicel of the ruminal bacteria Ruminococcus

flavefaciens and Fibrobacter succinogenes sub sp. Succinogenes // Appl. Environ. Microbiol. - 1990. - Vol.56. P.3081-3087

231. Rondon M. R., P. R. August, A. D. Bettermann, S. F. Brady, T. H. Grossman, M. R. Liles, K. A. Loiacono, B. A. Lynch, I. A. MacNeil, C. Minor, C. L. Tiong, M. Gilman, M. S. Osburne, J. Clardy, J. Handelsman, and R. M. Goodman. Cloning the soil metagenome: a strategy for accessing the genetic and functional diversity of uncultured microorganisms // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - Vol.66. P.2541-2547.

232. Roose-Amsaleg C. L., E. Gamier-Sillam and M. Harry. Extraction and purification of microbial DNA from soil and sediment samples // Applied Soil Ecology. -2001.-Vol.18. P.47-60.

233. Porteous L. A., R. J. Seidler and L. S. Watrud. An improved method for purifying DNA from soil for polymerase chain reaction amplification and molecular ecology applications // Mol. Ecol. - 1997. - Vol.6. P.787-791.

234. Rotger A., A. Ferret, S. Calsamiglia and X. Manteca. Effects of nonstructural carbohydrates and protein sources on intake, apparent total tract digestibility, and ru-minal metabolism in vivo and in vitro with highconcentrate beef cattle diets // J. Anim. Sci. - 2006. - Vol.84. P. 1188-1196.

235. Rowe A. R., B. J. Lazar, R. M. Morris and R. E. Richardson. Characterization of the community structure of a dechlorinating mixed culture and comparisons of gene expression in planktonic and biofloc-associated "Dehalococcoides" and Metha-nospirillum species // Appl. Environ. Microbiol. - 2008. - Vol.74. P.6709-6719.

236. Russell J. B., Baldwin R. L. Substrate Preterences in Rumen Bacteria - Evidence of Catabolite Regulatory Mechanisms // Applied and Environmental Microbiology. - 1978. - Vol.36. P.319-329.

237. Russell J.B., Dombrowski D.B. Effect of pH of the Efficiency of Groqth by Pure Cultures of Rumen Bacteria in Continuous Culture // Applied and Environmental Microbiology. - 1980.-Vol.39. P.604-610.

238. Russell J. B., James A., Lawrence M. Ward and Geraldine A. Pratt. Affective Quality Attributed to Environments - A Factor Analysis Study // Environment and Behavior. - 1981.-Vol.13. P.259-288.

239. Russell J. B., Hino T. Regulation of Lactate Production in Streptococcus Bovis

- A Spiraling Effect That Contributes of Rumen Acidodis // Journal of Dairy Science.

- 1985. - Vol.68. P.1712-1721.

240. Russell J.B., Wilson, D.B. Potential opportunities and problems for genetically altered rumen microorganisms // J. Nutr. - 1988. - Vol.118. P.271-279.

241. Russell J.B. and R.J. Wallace. Energy yielding and consuming reactions. In: P. N. Hobson (Ed.) The Rumen Microbial Ecosystem. Elsevier, Barking, Essex, UK. 1988. P.185.

242. Russell J.B., H.J. Strobel. Minireview: The effect of ionophores on ruminal fermentation // Appl. Environ. Microbiol. - 1989. - Vol.55. P. 1-6.

243. Russell J.B. and Rychlik J.L. Factors that alter rumen in microbial ecology // Science - 2001. - Vol.292. P. 1119-1122.

244. Schloss P.D. and Handelsman J. Metagenomics for studing unsulturable microorganisms: cutting the Gordian knot // Genome Biology. - 2005. - Vol.6.

245. Schwartz H.M. and Gilchrist, F.M.C. Microbial interaction with the diet and the host animal. The University of New England Publishing Unit, Armidale, Australia. 1974. P.165-179

246. Scully C., Collins G., and O'Flaherty, V. Assessment of anaerobic wastewater treatment failure using terminal restriction fragment length polymorphism analysis // Journal of Applied Microbiology. - 2005. - Vol.99. P.1463-1471.

247. Selenska S. and W. Klingmuller. Direct detection of nif-gene sequences of Enterobacter agglomerans in soil // FEMS Microbiol. Lett. - 1991. - Vol.80. P.243-246.

248. Sharma R., S.J. John, D.M. Damgaard and T.A. McAllister. Extraction of PCRquality plant and microbial DNA from total rumen contents // BioTechniques. -2003.-Vol.34. P.92-97.

249. Sharp R., C.J. Ziemer, M.D. Stern and D.A. Stahl. Taxon-specific associations between protozoal and methanogen populations in the rumen and a model rumen system // FEMS Microbiology Ecology. - 1998. - Vol.26. P. 71-78.

250. Shin E.C., Choi B.R., Lim W.J., Hong S.Y., An C.L., Cho K.M., Kim Y.K., An J.M., Kang J.M., Lee S.S., Kim H., Yun H.D. Phylogenetic analysis of archeae in

three fractions of cow rumen based on the 16S rDNA sequence // Anaerobe. - 2004. -Vol.10. P.313-319.

251. Shyu C., T. Soule, S. J. Bent, J. A. Foster and L. J. Forney. MiCA: a web-based tool for the analysis of microbial communities based on terminal restriction fragment length polymorphisms of 16S and 18S rRNA genes // Microb. Ecol. - 2007. - Vol.53. P.562-570.

252. Simpson J.M., McCracken V.J., White B.A., Gaskins H.R. and Mackie R.I. Application of denaturing gradient gel electrophoresis for the analysis of the porcine gastrointestinal microbiota// J. Microbiol. Methods - 1999. Vol.36. P.167-179.

253. Simpson J. M., McCracken V. C., Gaskins H. R. and Mackie R. I. Denaturing gradient gel electrophoresis analysis of 16S ribosomal DNA amplicons to monitor changes in fecal bacterial populations of weaning pigs after introduction of Lactobacillus renter/strain MM53 // Appl. Environ. Microbiol. - 2000. - Vol.66. P.4705-4714.

254. Singh B.K., Nazaries L., Munro S., Anderson I., Campbell C. Use of multiplex terminal restriction fragment length polymorphism for rapid and simultaneous analysis of different components of the soil microbial community // Applied and Environmental Microbiology. - 2006. - Vol.72. P.7278-7285

255. Skillman L. C., Evans, P. N., Strompl C. and Joblin K. N. 16S rDNA directed PCR primers and detection of methanogens in the bovine rumen // Letters in Applied Microbiology. - 2006. - Vol.42. P.222-228.

256. Slyter L.L. Influence of acidosis on rumen function // J. Anim. Sci. - 1976. -Vol.43. P.910-92

257. Smalla K., N. Cresswell, L.C. Mendoncahagler, A. Wolters, and J.D. Vanelsas. Rapid DNA Extraction Protocol from Soil for Polymerase Chain Reaction-Mediated Amplification // Journal of Applied Bacteriology. - 1993. - Vol.74. P.78-85.

258. Smith H.W. The development of the flora of the alimentary tract in young animals // J. Path. Bact. - 1965. - Vol.90. P.495-513.

259. Smith C.J., Danilowicz B.S., Clear A.K., Costello F.J., Wilson, B. and Meijer W.G. T-Align, a web-based tool for comparison of multiple terminal restriction frag-

ment length polymorphism profiles // FEMS Microbiology Ecology. - 2005. - Vol.54. P.375-380.

260. Stackebrandt E., Goebel B.M. Taxonomic note: a place for DNA-DNA reassociation and 16S rRNA sequence analysis in the present species definition in bacteriology // Int. J. Syst. Bacteriol. - 1994. - Vol.44. P.846-847.

261. Stahl D.A., B. Flesher, H.R. Mansfield and L. Montgomery. Use of phyloge-netically based hybridization probes for studies of ruminal microbial ecology // Appl Environ Microbiol. - 1988. - Vol.54. №5. P. 1079-1084.

262. Steffan R.J., J. Goksoyr, A.K. Bej, and R.M. Atlas. Recovery of DNA from soils and sediments //Appl. Environ. Microbiol. - 1988. - Vol.54. P.2908-2915.

263. Stein J.L., T.L. Marsh, K.Y. Wu, H. Shizuya and E.F. DeLong. Characterization of uncultivated prokaryotes: isolation and analysis of a 40- kilobase-pair genome fragment from a planktonic marine archaeon // J. Bacteriol. - 1996. - Vol.178. P.591-599.

264. Stevens C.E., Sellers, A.F. Rumination. In "Handbook of Physiology". C.F. Code (ed.), Vol. 5, Sect. 6: Alimentary Canal, American Physiology Society. 1968. P.2699-2704.

265. Stevenson D.M., P.J. Weimer. Dominance of Prevotella and low abundance of classical ruminal bacteria species in the bovine rumen revealed by relative quantification real-time PCR // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 2007. - Vol.75. P.165-174.

266. Stewart C.S., S.H. Duncan and A.J. Richardson. The inhibition of fungal cellu-lolysis by cell-free preparations from ruminococci // FEMS Microbiol. Lett. - 1992. -Vol.97. P.83-87.

267. Stewart C.S., Flynt H.J. and Bryant M.P. The Rumen Bacteria. In The Rumen Microbial Ecocystem. Hobson P. N. and Stewart C. S. (eds). Blackie Academic and Professional, NY, 1997. P.10-71.

268. Stewart C.S, Fonty G, Gouet P. The establishment of rumen microbial communities // Anim. Feed Sci. Technol. - 1988. - Vol.21. P.69-97.

269. Stewart C. S. and M. P. Bryant. The rumen bacteria. In: P. N. Hobson (Ed.) The Rumen Microbial Ecosystem. Elsevier, Barking, Essex, UK1988. P.21.

270. Stewart C.S, Gilmour J. and McConville M.L. Microbial interactions, manipulation and genetic engineering. In "New Developments on Future Perspectives in Research on Rumen Function".A. Niemann-Sorenson (ed.), Commission of the European Communities, 1986. P.243.

271. Strobel H.J., J.B. Russell. Effect of pH and energy spilling on bacterial protein synthesis by carbohydrate-limited cultures of mixed rumen bacteria // J. Dairy Sci. -1986. - Vol.69. P.2941-2947.

272. Stumm C.K., Gijzen H.J. and Vogels G.D. Association of methanogenic bacteria with ovine rumen ciliates // Br. J. Nutr. - 1982 - Vol.47. P.95-99.

273. Suzuki M.T. and Giovannoni S.J. Bias Caused by Template Annealing in the Amplification of Mixtures of 16S rRNA Genes by PCR // Applied and Environmental Microbiology. - 1996. - Vol.62. №2. P.625-630.

274. Sylvia D.M. 2005. Principles and applications of soil microbiology // 2nd ed. Pearson Prentice Hall, Upper Saddle River, N.J.

275. Tajima K., Aminov R.I., Nagamine T., Ogata K., Nakamura M., Matsui H. and Benno Y. Rumen bacterial diversity as determined by sequence analysis of 16S rDNA libraries // Ferns Microbiology Ecology. - 1999. - Vol.29. P. 159-169.

276. Tajima K., Arai S., Ogata K., Nagamine T., Matsui H. Nakamura M. Rumen bacterial community transition during adaptation to high-grain diet // Anaerobe. -2000. - Vol.6. P.273-284

277. Tajima K., R.I. Aminov, T. Nagamine, H. Matsui, M. Nakamura, and Y. Benno. Diet-dependent shifts in the bacterial population of the rumen revealed with realtime PCR // Appl. Environ. Microbiol. - 2001. - Vol.67. №6. P.2766-2774.

278. Tajima K et al. Phylogenetic analysis of archaeal 16S rRNA libraries from the rumen suggests the existence of a novel group of archaea not associated with known methanogens // FEMS Microbiol. Lett. - 2001. - Vol.200. P.67-72.

279. Tannock G. W., Munro K., Harmsen H.J.M., Welling G. W., Smart J. and Gopal P. K. Analysis of the fecal microflora of human subjects consuming a probiotic product containing Lactobacillus rhamnosus DR20 // Appl. Environ. Microbiol. -2000. - Vol.66. P.2578-2588.

280. Tebbe C. C. and W. Vahjen. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast // Appl. Environ. Microbiol. - 1993. - Vol.59. P.2657-2665.

281. Teunissen M.J., E.P.W. Kets and H.J.M. Opden Camp. Effect of co-culture of anaerobic fungi isolated from ruminants and non-ruminants with methanogenic bacteria on cellulolytic and xylanolytic enzyme activities // Arch. Microbiol. - 1992. -Vol.157. P.176-182.

282. Thaysen A. The nutritional role of the microflora in the alimentary tract. The microbiological aspect of rumen digestion // Proc. Nutr. Soc. - 1946. - Vol.3. P. 195199.

283. The rumen anaerobic fungi. In: Orpin CG, Joblin KN, Hobson PN, Stewart CS (eds), The Rumen Microbial Ecosystem, 2nd edn. Chapman and Hall, New York. P.140-195.

284. Tokura M., I. Chagan, K. Ushida, and Y. Kojima. Phylogenetic study of me-thanogens associated with rumen ciliates // Curr. Microbiol. - 1999. - Vol.39. P. 123128.

285. Trinci A.P.J., Davies D.R., Gull K., Lawrence M.I., Nielsen B.B., Rickers A., Theodorou M.K. Anaerobic fungi in herbivorous animals // Journal of Mycological Research. - 1994. - Vol.98. P. 129-152.

286. Tringe S.G., C. von Mering, A. Kobayashi, A.A. Salamov, K. Chen, H.W. Chang, M. Podar, J.M. Short, E.J. Mathur, J.C. Detter, P. Bork, P. Hugenholtz and E.M. Rubin. Comparative metagenomics of microbial communities // Science. - 2005. -Vol.308. P.554-557.

287. Tricarico J.M., M.D. Abney, M.L. Galyean, J.D. Rivera, K.C. Hanson, K.R. McLeod and D.L. Harmon. Effects of a dietary Aspergillus oryzae extract containing -amylase activity on performance and carcass characteristics of finishing beef cattle//J. Anim. Sci. -2007. - Vol.85. P.802-811.

288. Tringe S. G., von Mering C., Kobayashi A., Salamov A. A., Chen K, Chang H.W. et al. Comparative metagenomics of microbial communities // Science. - 2005. Vol.308. P.554-557.

289. Tsai Y.L., and B.H. Olson. Rapid method for direct extraction of DNA from soil and sediments // Appl. Environ. Microbiol. - 1991. - Vol.57. P.1070-1074.

290. Tsuda T., Sasaki Y. and Kawashima, R. Academic Press. San Diego. - 1990. -P.655-680.

291. Tyson G.W., Chapman J., Hugenholts P., Allen E.E., Ram R.J., Richardson P.M. et al. Community structure and metabolism throught reconstruction of microbial genomes from the environment // Nature. - 2004. - Vol.428 P.37-43.

292. Uyeno Y., Y. Sekiguchi, K.Tajima, A. Takenaka, M. Karihara, and Y. Kama-gata. Evaluation of group-specific, 16S rRNA-targeted scissor probes for quantitative detection of predominant bacterial populations in dairy cattle rumen // J. Appl. Microbiol. - 2007. - Vol.103. P.1995-2005.

293. Van Elsas J.D., V. Mantynen, and A.C. Wolters. Soil DNA extraction and assessment of the fate of Mycobacterium chlorophenicolum strain PCP-1 in different soils by 16S ribosomal RNA gene sequence based most-probable-number PCR and immunofluorescence // Biol. Fertil. Soils. - 1997. - Vol. 24. P. 188-195.

294. Van Nevel C.J., Demeyer D.I. Manipulation of rumen fermentation. In "The Rumen Microbial Ecosystem". P.N. Hobson (ed.). - 1988. P.387-443.

295. Vaughan E.E., Schut, F., Heilig, G.H.J., Zoetendal, E.G., de Vos, W.M. and Akkermans, A.D.L. A molecular view of the intestinal ecosystem // Curr. Issues Intest. Microbiol. - 2000. - Vol.1. P.l-12.

296. Veira D.M.The role of ciliate protozoa in nutrition of the ruminant //Journal of Animal Science. - 1986. - Vol.63. P.1547-1560

297. Venter J.C., K. Remington, J.F. Heidelberg, A.L. Halpern, D.Rusch, J.A. Eisen, D. Wu, I. Paulsen, K.E. Nelson, W. Nelson, D.E. Fouts, S. Levy, A.H. Knap, M.W. Lomas, K. Nealson, O. White, J. Peterson, J. Hoffman, R. Parsons, H. Baden-Tillson, C. Pfannkoch, Y. H. Rogers, and H. O. Smith. Environmental genome shotgun sequencing of the Sargasso Sea // Science - 2004. - Vol. 304. P.66-74.

298. Voget S., C. Leggewie, A. Uesbeck, C. Raasch, K. E. Jaeger, and W. R. Streit. Prospecting for novel biocatalysts in a soil metagenome // Appl. Environ. Microbiol. -2003. - Vol.69. P.6235-6242.

299. Wallace R. E., Cheng K. et al. An independend microbial flora of the epithelium and its role in the microbiology in rumen // Nature. - 1979. - Vol. 279. №5712. P.424-426.

300. Wallace R.J., Cotta, M.A. Metabolism of nitrogen-containing compounds. In "The Rumen Microbial Ecosystem". P.N. Hobson (ed.). - 1988.P.217-249.

301. Wallace R.J. and Newbold, C.J.: Probiotics for ruminants. In: Probiotics, the scientific basis (Ed.: Fuller, R.). Chapman and Hall, London. - 1992. P.317-353

302. Wallace R.J., and C.J. Newbold. Rumen fermentation and its manipulation: the development of yeast cultures as feed additives. In: T. P. Lyons (Ed.) Biotechnology in the Feed Industry. Alltech Technical Publications, Nicholasville, KY. 1993. P. 173.

303. Wanapat M., O. Pimpa, A. Petlum and C. Wachirapakorn. Participation scheme of small holder dairy farmers in the northeast Thailand on improveing feeding systems Asian-Aus // J. Anim. Sci. - 2000. - Vol.13. P.600-604.

304. Wardrop J.D., Comde J.B. // J. Agric. Res. - 1961. - Vol.12. №4.

305. Warner A.C.I., Stacy B.D. Solutes in the rumen of the sheep// J.Exp. Physiol. - 1965. - Vol.50. P. 169.

306. Webster G., C.J. Newbury, J.C. Fry and A.J. Weightman. Assessment of bacterial community structure in the deep sub-seafloor biosphere by 16S rDNAbased techniques: a cautionary tale // J. Microbiol. Methods. - 2003.- Vol.55. P.155-164.

307. Weimer P.J. Why don't ruminal bacteria digest cellulose faster? // Journal of Dairy Science. - 1996.-V.79. P.1496-1502.

308. Weimer P.J. Manipulating ruminal fermentation: A microbial ecological perspective//J. Anim. Sci. - 1998. - Vol.76. P.3114-3122.

309. Weimer P.J., Waghorn G.C., Odt C.L. and Mertens D.R. Effect of diet on populations of three species of ruminal cellulolytic bacteria in lactating dairy cows // Journal of Dairy Science - 1999. - Vol. 82. P. 122-134.

310. Weimer P.J., J.B. Russell, R.E. Muck. Lessons from the cow: what the ruminant animal can teach us about consolidated bioprocessing of cellulosic biomass // Bioresour. Technol. - 2009. - Vol.100. P.5323-5331.

311. Weller R.A. and Pilgrim A.F. Passage of protozoa and volatile fatty acids from the rumen of the sheep and from a continuous in vitro fermentation system // British Journal of Nutrition. - 1974. - Vol.32. P.341-351.

312. Wells J.E. and J.B. Russell. Why do many ruminal bacteria die and lyse so quickly? // Journal of Dairy Science. - 1996. - Vol.79. P.1487-1495.

313. Whitehead T.R. and M.A. Cotta. Characterization and comparison of microbial populations in swine faeces and manure storage pits by 16S rDNA gene sequence analyses//Anaerobe. - 2001.-Vol.7. P. 181-187

314. Whitford M.F., R.J. Forster, C.E. Beard, J. Gong and R.M. Teather. Phyloge-netic analysis of rumen bacteria by comparative sequence analysis of cloned 16S rRNA genes //Anaerobe. - 1998. - Vol.4. №3. P.153-163.

315. Whitford M.F., R.M. Teather and R.J. Forster. Phylogenetic analysis of metha-nogens from the bovine rumen // BMC. Microbiol. - 2001. Vol.1. P.5.

316. Williams A.G., Orpin C.G. Glycoside hydrolase enzymes present in the zoospore and vegetative stages of the rumen fungi Neocallimastix frontalis, Piromonas communis and an unidentified isolate grown on a variety of carbohydrates // Can. J. Bot. - 1987. Vol.33. P.427-434.

317. Williams P.E.V., and C.J. Newbold. Rumen probiosis: the effects of novel microorganisms on rumen fermentation and ruminant productivity. In: W. Haresign and D.J.A. Cole. Recent Advances in Animal Nutrition. - 1990. P. 211.

318. Williams A.G., Coleman G.S. Hemicellulose degrading enzymes in rumen ci-liate protozoa // Curr. Microbiol. - 1985. Vol.12. P.85-90.

319. Williams A.G. and Coleman G.S. The rumen protozoa. In «The Rumen Microbial Ecosystem». P.N. Hobson (ed.). Elsevier Applied. - 1988. P.77-128.

320. Williams A.G., Coleman G.S.. The Rumen Protozoa. Springer-Verlag, New York. 1992.

321. Wintzingerode F.V., Gobel U., Stackebrandt E. Determination of microbial diversity in environmental samples: pitfalls of PCRbased rRNA analysis // FEMS Microbiol. Rev. - 1997. -Vol.21. P.213-229.

322. Wojciechowicz M., Heinrichova K. and Zioleski A. An Exopectate Lyace of Butivibrio Fibriosolvens from Bovine Rumen // Journal of General Microbiology. -1982. - Vol.128. P.2661-2665.

323. Wojciechowicz M. and Ziolecki A. A Note on the Pectinolytic Enzyme of Streptococcus Bovis // Journal of Applied Bacteriology. - 1984. - Vol.56. P.515-518.

324. Wolin M.J. The rumen fermentation: a model for microbial interactions in anaerobic ecosystems //Adv. Microbial. Ecol. - 1979. - Vol.3. P.49-77.

325. Wolin M.J. The rumen fermentation: a model for microbial interactions in anaerobic ecosystems //Adv. Microbial. Ecol. - 1979. - Vol.3. P.49-77.

326. Wolin M.J., Miller T.L. Microbe-microbe interactions. In "The Rumen Microbial Ecosystem". P.N. Hobson (ed.). Elsevier Applied Science. London. - 1988. P.343-359,

327. Wozny M.A., Bryant M.P., Holdeman L.V. and Moore W.E.C. Urease Assay and Urease-Producing Species of Anaerobes in Bovine Rumen and Human Feces // Applied and Environmental Microbiology. - 1977. - Vol.33. P.1097-1104.

328. Wright A. D., A.J. Williams, B. Winder, C.T. Christophersen, S.I, Rodgers, and K.D. Smith. Molecular diversity of rumen methanogens from sheep in Western Australia // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - Vol.70. P. 1263-1270.

329. Wright A.G., A.F. Toovey, C.L. Pimm. Molecular identification of methon-genic archaea from sheep in Queensland, Australia reveal more uncultured novel arc-haea//Anaerobe. - 2006,-Vol.12. P.134-139.

330. Wright A.D., C.H. Auckland, and D.H. Lynn. Molecular diversity of methanogens in feedlot cattle from Ontario and Prince Edward Island, Canada // Appl. Environ. Microbiol. -2007. - Vol. 73. P.4206-4210.

331. Yanagita K., Y. Kamagata, M. Kawaharasaki, T. Suzuki, Y. Nakamura, and H. Minato. Phylogenetic analysis of methanogens in sheep rumen ecosystem and detection of Methanomicrobium mobile by fluorescence in situ hybridization // Biosci. Bio-technol. Biochem. - 2000. - Vol.64. P. 1737-1742

332. Yu I., Hungate R.E. Extracellular Cellulases of Ruminococcus Albus // Annales de Recherches Veterinaires. - 1979. - Vol. 10. P.251-254.

333. Yu Z. and M. Morrison. Comparisons of different hypervariable regions of rrs genes for use in fingerprinting of microbial communities by PCR-denaturing gradient gel electrophoresis // Appl. Environ. Microbiol. - 2004. - Vol.70. №8. P.4800-4806.

334. Yokoyama M.T., K.A. Johnson. Microbiology of the rumen and intestine, in The Ruminant Animal Digestive Physiology and Nutrition. D.C. Church, ed. Wavel-and Press, Inc., Prospect Heights, IL. - 1988. P.145-171

335. Zhen L. and R.T. Swank. A simple and high yield method for recovering DNA from agarose gels // Biotechniques. - 1993. Vol.14. P894-898.

336. Zhou J., M.A. Bruns, and J.M. Tiedje. DNA recovery from soils of diverse composition// Appl. Environ. Microbiol. - 1996. - Vol.62. P316-322.

337. Zhu X.Y., Zhong, T., Pandya, Y. and Joerger, R.D. 16S rRNA-based analysis of microbiota from the cecum of broiler chickens // Appl. Environ. Microbiol. - 2002. -Vol.68. P.124-137.

338. Zoetendal E.G., Akkermans A.L., Devos W.M. Temperature gradient gel electrophoresis analysis of 16S rRNA from human fecal samples reveals stable and host-specific communities of active bacteria // Appl. Environ. Microbiol. - 1998. - Vol.64. P.3854-3859.

339. Zoetendal E.G., Akkermans, A.D.L., Akkermans van-Vliet, W.M., de Visser, J.A.G.M. and de Vos W.M. The host genotype affects the bacterial community in the human gastrointestinal tract // Microb. Ecol. Health Disease - 2001. - Vol.13. P. 129134.

340. Zoetendal E.G., von Wright A., Vilponnen-Salmela, T., Ben-Amor, K., Akkermans, A.D.L., de Vos, W.M. Mucosa-associated bacteria in the human gastrointestinal tract are uniformly distributed along the colon and differ from the community recovered from feces // Appl. Environ. Microbiol. - 2002. - Vol. 68. P.3401-3407.

341. Zoetendal E.G., C.T. Collier, S. Koike, R.I. Mackie and H.R. Gaskins. Molecular ecological analysis of the gastrointestinal microbiota: A review // Journal of Nutrition. - 2004. - Vol.134. P.465-472.

342. Xu M., F. Wang, J. Meng and X. Xiao. Construction and preliminary analysis of a metagenomic library from a deep-sea sediment of east Pacific Nodule Province // FEMS Microbiol. Ecol. - 2007,- Vol.62. P.233-241.

В заключение автор выражает искреннюю благодарность коллективу лаборатории зоологической микробиологии ГНУ ВНИИСХМ: к.с.-х.н. В.В. Солдатовой, к.б.н. Е.А. Йылдырым и А.Ф. Балакиревой, к.с.-х.н. В.Н. Большакову во главе с руководителем д.б.н. Г.Ю. Лаптевым за их теплое отношение, неоценимую помощь и поддержку при выполнении работы. Также хочется поблагодарить сотрудников компании «Биотроф», особенно ее коммерческого директора к.б.н. Н.И. Новикову, без участия которых некоторые работа попросту не могла бы быть осуществлена.

Также автор выражает искреннюю признательность всем сотрудникам ГНУ ВНИИСХМ, в особенности коллективу и заведующему лаборатории генетики растительно-микробных взаимодействий ГНУ ВНИИСХМ - д.б.н. А.Ю. Борисову, а также сотрудникам к.т.н. Воробьеву Н.И., ст.н.с. Пинаеву А.Г., Першиной Е.В., Думовой В.А.

Кроме того, благодарность хотелось бы высказать сотрудникам ГНУ ВИЖа РАСХН, в особенности коллективу отдела кормления сельскохозяйственных животных и технологии кормов (Подольский район Московской области) за ценные советы и неоценимую помощь.

И, наконец, особая благодарность за ценные советы и непосредственное участие в постановке опытов специалистам и руководителям хозяйств Ленинградской, Тверской, Белгородской областей и Краснодарского края, на базе которых были выполнены эксперименты.