Изучение механизмов регуляции разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени крыс тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Марчик, Евгений Игоревич

• Марчик, Евгений Игоревич
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Марчик, Евгений Игоревич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ХЕМИОСМОТИЧЕСКАЯ ТЕОРИЯ СОПРЯЖЕНИЯ ОКИСЛЕНИЯ И СИНТЕЗА АТР В МИТОХОНДРИЯХ ДЕЙСТВИЕ РАЗОБЩИТЕЛЕЙ

ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ.

1.2. ПАССИВНАЯ УТЕЧКА ПРОТОНОВ ЧЕРЕЗ ВНУТРЕННЮЮ МЕМБРАНУ МИТОХОНДРИЙ: МЕХАНИЗМЫ, ПУТИ РЕГУЛЯЦИИ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ.

1.3. РАЗОБЩЕНИЕ ЖИРНЫМИ КИСЛОТАМИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ В МИТОХОНДРИЯХ ЖИВОТНЫХ.

1.3.1. Са2+-зависимое разобщающее действие жирных кислот.

1.3.2. Ионофорное разобщающее действие жирных кислот.

1.3.3. Протонофорное разобщающее действие жирных кислот при участии белков-переносчиков метаболитов внутренней мембраны митохондрий.

1.3.4'. Механизмы регуляции протонофорного разобщающего действия жирных кислот.

2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1. Выделение митохондрий из печени крыс.

2.2. Регистрация дыхания суспензии митохондрий.

2.3. Регистрация разности электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий (Д^Р).

2.4. Определение разобщающей активности жирных кислот.

1 2.5. Статистическая обработка результатов исследований.

2.6. Реактивы.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Исследование зависимости доли участия в разобщении АГ>Р/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров от концентрации пальмитиновой и лауриновой кислот.

3.2. Сравнение действия различных предельных жирных кислот как индукторов и регуляторов разобщения окислительного фосфорилирования при участии АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров в митохондриях печени.

3.3. Влияние неорганического фосфата и нигерицина на разобщающее действие пальмитиновой кислоты при участии АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров в митохондриях печени.

3.4. Сравнительное исследование эффектов неорганического фосфата и мерсалила на разобщающее действие пальмитиновой кислоты при участии АБР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров в митохондриях печени истощенных по эндогенным субстратам окисления.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение механизмов регуляции разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени крыс»

j i

В клетках печени от 20 до 30 % потребления кислорода митохондриями не связано с синтезом АТР и обусловлено пассивной утечкой протонов через внутреннюю мембрану (Nobes et al., 1990; Brand et al., 1994; Porter and Brand, ; 1995; Rolfe and Brand, 1997; Rolfe et al., 1999; Stuart et al., 2001; Mookerjee et al.,

I 2010). Пассивная утечка протонов может выполнять следующие функции: 1) i продукция тепла для поддержания температуры тела у теплокровных ; животных (Скулачев, 1989; Skulachev, 1998; Talbor et al., 2004; Affourtis et al.,

2007); 2) ингибирование продукции активных форм кислорода, образующихся V в митохондриях (Skulachev, 1998; Echtay, 2007; Oelkrug et al., 2010; Dietrich and

Horvath, 2010); 3) увеличение степени регулирования окислительного синтеза - (

-j ATP (Rolfe and Brand, 1997); 4) нормализация обмена веществ при ожирении

Boss et al.,. 1998; Blaikie et al., 2006;, Jastroch et al., 2010; Geisler, 2011); 5) участие в регуляции метаболизма углеводов (Rolfe and Brand, 1997; Brand et al., 2010; Heuett and Periwal, 2010). Пассивная утечка протонов в митохондриях может быть - обусловлена различными процессами, протекающими во внутренней мембране, однако наибольшее значение придается действию свободных жирных кислот, уровень которых в клетках животных и человека повышается при различных физиологических и патологических состояниях

Биленко, 1989; Lenton et al., 1995; Skulachev, 1998; Talbor et al., 2004; Di Paola and Lorusso 2006; Jastroch et al., 2010; Rodrigues et al., 2010).

Длинноцепочечные свободные жирные кислоты в зависимости от концентрации и экспериментальных условий оказывают различные эффекты на энергетические функции митохондрий (Wojtczak and Schönfeld 1993; Skulachev, 1998; Мохова и Хайлова 2005; Di Paola and Lorusso 2006). В-1 присутствии ионов, кальция жирныё кислоты способны индуцировать неспецифическую проницаемость внутренней мембраны митохондрий для гидрофильных соединений (открытие поры), которая подавляется хелатирующими агентами EGTA и EDTA, и в некоторых случаях, но не всегда, 1 5 циклоспорином А (Мохова и Хайлова 2005; Di Paola and Lorusso 2006; Belosludtsev et al., 2006; 2009). При патологических состояниях, сопровождающихся накоплением жирных кислот, такое их действие на митохондрии рассматривается как одна из причин гибели клеток по типу апоптоза и некроза (Di Paola and Lorusso 2006; Belosludtsev et al., 2006; 2009).

В отсутствие ионов кальция (в присутствии в среде инкубации EGTA) жирные кислоты в микромолярной концентрации в митохондриях животных индуцируют разобщение окислительного фосфорилирования по протонофорному механизму (Skulachev, 1998; Мохова и Хайлова 2005; Di Paola and Lorusso 2006). Важной физиологической функцией этого так называемого «мягкого» разобщения у млекопитающих является продукция тепла для поддержания' необходимой температуры тела, а также снижение в митохондриях генерации токсичных активных форм кислорода (Skulachev, 1998; Мохова и Хайлова 2005; Di Paola and Lorusso 2006; Самарцев и Кожина; 2008; Кожина и Самарцев, 2010). В митохондриях печени в протонофорном разобщающем действии жирных кислот принимают участие белки-переносчики метаболитов внутренней мембраны митохондрий: осуществляющие обменный транспорт ADP на ATP (ADP/ATP антипортер) и глутамата на аспартат (аспартат/глутаматный антипортер), а также переносчик фосфата (Skulachev, 1998; Самарцев и др., 2003; Мохова и Хайлова 2005; Di Paola and Lorusso 2006). Участием" ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров обусловлено около 70 - 80 % разобщающей активности пальмитиновой и лауриновой кислот (Самарцев и др., 1999; Мохова и Хайлова 2005). Другая часть разобщающей активности этих жирных кислот (20 - 30 %), по-видимому, осуществляется по иному механизму и обусловлена участием особой системы, чувствительной к циклоспорину А, но не связанной с циклофилином D (Самарцев и др., 2008; 2010). Участие в разобщающем действии жирных кислот ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров заключается в переносе аниона жирной кислоты с внутреннего монослоя мембраны на наружный, где эти анионы протонируются и в обратном направлении перемещаются без участия белков по механизму флип-флоп, освобождая затем протон в матрикс (ЭкиксЬеу, 1998; Мохова и Хайлова 2005). Предполагается, что в митохондриях печени переносчик фосфата участвует в разобщении только совместно или с АОР/АТР антипортером, или с аспартат/глутаматным антипортером, выполняя при этом лишь вспомогательную роль (Самарцев и др., 2003).

Если протонофорное разобщающее действие жирных кислот в митохондриях имеет важное физиологическое значение, то этот процесс должен регулироваться в широких пределах. Представляет большой интерес изучение механизмов регуляции разобщающего действия жирных кислот при участии АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров.

Известно, что степень участия^ АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров в разобщающем действии жирных кислот может существенно меняться. Показано, что при рН 7,0 в разобщении в большей степени участвует аспартат/глутаматный антипортер, а при рН 7,8 - АОР/АТР антипортер (ЗатайБеу е! а1., 1997Ь). Добавление к митохондриям гидрофобных катионов цетилтриметиламмония приводит к таким же разнонаправленным изменениям степени'участия в разобщении этих переносчиков, как и снижение рН среды инкубации с 7,8 до 7,0 (Самарцев и др., 2001). В то время как добавление к митохондриям отрицательно заряженного амфифильного соединения лаурилсульфата приводит к увеличению доли участия в разобщении АОР/АТР антипортера и соответственно к уменьшению — аспартат/глутаматного антипортера (ЗатаЛэеу а1., 2000). Для объяснения этих феноменов было предположено, что жирные кислоты в анионной форме лучше доступны для АОР/АТР антипортера, а в нейтральной форме — для аспартат/глутаматного антипортера (Самарцев и др., 2001). Однако другие данные не согласуются с этой гипотезой. Так было установлено, что степень участия этих анионных переносчиков в разобщении зависит также от длины цепи жирных кислот: при применении относительно короткоцепочечных каприновой или лауриновой кислот, в разобщении в большей степени участвует аспартат/глутаматный антипортер, чем ADP/ATP антипортер, а при применении длинноцепочечной пальмитиновой кислоты — ADP/ATP антипортер, чем аспартат/глутаматный антипортер (Самарцев и др., 1999).

Предельные жирные кислоты, имеющие различное количество атомов углерода Вг молекуле, сильно отличаются друг от друга по растворимости в липидах (Smith and Tanford, 1973; Sallee, 1974). Так, с увеличением длины, ацильной цепи всего* на два, атома- углерода коэффициент распределения липид/вода для жирных кислот возрастает в 14 раз (Smith andiTanford, 1973;: Sallee; 1974). Поэтому при одной и той же применяемой концентрации количество длинноцепочечных жирных кислот в. гидрофобной области внутренней мембраны: митохондрий: будет больше, чем короткоцепочечных. Можно предположить, что степень участия ADP/ATP- и аспартат/глутамат] юго антипортеров в разобщении будет зависеть, от количества; анионов жирных кислот в гидрофобной-: области внутренней мембраны,, а не от соотношения их анионных и нейтральных форм, как предполагалось ранее (Самарцев и др., 2001): Представляет интерес исследовать действие; жирныех кислот не только как разобщителей окислительного фосфорилирования;.но!шкак регуляторов;этого процесса.

Выше уже отмечалось, что в митохондриях печени: механизм, разобщающего- действия- жирных кислот при • участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров заключается в переносе аниона жирной кислоты, с внутреннего монослоя мембраны на наружный, где эти; анионы, протонируются; и в. обратном, направлении перемещаются без участия белков по механизму флип-флоп, освобождая затем протон в матрикс (Skulachev, 1998; Мохова и Хайлова, 2005). Следовательно, процесс разобщающего действия^ жирных кислот при участии: ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров можно рассматривать как состоящий из двух стадий: 1) зависимый от AT перенос аниона жирной кислоты, с внутреннего монослоя мембраны на наружный; 2) зависимый от АрН- перенос протонов жирными кислотами в противоположном: направлении. Из этого следует, что превращение АрН в А*Р могло бы оказывать существенное влияние на разобщающее действие жирных кислот при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров, т.е. являться одним из факторов регуляции. Известно, что превращение АрН в А*Р может быть вызвано транспортом анионов> фосфата в матрикс митохондрий совместно с протоном (Nicholls, 1974; Boss et al., 2003; Dzbek and Korzeniewski, 2008), а также с помощью КТН^-антипортера нигерицина (Скулачев, 1989; Bernard!, 1999; Selivanov et al., 2008).

Цель работы: изучение механизмов регуляции разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени крыс при участии ADP/ATP- и, аспартат/глутаматного антипортеров. Для достижения этой цели- необходимо было решить следующие задачи:

1. Выяснить, каким образом степень участия ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в- разобщающем действии пальмитиновой и лауриновой кислот в митохондриях печени зависит от концентрации этих разобщителей.

2. Сравнить действие различных предельных жирных кислот, отличающихся по растворимости в липидах, как индукторов и регуляторов разобщения окислительного фосфорилирования при участии. ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров в митохондриях печени.

3. Исследовать влияние превращения^ АрН в А^Р на внутренней мембране митохондрий печени, индуцированного неорганическим фосфатом и нигерицином, на разобщающее действие пальмитиновой кислоты при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров.

4. Сравнить эффекты неорганического фосфата на разобщающую активность жирных кислот в митохондриях печени с действием лиганда переносчика фосфата мерсалила непроникающего через внутреннюю мембрану митохондрий.

Научная новизна работы.

Впервые установлено, что свободные длинноцепочечные жирные кислоты в митохондриях печени являются не только индукторами разобщения-окислительного фосфорилирования, но и регуляторами этого процесса при участии АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров. Показано, что эффективность жирных кислот как регуляторов разобщения существенно уменьшается по мере снижения гидрофобности их молекул в ряду: пальмитиновая, миристиновая, лауриновая, каприновая и каприловая кислоты. При этих условиях эффективность тех же жирных кислот как разобщителей окислительного- фосфорилирования по5 мере снижения гидрофобности их молекул уменьшается в меньшей степени: Впервые установлено, что одним из факторов регуляции разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени при участии АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров является транспорт ионов, вызывающий* превращение ДрН>; в« А^Р' на внутренней мембранё.

Научно-практическое значение работы.1

Полученные, при выполнении* диссертации научные результаты имеют фундаментальное биологическое значение. Они расширяют и углубляют представления о механизмах регуляции функционирования митохондрий при участии свободных жирных кислот. Результаты проведенных исследований могут быть использованы в фундаментальных исследованиях в, области биохимии,-биофизики, биоэнергетики, а также в^ области экспериментальной медицины. Новые знания, полученные при выполнении диссертации, в перспективе* могут быть использованы для разработки- методов и средств управления термогенезом и гибели клеток за счет изменения пассивной4 утечки протонов-через внутреннюю мембрану и связанной с этим генерации активных форм кислорода в митохондриях.

Основные научные положения, выносимые на защиту.

1. Свободные длинноцепочечные жирные кислоты являются регуляторами индуцированного ими разобщения окислительного фосфорилирования в митохондриях печени при участии АБР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров.

2. Разобщающая активность свободных жирных кислот при участии АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров регулируется в митохондриях печени посредством транспорта ионов, вызывающего превращение АрН в на внутренней мембране.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.Г. Хемиосмотическая теория сопряженияокисления и синтеза АТР в митохондриях. Действие разобщителей окислительного-фосфорилирования.

Впервые хемиосмотическая гипотеза преобразования энергии? в митохондриях была сформулирована Петером« Митчеллом в 1961 году. Согласно ее первоначальному варианту (Mitchell j 1961), функционирование дыхательной цепи;-локализованной во внутренней мембране митохондрий, приводит к накоплению Hi но одну,, "субстратную" сторону мембраны, и образованию ObF по другую, "кислородную" ее; сторону. Субстрат, поступающий в митохондрию, окисляется; таким образом:, что два иона остаются снаружи, а пара электронов; переносится дыхательной цепью через толщу мембраны на другую, внутреннюю сторону, где они присоединяются к кислороду. В результате внутримитохондриальное пространство должно; подщелачиваться, а внешнее, - подкисляться. Таким; образом; химическая энергия, освобождающаяся < при транспорте электронов по дыхательной цепи, трансформируется в электрическую энергию; накапливаясь в форме мембранного потенциала. Затем; - согласно предположению- Митчелла; электрическая; энергия; переходит в химическую, в процессе синтеза АТР без каких-либо промежуточных стадий переноса энергии (Mitchell, 1961).

В настоящее: время хемиосмотическая гипотеза; достаточно хорошо аргументирована и признана подавляющим большинством, исследователей так, что можно говорить о хемиосмотическот теории (Mitchell, 1966; 1972; 1977а; 1977b; Mitchell and Moyle, 1967; Boyer et al., 1977; Skulachev, 1972; 1984; 1998; Скулачев, 1989; Bernard! 1999).

Основные положениям хемиосмотической теории, подтвержденные экспериментально, заключаются в следующем (Либерман и др., 1969; Liberman et al., 1969; Mitchell and Moyle, 1969; Skulachev, 1970; 1972; Grinius et al., 1970; Bakeeva et al., 1970; Jasaitis et al., 1972; Скулачев, 1989):

1. Транспорт электронов по дыхательной цепи митохондрий и (или) гидролиз АТР расположенной в мембране АТР-азой жестко сопряжен с векторным электрогенным переносом протонов и приводит к созданию трансмембранной разности электрохимических потенциалов протонов (А цН").

2. Величина АцН* состоит из электрической- (AT) и химической (АрН) составляющих, которые могут взаимно превращаться.

3. A(itT являетсяг источником энергии для синтеза АТР, а также универсальной формой энергии в клетке.

4. Мембрана является» диффузионным барьером с низкой проницаемостью для ионов, что обеспечивает сохранение AjuH4".

Основная часть энергии-, запасенной- в, форме AjiHT в интактных митохондриях, используется для-синтеза АТР, часть энергии рассеивается в виде тепла вследствие наличия пассивношутечкшпротонов.через внутреннюю мембрану (рис. 1). Пассивная утечка протонов может быть усилена с помощью химических веществ, называемых разобщителями окислительного фосфорилирования (Скулачев, 1989; Skulachev, 1998).

Как правило, наиболее мощные разобщители окислительного фосфорилирования имеют относительно простую химическую структуру и являются слабыми кислотами с константой диссоциации (рКа) их кислотной группы в пределах 5-7. Эти соединения- усиливают проводимость Н4" как на моделях фосфолипидных мембран, таких как плоские фосфолипидные мембраны и липосомы, так и через мембраны митохондрий и хлоропластов.

Эти разобщители называют протонофорами, потому что они нарушают 1 сопряжение дыхания и фосфорилирования увеличивая протонную проводимость внутренней мембраны митохондрий, рассеивая электрохимический потенциал (Skulachev et al., 1967; Hanstein, 1976; Terada, 1981; Skulachev, 1998).

Рис. 1. Образование и использование AfiH1" в митохондриях в процессе сопряженного с транспортом электронов по дыхательной цепи (ДЦ) синтеза АТР ферментом АТР синтазой и пассивной утечки протонов.

Для разобщителей этого типа, одним из немногих общих химических свойств, является наличие кислотной группы, способной обратимо связывать и отдавать протоны. Гидрофобные объёмные группы придают молекулам этим соединениям липофильность, что позволяет проникать в мембрану и оставаться там, в течение разобщающего действия. Удерживаться в заряженной мембране митохондрий разобщителям позволяет сопряжение кратных связей с ионогенной группой, что приводит к делокализации заряда в анионе и обуславливает более высокую растворимость заряженной формы в мембране (McLaughlin and Dilger, 1980; Terada, 1981).

Молекулярный механизм переноса протонов слабыми кислотами через фосфолипидный бислой постулируется, исходя из исследований на искуственных мембранных системах, таких как плоские фосфолипидные мембраны и липосомы (Маркин и др., 1969; Чизмаджев и др., 1971; Le Blanc, 1971; Neumcke and Bamberg, 1975; Cohen et al., 1977; Benz et al., 1983;

Kasianowicz et al., 1984). Существует несколько моделей описывающих этот механизм. Циклическое движение молекулы является общей чертой разобщителей типа: в протонированной форме в одном направлении, а в анионной форме противоположном. Перенос протона по градиенту ДцН4" является суммарным результатом этого процесса (Finkelstein, 1970; Le Blanc, 1971; Neumcke and Bamberg, 1975).

Наиболее простая модель соответствует оригинальной схеме Митчелла (Mitchell, 1966). В- первом варианте этой модели постулируется внутримембранная циркуляция разобщителя (по "малой карусели"). Анионная форма разобщителя Р~ на. границе раздела фаз- мембрана-раствор взаимодействует с H+ с образованием нейтральной молекулы РН. Нейтральная-молекула затем пересекает мембрану и на противоположной поверхности мембраны освобождает протон в водную фазу, Р~ затем переносится обратно электрофоретически и вновь протонируется (Маркин и др., 1969; Finkelstein, 1970). В другом варианте-этой, модели ("большая карусель") постулируется выход молекул разобщителя в водную» фазу, где и происходит процесс протонирования -депротонирования (Le Blanc, 1971; Neumce and Bamberg, 1975). Этот механизм, однако, считается- менее вероятным, чем "малая карусель" (McLaughlin and Dilger, 1980). Вторая модель отличается от первой тем, что РН играет роль переносчика для Р" образуя комплекс РН-Р , который является более подвижным в фосфолипидном бислое по сравнению с Р~ (Finkelstein, 1970; McLaughlin and Dilger, 1980).

В третьей модели постулируется, существование переносчика ионов, который переносит Р~. В этом случае перенос аниона разобщителя с одной поверхности мембраны на другую опосредуется формированием- комплекса переносчик-анион разобщителя. Реальность такой модели демонстрировалась в опытах на липосомах, где применялся валиномицин в присутствии ионов калия, при этом образовывался тройной комплекс валиномицин-К+-Р~ со стехиометрией 1:1:1 (Ahmed and Krishnamoorthy, 1990; Kamp and Hamilton, 1993). Следует сказать, что вместо валиномицина и К+ может быть применен какой-либо проникающий катион, например ТРР+ (Ahmed and Krishnamoorthy, 1990). Благодаря образованию подобного комплекса становится возможным перенос через мембрану анионов разобщителей, которые в отсутствии переносчика практически неспособны ее пересекать. Полагают, что в соответствии с этой схемой функционируют наиболее слабые разобщители-протонофоры, которые в анионной форме не способны пересекать мембрану, например, тиосалициловая кислота (Ting et al., 1970) и жирные кислоты (Kamp and Hamilton, 1993).

Существование в митохондриях белков, связывающих разобщители, было обнаружено в 1974 году Ханстейном и Хатефи в экспериментах с водорастворимым разобщителем1 2-азидо-4-нитрофенолом, который можно1 рассматривать как аналог ДНФ. Это вещество фотоаффинно метит несколько белков в митохондриях, при этом основное включение метки было в белки молекулярной массой 56 кДа и 30 кДа (Hanstein and Hatefi, 1974): Было предположено, что 56 кДа белок является одной из субъединиц фактора Fi АТР-азы (Hanstein, 1976): По мнению В:П. Скулачева, 30 кДа белок может рассматриваться как ADP/ATP' антипортер, который принимает участие в разобщающем'действии ДНФ (Skulachev, 1998).

Среди природных разобщителей окислительного фосфорилирования большой интерес представляют свободные жирные кислоты (Скулачев, 1989; Skulachev, 1998; Самарцев, 2000; Мохова и Хайлова, 2005).

Как уже отмечалось выше электрическая (AT) и химическая (АрН) части AjiH1" могут переходить друг в друга. Хорошо известно, что анионы фосфата, транспортируясь в матрикс энергизованных митохондрий совместно с протоном, вызывают превращение АрН в AY на внутренней мембране без изменения разности электрохимических потенциалов ионов водорода (Nicholls, 1974; Boss et al., 2003; Dzbek and Korzeniewski, 2008). Превращение АрН в AT на внутренней мембране может быть также вызван с помощью К+/Н+-антипортера нигерицина (Скулачев, 1989; ВегпагсН, 1999; БеНуапоу ег а1., 2008).

На рис. 2 приведена схема, объясняющая превращение ДрН в ДЧ* на внутренней мембране в процессе транспорта ионов фосфата и в процессе индукции обменного транспорта ионов калия на ионы водорода с помощью нигерицина. Отрицательно заряженные анионы фосфата с помощью переносчика фосфата переносятся из межмембранного пространства в матрикс митохондрий вместе с положительно заряженным ионом водорода. В результате этого в межмембранном пространстве заряд увеличивается количество положительных зарядов, в то время как количество ионов водорода уменьшается. Нигерицин переносит из матрикса в межмембранное пространство ионы калия в обмен на ионы водорода, и в этом случае в межмембранном пространстве заряд становится более положительным, а количество ионов водорода уменьшается.

Межмембранное м пространство

Рис. 2. Превращение ДрН в Д¥ на внутренней мембране митохондрий в процессе транспорта ионов фосфата (РГ) с помощью переносчика фосфата и в процессе индукции обменного транспорта ионов калия на ионы водорода с помощью нигерицина (Ниг).

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Марчик, Евгений Игоревич

выводы

1. В митохондриях печени под влиянием повышения концентрации пальмитиновой и лауриновой кислот увеличивается доля участия в разобщении ADP/ATP антипортера и в той же мере уменьшается доля участия в разобщении аспартат/глутаматного антипортера. Эти данные свидетельствуют о том, что свободные длинноцепочечные жирные кислоты в митохондриях печени являются регуляторами индуцированного ими разобщения при участии вышеназванных переносчиков.

2. Коэффициент эффективности жирных кислот, применяемый для количественной характеристики действия, жирных кислот как регуляторов разобщения в митохондриях печени, уменьшатся^ по- мере снижения гидрофобности молекул в ряду: пальмитиновая, миристиновая, лауриновая, каприновая и лаприловая кислоты. Эффективность этих же жирных кислот как индукторов разобщения по мере снижения« гидрофобности молекул уменьшается в меньшей степени.

3. В митохондриях печени индуцируемое неорганическим фосфатом или нигерицином превращение АрН в A Y на внутренней мембране приводит к ингибированию разобщающей активности, пальмитиновой кислоты при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров. Следовательно, одним из факторов регуляции разобщающего действия жирных кислот при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров является транспорт ионов вызывающий превращение АрН в АЧ'на внутренней мембране.

4. В митохондриях печени, истощенных по эндогенным субстратам окисления, неорганический фосфат более эффективно, чем мерсалил ингибирует разобщающую активность пальмитиновой кислоты при- участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров. При этих условиях карбоксиатрактилат и аспартат будучи добавленные к митохондриям по отдельности в присутствии неорганического фосфата или мерсалила не подавляют разобщающее действие пальмитиновой кислоты.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что в митохондриях печени при повышении концентрации пальмитиновой кислоты с 15 до 35 мкМ увеличивается степень участия в разобщении А1ЭР/АТР- антипортера и соответственно уменьшается — аспартат/глутаматного антипортера. Равные по величине данные получены двумя независимыми методами оценки разобщающей активности жирных кислот — по величине стимуляции дыхания-и по величине снижения разности электрических потенциалов на внутренней мембране митохондрий (ДЧ*). Во всех других экспериментах разобщающее действие жирных кислот оценивалось по величине стимуляции дыхания-митохондрий.

Установлено, что зависимость разобщающей-активности пальмитиновой кислоты от ее концентрации в пределах от 0 до 35 мкМ! близка к линейной. Зависимость разобщающей активности лауриновой кислоты от ее концентрации в пределах от 0 до бО мкМ также близка к линейной. Показано, что имеет место линейная зависимость величины составляющей разобщающей активности, чувствительной к карбоксиатрактилату и глутамату, от концентрации пальмитиновой и лауриновой кислот. Основываясь на этом, разработан новый метод определения разобщающей активности эндогенных жирных кислот в митохондриях печени. Концентрация эндогенных жирных кислот была выражена как концентрация' пальмитиновой или лауриновой кислот. Установлено, что значения этих величин можно вычислить путем деления величины разобщающей активности эндогенных жирных кислот на тангенс угла наклона экспериментально полученных прямых. Для корректного определения ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и глутамата при всех концентрациях жирных кислот к значениям величины разобщающей активности необходимо прибавить значение разобщающей активности эндогенных жирных кислот.

Показано, что при увеличении концентрации пальмитиновой кислоты ресопрягающий эффект карбоксиатрактилата повышается, а ресопрягающий эффект глутамата на ту же величину снижается без изменения суммарного ресопрягающего эффекта этих агентов. Аналогичные данные были получены при замене пальмитиновой кислоты лауриновой. Следовательно, при увеличении концентрации пальмитиновой или лауриновой кислот увеличивается степень участия в разобщении АОР/АТР-антипортера и в той же степени уменьшается степень участия: в разобщении аспартат/глутаматного антипортера. В то время как степень участия? в разобщении нечувствительной к карбоксиатрактилату и глутамату структуры (или структур) не зависит от концентрации' жирных: кислот. Эти данные свидетельствуют о том; что: жирные; кислоты, являются; не:, только индукторами разобщения окислительного5 фосфорилирования, но и регуляторами, этого процесса при участии АОР/АТР- и аспартат/глутаматного антипортеров;

Эффективность жирных кислот как регуляторов разобщения существенно уменьшается по мере снижения гидрофобности их молекул в ряду: пальмитиновая, миристиновая, лауриновая, каприновая и каприловая. кислоты. Предполагается* что молекулы: различных: жирных кислот, находясь, в гидрофобной области мембраны, одинаково1 эффективны, как- регуляторы, разобщения. При этих условиях различие в регуляторных эффектах связано только с. лучшей растворимостью* в липидах более гидрофобных жирных, кислот по сравнению с менее гидрофобными. Эффективность, жирных кислот как разобщителей окислительного фосфорилирования также уменьшается по мере снижения гидрофобности их молекул. Однако в; этом случае исключение составляет миристиновая кислота; разобщающая активность которой не ниже разобщающей активности более гидрофобной пальмитиновой кислоты.

Проведенные расчеты позволили предположить, что находящиеся в гидрофобной области внутренней мембраны молекулы жирных кислот в зависимости от их размера обладают разной разобщающей активностью. Наиболее высокая разобщающая активность выявлена у самой короткоцепочечной каприловой кислоты. По мере увеличения длины ацильной цепи разобщающая активность жирных кислот экспоненциально уменьшается. Хорошо известно, что разобщающее действие жирных кислот связано с их перемещением с одного монослоя внутренней мембраны на другой (Skulachev, 1998; Мохова и Хайлова, 2005). Короткоцепочечные жирные кислоты по сравнению с длинноцепочечными обладают более высокой подвижностью в гидрофобной области мембраны (Hamilton, 1998). Следовательно,,при одном и том же количестве молекул в гидрофобной области мембраны разобщающая активность короткоцепочечных жирных кислот выше, чем длинноцепочечных.

Установлено, что добавление к митохондриям печени неорганического фосфата или нигерицина вызывает существенное ингибирование разобщающей активности пальмитиновой' кислоты при" участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров; Известно, что анионы фосфата, транспортируясь. в матрикс* энергизованных митохондрий совместно с протоном, вызывают превращение ДрН в, на внутренней мембране без изменения' разности электрохимических потенциалов ионов водорода (Nicholls, 1974; Boss et al., 2003; Dzbek and Korzeniewski, 2008). Превращение ДрН в АЧ* на внутренней мембране может быть также вызвано путем индукции транспорта ионов калия из матрикса в межмембранное пространство в обмен на транспорт протонов в противоположном направлении с помощью К+/Н+-антипортера нигерицина (Скулачев, 1989; Bernardi, 1999; Selivanov et al., 2008). Следовательно, полученные данные можно рассматривать как свидетельство того, что одним из факторов регуляции разобщающего действия жирных кислот при участии ADP/ATP- и аспартат/глутаматного антипортеров является транспорт ионов вызывающий превращение АрН в Д^Р на внутренней мембране: '

Проведенные исследования показали, что в митохондриях печени, истощенных по субстратам окисления, под влиянием неорганического фосфата и мерсалила происходят характерные изменения ресопрягающих эффектов карбоксиатрактилата и аспартата: эти реагенты, при добавлении по отдельности после жирной кислоты, не подавляют ее разобщающее действие и эффективны только при их совместном добавлении. Эти данные рассматриваются как свидетельство того, что в процессе разобщающего действия жирных кислот в формировании функциональной связи между АБР/АТР- и аспартат/глутаматным антипортерами принимает участие переносчик фосфата. Предполагается, что в присутствии неорганического фосфата или мерсалила переносчик фосфата содействует латеральному перемещению молекул жирных кислот от одного антипортера к другому.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Марчик, Евгений Игоревич, 2011 год

1. Белослудцев К.Н. Возможный механизм образования и регуляции пальмитат-индуцированной циклоспорин- А-нечувствительной митохондриальной поры. / Белослудцев К.Н.,. Белослудцева Н.В:, Миронова Т.Д. // Биохимия 2005.-Т. 70, вып. 7. - С.987-994.еу í

2. Белослудцев К.Н. Роль митохондриальной^ пальмитат/Са -активируемойi поры- в пальмитат-индуцированном апоптозе. / Белослудцев: К.Н; Белослудцева Н.В., Миронова. Г.Д: // Биофизика;,— 2008; — Т. 53, вып. 6. -С.967-971.

3. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов (молекулярные механизмы, пути предупреждения и лечения). / Биленко-М.В//Москва, Медицина. 1989; 368 с.

4. Бодрова'; М.Э. Участие ADP/ATP антипортера? в разобщающем' действии: жирных кислот в. митохондриях печени.:. / Бодрова? М.Э. Маркова 0:B¿, Мохова Б.Ж, Самарцев В.Н. // Биохимия; 1995; - Т.60, вып. 8; - С. 1349.1357;,, .

5. Теннис Р. Биомембраны: Молекулярная структура и функции; / Теннис Р: -Москва, Мир. 1997.' 624 с.

6. Досон Р: Справочник биохимика: Пер. с англ. / Досон Р., Эллиот Д;, Эллиот У., Джонс К. // Москва, Мир, 1991. 544 с.

7. Емельянова; Л.В. Участие АДФ/АТФ- и аспартат/глутаматного антипортера в разобщающем действии жирных кислот в митохондриях печени, лягушки Rana temporaria. / Емельянова- Л.В., Самарцев В.Н.,

8. Савина М.В., Брайловская И.В. // Ж. эволюц. биохим. и физиол. 2003, Т. 39, вып. 6, С.525 — 530.

9. Западнюк И.П. Лабораторные животные. Разведение, содержание и использование в эксперименте. / Западнюк И.П., Западнюк В.И., Захария Е.А., Западнюк Б.В.// Вища школа, Киев, 1983.

10. Кожина О.В: Особенности разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени при- окислительном стрессе / Кожина О.В., Степанова JI.A., Самарцев В.Н. // Биол. мембр. 2007. - Т.24, № 5. - С.421 -429.

11. Либерман Е.А. Транспорт ионов и электрический потенциал митохондриальных мембран. / Либерман Е.А., ТопальъВ.П., Цофина Л.М., Ясайтис A.A., Скулачев В.П. //Биохимия. 1969. - Т.34. С. 1083 - 1087.

12. Мохова E.H. Участие анионных переносчиков внутренней мембраны митохондрий в разобщающем действии жирных кислот. / Мохова Е.Н, Хайлова Л.С. // Биохимия. 2005. - Т.70. - С. 197 - 202.

13. Ноздрачев А.Д. Начала физиологии: учебник для вузов. 2-е изд., испр. / Ноздрачев А.Д., Баженов Ю.И., Баранников И.А., Батуев A.C. и др. // СПб. Лань, 2002. 1088 с.

14. Самарцев В.Н. Влияние цистеинсульфината на разобщающее действие жирных кислот: модуляция ресопрягающих эффектов субстратов аспартат-глутаматного антипортера и диэтилпирокарбоната. / Самарцев

15. B.Н., Мохова E.H. // Биохимия. 1997. - Т.62, С.581-587.

16. Самарцев- В'.Н. Жирные кислоты как разобщители окислительного* фосфорилирования. / Самарцев В.Н. // Биохимия. — 2000: Т.65. - С. 11731189:

17. Самарцев В.Н. Влияние этанола на разобщение пальмитиновой кислотой окислительного фосфорилирования в митохондриях печени / Самарцев В!Н1., Белослудцев К.Н., Чезганова С.А., Зелди И.П. // Биохимия. 2002. -Т.67. С.1502-1510.

18. Самарцев В.Н. Температурная зависимость дыхания митохондрий печени крыс при разобщении окислительного фосфорилирования жирными кислотами. Влияние неорганического фосфата. / Самарцев В.Н. Чезганова

19. C.А., Полищук Л.С., Пайдыганов А.П., Видякина О.В., Зелди И.П. // Биохимия. 2003. - Т.68. - вып. 6. - С.1137-1143.

20. Самарцев В.Н. Изучение разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени при различных pH среды инкубации. / Самарцев

21. В;Н., Пайдыганов А.П., Полищук Л.С., Зелди И.П. // Биол. мембр. 2004а. -Т.21. - вып. 1 -С.39-45.

22. Самарцев В;Н. Особенности разобщающего действия жирных кислот в митохондриях печени млекопитающих с различной массой тела. / СамарцевВШ. Полищук Л;С., Пайдыганов АЛ;, Зёлди И:П: //Биохимия; -20046. Т.69. - вып. 6. - 0.832-842.

23. Самарцев В.Н. Циклоспорин А ингибирует протонофорную разобщающую активность лаурата в митохондриях печени. / Самарцев

24. B.Н., Кожина О.В., Рыбакова Р. // Биол. мембр: 2008; - Т.25; - выш 3^1. C.191-195. •

25. Самарцев В.Н. Зависимость разобщающей активности пальмитата в митохондриях печени от массы тела крыс различного возраста / Самарцев

26. В.Н., Кожина O.B., Рыбакова С.Р. // Ж. эвол. биохим. физиол. 2010. Т.46. - № 2. - С.164-166.

27. Скулачев В.П. Энергетика биологических мембран. / Скулачев В.П. // Москва, Наука, 1989. 564 с.

28. Ульмер Х.-Ф., Брюк К., Эве К., Карбах У и др. Физиология человека. В 3-х Т.ах. Т. 3. Пер. с англ./ Под ред. Р. Шмидта и Г. Тевса. / Ульмер Х.-Ф., Брюк К., Эве К., Карбах У и др. // Москва, Мир, 1996: 198 с.

29. Уэбб JI. Ингибиторы ферментов и метаболизма / Уэбб JI. — Москва, Мир, 1966.-862 с.

30. Чизмаджев Ю.А. Эстафетный перенос ионов через мембрану./ Чизмаджев Ю.А., МаркишВ.е., Куклин Р.Н.// Биофизика. 1971. Т.16. С.230 - 238.

31. Шольц К.Ф., Захарова* Т.О. Действие нормальных предельных жирных кислот на митохондрии печени крыс. / Шольц К.Ф., Захарова Т.С. // Биохимия. 1977. Т.42. - С.809 - 814.

32. Affourtit С., Crichton P.G., Parker N., BrandM.D: Novel uncoupling proteins. / Affourtit C., Crichton P.G., Parker N:, Brand M.D: // Novartis Found Symp.-2007. Vol.287. P.70-91.

33. Aguirre E. GDP and cardoxyatractylate inhibit 4- hydroxynonenal- activated protons conductance to differing degrees in-mitochondria from skeletal muscle and heart. / Aguirre E, Cadenas S. // Biochim. Biophys. Acta 2010. - Vol. 1797, - P.1716-1726.

34. Ahmed I. Enhancement of transmembrane proton conductivity of protonophores by membrane-permeant cations. / Ahmed I., Krishnamoorthy G. // Biochim. Biophys. Acta 1990; - Vol.1024. - P.298 - 306.

35. Aquila Hi Solute carriers; involved; in energy transfer of mitochondria form a homologous protein family. / Aquila H., Link T.A., Klingenberg M. // FEBS Lett.- 1987. Vol.212. - P.l-9.

36. Azzu V. High* membrane potential promotes alkenal- induced mitochondrial uncoupling« andiinfluences adenine nucleotide translocase conformation. / Azzu V., Parker N., Brand M.D.//Biochem: Ji 2008. -Vol.413. - P.323-332.

37. Belosludtsev K.N. Palmitic acid induces the opening of a Ca2+ dependent pore in- erythrocyte lysis. / Belosludtsev K.N., Trudovisnikov A.S., Belosludtseva N.V, Agafonov A.V., Mironova G.D. // J. Memdr. Biol.- 2010. - Vol.237. -P.13-19.

38. Benz R. The molecular mechanisms of action of the proton ionophore FGCP (carbonylcyanide p-triflurometoxy phenylhydrozone). / Benz R., McLaughlin S. //Biophys. J. 1983. - Vol.41-. - P.381 - 398.

39. Bernardi P: Mitochondrial transport of cations: channels, exchengers, and permeability transition. / Bernardi P. // Physiol'. Rev. — 1999. — Vol;79. -P.sl 127-1155.

40. Bezaire V. Uncoupling protein -3 clues in an ongoing mitochondrial mystery. / Bezaire V., Seifer E.L., Harper M.E. // FASEB J. 2007. - Vol.21. - P.312-324.

41. Bisaccia F. Specific elution from hydroxylapatite of the mitochondrial phosphate carrier by cardiolipin. / Bisaccia F., Palmieri F. // Biochim. Biophys. Acta 1984. - Vol.766. - P.386 - 394.

42. Boss O. Tissue-dependent upregulation of rat uncoupling protein-2 expression in response to fasting or cold. / Boss O., Samec S., Dulloo A., Seydoux J., Muzzin P. and Giacobino J.P. // FEBS Lett.- 1997b. Vol.412. - P.l 11-114.

43. Boss O. The uncoupling proteins, a review. / Boss O., Muzzin PI, Giacobino J.P: // Eur. J. Endocrin. 1998. - Vol. 139: - P. 1-9.

44. Boss S: Metabolic network control3 of oxidative phosphorylation: multiple roles of inorganic phosphate. / Boss S., French S., Evans F.J"., Jouberrt F., Balaban R.S. //J. Biol. Chem: -2003. Vol.278'. - P.39155-39165.

45. Boyer P.D. Oxidative phosphorylation and photophosphorylation. / Boyer P.D., Chance B., Ernster L., Mitchel P., Racker E., and Slater E. // Ann. Rev. Biochem. 1977. - Vol.46: - P.955 - 1026.

46. Bouillaud F. Homologues of the uncoupling protein from brown adipose tissue (UCP1): UCP2, UCP3, BMCP1 and UGP4. / Bouillaud F., Couplan E., Pecqueur C., Ricquier D. // Biochim. Biophys. Acta 2001. - Vol.1504. - P: 107-119:

47. Brand M.D. Evolution of energy metabolism: proton permeability of the inner membrane of liver mitochondria is greater in a mammals than in a reptile. / Brand M.D:, Coutere P., Else P.L., Wither K.W., Hulbert A.J. // Biochem. J. -1991.-Vol.275.-P.81-86.

48. Brand A. Retailoring docosahexaenoic acid-containing phospholipid species during impaired neurogenesis following omega-3 alpha-linolenic acid deprivation: / Brand A, Crawford MA, Yavin E. // J. Neurochem. 2010. -Vol.114.-P. 1393-404.

49. Brown G.C. On the nature of the mitochondrial proton leak. / Brown G.C., Brand M.D. II Biochim. Biophys. Acta 1991. - Vol.1059. - № 1. - P.55 - 62.

50. Brustovetsky N. The:reconstituted1: ADP/ATP"carrier can- mediate:Ht transport by free fatty acids, which is further stimulated" by mersalyl. / Brustovetsky N., KlingenbergM.//J. Biol. Chem:-19941-Vol.269:-P127329--27336; .

51. Cannon B. Uncoupling proteins: a role in protection against reactive oxygen species or not? / Gannon B., Shabalina I.G., Kramarova T.V., Petrovic N., Nedergaard J. // Biochim. Biophys. Acta - 2006. - Vol.1757. - P.449-459;

52. Chavez E. Carboxyatractyloside increases the effect: of oleate on mitochondrial permeability transition./ Chavez E., Zazueta G., Garcia N. // FEBS Lett -1999:, -Vol.445.-P. 189- 191.

53. Claypool SM. Cardiolipin, a critical determinant of mitochondrial carrier assembly and function. / Claypool SM. // Biochim: Biophys. Acta 2009: -Vol.1788.-P.2059-2068.

54. Cohen F.G. The; kinetic mechanism of action of, an uncoupler of oxidative phosphorylation:. / GohemF.G., Eisenberg Mi, andiMcLaughiinS; // J. Membr.

55. Biol.-1977.- Vol.37.-P.361 396.

56. Del Arco A. Molecular cloning, of Aralar, a new member of the mitochondrial carrier superfamily that binds calcium and is present in human muscle and: brain: / Del Arco A., Satrustegui J: II J. Biol. Ghem. 1998. - Vol.273. -P.23327-23334.

57. Del Arco A. Expression of the aspartate/glutamate mitochondrial carriers aralarl and citrin during development and in adult rat tissues. / Del Arco A.,

58. Morcillo J., Martinez-Morales J.R., Galian C., Martos V., Bovolenta P., Satrustegui J. // Eur. J. Biochem. 2002. - Vol.269. -P.3313-3320.

59. DePinto V. Purification of the active mitochondrial phosphate carrier by affinity chromatography with an organomercurial agarose column. / DePinto V.j Tommasino M., Palmieri F., Kadenbach B. // FEBS Lett. 1982. - Vol.148. -P.103 - 106.

60. Duszynski L Micrócompartmentationí of aspartate: in rat liver mitochondria. / Duszynski J;,.Mueller G., LaNoue K. // J. Biol. Chem. 1978, - Vol.253. -P.6149 - 6157. ;

61. Dzbek J. Control over the contribution of the mitochondrial membrane potential (AVF) and proton1 gradient (ApH)- to the protonmotive force (Ap). Iii silico studies. / Dzbek J., Korzeniewski B. // J. Biol. Chem. 2008. - Vol.283. - P. 33232-33239; • ' :

62. Echtay K.S; Mitochondrial uncopling proteins- what is their physiological role? / Echtay K.S; // Free Radie. BioLMed. 2007; - Vol.43; - P. 1351-1371

63. Ferreira G.C. Phosphate transport in mitochondria: past accomplishments, present problems, and future challenges. / Ferreira G.C., Pedersen P.L. // J. Bioenerg. Biomembr. 1993. - Vol.25. - P.483-492.

64. Finkelstein A. Weak-acid uncouplers of oxidative phosphorylation. Mechanism of action on thin lipid membrane. / Finkelstein A. // Biochim. Biophys. Acta — 1970.-Vol.205.-P. 1-6.

65. Fonio A. SH-group reagents as tool in the study of mitochondrial anion transport. / Fonio A.// J. Bioenerg. Biomembr. 1978. - Vol.10. - P.171-194.

66. Galat A. Peptidyleproline cis-trans-isomerases-immunophilins. / Galat A. // Eur. J. Biochem. 1993: - Vol.216. -P.689-707.

67. Garlid K.D. The mitochondrial potassium cycle. / Garlid K.D., Paucek P. // IUBMB Life. 2001. - Vol.52. - P.153 - 158.

68. Geisler J.G. Targeting energy expenditure via fuel switching and beyond./ Geisler J.G. // Diabetalogia. 2011. - Vol.54. - P.237-244.

69. Gimeno R.E. Cloning and characterization of an uncoupling protein homolog: a potential molecular mediator of human thermogenesis. / Gimeno R.E., Dembski

70. M., Weng X., Deng N., Shyjan A.W., Gimeno C.J., Iris F., Ellis SJ., Woolf E.A. Tartaglia L.A. // Diabetes. 1997. - Vol.46. - P.900-906.

71. Girotti A.W. Lipid hydroperoxide generation, turnover, and effector action in biological systems. / Girotti A.W. // J. Lipid Res. 1998. - Vol.39, P.1529-1542.

72. Halestrap A. Elucidating the molecular mechanism of the permeability transition pore and its role in repefusion injury of the heart; / Halestrap A., Kerr P., Javadov S., Woodfield K. // Biochim: Biophys. Acta 1998. - Vol.1366. -P.79-94.

73. Halestrap A. The permeability transition pore complex: another view. / Halestrap A., McStay G., Clarke S. // Biochimie. 2002. - Vol.84. - P. 153-166.

74. Halestrap A. Mitochondrial permeability transition pore opening during myocardial reperfusion a target for cardioprotection. / Halestrap A., Clarke S., Javadov S. // Cardiovasc. Res. - 2004. - Vol.61. - P.372-385.

75. Hamilton J.A. Fatty acid transport: difficult or easy? / Hamilton J.A. // J. Lipid. Res. 1998. - Vol.39. - P.467 - 481.

76. Hanstein W.G. Characterization and localization of mitochondrial uncoupler binding sites with uncoupler capable of photoaffinity labeling. / Hanstein W.G., Hatefi Y. // J. Biol. Chem. 1974. - Vol.249. - P. 1356 - 1362.

77. Hanstein-W.G. Uncoupling* of oxidative phosphorylation. / Hanstein W.G. // Biochim. Biophys. Acta 1976: - Vol.456. - P. 129 - 148.

78. Harper J.A. Artifactual, uncoupling by uncoupling protein 3 in* yeast mitochondria at the concentrations found in mouse and rat skeletal-muscle1 mitochondria. / Harper J:A., Stuart J:A., Jekabsons M.B'. // Biochem- Ji. 2002. - Vol:361. - P.49-56.

79. Harper M.E., Thyroid hormone effects on mitochondrial energetics / Harper M'.E., Seifert E.L. // Thyroid. 2008. - Vol.18. - P.145-156'

80. Herlein J:A. Superoxide and respiratory coupling in mitochondria-of insulin-deficient diabetic rats. / Herlein J.A., Fink B.D., O Malley Y, Sivitz W.I. // Endocrinology 2009: - Vol.150. - P.46-55.

81. Heuett W.J. Autoregulation of free radicals via uncoupling protein'control in pancreatic beta-cell' mitochondria. / Heuett W.J., Periwal V. // Biophys. J; -2010.- Vol.98. -P.207-217.

82. Hunter D. The Ca -induced membrane transition in mitochondria. I. The protective mechanisms. / Hunter D., Haworth R. // Arch. Biochem. Biophys. — 1979.-Yol.195.-P. 453-459.

83. Jastroch M. Mitochondrial proton and electron leaks. / Jastroch M, Divakaruni A.S, Moonkerjee S, Treberg J.R, Brand M.D-// Essays Biochem. 2010. -Vol.47. - p: 53-67.

84. Jezek P. Mitochondrial uncoupling proteins facts and, fantasies. / Jezek P., Zackova M., Ruzicka M., Skobisova E., Jaburek M. // Physiol. Res. — 2004. -Vol.53.-P.199-211.

85. Kamp F. Movement of fatty acids, fatty acid analogues, and bile acids across phospholipid bilayers. / Kamp F.,- Hamilton J.A. // Biochemistry 1993. -Vol.32.-P.11074- 11086.

86. Kasianowicz J. The kinetic mechanism by which CCCP (carbonyl cyanide m-chlorophenilhydrazone) transports protons across membrane. / Kasianowicz J., Benz R., McLaughlin S. // J. Membr. Biol. 1984. - Vol.82. - P.179 - 190.

87. Kim-Han J.S; Mitochondrial uncoupling proteins in the central nervouse system. / Kim-Han J.S., Dugan L.L. // Antioxid. Redox. Signal. 2005. -Vol.7.-P.l 173-1181.

88. Klingenberg M. Structure and function of the uncoupling protein from brown' adipose tissue / Klingenberg, M., Huang S.G. // Biochim. Biophys. Acta — 1999.-Vol.1415. -P.271-296.

89. Krämer R. Reconstitution of adenine nucleotide transport with purified ADP, ATP-carrier protein. / Krämer R. Klingenberg M. // FEBS Lett. 1977. -Vol.82. - P.363-367.

90. Krämer R. Mitochondrial carrier proteins can reversibly change their transport mode: the cases of the aspartate/glutamate and the phosphate carrier. / Krämer R. // Exp. Physiol. 1998. - Vol.83. - P.259-265.

91. Kroemer G. Mitochondrial membrane permeabilization in cell death. / Kroemer

92. G., Galluzzi L., BrennenC. // Physiol. Rev. 2007. - Vol.87. - P.99-163.

93. Kwok K.H. Mitochondrial UCP 5 is neuroprotective by preserving mitochondrial membrane potential, ATP levels, and reducing oxidative stress in MPP+ and dopamine toxicity. / Kwok K.Hi, Ho P:W., Chu A.C., Ho J.W., Liu

94. H.F., Yiu D.C., Ghan K.H., Kung M.H., Ramsded D.B., Ho S.L. // Free Radic. Biol. Med. 2010. - Vol.49. - P.1023-1035.

95. LaNoue K.F. Metabolite transport in mitochondria. / LaNoue K.F. and Schoolwerth A.C. // Ann. Rev. Biochem. 1979. - Vol.48. - P.871-922.

96. LaNoue K.F. Metabolite transport in mammalian'mitochondria. / LaNoue K.F., Schoolwerth A.C. // Bioenergetics 1984. - P.221 - 268.

97. Le Blanc O.H. The effect of uncouplers of oxidative phosphorylation on lipid bilayer membrane: carbonil cyanide m-chlorophenylhyd-razone. / Le Blanc O.H. // J. Membr. Biol. 1971. - Vol.4. - P.227 - 251.

98. Lemasters J.J. Mitochondrial calcium and the permeability transition in cell death. / Lemasters J.J., Theruvath T.P:, Zhong Z., Nieminen A.L. // Biochim. Biophys. Acta- 2009. Vol.1787. - P.1395-1401.

99. Liberman E.A. Mechanism of coupling of oxidative phosphorylation and the membrane potential of mitochondria. / Liberman E.A., Topali V.P., Tsofina L.M., Jasaitis A.A, Skulachev V.P. // Nature 1969; - Vol.222 - P. 1076 - 1078.

100. Ligeti E. Kinetic of Pi-Pi exchange in rat liver mitochondria. Rapid filtration experiments in the millisecond time range. / Ligeti E., BrandolinG., Dupont Y., Vignais P.V. IIBiochemistry- 1985. Vol;24> P;4423-4428;

101. Ling X. Modulation of mitochondrial permeability transition pore affects multidrug resistance in human hepatocellular carcinoma cells. / Ling X., Zhou Y., Li S.W., Yan B., WemL. //Int J; BioltSci. -2010^- P.773-783;

102. Mailloux R.J. Genipin-induced inhibition of uncoupling protein-2: sensitizes drug-resistant cancer cells to cytotoxic agents. / Mailloux R:J., Adjeitey G.N., Harper M.E. II PloS One.- 2010. Vol.5. - P.l-10.

103. McLaughlin S. Transport of protons across membranes by weak acids. / McLaughlin S., DilgerJ.P. // Physiol. Rev. 1980. - Vol.60. - P.825 - 863.

104. Mitchell P. Goupling of phosphorylation to electromand hydrogen transfer by a chemiosmotic type of mechanism. / Mitchell P. // Nature 1961. - Voli 191. -P.144- 148.

105. Mitchell P. Chemiosmotic coupling in energy transduction: a logical development of biochemical knowledge; / Mitchell P: // Bioenergetics 1972. -Vol.3.-P.5 -24. —

106. Mitchell P; Vectorial chemiosmotic processes. / Mitchell P.7/ Ann. Rev. Biochem. 1977a: - Vol.46. - PI996 - 1005:

107. Mitchell P. A commentary on alternative hypotheses of protonic coupling in the• membrane systems catalysing oxidative and photosynthetic phosphorilation. / Mitchell P. // FEBS Lett 1977b. - Vol.78. - P.l - 20.

108. Mookerjee S.A. Mitochondrial uncoupling and lifespan. / Mookerjee S.A., Divakaruni A.S., Jastroch M., Brand M.D. // Mech. Ageing. Dev. — 2010. -Vol.131. -P.463-472

109. Neumcke B. The action of uncouplers on lipid bilayer membranes. / Neumcke B., Bamberg B. // Membranes 1975. - Vol.3. - P.215 - 253.

110. Nobes G.Di Non-ohmic proton conductance of the mitochondrial inner membrane^^^in^^hepatocytes. / NobesiC.D.', Brawn G.C. Olive P;N. Brand M'.D; // J. Biol. Chem. 1990.- Vol.265. - P:12903 - 12909.

111. Nury H; Structural approaches of the mitochondrial carrier family. / Nury H., Blesneac I., Ravaud S., Pepbay- Peyroula E. // Methods Mol. Biol. 2010. -Vol.654.-P.105-117

112. Palmieri L. Citrin and aralarl are Ca2+-stimulated aspartate/glutamate transporters in mitochondria. / Palmieri L., Pardo B.} Lasorsa F.M., del Arco

113. A., Kobayashi K., Iijima M., Runswick M.J., Walker J.E., Saheki T., Satrustegui J., Palmieri F. // EMBO J. 2001. - Vol.20. - P.5060-5069.

114. Pande S.V. Reversible inhibition of mitochondrial adenosine diphosphate phosphorylation by long chain acyl coenzyme A esters. / Pande S.V., Blanchaer M:G. // J. Biol. Chem. 1971. - Vol.246; - P:402-411.

115. Parker N. Energization-dependent" endogenouse activation of proton conductance in skeletal" muscle mitochondria: / Parker N., Affourtit C., Vidal-Puing A., Brand M:D.//Biochem: J:-2008: Vol.412. - P. 131-139:

116. Porter, R.K. Causes of differences in. respiration rate of hepatocytes from mammals of different body mass. / Porter, R.K., Brand; M:D. // Am. J. Physiol. 1995. - Vol.269. - P.1213 - 1224.

117. Porter, R.K. Allometry of mammalian cellular oxygen consumption. / Porter, R:K. // Cell. MoL Life Sci. 2001. - Vol.58; - P.815 - 822.

118. Pressman B.C. Effect of surface active agents on the latent ATPase of mitochondria. / Pressman B.C., Lardy H.A. // Biochim. Biophys. Acta 1956. -Vol.21.-P.458-466.

119. Ptak M. A NMR study of the ionization of fatty acids, fatty amines and n-acylaminoacids incorporated in phosphatidylcholine vesicles. / Ptak M., Egret-Charlier M., Sanson A., Bouloussa O. // Biochim. Biophys. Acta 1980. -Vol.600. - P.387-397.

120. Ricquier D. The uncoupling protein homologues: UCP1, UCP2, UCP3, StUCP and AtUCP. / Ricquier D. Bouillaud F. // Biochem. J.- 2000. Vol.345. - P.161-179.

121. Rodrigues AS. Proton leak modulation in testicular mitochondria affects reactive oxygen^ species production" and lipid peroxidation. / Rodrigues A.S., Lacerda B., Moreno A.J., Ramalho-Santos J: // Cell Biochem. Funct. 2010. -Vol.28. -P.224-31.

122. Rigobello M.P. Inhibition of rat liver mitochondrial permeability transition by respiratory substrates. / Rigobello M.P., Turcato F., Bindoli" A. // Arch. Biochem. Biophys. 1995. - Vol.319. - P.225-230:

123. Rolfe D.E. The physiological significance of mitochondrial proton leak in animal cells and* tissues. / Rolfe D.E. Brand M.D. // Biosci. Rep. 1997. Vol.17.-P.9-16.

124. Rolfe D.F.S. Contribution of mitochondrial proton leak to respiration rate in working skeletal muscle and liver and to SMS. / Rolfe D.F.S., Newman J.M.B., Buckingham J.A., Clark M.G., Brand M.D. // Am. J. Physiol. 1999. -Vol.276. - P.692 - 699.

125. Rottenberg H. Decoupling of oxidative phosphorylation and photophosphorylation. / Rottenberg H. // Biochim. Biophys. Acta -1990. -Vol.1018.-P.l-17.

126. Sallee V.L. Apparent monomer activity of saturated fatty acids in micellar bile salt solutions measured by a polyethylene partitioning systems. / Sallee V.L. // J. Lipid. Res. 1974. - Vol.15. - P.56 - 64.

127. Satrustegui J: Mitochondrial transporters as novel targets for intracellular calcium signaling. / Satmstegui J:, Pardo Bi, Del; Arco A. // Physiol. Rev. — 2007.-Vol.87.-P: 29-67.

128. Scholefield P.G. Studies of fatty acid oxidation. 5. The effect of decanoic acid on oxidative phosphorylation. / Scholefield P.G.// Can. J. Biochem. Physiol. -1956. Vol.34. - P.1227 - 1232.

129. Schônfeld P. Long-chain fatty acids act as protonophoric uncouplers of oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria. / Schônfeld P., Schild L., KunzW. // Biochim. Biophys. Acta-1989. Vol.977 - P.266 - 272.

130. Skulachev V.P. Solution of the problem of energy coupling in terms of chemiosmotic theory. / Skulachev V.P. II J. Bioenerg. 1972: - Vol.3. - P.25 -38.

131. Skulachev V.P. Membrane bioenergetics Should1 we build the bridge across the river or alongside of it: / Skulachev V.P.// Trends Biol. Sci. - 1984. - Vol.9. -P.182- 185.

132. Skulachev V.P. Fatty acid circuit as a physiological mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation. I Skulachev V.P. // FEBS Lett. 1991. -Vol.294. - P.158-162.

133. Skulachev V.P. Uncoupling: new approaches to an old problem of bioenergetics. / Skulachev V.P. // Biochim. Biophys. Acta 1998. - Vol.1363. -P.100 —124.

134. Smith R. Hydrophobicity of long chain n-alkyl carboxylic acids, as measured by their distribution between heptane and aqueous solutions. / Smith R., Tanford C. // Proc. Natl. Acad.Sci: USA 1973. - Vol.70. - P.289 - 293".

135. Solem L. Selective activation of the sodium-independent, cyclosporin Asensitive calcium1 pore of cardiac mitochondria by doxorubicin. / Solem L., Wallace'K. // Toxicol. AppL Pharmacol. 1993. - Vol.121. - P:50-57.

136. Stuart J.A. Mitochondrial proton leak and the uncoupling protein 1 homologues., / Stuart J.A'., Gadenas S., Jekabsons M.B., Roussel D., Brand M.D. // Biochim. Biophys. Acta 2001. - Vol. 1504. - P. 144 - 158:

137. Stubbs M. Inhibitors of the adenine nucleotides translocase. / Stubbs M. // Pharm. and Ther. 1919: - Vol.7. - Pi329 - 349?

138. Sultan A. Free fatty acid» effects on mitochondrial permeability: an overview. / Sultan A.,.Sokolove P. // Arch. Biochem. Biophys. 2001. - Vol.386. - P:52-61.

139. Terada* H. The interaction of highly active uncouplers- with- mitochondria. / Terada H. // Biochim. Biophys. Acta 1981. - Voi:639: - P:225 - 242.

140. Ting H.P. Effects of uncouplers of"oxidative phosphorilation on the specific conductance of bimolecular lipid membranes. / Ting H.P., Wilson D.F., Chance B. // Arch. Biochem. Biophys. 1970. - Vol.141. - P.141 - 146.

141. Toime L.J., Brand M.D. Uncoupling protein- 3 lowers reactive oxygen species production in isolated mitochondria. / Toime L.J., Brand M.D. // Free Radic. Biol. Med. -2010. Vol.49. - P.606-611.

142. Wehrle J.P. Phosphate transport in rat liver mitochondria: location of sulfhydryl groups essential for transport activities. / Wehrle J.P., Pedersen P.L. // J. Bioenerg. Biomembr. 1982. - Vol.13. - P.285-294.

143. Wojtczak L. Effect of fatty acids and acyl-CoA on the permeability of mitochondrial membranes to monovalent cations. / Wojtczak L. / FEBS lett. -1974. Vol.44. - P.25 - 30.

144. Wojtczak L. Effect of fatty acids on energy coupling processes in mitochondria. / Wojtczak L., Schönfeld P. // Biochim. Biophys. Acta 1993. - Vol.1183. -P.41-57.

145. Zachova,M. Interaction of mitochondrial phosphate carrier with fatty acids and hydrophobic phosphate analogs. / Zachova M., Krämer R., Jezek P. // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2000. - Vol.32. - P.499-508.

146. Zhang F. Dissociation of long and vary long chain fatty acids from phospholipids bilayers. / Zhang F., Kamp F., Hamilton J.A. // Biochemistry -1996. Vol. 35. - P.16055-16060.

147. Zoratti M., Szabo I. The mitochondrial permeability transition. / Zoratti M., Szabo I. // Biochim. Biophys. Acta- 1995. Vol: 1241. - P.139-176.

148. Zorov D.B. Regulation and pharmacology of the mitochondrial permeability transition pore. / Zorov D.B., Juhaszovaf M., Yanin Y., Nuss H.B., Wang S.} Sollott S.J. // Cardiovasc. Res. 2009. - Vol.83. - P.213-225.