Изучение механизмов действия мембранотропных химических соединений на импрегнированных липидоподобными веществами ультрафильтрах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.02, кандидат биологических наук Осак, Игорь Симеонович

• Осак, Игорь Симеонович
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Осак, Игорь Симеонович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.4 стр.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

ГЛАВА I. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДА ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА 2. МОДЕЛИРОВАНИЕ НА 1ШПРЕГНИРОВАННЫХ ЛШЩОПОДОБНЬМИ ВЕЩЕСТВАМИ УЛЬТРАФИЛЬТРАХ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

ЕЙОМЕМБРАН.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ШГРЕГНИРОВАННЫХ ФИЛЬТРОВ

ДНЯ ВОДЫ.

ГЛАВА 4. ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ КАК ПЕРЕНОСЧИКИ ОДНОВАЛЕНТНЫХ

КАТИОНОВ

§ I. Электронейтральный К+ - Н+ - обмен на импрегни-рованных ультрафильтрах, индуцированный жирными кислотами.

§ 2. Изучение электрогенных процессов на импрегнированных жирными кислотами ультрафильтрах

§ 3. Механизм действия переносчиков, стимулирующих электронейтральный обмен ионов

§ 4. Возможная роль свободных жирных кислот как ионофоров в регуляции мембранного транспорта

§ 5. Зависимость времени задержки от содержания переносчика в жидкой мембране

ГЛАВА 5. ДЕТЕРГЕНТОПОДОБНЫЕ СВОЙСТВА АМИНАЗИНА И РЯДА

АНТИДЕПРЕССАНТОВ.

ШАВА 6. ИОНООБМЕННОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ РМЛАНТАДИНА С ИМПРЕГ

НИРОВАННЫМИ УЛЬТРАФИЛЬТРАМИ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение механизмов действия мембранотропных химических соединений на импрегнированных липидоподобными веществами ультрафильтрах»

Массовый поиск новых биологически активных веществ, а также детальное изучение механизмов их фармакологического действия на организм, является одной из актуальных задач современной медицинской биофизики. Решение этой задачи должно основываться на сочетании различных методических подходов и не может ограничиваться только опытами на животных. Все большее количество исследований проводится на органном, тканевом, клеточном и субклеточном уровнях. Однако проведение экспериментов на этих системах во многих случаях сопряжено с возможностью неоднозначной интерпретации результатов, обусловленной исключительной сложностью и многокомпонент-ностью природных объектов.

Детальное изучение физико-химических механизмов действия веществ возможно во многих случаях лишь благодаря использованию различных модельных систем. В современной мембранологии наиболее известными и широко применяемыми модельными системами являются монослои липидов, бислойные липидные мембраны ШШ) и липосомы. На этих моделях удалось исследовать механизмы действия мембрано-активных комплексонов, глубже понять многие физико-химические характеристики биологических мембран, выяснить основные факторы, определяющие белок-лшшдные взаимодействия и т.д. В то же время эксперименты на модельных мембранах такого типа сопряжены с рядом трудностей как принципиального, так и методического характера. Одно из основных требований, предъявляемых к модельным системам, заключается в соответствии их свойств свойствам моделируемого объекта. Это соответствие далеко не всегда наблюдается при сравнении характеристик биологических мембран и таких моделей, как монослои, БЛМ, липосомы. Методические трудности, возникающие при работе с этими моделями, как правило, связаны либо с их низкой стабильностью монослои, ЕШ'Л), либо с малыми размерами (липосомы, ЕДМ).

При решении ряда задач особенно удобными оказались небислой-ные модельные мембраны, среди которых простейшими являются слои органического растворителя, разделяющие две водные фазы [ 1,2 ]. Значительное число работ было выполнено на мембранных ультрафильтрах из различных полимерных материалов [ 3 ] . Такие системы после пропитки органическим растворителем и введения модификатора могут использоваться не только для решения биофизических задач, но и для создания ион-селективных электродов [ 4 ] , очистки воды [о] и т.д., и находят все более широкое применение на практике. Большие размеры, стабильность, воспроизводимость результатов, простота в работе делают эти мембраны весьма удобными в эксперименте.

Целью данной работы являлась разработка новой модели биологической мембраны макроскопических размеров и демонстрация возможностей ее применения для исследовании физико-химических факторов, определяющих проницаемость биологических мембран, а также для проведения скрининга и изучения механизмов действия мембрано-т ропных с о единений.

В литературном обзоре рассмотрены наиболее известные модельные системы (монослои, ШМ, липосомы), а также различные небислой-ные искусственные мембраны. Наиболее подробно рассмотрены работы, в которых в качестве модели биомембраны использовались импрегни-рованные ультрафильтры.

После описания использованных материалов и методов (глава I) в диссертации рассмотрены основные характеристики предложенной нами новой модели биологической мембраны, представляющей собой нитроацетатцеллюлозные ультрафильтры, импрегнированные жидкими аналогами липидов, например, жирными кислотами или их эфирами. Эта модель по ряду физшш-химических свойств (удельные электрические сопротивление и емкость, проницаемость по воде, наличие катион-катионной и катион-анионной селективности и т.д.) близка к биологическим мембранам (глава 2,3). На предложенной модели изучены все основные физико-химические характеристики, определяющие ионофорную активность олеиновой и других жирных кислот.Полученные результаты использованы для анализа роли жирных кислот в регуляции ионного транспорта через биомембраны (глава 4).

Б главе 5 показано, что аминазин, а также ряд, антидепрессантов в достаточно высоких концентрациях приводят к нарушению барьерных свойств иьшрегнированных фильтров, что связано с детергенто-подобными свойствами этих агентов. Обнаружена взаимосвязь таких эффектов и побочного токсического влияния этих препаратов на биомембраны.

На примере противовирусного препарата ремантадина показано, что органические катионы способны вступать в реакции ионного обмена с протонами на локализованных в мембране карбоксильных группах, а также изменять сопротивление и мембранный потенциал (глава ь).

Проведенный в заключении анализ полученных результатов позволяет глубже понять физико-химические механизмы, определяющие проницаемость биологических мембран. Проведенные модельные эксперименты свидетельствуют о существенной роли в этих процессах областей контакта белков и лжщдбв. Благодаря своим физико-химическим свойствам импрегнированные шдаш аналогами липццов ультрафильтры могут использоваться для проведения массовых первичных испытаний химических соединений на мембранотропную активность и в ряде случаев - для изучения механизмов их действия.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Наиболее известными и широко применяемыми моделями биомембран являются монослои, моно- и мультиламеллярные липосомы и плоские бислойные (черные) липидные мембраны.

Исследование монослоев имеет многолетнюю историю и долгое время было основным методом моделирования мембранных систем. Оно позволяет изучать липид-липидные и липид-белковые взашлодействия . 6-9 J .

Монослои, образуемые на межфазной границе, можно условно подразделить на два существенно различных типа: монослои из поверхностно-активных веществ (ПАВ), нерастворимых в объемных фазах, и монослои из растворимых ПАВ. В первом случае монослой представляет собой как бы "двумерную фазу" (двумерный газ и жидкость или твердое тело в зависимости от общей площади поверхности), поскольку ни в одну из объемных фаз молекулы уйти не могут. Площадь, занимаемая одной молекулой ПАВ в таком монослое, определяется количеством вещества, нанесенного на границу раздела фаз. Такого типа монослои, например, из практически нерастворимых в воде лшщцов, образованные на границе вода- воздух, являются хорошей моделью для изучения упаковки молекул в мембранном бислое и ее зависимости от поверхностного давления. На таких системах изучают влияние на структуру монослоя как липидного состава, так и других факторов (ионной силы, рН, температуры,встраивания белков и т.д.).

Состояние монослоя второго типа определяется адсорбцией (и десорбцией) молекул IIAB из одной или обеих объемных фаз на границе раздела, т.е. термодинамическим процессом распределения, поэтому равновесное состояние монослоя в этом случае не зависит от площади межфазной границы, а определяется концентрацией ПАВ в объемных фазах, типом растворителей и термодинамическими параметрами систем. Для образования монослоя второго типа можно использовать либо жиро-, либо водорастворимые ПАВ. При его формировании наблюдается уменьшение поверхностного натяжения. На основании зависимости изменения поверхностного натяжения от концентрации ПАВ можно определить, при какой концентрации происходит предельная адсорбция ПАВ на границе, а также измерить критическую концентрацию мицеллообразования этих веществ 6-э] .

Ограниченные липидными мембранами замкнутые структуры (липосомы) широко используются для изучения барьерных свойств липидного бислоя. При достаточно долгом и тщательном встряхивании суспензии липидов в водных растворах образуются мультиламеллярные липосомы 10 J . Судя по спектрам ЯМР и исследованию фазовых переходов методом дифференциальной сканирующей калориметрии, состояние липидов в многослойных липосомах подобно состоянию липидов в областях биологических мембран, имеющих биелойную структуру. Однако для получения количественных характеристик проницаемости эту модель применить не удается, так как в суспензии обычно имеются липосомы, имеющие различные размеры и количество бислоев. Полученные длительной обработкой ультразвуком однослойные липосомы имеют достаточно определенную площадь поверхности мембран. Однако малые размеры этих липосом и значительная кривизна их поверхности приводят к существенным нарушениям упаковки липидов в мембранах такого типа, значительным отличиям свойств внешнего и внутреннего монослоя |П Интересно, что времена флип-флопа на липосомах такого типа и в природных мембранах могут отличаться в сотни и тысячи раз L 9,12 На таких липосомах, а также на применяемых в последнее время и имеющих несколько большие размеры липосомах, полученных методом инжекции или обращения фаз [13,14J, удобно изучать проницаемость различных ионов и неэлектролитов. В то же время,в опытах на моно-и мультиламеллярных липосомах не удается проводить прямые измерения трансмембранной разности потенциалов и протекающего через мембрану тока.

Для измерений такого типа гораздо более удобными оказались плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ). Впервые такую м

15 оделъ . По их применили в своих исследованиях Мюллер с сотрудниками методу каплю раствора фосфолипида в декане помещают в отверстие в тефлоновой перегородке, разделяющей два водных раствора. После того, как растворитель постепенно собирается в торусе по периметру отверстия, в его центре образуется бислой толщиной 5-7 нм и диаметром, обычно не превышающим I мм. Введя слева и сцрава от мембраны соответствующие электроды, можно измерять ее электрическое сопротивление или емкость, а также величину мембранного потенциала. На таких моделях удалось изучить ионную проницаемость липидных мембран и механизм влияния на нее переносчиков ионов типа валиномицина и нигерицина [l6-I8 ] , каналоформера грамицидина a[i9 , ряда соединений - модификаторов проницаемости мембраны ных веществ

2l] ,

20 токсинов

22 лекаретвени различных белков

2з] и т.д.

Однако у этой модели есть ряд существенных недостатков. Во-первых, удельное сопротивление БЛМ обычно достигает 10^ Ом.см^, что отличается от соответствующих значений для мембран клеток на 1-2 порядка. Во-вторых, немодифицированные БЛМ из нейтральных липидов практически не обладают катион-анионной специфичностью, причем ряд катионной селективности оказался отличным от наблюдаемого у природных мембран 3,9 J . Значения электрической емкости БЛМ, как правило, несколько ниже соответствующих значений для природных мембран, и наблюдается лишь весьма слабая зависимость электрической емкости от частоты подаваемого напряжения

24 В тех случаях, когда ЕЖ содержит значительное количество растворителя, наблюдается довольно плохая воспроизводимость значений проводимости БЛМ. Этот дефект, по-видимому, связан со способностью растворителя образовывать микролинзы в КЕМ и собираться в области контакта ЕЛМ и тефлона, образуя при этом торус LII I . Относительно небольшая площадь поверхности БЛГЛ и ограниченное время их жизни существенно затрудняют изучение электронейтральных потоков ионов.

При решении многих задач, связанных с мембранным транспортом, удается использовать наиболее простые модели мембран, представляющие собой слой органического растворителя, разделяющий две несме-шиващиеся с ним водные фазы. Такие толстые жидкие мембраны начали применяться еще Бойтнером в 20-е годы [ I ]и позднее использовались для изучения прямой диффузии ионов и низкомолекулярных веществ из одной водной фазы в другую. Модели такого типа оказались весьма эффективными при изучении неэлектрогенного переноса ионов, например, стимулированного нигерицином электронейтрального К+ - Н+ антипорта . Кислые лшшды, например, фосфатидилс ерин, кардиолипин и фосфатидная кислота способны переносить одно- и двух-Валентине катионн через органическую фазу, тогда как нейтральные фосфолипиды практически не обладают ионофорными свойствами [ 26 J . Б работе [27] было показано, что жирные кислоты, добавленные в слой хлороформа, стимулируют электронейтральный К+-Н+-обмен. Имеются данные, что фосфолипиды увеличивают скорость переноса через слой хлороформа различных неэлектролитов, например, глюкозы " [ 28 ] . На толстых жидких мембранах удается изучать транспортные процессы с участием краун-эфиров [ 29 ] , перенос электронов [зо]и т.д.

Определенный интерес представляют ташке такие небислойные модельные системы,как окисленные на поверхности воды в присутствии

0,1% раствора ШпО^ масляные капли, например, из линолеата глицерина [ 31, 32 ] . Через несколько часов в этой системе образуется тонкая подвижная мембрана толщиной меньше микрона. Если эту мембрану покрыть другим солевым раствором, то она будет разделять две водные фазы. При наложении небольших полей (50-5С0 В/см) на такой мембране можно наблюдать кратковременное увеличение проводимости, что имитирует реакцию клеточной мембраны на электрическое поле, т.е. ее возбудимость [ 31 ] . Кроме того, на искусственной мембране можно наблюдать и другие свойства электровозбудимости мембран, например, зависимость частоты ответа от величины поля. Импедансные характеристики модельных мембран такого типа также напоминают соответствующие характеристики, наблюдаемые у природных мембран. Описанная модельная мембрана обладает также выраженном катионной селективностью. Методом би-ионных потенциалов было показано, что К+ в 8-20 раз лучше проникает в мембрану, чем ион Jfa+, что близко к наблюдаемому на природных мембранах. В то же время большие органические катионы проникают в мембрану на один-два порядка лучше иона К+. Все эти интересные свойства связаны с тем, что мембрана состоит из находящихся в непосредственном контакте гидрофобных и гидрофильных зон, а также с присутствием в ней образованных в результате реакций окисления фиксированных карбоксильных групп. Благодаря этому мембрана ведет себя как катионообменник, который имеет очень сильное сродство к органическим катионам [ 32 .

Интересно отметить, что многие модельные мембраны такого типа, образованные из различающихся по структуре липидов и их производных, имеют ряд характеристик, сходных с наблюдаемыми у клеточных мембран. По-видимому, бислойная структура не является обязательным условием для получения вышеописанных свойств.

Коллагеновые пленки, содержащие лаурилсульфат, как оказалось, также обладают свойством возбудимости [ 33 ] .

Электрохимические свойства пленок из коллодия изучались еще Михаэлисом [ 34 ] , однако эти мембраны не обладали высокой проницаемостью для липидорастворимых веществ.

Модель, сочетающая положительные свойства мембран Бойтнера и более тонких коллодиевых и других пленок, была предложена и довольно подробно изучена в работах Тобиаса и Илани, которые исследовали миллипоровские фильтры из нитроацетатцеллюлозы, пропитанные различными органическими растворителя!.® и липидами [ 35-46 ] .

Такие мембраны имели ряд свойств, отсутствующих у составляющих их материалов (миллипоровского фильтра и органического растворителя), взятых порознь, а именно, высокую катион-анионную селективность и катионную специфичность.

В работах Тобиаса впервые были описаны импрегнированные сме 35-38 ] . сыо животного кефалина с холестерином ультрафильтры о

Миллипоровские фильтры с диаметром пор 100+ 20 А,толщиной 0,015см пропитывались раствором липидов в бензоле, после чего растворитель отгонялся. Увеличение массы фильтра после импрегнации такой смесью о составляло 1-1,81лг/см'°. В основном,измерялось сопротивление R таких модельных систем на постоянном и переменном токе и его зависимость от ионного состава омывающих мембрану растворов. Было показано, что эта величина изменяется от нескольких 0м.смй в раствор pax KCI или JfaCI до нескольких сотен 0м.см в растворе CaCIg. Отметим, что при импрегнации фильтра чистым холестерином сопротивление превышало I05 Ом.см^ | 35 Сопротивление мембран, пропитанных фосфолшщцами, уменьшалось с увеличением ионной силы, если в среде находились только одно- или двухвалентные ионы, либо если ЛаС1 или KCI добавляли в раствор, содержащий CaCIg. В случае, когда в омывающие мембрану водные растворы, содержащие KCI или JfaCI, добавляли CaCIg, величина сопротивления увеличивалась в несколько раз с увеличением концентрации CaGIg до 100 мМ. По-видимому, ионы CaCIg увеличивают сопротивление мембраны для прохождения одновалентных ионов. При более детальном анализе составных частей животного кефалина оказалось, что эффект увеличения сопротивления при добавлении CaCIg связан со взаимодействием CaCIg лишь с одним из компонентов кефалина, а именно с фосфатидилсерином. Механизм этого явления, по-видимому, заключается в реакции между анионом фосфолипида и катионом Са+^ [36 ] . Кроме того, в работах Тобиаса отмечено, что импрегнированные смесью липиды-холестерин мембраны +2 поглощают Са из раствора, причем эти ионы способны вытеснять ионы К+ из мембранной фазы. С другой стороны, если использовался неимпрегнированный, либо импрегнированный одним холестерином миллипоровский фильтр, то преимущественное поглощение ионов Са+^ по сравнению с ионами К+ не наблюдалось [ 3? . В работе [ Зб] чалась зависимость содержания воды в импр егнированном фильтре и проницаемости фильтра по воде от ионного состава омыванцих растворов и от состава импрегнируицей жидкости. Отмечено, что поглощение воды мембраной уменьшалось с увеличением концентрации KCI или CaCIg в растворах и достигало 1,5 мг воды/мг липида. При введении I М сахарозы с одном из сторон удается наблюдать осмотический поток воды через мембрану. Его величина достигала 3. Ю-^ моль/см^.сек и уменьшалась при введении CaCIg. Поток воды снижался практически до нуля приблизительно при том же соотношении ионов Са+2 и К+, при котором мембранное сопротивление достиизугало своего максимального значения за].

На основании проделанных экспериментов 35-38] авторами сделан вывод, что, возможно, и в биологии ионный состав растворов, омывающих клеточную мембрану, оказывает влияние на содержание в ней воды и на проницаемость ее по воде.

Подчеркнем, что в опытах Тобиаса мембраны, несмотря на их значительные размеры, имели электрическое сопротивление, существенно меньшее, чем наблюдаемое у биологических мембран и,тем более,у EJIM. В значительной степени это связано с неполным заполнением пор ультрафильтра липидами. Об этом говорят как довольно высокое отр носительное содержание воды, достигавшее I - 1,5 мг воды/см , так и низкое увеличение веса фильтра после имцрегнирования, равное р

1-3 мг/см .

В 1965 году Г.А. Дебориным с сотрудниками были начаты работы по изучению проницаемости для белков импрегнированных липидами фильтровальных дисков (бумага Фильтрак 90). Было показано, что такие ферменты,как РНК-аза, трипсин, амилаза, альдолаза, инверта-за и др., могут проникать через модельную мембрану .8,47 , 48] . На основании изучения зависимости этого процесса от рН, ионной силы, температуры, наличия полиэлектролитов и субстратов был сделан вывод о том, что лимитирующей стадией процесса является стадия диффузии фермента через липидную фазу.

В работе использовались два типа мембран. Мембраны 1-го типа -это фильтры, импрегнированные жидким оливковым маслом. Мембраны

2-го типа были приготовлены по методу Тобиаса, т.е. пропитывали фильтры смесью фосфолипида с холестерином в бензоле, после чего бензол отгоняли. В результате пропитки вес фильтра увеличивался 2 на 0,5-1,0 мг/см . Оказалось, что фосфолипид-холестериновая мембрана обладает более высокой проницаемостью для изученных ферментов [ 48 ] .

В ряде работ Илани было показано, что ультрафильтры из эфи-ров целлюлозы производства Миллипор, пропитанные органическими растворителями, в отличие от ультрафильтров с фосфолипидами, описанных Тобиасом, обладают катион-анионной и даже катион-катионной селективностью 39-46] . Так, уже в одной из первых работ Илани говорится, что мембраны, пропитанные толуолом и хлороформом, более проницаемы по ионам К+, чем по ионам JfaВведение KCI и IfaCI в одинаковых концентрациях в растворы с одной и другой стороны мембраны, соответственно, приводило к образованию мембранного потенциала (би-ионный К+ - Яа+ потенциал), величина которого незначительно зависела от полярности растворителя [ 39-41 ] . На мембранах, пропитанных бромбензолом, было показано, что они ведут себя как катионообменншш, что связано с наличием в них примесных карбоксильных групп, иммобилизованных на ацетатцеллкшозной матрице. Количество этих групп, измеренное в прямых экспериментах по связыванию катионов с мембраной, для фильтров объемом 0,045 см3 (диаметр фильт7 ра 25 мм) равнялось примерно 10 молей, что соответствует эффективной концентрации этих групп около 2 . I0"3 М . 40 ] . Селективность мембраны для катионов изменялась в следующем ряду: хинин>тет-раэтиламмоний > Cs+ = К+> ацетилхолин> ЯН|> Яа+> холин > L i> . Высокие значения К+ - i?a+ - селективности импрегнированных миллипоров-ских фильтров были подтверждены работами Иванова Б.Н. и Llflke L. ( 49,50 ] . Интересно, что ранние попытки использовать для получения ион-селективных мембран ультрафильтры чешского производства, имеющие одинаковые с миллипоровскими фильтрат.® размеры пор, оказались безуспешными [з]. "

Как отмечалось, мембраны обладали высокой катион-анионной селективностью и полученные результаты хорошо описывались на основании представлений, согласно которым анионы С1~ не проникают в мембрану [ 40 ] . Частотная зависимость сопротивления и емкости в координатах Коула-Коула имела вид одной дуги при изменении частоты от 500 до 20000 Гц [40 ] , причем физические причины возникновения такой зависимости в этой работе не рассматривались. Более подробно влияние природы заполняющего поры гидрофобного растворителя на электрические характеристики импрегнироваиных ультрафильтров рассматривалось в работе [ 41 ] . Было показано, что мембраны, пропитанные толуолом, бромбензолом, бутилбромидом и хлористым этиленом, отличаются между собой по величине электрического сопротивления более, чем на два порядка, причем самая низкая величина сопротивления наблюдалась в опытах с хлористым этиленом и равнялась примерно 3.10^ Ом.см^. Величина би-ионного К+ - ](а+ потенциала достигала 90 мВ, причем она практически не зависела от полярности растворителя, диэлектрическая постоянная которого в этом случае изменялась от 2,3 (бензол) до 7,0 (хлористый этилен). Кроме того, знак потенциала свидетельствовал о более высокой проницаемости мембран по К+, чем по i."a+. Величина этого потенциала практически не зависела от природы присутствующих анионов, среди которых были хлорид, иодид, оксалат и фосфат. Аналогичные эффекты наблюдались при изучении Jfa+ -Li+ и К+ - Н+ - селективностей. В то же время в экспериментах с органическими катионами тетраэтиламмонием, аце-тилхолином и хинином было показано, что их проницаемость и соответственно величина мембранного потенциала изменяется в зависимости от природы пропитывающей ультрафильтр жидкости. Возникновение мембранного потенциала удается количественно описать на основании представлений о распределении катионов между водой и мембраной и их последующей диффузии в жидкой органической фазе между ионообменными группами, фиксированными на полимерной матрице. Эти механизмы позволяют, кроме того, понять обнаруженный в работе [42] факт, что подвижность в мембране одних катионов зависит от присутствия в ней других катионов. Такое взаимодействие между противо-ионами приводит, в частности, к увеличению эффективного коэффициента диффузии иона К+ от 3,6'Ю-^ см^/сек до 8'10-^ см^/сек в мембране, ионообменные группы которой переведены в натриевую форму L 42 J .

Сопоставление селективности импрегнированных фильтров по от ношению к одно- и двухвалентным катионам приведено в работе [ 44 где, в частности, было показано, что отношение подвижности К+ и Са+2 на ультрафильтрах, пропитанных бромбензолом, может достигать 6900. Интересно, что значения электрического сопротивления мембран в опытах с двухвалентными ионами при измерениях на постоянном токе и частоте 250 Гц отличались друг от друга в 40-100 раз и были значительно выше, чем соответствующие значения в опытах с одновалентными катионами. Анализ результатов, полученных при измерениях мембранного потенциала, электрического сопротивления, а также прямых потоков радиоактивно меченных катионов, показал, что двухвалентные катионы обладают в мембране предельно низкой подвижностью, величина которой изменяется в ряду Ba+2>Sz+2> Са+%>М^+2. В свою очередь, способность двухвалентных катионов связываться с фиксированными ионообменными группами и таким образом конкурировать за них с одновалентными катионами увеличивалась в ряду

Mcj+2> Са+2> 5?+2> Ва+2.

В двух опубликованных в 1973 году работах йлани были представлены экспериментальные данные и теоретическая модель, согласно которой импрегнированные ультрафильтры представляют собой неоднородную мембрану, содержащую как объемную гидрофобную фазу, так и пронизывающие ее непрерывные узкие водные каналы, в которых 45,46 . В соответлокализованы фиксированные отрицательные заряды ствии с этим органические катионы, например хинин, могут проникать через мембрану как по гидрофобной фазе, так и по водным каналам. Необходимо учитывать возможность протекания этого межфазного обмена органических катионов, а также их способность переходить от одной вакансии к другой по фиксированным ионообменным группам в водном канале. Анализ электростатических взаимодействий катионов с ионообменными группами в узком канале показал, что окружающая водный канал среда с низкой диэлектрической постоянной, во-первых, изменяет собственную энергию ионов и, во-вторых, влияет на их взаимодействие с фиксированными ионообменными группами. Учет этих факторов позволяет объяснить влияние диэлектрической постоянной окружающей среды на сопротивление и другие свойства импрегни-рованного фильтра [ 45, 46 ] .

В отдельной работе была изучена зависимость емкости импрег-нированного фильтра от частоты подаваемого напряжения, изменявшегося в диапазоне 50 Гц - 30 кГц [ 43 ] . Было показано, что с ростом частоты измеряемая электрическая емкость уменьшалась, и ее предельные значения на высоких частотах (С оо) в опытах с ультрар фильтрами, пропитанными бромбензолом, равнялись примерно 50 пФ/см . По этой величине для мембран, имевших толщину 0,015 см и пористость 80$, была определена эффективная диэлектрическая постоянная мембраны, равная 8. Такую большую величину нельзя объяснить присутствием в мембране только двух компонент, а именно, бромбензола и эфиров целлюлозы, т.к. ё бромбензола 5,2, а § нитроацетатцеллюлозы 3*8. Эти данные дополнительно показывают, что в мембране находится вода, количество которой в данном случае составляло 1-2% от общего веса фильтра. Изменение емкости с частотой зависело от ионного состава омывающих мембрану растворов, что свидетельствовало, по мнению Илани, о существенной роли электрического сопротивления на границе раздела мембрана/вода [ 43 ] .

Другая трактовка частотной дисперсии емкости была предложена в работах [51, 52 ] . В этих работах использовались ультрафильтры из эфиров целлюлозы и из найлона. Ультрафильтры пропитывали раствором диолеилфосфата и его смесей с холестерином в бензоле, после чего фильтры высушивали на воздухе и взвешивали. Увеличение веса р в результате импрегнирования обычно превышало 2 мг/см и в ряде р случаев достигало 6,0 мг/см'. Электропроводность и емкость модельных мембран, импрегнированных синтетическим аналогом липидов, скачкообразно изменялись после достижения определенной (критической) концентрации соли в растворе. Эти изменения были обратимы, а пороговое значение концентрации соли не зависело от количества адсорбированного липида и размера пор в фильтре. Обнаруженные эффекты удалось объяснить на основании представлений об индуцированном добавками соли изменении фазового состояния диолеилфосфата в мембране, образующего мицеллы и бислои при низких и достаточно высоких концентрациях соли, соответственно [ 52 ] . Значения электрической емкости в опытах с фильтрами из эфиров целлюлозы уменыпа-лись с ростом частоты от 20 до 3*10 Гц и не зависели от частоты в опытах с найлоновыми фильтрами, импрегнированными диолеилфосфа-том. Эти различия импедансных зависимостей для двух типов модельных мембран были объяснены на основании представлений о различных взаимодействиях диолеилфосфата с полимерными цепями найлона и эфиров целлюлозы. Интересно, что введение холестерина в модельные мембраны с найлоновыми матрицами приводило к появлению частотной зависимости емкости . 52 ] .

Работы Кобатаки и соавторов были первым указанием на возможность получения жидкокристаллических структур из липидов или их аналогов в порах ультрафильтров [ 51, 52 J . Метод получения анизотропных жидких кристаллов из яичного лецитина в порах поликарбонатного ультрафильтра описан в работе [ 53 ] . Эти фильтры, производимые фирмой "Нуклеопор", имеют толщину 5 мкм и диаметр пор

ОД мкм. Для получения модельной мембраны ультрафильтры погружали в раствор фосфолипидов в метаноле или пропаноле с концентрацией липидов не менее 20 мМ, после чего легколетучие растворители удалялись под вакуумом. Фильтры выдерживались в водном растворе в течение нескольких часов, что приводило к образованию анизотропных жидкокристаллических структур, обнаруживаемых с помощью спиновых зондов [ 53 ] . В опытах с яичным лецитином было показано, что жирно-кислотные цепи этого липида предпочтительно ориентированы перпендикулярно поверхности фильтров. В порах импрегнированного фильтра присутствовало от 20 до 50 нмолей липидов, что приводило к снижению его проницаемости для полярных молекул, например, радиоактивно меченной лактозы и ионов рубидия примерно в 100 раз [ 53 ] .

Если на поверхность поликарбонатного ультрафильтра нанести всего около 10 мклитров раствора яичного лецитина с холестерином в декане и фильтр быстро погрузить в водный раствор электролитов, то в каждой поре можно получить как несколько, так и одну BJUV1 [54] . Существенно, что механическая прочность таких модельных мембран из-за их малого диаметра оказывается гораздо выше, чем наблюдаемая в опытах с обычными EJIM. Проведенные в работе L 54 эксперименты показали, что в опытах с импрегнированными таким образом ультрафильтрами вольт-амперные характеристики, влияние приводящего к образованию в мембране каналов полиенового антибиотика амфотерицина В, а также влияние флоритина и валиномицина аналогичны таковым на макро-.

54

Импрегнированные ультрафильтры находят довольно широкое применение в решении биофизических задач. Так, в работах Ониши и соавторов на ультрафильтрах, импрегнированных смесью лецитина и фосфатидилсерина, методом спиновых зондов было показано, что ионы о +2

Са взаимодействуют с кислым липидом фосфатидилсерином и таким образом приводят к латеральному перераспределению и образованию кластеров липидов в модельных мембранах [55 - 57] . Наблюдаемые эффекты зависели от ионного состава раствора и исчезали после выдерживания мембран в растворе с рН, меньшим, чем 5,5. Методом электронной микроскопии было показано, что в порах миллипоровского ультрафильтра имеются миелиноподобные образования с толщиной ламелл в них около 2,9 нм. Если использовались ультрафильтры с диаметром пор 0,45 мкм и выше, то поры такими ламеллами заполнялись не полностью, с чем, по-видимому, связано низкое электрическое сопротивление этих модельных мембран, не превышавшее 5 кОм*см^[ 56 . . Подобно ионам Са+2 к фазовому разделению фосфатидилсерина и лецитина приводило понижение рН при постоянной ионной силе, что позволило определить локальное значение рК карбоксильной группы фосфатидилсерина на поверхности мембраны, величина которого уменьшалась от 6 до 4 с ростом концентрации KCI от Ю~4 до Ю"1 М 57 ] . Полученные результаты свидетельствуют о значительном увеличении эффективного значения рК карбоксильной группы при ее переходе из воды в мембрану, т.к. значение рК карбоксильной группы водорастворимого фосфосерина равно 2,65 [б7 . •

В недавно вышедшей работе [бв] было показано, что импрегни-рованные фосфатидилсерином в декане тефлоновые фильтры (тип LS. диаметр пор 5 мкм, Миллипор) могут использоваться для изучения неэлектрогенных потоков катионов К+, ](а+, Са+^ в присутствии кар-боксилсодержащих антибиотиков Нигерии,ина, моненсина и A23I87. Эти фильтры не содержат фиксированные ионообменные группы, и создание градиента концентрации щелочных металлов приводит к генерации мембранного потенциала только в присутствии соответствующих переносчиков совместно с протонофором, например, тетрахлортрифторме-тилбензимидозолом (ТТЕВ). Образование потенциала в этом случае обусловлено возникновением в результате электронейтрального обмена катионов металла на ионы Н+ градиента рН в фильтре и в прилегающих к нему неперемешиваемых слоях воды. Аналогичным образом генерацию потенциала можно было наблюдать, создавая градиент рН в присутствии моненсина и валиномицина. Авторы считают, что предложенный ими метод изучения неэлектрогенных переносчиков катионов намного проще, чем аналогичный подход с использованием БШ, и, по-видимому, будет полезен при изучении ионофорных свойств новых не-электрогенных переносчиков, синтезированных или выделенных из природных мембран

56

Ионная проницаемость миллипоровских фильтров с различными фосфолипидами в присутствии валиномицина и грамтщцина исследовалась в работах L 59, 60 J .

Влияние фосфолипаз ядов змей на скорость пассивной диффузии через импрегнированные фильтры некоторых производных барбитуровой кислоты изучено в работе

61

Выше отмечалось, что в опытах с импрегнированными диолеил-фосфатом миллипоровскими фильтрами изменение солевого состава растворов приводит к фазовым переходам этого синтетического аналога липццов

52 Скачкообразное изменение содержания KCI в омывающих мембрану растворах при определенных условиях приводит к появлению на этой мембране флуктуаций электрического поля, величина которых достигает 20 мВ. Наложение внешнего напряжения, превышающего 2 В, приводит к флуктуациям тока, длительность которых превышает 50 мксек, а величина 5,10~^А[б2 . Эти флуктуации, а также обнаруженные при изучении вольт-амперных характеристик гистерезис-ные явления указывают на способность мембраны переходить в высоко-проводящее состояние при наложении достаточно большого электрического поля. В этом состоянии мембрана остается вплоть до того момента, когда прилоясенное напряжение станет ниже некоторого критического значения. Способность мембраны переходить из нестабильного в исходное стабильное состояние, что приводит к изменению ее сопротивления, позволяет наблюдать явления, аналогичные потенциалу действия на биологических мембранах, т.е. моделировать их возбудимость [ 62 ] .

В ряде работ импрегнированные ультрафильтры использовались как инструмент для изучения процессов генерации электрического потенциала, транспорта ионов и т.д. на замкнутых структурах, образованных биологическими мембранами или искусственными протеоли-посомами [ 63- 7о] . Импрегнированные фильтры совместно с хлорсере-бряными электродами могут применяться для определения концентрации в растворе проникающих ионов, например, тетрафзенилфосфония, что может использоваться в опытах с суспензией биологических мембран 68] . Широко распространен, кроме того, подход, при котором изучаемые биологические объекты сорбируются на поверхности импрег-нированного ультрафильтра, вь,его в данном случае уже роль не модели биологической мембраны, а несущей подложки L69, 70 J . Основные методические преимущества такого подхода состоят в том, что он позволяет коренным образом увеличить площадь тестируемых мембран и, благодаря этому, использовать при изучении электрогенных транспортных процессов методы прямой регистрации трансмембранных потенциалов и токов. В дальнейшем, по-видимому, этот подход может использоваться для встраивания в импрегнированные фильтры различных фармакологических рецепторов и скрининга новых лекарственных соединений.

Целью данной работы являлась разработка новой и более совершенной модели биологической мембраны макроскопических размеров и демонстрация возможностей ее применения для исследования физико-химических факторов, определяющих проницаемость биологических мембран, а также для проведения скрининга и изучения механизмов действия мембранотройных соединений. Одно из основных требований, предъявляемых к этой модели, заключается в том, что она должна обладать не только ионной селективностью, как мембраны Илани, но и быть похожей на биологические мембраны по многим друтим физико-химическим характеристикам. Можно было думать, что такое соответствие будет наблюдаться, если поры нитроацетатцеллюлозных ультрафильтров будут полностью заполнены природными липидами.

Прежде всего, можно было ожидать,что такая мембрана будет содержать жидкокристаллические структуры, аналогичные существующим в биомембранах. Однако высокая вязкость большинства животных липидов не позволяет полностью импрегнировать поры ультрафильтров без введения дополнительного растворителя, присутствие которого может существенно исказить свойства модельных мембран. Поэтому мы в работе изучали электрохимические характеристики и проницаемость нитроацетатцеллюлозных ультрафильтров, пропитанных жидкими органическими веществами, напошнавдими по структуре липиды биологических мембран. Возможность проведения скрининга и изучения механизмов действия мембранотропных химических соединений нами была показана на примерах стимулированного анионами жирных кислот транспорта одновалентных катионов, детергентоподобного действия аминазина и ряда антидепрессантов, а также взаимодействия катионной формы противовирусного препарата ремантадина с жшрегнированными уль трафильтрами.

ЗКСПЁРЖШТМЫШ! ЧАСТЬ ГЛАВА I

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве модельной мембраны использовались импрегнирован-ные липидоподобными веществами мембранные нитроацетатцеллкшозные ультрафильтры марки "Синпор-2" (ЧССР). Структура фильтров соответствует многослойной системе близких по размеру каверн с проломленными стенками, которые собственно и образуют поры. В работе были.использованы фильтры со средним диаметром пор 2,5 + 0,5 мкм, объем пор составлял 60-85/Ь от общего объема фильтра. Диаметр фильтров составлял 35 мм, толщина 100 + 20 мкм. Толщину фильтров дополнительно контролировали микрометром. Некоторые эксперименты проводились на пористых пленках из тефлона (толщина 100 мкм, диаметр пор 2 мкм), любезно представленных нагл д.ф.-м. наук С.Ф. Тимашевым. Поры в этих пленках были созданы в результате облучения пучком нейтронов и последующего растравливания. Перед экспериментами тефлоновые пленки промывались этиловым спиртом и высушивались в течение 30 минут.

Фильтры пропитывали, погружая их в жидкие (при комнатной температуре) изо-бутиловый эфир лауриновой кислоты (и-БЭЖ), метиловый эфир миристиновой кислоты или олеиновую кислоту. Для пропитки веществагли, твердыми при комнатной температуре (калри-новая кислота, ланолин), их предварительно расплавляли. Ультрафильтры импрегнировали простым погружением в органическую жидкость на I мин. Несодержащие значительные инородные включения и равномерно пропитанные ультрафильтры довольно хорошо пропускали свет в видимой области. Образцы из тефлона быстро пропитывались и-БЭЖ.

Для пропитки олеиновой кислотой из-за плохого смачивания тефлоно-вых фильтров требовалось несколько суток.

Липидоподобные вещества, применяемые для пропитки фильтров, предварительно инкубировались вместе с водными растворами, используемыми для наполнения ячейки. Происходящее при этом уравновешивание проводили совместным перемешиванием водной и органической фаз с последующим их разделением. Величину рН нижнего водного слоя устанавливали добавлением 0,1 н раствора HCI или JfaOH. Верхний органический слой использовали для пропитки фильтра. Увеличение массы фильтра в результате пропитки лишгдоподобным вещеетр вом достигало 8-10 мг/см , что свидетельствовало о полном заполнении пор импрегнирующей жидкостью.

Эксперименты проводились на установке, блок-схема которой представлена на рис.1. Измерительная ячейка представляла собой термостатируемую кювету, разделенную мембраной на две равные части. В процессе работы были использованы 4 вида кювет. При изучении прямой диффузии меченной тритием воды использовалась стеклянная цилиндрическая кювета общим объемом 50 мл с рабочей площадью р мембраны 3,8 см . При исследовании механизмов действия жирных кислот, аминазина и ряда антидепрессантов использовалась цилиндрическая термостатируемая кювета из оргстекла объемом 16 мл, с р площадью мембраны, контактирующей с растворами, 2,54 см . При изучении переноса ионов К+ с помощью К+ - селективного электрода с содержащей валиномицин мембраной, а также при изучении влияния ремантадина и амантадина на импрегнированные фильтры использовалась прямоугольная кювета из оргстекла объемом 30 мл с рабочей р площадью мембраны 4,5 см . В этом случае ион-селективные электроды можно было погружать непосредственно в омывающие мембраны растворы. При изучении зависимости сопротивления и емкости мембраны самописец КС/7-4 гу/7?о/> 02

Бис. I. Блок-схема экспериментальной установки. от частоты подаваемого напряжения использовалась цилиндрическая термостатируемая кювета из стекла объемом 28 мл, тлеющая рабочую о площадь мембраны 3,8 см . Эта кювета была снабжена круглыми плар типовыми электродами площадью около 3 см . Перемешивание осуществлялось во всех кюветах, кроме цилиндрической ячейки из оргстекла, погружными механическими мешалками с регулированным числом оборотов. В последнем случае перемешивание раствора проводили путем принудительной циркуляции жидкости с помощью перистальтического насоса марки "ELMEZ) -304" (ПНР). При скорости работы насоса 18 отн.ед. поток жидкости равнялся 30 мл/мин.

Непрерывное измерение значений рН водных растворов в кюветах проводилось при помощи проточных термостатируемых электродов 0P-743I "Radetkis" (Biff), модифицированных нами для проведения непрерывной регистрации и присоединенных к иономерам ЭВ-74. Электродами сравнения служили хлорееребряыые электроды ЭМ-1МЗ с солевыми агар-агаровыми мостиками. Мостики заполняли нагретым 3% раствором агар-агара, насыщенным KCI. Циркуляция растворов через кювету и проточный электрод осуществлялась также перистальтическим насосом. Поскольку показания электродов зависели от скорости циркуляции потока жидкости, их калибровку проводили с помощью стандартных растворов, пропускаемых через электроды с такой же скоростью, как в эксперименте.

Измерение концентрации ионов К+ в водных растворах проводили погруженным К+-селективным электродом с мембраной, содержащей вали-номицин. Показания иономеров при измерении рН и концентрации ионов К+ непрерывно регистрировались на самописце КСП-4 на I мВ. Вся шкала самописца соответствовала 0,25 единицам рН или рК+.

Величину мембранных потенциалов контролировали с помощью двух хлорееребряных электродов с солевыми мостиками, показания которых регистрировались на рН - метре рН-673, присоединенном к КСП-4 на 100 мВ. Вся шкала самописца при регистрации в режиме нуль-индикации соответствовала 250 мВ.

Выходное напряжение рН -метра и иономеров компенсировали с помощью имитаторов электродной системы И-02 или Н-01.

Для перевода значений скоростей : закисления из единиц рН/час в г-ион/см^.сек проводилось определение буферной емкости растворов, насыщенных олеиновой кислотой и содержащих импрегнированньш ею фильтр. Изменение содержания ионов Н+ проводили добавлением 0,1 н раствора HGI. Определенная таким образом буферная емкость как фосфатного, так и цитратного буферов, содержащих Ш KCI, была равна примерно 3*10 г-ион/литр. После скачкообразного изменения рН раствора введением HCI в кювету "мертвое время" реагирования электродов не превышало 5-10 сек. Показания Н+- и К+ - селективных электродов выходили на стабильный уровень за 1-2 минуты. Поскольку показания ион-селективных электродов сильно зависят от температуры U^AT^I мВ/град), электроды и вся измерительная ячейка термостатировались с помощью жидкостного термостата U -15 (ГДР) и прогревались до начала измерения в течение часа.

Необходимо отметить, что из-за взаимного влияния измерительных систем одновременно можно было измерять либо<д рН в одной половине ячейки и мембранный потенциал, либо только значения рН с обеих сторон мембраны. В первом случае в одну половину ячейки вводился солевой мостик от общего электрода сравнения для измерения рН с этой же стороны мембраны и для определения мембранного потенциала. Во втором случае для каждого рН-селективного электо рода использовался отдельный вспомогательный электрод.

Сопротивление на постоянном токе К^ (подаваемое напряжение ~ 2 вольта) и емкость мембраны на частоте I кГц измеряли с помощью вольтфарадоомметра Р-385 (СССР) и присоединенных к нему хлорсе-ребряных электродов с солевыми мостиками. При измерении емкости генератором переменного напряжения подавалось напряжение синусоидальной формы с амплитудой 5 вольт и частотой I кГц. Между одним электродом и вольтфарадоомметром дополнительно вводился конденсатор с емкостью С0 = I мкФ. Благодаря введению этой емкости подавлялась поляризация примембранных слоев, связанная с активным сопротивлением мембраны постоянному току, выделялись только емкостные токи и определялась истинная емкость мембраны. Емкость, измеренная в контрольных опытах без мембраны, определялась геометрией кюветы и на цилиндрической кювете из оргстекла равнялась 16-17нФ. Поскольку общая емкость последовательно соединенных конденсаторов меньше наименьшей из них, то данная схема позволяет корректно измерять емкости до 1,6-1,7 нФ (ошибка не превышает 10%).

При измерении сопротивления, емкости и мембранного потенциала показания приборов не всегда устанавливались сразу из-за переходных процессов. Иногда приходилось выжидать 10-15 минут до установления "стационарной величины", сохраняющей свое значение в течение 5 минут с точностью 5%. После измерений сопротивления на постоянном токе величины рН растворов и мембранного потенциала отличались от исходных значений и постепенно возвращались к ним, на что уходило примерно 10 мин.

Сопротивление хлорееребряных электродов с мостиками составляло примерно 10 кОм. Поэтому в тех случаях, когда сопротивление мембраны было мало, для его регистрации использовались электроды из медной проволоки или листов алюминиевой фольги и платины, дававшие близкие между собой результаты.

Зависимость электрического сопротивления и емкости мембраны от частоты подаваемого напряжения исследовали с помощью плоских платиновых электродов в стеклянной ячейке по мостовой схеме на установке, состоящей из моста емкостей со встроенным нуль-индикатором и внешнего генератора звуковых сигналов.

Измеряете значения R и С в диапазоне частот (СО ) 100 Гц

10000 Гц использовали для вычислен ти импеданса мембраны по формулам R ия действительной и мнимои час

71 J R

X, = i*<o'CzR* ' йл) a)CR& с I * co*C*R*

1.2)

По полученным значениям R и Хс в координатах Коула-Коула строили импедансные диаграммы, т.е. зависимости 1п от R .

Необходимо отметить, что в процессе работы использовались партии ультрафильтров, изготовленные в разные сроки. Но все они, за исключением одной партии, после импрегнации липидоподобными веществами имели величину сопротивления мембраны, равную примерно 5*10 0м. Партия ультрафильтров, явившаяся исключением, имела величину сопротивления на один порядок выше.

При появлении в фильтрах случайных механических повреждений происходило резкое уменьшение их сопротивления, а также наблюдался значительный перенос HCI в градиенте рН. В этом случае фильтры немедленно заменялись. За целостностью фильтров следили также по наличию мембранного потенциала, а также измеряя сопротивление и емкость мембраны. Если в ячейке закреплялись фильтры, не пропитанные и-БЭЖ, и с одной стороны вводилась соляная кислота, то при перемешивании значения рН выравнивались за время, меньшее1мин. На целых пропитанных и-БЭЛК фильтрах изменения концентрации ионов

Н+ в градиенте рН не наблюдались в течение часа.

При изучении прямой диффузии меченной тритием воды цилиндрическую ячейку из стекла объемом 50 мл с обеих сторон от импрег-нированной мембраны заполняли одинаковыми водными растворами, насыщенными липидоподобным веществом. Затем в один из растворов (до-норный) добавляли небольшой объем меченной тритием воды. Радиоактивность этого раствора достигала в среднем 0,6 мкКи/мя. До начала опыта определяли радиоактивность 0,1 мл донорного раствора (CQ). Во время опыта через некоторые промежутки времени определяли радиоактивность в пробах акцепторного раствора объемом 0,1 мл (Сi ), а по окончании опыта - радиоактивность фильтра (С,.). Для измерений отобранные пробы или фильтр растворяли в 5 мл сцинтиллятора ЖС-8. Уровень радиоактивности определяли на счетчике импульсов "Бета" (СССР).

В предварительных экспериментах было показано, что потери в счете, вызванные тушением и самопоглощением после добавления образца, составляют менее 10% от теоретического уровня радиоактивности проб и фильтра.

Дифференциальные Ж-спектры импрегнированных и-БЭЛК фильтров до и после пятиминутного выдерживания в водном растворе аминазина М) регистрировали на прибореUR -20 (ГДР). В оба луча прибора помещали одинаковым образом импрегнированные фильтры. В луче сравнения устанавливали необработанный аминазином фильтр с несколько меньшей толщиной.

В работе были использованы обычные коммерческие реактивы без дополнительной химической очистки за исключением и-БЭЛК, подвергавшегося предварительной перегонке под вакуумом. В опытах с олеиновой кислотой был использован препарат фирмы "Реахим" (СССР) для определения жесткости воды (2). Температура его кристаллизации 4-7°С. Чистоту используемой олеиновой кислоты проверяли хроматографическим методом в системе хлорофорьу^уксус-ная кислота (объемное отношение 24:1 )?-на пластинке с силикагелем получалось одно пятно с Щ =0,8. Аминазин и антидепрессанты были любезно представлены академиком АМН СССР М.Д.Машковским. Ремантадин и амантадин были синтезированы НЛО.Полисом в Институте Органического синтеза АН Латвийской ССР.

ГЛАВА 2

МОДЕЛИРОВАНИЕ НА ИМПРЕГНИРОВАННЫХ ЛИПИДОПОДОБНЫМИ ВЕЩЕСТВАМ УЛЬТРАФИЛЬТРАХ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКИХ СВОЙСТВ

БИОМЕМБРАН

Как уже указывалось в литературном обзоре, для моделирования ряда физико-химических процессов, протекающих на биомембранах, в последнее время все большее применение находят небислойные липид-ные мембраны, в частности, импрегнированные органическими растворителями или липидами поликарбонатные, ацетатцеллюлозные и тефло-новые мембранные фильтры [б, 35-58] . Мы предложили новую модель биологической мембраны [ 72 ] , представляющую собой нитроцеллюлоз-ный ультрафильтр, импрегнированный жидкими эфирами жирных кислот. Достоинствами такой модельной системы являются достаточно большие размеры, высокая стабильность, возможность работать с такими органическими веществами, которые не образуют стабильные бислои. В качестве пропитывающей органической жидкости использовался, в частности, изо-бутиловый эфир лауриновой кислоты (и-БЭЛК). Благодаря наличию полярной головки и жирнокислотной цепи этот растворитель может рассматриваться как модель нейтральных липидов. Пропитка ультрафильтров жидким и-БЭЛК, в отличие от работы с фосфолипидами, не требует введения растворителей, дополнительно изменяющих свойства мембран [41, 53 ] . Кроме того, и-БЭЛК практически не растворим в воде, не приводит к нарушению структуры и растворению ультрафильтров, достаточно чист (например, не содержит двойных связей и перекисных групп в отличие от природных липидов), стабилен и дешев, что важно при проведении массовых автоматизированных предбио-логических испытаний химических соединений на мембранотропную активность. Вследствие удачного выбора импрегнирующей жидкости и пористой матрицы предлагаемая модель, как будет показано ниже, оказалась ближе по своим удельным электрическим характеристикам к биомембранам, чем бислойные лецитиновые мембраны.

Рассмотрим последовательно основные электрические характеристики импрегнированных и-БЭЛК фильтров: электрическую емкость (С ), измеренную на частоте I кГц, сопротивление (К) на постоянном токе и мембранный потенциал (У).

Величины С и R для фильтров при 20°С раышлись^бО пФ/см2 и 5*10^ - 2*10^ Ом.см2, соответственно (см. табл.1). В отдельных опытах, где в качестве мембраны использовались стопки из различного количества импрегнированных ультрафильтров, было показано, что сопротивление и обратная величина емкости прямо пропорциональны толщине ультрафильтров (рис.2). Вклад неперемешиваемых слоев и границы раздела фаз определяется по величине отрезков, отсекаемых полученными прямыми на оси ординат. Как видно из рис.2, значения R и С определяются толщиной мембраны, а не прилегающими к ней непе-ремешиваемыми водными слоями и границами раздела фаз. Все это позволяет пересчитать значения емкости и сопротивления на толщину о

100 А, что соответствует толщине биомембраны. Эти значения приведены в таблице I.

Видно, что полученные значения С при использовании импрегнирующей жидкости с диэлектрической постоянной & , равной 2*2,5, сравнимы с величинами, полученными на биомембранах. Эффективная диэлектрическая постоянная & для импрегнированных и-БЭЖ фильтров, вычисленная по формуле плоского конденсатора [ 73 ]

Таблица I.

Сравнение свойств биологических мембран, бислойных липидных мембран (ЕЛМ) и импрегнированных фильтров (ИФ) [ 75-78

Биомембраны БЛМ из нейтральных липи-дов ИФ толщиной 0,01 см ИФ в pac4gTe на 100 А

Сопротивление, Ом'см2 Ю2-Ю5 Ю6-Ю9 5'106-2-Ю7 5'102-2-103

Емкость, мкФ/см2 0,5-1,3 0,3-1,0 (0,4-0,8)Ю~4 0,4-0,8

Проницаемость по олеиновой кислоте, см/сек 5,6'Ю~3 56

Проницаемость по воде, Ю~^см/сек 1,0-400 4 - 120 (9-40)'М-3 90 - 400

Би-ионный К+ -J(a+ - потенциал, мВ 60 - 90 0-10 25 - 40 25 - 40

Потенциал в десятикратном градиенте KCI, мВ • 20 - 58 0-10 20 - 50 20 - 50

2.1)

2 /> 0 (С - емкость, мкФ/см, С - толщина в А )5 близка при 20 С к 7.

Поскольку импрегнированный фильтр представляет собой высокопористый неоднородный диэлектрик, можно считать, что его емкость равна е-/о? см

Рис. 2. Зависимости I/С СI) и R(2) от толщины состоящей из нескольких фильтров мембраны, пропитанной метиловым эфиром миристиновой кислоты, рН 4,0;40° С. сумме емкостей целлюлозной матрицы (Cj) и и-БЭЛК (Gg), взятых порознь, что соответствует эквивалентной схеме из двуз£ рараллельных конденсаторов [74] . В таком случае: с . + Si-Si , где £ и £ - площади и диэлектрические постоянные соответствующих конденсаторов. Считая, что б целлюлозы 6,5 74 ] , а пористость ультрафильтра 60-80$, получим, что £ органического растворителя близка к 7, что значительно превышает значения*? для чистого и-БЭЛК. Эти различия £ могут свидетельствовать о существенном включении воды в мембрану. Оценки, аналогичные приведенным выше, показывают, что ее количество может доходить до Близкие значения, как будет видно в следующей главе, были получены в прямых экспериментах при изучении содержания воды в мембране по три-тиевой метке.

Значение электрического сопротивления шлпрегнированного и-БЭЛК фильтра равнялось 5*10^ - 2*10^ Ом.см?, что сопоставимо со значениями, полученными в . 63-65, 79 ] . Как и следовало ожидать для проводников второго рода с ионной проводимостью, сопротивление импрегнированных фильтров уменьшалось при нагревании примерно в два раза при изменении температуры от 20° до 40°С, емкость же при этом возрастала на 20 - 30%. Величины сопротивления импрегнированных фильтров по порядку величины сопоставимы с аналогичными значениями, полученными на БЛМ из нейтральных липидов. Однако, как видно из таблицы I, сопротивление импрегнированных фильтров, о" приведенное к толщине 100 А, близко к значениям, наблюдаемым на биомембранах, и на три порядка меньше величин , характерных для ^модифицированных БЛМ. В работе .54] показано, что в случае очень малых добавок растворенных в декане липидов в фильтре могут образовываться микро-ЕШ с диаметром, равным диаметру поры. В наших экспериментах и-БЭЛК заполнял все поры полностью, о чем свидетельствует, например, увеличение веса фильтра после пропитки, достир гавшее 8-10 мг/см .

Соответствие электрических характеристик импрегнированных фильтров и биомембран наблюдалось также, если вместо и-БЭЛК для пропитки использовать жидкие растительные липиды, например, касторовое масло или ланолин.

При изучении зависимости сопротивления фильтров,пропитанных и-БЭЛК, от рН омывающих растворов видно, что с уменьшением концентрации ионов Н+ сопротивление падает (рис.3), причем зависимость эта имеет вид кривой титрования с перегибом в области рН 6,5. Этот перегиб может быть обусловлен титрованием имеющих гид-ратную оболочку карбоксильных групп, фиксированных в толще мембраны.

Введение' различных концентраций KCI с двух сторон импрегниро-ванного и-БЭЛК фильтра приводит к образованию трансмембранной разности потенциалов, линейно связанной с логарифмом концентрации KCI (рис.4). Крутизна электродной характеристики зависела от природы матрицы и величина потенциала изменялась от 20 мВ, при изменении концентрации KCI на порядок в опытах с тефлоновой матрицей (кривая I), до 30 мВ, когда импрегнировали и-БЭЛК нитроацетатцел-люлозный фильтр (кривая 2). Знак потенциала свидетельствовал о более высокой проницаемости по ионам К+ по сравнению с С1~. Эти данные свидетельствуют о том, что импрегнированные и-БЭЛК синпо-ровские ультрафильтры обладают катион-анионной селективностью.

При создании градиента рН на мембране также возникает электрический потенциал, зависимость которого от рН с одной стороны

3,0 6,0 9,0 ри

Рис. 3. Зависимость относительного сопротивления мембраны от рН растворов, BQ - сопротивление мембраны при рН 3,6. Растворы содержали 5мМ фосфатный буфер и 0,1 М KCI при 20° С. f.^Ccp" /

ЬО

ZO

OS to d Co

Рис. 4. Зависимости величины трансмембранной разности потенциалов от концентрации КС! в одной полуячейке (СО. Концентрация KCI в другой полуячейке (С ) оставалась постоянной и равнялась 0,1 М. Отрицательный знак У-в более концентрированном растворе. До создания градиента К+ все растворы содержали 0,1 М KCI и 5мМ фосфатный буфер при рН 5,5; 40° С.

1 - тефяоновая мембрана, пропитанная и-БЗЖ.

2 - нитроацетатцеллюлозный фильтр, прпитэдный и-БЭЛК. мембраны приведена на рис.5. Величина трансмембранной разности потенциалов достигала 60 мВ. Положительное значение потенциала соответствовало стороне с меньшей концентрацией ионов Н+. Крутизна электродной характеристики равнялась на начальном участке рН-зависимости 25-30 мВ при десятикратном градиенте Н+, что свидетельствует о значительной селективности к ионам Н+ по сравнению с С1~. Селективность типа Н"*1- С1~ описана также для ацетатцеллюлозных фильтров, пропитанных бромбензолом [ 80 ] . В этой работе был сделан вывод о том, что мембранный потенциал импрегнированных фильтров лучше описывается на основании представлений об ионном обмене, чем уравнением Гольдмана. С этим выводом вполне согласуются результаты, представленные на рис.5. Интересно отметить, что катион-анионная селективность зависит не только от природы матрицы, но и от природы импрегнирущей ее органической жидкости. На рис.17 видно, что при замене и-БЭЖ олеиновой или каприновой кислотами селективность К+-С1~ резко увеличивается.

Кроме катион-анионной селективности имцрегнированные фильтры обладают также высокой катион-катионной селективностью, что не наблюдается на ^модифицированных EJIM из нейтральных липидов .3,80 J . В наших опытах при концентрациях KCI и JfaCI, равных 0,2 М, величина би-ионного потенциала, моделирующего потенциал покоя [7б], достигала 27 мВ (рис.6), "плюс" со стороны JfaCI. Одинаковое уменьшение рН обоих растворов приводило к протонированию ионизованных карбоксильных групп, в результате чего мембранный потенциал падал практически до нуля, т.е. исчезала K"t-|fa+ - селективность. Зависимость от рН имеет перегиб при рН 4,5, что близко к значениям рК карбоксильных групп. Близкое значение точки перегиба в опытах по зависимости би-ионного К+ - Jfa+ - потенциала от рН к значению рК карбоксильных групп в воде, по-видимому, свидетельг з и 5 рН

Рис. 5. Зависимость мембранного потенциала от рН с той стороны, в которую постепенно вводили ОД М HGI; рН 4,8 с другой стороны, I М KGI, 5мМ фосфатный буфер, 20° С.

Р"

Рис. б. Зависимость би-ионного К+- ifа+ - потенциала от рН, одинаково изменяющегося с обеих сторон мембраны, пропитанной и-БЭЛК. ствует о том, что в генерации мембранного потенциала принимают участие гидратированные карбоксильные группы, находящиеся на поверхности мембраны.

Вполне удовлетворительное соответствие многих измеренных нами физико-химических параметров импрегнированных фильтров и аналогичных величин у биомембран обусловлено наличием в импрегнированных фильтрах трех основных компонент, а именно, полимерных углеводных цепей с катионообменными группами, содержание которых достигает 10"^ г-ион/литр[ 40, 46, 80 ] , лишщшодобной импрегни-рующей жидкости и воды, которые соответственно отражают некоторые свойства полимерных цепей белков и полисахаридов, а также липидов и воды биологических мембран. Можно думать, что шлпрегнированные жидкими и жидкокристаллическими жпидоподобными веществами ультрафильтры будут широко использоваться как модель биологических мембран и, в частности, для проведения массовых биологических испытаний химических соединений на мембранотропную активность.

ГЛАВА 3

ИЗУЧЕНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ШПРШШРОВАННЫХ ФИЛЬТРОВ

ДЛЯ ВОДЫ

В предыдущем параграфе были рассмотрены основные электрохимические характеристики импрегнированных ультрафильтров, в частности, их электрическое сопротивление, электрическая емкость, наличие ионной селективности. Ниже приведены результаты экспериментов по определению проницаемости импрегнированных фильтров для меченной тритием воды.

Известно, что некоторые биомембраны имеют аномально высокую проницаемость для ряда неэлектролитов и, в первую очередь, для воды . 81 ] . Физико-химические факторы, обусловливающие повышенную проницаемость мембран для воды, многократно исследовались на таких широко известных моделях биологических мембран,как БЛМ и липосомы.

Анализ этих работ был опубликован в обзоре [ 82 ] . Величины проницаемости модельных мембран для воды различаются на порядок в зависимости от типа используемого липида и в целом соответствуют значениям, характерным для биологических мембран. В то же время транспорт воды через эритроцитарные мембраны оказывается существенно выше, чем наблюдаемый в модельных экспериментах [ 82 ] . Обычно аномально высокая проницаемость воды объясняется на основании различных косвенных экспериментов как прямой диффузией через липидные ные области . Возможно, что эти "каналы" связаны с белками мембран эритроцитов и с нарушениями вблизи них структуры идеального липидного бислоя [ 83 ] . бислои, так и дополнительным транспортом через гидрофиль мембраны, часто рассматриваемые как водные "каналы" [ 83

В предварительных экспериментах с импрегнированными фильтрами, инкубированными с водой, содержащей тритиевую метку, было показано, что разброс значений радиоактивности в одинаковых по площади частях фильтра достигал нескольких десятков процентов. В отдельных опытах было показано, что с этой точностью равновесное распределение метки между фильтром и раствором устанавливается меньше, чем за одну минуту. По содержанию тритиевой воды в модельных мембранах определяли эффективный коэффициент распределения импрег-нированный фильтр/вода^^) , равный: пг- См-Ун*а (3.1)

I/ V r'Co-vM где Vm и *нго - объемы импрегнированного фильтра и отбираемого раствора, соответственно. С„, С; и СЛ- те яе, что и в главе 1. м ь и

По результатам кинетических экспериментов строили зависимость степени достижения равновесия / от времени (• , где

Наклон этих зависимостей, при малых значениях t имевших вид прямой, характеризует проницаемость мембраны. Проницаемость по воде^} определяется значением f и эффективным коэффициентом диффузии воды в мембране Ю (см^/сек) и равна В свою очередь , по величине F можно найти произведение :

7Ь---FV-t(3.2) где А = 3,8 см^ - площадь мембраны, соприкасающейся с раствором;

С - толщина мембраны; V = 25 см3 - объем половины ячейки. Зная из независимых экспериментов величину у , мы определяли эффективное значение © .

Отметим, что изменение начального уровня радиоактивности в донорном растворе на порядок не влияло на наклон кинетической зависимости. Во всех опытах частота перемешивания равнялась

500 об/мин. В этих условиях, как будет показано ниже, диффузионные ограничения, обусловленные неперемешиваемыми слоями примем-бранной воды, отсутствовали. В опытах, осуществляемых без перемешивания, проявлялось влияние этих слоев, что приводило к уменьшению наклона кинетической зависимости в 1,7 раза.

Как видно из рис.7, проницаемость мембраны зависит от типа импрегнирующей жидкости и существенно уменьшается при замене каприновой кислоты более вязким ланолином. Удельный поток воды в опы

-7 тах с фильтром, пропитанным каприновой кислотой, равен 4,2*10 моль/см .сек, что соответствует величине равной 7,6*10 ^см^/сек Можно думать, что в данном случае осуществляется прямая диффузия воды в соответствии с ее эффективной константой распределения f и коэффициентом диффузии в мембране . В пользу этих представлений свидетельствует тот факт, что наклон кинетической кривой не зависит от исходной концентрации меченной тритием воды.

Измеряемая проницаемость (Р) мембраны для воды определяется проницаемоетягли собственно мембраны (Р ) и двух неперемешиваемых примембранных слоев и описывается формулой:

7 А "0Г ©н <3-3> где 4 и / - толщины неперемешиваемого слоя и мембраны, а и ® - соответствующие коэффициенты диффузии. В отдельных экспериментах была изучена зависимость Р от толщины мембраны, которая представляла собой в этом случае набор из Нескольких фильтров, пропитанных метилмиристатом. После достижения стационарной скорости зависимость t/F от толщины мембраны представляла собой прямую линию, причем вклад неперемешиваемых слоев, определяемый по пересечению с осью ординат, был практически равен 0. Величина , определенная по наклону этой зависимин

Рис. 7. Кинетика транспорта воды через шлпрегнированные фильтры с различными пропитками:

1 - кадриновая кислота;

2 - и-БЭЖ;

3 - олеиновая кислота;

4 - ланолин.

Толщина фильтра 0,012 см (I),0,011 см (2), 0,012 см (3), 0,011 см (4). С обеих сторон от мембраны вводилась уравновешенная с шлпрегнированным веществом вода с рН 5,0* 40° С.

- ы мости, равна см2/сек. Такие же значения 2)^Гполучены из анализа отдельных кинетических экспериментов по формуле 3.2.

Как отмечалось в методике, содержание тритиевой воды в фильтре довольно сильно варьировало от образца к образцу, и величина^ изменялась для разных пропиток в пределах от 0,01 до 0,05. Вычисленный из величин 0у&ффективный коэффициент диффузии воды через импрегнированный фильтр с различными пропитками изменяется гу с Г) в диапазоне от 10 до 10 см /сек. В этом случае характерное время задержки для прямой диффузии воды, вычисленное по формуле v = —£—

6Ю (3.4) не должно превосходить 3 минуты для фильтра толщиной 0,01 см, что и наблюдается на опыте.

Особый интерес представляет сравнение проницаемости импрег-нированных фильтров и биомембран. Для фильтров, импрегнированных метилмиристатом и имеющих толщину 15*10 см, величина Р равна 2,8-Ю-6 см/сек. Поскольку проницаемость неперемешиваемых слоев достаточно велика, то проницаемость импрегнированных фильтров, как видно из формулы 3.3, обратно пропорциональна толщине мембраны. При пересчете для толщины 10 см, что соответствует толщине биомембран, проницаемость будет равна 4,2-см/сек при температуре 40°С.

В случае наиболее вязкого из использованных веществ, ланолина, соответствующая величина равна S,0см/сек в пересчете на толщину биомембран. Это значение довольно близко, хотя и несколько выше проницаемости эритроцитов собаки при 37°С, равной

7,2-10 3 см/сек

84

Ранее мы показали, что различные электрохимические характеристики импрегнированных фильтров и, в частности, катион-анионная селективность, в значительной степени определяются свойствами мембранной матрицы, содержащей СООН-группы. Можно было предположить, что и диффузия такого полярного неэлектролита, как вода, будет зависеть не только от типа пропитывающей жидкости, но и от состояния матрицы.

Непосредственно это удалось показать в опытах, где фильтр сначала погружали в водные растворы, насыщенные СаС19 или JfaCI, и затем высушивали, После такой предобработки проницаемость воды через фильтры, пропитанные олеиновой кислотой, возрастала в обоих случаях на порядок. Гораздо меньшие эффекты наблюдались после аналогичной предобработки в 1н растворе HCI.

Предобработка в солевых растворах, возможно, приводит к дополнительной гидратации карбоксильных и других групп и их связыванию с противоионами, также имеющими гидратнуто "шубу". Существование и свойства слоев воды, взаимодействующих с волокнами целлю

В результате образования взаимодействующих с полимерной матрицей водных слоев меченная тритием вода может диффундировать через импрегнированные фильтры уже по двум путям. Один из них представляет собой заполняющую пору пропитку, а другой - водные ассоциаты, локализованные между углеводной матрицей и пропиткой.

Наличие таких водных ассоциатов, взаимодействующих с карбоксильными группами пористой матрицы, должно приводить к концентрированию в них неорганических катионов, компенсирующих избыточный отрицательный заряд на стенках каналов и, таким образом, определять проводимость мембраны.

О значительном взаимодействии воды с матрицей свидетельствует также величина^ изменявшаяся в наших опытах с предобработкой в водных растворах от 0,03 до 0,1, тогда как коэффициент лозы, описаны, например, в работах распределения воды в системах вода-гексадекан и вода - оливковое

Ч —А масло гораздо меньше и равен 4,2-10 и 7«10 , соответственно [ 86 ] . По величине уможно оценить как количество воды в фильтре, так и среднюю толщину слоя воды в отдельной поре. Приу = 0,01 -0,05 содержание воды в фильтре составляло 1-5%. После предобработки величина у, как указывалось ранее, увеличивалась и количество воды возрастало вплоть до 10$. При у, равном 0,01, в фильтре площадью I см2 и толщиной 0,01 см содержится I'lG™^ см^ воды. р

Тогда, вычислив по пористости и размерам пор их число jf на I см

16-10 ) и считая, что они представляют собой цилиндры радиусом

1,25'Ю""4 см, стенки которых покрыты по всей высоте тонким слоем воды, получим, что толщина водного пристеночного слоя равна при--6 мерно 0,8-10 см.

Наличие двух путей диффузии воды через импрегнированный фильтр означает, что полученные нами величины проницаемости,®, ^Г и т.д. являются эффективными значениями, усредненными по площади фильтра.

Таким образом, в экспериментах на импрегнированных различными липидоподобными веществами мембранных фильтрах нагл удалось продемонстрировать существование двух различных механизмов диффузии воды. Один из них соответствует транспорту воды через липидные 6и-слои биологических мембран. Второй механизм напоминает процессы транспорта через каналы, и его вклад определяется толщиной водных слоев и состоянием локализованных в них ионообменных, например карбоксильных,групп. Тот факт, что пересчитанная на толщину биологической мембраны проницаемость импрегнированных ультрафильтров для воды даже при пропитке ланолином несколько превосходит значение проницаемости эритроцитарных мембран, по-видимому, можно объяснить как повышенным по сравнению с биомембранами содержанием "каналов" в импрегнированных фильтрах, так и их большими размерами.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Осак, Игорь Симеонович

вывода

1. Предложена новая модель биологической мембраны, представляющая собой импрегнированные жидкими липидоподобными веществами нитроацетатцеллюлозные ультрафильтры.

2. Показано, что импрегнированные изо-бутиловым эфиром лаури-новой кислоты ультрафильтры обладают катион-анионной и катион-кати-онной селективностью. Удельное электрическое сопротивление, емкость и проницаемость по воде импрегнированных ультрафильтров близки к значениям этих параметров биомембран.

3. Обнаруженное соответствие многих физико-химических характеристик импрегнированных ультрафильтров и биологических мембран связано с наличием в них "водных каналов", локализованных в среде с низкой диэлектрической постоянной и содержащих фиксированные карбоксильные группы.

4. Экспериментально показано, что жирные кислоты способны переносить ионы Н+ как по неэлектрогенному механизму в обмен на катионы щелочных металлов, так и по электрогенному механизму, приводя к генерации мембранного потенциала. Предложена теоретическая модель, количественно описывающая ионофорную активность жирных кислот и удовлетворительно объясняющая проницаемость биологических мембран для ионов К+.

5. Обнаружено детергентоподобное действие аминазина и ряда антидепрессантов на импрегнированные ультрафильтры, приводящее к нарушению их барьерных свойств. Показана взаимосвязь между процессом мицеллообразования этих лекарственных веществ и их побочным токсическим действием в клинике.

6. Обнаружено, что противовирусные препараты ремантадин и амантадин способны вступать в реакции обмена с ионами Н+ на локализованных в мембране карбоксильных группах. Высказана гипотеза о возможном влиянии этих реакций на процессы инфицирования клетки вирусом.

В заключение хочу выразить искреннюю благодарность моему научному консультанту доктору химических наук, профессору Мош-ковскому Юрию Шабсаевичу за его постоянный интерес, внимание и тщательный научный анализ моей работы. Его ценные советы очень помогли мне как при выполнении экспериментальной части, так и при написании и оформлении диссертации.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Различные биологические мембраны, как правило, выполняют те или иные специфические функции. В качестве примера можно привести, в частности, фотосинтетические мембраны хлоропластов, синаптические мембраны, участвующие в проведении нервного импульса, митохондриальные мембраны, на которых происходит окислительное фосфорилирование, микросомалъные мембраны, участвующие в процессах гидрокси +2 лирования, приводящие к активного/ транспорту Са мембраны сарко-плазматического ретикулума мышц и т.д. Наиболее общей функцией, присущей всем этим и другим мембранам, является их способность разделять две водные фазы и служить барьером, проницаемым для одних и непроницаемым для других веществ.

Естественно, что изучение механизмов, благодаря которым осуществляются тонкие процессы трансмембранного транспорта и их регуляция, является основой современной биофизики мембран. Как показали наши эксперименты, во многих случаях наблюдается количественное соответствие между свойствами искусственной мембраны, представляющей собой ультрафильтр из эфиров целлюлозы, поры которого заполнены жидкими аналогами липидов, и типичными свойствами биологической мембраны. Импрегнированные ультрафильтры не только обладают значительной катион-анионной, но и катион-катионной селективностью. Подобно мембране аксона [ ?б],эти искусственные мембраны обладают более высокой проницаемостью для ионов К+, чем ifa+. В результате, создавая различные концентрации ионов К+ и ),га+ в растворах с двух сторон мембраны, можно наблюдать генерацию трансмембранного электрического потенциала, аналогичного потенциалу покоя на нервных клетках.

Специально поставленные опыты по изучению зависимости электрического сопротивления и емкости искусственной мембраны от ее толщины показали, что эти электрические характеристики определяются объемными свойствами мембраны. Этот факт позволил вычислить соответствующие удельные, т.е. не зависящие от толщины мембраны, характеристики, которые оказались близки к типичным величинам, наблюдаемым в опытах с биомембранами (глава 2).

Ранее на аксоне кальмара была изучена частотная зависимость диэлектрических характеристик его мембраны, причем оказалось, что измеряемая емкость существенно уменьшается с ростом частоты подаваемого переменного напряжения (частотная дисперсия емкости) [ 71 . Это явление удается наблюдать и в модельных экспериментах на импрегнированных аналогами липидов нитроацетатцеллюлозных ультрафильтрах.

Электрические характеристики мембран, в первую очередь, характеризуют их проницаемость для присутствующих в водных растворах ионов. Изученная с помощью тритиевой метки проницаемость модельных мембран для незаряженных молекул воды также (с учетом различий толщин) оказалась близка к наблюдаемой на биологических мембранах. Эффективную энергию активации для транспорта воды в модельных экспериментах можно было изменять от значений, характерных для би-слойных липосомальных мембран до величин, типичных для диффузии воды по водным каналам эритроцитарных мембран (глава 3).

На импрегнированных ультрафильтрах удается изучать транспорт и других неэлектролитов. Так, проведенные в нашей лаборатории Ко-чергинским Н.М. и Бромбергом Л.Ё. эксперименты показали, что импрег-нированные ультрафильтры в ряде случаев обладают существенно более высокой проницаемостью для воды и мочевины, чем для глюкозы и сахарозы. Напомним, что высокая селективность мембран типа мочевина/ глюкоза характерна для мембран эпителия почечных канальцев. Эти же авторы исследовали проницаемость импрегнированных ультрафильтров для газов. В отличие от БЛМ и липосом, ультрафильтры удается расположить на границе раздела газ/жидкость, что напоминает ситуацию, например, с мембранами стенки легкого и кожи. Проведенные эксперименты показали, что импрегнированные и-БЭЛК ультрафильтры в такой системе обладают большей проницаемостью для COg, чем для кислорода, причем значения в случае обоих газов оказались близки к величинам, измеренным в опытах с альвеолярно-капиллярными мембранами . 215] .

Анализ полученных нами результатов, а также значительного числа публикаций, посвященных изучению импрегнированных ультрафильтров, позволяет думать, что возможность проведения не только качественных, но и количественных аналогий между этими искусственными и биологическими мембранами обусловлена, прежде всего, их микрогетерогенностью. В обоих случаях,наряду с являющейся изолятором неполярной органической фазой (липиды или их аналоги), в мембранах присутствуют водные каналы с локализованными в них катионообменными группами. В результате транспорт веществ может осуществляться через различающиеся по своей полярности участки мембран. Вклад более полярных участков и, в особенности, водных каналов должен быть более существенен в случае диффузии электролитов и,по-видимому, определяет электропроводимость и селективность мембран для неорганических ионов. Достаточно гидрофобные вещества, например,жирные кислоты, в основном диффундируют через неполярные участки мембраны, и их подвижность определяется микровязкостью и структурой этих областей.

В отличие от Илани, использовавшего в своих работах различные отличающиеся полярностью органические растворители

39-46 мы пропитывали нитроацетатцеллншозные ультрафильтры жидкими аналогами липидов, т.е. веществами, имеющими полярную головку и жир-нокислотный хвост. Проведенные в нашей лаборатории эксперименты показали, что эти вещества образуют в порах ультрафильтра жидкокристаллические структуры, что было показано методами поляризационной микроскопии, спиновых зондов и %-ЯМР. Методом дифференциальной сканирующей калориметрии было показано, что импрегнирующие вещества могут переходить из гелеобразного в .жидкокристаллическое состояние. В результате подвижность жирной кислоты, ее число оборотов и другие характеристики, измеренные в модельных экспериментах, оказались близки к типичным значениям, присущим различным ионофорам в биологических мембранах (глава 4).

На рис.42 схематически отражены представления о структуре поры импрегнированного ультрафильтра. Объем поры заполнен жидкокристаллической органической фазой, возможно, имеющей гексагональную упаковку. Поверхность пор покрыта тонким слоем иммобилизованной о воды, толщина которого, как было показано в главе 3, равна 25*50А. Значительный интерес представляет также среднее расстояние между карбоксильными группами на поверхности пор. Эту величину можно оценить на основании следующих соображений. Как отмечалось в литературном обзоре, концентрация (С) примесных карбоксильных групп в -Я -А ультрафильтре равняется 10 - 10 М. Для определенности примем, что она равна 5*I0~4 М. Пористость ультрафильтра близка к 0,8. Суммарная площадь поверхности цилиидрических пор (S ) в литре ультрафильтров (для простоты считаем, что коэффициент извилистости равен I) вычисляется по формуле: с о,8-/ооо > г 6 mqq ь--~ ' где Z - радиус поры (см), a h - толщина ультрафильтра. В таком

А/ случае площадь, приходящаяся на I ионообменную группу (S )t выраженная в А , равна: дрг5окси/7бНЬ/е группы

Рис. 42. Модель поры в шдпрегнированном фильтре. Схематически показаны кидкокристаллическая структура заполняющих пору аналогов липидов, пристеночный слой воды и локализованные в нем карбоксильные группы. Реаль joe соотношение размеров не соблюдено.

S,A^.430 где IVo - число Авогадро, что соответствует расстоянию между о группами, равному примерно 20-25 А.

Отметим, что согласно современным представлениям существенными элементами структуры потенциало-зависимых ионных каналов в биологических мембранах являются 2-3 карбоксильных группы, одна из которых локализована в воротах ионного канала. Расстояние между карбоксильными группами в такой модели канала также должно быть о порядка 20-30 А [ 216 J . Косвенные эксперименты на мембране аксона показали, что плотность фиксированных зарядов на этой мембране

On равна примерно I ё/400 А , что практически совпадает с соответствующим значением, полученным на импрегнированных ультрафильтрах!^!?.

Проведенное сопоставление многих физико-химических свойств предложенной в работе модельной и различных биологических мембран позволяет думать, что в основе барьерных свойств импрегнированных ультрафильтров и природных мембран лежат общие физико-химические принципы. По-видимому, как в том, так и в другом случае основными факторами, определяющими проницаемость ионов, воды, жирных кислот и других веществ, являются, во-первых, наличие и структура неполярных жидкокристаллических областей и, во-вторых, свойства водных каналов с локализованными в них ионообменными группами. Отметим, что проведенные нами модельные эксперименты показывают, что для образования обладающего ионной селективностью водного канала не является обязательным наличие специфического белка-каналофор-мера. Такие водные каналы, в принципе, могут образовываться на различных дефектах жидкокристаллической мембранной структуры. Факторами, приводящими к каналообразованию такого типа могут быть как со су ществование при определенной температуре гелеобразной и жидкокристаллической липидных фаз в мембране [iOl], так и встраивание в

218 мембрану различных детергентов, перекисей липидов и др.

Общность физико-химических факторов, определяющих проницаемость биологических и используемых в работе искусственных мембран, делает достаточно обоснованным изучение на этой модельной системе широких классов различных мембранотропных агентов. Под этим термином мы подразумеваем вещества, изменяющие состояние мембраны в целом, а не вступающие в специфические реакции с определенными химическими компонентами биомембран, например, рецепторами.

В работе возможности применения импрегнированных лишщоподоб-ными веществами ультрафильтров для изучения механизмов действия мембранотропных соединений показаны на трех примерах, а именно, для ионофорного действия жирных кислот, детергентоподобного действия аминазина и ряда антидепрессантов, а также реакций ионного обмена и процессов генерации трансмембранного потенциала в присутствии ремантадина и других биологически активных аминов.

Простота экспериментов с импрегнированными ультрафильтрами, их низкая стоимость и технологичность в сочетании с высокой производительностью делают целесообразным их применение для проведения массовых предбиологических испытаний химических соединений на мембранотропную активность. Такие испытания позволят охарактеризовать заряд химических соединений, их гидрофобность, способность проникать в мембрану и вступать в ней в реакции ионного обмена и т.д. Совокупность физико-химических характеристик такого типа в ряде случаев может использоваться для количественных рекомендаций при направленном синтезе наиболее эффективных лекарственных соединений в рядах веществ со сходной химической структурой.

Необходимо подчеркнуть, что лишь в редких случаях можно ожидать наличия прямой связи между эффектами, наблюдаемыми в опытах с модельными мембранами и фармакологическим действием того или иного химического соединения. Ярко выраженные корреляции такого типа должны быть лишь при условии, когда имеется однозначный и простой механизм взаимосвязи между мембранотройным и фармакологическим эффектом. Такая ситуация реализуется, например, в случае антигемоли-тиков, стабилизирующих мембрану эритроцитов, поверхностно-активных веществ-антисептиков, антибиотиков-ионофоров и т.д. Модельные эксперименты и анализ клинических данных позволили нагл обнаружить корреляцию между детергентоподобным действием аминазина и ряда антидепрессантов на мембрану и их побочным токсическим действием на печень. Б более общем случае данные, полученные в модельных экспериментах, могут использоваться лишь как предпосылка для фармакологического прогноза. По-видимому, эти данные необходимо использовать в сочетании с результатами фармакологических исследований и методами классического фармакологического скрининга. Иными словами, исследования на простейших модельных системах не заменяют, а дополняют и обогащают классические фармакологические подходы.

Дальнейшее усовершенствование модели должно, по-видимому, идти по пути ее усложнения. В частности, для поиска лекарственных препаратов, взаимодействующих со специфическими компонентами биомембран, в импрегнированные фильтры можно встраивать соответствующие рецепторы, различные мембранные ферменты и т.д. Проведение экспериментов на импрегнированных ультрафильтрах в присутствии микросом печени, а также при наложении внешних электрических полей позволит сделать новый шаг на пути совершенствования предбиологических испытаний с учетом возможной биотрансформации вещества в печени и влияния на его взаимодействия с мембранами значительных трансмембранных электрических полей.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Осак, Игорь Симеонович, 1984 год

1. Beutner R. Physical chemistry of living tessues and life processes. As studied by artificial imitation of their single phases. - Baltimore; Williams and Y/ilkins, 1933, -337 p.

2. Pressman B.C. Properties of ionophores with broad range cation selectivity. Fed. Proceed., 1973, v. 32, Ж 6, p. 1698-1703.

3. Лев А.А. Моделирование ионной избирательности клеточных мембран. Л.: Наука, 1976, -210 с.

4. Никольский Б.П., Матерова Е.А. Ионоселективные электроды. -Л.: Химия, 1980, 239 с.

5. Хванг С.-Т., Каммермейер К. Мембранные процессы разделения. М.: Химия, 1981, -464 с.

6. Абрамзон А.А. Поверхностно-активные вещества: свойства и применение. Л.: Химия, Ленингр. отделен., 1975, -246 с.7» Фридрихсберг Д.А. Курс коллоидной химии. Л.: Химия, Ленингр. отделен., 1974, -351 с.

7. Bangham A.D., Standish М.М., Watkins J.С. Diffusion of univalent ions across the lamellae of swollen phospholipids.

8. J. Moleс. Biol., 1965, v. 13, N 1, p. 238-252.

9. S.zabo G., Waldbilling R.C. Lipid model membranes. Methods of experimental, physics, 1982, v. 20, N 4, p. 513-543.

10. Grant C.W.M., Mc Connell H.M. Pusion of phospholipid vesicles with viable Acholeplasma laidlawii. Proc. Hat. Acad. Sci. USA, 1973, v. 70, I 4, p. 1238-1240.

11. Cafiso D.S., Petty H.E., Me Connell Н.Ы. Preparation of unilamellar lipid vesicles at 37° G by vaporization methods. Biochim. biophys. acta, 1981, v. 649, К 1, p. 129-132.

12. Saoka P., Papahadjopoulos D. Liposomes: preparation and characteriaation. In: Liposomes : from physical structure to therapeutic applications, ed. C.G. Knight. - Elsevier/ Horth-Holland, Biomedical press, 1981, p. 51-82.

13. Mueller P., Rudin D.O., lien H.Ti., Wescott Y/.C. Reconstitu-tion of cell membrane structure in vitro and its transformation into an excitable system. Mature, 1962, v. 194, 114832, p. 979-980.

14. Овчинников Ю.А., Иванов В.Т., Шкроб A.M. Мембрано-активные комплексоны. М.:-Наука, 1974, - 463 с.

15. Мельник Е.И. Механизм катионного транспорта, индуцированного циклодепсипептидами группы валиномицина, через би-слойные липидные мембраны: Автореф. Дис. на соискание уч. степени канд. физ.-мат. наук. М.: 1972, - 23 с.

16. Markin V.S., Sokolov V.S., Boguslavsky L.I., Jaguahinsky L.S. Nigericin-induced charge transfer across membranes. -J. Memb. Biol., 1975, v. 25, N 1/2, p. 23-45.

17. Hladky S.B., Haydon D.A. Discretness of conductance change in bimolecular lipid membranes in the presence of certain antibiotics. Hature, 1970, v. 225, N 5231, p. 451-453.

18. Daniel W., Ricardo B. Modification of ion transport in lipid bilayer membranes by insecticides DDT and DDE. Biochim. biophys. acta, 1982, v. 688, N 1, p. 138-144.

19. Roy G. Properties of the conductance induced in lecithin bilayer membranes by alamethicin. J. Membr. Biol., 1975,v. 24, N 1, p. 71-85.

20. Moran A., Hani A. The effect of prymnesium toxin on the electric conductivity of thin lipid membranes. J. Merabr. Biol., 1974, v. 16, N 3, p. 237-256.

21. Wobschall D., Mc Keoon G. Step conductance increases in bi-layer membranes induced Ъу antibody-antigen-complement action. Biochim. biophys. acta, 1975, v. 413, N 2, p. 317-321.

22. Moore T.J., Schlowaky В. Glucose and galactose transport acrossa water-butanol-phospholipid interface. Chem. phys. lipids, 1969, v. 3, N 3, p. 273-279.

23. Ohki A., Hinoshita H., Takagi M., Ueno K. Transport of iron and cobalt complex ions through liquid membrane mediated by methyltrioсtylammonium ion with the aid of redox reaction.

24. Separation Sci: Technology, 1983» v. 18, N 11, p. 969-983.

25. Monnier A.M. Excitable and. ion-selective artificial membranes. XI Non-bilayer lipidic membranes. J. Membr. Sci., 1977» v. 2, N 1, p. 67-97.

26. Monnier A.M. Excitability and ionic selectivity, common properties of many lipidic derivatives. In: Membranes, dissipa-tive structure and evolution, ed. Nicolis G., Lefever R.

27. An interscience. John Wiley and Sons, N.Y., L., Sydney, Toronto, 1975, v. 29, p. 341-342.

28. Botre C., Dorst W., Marchetti M., Memoli A., Scarpelli E.M. The generation of "spikes" by lipo-collagen membranes. Bio-chim. biophys. acta, 1970, v. 219, N 2, p. 283-289.

29. Michaelis L., Weech A.A., Yamatori A. Studies on the permeability of membranes; electric transfer experiments with dried collodion membrane. J. Gen. Physiol., 1927, v. 10, N 5,p. 685-701.

30. Tobias J.M., Agin D.P., Pawlowski R. Phospholipid-cholesterol membrane model. Control of resistance by ions or current flow. J. Gen. Physiol., 1962, v. 45, H 5, p. 989-1001.

31. Ilani A. Ion discrimination by "millipore" filters saturated with organic solvents. I. Cation selectivity, mobility and relative permeability of membranes saturated with bromobenzene.- Biochim. biophys. acta, 1965» v. 94, N 2, p. 405-414.

32. Ilani A. Ion discrimination by "millipore" filters saturated with organic solvents. II. The significance of the hydrophobic medium. Biochim. biophys. acta, 1965, v. 94, N 2, p. 415-422.

33. Ilani A. Interaction between cations in hydrophobic solvent-saturated filters containing fixed negative charges. Biophys. J., 1966, v. 6, N 3, p. 329-352.

34. Ilani A. Frequency-dependent capacitance of hydrophobic membranes containing fixed negative charges. Biophys. J., 1968, v. 8, N 5, p. 556-574.

35. Shohami E., Hani A. Model hydrophobic ion exchange membrane. Biophys. J., 1973, v. 13, I 11, p. 1242-1262.

36. Янопольская Н.Д., Деборин Г.А. Исследование проницаемости модельной липидной мембраны для некоторых ферментов. Биохимия, 1978, т. 43, № I, с. I03-II0.

37. Янопольская Н.Д. Исследование проницаемости модельных липид-ных мембран для некоторых ферментов. Дис. на соискание уч. степени канд. биол. наук. М.: 1979, -165 с.

38. Иванов Б.Н. Избирательные свойства изолированных оболочек клеток Nitella flexilis и искусственных целлюлозных мембран: Автореф. Дис. на соискание уч. степени канд. биол. наук. -М.: 1971, 22 с.

39. Linke L.J. Does the cell membrane act as a cation exchange resin? In: Biophysics of membrane transport. - School Proc., Wroclow, 1979, v. 2, p. 305-306.

40. Kobatake Y., Irimajiri A., Matsumoto H. Studies of electric capacitance of membranes. 1. A model membrane composed of filter paper and lipid analogue. Biophys. J., 1970, v. 10,1. N 8, p. 728-744.

41. Yoshida M., Kobatake Y., Hashimoto M., Morita S. Studies of electric capacitance of membranes. II. Conformational change in model membranes composed of a filter paper and lipid analogue. J. Membr. Biol., 1971, v. 5, N 2, p. 185-199.

42. San&ermann Pi. Jr. Preparation of stable and solvent-free model membranes. Biochem. Biophys. Res. Gommun., 1979, v. 87,1. N 3, p. 789-794.

43. Thompson M., Lennox R.B., McClelland R.A. Structure and electrochemical properties of microfiltration filter-lipid membrane systems. Anal. Chem., 1982, v. 54, N 1, p. 76-81.

44. Ohnishi S.-I., Ito T. Clustering of lecithin molecules in phosphatidylserine membranes induced by calcium ion binding to phosphatidylserine. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1973, v. 51, N 1, p. 132-138.

45. Antonenko Y.N., Yaguzhinsky L.S. The use of phospholipid-impregnated millipore filters for recording nonelectrogenic1. Tl-f* / 4>cation flows in the presence of Me /nil exchangers. Analyt, Biochem., 1984, v. 140, N 2, p. 468-471.

46. Sugiura M., Shinbo T. Studies on preparation of artificial biomembranes. I. Ion selectivity of phospholipid membranes constructed in a porous membrane. Tokyo kogyo shikensho hokoku, J. Nat. Chem. Lab. Ind., 1976, v. 71, N 10, p. 407414.

47. Sugiura M., Shinbo T. Effect of various ionophores on ion selectivity of phospholipid membranes. Nippon nogei. kagaku kaishi, J. Agr. Chem. Soc. Japan, 1976, v. 50, N11, p. 547-553.

48. Koprivc L., Hranilovic J., Stefanac Z. Transfer of some barbituric acid derivatives across lipid barrier as model membrane. Acta Pharm. Jugoslav., 1977, v. 27, N 3, p. 147-156.

49. Kabatake Y. Physicochemical problems in excitable membranes. In: Membranes, dissipative structures and evolution,ed. Hicolis G., Lefever R. An interscience, N.Y., London, Sydney, Toronto; John Wiley and sons, 1975, v. 29, p. 319-340.

50. Skulachev V.P. Conversion of light energy into electric energy by bacteriorhodopsin. FEBS Lett., 1976, v. 64, 11, p. 2325.

51. Moran A., Tal E., Eytan E., Helson H. Study of proton pumps by phospholipid-impregnated millipore filters. FEBS Lett., 1930, v. 110, H 1, p. 62-64.

52. Drachev L.A., Kondrashin A.A., Semenov A.Yu., Skulachev V.P, Reconstitution of biological molecular generators of electric current. Transhydrogenase. Eur. J. Biochem., 1980, v. 113, IT 1, p. 213-217.

53. Drachev L.A., Kaulen A.D., Semenov A.Yu., Severina X.I., Skulachev V.P. Lipid-impregnated filters as a tool for studying the electric current-generation proteins. Analyt. Biochem., 1979, v. 96, I 1, p. 250-262.

54. Konstantinov A., Skulachev V.P., Smirnova I.A. Membrane potential generation by submitochondrial particles associated with a lipid-impregnated filter. FEBS Lett., 1980, v. 114, N 2, p. 302-306.

55. Rayfield G.W., Events in proton pumping by bacteriorhodopsin.- Biophys. J., 1983, v. 41, N 2, p. 109-117.

56. Schanne O.F., Ceretti E.R.P. Impedance measurements in biological cells. N.Y., Chichester, Brisbane, Toronto: J. Wiley and sons, 1978, -430 p.

57. A.C. № 1043564 (СССР). Модель биологической мембраны /Кочер-гинский Н.М., Мошковский Ю.Ш., Осак И.С., Пирузян JI.A. Опубл. в БИ. № 35, 1983.

58. Флойд У.Ф. Электрохимические свойства нервов и мышц. В кн.: Некоторые проблемы современной электрохимии, под ред. Бокри-са Дж.- М.: Иностранная литература, 1958, с. 322-378.

59. Корицкий Ю.В. Основы физики диэлектриков. М.: Энергия, 1979, с. 72.75» Tien H.Ti. Bilayer lipid membrane (BIM). Theory and practice.- II.Y, 5 Marcel Dekker, 1974, -655 p.

60. Катц Б. Нерв, мышца, синапс. М.: Мир, 1968, -221 с.

61. Henn Р.A., Thompson Т.Е. Synthetic lipid bilayer membranes.- Annu. Rev. Biochem., 1969, v. 38, p. 241-262.

62. Нобел П. Физиология растительной клетки. М.: Мир,1973,с.113,

63. Gridle R.C., Packer L., Shien P. Oligomycin-dependent iono-phoric protein subunit of mitochondrial adenosinetriphospha-tase. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1977, v. 74, N 10, p. 4306-4310.

64. Hani A., Taivoni D. Hydrogen ions in hydrophobic membranes.- Biochim. biophys. acta, 1968, v. 163, N 4, p. 429-438.

65. Garric R.A., Patel B.C., Chinard F.P. Erythrocyte permeability to lipophilic solutes changes with temperature. Amer. J. Physiol., 1982, v. 242, N 1, p. C74-C80.

66. Pettiplace R., Haydon D.A. Y/ater permeability of lipid membranes. Physiol. Rev., 1980, v. 60, N 2, p. 510-550. 83« Stein W.D. The movement of molecules across cell membranes.- N.Y.-London: Acad. Press., 1967, p. 73-77, 85-88, 110-111.

67. Solomon A.K. Properties of water in red cell and synthetic membranes. In: Biomembranes. Passive permeability of cell membranes, eds. Kreusser P., Manson L.A., Sieger J.P.G. -N.Y.-London: Plenum Press, 1972, v. 3, p. 299-330.

68. Фролов M.B. Структурная механика бумаги. M.: Лесная промышленность, 1982, с. 209-219.

69. Orbach Е., Pinkelstein A. The nonelectrolite permeability of planar lipid bilayer membranes. J. Gen. Physiol., 1980,v. 75, И 4, p. 427-436.

70. Orly J., Schramm M. Patty acids as modulators of membrane functions: catecholamine-activated adenylate cyclase of the turkey erythrocyte. Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 1975, v. 72, И 9, p. 3433-3437.

71. Kantor ILL., Prestegard J.H. Pusion of phosphatidylcholine bilayer vesicles: role of free fatty acid. Biochemistry, 1978, v. 17, H 17, p.3592-3597.

72. Ahkong Q.G., Pisher D., Tampion V/., Lucy J.A. The fusion of erythrocytes by fatty acids, esters,retinol and dL-tocopherol.- Biochem. J., 1973, v. 136, И 1, p. 147-155.

73. Massari S., Arslan P., Nicolussi A., Colonna R. 1. Phospholipid release from sonicated vesicles induced by a "critical" fatty acid concentration Biochim. biophys. acta, 1980, v. 599, 11, p. 110-117.

74. Lochner A., Kodae J.C., Benade A.J., Gevers W. Mitochondrial oxidative phosphorylation in low-flow hypoxia: role of free fatty acids. J. Mol. Cell, Cardial., 1978, v. 10, I'T 9,p. 857-875.

75. Johnson S.M., Robinson R. The composition and fluidity of normal and leukaemic membranes in mouse and man. Biochim. biophys. acta, 1979, v. 558, I 3, p. 282-295.

76. Скулачев В.П. Трансформация энергии в биомембранах. М.: Наука, 1972, 203 с.95» Pressman B.C., Lardy Н.А. Influence of potassium and other alkali cations on respiration of mitochondria. J. Biol. Chem., 1952, v. 197, N 2, p. 547-556.

77. Pressman B.C., Lardy II.A. Effect of surface active agents on the latent ATPase of mitochondria. Biochim. biophys. acta, 1956, v. 21, N 3, p. 458-466.

78. Lehninger A.L., Remmert L.P. An endogenous uncoupling and swelling agent in liver mitochondria and its ensymic formation. J. Biol. Chem., 1959, v. 234, N 9, p. 2459-2464.

79. Ленинджер А. Биохимия,- М.:Мир, 1976, 960 с.

80. Антонов В.Ф. Липиды и ионная проницаемость мембран. М.: Наука, 1982, - 151 с.

81. Wo^tczak L., Wlodawer Р., Zborowski J. Adenosine triphospha-te-induced contraction of rat liver mitochondria and synthesis of mitochondrial phospholipids. Biochim. biophys. acta, 1963, v. TO, N 3, p. 290-305.

82. Zborowski J., Wojtczak L. Induction of swelling of liver mitochondria by fatty acids of various chain length. Biochim, biophys. acta, 1963, v. 70, Ж 5, p. 596-593.

83. Uojtcaak L., Lehninger A.L. Formation and disappearance of an endogenous uncoupling factor during swelling and contraction of mitochondria. Biochim. biophys. acta, 1961, v. 51, N 3, p. 442-456.

84. V/ojtczak L. Effect of long-chain fatty acids and acyl-GoAon mitochondrial permeability, transport and energy-coupling processes. J. Bioenerg. Biomembr., 1976, v. 8, И 6, p. 293-311.

85. Рэкер Э. Биоэнергетические механизмы: новые взгляды. -М.: Мир, 1979, -175 с.

86. Корепанова Е.А., Антонов В.Ш., Владимиров Ю.А. Линолевая кислота как индуктор поверхностного заряда БЛМ. Биофизика, 1975, т. 20, № 4, с. 737-739.

87. Prestegard «Т.Н., Cramer J.A., Viscio D.B. Nuclear magnetic resonance determinations of permeation coefficient for maleic acid in phospholipid vesicles. Biophys. J«, 1979, v. 26, N 3, p. 575-584.

88. Racker E, Reconstitution of cytochrome oxidase vesicles and conferral of sensitivity to energy transfer inhibitors.

89. J. Membr. Biol., 1972, v. 10, N 3/4, p. 221-235.

90. Shinitaky M., Henkart P. Fluidity of cell membranes-current concepts and trends. International review of cytology, 1979, v. 60, p. 121-147.

91. Справочник химика. Т. 2. Основные свойства неорганических и органических соединений. Л., М.: Государственное научно-техническое издательство химической литературы, 1951, с. 528, 564.

92. Sillen L.G., Martell А*Е. Stability constants of metal ion complexes. London, 1964, -754 p.115* Martell A*E*, Smith R.M. Critical stability constants. -N.Y.: Plenum Press, 1975, v. 3, -495 p.

93. Камман К. Работа с ионселективными электродами. М.: Мир, 1980, -285 с.

94. Байулеску Г., Кошофрец В. Применение ион-селективных электродов в органическом анализе. М.:Мир, 1980, -232 с.

95. Sandblom J. Liquid ion- exchange membranes with weak ionized groups. 1. A theoretical study of their steady-state properties. J. Phys. Chein., 1969, v. 73, И 1, p. 249-256.

96. Корыта И., Дворжак И., Богачкова В. Электрохимия. М.: Мир, 1977, с. 302.

97. Айтьян С.Х., Маркин B.C., Чизмаджев Ю.А. Теория прохождения переменного тока через искусственные мембраны в схеме переносчика. Биофизика, 1973, т. 18, № I, с. 75-82.

98. Egret-Charlier М., Sanson A., Ptak М., Bouloussa О. Ionization of fatty acids at the lipid-water interface. FEBS Lett., 1978, v. 89, N 2, p. 313-316.

99. Kinsel J.F., Melnik E.I., Lindenbaum S., Sternson L.A., Ovchinnikov Yu.A. A model for lasolocid-mediated electrical transport of biogenic amines through lipid bilayer membranes. J, Pharmaceutics, 1982, v. 12, N 1, p. 97-106.

100. Beck J.C., Rosen B.P. Cation/proton antiport systems in Escherichia colis properties of the sodium/proton anti-porter. -Arch. Biochem. Biophys., 1979, v. 194, N 1, p. 208-214.

101. Шарышев А.А., Костава В.Т., Евтодиенко Ю.В., Ягужинский Л.С. Образование нигерицинподобного переносчика в мембранах митохондрий под действием кислот. Биофизика, 1979, т. 24, № 2, с. 339-340.

102. Маркин B.C., Чизмаджев Ю.А. Индуцированный ионный транспорт. М.: Наука, 1974, -257 с.

103. Baker R.W., Tuttle М.Е., Kelly D.J., Lonsdale H.K. Coupled transport membranes. 1. Copper separations. J. lembr. Sci,, 1977, v. 2, H 3, p. 213-233.

104. Molnar W.J., tfang С.-P., Evans D.F., Cus3ler E.L. Liquid membranes for concentrating anions using a hydroxide flux.- J. Membr. Sci., 1978, v. 4, N 1, p. 129-140.

105. Rooney E.K., East J.M., Jones O.T.,McWhirter J.,Simmonds A.C., Lee A.G. Interaction of fatty acids with lipid bi-layers. Biochim. biophys. acta, 1983, v. 728, 12, p. 159-170.

106. Pressman B.C. Ionophorous antibiotics as models for biological transport. Fed. Proc., 1968, v. 27, N 6, p. 12831288.

107. Lutz W.K., Friih P.U., Simon W. Microcalorimetric determi1. Q Q Qnation ofдН ,aG and^S for the interaction of the carrier antibiotics nigericin and monensin with sodium and potassium ions, Ilelv. chim. acta, 1971, v. 54, И 8, p. 2767-2770.

108. Bloch R. Hydromettallyrgical separations by solvent membranes. In: Membrane Science and Technology, ed. S.E.Flinn,- N.Y.: Plenum Ргезз, 1970, p. 171

109. Devaux P., McConnell H.M. Lateral diffusion in spin-labeled phosphatidylcholine multilayers. J, Amer. Chem. Soc., 1972, v. 94, N 13, p. 4475-4481.

110. Lauger P., Benz R., Stark G., Bamberg E., Jordan P.O., Fahr A., Brock W, Relaxation studies of ion transport systems in lipid bilayer membranes, Quarterly Review Biophysics, 1981, v. 14, N 4, p. 513-598.

111. Кузнецов A.H., Лившиц В.А., Маленков Г.Г., Тенчов Б.Г. Исследование физико-химических свойств лецитиновых мембран при помощи гидрофобных и гидрофильных спиновых зондов.- Мол. биолог., 1976, т. 10, №2, с. 386-394.

112. Kornberg R.D., MeConnell H.M. Inside-outside transitions of phospholipids in vesicle membranes, Biochemistry, 1971, v. 10, И 7, p. 1111-1120.

113. McLaughlin S.G.A., Dilger J.P. Transport of protons across membranes by weak acids. Physiol. .Rev., 1980, v. 60, If 3, p. 825-863.

114. Antonenko Yu.N., Yaguzhinski L.S. Generation of potential in lipid bilayer as a result of proton-transfer reaction in the unstirred layers. J. Bioenerg. and Biomembr., 1982, v. 14, N 5/6, p. 457-465.

115. Walter A., Hastings D., Gutknecht J. Weak acid permeability through lipid bilayer membranes. Role of chemical reactionsin the unstirred layer. J. Gen. Physiol., 1982, v. 79, N 5, p. 917-933.

116. Биологические мембраны. Под ред. Парсонса Д.С. М.: "Атомиздат", 1978, с. 29.

117. Hanstein W.G., Keihl R. Energy-dependent accumulation of the uncoupler picrate and proton f Xiix xn submitоchondrial particles, Biochem. Biophys. Res. Commun., 1981, v. 100, :Л 3, p. 1118-1125.

118. Кларксон Д. Транспорт ионов и структура растительной клетки. М.: Мир, 1978, с. 156.

119. Locke R.M., Rial Е., Scott I.D., JJicholls D.G. Patty acids as acute regulators of the proton conductance of hameter brown-fat mitochondria. Eur. J. Biochem., 1982, v. 129, N 2, p. 373-380.

120. Nicholls D.G., Snelling R., Rial E. Proton and calcium circuits across the mitochondrial inner membrane. Biochem. Soc. Trans., 1984, v. 12, N 3, p. 388-390.

121. Николаев Н.И. Диффузия в мембранах. М.: Химия, 1980, -232 с.

122. Голубев В.Н., Маркин B.C., Филатова Т.А. Описание диализного переноса вещества для жидкой мембраны с переносчиком. Электрохимия, 1984, т. 20, № 2, с. 199-203.

123. Folkner С.A., Hoble R.D. Transient-response of facilitated transport membranes. J. Membr. Sci., 1983, v. 12, ST 3, p. 289-301.

124. Chiarizia R., Castagnola A., Danesi P.R., Horwitz E.P. Mass transfer rate through solid supported liquid membranes: influence of carrier dimerization and feed metal concentration on membrane permeability» J. Membr. Sci., 1983, v. 14, N 1, p. 1-11.

125. Бокштейн B.C. Диффузия в металлах. М.: Металлургия, 1978, - 172 с.

126. Корн Г., Корн Т. Справочник по математике для научных работников и инженеров, издание второе. М.: Наука, 1970, с. 315.

127. Masi P., Paul D.R. Modeling gas-transport in packaging applications. J. Membr. Sci., 1982, v. 12, И 2, p. 137-151.

128. Кочергинский H.M. Дипиды как возможные переносчики протона от дыхательной цепи к АТФ-синтетазе и механизм окислительного фосфорилирования. Биофизика, 1979, т. 24, №5, с. 954-959.

129. Машковский М.Д., Андреева Н.И., Полежаева А.И. Фармакологияантидепрессантов. -М.: Медицина, 1983. чЛ, с. 14-15. 157.Janoff A.S., Mazorow D.I»., Coughlin R.T., Bowdler A.J.,

130. Hang A., McGroarty E.J. The modification of human erythrocyte membrane structure by membrane stabilizers: an ESR study. Amer. J. Hematol., 1981, v. 10, N 2, p. 171-179.

131. Seeman P., Kwant W.O. Membrane expansion of the erythrocyte by both the neutral and ionized forms of chloropomazine. -Biochim. biophys. acta, 1969, v. 183, Ж 3, p. 512-519.

132. Ahtee L., Paasonen M.K. The haemolytic effect of some phe-nothiazine derivatives. Ann. Med. exp. Fenn., 1965, v. 43. Ж 2, p. 101-105.

133. Eilam Y. Membrane effects of phenothiazines in yeasts. 1. Stimulation of calcium and potassium fluxes. Biochim. biophys. acta, 1983, v. 733, Ж 2, p. 242-248.

134. Guth P.S., Amaro J., Sellinger 0.2., Elmer L. Studies in vitro and in vivo of the effects of chloropromazine on rat liver lysosomes. Biochem. Pharmacol., 1965, v. 14, Ж 5, p. 769-775.

135. Морозова Г.И., Баренбойи Г.М., Добрецов Г.Е. Взаимодействие некоторых ксенобиотиков с живыми клетками: исследование методом флуоресцентных зондов. Хим.-фарм. журн., 1982, т. 16, №2, с. 1452-1457.

136. Мизрахи Л.М. О токсичности фенотиазиновых препаратов. -Шармакол. токсикол., 1981, т. 44, № 6, с. 724-726.

137. Chen V.K.-H*, Pant Н.С. Chloropromazine induced excitability of lipid bilayer membranes. Fed. Proc., 1974, v.33, Ж 5, p. 1387.

138. Ahmed M., Burton J.S., Hadgraft J., Kellaway I.W. Partitioning and efflux of phenothiazines from liposomes. -Biochem. Phamac., 1980, v. 29, H 17, p. 2361-2365.

139. Добрецов Г.E., Спирин М.М. Проницаемость мембран для аминазина и нонахлазина. Бюлл. эксп. биол. мед., 1980,т. 90, № д, с. 3II-3I3.

140. Seeman P., Membrane actions of unesthetics and tranquilizers. Pharmacol. Rev., 1972, v. 24, И 4, p. 583-655.

141. Ogiso Т., Iwaki M., Mori K. Fluidity of human erythrocyte membrane and effect of chlorpromazine on fluidity of membrane. .'Biochim. biophys., acta, 1981, v. 649, N 2, p. 325335.

142. Palatini Pictro. Mode of interaction of tricyclic antipsychotics with membrane ATPases. Res. Adv. Receptor Chem. Amsterdam, e.a., 1979, p. 111-126.

143. Лаврецкая Э.Ф., Татьяненко Л.В., Мошковский Ю.Ш., Райхман Л.М., Котельникова Р.В., Васюкова Н.В. О некоторых механизмах действия психотропных препаратов на транспортные АТЗ?-азы. ©армакол. токсикол., 1980, № 3, с. 292-295.

144. Щорс Е.В. Взаимодействие производных фенотиазина с алко-гольдегидрогеназой и альдегиддегидрогеназой из печени млекопитающих. Хим.-фарм. журн., 1979, № 2, с. 19-24.

145. Dhalla U.S., Lee S.L., Takeo S., Panagia V., Bhayana V. Effects of chlorpromazine and imipramine on rat heart subcellular membranes. Biochem. Pharmacol., 1980/ v. 29,1. N 4, p. 629-633.

146. Guth P.S., Spirtes M.A. The phenothiazine tranquilizers ; biochemical and biophysical actions. Inter. Review of Neurobiology, 1964, v. 7, p. 231-274.

147. Ichak K. G., Irey U.S. Hepatic injury associated with the phenothiazines. Archs. Pathol., 1972, v. 93, H 4, p. 283-304.

148. Powell W.J., Koch-V/eser J., Williams R.A. Lethal hepatic necrosis after therapy with imipramine and desipramine.- J. Amer. med. Ass., 1968, v. 206, p. 642-645*

149. Morgan D.M. Jaundice associated with amitryptiline. Br. J. Psychiat., 1969, v. 115, И 518, p. 105-106.

150. Bhise S.B., Marwadi P.R., Mathur S.S., Srivastava R.C. Liquid phenomena in chlorpromazine action. Biophysic. Chem., 1983, v. 17, N 3, p. 187-192.

151. Srivastava R.C., Jalchar P.P.S., Bhise S.B. Liquid-membrane phenomena in imipramine action. J. Colloid. Interface Sci., 1982, v. 87, И 1, p. 56-61.

152. Ahmet M., Burton J.S., Hadgraft J., Kellaway I.W. The in-terfacial transport of phenothiazine-bile salt ion- pairs.- J. Pharnw Pharmacol., 1980, v. 32, suppl., p. 66P.

153. Green A.L. Ionization constants and water solubilities of some aminoalkylphenothiazinesand related compounds. J. Pharm. Pharmacol., 1966, v. 19, N 1, p. 10-16.

154. Attwood D.A., Florence А.Т., Gillan M.N. MIcellar properties of drug3i properties of micellar aggregates of phe-nothiazines and their aqueous solutions. J. Pharm. Sci., 1974, v. 63, N 6, p. 988-993.

155. Patel R.M., JSografi G. Factors influencing the surface activity of chlorpromazine at the air-solution interface. J. Pharm. Sci., 1966, v. 55, N 12, p. 1345-1349.

156. Attwood D.A., Gibson J. Aggregation of antidepressant drugs in aqueous solution. J. Pharm. Pharmacol., 1978, v. 30,1. N 3, p. 176-180.

157. Tsao S.C., Iga T., Sugiyama Y., Hanano M. Effect of chlorpromazine on isolated rat hepatocytes. Biochem. Pharmacol., 1982, v. 31, N 4, p. 491-497.

158. Zimmerman H.J. Clinical and laboratory manifestations of hepatotoxicity. Ann. N.Y. Acad. Sci., 1963, v. 104, art. 3, p. 954-987.

159. Tavoloni N., Boyer J.L. Relationship between hepatic metabolism of chlorpromazine and cholestatic effects in the isolated perfused rat liver. J. Pharmacol. Exp. Ther., 1980, v. 214, N 2, p. 269-274.

160. Abemathy C.O., Ьикасз L., Zimmerman H.J. Adverse effects of chlorpromazine metabolites isolated hepatocytes. Proc. Soc. exp. Biol. Med., 1977, v. 154, N 4, p. 474-478.

161. Abernathy C.O., Ьикасз I»., Zimmerman H.J. Toxicity of tricyclic antidepressants to isolated rat hepatocytes. -Biochiin. Pharmacol., 1975, v. 24, N 3, p. 347-350.

162. Dukes M.N.G. In: Side effects of drugs. - Amsterdam-Oxford- Princeton: 'Experta medica, annual, 1982, v. 6; 1983, v. 7.

163. Miller M., Neuropathy, agranulocytosis and hepatotoxicity following imipramine therapy. Amer. J. Psychiat., 1963, v. 120, U 2, p. 185-186.

164. Lowe M.C. Hepatоtoxicity of pargyline hydrochloride. -Proc. West. Pharmacol. Soc., 1978, v. 21, p. 215.

165. Thornsen P., Jensen H.C., Thornsen P. Liver damage after nomifensin (Alival) Ugeskr. Laeger, 1981, v. 143, Ж 21, p. 1331-1332.

166. Cullis P.R., Verklei^ A.J., Ververgaert P.H.J.Th. Polymorphic phase behaviour of cardiolipin as detected by 31

167. Р-МШ. and freeze-fracture techniques. Effects of calcium, dibucaine and chlorpomazine. Biochim. biophys. acta, 1978, v. 513, II 1, p. 11-20.

168. Huang C.L., Ruskin B.H. Determination of serum chlorpro-mazine metabolites in psychotic patients. J. nerv. ment. Dis., 1964, v. 139, N 4, p. 381-386.

169. TJhitfield L.R. Chlorpromazine metabolism. IX. Pharmacokinetics of chlorpromaaine following oral administration in man. — J. Pharmacokinet. Biopharmaceut., 1978, v. 6, N 3, p. 187-196.

170. Ковалева H.G., Тенцова А.И., Ладыгина Г.А., Ивков Н.Н. Биофармацевтическая оценка накопления аминазина в печени и мозге крыс. Фармация, 1978, № I, с. 31-33.

171. Ковалева Н.С., Ладыгина Г.А., Тенцова А.И., Ивков Н.Н. Внутриклеточное распределение аминазина в печени крысв зависимости от способа введения, дозы и времени нахождения препарата в организме животных. Фармация, 1975, № 2, с. 30-35.

172. Кок К. Investigation into the distribution of chlorpro-mazine and 10-(3'-dimethyl-aminopropyl)-phenothiazine. -Acta Physiol. Pharmacol. Neerl., 1955, v. 4, N 3» p. 388394.

173. Yasuhara H., Matsuo H., Sakamoto K., Ueda I. Mechanism of membrane stabilizing and lytic effects of tricyclic antidepressants. Jap. J. Pharmacol., 1980, v. 30, H 3» p. 397-401.

174. Skehel J.J., Hay A.V., Armstrong J.A. On the mechanism of inhibition of influenza virus replication by amantadine hydrochloride. J. Gen. Virol., 1977, v. 38, If 1, p. 97110.

175. Калныня В.А., Фельдблюм P.JI., Индулен M.K. Устойчивость вирусов к химиопрепаратам. Рига: Зинатне, 1984, -160 с.

176. Эль-Карадаги С.Б.Н. Взаимодействие белков, липопротеидов и вирусов гриппа с мембранами. Дис. на соискание уч. степени канд. физ-мат. наук. М.: МГУ, 1982, - 148 с.

177. Симонова М.В., Черный В.В., Тулькес С.Г., Маркин B.C. Адсорбция аминопроизводных адамантана на бислойных мембранах. Влияние на распределение электрического поля. -Биолог, мембраны, 1984, т. I, № 5, с. 516-523.

178. Харитоненков И.Г., Гинсбург В.П., Климов А.И., Тихонов А.Н. Взаимодействие ремантадина с липидной мембраной чувствительных и резистентных к препарату вариантов вируса гриппа. Вопр. вирусол, 1982, т. 27, № 5, с. 564-566.

179. Воркунова Г.К., Тулькес С.Г., Букринская А.Е. Влияние ремантадина на ассоциацию белка М вируса гриппа с липосомами. Молекулярная генетика, микробиология, вирусология, 1983, т. I, № 2, с. 43-47.

180. Helenius A., Marsh М., White J. The entry of viruses into animal cells. Trends Biol. Chem. Sci., 1980, v. 5, N 1, p. 104-106.

181. Koff W.C., Knight V. Effect of rimantadine on influenza virus replication. Proc. Soc. exp. Biol. Med., 1979, v. 160, N 2, p. 246-253.

182. Lev A.A. Interaction of ionophores with model lipidmembranes. In: 16 Meeting of FEBS: Abstract. - Moscow: 1984, XV, 33, p. 95.