Исследование некоторых аспектов фармакологической активности сополимера 1-винил-3-метилимидазолия иодида с диэтиловым эфиром малеиновой кислоты тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.25, кандидат биологических наук Глазунова, Ольга Олеговна

• Глазунова, Ольга Олеговна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Глазунова, Ольга Олеговна

Введение 5.

1. Обзор литературы. 12.

1.1. Характеристика гепарина. 12.

1.2. Новые антагонисты гепарина - синтетические поликатионы и их влияние на клетки крови. 16.

1.3. Активный и пассивный транспорт ионов в мембранах эритроцитов. 20.

1.3.1. Системы транспорта ионов калия в эритроцитах. 21.

1.3.2. Системы транспорта анионов в эритроцитах. 24.

1.3.3. Действие детергентов на биологические мембраны и липидные бислои. 27.

1.3.4. Индуцированный ионофорами транспорт ионов через мембраны эритроцитов. 29.

1.4. Свободные жирные кислоты и их влияние на транспорт через эритроцитарную мембрану. 30.

1.4.1. Влияние свободных жирных кислот на мембранный транспорт. 31.

1.4.2. Изменение жирнокислотного состава мембран при различных патологических процессах или состояниях. 37.

1.5. Взаимодействие поликатионов с генетическим материалом клетки. 40.

2. Материалы и методы. 47.

2.1. Синтез и физико-химическая характеристика поливинилазолов. 47.

2.2. Методы изучения агрегации эритроцитов. 48.

2.3. Методы изучения ионной проницаемости эритроцитов. 48.

2.4. Методы изучения жидкокристаллических дисперсий ДНК.

3. Результаты исследований и их обсуждение.

3.1. Результаты исследований агрегации эритроцитов под влиянием поликатиона.

3.2. Изучение действия поликатиона на ионную проницаемость мембран эритроцитов.

3.2.1. Ионофорная активность синтетического антигепарината ВИМ-ДЭМК в эритроцитах кролика в условиях присутствия детергента.

3.2.2. Жирные кислоты потенцируют ионофорное действие синтетического антигепарината ВИМ-ДЭМК.

3.2.3. Влияние сывороточного белка альбумина на эффективность совместного ионофорного действия поликатионаВИМ-ДЭМК и жирной кислоты.

3.2.4. Изучение действия ВИМ-ДЭМК на эритроциты больных сахарным диабетом. Роль высших жирных кислот.

3.3. Результаты исследований взаимодействия поликатиона ВИМ-ДЭМК и жидкокристаллической ДНК.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование некоторых аспектов фармакологической активности сополимера 1-винил-3-метилимидазолия иодида с диэтиловым эфиром малеиновой кислоты»

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ: Современная терапия широко использует природный антикоагулянт прямого действия - гепарин для предотвращения свертывания крови при проведении операций с использованием аппаратов искусственного происхождения, а также для быстрой коррекции нарушений свертываемости крови при гиперкоа-гуляционных расстройствах системы гемостаза (Jaques L.B., 1975; Лакин K.M. и соавт., 1974; Макаров В.А., 1989).

Гарантировать безопасность применения гепарина в клинике можно только в случае наличия и рационального применения его высокоактивных антагонистов, которые способны быстро и необратимо устранить антикоагулянт-ный эффект. Для этих целей в настоящее время используют протамины -природные поликатионы белковой природы. Их многолетнее использование убедительно показало, что они не обладают необходимой избирательностью связывания гепарина в условиях кровотока, кроме того, их применение сопровождается различными побочными эффектами даже при адекватной дозировке, но, особенно, при нередких передозировках. Ограниченная доступность использования протаминов в практической медицине зависит от объемов добычи ценных пород рыб, гонады которых являются сырьем для получения этого вида антигепаринатов.

В результате активных поисков синтетических аналогов протамина появились сообщения, которые описывают структуру и биологические свойства новых перспективных антигепаринатов - катионных полимеров, обладающих более сильной, чем протамины, нейтрализующей активностью (Смирнов А.И. и соавт., 1990; Афанасьева Г.В. и соавт., 1991; Гаврилова Е.А. и соавт., 1995). В Иркутском госуниверситете под руководством д.хим.н. профессора Смирнова А.И. в результате длительных исследований из ряда сополимеров и гомопо-лимеров на основе винилазолов был выбран сополимер 1-винил-Зметилимидазолия иодида с диэтиловым эфиром малеиновой кислоты (86:14моль %) - ВИМ-ДЭМК, который отличается оптимальным сочетанием высокой антигепариновой активности и низкой токсичности (Гаврилова Е.А. и соавт., 1996).

В результате исследований, проведенных в отделе фармакологии гемостаза РГМУ под руководством д.мед.н. проф. Ефимова B.C., было установлено, что катионный сополимер 1-винил-3-метилимидазолия иодида с диэтиловым эфиром малеиновой кислоты (ВИМ-ДЭМК) обладает свойствами антагонизма к гепарину и эффективно нейтрализует его в водной и биологических средах (в том числе и в условиях кровотока экспериментальных животных). Нейтрализующее соотношение сополимера с антикоагулянтом составляет 0,6 : 1 (мг/мг). Терапевтическая доза - 3 мг/кг (Афанасьева Г.В., 1992; Гаврилова Е.А., 1997). Специфические токсикологические исследования показали, что острая токсичность при однократном внутрибрюшинном введении составляет 120 мг/кг, при внутривенном введении - 100 мг/кг. Среди побочных эффектов однократного применения сополимера отмечено стимулирование синтеза белковых факторов свертывания из группы протромбинового комплекса (факторы II, VII, IX и X), агрегация тромбоцитов (в концентрации 0,144 мг/кг) (Гаврилова Е.А. и соавт., 1995). Таким образом, ранее была изучена антигепариновая активность ВИМ-ДЭМК и его токсические свойства.

Поскольку для нейтрализации гепарина предполагается непосредственное введение поликатиона в кровоток, при интенсивной инъекции может создаться состояние передозировки (градиент концентрации), при котором часть поликатиона остается в свободном, не связанном с гепарином, виде. Это непродолжительное состояние может повлечь за собой специфические эффекты взаимодействия с белками и клетками крови. В то же время именно этот аспект биологической активности ВИМ-ДЭМК изучен недостаточно. Поскольку основную клеточную массу крови составляют эритроциты, было целесообразно изучить возможное воздействие сополимера ВИМ-ДЭМК на эти клетки.

В частности, известно, что поликатионы вызывают агглютинацию эритроцитов и их теней. Причем этот эффект зависит не только от степени положительной заряженности, но и от структуры катионного мономера. При адсорбции поликатионов на эритроцитах абсолютная величина отрицательного поверхностного потенциала эритроцитов (- 15 мВ) уменьшается, и при возрастании концентрации поликатиона эритроциты приобретают положительный потенциал (+ 26 мВ). Однако, несмотря на высокий положительный потенциал, связывающая сила поликатионов достаточно велика, чтобы удерживать клетки вместе, так как разрушения агрегатов не происходит (Katchalsky А. et al., 1959).

Влияние поликатионов на состояние отдельных клеток крови изучено недостаточно, и описано в основном на уровне феномена тромбоцитопении. В то же время известно, что при взаимодействии положительно заряженных поликатионов с отрицательно заряженной поверхностью мембран клеток крови могут возникать различные эффекты, обусловленные их непосредственным взаимодействием. Так, поликатионы могут вызывать фазовые переходы в мембранных липидах (Galla H.J., Sackmann Е., 1975), образовывать сшивки электроотрицательных областей клеточной мембраны и даже стягивать их вместе (Платэ H.A., Васильев А.Е., 1986) - а всякое изменение физико-химических параметров мембраны ведет за собой изменения ее функциональной активности, отражающиеся на жизнедеятельности клеток.

В частности, некоторые поликатионы активируют процессы окислительного метаболизма в макрофагах и лейкоцитах, и индуцируют перераспределение тока ионов через мембрану этих клеток (Коркина Л.Г. и соавт., 1986; Петров Р.В. и соавт., 1984; Allen R.S. et al., 1972; Ginsburg I. et al., 1987). Положительно заряженные пептиды с антибактериальными свойствами (полимиксины) при определенных условиях обладают способностью изменять ионную проницаемость модельных и биологических мембран (Головлева O.A. и соавт., 1994; Корепанова Е.А. и соавт., 1985). Доказано, что при взаимодействии поликатионов с липидным бислоем происходит увеличение проницаемости клеточной мембраны лимфоцитов для ионов калия и кальция в соответствии с градиентом концентрации, несмотря на усиленную работу Na+, К+ - и Са2+ -АТФаз (Февралева И.С. и соавт., 1986). Однако, условия, определяющие интенсивность воздействия поликатионов на функциональное состояние мембраны клеток, изучены недостаточно и представляют большой интерес для фундаментальных знаний.

При некоторых патологических состояниях, таких как, канцерогенез (Денисов JI.E. и соавт., 1992; Hudson Е.А., Tisdale M.J., 1994), пероксисомные заболевания (Moser H.W., Moser A.B., 1996; Martinez M. et al., 1994), хроническая почечная недостаточность (Акалаев Р.Н., Абидов A.A., 1993), псориаз (Олисова О.М. и соавт., 1986), сепсис (Соболева М.К., Шарапов В.И., 1993), сахарный диабет (Касимова Г.М. и соавт., 1989; Bunn H.F., 1981; Харченко C.B. и соавт., 1992), основная патология сопровождается увеличением количества свободных жирных кислот в мембранах эритроцитов. Известно, что свободные жирные кислоты увеличивают электроотрицательность мембраны, и поэтому увеличение содержания свободных жирных кислот в клеточных мембранах может увеличивать связывание поликатиона с клеточной поверхностью и, следовательно, оказаться провоцирующим фактором мембранной активности поликатиона ВИМ-ДЭМК, что представляет реальный клинический интерес.

Многие биополимеры организма являются полианионами (белки, нуклеиновые кислоты, ряд полисахаридов) и могут, в силу своей природы, взаимодействовать с поликатионами с образованием устойчивых интер-полиэлектролитных комплексов (Платэ H.A., Васильев А.Е., 1986). В работе Силаевой С.А. и соавт. с помощью радиоактивномеченого С14 показано, что синтетический поликатион (олигомер 25 кони дина) легко проникает из кровотока в клетки и субклеточные органеллы гепатоцитов регенерирующей печени, в ядрах и митохондриях гепатоцитов это соединение обычно локализуется в ДНП фракции этих органелл (Силаева С.А. и соавт., 1985).

В случае попадания поликатиона внутрь клетки, можно предвидеть взаимодействие сополимера ВИМ-ДЭМК с молекулами ДНК (основой генетического материала клетки), а значит, и изменение ее структурных свойств и функций, что также представляет значительный научный и практический интерес. Известно, что при проникновении внутрь клетки ионены (синтетические поликатионы, содержащие в главной цепи четвертичные атомы азота, и также применяющиеся в качестве антидота гепарина) могут образовывать полиэлектролитные комплексы с ДНК, являющейся поликислотой (ЯетЬаиш А., 1973). Низкомолекулярные амины (спермин, спермидин, путресцин) стимулируют РНК-синтезирующие ферменты, взаимодействуют с рибосомами и играют определенную роль в канцерогенезе. Вполне возможно, что высокомолекулярные полиамины, к которым принадлежит и исследуемый сополимер ВИМ-ДЭМК, могут оказывать значительное влияние на функции и строение ДНК. В качестве модели для изучения взаимодействия между поликатионом и ДНК были выбраны холестерические жидкие кристаллы молекул ДНК. Такая упаковка генетического материала (в виде жидкокристаллических молекул ДНК) встречается в живой природе - в ДНК-содержащих вирусах, у некоторых простейших, а оптические свойства такого жидкокристаллического состояния ДНК позволяют судить о структурных перестройках молекулы при взаимодействии с поликатионами.

Таким образом, основное фармакологическое действие поликатионов, используемых в медицинской практике, нередко сопряжено с некоторыми побочными эффектами в организме. Поскольку исследуемый нами синтетический катионный сополимер ВИМ-ДЭМК является активным антигепаринатом с низкой токсичностью и коротким периодом полувыведения, что обеспечивает ему хорошую перспективу применения в качестве антагониста гепарина, то изучение характера его воздействия на клеточные компоненты крови позволит также учитывать и возможные побочные проявления его активности.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью данной работы было исследование особенностей воздействия синтетического поликатионного сополимера ВИМ-ДЭМК, предлагаемого в качестве нового антигепарината, на эритроциты человека и животных, в системах in vitro. На клеточном уровне - на агрегацию, на субклеточном уровне - на мембранную проницаемость, на молекулярном уровне - на структуру ДНК.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Установить влияние сополимера ВИМ-ДЭМК на агрегацию эритроцитов in vitro и ее зависимость от концентрации гепарина и поверхностно-активных веществ.

2. Изучить эффекты воздействия сополимера ВИМ-ДЭМК на ионную проницаемость мембран эритроцитов кролика, интактных и обработанных анионным поверхностно-активным веществом - SDS, использованным в качестве источника дополнительного отрицательного заряда на поверхности клеточной мембраны.

3. Изучить действие ВИМ-ДЭМК на ионную проницаемость мембран эритроцитов, обработанных естественными метаболитами - свободными жирными кислотами.

4. Сравнить различные жирные кислоты в их способности к совместному с поликатионом ионофорному действию на мембраны эритроцитов.

5. Исследовать действие поликатиона ВИМ-ДЭМК на ионную проницаемость мембран эритроцитов больных с патологиями, сопровождающимися повышением уровня свободных жирных кислот в мембранах их эритроцитов (на примере сахарного диабета).

11

6. Изучить возможность существования жидкокристаллической дисперсии комплекса ДНК-сополимер и условия ее получения. Исследовать влияние гепарина на структуру и оптические свойства образованного комплекса.

Заключение диссертации по теме «Фармакология, клиническая фармакология», Глазунова, Ольга Олеговна

выводы

1. Экспериментально показано, что синтетический сополимер ВИМ-ДЭМК вызывает эффект агрегации эритроцитов. В присутствии отрицательно заряженных молекул - биологического полианиона гепарина и анионного детергента увеличивается максимальный выход реакции образования агрегатов.

2. Установлено, что жирные кислоты потенцируют ионофорное действие поликатиона ВИМ-ДЭМК на мембраны эритроцитов (кролика). Величина эффекта зависит от длины углеводородной цепи и степени насыщенности жирной кислоты. Наиболее эффективные среди исследованных жирных кислот - насыщенные С12 -Си кислоты и ненасыщенная линолевая кислота.

3. Исследовано действие поликатиона ВИМ-ДЭМК на ионную проницаемость мембран эритроцитов у больных сахарным диабетом (отличающихся повышенным уровнем свободных жирных кислот). Установлено, что у 81% больных сахарным диабетом и у 77% здоровых людей добавление сополимера ВИМ-ДЭМК вызывает утечку калия из эритроцитов.

4. Поликатион ВИМ-ДЭМК (в концентрации 0,5 мкМ) увеличивает ионную проницаемость мембран эритроцитов человека, но не оказывает влияния на эритроциты кролика.

5. Сополимер ВИМ-ДЭМК способен образовывать жидкокристаллическую дисперсию ДНК-сополимер. Присутствие гепарина изменяет структуру образованного комплекса ДНК-сополимер и индуцирует практически полное восстановление аномальной оптической активности в жидкокристаллической дисперсии комплекса. Между величиной амплитуды аномальной оптической активности комплекса ДНК-сополимер и концентрацией гепарина (в области гепариновых концентраций от 0 до 1 мкг/мл) наблюдается пропорциональная зависимость.

Заключение.

По совокупности основных фармакологических свойств синтетический поликатион ВИМ-ДЭМК является веществом, обладающим признаками препарата для использования в целях нейтрализации гепарина. Поскольку для нейтрализации гепарина предполагается непосредственное введение поликатиона в кровоток, когда при интенсивной инъекции может создаться состояние передозировки (градиент концентрации), при котором часть поликатиона остается в свободном, не связанном с гепарином, виде. Это непродолжительное состояние может повлечь за собой дополнительные эффекты, выражающиеся в воздействии на клетки крови и обусловленные непосредственным взаимодействием положительно заряженных поликатионов с отрицательно заряженной поверхностью мембран клеток крови.

В данной работе изучено поведение эритроцитов и наиболее существенные реакции клеточной мембраны и генома клетки в условиях присутствия ВИМ-ДЭМК.

Как и другие синтетические и природные поликатионы, ВИМ-ДЭМК обладает способностью в небольших концентрациях (несколько мкг на мл) вызывать сильную агглютинацию эритроцитов. Эта агглютинация вызвана адсорбцией полиионов на клеточной поверхности. В дальнейшем это приводит к различным биологическим изменениям в клетках, таким как ингибирование роста, гемолиз эритроцитов (КаиЖа^ку А., 1964).

Добавление в реакционную смесь анионного детергента додецил-сульфата натрия (8Э8), применяющегося для создания дополнительного отрицательного заряда на поверхности мембраны, приводит к существенному изменению как константы скорости реакции агглютинации эритроцитов, так и максимального выхода реакции. Влияние 8Б8 на образование агрегатов зависит от степени заряженности сополимера. Возрастание максимального выхода реакции можно объяснить сдвигом химического равновесия реакции образования агрегатов в сторону прямой реакции, связанного с изменением электрического заряда на поверхности мембран эритроцитов под влиянием SDS.

Добавление гепарина (в концентрации 0,2 Ед/мл) в среду агрегации, содержащую также SDS и индуктор агрегации - поликатион, увеличивает и константу скорости, и максимальный выход реакции, то есть еще больше сдвигает равновесие реакции образования эритроцитарных агрегатов в сторону прямой реакции. В присутствии гепарина и SDS (8,6 * 10" 5 М) поликатион вызывает агрегацию с наибольшей максимальной амплитудой.

Полученные результаты позволяют сделать вывод, что добавление отрицательно заряженных молекул в среду инкубации, будь то анионный детергент SDS, либо антикоагулянт гепарин, существенно изменяет кинетические характеристики процесса агрегации эритроцитов, индуктором которого служит исследуемый поликатион ВИМ-ДЭМК. Изменение кинетических характеристик процесса можно объяснить количественным изменением отрицательного заряда на поверхности мембран эритроцитов под влиянием этих заряженных молекул.

В данной работе также изучено влияние поликатиона ВИМ-ДЭМК на пассивную ионную проницаемость мембран эритроцитов кролика и человека. В концентрациях, используемых в практике восстановления свертываемости крови, поликатион не оказывал влияния на пассивную калиевую проницаемость и амплитуду СГ/ОН" обмена в мембране эритроцитов кролика. Но при добавлении в среду инкубации длинноцепочечного аниона додецилсульфата натрия (SDS), использованного в качестве источника дополнительного отрицательного заряда, картина изменяется. Амплитуда СГ /ОН" обмена существенно уменьшается и одновременно увеличивается выход калия из эритроцитов. Причем SDS использовался в концентрациях, самостоятельно не оказывающих влияния на ионную проницаемость. Только совместное воздействие поликатиона и SDS вызывало данный эффект. Таким образом, появление дополнительных отрицательных зарядов на поверхности мембран инициирует мембранную активность ВИМ-ДЭМК. Этот факт приобретает важное значение в свете того, что плотность зарядов на поверхности эритроцитов человека не является неизменной, жестко фиксированной величиной, а колеблется в интервале от 1300 - 1900 А0 на единичный заряд.

Отметим, что при добавлении в среду инкубации гепарина в концентрации 3 мкМ, достаточной для нейтрализации заряда поликатиона, происходила полная отмена совместного мембранотропного действия поликатиона и SDS.

Ионофорное действие поликатиона ВИМ-ДЭМК на мембраны эритроцитов кролика можно инициировать путем предварительной инкубации эритроцитов с жирными кислотами, которые являются природными аналогами детергентов и в свободном виде всегда присутствуют в небольших количествах в мембранах эритроцитов (Леонова В.Г., 1987; Shofet S.B., 1980). Жирные кислоты легко адсорбируются в мембране эритроцитов из среды инкубации и плазмы крови (Tamura A. et al., 1982; Renooij W. et al., 1974). После обработки эритроцитов насыщенными карбоновыми кислотами С12-С16 наблюдалось значительное увеличение выхода калия из эритроцитов и существенное уменьшение амплитуды анионного обмена в ответ на добавку ВИМ-ДЭМК. При этом жирные кислоты в используемых концентрациях не оказывают влияния на ионную проницаемость мембран.

Обнаружена зависимость между величиной ионофорного эффекта поликатиона и длиной цепи насыщенной жирной кислоты. Наиболее эффективными среди исследованных насыщенных жирных кислот были лауриновая (С12) и тридекановая (С[3) кислоты. Эффективность совместного с поликатионом ВИМ-ДЭМК действия снижалась при использовании как более коротко-, так и более длинноцепочечных кислот. Появление двойных связей в алифатических структурах также влияло на эффективность ионофорного действия. Жирная кислота (на примере Cig-цепи линолевой кислоты) приобретала способность (в отличие от С]8 стеариновой кислоты) совместно с поликатионом нарушать пассивную проницаемость мембран эритроцитов.

Поскольку все биологические мембраны (и в частности, клетки крови) несут на своей поверхности отрицательный заряд, то в присутствии свободного, не связанного с гепарином поликатиона, возможно его взаимодействие не только с эритроцитами, но и с другими клетками, в том числе и с тромбоцитами, плотность заряда на поверхности которых (1550-1640 А0 на заряд) сравнима с плотностью заряда на мембранах эритроцитов. В случае невысокого содержания свободных жирных кислот в мембранах, это взаимодействие, по-видимому, не обязательно будет выражаться в увеличении ионной проницаемости клеточных мембран, а может приводить к другим эффектам, например, агрегации, как это наблюдается с тромбоцитами.

Известно, что некоторые патологии, в частности, сахарный диабет, приводят к нарушениям в составе и увеличению количества свободных жирных кислот, находящихся в эритроцитарных мембранах. В условиях, когда количество поликатиона в кровотоке превышает количество циркулирующего гепарина, свободные жирные кислоты в мембранах эритроцитов могут оказаться провоцирующим фактором ионофорной активности поликатиона ВИМ-ДЭМК в клеточных мембранах. Поэтому проведено исследование влияния поликатиона на ионную проницаемость мембран эритроцитов больных сахарным диабетом.

В большинстве случаев (17 из 21) у больных при сахарном диабете обнаружена утечка калия из эритроцитов в ответ на добавку ВИМ-ДЭМК, но неожиданно оказалось, что поликатион вызывает выход калия из эритроцитов и у здоровых доноров (контрольные эритроциты). Более того, эритроциты не всех больных сахарным диабетом были подвержены действию поликатиона. Процент больных сахарным диабетом, у которых добавление поликатиона в суспензию эритроцитов практически не нарушало ионной проницаемости мембран эритроцитов, что регистрировалось отсутствием дополнительной утечки калия и анионов, составлял около 19 %. В контрольной группе из 13 человек примерно у 23% доноров эритроциты не реагировали на добавление поликатиона в кювету. Таким образом, и среди больных с сахарным диабетом и среди здоровых людей примерно у 80% добавление сополимера вызывает нарушение ионной проницаемости мембран эритроцитов, и только 20% как в той, так и в другой группе не чувствительны к действию сополимера в использованной нами концентрации.

Амплитуда выхода калия под влиянием поликатиона из эритроцитов в у контрольной группе находилась в интервале величин - (0,15 - 1,05) * 10" мкг К+ /эрит. за 5 мин., а из эритроцитов больных сахарным диабетом - (0,2 - 0,97) 7 10" мкг К /эрит. за 5 минут. То есть, ионофорный эффект поликатиона дает одинаковое увеличение ионной проницаемости мембран эритроцитов как у больных сахарным диабетом, так и у условно здоровых доноров, чувствительных к действию этого синтетического поликатиона.

Утечка калия, наблюдавшаяся при действии поликатиона на эритроциты больных с сахарным диабетом, в процентном отношении ко всему калию, содержащемуся в клетке, оказалась ниже или сравнима с наблюдаемой нами при искусственном обогащении мембран эритроцитов экзогенными жирными кислотами, хотя, по-видимому, далеко не все молекулы жирной кислоты, добавленной в кювету, встраиваются в мембрану.

По нашему мнению, невысокая (по сравнению с эритроцитами здоровых доноров) чувствительность мембран эритроцитов при сахарном диабете к действию поликатиона, может быть объяснена накапливанием в их мембранах длинноцепочечных насыщенных жирных кислот, малоэффективных в потенцировании ионофорного действия поликатиона.

Совокупность полученных данных позволяет думать, что обнаруженный эффект потенцирования ионофорного действия поликатионов в клеточных мембранах не является специфичным и может рассматриваться не только как возможное побочное действие поликатионов, но и как указание на возможность использования синтетических поликатионов в других целях, например, при создании антибактериальных препаратов, для которых способность повреждать мембрану относится к ценным свойствам соединения.

В случае попадания поликатиона внутрь клетки, между сополимером ВИМ-ДЭМК и генетическим материалом клетки - молекулой ДНК, благодаря электростатическому притяжению может происходить взаимодействие, а значит, изменение структурных свойств и функций ДНК.

Установлена возможность существования жидкокристаллической дисперсии комплекса ДНК-сополимер, подобраны условия ее получения (молекулярная масса и концентрация полиэтиленгликоля, катионный состав, ионная сила, рН и температура раствора). Образование дисперсии ДНК сопровождается возникновением интенсивной полосы в спектре кругового дихроизма (КД), расположенной в области поглощения азотистых оснований. Получены спектры кругового дихроизма жидкокристаллических дисперсий комплексов ДНК-сополимер с различным содержанием сополимера.

Изучено влияние гепарина на структуру и оптические свойства образованного комплекса. При добавлении к этому комплексу гепарина, обладающего более сильным отрицательным зарядом, чем ДНК, происходит конкурентное вытеснение гепарином поликатиона, разрушение сшивок в комплексе ДНК-сополимер и освобождение ДНК. В результате удаления молекул сополимера из состава комплекса ДНК-сополимер взаимная ориентация молекул ДНК в частицах жидкокристаллической дисперсии меняется и молекулы ДНК перестраиваются, образуя холестерические жидкие кристаллы с присущими им аномальными оптическими свойствами. В спектрах кругового дихроизма эти изменения выражаются в резком увеличении амплитуды отрицательной полосы.

Снята зависимость величины амплитуды аномальной оптической активности комплекса ДНК-сополимер от концентрации гепарина. В интервале концентраций от 0 до 1 мкг/мл гепарина наблюдается пропорциональная

123 зависимость, следовательно этот участок кривой можно использовать для калибровки, пользуясь которой можно с высокой точностью определять концентрацию гепарина в исследуемом растворе. Минимальная концентрация гепарина, определяемая при помощи предлагаемого метода, составляет (1-2) * 10~4 мг/мл.

Таким образом, синтетический сополимер ВИМ-ДЭМК, относящийся к классу поликатионов, предназначенных для применения в лечебной практике, обладает не только специфическим антигепаринатным действием, но и имеет способность агрегировать эритроциты, а также увеличивать пассивную проницаемость мембраны эритроцитов для ионов калия и протонов, обладает способностью взаимодействовать с ДНК и изменять ее структурные и физико-химические свойства. Поэтому при его дальнейшем использовании в качестве антидота гепарина необходимо учитывать условия, индуцирующие его побочные действия.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Глазунова, Ольга Олеговна, 1998 год

1. Акалаев Р.Н., Абидов A.A. Фосфолипидный состав эритроцитов у больных хронической почечной недостаточностью //Вопросы мед. химии. 1993. -Т. 39, N5. -С.43-45.

2. Альберт Э. Избирательная токсичность. -М.:Мир,1971. -360 с.

3. Анненков В.В., Кругл ова В. А., Казимировская В.Б. и др. Физиологическая активность сополимеров 5-изопропенилтетразола с 1-винилпирролидоном//Хим.-фарм. журн. -1995. -N 1. -С.38-42.

4. Антонов В.Ф Липиды и ионная проницаемость мембран. -М.:Наука -1982. -С.151.

5. Асташкин Е.И, Антонов В.Ф. Индуцированный валино-мицином сопряженный перенос ионов через мембраны эритроцитов. -В сб. Биофизика мембран. -Каунас.-1973.-С.46-51.

6. Асташкин Е.И., Антонов В.Ф. Сопряженный транспорт ионов Н + , К+ и С1 через мембраны эритроцитов//Физиол. журн. СССР. -1974.-Т.60.-С.1813-1818.

7. Афанасьева Г.В. Фармакологическое исследование поликатионов на основе N-винилазолов по влиянию на свертываемость крови и взаимодействие с гепарином. -Дисс. канд. биол. наук. -Купавна. -1992.

8. Афанасьева Г.В., Антонович A.A., Ефимов B.C., Смирнов А.И. Влияние сополимера 1-винил-З-метилимидазолий йодида с диэтиловым эфиром малеиновой кислоты на свертываемость крови в эксперименте //Фармакол. и токсикол. -1991. -Т. 54, N 5. С. 31-33.

9. Беляков В.А., Сонин A.C. Оптика холестерических жидких кристаллов. М.:Наука, 1982. -360 с.

10. Беляков В.А. Жидкие кристаллы. -М.:3нание , 1986. -158 с.

11. Бреслер В.М., Никифоров A.A. Транспорт органических кислот через плазматические мембраны дифференцированных эпителиальных слоев у позвоночных. -Л.:Наука,1981. -203с.

12. Ващенко В.И., Есырев О.В., Успанова Ж.К. Влияние жирных кислот на кальциевые каналы саркоплазматического ретикулума скелетных мышц//Укр. биохимич. журнал. -1995. -Т.67, N 2. -С.41-45

13. Виевский А.Н. Механизм биологического влияния катионных поверхностно активных веществ. -Киев, 1991. -250с.

14. Гаврилова Е.А., Баженов Д.Н., Афанасьева Г.Н. Сравнительная оценка антигепариновой активности в ряду поликатионов винилазолов// Природные ресурсы, экология и социальная среда Прибайкалья. Иркутск, 1995. -Том 1. -С. 209.

15. Гаврилова Е.А. Исследование фармакологического влияния на свертываемость крови полиэлектролитов — производных винилазолов и фукоиданов. Дисс. канд. биол. наук. -М. -1997.

16. Гаврилова Е.А., Бирюкова Е.И., Ефимов B.C. Влияние природы противоиона на антигепариновую активность имидазолсодержащих поликатионов//Хим.-фарм. журн. -1996. -Т.30, N12. -С.33-34.

17. Головлева O.A., Корепанова Е.А., Ефимов B.C., Владимиров Ю.А. Действие ионенов на ионную проницаемость мембран эритроцитов //Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -1994. -N 7. -С. 44-46.

18. Гущин И.С., Войтенко В.Г., Свиридов Б.Д., Зебров А.И., Панарин Е.Ф., Горбунова О.П., Кочеткова И.С. Действие синтетических полианионов и поликатионов сополимеров N-винилпирролидона на тучные клетки//Иммунология. -1988. -N5. -С.49-52.

19. Денисов JI. Е., Прохорович В.А., Вержкин А.Л. и др. Жирные кислоты и злокачественные опухоли//Клиническая медицина. -1992. -Т.70, N 7-8. -С. 20-23.

20. Долгинова Е.А., Корепанова Е.А., Осипов А.Н., Владимиров Ю.А. Полимиксин В уменьшает активацию нейтрофилов, индуцированную латексом//Биологические мембраны. -1991. -Т. 8, N 6. -С. 606-611.

21. Евдокимов Ю.М. Жидкокристаллические дисперсии нуклеиновых кислот//Извест. Акад. наук СССР. -1991. -Т. 55, N 9. -С.1804-1816.

22. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г. Описание процесса конденсации ДНК (РНК) в водно-солевых растворах, содержащих полиэтилен-гликоль/УБиофизика. -1981. Т. 26, N2. -С. 222-227.

23. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г. Биодатчики на основе нуклеиновых кислот//Итоги науки и техники, сер. Биотехнология.-1990. -Т. 26. -С. 134-161.

24. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Чернуха Б.А. Биодатчики на основе жидкокристаллических дисперсий двухцепочечных нуклеиновых кислот//Биотехнология. -1992. -Вып. 5. -С.103-109.

25. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., СаляновВ.И. и др. Нуклеиновые кислоты как основа для создания биосенсоров//Молекулярная биология. 1989. -Т. 23, вып. 6. -С.1581-1588.

26. Евдокимов Ю.М., Скуридин С.Г., Салянов В.И. и др. Принципы создания биодатчиков на основе жидких кристаллов нуклеиновых кислот// Биофизика. -1990. -Т. 35, N5. -С. 731-738.

27. Ермаков Ю.А., Февралева И.С., Атауллаханов Р.И. Влияние поликатиона на граничные потенциалы БЛМ//Биол. мембраны. -1985. -Т.2, N11. -С.1094-1099.

28. Еропкин М.Ю., Афиногенов Г.Е., Еропкина Е.М. Некоторые биохимические показатели цитотоксического ответа фибробластов человека в культуре под действием природных и синтетических поликатионов//Вопр. мед. химии. -1995. -T.41,N2. -С.36-39.

29. Заводник И.Б., Пилецкая Т.П., Степуро И.И. Влияние температуры на лизис эритроцитов человека пальмитиновой кислотой/УБиофизика. -1991. -Т. 36, вып. 6. -С. 1056-1060.

30. Заводник И.Б., Лапшина Е.А., Брышевска М. Эффект свободных жирных кислот на состояние липидного и белкового компонентов мембран//Биол. мембраны. -1995. -Т.12, N 5. -С.516- 523.

31. Закс JI. Статистическое оценивание. -М.:Статистика. -1976.-598 с.

32. Касимова Г.М., Мирталипов Д.Т., Абидов A.A. и др. Липиды эритроцитов при сахарном диабете с сосудистыми поражениями//Вопр. мед. химии. -1989. -Т.35, вып. 3. -С.42-47.

33. Козлов М.М., Лерхе Д., Маркин B.C., Майер В. Втягивание мембраны эритроцита в микропипетку: перераспределение мембранного скелета//Биол.мембраны. -1989. -Т.6, вып.7. -С.754-763.

34. Конев C.B. Структурная лабильность биологических мембран и регуляторные процессы. -Минск:Наука и техника. -1987.

35. Корепанова Е.А., Антонов В.Ф. Роль поверхностного заряда при взаимодействии полимиксина M с липидными мембранами/Биофизика мембран. -Каунас. -1973. -С.348-353.

36. Корепанова Е.А. Взаимодействие основных низкомолекулярных белков с заряженными модельными и биологическими мембранами. -Дисс. канд. биол. наук. -М. -1975.

37. Круглова В.А., Анненков В.В., Верещагин Л.И. и др. Синтез сополимеров винилазолов и их физиологическая активность//Хим.-фам. журн. -1987. N 2. -С.159-163.

38. Круглова В.А., Анненков В.В., Москвитина JI.T. и др. Синтез и исследование влияния на процесс гемокоагуляции поли-5-изопропенил-тетразола//Хим.-фарм. журн. -1989. -Т.23, N 2. -С. 195-198.

39. Лакин K.M., Шеметов В.Д., ЕфимовВ.С. и др. Фармакологическая регуляция свертывания крови при пересадке органов и тканей//В кн.: Актуальные проблемы пересадки органов. -1974. -С. 78-96.

40. Лапшина Е.А., Заводник И.Б. Структурные изменения эритроцитарных мембран в присутствии свободных жирных кислот и их производных//Биол. мембраны. -1995. -Т.12, вып. 2. -С.157-163.

41. Лев A.A. Ионная избирательность клеточных мембран. -Л.:Наука. -1975. -257 с.

42. Леонова В.Г. Анализ эритроцитарных популяций в онтогенезе человека. -Новосибирск: Наука, 1987. -234 с.

43. Линчевская A.A., Кондратьева Л.А. Влияние гипотермии на структурнофункциональные свойства мембран эритроцитов белых крыс//Вопросы мед. химии. -1989. -Т. 35, вып. 6. -С.36-39.

44. Макаров В.А. Современные проблемы лекарственной регуляции функции гемостаза//Фармакология и токсикология. -1989. -Т. 52, N 4. -С. 913.

45. Максимова О.В., Солун М.Н. Особенности липидного состава эритроцитарных мембран у больных сахарным диабетом //Пробл. эндокринологии. -1988. -вып.5. -С.14-18.

46. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В. Биохимия человека -М: Мир, 1993. -Т. 1. -347 стр.

47. Нобль Д. Химические модели селективности и проводимости возбудимых мембран/В кн.:Биологические мембраны; под ред. Д.Парсонса. -М.:Атомиздат, 1979. -232с.

48. Овчинников Ю.А., Иванов В.Г., Шкроб A.M. Мембранно-активные комплексоны. -М.:Наука. -1974.

49. Олисова О.М., Лашманова А.П., Акимова В.Г. Спектр нейтральных липидов в плазме крови и эритроцитах больных псориазом//Вестник дерматол. и венерол. -1986. -N10. -С. 17-21.

50. Орлов С.Н., Кузнецов С.Р., Скрябин Г.А. и др. Особенности объемзависимой регуляции потоков натрия и калия в эритроцитах кролика//Биол. мембраны. -1992. -Т.9, вып. 7. -С.716-722.

51. Пасынский В.И. Коллоидная химия . -М.:Высшая школа. -1968. -С.107-109.

52. Петров В.В. Изучение зависимости ионной проницаемости от поверхностного потенциала и фазового состояния липидных мембран. -Дисс. канд. биол. наук. -М. -1978.

53. Петров Р.В., Хаитов P.M., Атауллаханов Р.И. Молекулярные механизмы активации лимфоцитов полиионами. I. Модификация трансмембранного переноса катионов//Биологические мембраны. -1984.1. Т.1, N6. -С.599-604.

54. Платэ H.A., Васильев А.Е. Физиологически активные полимеры. -М.:Химия. -1986. -296 с.

55. Плохинский H.A. Биометрия. -М.:Изд-во Моск. университета. -1970.367 с.

56. Погорелова Т.Н., Крукиер И.И., Орлов В.И. Липидный состав и активность фосфолипазы А2 плазматических мембран плаценты крыс при гипоксических состояниях//Вопр. мед. химии. -1995. -Т.41, вып.6.-С.30-33.

57. Резвухин А.И., Шалаурова И.Ю., Потапова И.А. и др Хроматомасс-спектрометрическое определение свободных жирных кислот в сыворотке крови//Вопр. мед. химии. 1993. - Т.39, N 5. - С. 55-57.

58. Рыбин В.К., Скуридин С.Г. Управление структурой лиотропных жидких кристаллов ДНК при помощи протаминов//Извест. Акад. наук СССР. Сер. физ. наук. -1991. -Т. 55, N9. -С.1828-1831.

59. Салянов В.И., Погребняк В.Г., Скуридин С.Г. и др. О связи между молекулярным строением водных растворов полиэтиленгликоля и компактизацией двухцепочечных молекул ДНК//Молек. биол. -1978. -Т. 12, N 3. -С. 485-495.

60. Семенов Н.В. Биохимические компоненты и константы жидких сред и тканей человека:Справочник. -М:Медицина, 1971. -С. 94.

61. Скворцова Г.Г., Скушникова А.И., Домнина Е.С. Синтез и противоопухолевая активность комплекса хлорида кадмия с поливинилимидазолом//Хим.-фарм. журн. -1984. -Т. 18, N 6. -С.679-681.

62. Скуридин С.Г. Биодатчики на основе жидкокристаллической дисперсии ДНКУ/Извест. акад. наук СССР. Сер. физ. наук. -1991. -Т. 55, N 9. -С.1817-1824.

63. Скуридин С.Г., Шашков B.C., Евдокимов Ю.М. и др. Об условиях формирования оптически активных компактных частиц двухцепочечной ДНК в содержащих полиэтиленгликоль растворах разных солей//Молек. биол. -1979. -Т. 13, N4. -С. 804-810.

64. Скуридин С.Г., Рыбин В.К., Дембо А.Т. и др. Перестройка структурной организации жидких кристаллов ДНК под действием природных соединений//Докл. АН СССР. -1990. -Т. 311, N4. -С. 980-983.

65. Смирнов А.И., Антонович A.A., Кижняев В.Н. и др. Антигепариновая активность поликатионов на основе 1-винилазолов //Хим.-фарм. журн. 1990. -N4. - С. 28.

66. Смирнов А.И., Баженов Д.Н., Антонович A.A., Гаврилова Е.А., Ефимов B.C. Синтез и антигепариновая активность поликатионов на основесополимеров 1-винилимидазола с МДчГ-метилен-бис-акриламидом //Хим. -фарм. журнал. -1995. -T.29,N10. -С.20-21.

67. Соболева М.К., Шарапов В.И. Жирнокислотный состав и функциональное состояние эритроцитарных мембран у больных сепсисом//Вопр. мед. химии. -1993. -Т.39, N5. -С.19-21.

68. Степуро И.И., Заводник И.Б., Пилецкая Т.П. и др. Лизис эритроцитов человека, индуцируемый алифатическими альдегидами//Биол. мембраны. 1990. -Т.7, вып.7. -С.742-749.

69. Уайт А., Хендлер Ф., Смит Э. и др. Основы биохимии/ -М.Мир. -1981. -Т.1. -С.57.

70. Ульянов A.M., Ляпина Л.А. Современные данные о гепарине и его биохимических свойствах//Успехи совр. биологии. -1977. -Т.83, Вып.1. -С.69-85.

71. Февралева И.С., Ермаков Ю.А., Атауллаханов Р.И. Значение взаимодействия полиэлектролитов с липидным бислоем для повышения проницаемости клеточных мембран//Иммунология. -1986. -N1. -С.66-69.

72. Февралева И.С. Изучение состояния белков и липидов мембран лимфоцитов при воздействии иммуностимулирующими полиэлектро-литами. Автореф. канд. дис. -М., 1988.

73. Федорова М.В., Ефимов B.C., Петрухин В.А., Гришин В.Л. Использование ингаляций гепарина в акушерской практике//Вестник. -1996. -Вып.1. -С.69-73.

74. Филиппосьянц С.Т. Очищение организма кролика от полимиксина М//Антибиотики. -1967. -Т. 12, N5. -С. 414-419.

75. Флоренс А.Т. Мицеллообразование, солюбилизация и микроэмульсии. -М.:Мир, 1980. -276с.

76. Харченко C.B., Пронин B.C., Александров А .В. и др. Новые подходы к диагностике нарушений углеводного обмена//Изв. АН СССР, сер. Биол. -1992. -N4. -575-590.

77. Черницкий Е.А., Воробей А.В. Структура и функции эритроцитарных мембран. Минск:Наука и техника. -1981.

78. Шаму А.Е., Хэррман Т.Р. Природные ионофоры и их роль в транспорте ионов через мембраны//Успехи совр. биол. -1981. -Т.9, N 3. -С.350-365.

79. Шофит С.Б. Механизмы обновления липидов в мембране эритроцитов/Мембраны и болезнь (под ред. Болис Л., Хоффман Д.Ф., Лиф А.). -М.-.Медицина, 1980. -С. 76-89.

80. Эмануэль Н.М., Кнорре Д.Г. Курс химической кинетики. -М.:Высшая школа, 1974. -400 с.

81. Ababouch L.H., Bouqartacha F., Busta F.F. Inhibition of Bacillus cereus spores and vegetative cells by fatty acids and glycerylmonododecanoate//Food microbiol. -1994. -V.ll, N 4.-P.327-336.

82. Agren J.J., Tormala M.-A., Nenonen M.T., Hanninen O.O. Fatty acid composition of erythrocyte, platelet and serum lipids in strict vegans//Lipids. -1995. -30, N4. -P.365-369.

83. Allen R.S., Stjernholm R.L., Steele R.H. Evidence for the generation of an electronic state(s) in human polymorphnonuclear leukocytes its participation in bacterial activity//Biochem. Biophys. Res. Commun. -1972. -V.47. -P.679-684.2"Ь "Ь

84. Alvarez J. The role of calmodulin on Ca -dependent К transport regulation in the human red cell//Biochem. et Biophys. acta. -1986. -V.860, N 1. -P.25-34.

85. Anderson L.O., Barrowuliff T.W., Holmer F. Molecular weight dependency of thrombin and activated factor X. Effect of heparin neutralization in plasma//Thrombos.Res.- 1976. Vol.15. - P.531-541.

86. Andrew J., Willis J.S. The temperature dependence of passive potassium permeability in mammalian erythrocytes//Criobiology. -1986. -V.23, N 5. -P.395-405.

87. Bogind B., Stampe P., Christophersen P. Some characteristica of Ca -activated K+ channel of the human red cell membrane//Acta Physiol. Scand. -1985. -V.124, Sup.542. -P. 149.

88. Brown G.C., Brand M.D. On the nature of the mitochondrial proton leac//Biochim. Biophys. Acta. -1991. -1059. -P.55-62.

89. Bunn H.F. Nonenzymic glycosylation of protein: relevance to diabetes//Amer. J. Med. -1981. -V.70(2). -P.325-330.

90. Burton A.F., Piette L.H. Spin labelling studies of cytolysis induced by fatty acids//Mol. and Cell. Biochem. -1983. -V.51, N 1. -P.73-78.

91. Cartwringht-Shamoon J.M., Dodge J.A. A selective effect of unsaturated fatty acids on ionic transport in rat intestine//3rd Int. Congr. Essent. Fatty Acids and Eicisanoids, Adelaide, 1-5 March, 1992:Program. and Abstr. -Adelaide, 1992. -p.165.

92. Cooper R., Noy N., Zakim D. Differential solvation of fatty acids (FA) in natural and synthetic membranes//Hepatology -1986. -V. 6, N 5. -P. 187-190.

93. Csordas A., Rubczynska M. Critical temperatures for the interaction of free fatty acids with the erythrocyte membrane//Biochem. et Biophys. acta. -1988. -V.944. -P. 156-163.

94. Das U.N., Begin M.E., Ells G. et al. Polyunsaturated fatty acids augment free radical generation in tumor cells in vitro//Biochem. Biophys. Res. Commun. -1987. -V.145(l). -P. 15-24.

95. Deamer D.W. Proton flux mechanisms in model and biological membranes//J. membrane biol. -1989. -V.107, N 1. -P.91-103.

96. Duncan P.T. Heparin, low molecular weight heparin and heparin analogues //Brit.J.Haematol. -1984. -Vol.58, N3. -P.385-390.

97. Dunham Ph.B., Stewart G.M., Ellory J.C. Chloride-activated passive potassium transport in human erythrocytes//Proc. Nat. Acad. Sci. USA Biol. Sci.-1980. -V.77,N3.-P.1711-1715.

98. Engelberg H. Probable physiologic function of heparin //Fed. Proc.-1977.-Vol.36,N1.-P.70-72.

99. Ermakov Y.A. The determination of binding site density and assotiacion constants for monovalent cation adsorption onto liposomes made from mixtures of zwitterionic and charged lipids//Biochim. Biophys. Acta. -1990. -V.1023. -P.91-97.

100. Eskelinen S. The casual and consecutive role of the relative area of coupled membrane layers in some shape transformation of red blood cells//Acta Univ. Ouluen. -1986. -A ,N 179.-P. 115-118.

101. Frebelius S., Hedin U., Swedenborg J. Thrombogenicity of the jugured Vessel Wall-Role of antithrombin and heparin//Thrombosis and haemostasis. -1994. -V. 71, N 1. -P. 147-153.

102. Frohlich O., Gunn R.B. Erythrocyte anion transport: the kinetics of single-site obligatory exchange system//BBA: Rev. Biomembranes. -1986. -864 (M 15), N2. -P.164-194.

103. Galla H.I., Sackmann E. Chemically induced lipid phase separation in model membranes, containing charged lipids: a spin label study//BBA. -1975. -V. 401, N3. -P. 509-529.

104. Geek P., Heinz R. The Na -K -2C1" cotransport system//J. membrane Biol. -1986. -V.91, N 2. -P.97-105.

105. Ginsburg I., Borinski R., Sadovnic Y.E., Rainsford K. PolyL-histidine. A potent stimulator of superoxide generation in human blood leukocytes//Inflanimation. -1987. -V. 11,N3. -P. 253-277.

106. Gordon L.M., Looney F.D., Curtain C.C. Estimation of spin priobe clustering in biological membrane//Biochim. and Biophys. Acta. -1987. -V. 898 (Ml47), N 2. -P. 202-213.

107. Gutknecht J. Proton conductance caused by longchain fatty acids in phospholipid bilayer membranes//J. Membrane biol. -1988. -V.106, N 1. -P.83-93.

108. Haas S., Haas P. Blumel Nidermolekulare Heparin. Uberichtuber wirkprofil und bis herigeklinishe Anwendung//Hemostaseologil. -1986, N 6. -P.180-192.

109. Haest C.W.M., PlasaG., Deuticke B. Selective of lipids from the outer memebrane layer of human erythrocytes without hemolysis. Consequences for bilayer stability and cell shape//BBA. -1981. V. 649, N3. -P. 701-708.

110. Hagerstrand H., Jsomaa B., Paatro G. The effects of amphiphilic agents on osmotic tragility and ion permeability in human erythrocytes, the role of the polar head group and the alkylchain length//Acta Univ. Ouluen.-1986. -A , N179. -P.119-120.

111. Hauser H., Guyer W. Clustering of fatty acids in phospholipid bilayers//Biochim. and Biophys. Acta. -1979. -V. 553, N 2. -P. 359-363.

112. Hudson E.A., Tisdale M.J. Alterations in plasma and tumor levels of fatty acids with weigth less in experimental cachexcia model//Prostagland., Leukotrienes and Essent. Fatty Acids. -1994. -50, N 5. -P.229-234.

113. Jaques L.B. Heparin and related polyelectrolytes// Polyelectrolytes and their application.-Dodrecht. 1975. -P. 145-161.

114. Jones G.S., Knauf P.A. Mechanism of the increase in cation permeability of human erythrocytes in low-chloride media involvment of the anion transport protein capophorin//J. Gen. Physiol. -1985.-V.86, N 5.-P.721-738.

115. Jsomaa B., Paatero J. Shape and volume changes in rat erythrocytes induced by surface-active alkyltrimethylammonium salts and sodium dodecyl sulphate//Biochim. Biophys. Acta. -1981. -Y.647, N 2. -P.211- 222.

116. Jsomaa D., Hagerstrand H., Paatro G., Engblom A.C. Permeability alterations and antihaemolysis induced by amphiphiles in human erythrocytes//Biochim. Biophys. Acta. -1986. -V.860. -P.510-524.

117. Kabara J.J. Fatty acids and derivatives as antimicrobial agents. A review//Symp. Pharmacol. Effect Lipids. 69 Annu. Meet., St. Louis, Miss., May 1418, 1978 Champaign, 1978, P.l-14.

118. Kamp F., Hamilton J.A. pH gradients across phospholipid membranes caused by fast flip-flop on unionized fatty acids//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1992. -V.89. -P.l 1367-11370.

119. Kanamori, Naoaki. Patogenic effect of unfractionated heparin on hypercoagulability and vasculoendothelial dysfunction of regular hemodialis patients//Showa Igakkoi Zasshi. -1993. -Vol.53, N 6. -P. 529-536//Chem. Abstr. -1994. -Vol.121. -245612w.

120. Karnovsky M.J. Lipid domains in biological membranes. Their structural and functional perturbation by free fatty acids and the regulation of receptor mobility//Amer. J. Pathol. -1979. -V.97,N2. -P.212-221.

121. Katchalsky A. Polyelectrolytes and their biological interactions //Bioph. J. -1964. -V.4. -N1,2.-P. 9-43.

122. Katchalsky A., DanonD., Nevo A., De Vries. A Interactions of basic polyelectrolytes with the red blood cell. Agglutination of red blood cells by polymeric bases//Biochim. et biophys acta. -1959. -V.33. -P.120-138.

123. Knauf P.A., Brahm J. The functional assimetry of the anion transport system in human red blood cells at 38 0 C//Acta Physiol. Scand. -1985. -V.124, Sup.542. -P. 155.

124. Koide T., Odani S., Takahashi K. Antithrombin III Toyama: replacement of arginine-47 by cycteine in hereditary abnormal antithrombin III that laks heparin-binding ability//Proc.Nat.Acad. Sci. -1984. -Vol.81. -P.289-293.

125. Langner M., Isac T., Hui S.W. Interaction of free fatty acids with phospholipid bilayers//Biochem. and Biophys. acta. Biomembranes. -1995. -V.1236, N 1. -P.73-80.

126. Liberti P.A., Stivala S.S. Physicochemical studies of functionated bovin heparin. ll.Viscosyty as a function of ionic strength//Arch. Biochem. Biophys. -1967. Vol.119. - P.510-518.

127. Locke R.M., Rial E., Scott I.D., Nicholls D.G. Fatty acids as acute regulators of the proton conductance of hamster brown-fat mitochondria//Eur. J. Biochem. -1982. -V.129, N 2. -P.373-380.

128. Machovich R., Blasko G., Palosh A. Action heparin on thrombin-antithrombin reaction//Biochem. Biophys. Acta.-1975. -Vol.379. -P.193-200.

129. Macri F., Vianello A., Braidot E., Zancani M. Free fatty acids dissipate proton electrochemical gradients in pea stem microsomes and submitochondrial particles//Biochim. Biophys. Acta. -1991. -1050: P.249-255.

130. Makary A., Pataki M., Kolthay E. et al. A heparin hatasaaz aortatal prosztaciklin termlesere hazinyulon//Kiserl.Orvostub.- 1985. -Vol.37, N4. -P.405-407.

131. Martinez M., Mougan I., Roig M., Ballabriga A. Blood polyunsaturated fatty acids in patiens with peroxsisomal disoders. A multicenter study//Lipids. -1994.-29, N4. -P.273-280.

132. Ma Shu Ching, Yang Victor C. Applications of affinity binding to the development of heparin removing and sensing devices//Mol. Interact. Biosep. 1993. P.451-468. //Chem.Abstr. -Vol.121. -1994. -263344q.

133. Miwa H., Yamamoto M., Nishida T. et al. High-performance liquid chromatographic analysis of serum long-chain fatty acids by direct derivatization method// J. Chromatography. -1987. -V. 416. -P. 237-245.

134. Moser H. W., Moser A. B. Very long-chain fatty acids in diagnosis, pathogenesis and therapy of peroxisomal disorders//Lipids. -1996. -V.31,N3. -P.141-145.

135. Odegard O.R., Abildgaard U. Antithrombin III: Critical review of assay methods//Haemostasis. -1978, N7. -P.127-134.

136. Passow H., Schnell K.F. Chemical modifiers of passive ion permeability of the erythrocyte membrane//Experientia. -1969. -V.25. -P.460.

137. Piper H.M., Sezer O., Scwartz P., Hutter J.F., Spieckermann P.G. Fatty acid-membrane interaction in isolated cardiac mitochondria and erythrocytes //Biochim. et biophys. acta. -1983. -V.732, N 1. -P. 193-203.

138. Post R.L., Albright C.D., Dayam K. Resolution of pump and leak components of sodium and potassium ion transport in human erythrocytes//!. Gen. Physiol. -1967. -V.50. -P.1201-1220.

139. Raddoff S., Danishefsky I. Distribution of glucuronic and iduronic acid units in heparin chains//J. Biol. Chem. -1985. -Vol.260, N 28. -P.1506 -1511.

140. Ramsay B., Curtis J.R., Mancu M.S. et al. Grossly abnormal fatty acid content of red blood cells in haemodialysis patiens//3Rd Int. Congr. Essent. Fatty Acids and Eicisanoids, Adelaide, 1-5 March, 1992:Program and Abstr. -Aelaide,1992. -P.27.

141. Regelson W., Marahan P., Kaplan A. The role of molecular weight in pharmacologic and biologic activity of synthetic polyanions //Polyelectrolytes and their applications.-Dordrecht.-1975 .-P.131-141.

142. Renooij W., Golde L.M.G. van, Zwaal R.F.A. et al. Preferential incorporation of fatty acids at the inside of hunan erythrocyte membranes//BBA. -1974. -V. 363. -P. 287-292.

143. Riesenfeld J. Biosinthesis of heparin//Heparin. New biochemical and medical Aspects.- Berlin New-York.- 1982,-P.35-42.

144. Robinson J.D. Cation interaction with different functional states of the Na + ,K + -ATPase//Ann. N.-Y. Acad. Sci. -1974. -V.242. -P. 185-202.

145. Rosenberg R.D. Chemistry of the hemostatic mechanism and its relationship to the action of heparin //Red. Proc. -1977. -Vol.36. -P.10-18.

146. Rothstein A., Grinstein S., Ship S., Knauf P.A. Assimetre of functional sites of the erythrocyte anion transport protein//Trends Biochem. Sci. -1978. -V.3, N6. -P.126-128.

147. Saxton M.J. The membrane skeleton of erythrocytes: models of its effect on lateral diffusion//Int. J. Biochem. -1990. -V.22, N 8. -P.801-809.

148. Scarpra A., Cecchetto A., Azzone G.F. The mechanism of anion translocation and pH equilibration in erythrocytes//Biochim. Biophys. Acta.-1970. -V.219. -P.179-188.

149. Seeman Ph.M. Membrane stabilization by drugs: tranqvilizers, teroids and anesthetics//J. Int. Rev. Neurobiol. -1966. -V.91. -P. 145- 222.

150. Sharpe M.A., Cooper C.E., Wriglessworth J.M. Transport of K and other cations across phospholipid membranes by nonesterified fatty acids//J. Membrane Biol. -1994. -141, N 1. -P.21-28.

151. Simpson R.J., Moore R., Peters T.J. Significance of nonesterified fatty acids in irone uptake by intestinal brush-border membrane vesicles //Biochim. Biophys. Acta.-1988. -V.941, N 1. -P.39-47.

152. Smith G.F. The heparin-thrombin complex in the mechanism of thrombin inactivation by heparin//Biochem.Biophys.Res.Commun. -1977. -Vol.74. -P.l 11-117.

153. Skou J.C. Effect of ATP on Na : K. Affinity and catalitic activity of Na + , K + -activated enzyme system//Ann. N.-Y. Acad. Sci. -1974. -V.242. -P. 168184.

154. Skuridin S., Damaschun H., Damaschun G. et al. Polymer Condensed DNA: A Study by Small-Angle X-ray Scattering, Intermediate-Angle X-ray Scattering, and Circular Dichroitic Spectroscopy //Studia biophysica. -1986. -V. 112, N2-3. -P. 139-150.

155. Skuridin S.G., Hall J., Turner A.P.F., Yevdokimov Yu.M. Restructuring space ordering of (DNA-protamine) complexes in liquid crystalline dispersionsunder proteolytic enzyme treatment//Liquid Crystals. -1995. -V. 19, N5. -P. 595602.

156. Skuridin S.G., Yevdokimov Yu.M., Efimov V.S. et al. A new approach for creating louble-stranded DNA biosensors//Biosensors and Bioelectronics. -1996. -V. 11, N9. -P. 903-911.

157. Spaethe R., Naumann M., Straub J. Determination of heparin by fluorogenic synthetic substrate/Heparin. New Biochemical and Medical Aspects.-Berlin -New-York.- 1982,-P.103-115.

158. St.-Onge D., Gicquand C. Researh on the mechanizm of interaction between actin and membrane lipids//Biochem. Biophys. Res. Commun. 1990. -Y.167, N 1. -P.40-47.

159. Tamura A., Morita K., Fujii T., Kojima K. Detection of the electrical surface charge induced by treatment of the membrane lipid bilayer of human erythrocites//Cell. Struct. Funct. -1982.-V.7, N 1.-P.21-27.

160. Teien A.M., Lie M. Heparin assay in plasma a comparison of five clotting methods//Trombosis Research. -1975. -V. 7. -P. 777-788.

161. Wang F., Liu L. Research status and developing trends of some biochemichal drugs//Zhongguo Jiyao Gongye Zazhi.- 1994.- Vol.25, N1.- P.38-41 //Chem. Abstr.- 1994. -Vol. 121.- P. 101 a.

162. Wilschut J., Scholma J., Eastman S.J. et al. Ca -induced fusion of phospholipid vesicles containing free fatty acids: modulation by transmembrane pH gradients//Biochem. -1992. -V.31. -P.2629-2636.

163. Winkler E., Klingenbesrg M. Effect of fatty acids ontransportactivity of the reconstituted uncouling protein//J. Biol. Chem. -1994. -269, N 4. -P.2508-2515.

164. Wojtczak L. Effect of fatty acids and acyl-CoA on the permeability of mitochondriical membranes to monovalent cations//FEBS Lett. -1974. -V.44, N 1. -P.25-30.142

165. Wrigglesworth J.M., Cooper C.E., Sharpe M.A., Nicholls P. The proteoliposomal steady state: effect of size, capacitance and membrane permeability on cytochrome-oxidase inducedion gradients//Biochem. J. -1990. -V.270, N 1. -P.109-118.

166. Yevdokimov Yu.M., Skuridin S.G., Salyanov V.I. The Liquid-Crystalline Phases of Double-Stranded Nucleic Acids in vitro and in vivo. Liquid Crystals. -1988. -V. 3,N11. -P. 1443-1459.