Изучение генетического контроля RecA-независимой индукции профага λ тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Розанов, Дмитрий Вячеславович

• Розанов, Дмитрий Вячеславович
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Розанов, Дмитрий Вячеславович

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ: "Адаптация клеток Escherichia coli

к воздействиям окружающей среды"

1. Введение

2. Схемы сигнальной трансдукции в бактериях

2.1. Внутриклеточная передача сигналов через коммуникативные

модули

2.2. Фосфорилирующие активности сенсоров и эффекторов

2. 3. Сигнальные свойства сенсоров и эффекторов

2. 4. Осморегуляция

2. 5. Ассимиляция азота

2. 6. Хемотаксис

3. Регуляция синтеза капсульного полисахарида в. клетках

Escherichia coli К12

3.1. Введение

3. 2. Регуляция: обзор

3.3. RcsB и RcsC составляют двухкомпонентную регуляторную

систему

3. 4. Lon расщепляет RcsA

3.5. RcsA взаимодействует с RcsB для стимуляции транскрипции

генов cps

3.6. Модель синтеза клеточной капсулы

4. SOS ответ клеток Escherichia coli

4. 1. Введение

4. 2. SOS система

4. 3. Развитие модели регуляции SOS системы

4. 4. Тонкая настройка SOS системы

5. Выживание клеток при голодании и стрессах в стационарной фазе

развития

5.1. Введение

5. 2. Ген rpoS кодирует регулятор стационарной фазы, имеющий

сходство с вегетативными а факторами

5. 3. RpoS-зависимые гены и их клеточные функции

5. 4. Как RpoS контролирует генную экспрессию

5. 5. Перспективы

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Среды и химические вещества

2. Бактериальные штаммы и бактериофаги

3. Плазмиды

4. Перенос мутации из плазмиды в хромосому

5. Спот-тест и количественное определение эффективности индукции

профагаА

6. Определение эффективности адсорбции фага к

III. РЕЗУЛЬТАТЫ

1. Выделение неиндуцибельных (1псГ) мутантов, генетическое

картирование мутаций и комплементационный анализ

2. Клонирование генов Escherichia coli, чья сверхэкспрессия приводит к

11есА-независимой индукции профага X

2. 1. Избыток ЯсэА и БбгА в клетке приводит к ЯесА-независимой

индукции профага X

2. 2. Эффект сверхпродукции ЯсэА и ЭбгА на индукцию других

лямбдоидных профагов

2. 3. Количественное определение эффективности ЯесА-независимой

индукции профага X

2. 4. Роль генов г а-А, гс$В и (кгА в ЯесА-независимой индукции

профага X

2. 5. Эффект сверхпродукции репрессора фага X на индукцию

лямбдоидных профагов посредством системы ЯсзАВС

2. 6. Механизм индукции профага X посредством ЯсбА и БбгА РНК

IV. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ЛИТЕРАТУРА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение генетического контроля RecA-независимой индукции профага λ»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Взаимоотношения фага X и клеток Escherichia coli являются наиболее детально изученным примером взаимодействия вируса с клеткой-хозяином. Достигнутые в этой области успехи связаны с тем, что и фаг X, и клетки Е. coli являются одними из наиболее подробно исследованных с генетической точки зрения организмов. Умеренные бактериофаги способны развиваться двумя способами, а именно: лизировать чувствительные клетки или идти по лизогенному пути развития, при котором фаговый геном поддерживается в клетке в неактивном состоянии посредством репрессии его генов одним или несколькими репрессорами (Lamont et al., 1989; Roberts and Devoret, 1983).

Открытие, что облучение УФ светом лизогенных клеток приводит к индукции некоторых профагов (Lwoff, 1953; Lwoff et al., 1950), было крупным научным достижением, положившем начало изучению механизма индукции профага. С этого времени усилиями многих исследователей был установлен механизм индукции профага посредством УФ света и других воздействий на клетку, вызывающих повреждения в ДНК или задерживающих репликацию, и, как следствие этого, приводящих к появлению одноцепочечной ДНК (Gimble and Sauer, 1986; Little, 1991; Roberts and Devoret, 1983; Walker, 1984, 1996). При этих условиях индуцируется SOS ответ. Белок RecA, активированный одноцепочечной ДНК, способствует автопротеолитическому расщеплению некоторых фаговых репрессоров, также как и расщеплению клеточного репрессора SOS генов, белка LexA. SOS система и SOS-индуцибельные умеренные фаги описаны для многих бактерий (Roberts and Devoret, 1983; Walker, 1996). Во всех этих случаях SOS система является основной системой спонтанной индукции

профагов, которая, по крайней мере в лабораторных условиях, сильно снижается в клетках, несущих мутацию в гене recA (Lamont et al., 1989; Roberts and Devoret, 1983).

Предполагается, что индукция профага, опосредованная SOS системой, служит цели спасения фага, когда клетке грозит гибель при возникновении повреждений в ДНК. В настоящее время известны воздействия окружающей среды, такие как осмотический шок, изменение кислотности среды и т. д., которые не действуют на ДНК, но являются также губительными для клетки. Можно допустить, что такие стрессы способны вызывать индукцию профагов посредством клеточных систем, отличных от SOS системы. Это косвенно подтверждается фактом наличия умеренных бактериофагов, которые не являются SOS-индуцибельными, а в их лизогенных клетках отмечена спонтанная индукция. Хорошо известными примерами таких фагов Е. coli являются Mu и Р2.

Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы заключалась в поиске генов Е. coli, чьи продукты участвуют в предполагаемой RecA-незавиеимой индукции профага X. Работа строилась исходя из двух допущений, Во-первых, снижение эффективности индукции профага A,cI857ts, репрессор которого является резистентным к действию RecA, могло бы отражать дефект в клеточном гене, чей продукт необходим для RecA-незавиеимой индукции профага. Во-вторых, трансформация клеток плазмидой, которая содержит ген предполагаемого индуктора, могла бы имитировать условия окружающей среды, необходимые для активации синтеза этого индуктора, и приводить к RecA-незавиеимой индукции профага. В соответствии с данной целью были поставлены следующие задачи исследования:

-выделение мутантов Е. coli К-12, в которых снижена индукция профага XcI857ts; -генетическое картирование мутаций и комплементационный анализ;

-получение банка генов in vivo, трансформация им клеток индикаторного штамма и отбор

клонов с фенотипом Ind+; -рестрикционный анализ клонированных генов, идентификация их продуктов и секвенирование;

-получение банка генов in vivo, трансформация им клеток индикаторного штамма и

отбор клонов с фенотипом Ind+; -рестрикционный анализ клонированных генов, идентификация их продуктов и секвенирование;

-инактивация клонированных генов in vitro, перенос полученных мутаций в хромосому

и комплементационный анализ; -проверка влияния RecA-незавиеимой системы Е. coli, вызывающей индукцию профага

X, на стабильность других лямбдоидных профагов; -проверка влияния увеличенной дозы гена репрессора фага X на

эффективность RecA-незавиеимой индукции; -тестирование на индуцибельность профагов kind при действии RecA-незавиеимой системы.

Новизна результатов. Впервые предложен прямой метод отбора клонированных бактериальных генов, чья сверхэкспрессия влияет на стабильность профага X. В работе впервые выявлена адаптационная система клеток Е. coli, отличная от SOS системы, которая отвечает за RecA-независимую индукцию лямбдоидных профагов. Показано, что гены, вовлеченные в RecA-незавиеимую индукцию профагов, являются ранее идентифицированными генами г es А и dsrA, чьи продукты участвуют в позитивной регуляции синтеза капсульного полисахарида клетки, колановой кислоты (Gottesman, 1995; Gottesman and Stout, 1991; Gottesman et al., 1985; Sledgjeski and Gottesman, 1995; Stout et al., 1991). Комплементационный анализ показал, что: 1. RcsA вызывает индукцию профага в экспоненциальной фазе клеточного роста и его действие зависит от наличия в клетке интактной аллели гена г es В. Ген rcsB также кодирует позитивный регулятор синтеза клеточной капсулы. По-видимому, механизмы активации синтеза

капсульного полисахарида и индукции профага X имеют общие регуляторные стадии; 2. DsrA вызывает RecA-незавиеимую индукцию профага X по двум различным путям. В экспоненциально растущих клетках индукция профага зависит от RcsA и RcsB и происходит, по-видимому, через опосредованную DsrA активацию транскрипции res А. При входе клеток в стационарную фазу развития индукция профага посредством DsrA идет независимо от наличия мутаций в генах rcsA и rcsB. На основании данных об эффективности RecA-независимой индукции профага X при увеличенной дозе гена репрессора фага в клетке был сделан вывод, что индукция посредством системы RcsABC идет или через инактивацию репрессора, или через снижение его синтеза. Исходя из анализа эффективности RecA-незавиеимой индукции профагов Xind было предположено, что индукция посредством RcsA в экспоненциальной фазе клеточного роста идет через инактивацию репрессора, возможно, альтернативной RecA протеазой, в то время как индукция посредством DsrA при входе клеток в стационарную фазу развития происходит, по-видимому, на транскрипционном уровне.

Научно-практическая значимость работы и практическое использование результатов. Результаты изучения генетического контроля индукции профагов в клетках Е. coli позволяют выявлять новые регуляторные гены, а также новые функции продуктов известных регуляторных генов клетки-хозяина. Разработанный подход может быть применен к широкому классу бактерий, для которых известны умеренные фаги.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференции молодых ученых ГНИИгенетики (1997).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 228 наименований. Диссертация содержит 9 рисунков и 8 таблиц.

s

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Адаптация клеток Escherichia coli к воздействиям окружающей среды 1. Введение

Жизнь бактерий, как и всего микробного мира, во многом зависит от окружающей среды. Различные природные вещества непрерывно воздействуют на микроорганизм: вид питательного вещества непредсказуем и его концентрация часто бывает недостаточной для роста, возможные конкуренты за их использование могут быть в любом месте нахождения клетки. При возникновении угрозы жизни клетки ее выживание зависит от способности приспосабливаться к природным условиям и быстрой реакции на их изменения. При наличии таких селективных факторов не удивительно, что бактерии в процессе эволюции приобрели различные сигнальные системы, реагирующие на состояние окружающей среды (Bourret et al., 1991; Parkinson, 1993; Parkinson and Kofoid, 1992; Ronson et al., 1987; Stock et al., 19896, 1990, 1991). Одной из впечатляющих способностей бактериальных клеток является их движение или миграция в направлении более предпочтительного окружения. Способная к движению клетка проявляет локомоторные ответы при появлении различных стимулов, которые представляют собой: воздействия химических веществ, свет, осмотическое давление, температуру и электрическое или магнитное поле. Таким образом, бактерии могут активно искать оптимальные для жизни условия.

В добавление к миграции бактериальные клетки проявляют множество регуляторных ответов, позволяющим им адаптироваться в данном природном окружении. Появление в окружающей среде новых питательных веществ и

метаболитов, например, включает клеточный аппарат, необходимый для их транспорта и утилизации. Стрессовые условия различного сорта, такие как: голодание, действия антибиотиков, тяжелых металлов, ДНК-повреждающих веществ и т. д., вызывают изменения в генной экспрессии, приводящие, в свою очередь, к индукции различных ответов клетки, необходимых для ее выживания.

Генетические эксперименты последних лет показали, что многие бактериальные ответы, названные адаптивными ответами, контролируются, по крайней мере частично, двухкомпонентными регуляторными системами или сенсорными системами (Bourret et al., 1991; Parkinson, 1993; Parkinson and Kofoid, 1992; Ronson et al., 1987). Один компонент такой системы, сенсор, передает принятый из окружающей среды сигнал второму компоненту, эффектору, который обычно непосредственно влияет на генную экспрессию.

Клеточный аппарат, контролирующий проявление адаптивных ответов, выполняет задачи, которые являются фундаментальными для всех сенсорных систем: детекция стимулов окружающей среды, сигнальный процессинг (амплификация и интеграция входящего сигнала) и активация соответствующего регуляторного ответа. Сенсорные системы прокариот являются не только удобными для обработки моделями при исследовании молекулярной основы явлений, происходящих при активации адаптивного ответа клетки, но также помогают в понимании общей внутренней структуры клеточных сигнальных механизмов. Данный обзор коснется трех хорошо изученных сенсорных систем клеток Escherichia coli и Salmonella typhimurium, иллюстрирующих свойства и молекулярные механизмы действия бактериальных сигнальных белков. Все три системы, контроль соотношения поринов во внешней мембране, регуляция экспрессии гена глутамин синтетазы и хемотаксис, используют коммуникативные модули, что является всеобъемлющей сигнальной стратегией в

прокариотах. Подобно эукариотам бактерии в своих сенсорных системах используют обратимое фосфорилирование, характерное при регуляции всех известных адаптивных ответов.

После рассмотрения модели двухкомпонентных систем в обзоре будет представлен механизм контроля синтеза капсульного полисахарида в клетках Е. coli, который, по крайней мере частично, опирается на данную модель регуляции генной экспрессии, а также SOS система, работающая при повреждениях в ДНК, и ответы клетки на губительные воздействия в стационарной фазе развития. Механизмы регуляции SOS ответа и клеточных ответов в стационарной фазе не включают двухкомпонентную систему, типа сенсор-эффектор.

2. Схемы сигнальной трансдукции в бактериях

2.1. Внутриклеточная передача сигналов через коммуникативные модули

Адаптивные ответы в бактериях варьируют от быстрого и кратковременного изменения в уровне транскрипции отдельных генов до глобальных реорганизаций в генной экспрессии и клеточной морфологии. Сигналы из окружающей среды влияют на активности регуляторных белков и вызывают специфичный для данного сигнала тип ответа. Многие из бактериальных сигнальных белков содержат два характерных мотива первичной структуры, служащих для приема и передачи сигнала (Parkinson, 1993; Parkinson and Kofoid, 1992). Эти мотивы первичной структуры, называемые коммуникативными модулями, способствуют сигнальным трансдействиям внутри белка и между белками. Коммуникативные модули работают в комбинации с доменами для приема и передачи сигнала в других белках, что приводит к построению

и

сигнальных цепей различных конфигураций. Наиболее простая цепь включает два белковых компонента: сенсор, часто расположенный в цитоплазматической мембране, имеет домен, реагирующий на природный стимул, и цитоплазматический регулятор клеточного ответа, называемый эффектором, который определяет специфичный адаптивный ответ, в основном, через влияние непосредственно на генную экспрессию (рис. 1).

Рис.1. Контрольные элементы двухкомпонентных сигнальных систем.

Сигнал идет от сенсора к эффектору через контроль одного домена другим без образования ковалентных связей (пунктирные стрелки) и через реакции фосфорилирования между коммуникативными модулями. Условное изображение прямоугольником и овалом передающих сигнал и принимающих сигнал модулей соответственно будет использоваться в последующих рисунках.

Сенсоры обычно содержат С-концевой передающий сигнал модуль, сопряженный с М-концевым принимающим сигнал доменом. Эффекторы содержат Ы-концевой модуль для приема сигнала, сопряженный с одним или несколькими С-концевыми доменами, служащими для выхода сигнала, т. е. непосредственно взаимодействующими с клеточными регуляторными элементами для установления уровня генной экспрессии. При появлении сигнала окружающей среды приемный домен сенсора изменяет активность модуля сенсора, ответственного за передачу сигнала, который, в свою очередь, определяет взаимодействие сенсора с соответствующим эффектором. Приемный модуль эффектора реагирует на сигнал сенсора и изменяет активность

сенсор

эффектор

сигнал на входе

сигнал на выходе

домена эффектора, ответственного за выход сигнала, для активации соответствующего ответа клетки (рис. 1).

При сигнальной трансдукции только процесс коммуникации сенсора с эффектором включает реакции фосфорилирования и дефосфорилирования. Данные реакции позволяют сенсорам регулировать степень фосфорилирования соответствующих эффекторов. Степень фосфорилирования эффектора определяет активность домена эффектора, служащего для выхода сигнала. Схожесть функций различных сенсоров и эффекторов, а также большая степень нуклеотидной гомологии их генов свидетельствуют о том, что обратимая реакция фосфорилирования широко используется при сигнальной трансдукции в бактериальном мире (Bourret et al., 1991; Parkinson and Kofoid, 1992; Ronson et al., 1987).

2.2. Фосфорилирующие активности сенсоров и эффекторов

Сенсоры регулируют степень фосфорилирования эффекторов двумя способами. Во-первых, они имеют автокиназную активность, которая необходима для присоединения фосфата от АТФ к своему гистидиновому остатку (Hess et al., 1988а; Ninfa and Bennett, 1991). Данная реакция фосфорилирования легко обратима. Ее продукт, фосфогистидин, служит как высоко энергоемкий промежуточный элемент для последующего перемещения фосфата к остатку аспартата в эффекторе (Sanders et al., 1989, 1992). Во-вторых, некоторые, возможно многие, сенсоры имеют очевидную фосфатазную активность, проявляющуюся на соответствующих им эффекторах (Aiba et al., 19896; Igo et al., 1989; Keener and Kustu, 1988; Ninfa and Magasanik, 1986). Природные стимулы приводят к преимущественному проявлению одной из этих

активностей сенсоров для установления степени фосфорилирования соответствующих эффекторов.

Сенсоры, вероятно, функционируют как димеры с каталитическим сайтом в одной субъединице, фосфорилирующим акцепторный сайт в другой субъединице (Swanson et al., 1993; Wolfe and Stewart, 1993; Yang and Inouye, 1991). Мало известно о вторичной и третичной структурах сенсоров, но анализ первичной структуры позволил сделать некоторые заключения об их функциональной архитектуре (Parkinson and Kofoid, 1992). Известно более 50 белков, содержащих модуль для передачи сигнала. Сравнение их аминокислотных последовательностей показало, что эти модули состоят приблизительно из 240 аминокислот и имеют несколько консервативных участков (рис. 2). Гистидиновый фосфорилируемый сайт обычно расположен вблизи N-конца соответствующего модуля. За исключением данного консервативного участка оставшаяся часть N-конца вариабельна у различных сенсоров. Этот район, возможно, содержит специфичные детерминанты, необходимые сенсору для обнаружения соответствующего эффектора, но экспериментальных доказательств этому предположению еще нет. Четыре участка аминокислотной последовательности в С-конце, по-видимому, образуют каталитический центр. Различные замещения аминокислот внутри данных консервативных районов снижают или полностью подавляют автокиназную активность (Oosawa et al., 1988; Yang and Inouye, 1991). Два из этих сегментов насыщенны глицином и имеют сходство с ДНК-связывающими мотивами других белков (Parkinson, 1993).

Модуль для передачи

(Т)

Е

-240АК

G1 F G2

Модуль для приема сигнала

(R)

DD

~120АК

состояние фосфорилирования

I автофосфорилирование

АТФ

"фосфатаза" (АТФ)

Н

АДФ X ®

СЕ>

d

дефосфорилирование

/

Pi

CD

фосфорилирование

Рис. 2. Свойства аминокислотных последовательностей и фосфорилирующие активности коммуникативных модулей.

Участки аминокислотных последовательностей, наиболее характерные для передающих и принимающих сигнал модулей, представлены черными сегментами, толщина которых грубо пропорциональна длине данного участка. Каждый сегмент отмечен своей наиболее консервативной аминокислотой. Детали реакций фосфорилирования обсуждаются в тексте.

Как предполагается, фосфогистидиновые остатки сенсоров служат как субстраты при фосфорилировании эффекторов (Hess et al., 1988а; Sanders et al., 1989). Эффекторы могут сами себя фосфорилировать, используя также малые донорные молекулы, такие как ацетил фосфат или фосфорамидат (Feng et al., 1992; Lukat et al., 1992). In vivo эффектор, вероятно, фосфорилирует себя посредством катализа переноса фосфата от соответствующего сенсора и в некоторых случаях от малых донорных молекул,

подобных ацетил фосфату. Одновременно эффекторы катализируют гидролитическое отщепление своих фосфатов (Hess et al., 19886; Weiss and Magasanic, 1988) с периодом полураспада от нескольких секунд до многих минут. Характерное время существования фосфорилированных эффекторов, очевидно, является ключевым фактором в их сигнальной роли in vivo, так как мутации, которые изменяют скорость дефосфорилирования, приводят к нарушению их регуляторных функций (Aiba et al., 19896; Bourrett et al., 1990). Наблюдаемая фосфатазная активность некоторых сенсоров, возможно, является следствием увеличения дефосфорилирующей способности соответствующих эффекторов по аллостерическому механизму. Фосфатазная активность сенсоров является АТФ-зависимой, но не участвующий в гидролизе АТФ функционирует также как кофактор, возможно, как конформационный эффектор (Aiba et al., 19896; Igo et al., 1989; Keener and Kustu, 1988; Ninfa and Magasanik, 1986).

Принимающие сигнал модули эффекторов состоят приблизительно из 120 аминокислот. В отличие от модулей сенсоров, передающих сигнал, их структура исследована более подробно. Изучения с помощью рентгеновского излучения белков CheY S. typhimutium (Stock et al., 1989a) и E. coli (Volz and Matsumura, 1991), которые соответствуют индивидуальным модулям для приема сигнала, свидетельствуют о подобном цилиндру построении пяти наборов чередующихся ß-слоев и a-спиралей. Эти белки имеют гидрофобную внутреннюю сердцевину, сформированную из ß-слоев, окруженную с внешней стороны а-спиралями. Аминокислотные остатки, важные для реакции фосфорилирования, расположены на одном конце цилиндра. Они представляют собой два аспартата вблизи N-конца (Bourrett et al., 1990; Brissette et al., 1991; Stewart et al., 1990), лизин рядом с С-концом (Lukat et al., 1991; Stewart, 1993) и аспартат, который расположен в центре аминокислотной последовательности, и, который является сайтом фосфорилирования

(Sanders et al., 1992, 1989) (рис. 2). Эти и другие характерные свойства структуры молекулы отмечены для более чем 90 известных эффекторов и свидетельствуют, что все модули, принимающие сигнал от сенсора, возможно, представляют собой а/р-цилиндры, подобные CheY (Stock et al., 1989a).

2.3. Сигнальные свойства сенсоров и эффекторов

Большинство сенсоров пересекают цитоплазматическую мембрану, выходя в цитоплазму своим передающим сигнал модулем. Сенсоры обычно содержат два сегмента, проходящих через мембрану и фланкирующих домен, служащий для приема сигнала из окружающей среды. Этот домен, таким образом, находится в периплазматическом пространстве между внутренней мембраной и клеточной стенкой. Принимающие сигнал домены различных сенсоров структурно отличаются друг от друга, отражая разнообразие природных сигналов, на которые они реагируют. Некоторые из них имеют ярко выраженные лиганд-связывающие свойства, хотя большинство еще плохо характеризовано, часто из-за незнания точной природы стимула, определяющего их активность. Взаимодействие принимающего сигнал домена с цитоплазматическим передающим информацию модулем, свидетельствует о переходе сигнала через цитоплазматическую мембрану. Небольшое число сенсорных белков, например NtrB (см. ниже), гидрофильны и содержат N-концевые домены, которые, возможно, играют роль в приеме сигнала.

Все эффекторы являются цитоплазматическими белками. В большинстве случаев их домены, служащие для выхода сигнала, имеют ДНК-связывающие или другие регуляторные функции, которые обеспечивают транскрипционный контроль одного или нескольких генов. Модуль и домен эффектора, ответственные за вход и выход

сигнала соответственно, обычно соединены между собой эластичными линкерами (Wootton and Drummond, 1989). Такая гибкая взаимосвязь, возможно, играет важную роль при передаче сигнала от приемного модуля к домену, влияющему на генную экспрессию. Изучения белков CheY с помощью ядерного магнитного резонанса свидетельствуют, что фосфорилирование индуцирует существенные конформационные изменения в эффекторе (Hazelbauer et al., 1993), но как это ведет к получаемому в результате контролю генной экспрессии - не ясно. С одной стороны, фосфорилирование, возможно, способствует ассоциации или диссоциации принимающих сигнал модулей эффекторов, приводя к изменениям четвертичной структуры белка, которая, в свою очередь, определяет его регуляторную активность. С другой стороны, фосфорилирование, возможно, модулирует прямые взаимодействия между модулем и доменом эффектора, служащих для приема и выхода сигнала соответственно, в результате которого увеличивается или уменьшается их функциональная активность. Любая из этих моделей основывается на наличии гибкой связи между модулем и доменом эффектора.

Так как окружающая среда влияет на активности передающих и принимающих информацию модулей, они, как регуляторные элементы, идеально подходят для построения сигнальных путей. Сигнальные характеристики основанных на таких модулях конструкций зависят от большого числа параметров, которые включают чувствительность к природному стимулу, исходную и стимулированную скорости переноса фосфата сенсором, а также время пребывания в активированном состоянии сенсора и эффектора (рис. 3).

Однако специфичность процесса переноса фосфата играет первостепенную роль. Клетки Е. coli содержат около 50 известных пар сенсор-эффектор и приблизительно такое же количество сигнальных путей (Parkinson and Kofoid, 1992; Stock et al., 1990).

Неправильное перекрестное взаимодействие (кросс-взаимодействие) между ними сведено до минимума, что свидетельствует о точном соответствии эффекторов своим сенсорам. Нефосфорилированный эффектор, вероятно, соединяется с соответствующим фосфорилированным сенсором, катализирует перенос фосфата к своему акцепторному сайту и затем отходит от него. Перенос фосфата должен включать обратимую ассоциацию сенсора с эффектором посредством специфичного для них взаимодействия, но молекулярный механизм их узнавания еще не понят.

О

активация и / узнавание и дефосфорилирование и

автофосфорилирование / соединение дезактивация

входной / V / \

сигнал -

\ ■

0----

выходной сигнал

амплификация /V /

фосфоперенос и /

дезактивация '• разъединение активация

Рис. 3. Сигнальные трансдействия коммуникативных модулей.

Хотя каждая ступень является потенциально обратимой, переход информации случается только, если циклы идут в указанных направлениях. Продолжительность любой ступени, а особенно временные периоды нахождения белков в активированном состоянии, влияют на общие сигнальные характеристики регуляторных систем (фактор амплификации, скрытый период ответа, длительность ответа и т. д.). Активированные домены, служащие для входа и выхода сигнала, заштрихованы. Фосфорилированные формы модулей сенсоров и эффекторов, которые передают и принимают сигнал соответственно, затемнены. Фосфат обозначен как темный круг в центре фигуры. Эти условные обозначения используются в последующих рисунках.

2. 4. Осморегуляция

Клетки Е. coli, как и другие грамотрицательные бактерии, имеют две клеточные мембраны. Внутренняя или цитоплазматическая мембрана представляет собой главный проницаемый барьер клетки. Внешняя мембрана не пропускает макромолекулы, но содержит большое количество пор, пропускающих посредством пассивной диффузии небольшие молекулы в периплазматическое пространство. Основные пориновые белки, OmpF и ОшрС, сходны в структуре, но имеют различные свойства. OmpF образует отверстие во внешней мембране немного большего размера, чем это делает ОшрС. Хотя общее число пор во внешней мембране остается в известной степени постоянным, относительные количества OmpF и ОшрС изменяются в зависимости от осмотического давления среды. OmpF преимущественно синтезируются при низком осмотическом давлении, а ОтрС - при высоком (Igo et al., 1990; Mizuno and Mizushima, 1990).

Сигнальная система, которая реагирует на осмотическое давление и регулирует экспрессию локусов ompF и отрС, представляет собой наипростейшую систему, основанную на коммуникативных модулях (рис. 4). Она имеет два компонента: EnvZ, сенсор, находящийся во внутренней мембране, и OmpR, цитоплазматический регулятор клеточного ответа. EnvZ содержит С-концевой передающий сигнал модуль и N-концевой периплазматический домен, фланкированный пересекающими мембрану сегментами. Как предполагается, периплазматический домен служит для приема сигнала при изменениях осмотического давления среды (Tokishita et al., 1991), но механизм его работы остается пока не ясным. Прокаин, который представляет собой местное анестезирующее вещество, встраивается в мембранные бислои и защищает клетку от действия высокого осмотического давления (Rampersaud and Inouye, 1991). Данный факт свидетельствует, что EnvZ может каким-то образом реагировать на

искривления мембраны или изменения в ее текучести. В любом случае, изменения осмотического давления среды приводят к переключению регуляторных ответов посредством изменения относительных величин фосфатазной и автокиназной активностей EnvZ (Aiba et al., 1989a; Forst et al., 1989; Igo et al., 1989).

периплазматическое пространство

цито плазматическая мембрана

EnvZ

о с мотиче ское

давление среды РИС. 4. ОсМОрегуЛЯТОрнаЯ

система в клетках Е. coli. Регуляторная пара EnvZ и OmpR составляет одну из нескольких систем клеток Е. coli, реагирующих на изменения осмотического давления среды. Осмотический стресс влияет на соотношение фосфатазной (Р) и автокиназной (К) активностей EnvZ для установления степени

фосфорилирования OmpR. OmpR непосредственно контролирует экспрессию генов ompF и отрС на транскрипционном уровне. Стрелки со светлыми окончаниями обозначают регуляцию указанных сигнальных ступеней. OmpR может быть фосфорилирован при использовании других донорных молекул.

OmpR

другие фосфодоноры

регуляция экспрессии ompFn отрС

Высокое осмотическое давление способствует автофосфорилированию ОтрЛ, приводя к увеличению концентрации фосфорилированного ОтрЯ. Низкое осмотическое давление способствует дефосфорилированию фосфо-ОтрЛ. Киназная и фосфатазная активности ЕххчЪ, вероятно, отражают различные конформационные состояния белка (обозначены на рис. 4 как К и Р соответственно). Большое число мутаций в етХ, которые являются причиной нарушенной экспрессии ортПотрС, приводят к проявлению только одной из этих активностей ЬтЪ.

OmpR имеет N-концевой принимающий сигнал модуль и С-концевой ДНК-связывающий домен. Многие сайты связывания OmpR лежат выше по ходу РНК-полимеразы промоторных районов ompF и отрС (Rampersaud et al., 1989) и должны располагаться близко к -35 консенсус районам промоторов ompF и отрС для правильной их регуляции (Maeda and Mizuno, 1990). Данный факт свидетельствует, что OmpR контролирует транскрипцию, влияя на связывание РНК-полимеразы с промотором. Действительно, специфичные мутации в гене гроА, который кодирует а субъединицу РНК-полимеразы, влияют на OmpR-зависимую транскрипцию ompF и отрС (Slauch et al., 1991). Фосфорилированный и дефосфорилирофанный OmpR связывается с идентичными сайтами на ДНК, но фосфо-OmpR имеет намного большее к ним сродство (Aiba et al., 1989с). OmpR в нормальном состоянии является мономером, а фосфорилирование, возможно, способствует олигомеризации, приводя к усилению его связывания с тандемно расположенными сайтами (Nakashima et al., 1991). Генетические исследования in vivo свидетельствуют, что промотор ompF более эффективно активируется при низкой концентрации фосфорилированного OmpR, в то время как при высоком уровне фосфо-OmpR, промотор отрС активируется, а промотор ompF репрессируется (Russo and Silhavy, 1991; Slauch and Sihavy, 1989).

Экспрессия ompF и отрС при различных мутациях в генах envZ и ompR почти полностью согласуется с данной моделью, но одновременно отражает дополнительную, более сложную регуляцию этой сигнальной системы (Russo and Silhavy, 1991). Мутантный белок EnvZ, не имеющий фосфатазную активность, способствует синтезу ОтрС, но не OmpF, при любом осмотическом давлении, что свидетельствует о наличии в клетке высокого уровня фосфо-OmpR. Мутантный белок OmpR, который не может быть дефосфорилирован посредством EnvZ, вызывает сходный фенотип OmpF- OmpC+, а если мутация в ompR приводит к дефекту в автофосфорилировании, то клетки

приобретают фенотип OmpF" OrnpC". Однако, если в результате мутации EnvZ утратил киназную и фосфатазную активности, то клетки не приобретают сходный фенотип OmpF" OrnpC", а являются OmpF+ ОтрСГ, что свидетельствует о существовании низких уровней фосфорилирования OmpR (Russo and Silhavy, 1991). По-видимому, OmpR получает некоторые фосфаты из других источников (Forst et al., 1990), например, от небольших молекул, подобных ацетил фосфату, или даже от других киназ. Данное кросс-взаимодействие низкого уровня, возможно, отражает связь осморегуляторной системы с другими физиологически соответствующими сигнальными системами.

2.5. Ассимиляция азота

Бактерии усваивают азот в основном через синтез глутамина из глутамата и аммония. Истощение внутриклеточных резервов азота приводит к активации различных систем клетки, служащих для повышения его концентрации до уровня, достаточного для роста. Эти системы индуцируют синтез глутамин синтетазы, продукт гена glnA (Bourrett et al., 1991; Stock et al., 19896).

Ген glnA транскрибируется с двух промоторов: glnApl, нерегулируемый промотор с умеренной активностью и glriAp2, промотор, который сильно активируется при условиях нехватки азота. Сигнальная система, которая регулирует транскрипцию с промотора glnAp2, состоит из сенсора (NtrB или NRn), содержащего передающий сигнал модуль, эффектора (NtrC или NRi) с модулем для приема сигнала и двух добавочных компонентов (уридил трансфераза, уридин-удаляющий фермент [UT/UR] и белок Рц, являющийся субстратом уридил трансферазы) без каких-либо коммуникативных модулей (см. ниже и рис. 5). На рисунке показана упрощенная модель транскрипционной регуляции экспрессии glnA со множеством пропущенных

нюансов. Более полное описание данной модели можно найти в работах Воиггей е1 а1. (1991) и вЮск ег а1. (19896).

доступность азота

NtrB (NR„)

NtrC (NR!)

другие фосфодоноры

регуляция экспрессии glnA фосфодоноров.

Рис. 5. Нитрорегуляторная система клеток Е. coli.

Система NtrB-NtrC регулирует экспрессию гена глутамин синтетазы в ответ на изменения концентрации азота в клетке. Сигнальный аппарат многих других нитрорегуляторных ответов клеток Е. coli не показан. Уровень азота в клетке определяет относительные величины активностей уридил трансферазы, UT и UR, которые вызывают обратимую модификацию белка Рп. Белок Рц регулирует соотношение относительных величин фосфатазной (Р) и автокиназной (К) активностей сенсора NtrB, которые необходимы для установления степени фосфорилирования эффектора NtrC. Концентрация фосфо-NtrC определяет экспрессию гена глутамин синтетазы. Стрелки со светлыми окончаниями обозначают регуляцию указанных сигнальных ступеней. Цепь может также контролироваться посредством других

Эффектор NtrC содержит N-концевой принимающий сигнал модуль и два дополнительных домена, необходимые для активации транскрипции с промотора glnAp2 при использовании а54 РНК-полимеразы. С-концевой домен NtrC обеспечивает его связывание с короткими палиндромами, расположенными выше по ходу РНК-полимеразы (5') участка промотора (Ninfa et al., 1987; Sasse-Dwight and Gralla,

1988). Когда NtrC фосфорилирован и связан с этими сайтами, он способствует образованию открытых транскрипционных комплексов РНК-полимеразы и промотора glnAp2 (Popham et al., 1989). Эта реакция зависит от гидролиза АТФ, который, вероятно, катализируется центральным доменом NtrC (Weiss et al., 1991). Сайты связывания NtrC служат для стимуляции транскрипции. При их перемещении они продолжают функционировать на протяженных участках той же молекулы ДНК (Ninfa et al., 1987) и даже на другой молекуле ДНК, если она топологически связана с ДНК, содержащей промотор glnAp2 (Wedel et al., 1990). При достаточно высоких концентрациях NtrC в клетке его сайты связывания на ДНК уже становятся ненужными для активации транскрипции (Ninfa et al., 1987). Их целью, очевидно, является увеличение локальной концентрации NtrC на промоторе glnAp2 посредством его титрования в непосредственной близости от промотора или, если сайты расположены на удалении от промотора, через образование петли ДНК (Su et al., 1990). Транскрипционная активация посредством NtrC требует фосфорилирования его модуля, ответственного за прием сигнала (Ninfa and Magasanik, 1986). Нефосфорилированный NtrC существует в димерной форме и может связываться с единичными сайтами, но фосфорилирование сильно увеличивает его кооперативное связывание к тандемным сайтам посредством улучшенного взаимодействия между димерами NtrC (Weiss et al., 1992). Форма NtrC, способная к активации транскрипции, вероятно, является тетрамером (Feng et al., 1992; Weiss et al., 1991, 1992). Фосфорилирование, по-видимому способствует ассоциации принимающих сигнал модулей NtrC, что ведет к образованию тетрамеров.

NtrB контролирует степень фосфорилирования NtrC посредством своих киназной и фосфатазной активностей (Keener and Kustu, 1988; Ninfa and Magasanik, 1986; Weiss and Magasanik, 1988). Однако в отличие от EnvZ NtrB является цитоплазматическим белком

и реагирует на изменения в концентрации азота в клетке посредством внутреннего сенсорного аппарата, включающего белки UT/UR и Рц. Изменения концентрации азота приводят к модуляции активностей белка UT/UR, которые вызывают ковалентную модификацию Рц. При условиях нехватки азота UT/UR катализирует перенос уридина на Рц; при избытке азота UT/UR катализирует отщепление уридина от Рц. Баланс между относительными величинами UT- и UR-активностей зависит от соотношения в клетке концентраций глутамина к 2-кетоглутарату, что является индикатором достаточного или недостаточного уровня азота в клетке. Глутамин стимулирует реакцию UT (уридин переносится на Рц), а 2-кетоглутарат стимулирует реакцию UR (уридин удаляется с Рц). NtrB реагирует на состояние модификации Рц. Несодержащий уридин Рц взаимодействует с NtrB, что приводит к преимущественному проявлению фосфатазной активности NtrB в направлении NtrC (Ninfa and Magasanik, 1986; Keener and Kustu, 1988). Автокиназная активность NtrB преимущественно проявляется, когда Рц содержит уридин, и вообще отсутствует, если Рц инактивирован мутацией.

Можно ожидать, что мутации в ntrB будут приводить к снижению экспрессии gin А, но, на самом деле, этого не происходит. В действительности, NtrC, подобно OmpR, может получать фосфаты из различных источников. Ацетил фосфат, в частности, широко используется при фосфорилировании NtrC in vivo (Feng et al., 1992). Этот механизм скорее представляет широко используемую сигнальную модель (перекрестная регуляция или кросс-регуляция), чем неправильное кросс-взаимодействие (Wanner, 1992). Клетка имеет возможность не учитывать кросс-регуляторные сигналы через контроль фосфатазной активности NtrB.

2. 6. Хемотаксис

Клетки Е. coli перемещаются посредством вращающихся спиральных флагеллярных филамент, которые функционируют подобно винтам на корабле. Индивидуальная клетка может иметь шесть и более флагеллярных моторов, распределенных хаотично по всей клеточной поверхности. Хотя каждый флагеллярный мотор и вращается независимо, филаменты работают сообща, посредством гидродинамических сил образуют связку и вращаются в унисон сзади передвигающейся клетки. Вращение против часовой стрелки направляет клетку вперед; вращение по часовой стрелке разрушает связную работу филамент, вызывая поворот или хаотичное движение. При гомогенном окружении клетки дикого типа хаотично движутся в течении около одной секунды и каждый эпизод такого движения в основном наугад определяет направление следующего движения. Результатом является трехразмерное хаотичное движение, оптимальная стратегия для поиска новых источников питания (Jones and Aizava, 1991; Macnab, 1992).

Клетки E. coli предпочитают различные сахара и аминокислоты, а избегают жирных кислот, спиртов и других потенциально вредных веществ (Eisenbach, 1991; Manson, 1992). Хемотаксисные ответы имеют высокую степень чувствительности: клетки Е. coli легко обнаруживают изменения на 0.1% в микромолярной концентрации хемоэффектора (Segall et al., 1986). Благоприятные и вредные вещества обнаруживаются при помощи хеморецепторов, а не посредством их полезного или губительного влияния на клетку. Недавно было показано, что связанные с мембраной хеморецепторы распределены на небольших участках, часто на клеточных полюсах (Maddock and Shapiro, 1993; Shapiro, 1993). Функциональное значение такой скученности рецепторов неизвестно, но такое их расположение не может быть

использовано для сравнения концентраций веществ на противоположных концах клетки при выборе направления движения. Эукариотические клетки, возможно, используют свои сенсорные рецепторы для пространственного различения концентраций, но этого не могут делать бактерии. Их малый размер и высокая подвижность сводят на нет выгоду сенсорных стратегий, основанных на пространственных сравнениях (Berg, 1988). В действительности, бактериальные клетки определяют направление движения в химическом градиенте посредством измерения промежуточных изменений концентраций веществ во время их перемещения с места на место. Типичная скорость движения клеток Е. coli составляет 10-20 длин клетки в секунду. Сравнивая насыщенность хеморецепторов в данный момент с тем, что было несколько секунд назад, клетка способна делать измерения на протяжении дистанции, составляющей много длин ее тела (Segall et al., 1986). Благоприятные стимулы, такие как увеличение концентрации полезных веществ, уменьшают вероятность хаотичного движения и направляют клетку в сторону предпочтительного окружения. Однако из-за малого размера клетки ее движение постоянно испытывает на себе воздействие Бруоновского движения, и его направление никогда не может быть долго прямым. Таким образом, хемотаксисная миграция представляет собой процесс направленного перемещения, которое постоянно подвержено различным отклонениям в сторону из-за действия Бруоновского движения. Внутриклеточный сигнальный аппарат хемотаксиса показан на рис. 6.

химические стимулы

№ +А7Т

AdoMet

периплазматическое пространство

цитоплазматическая мембрана

сенсорная адаптация

регуляция вращения филамент

Рис. 6. Хемотаксисная система клеток Е. coli.

Сигнальная система регулирует ответы клетки на изменения в окружающей среде концентраций химических веществ, которые обнаруживаются посредством хеморецепторов класса МХБ. Другие типы сенсорных рецепторов, например, для глюкозы, маннита или кислорода, возможно, также проводят сигналы через эту систему, но точки их соединения не известны. Сигналы от рецепторов определяют скорость автофосфорилирования CheA, которая имеет ключевое

значение при модуляции дальнейшего переноса фосфата к СЬеУ и СЬеВ. Фосфо-СЬеУ контролирует вращение флагеллярных моторов, а фосфо-СЬеВ регулирует сенсорную адаптацию через изменение степени метилирования МХБ. Метальные группы обозначены темными ромбами; их число условно. Стрелки со светлыми окончаниями обозначают регуляцию указанных сигнальных ступеней. Аббревиатура т и прч относится к вращению по часовой- и против часовой стрелки соответственно.

В дополнение к различным семействам хеморецепторов, 6 цитоплазматических белков (СЬеА, СЬеВ, СЬеИ, СЬе\У, СЬеУ и СЪ.&) необходимы для процессинга сенсорной информации и передачи ротационных контрольных сигналов флагеллярным моторам. Такая сложная регуляция необходима клетке по нескольким причинам. Во-первых, из-за того, что Бруоновское движение может реориентировать их, клетки

требуют наличия скрытых состояний быстродействующих ответов, обеспечивая себя возможностью реагировать на большую часть поступающей информации. Хемотаксисные стимулы переключают моторные ответы менее чем за 200 миллисекунд (Segall et al., 1982), что намного меньше, чем требуется для переключения регуляторных ответов. Во-вторых, для проведения промежуточных сравнений концентраций хемоэффектора клеткам необходим сенсорный адаптационный аппарат, который не дает выхода хеморецепторному сигналу в статическое окружение вне зависимости от природы хемоэффектора. Это позволяет клеткам заново устанавливать пороговую чувствительность сигнальной системы для обнаружения новых изменений в их химическом окружении.

Многие бактерии реагируют на хемотаксисные стимулы посредством хеморецепторов, известными как метилируемые хемотаксисные белки или МХБ (Hazelbauer, 1992; Hazelbauer et al., 1990). Клетки E. coli имеют 4 различных МХБ, которые определяют клеточные ответы на появление в окружающей среде серина (Tsr), аспартата и мальтозы (Таг), рибозы и галактозы (Trg) и дипептидов (Тар). МХБ являются трансмембранными белками приблизительно 550 аминокислот в длину с периплазматическим сенсорным доменом, который принимает сигнал, и цитоплазматическим сигнальным доменом, необходимым для выхода сигнала. Однако сигнальный домен МХБ не похож на ортодоксальные передающие сигнал домены и, фактически, для него не известна какая-либо каталитическая функция. Скорее, этот домен модулирует активность белка CheA, имеющего передающий сигнал модуль, для установления хемотаксисного ответа (Borkovich et al., 1989). При регуляции работы хеморецепторов CheW работает в паре с CheA и способствует образованию трехсоставных комплексов, содержащих димер МХБ, два мономера CheW и димер CheA (Gegner et al., 1992). Данные сигнальные комплексы существуют 10 минут и более

in vitro (Gegner et al., 1992) и, возможно, имеют такую же продолжительность жизни in vivo, так как большинство молекул CheW и CheA в клетке ассоциированы с участками расположения рецепторов на мембране (Maddock and Shapiro, 1993).

CheA имеет необычную структурную организацию (Parkinson and Kofoid, 1992). Его передающий сигнал модуль расположен в центре и фланкирован с каждой стороны добавочными доменами. С-концевой район работает как принимающий сигнал домен и служит для сопряжения работы CheA с CheW и хеморецепторами (Bourret et al., 1993; Parkinson, 1993). Укороченный на этот сегмент белок CheA сохраняет автокиназную активность, но скорость его автофосфорилирования не подвержена больше сенсорному контролю (Bourret et al., 1993). Гистидин, к которому присоединяется фосфат, расположен на небольшом N-концевом домене, вне передающего сигнал модуля (Hess et al., 1988а). Несмотря на это необычное построение, реакция автофосфорилирования схожа с наиболее типичными подобными реакциями, например, как при участии EnvZ и NtrB. Каталитический сайт молекулы одной субъединицы вызывает присоединение фосфата к акцепторному сайту на другой субъединице димера (Swanson et al., 1993; Wolfe and Stewart, 1993). Необычное расположение сайта фосфорилирования CheA, возможно, играет важную роль при регуляции сопряжения его работы с работой рецепторов (Parkinson and Kofoid, 1992). Несодержащие лиганд рецепторы стимулируют автофосфорилирование CheA, в то время как рецепторы со связанным веществом, благоприятным для жизни клетки, ингибируют CheA (Borkovich et al., 1989; Ninfa et al., 1991). Молекулы МХБ, по-видимому, контролируют работу CheA через индукцию в нем конформационных изменений, которые определяют доступ акцепторного сайта к каталитическому сайту.

CheA катализирует перенос своих фосфатов к CheB и CheY (Hess et al., 19886; Wylie et al., 1988), оба из которых содержат принимающие сигнал модули. CheY является

белком, только принимающим сигнал. Фосфорилирование позволяет ему взаимодействовать с белками переключения направления вращения филамент в основании флагеллярных моторов для установления вращения по часовой стрелке (Barak and Eisenbach, 1992; Roman et al., 1992). Флагеллярные моторы могут также вращаться против часовой стрелки при отсутствии данных регуляторных сигналов. Таким образом, относительный уровень фосфо-CheY определяет поведение движущейся клетки. Химические стимулы вызывают изменения в концентрации фосфорилированного CheY, от величины которой зависит работа флагеллярных моторов, а именно: преимущественное направление их вращения. В противоположность CheY, CheB представляет собой составную часть в цепи обратной связи. CheB терминирует хемотаксисные ответы клетки посредством изменения концентрации метилированных молекул МХБ. Степень метилирования МХБ является одним из основных факторов, определяющих их сигнальные свойства. Два фермента контролируют состояние МХБ: CheR, который катализирует переход метальных групп от S-аденозил метионина (обозначен на рис.6, как AdoMet) к молекулам МХБ, и CheB, который катализирует их отщепление. Однако каталитический домен CheB является активным, только когда фосфорилирован его N-концевой принимающий сигнал модуль (Lupas and Stock, 1989). Таким образом, посредством контролирования переноса фосфата через CheA к CheY и CheB рецепторы не только переключают хемотаксисные ответы клетки, но также приводят в работу сенсорный адаптационный аппарат.

Фосфорилированнные формы CheB и CheY имеют очень короткие периоды полураспада, грубо 10 секунд в условиях in vitro (Hess et al., 19886; Wylie et al., 1988). Быстрый кругооборот этих функционально активных белков, без сомнения, определяет короткое время существования скрытого состояния ответа при хемотаксисной передаче сигнала. Однако трудно понять, как одно это свойство может быть ответственно за

экстраординарную чувствительность клеток к стимулам окружающей среды. В попытке понять это внимание ученых было сфокусировано на CheZ, загадочном белке, чья известная к настоящему времени функция состоит только в ускорении отщепления фосфата от CheY (Hess et al., 19886). Клетки, несущие мутацию в гене cheZ, имеют высокие скорости хаотичного движения, долгосуществующие скрытые периоды ответов и, обычно, не обладают способностью к хемотаксису (Segall et al., 1985). Модулируется ли активность CheZ посредством сенсорных стимулов, например, через взаимодействие с МХБ или CheA, остается пока не ясным.

3. Регуляция синтеза капсульиого полисахарида в клетках Escherichia coli К12

3.1. Введение

Одним из общих свойств бактериальных клеток является их способность синтезировать капсульный полисахарид, колановую кислоту (М антиген). Колановая кислота является капсульным полисахаридом класса I, свойства которых определены Jann and Jann (1987). Полисахариды класса I представляют собой полипептиды высокого молекулярного веса с низкой плотностью заряда и максимально синтезируются при 20°С. В противоположность им, капсульные полисахариды класса II имеют низкий молекулярный вес и синтезируются при 37°С и выше (Jann and Jann, 1987).

Предполагается, что природная функция колановой кислоты состоит в защите клетки от стрессовых воздействий окружающей среды. Регуляция его синтеза в клетках Е. coli может служить моделью при изучении регуляции синтеза клеточной капсулы во многих грамотрицательных бактериях (Gottesman, 1995; Gottesman and Stout, 1991).

Компоненты регуляторной системы синтеза колановой кислоты в клетках Е. coli имеют много общих черт с регуляторными элементами синтеза капсульного полисахарида в клетках Erwinia (Coleman et al., 1990; Torres-Cabassa et al., 1987), Klebsiella (Allen et al., 1987; McCallum and Whitfield, 1991) и в других микроорганизмах (Gottesman, 1995; Gottesman and Stout, 1991).

3.2. Регуляция: обзор

Колановая кислота представляет собой полимер высокого молекулярного веса, который состоит из глюкозы, галактозы, фукозы и глюкороновой кислоты. Полимер модифицируется ацетатными и пируватными группами. Как описано в работе Markovitz (1977), путь его синтеза начинается с синтеза Сахаров, с последующим образованием полимера, возможно, на липидном носителе. В то время как много генов, необходимых для синтеза Сахаров, уже идентифицировано, гены, вовлеченные в образование самого полимера, а также в его модификацию и транспорт наружу, еще мало изучены. Гены синтеза клеточной капсулы определялись посредством изоляции немукоидных производных изначально мукоидных клеток Е. coli (наиболее часто использовались клетки, несущие мутацию в гене Ion). Эти гены были названы cps; они расположены в двух хромосомных локусах и составляют 6 комплементационных групп (Trisler and Gottesman, 1984).

По крайней мере четыре трансдействующих регуляторных белка играют роль в установлении уровня транскрипции генов cps (Gottesman et al., 1985). Мутации, которые снижают синтез капсульного полисахарида в изначально мукоидных клетках, картировались в двух генах, rcsA и rcsB. Мутации, которые увеличивают синтез

клеточной капсулы, картировались в генах Ion и rcsC или являлись доминантными мутациями в гене rcsA (RcsA*) (Gottesman et al., 1985).

Другие мутации, влияющие на экспрессию генов cps, не были подробно изучены и поэтому не будут обсуждаться в данном обзоре. Они представляют собой мутации в генах capS и сарТ (Makovitz, 1977), которые, возможно, аллельны локусам res, мутации в генах ops (Zinkevich-Peotti and Fraser, 1988) и rcsF (Gervais and Drapeau, 1992).

Основываясь на генетических исследованиях, анализах нуклеотидных последовательностей и биохимических характеристиках продуктов генов res, была предложена модель регуляторной системы, контролирующей синтез клеточной капсулы. В этой модели один уровень регуляции обеспечивается двухкомпонентной регуляторной системой RcsB-RcsC, реагирующей на стимулы внешней среды. Второй уровень регуляции обеспечивается расщеплением нестабильного позитивного регулятора RcsA посредством АТФ-зависимой протеазы Lon. Взаимодействие RcsA с RcsB приводит к проявлению активности RcsB, которая необходима для стимуляции транскрипции генов cps (Gottesman, 1995; Gottesman and Stout, 1991). Основные элементы этой модели и механизм их взаимодействия описаны ниже.

3.3. RcsB и RcsC составляют двухкомпонентную регуляторную систему

Гены rcsB и rcsC расположены рядом друг с другом на 48 минуте генетической карты Е. coli. Ген rcsB был идентифицирован посредством рецессивных мутаций, которые блокируют синтез клеточной капсулы при наличии в клетке мутации в гене lon (Brill et al., 1988; Gottesman et al., 1985). Ген rcsC был обнаружен посредством рецессивной мутации rcsC137, которая конститутивно активирует транскрипцию генов cps (Gottesman et al., 1985).

Анализ нуклеотидной последовательности и генетические эксперименты при использовании RcsC-PhoA соединений свидетельствуют, что RcsC является мембранным белком с молекулярным весом 104,000 Da (Stout and Gottesman, 1990). N-конец RcsC находится в цитоплазме, сам белок пересекает мембрану, имеет периплазматический домен из приблизительно 270 аминокислот и возвращается в цитоплазму своим С-концевым доменом, состоящим из 600 аминокислот (Stout and Gottesman, 1990). RcsB является цитоплазматическим белком с молекулярным весом 23,600 Da. Высокий уровень экспрессии генов cps при наличии в клетке мутации rcsC137 полностью зависит от rcsB, что свидетельствует о взаимодействии RcsB с RcsC.

Модель взаимодействия RcsB с RcsC предположена, исходя из анализа их белковых последовательностей. RcsC содержит домен, найденный в ряде киназ; RcsB имеет домен, характерный для мишеней этих киназ (рис. 7). По всей видимости, RcsC и RcsB составляют двухкомпонентную регуляторную пару, подобную EnvZ и OmpR или NtrB и NtrC. В таких парах сенсор, который часто расположен в мембране, фосфорилирует эффектор, что приводит к проявлению его определенной активности. Эффектор часто является транскрипционным активатором, когда фосфорилирован (Bourret et al., 1991; Parkinson, 1993; Parkinson and Kofoid, 1992; Stock et al., 19896, 1990). Как уже отмечалось, сенсоры содержат С-концевой консервативный район, определяющий их киназную активность; RcsC имеет этот характерный домен, который находится в цитоплазме (аминокислоты от 425 до 680) (рис. 7). Эффекторы имеют консервативный район в N-конце, который является местом фосфорилирования сенсором; RcsB содержит этот домен в N-конце (аминокислоты от 1 до 149) (рис. 7). Природные сигналы конвертируют сенсор в активную киназу, что приводит к накоплению фосфорилированного эффектора, который, в нашем случае, стимулирует транскрипцию

генов срв. В некоторых случаях сенсор дефосфорилирует эффектор, что приводит к негативной регуляции активности эффектора.

Сенсорные/Киназные Эффекторный

Гидрофобные домены

домены

домен

I J

св ▼ 903

Участок связывания с ДНК?

RcsC

/

\

149 203

периплазматический домен

RcsB

136

190

RcsA

Рис. 7. Домены регуляторных белков Res.

Числа сверху фигур указывают количество аминокислот от точки начала трансляции.

Вероятно, что мутация rcsC137 приводит к проявлению киназной активности RcsC (или ингибирует фосфатазную активность) при отсутствии сигнала, и, как следствие, фосфорилированная форма RcsB стимулирует транскрипцию генов cps. Мутации, инактивирующие rcsC, должны блокировать фосфорилирование RcsB; высокая экспрессия генов cps в клетках, несущих мутации в генах rcsC и Ion одновременно, отражает RcsC-независимый путь синтеза клеточной капсулы (см. ниже). Необычной характеристикой системы RcsB-RcsC является наличие у RcsC дополнительного эффекторного домена (рис. 7).

Гены res В и rcsC расположены близко друг к другу, что отличает их от многих других подобных регуляторных генов, но они не являются членами одного оперона, а транскрибируются навстречу друг другу и разделены 98 парами нуклеотидов повторяющейся последовательности (Stout and Gottesman, 1990).

Существование такой двухкомпонентной системы с ее возможностью быстро реагировать на природный сигнал свидетельствует, что клетка может, когда это необходимо, сильно увеличить синтез капсульного полисахарида и покрыть им себя и близлежащие клетки для защиты от губительных воздействий.

3. 4. Lon расщепляет RcsA

Первым открытым регуляторным геном синтеза колановой кислоты был ген АТФ-зависимой протеазы Lon. Мутации в гене Ion, названные capR Markovitz (1964), вызывают мукоидный фенотип у клеток при температуре ниже 37°С и ведут к увеличению в 4-100 раз экспрессии различных cpswlacZ соединений (Trisler and Gottesman, 1984). Увеличение синтеза капсулы в клетках, несущих мутацию в гене Ion, может быть объяснено накоплением в клетке RcsA, нестабильного позитивного регулятора траснкрипции генов cps. RcsA является субстратом протеазы Lon in vivo. Мутации в гене rcsA полностью подавляют активацию синтеза капсульного полисахарида, когда протеаза Lon инактивирована.

Расщепление RcsA посредством Lon обеспечивает второй уровень регуляции синтеза капсульного полисахарида. Так как концентрация RcsA в клетке является лимитирующим фактором для синтеза клеточной капсулы, то любое событие, вызывающее накопление в клетке RcsA, будет приводить к быстрому увеличению экспрессии генов cps. Активация транскрипции генов cps в клетках, содержащих мутацию в гене Ion, является полностью как RcsA-, так и RcsB-зависимой (Brill et al., 1988). RcsA, вероятно, стимулирует RcsB-зависимую транскрипцию и способствует максимальному синтезу клеточной капсулы, но не является абсолютно необходимым активатором транскрипции, подобно RcsB. Клетки, в которых RcsC-RcsB путь

является полностью активным (наличие в клетке мутации rcsC137 или многокопийной гау2?-содержащей плазмиды) имеют максимальную экспрессию генов cps, когда содержат дикую аллель гена rcsA, но продолжают синтезировать значительные количества клеточной капсулы, если ген rcsA инактивирован мутацией (Brill et al., 1988; Gottesman and Stout, 1991).

3. 5. RcsA взаимодействует с RcsB для стимуляции транскрипции генов cps

Вывод о взаимодействии RcsA с RcsB был сделан, исходя из ряда экспериментальных данных. Во-первых, RcsB влияет на стабильность RcsA in vivo (Stout et al., 1991). Период полураспада RcsA, синтезируемого с многокопийной плазмиды, увеличивается при избытке RcsB в клетке с 3 до 10 минут и уменьшается до одной минуты при его отсутствии. Во-вторых, укороченный RcsB, синтезируемый с плазмиды, вызывает снижение синтеза капсульного полисахарида при наличии в клетке мутации в гене Ion. Предположено, что укороченный RcsB образует смешанные нефункциональные мультимеры с регуляторным элементом, важным для активации синтеза клеточной капсулы. Данный негативный эффект устраняется при наличии в клетке избытка RcsA (Brill et al., 1988). Этот факт свидетельствует, что мультимеры, очевидно, образуются между RcsB и RcsA. Вполне вероятно, что RcsA помогает RcsB выполнять позитивную регуляцию транскрипции генов cps. Это подтверждается наличием в белковых последовательностях RcsA и RcsB С-концевых ДНК-связываюших мотивов (Stout et al., 1991).

3.6. Модель синтеза клеточной капсулы

Основываясь на анализе системы Rcs-Cps, предположено существование двух альтернативных механизмов активации синтеза клеточной капсулы (Gottesman, 1995; Gottesman and Stout, 1991) (рис. 8). При первом механизме природные сигналы конвертируют RcsC в активную киназу, которая фосфорилирует RcsB, по аналогии с реакцией фосфорилирования, отмеченной для других пар сенсор-эффектор. Фосфорилированый RcsB даже при отсутствии RcsA стимулирует синтез клеточной капсулы. Мутация rcsC137, возможно, приводит к конститутивному проявлению киназной активности RcsC.

Рис. 8. Модель регуляции синтеза клеточной капсулы в клетках Е. coli.

RcsC и RcsB составляют двухкомпонентную регуляторную систему, в которой сенсор RcsC в ответ на природный сигнал фосфорилирует эффектор RcsB, приводя его в активную форму для стимуляции транскрипции генов cps. RcsA является добавочным транскрипционным активатором и его комплекс с RcsB также вызывает усиление транскрипции генов cps. RcsA является нестабильным белком и его расщепление зависит от протеазы Lon. Одновременно транскрипция rcsA негативно регулируется гистон-подобным белком H-NS, а малая DsrA РНК препятствует репрессии посредством PINS. Подробно механизм взаимодействия регуляторных элементов данной модели обсуждается в тексте.

сигнал окружающей среды

Альтернативный механизм имеет место при отсутствии RcsC-зависимой активации RcsB, когда RcsA находится в избытке в клетке. Предположено, что этот путь не требует RcsC-зависимого фосфорилирования RcsB, возможно, он не нуждается в фосфорилировании RcsB вообще. Высокий уровень RcsA в клетке может быть получен посредством мутации в гене Ion или посредством увеличения дозы гена г es А. В работе Sledgjeski and Gottesman (1995) отмечено негативное влияние гистон-подобного белка H-NS на инициацию транскрипции гена rcsA. DsrA РНК, состоящая из 85 нуклеотидов, препятствует негативному эффекту H-NS. Гены res А и dsrA расположены близко друг к другу, но не являются членами одного оперона. Таким образом, увеличение экспрессии гена dsrA должно вызывать увеличение концентрации RcsA в клетке. Это предположение подтверждается данными работы Torres-Cabassa and Gottesman (1987), где показано, что многокопийная плазмида, несущая хромосомный фрагмент, как позже было установлено, с геном dsrA, приводила к увеличению экспрессии генов eps почти в 100 раз. Взаимодействие пары H-NS/DsrA показано при регуляции ряда других клеточных генов (Sledgjeski and Gottesman, 1995).

Так как RcsA и RcsB имеют схожие ДНК-связывающие домены и, так как RcsA, по-видимому, взаимодействует с RcsB, данная модель постулирует, что комплекс RcsA/RcsB связывается с ДНК для стимуляции транскрипции генов cps. Избыток RcsA в клетке, возможно, способствует либо связыванию фосфо-RcsB с ДНК, либо активации транскрипции посредством нефосфорилированного RcsB. Альтернативно, RcsA, возможно, вызывает активацию RcsB посредством другого, RcsC-независимого пути.

При отсутствии активированного RcsB и избытка RcsA в клетке только незначительный уровень транскрипции генов cps имеет место. Эта ситуация характерна для клеток Е. coli Kl2 дикого типа в лабораторных условиях.

4. SOS ответ клеток Escherichia coli

4.1. Введение

SOS система клеток Е. coli является первой идентифицированной регуляторной системой, активирующейся при возникновении повреждений в ДНК. Это самая большая, наиболее комплексная и лучше всего изученная к настоящему времени регуляторная система, реагирующая на действия ДНК-повреждающих или задерживающих репликацию веществ (Walker, 1984, 1985, 1996; Witkin, 1976). Существование SOS системы было постулировано в работе Défais et al. (1971) и эта гипотеза нашла свое развитие в трудах Radman (1975).

4.2. SOS система

Воздействие на клетки Е. coli ДНК-повреждающих или задерживающих репликацию веществ вызывает индукцию набора физиологических ответов, названных SOS ответами, при которой происходит увеличение экспрессии около 20 генов (Kenyon and Walker, 1980; Walker, 1984, 1996). Они представляют собой гены uvrAB (Kenyon and Walker, 1981), sulA (Huisman and D'Ari, 1981), umuDC (Bagg et al., 1981), himA (Miller et al., 1981), uvrD (Siegel, 1983), ruv (Shurvinton and Lloyd, 1982), recA (Casaregola et al., 1982) и recN (Lloyd et al., 1983). Экспрессия этих генов контролируется комплексной регуляторной системой, включающей белки RecA и LexA. SOS ответы включают Uvr-зависимую эксцизионную репарацию, SOS процессинг, репарацию двухцепочечных разрывов ДНК, репарацию брешей в дочерних цепях и филаментацию (Walker, 1984, 1985, 1996). Регуляторный механизм SOS системы показан на рис. 9.

Рис. 9. Модель SOS регуляторной системы клеток Е. coli. Одноцепочечные фрагменты ДНК, результат действия ДНК-повреждающих веществ, активируют RecA (активированный RecA затемнен), который, в свою очередь, стимулирует автопротеолитическое расщепления репрессора SOS генов, белка LexA. Детали механизма индукции SOS ответа обсуждаются в тексте.

В неиндуцированной клетке LexA действует как репрессор значительного числа не связанных генов, в том числе генов г ее А и lexA, посредством присоединения к сходным операторным последовательностям в промоторе каждого гена. LexA представляет собой белок с молекулярной массой 22,700 Da (Brent and Ptashne, 1980; Little and Harper, 1979). Консенсус последовательность для связывания LexA является TACTGATATA-A-ACAGTA (Walker, 1984, 1996).

Когда ДНК повреждена или репликация ингибирована, возникают одноцепочечные фрагменты ДНК. Взаимодействие RecA с одноцепочечной ДНК активирует его для стимуляции автопротеолитического расщепления LexA. Активация RecA является обратимым процессом (Little, 1983) и, вероятно, вовлекает конформационные изменения в молекуле RecA (Roberts and Devoret, 1983). При анализе in vitro активация происходит, когда RecA образует трехсоставной комплекс с одноцепочечной ДНК и нуклеозид трифосфатом (Roberts and Devoret, 1983). Основываясь на этих и других

Заключение диссертации по теме «Генетика», Розанов, Дмитрий Вячеславович

выводы

1. Предложен прямой метод отбора клонированных клеточных генов, чья сверхэкспрессия приводит к RecA-независимой индукции профага X. Метод основан на выведении гена из под клеточного контроля посредством клонирования его на плазмиде, содержащей свой собственный промотор, и использовании индикаторных клеток, эффективность индукции профага в которых можно характеризовать визуально.

2. Посредством предложенного метода отбора впервые был клонирован клеточный ген (гены), чья сверхэкспрессия приводит к RecA-независимой индукции профага X. Одновременно с индукцией профага плазмиды, содержащие этот ген (гены), вызывают мукоидный фенотип.

3. На основании генетических экспериментов и данных гибридизационного и рестрикционного анализов было заключено, что плазмиды pDR406 и pDR416 несут одинаковый фрагмент хромосомы с геном res А.

4. Субклонирование гена rcsA, инактивация его in vitro и тестирование полученных плазмид позволили предположить, что у всех г es А-содержащих плазмид рядом с геном г es А расположен ген dsrA, сверхпродукция которого также приводит к RecA-независимой индукции профага X и слабо выраженному мукоидному фенотипу клеток. Продукты этих генов являются позитивными регуляторами синтеза клеточной капсулы.

5. Повторное клонирование генов г es А и dsrA из транедуцирующего фага в pUC19 подтвердило, что сверхэкспрессия этих генов приводит к RecA-независимой индукции профага X. Более того, г es А- и dsrA-содержащие плазмиды вызывают RecA-незавиеимую индукцию лямбдоидных профагов 21, <¡>80 и 434, причем действие плазмид не зависет от используемого штамма. Возможно, влияние сверхэкспрессии rcsA и dsrA распространяется на все лямбдоидное семейство.

6. Количественное определение эффективности индукции профага X позволило заключить, что все тестированные генетические изменения, приводящие к индукции синтеза клеточной капсулы, вызывают RecA-незавиеимую индукцию профага X. Причем, частота индукции профага не всегда коррелирует с силой активации синтеза капсульного полисахарида. Данный факт свидетельствует о независимости индукции профага от активации какого-либо гена cps. На основании полученных данных был сделан вывод, что клеточная система, отвечающая за регуляцию синтеза клеточной капсулы, влияет на стабильность профага X.

7. Определение концентрации свободного фага ХС+ позволило заключить, что сверхэкспрессия г es А, dsrA или конститутивная активация RcsB (мутация rcsCIST) приводят к индукции профага в экспоненциально растущих клетках, а сверхэкспрессия dsrA оказывает также индуцирующее влияние на профаг при входе клеток в стационарную фазу развития.

8. Комплементационные тесты показали, что действие RcsA на профаг полностью зависит от RcsB и не зависит от DsrA РНК, в то время как действие DsrA РНК на профаг не зависит от RcsA и RcsB. Было заключено, что при наличии в клетке избытка RcsA механизмы RecA-независимой индукции профага X и активации транскрипции генов cps имеют общие регуляторные стадии, в то время как DsrA РНК влияет на стабильность профага независимо от системы RcsABC.

9. Определение концентрации свободного фага ХС+ в комплементационных тестах позволило заключить, что в экспоненциально растущих клетках действие DsrA РНК на профаг зависит от RcsA и RcsB. По-видимому, в данной фазе клеточного развития

DsrA РНК вызывает индукцию профага через стимуляцию транскрипции г es А. При входе клеток в стационарную фазу развития влияние DsrA РНК на профаг происходит независимо от наличия мутаций в генах rcsA и rcsB. Этот факт подтвердил сделанный ранее вывод, что продукт гена dsrA участвует в другом, RcsABC-независимом пути индукции профага. Возможно, его действие зависит от RpoS, глобального регулятора генной экспрессии в стационарной фазе клеточного развития.

10.Анализ эффективности индукции профага в клетках В7315(Я) (recA Ion) и В7399(Х) {recA rcsC137), содержащих pDRl (cl+), показал, что индукция профага посредством системы RcsABC зависит от уровня репрессора в клетке. Исходя из данного факта был сделан вывод, что данная индукция не является с1-независимой и идет, следовательно, или через инактивацию репрессора, или через снижение его синтеза.

11.Тестирование профагов kind на индуцибельность по частоте инфекционных центров показало, что индукция профага посредством RcsA наиболее сильно подавляется мутацией ind в фаге A.GE112, которая расположена в сайте расщепления репрессора. Исходя из данного факта было предположено, что индукция профага посредством системы RcsABC идет через инактивацию репрессора, возможно, альтернативной RecA протеазой. На основании механизма регуляции синтеза клеточной капсулы можно допустить, что индукция профага идет через транскрипционную активацию гена альтернативной RecA протеазы.

12.Тестирование профагов "kind на индуцибельность по уровню свободного' фага позволило заключить, что при сверхэкспрессии dsrA в постэкспоненциальной фазе клеточного роста индукция профага происходит независимо от наличия тестированых мутаций ind в гене репрессора фага. Исходя из данного факта было предположено, что в данной фазе клеточного развития DsrA РНК влияет на стабильность профага на транскрипционном уровне.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Розанов, Дмитрий Вячеславович, 1999 год

ЛИТЕРАТУРА

1. Aiba, Н., Т. Mizuno, and S. Mizushima. 1989a. Transfer of phosphoryl group between two regulatory proteins involved in osmoregulatory expression of the ompF and ompC genes in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264:8563-8567.

2. Aiba, H., F. Nakasai, S. Mizushima, and T. Mizuno. 19896. Evidence for the physiological importance of the phosphotransfer between the two regulatory components, EnvZ and OmpR, in osmoregulation in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 264:14090-14094.

3. Aiba, H., F. Nakasai, S. Mizushima, and T. Mizuno. 1989c. Phosphorylation of a bacterial activator protein, OmpR, by a protein kinase, EnvZ, results in stimulation of its DNA-binding ability. J. Biochem. 106:5-7.

4. Aldea, M., T. Garrido, C. Hernandez-Chico, M. Vicente, and S. R. Kushner. 1989. Induction of a growth-phase-dependent promoter triggers transcription of bolA, an Escherichia coli morphogene. EMBO J. 8:3923-3931.

5. Allen, P., C. A. Hart, and J. R. Saunders. 1987. Isolation "from Klebsiella and characterization of two res genes that activate colanic acid capsular biosynthesis in Escherichia coli. J. Gen. Microbiol. 133:331-340.

6. Almiron, M., A. Link, D. Furlong, and R. Kolter. 1992. A novel DNA-binding protein with regulatory and protective roles in starved Escherichia coli. Genes Dev. 6:2646-2654.

7. Arnosti, D. N., and M. J. Chamberlin. 1989. Secondary a factor controls transcription of flagellar and chemotaxis genes in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:830834.

10. Atlund, Т., A. Nielsen, and F. G. Hansen. 1989. Isolation, characterization, and nucleotide sequence of app Y, a regulatory gene for growth-phase-dependent gene expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. 171:1683-1691.

11. Bagg, A., C. J. Kenyon, and G. C. Walker. 1981. Inducibility of a gene product required for UV and chemical mutagenesis in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:5749-5753.

12. Barak, R., and M. Eisenbach. 1992. Correlation between phosphorylation of the chemotaxis protein CheY and its activity at the flagellar motor. Biochemistry 31:18211826.

13. Berg, H. C. 1988. A physicist looks at bacterial chemotaxis. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 53:1-9.

14. Boos, W., U. Ehmann, E. Bremer, A. Middendorf, and P. Postma. 1987. Trehalose of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 262:13212-13218.

15. Borkovich, K. A., N. Kaplan, J. F. Hess, and M. I. Simon. 1989. Transmembrane signal transduction in bacterial chemotaxis involves ligand-dependent activation of phosphate group transfer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1208-1212.

16. Bourret, R. B., K. A. Borkovich, and M. I. Simon. 1991. Signal transduction pathways involving protein phosphorylation in prokaryotes. Annu. Rev. Biochem. 60:401-441.

17. Bourret, R. B., J. Davagnino, and M. I. Simon. 1993. The carboxy-terminal portion of the CheA kinase mediates regulation of autophosphorylation by transducer and CheW. J. Bacteriol. 175:2097-2101.

18. Bourret, R. B., J. F. Hess, and M. I. Simon. 1990. Conserved aspartate residues and phosphorylation in signal transduction by the chemotaxis protein CheY. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:41-45.

19. Brent, R. 1982. Regulation and autoregulation by lexA protein. Biochimie 64:565-569.

20. Brent, R., and M. Ptashne. 1980. The I ex A gene product represses its own promoter. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:1932-1936.

21. Brent, R., and M. Ptashne. 1981. Mechanism of action of the lexA gene product. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:4202-4208.

22. Brill, J. A., C. Quinlan-Walshe, and S. Gottesman. 1988. Fine-structure mapping and identification of two regulators of capsule synthesis in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 170:2599-2611.

23. Brissette, R. E., K. 1. Tsung, and M. Inouye. 1991. Supression of a mutation in OmpR at the putative phosphorylation center by a mutant EnvZ protein in Escherichia coli. J. Bacteriol. 173:601-608.

24. Campbell, A. 1961. Conditions for existence of bacteriophage. Evolution 15:153-165.

25. Casaregola, S., R. D'Ari, and O. Huisman. 1982. Quantitative evaluation of recA gene expression in Escherichia coli. Mol. Gen Genet. 185:430-439.

26. Close, T. J., and R. L. Rodriguez. 1982. Construction and characterization of the chloramphenicol-resistance gene cartridge: a new approach to the transcriptional mapping of extrachromosomal elements. Gene 20:305-316.

27. Coleman, M., R. Pearce, E. Hitchin, F. Busfileld, J. W. Mansfield, and I. S. Roberts. 1990. Molecular cloning, expression and nucleotide sequence of the rcsA gene of Erwinia amylovora, encoding a positive regulator of capsule expression: evidence for a family of related capsule activator proteins. J. Gen. Microbiol. 136:1799-1806.

28. Csonka, L. N. 1989. Physiological and genetic responses of bacteria to osmotic stress. Microbiol. Rev. 53:121-147.

29. Daniels, D. L., F. Sanger, and A. R. Coulson. 1983. Features of bacteriophage X: analysis of the complete nucleotide sequence. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 48:1009-1024.

30. Dassa, J., H. Fsihi, C. Marck, M. Dion, M. Kieffer-Bontemps, and P. L. Boquet.

1992. A new oxygen-regulated operon in Escherichia coli comprises the genes for a

putative third cytochrome oxydase and for pH 2.5 acid phosphatase (appA). Mol. Gen. Genet. 229:342-352.

31. Defais, M., P. Fauquet, M. Radman, and M. Errera. 1971. Ultraviolet reactivation and ultraviolet mutagenesis of lambda in different genetic systems. Virology 43:495-503.

32. Demple, B., and C. F. Amabile-Cuevas. 1991. Redox redux: The control of oxidative stress responses. Cell 67:837-839.

33. Dersch, P., K. Schmidt, and E. Bremer. 1993. Synthesis of the Escherichia coli K-12 nucleoid-associated DNA-binding protein H-NS is subject to growth-phase control and autoregulation. Mol. Microbiol. 8:875-889.

34. Diaz-Guerra, L., F. Moreno, and J. L. SanMillan. 1989. appR gene product activates transcription of microcin C7 plasmid genes. J. Bacteriol. 171:2906-2908.

35. Eisenbach, M. 1991. Signal transduction in bacterial chemotaxis, p. 131-202. In J. L. Spudich (ed.), Sensory receptors and signal transduction. Wiley-Liss, Inc., New York.

36. Elespuru, R. K. 1984. Induction of bacteriophage lambda by DNA-interacting chemicals, p. 213-231. In F. J. de Serres (ed.), Chemical Mutagens, vol. 9. Plenum Press, New York.

37. Farr, S. B., and T. Kogoma. 1991. Oxidative stress responses in Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Microbiol. Rev. 55:561-585.

38. Feng, J., M. R. Atkinson, W. McCleary, J. B. Stock, B. L. Wanner, and A. J. Ninfa. 1992. Role of phosphorylated metabolic intermediates in the regulation of glutamine synthetase synthesis in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174:6061-6070.

39. Forst, S., J. Delgado, and M. Inouye. 1989. Phosphorylation of OmpR by the osmosensor EnvZ modulates expression of the ompF and ompC genes in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:6052-6056.

40. Forst, S., J. Delgado, A. Rampersaud, and M. Inouye. 1990. In vivo phosphorylation of OmpR, the transcription activator of the ompF and ompC genes in Escherichia coli. J. Bacteriol. 172:3473-3477.

41. Foster, P. L. 1992. Directed mutations: between unicorns and goats. J. Bacteriol. 174:1711-1716.

42. Gegner, J. A., D. R. Graham, A. F. Roth, and F. W. Dahlquist. 1992. Assembly of an MCP receptor, CheW, and kinase CheA complex in the bacterial chemotaxis signal transduction pathway. Cell 70:975-982.

43. Gervais, F. G., and G. R.Drapeau. 1992. Identification, cloning, and characterization of rcsF, a new regulator gene for exopolysaccharide synthesis that supresses the division mutation ftsZ84 in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 174:8016-8022.

44. Giaever, H. M., O. B. Styrvold, I. Kaasen, and A. R. Strom. 1988. Biochemical and genetic characterization of osmoregulatory trehalose synthesis in Escherichia coli. J. Bacteriol. 170:2841-2849.

45. Gimble, F. S., and R. T. Sauer. 1985. Mutations in bacteriophage a, repressor that prevent RecA-mediated cleavage. J. Bacteriol. 162:147-154.

46. Gimble, F. S., and R. T. Sauer. 1986. A repressor inactivation: properties of purified ind~ proteins in the autodigestion and RecA-mediated cleavage reactions. J. Mol. Biol. 192:39-47.

47. Gottesman, S. 1995. Regulation of capsule synthesis: modification of the two-component paradigm by an accessory unstable regulator, p. 253-262. In J. A. Hoch and T. J. Silhavy (ed.), Two-component signal transduction. American Society for Microbiology, Washington, D. C.

48. Gottesman, S., M. Gottesman, J. E. Shaw, and M. L. Pearson. 1981. Protein degradation in E. coli: the lort mutation and bacteriophage lambda N and ell protein stability. Cell 24:225-233.

49. Gottesman, S., and V. Stout. 1991. Regulation of capsular polysaccharide synthesis in Escherichia coli K12. Mol. Microbiol. 5:1599-1606.

50. Gottesman, S., P. Trisler, and A. Torres-Cabassa. 1985. Regulation of capsular polysaccharide synthesis in Escherichia coli K-12: characterization of three regulatory genes. J. Bacteriol. 162:1111-1119.

51. Groat, R. G., J. E. Schultz, E. Zychlinski, A. T. Bockman, and A. Matin. 1986. Starvation proteins in Escherichia coli: kinetics of synthesis and role in starvation survival. J. Bacteriol. 168:486-493.

52. Groisman, E. A., and M. J. Casadaban. 1986. Mini-Mu bacteriophage with plasmid replicon for in vivo cloning and lac gene fusing. J. Bacteriol. 168:357-364.

53. Hazelbauer, G. L. 1992. Bacterial chemoreceptors. Curr. Opin. Struct. Biol. 2:505-510.

54. Hazelbauer, G. L., H. C. Berg, and P. Matsumura. 1993. Bacterial motility and signal transduction. Cell 73:15-22.

55. Hazelbauer, G. L., R. Yaghmai, G. G. Burrows, J. W. Baumgartner, D. P. Dutton, and D. G. Morgan. 1990. Transducers: transmembrane receptor proteins involved in bacterial chemotaxis. Soc. Gen. Microbiol. Symp. 46:107-134.

56. Hengge-Aronis, R. 1993a. The role of rpoS in early stationary phase gene regulation in Escherichia coli K12, p. 171-200. In S. Kjelleberg (ed.), Starvation in bacteria. Plenum Press, New York.

57. Hengge-Aronis, R. 19936. Survival of hunger and stress: the role of rpoS in early stationary phase regulation in E. coli. Cell 72:165-168.

58. Hengge-Aronis, R. 1996. Regulation of gene expression during entry into stationary phase, p. 1497-1512. In F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanic, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter, and H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology, Washington, D. C.

59. Hengge-Aronis, R., and D. Fischer. 1992. Identification and molecular analysis of glgS, a novel growth phase-regulated and rpoS-dependent gene involved in glycogen synthesis in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 6:1877-1886.

60. Hengge-Aronis, R., W. Klein, R. Lange, M. Rimmele, and W. Boos. 1991. Trehalose synthesis genes are controlled by the putative sigma factor encoded by rpoS and are involved in stationary-phase thermotolerance in Escherichia coli. J. Bacteriol. 173:79187924.

61. Hess, J. F., R. B. Bourret, and M. I. Simon. 1988a. Histidine phosphorylation and phoshporyl group transfer in bacterial chemotaxis. Nature 336:139-143.

62. Hess, J. F., K. Oosawa, N. Kaplan, and M. I. Simon. 19886. Phosphorylation of three proteins in the signaling pathway of bacterial chemotaxis. Cell 53:79-87.

63. Higgins, C. F., J. C. D. Hinton, C. S. J. Hinton, T. Owen-Hughes, G. D. Pavitt, and A. Seirafi. 1990. Protein HI: a role for chromatin structure in the regulation of bacterial gene expression and virulence? Mol. Microbiol. 4:2007-2012.

64. Horii, T., T. Ogawa, T. Nakatani, T. Hase, H. Matsubara, and H. Ogawa. 1981a. Regulation of SOS function: purification of E. coli LexA protein and determination of its specific site cleaved by the RecA protein. Cell 27:515-522.

65. Horii, T., T. Ogawa, and H. Ogava. 19816. Nucleotide sequence of the lexA gene of E. coli. Cell 23:689-697.

66. Huisman, O., and R. D'Ari. 1981. An inducible DNA replication-cell division coupling mechanism in E. coli. Nature (London) 290:797-799.

67. Igo, M. M., A. J. Ninfa, J. B. Stock, and T. J. Silhavy. 1989. Phosphorylation and dephosphorylation of bacterial transcriptional activator by a transmembrane receptor-Genes Dev. 3:1725-1734.

68. Igo, M. M., J. M. Slauch, and T. J. Silhavy. 1990. Signal transduction in bacteria: kinases that control gene expression. New Biol. 2:5-9.

69. Jann, K., and B. Jann. 1987. Polysaccharide antigens of Escherichia coli. Rev. Inf. E>lS-9 (suppl. 5):S517-S526.

70. Jenkins, D. E., S. A. Chaisson, and A. Matin. 1990. Starvation-induced cross protection against osmotic challenge in Escherichia coli. J. Bacteriol. 172:2779-2781.

71. Jenkins, D. E., J. E. Shultz, and A. Matin. 1988. Starvation-induced cross-protection against heat or H202 challenge in Escherichia coli. J. Bacteriol. 170:3910-3914.

72. Jones, C. J., and S. Aizawa. 1991. The bacterial flagellum and flagellar motor: structure, assembly and function. Adv. Microbiol. Physiol. 32:109-172.

73. Jung, J. U., C. Gutierrez, F. Martin, M. Ardourel, and M. Villarejo. 1990. Transcription of osmB, a gene encoding an Escherichia coli lipoprotein, is regulated by dual signals. J. Biol. Chem. 265:10574-10581.

74. Kaasen, I., P. Falkenberg, O. B. Styrvold, and A. R. Strom. 1992. Molecular cloning and physical mapping of the otsBA genes, which encode the osmoregulatory trehalose pathway of Escherichia coli: evidence that transcription is activated by KatF(AppR)-Bacteriol. 174:889-898.

75. Keener, J., and S. Kustu. 1988. Protein kinase and phosphoprotein phosphotase activities of nitrogen regulatory proteins NTRB and NTRC of enteric bacteria: roles of conserved amino-terminal domain ofNTRC. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:4976-4980-

76. Kenyon, C., and G. Walker. 1980. DNA-damaging agents stimulate gene expression at specific loci in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:2819-2823.

77. Kenyon, C., and G. Walker. 1981. Expression of the E. coli uvrA gene is inducible. Nature (London) 289:808-810.

78. Kim, B., and J. W. Little. 1993. LexA and X cl repressors as enzymes: specific cleavage in an intermolecular reaction. Cell 73:1165-1173.

100. Kohara, Y., K. Akiyama, and K. Isono. 1987. The physical map of the whole E. coli chromosome: application of a new strategy for rapid analysis and sorting of a large genomic library. Cell 50:495-508.

101. Kolter, R., and F. Moreno. 1992. Genetics of ribosomally synthesized peptide antibiotics. Annu. Rev. Microbiol. 46:141-163.

102. Krueger, J. H., S. J. Elledge, and G. C. Walker. 1983. Isolation and characterization of TnJ insertion mutations in the lexA gene of Escherichia coli. J. Bacteriol. 153:1368-1378.

103. Lamont, I., A. M. Brumby, and J. B. Egan. 1989. UV induction of coliphage 186: prophage induction as an SOS function. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5492-5496.

104. Lange, R., and R. Hengge-Aronis. 1991a. Growth phase-regulated expression of bolA and morphology of stationary-phase Escherichia coli cells are controlled by the novel sigma factor as (rpoS). J. Bacteriol. 173:4474-4481.

105. Lange, R., and R. Hengge-Aronis. 19916. Identification of a central regulator of stationary-phase gene expression in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 5:49-59.

106. Lin, L. L., and J. W. Little. 1988. Isolation and characterization of noncleavable (Ind~) mutants of the LexA repressor of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 170:2163-2173.

107. Lin, L. L., and J. W. Little. 1989. Autodigestion and RecA-dependent cleavage of Ind~ mutant LexA proteins. J. Mol. Biol. 210:439-452.

108. Little, J. W. 1983. The SOS regulatory system: control of its state by the level of recA protease. J. Mol. Biol. 167:791-808.

109. Little, J. W. 1984. Autodigestion of lexA and phage lambda repressors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81:1375-1379.

110. Little, J. W. 1991. Mechanism of specific LexA cleavage: autodigestion and the role of RecA coprotease. Biochimie 73:411-422.

111. Little, J. W., and J. E. Harper. 1979. Identification of the I ex A gene product of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 76:6147-6151.

112. Little, J. W., D. W. Mount, and C. R. Yanisch-Perron. 1981. Purified lexA protein is a repressor of the recA and lexA genes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 78:4199-4203.

113. Lloyd, R. G., S. M. Picksley, and C. Prescott. 1983. Inducible expression of a gene specific to the recF pathway for recombination in Escherichia coli Kl2. Mol. Gen. Genet. 190:162-167.

114. Loewen, P. C., J. Switala, and B. L. Triggs-Raine. 1985. Catalases HPI and HPII in Escherichia coli are induced independently. Arch. Biochem. Biophys. 243:144-149.

115. Loewen, P. C., and B. L. Triggs. 1984. Genetic mapping of katF, a locus that with katE affects the synthesis of a second catalase species in Escherichia coli. J. Bacteriol. 160:668675.

116. Lonetto, M., M. Gribskov, and C. A. Gross. 1992. The a70 family: sequence conservation and evolutionary relationships. J. Bacteriol. 174:3843-3849.

117. Lukat, G. S., B. H. Lee, J. M. Mottonen, A. M. Stock, and J. B. Stock. 1991. Roles of the highly conserved aspartate and lysine residues in the response regulator of bacterial Chemotaxis. J. Biol. Chem. 266:8348-8354.

118. Lukat, G. S., W. R. McCleary, A. M. Stock, and J. B. Stock. 1992. Phosphorylation of bacterial response regulator proteins by low molecular weight phospho-donors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:718-722.

119. Lupas, A., and J. Stock. 1989. Phosphorylation of an N-terminal regulatory domain activates the CheB methylesterase in bacterial chemotaxis. J. Biol. Chem. 264:1733717342.

120. Lwoff, A. 1953. Lysogeny. Bacterid. Rev. 17:269-237.

121. Lwoff, A., L. Siminovitch, and N. Kjeldgaard. 1950. Induction de la production de bactériophages chez une bactérie lysogène. Ann. Inst. Pasteure 79:815-859 (In French).

122. Macnab, R. B. 1992. Genetics and biogenesis of bacterial flagella. Annu. Rev. Genet. 26:131-158.

123. Maddock, J. R., and L. Shapiro. 1993. Polar location of the chemoreceptor complex in the Escherichia coli. Science 259:1717-1723.

124. Maeda, S., and T. Mizuno. 1990. Evidence for multiple OmpR-binding sites in the upstream activation sequence of the ompC promoter in Escherichia coli: a single OmpR-binding site is capable of activating the promoter. J. Bacteriol. 172:501-503.

125. Manson, M. D. 1992. Bacterial motility and chemotaxis. Adv. Microbiol. Physiol. 33:277-346.

126. Markovitz, A. 1964. Regulatory mechanisms for synthesis of capsular polysaccharide in mucoid mutants of Escherichia coli K12. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 51:239-246.

127. Markovitz, A. 1977. Genetics and regulation of bacterial capsular polysaccharide synthesis and radiation sensitivity, p. 415-462. In I. Sutherland (ed.), Surface carbohydrates of the prokaryotic cell. Academic Press, Inc. (London), Ltd., London; United Kingdom.

128. Matin, A. 1991. The molecular basis of carbon-starvation-induced general resistance in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 5:3-10.

129. McCallum, K. L., and C. Whitfield. 1991. The rcsA gene of Klebsiella pneumoniae 01 :K20 is involved in expression of the serotype-specific K (capsular) antigen. Infecti. Immun. 59:494-502.

130. McCann, M. P., J. P. Kidwell, and A. Matin. 1991. The putative a factor KatF has a central role in development of starvation-mediated general resistance in Escherichia coli. J. Bacteriol. 173:4188-4194.

131. McEntee, K., and W. Epstein. 1977. Isolation and characterization of specialized transduicing bacteriophages for the recA gene of Escherichia coli. Virology 77:306-318.

132. Merrick, M. J. 1993. In a class of its own-the RNA polymerase sigma factor a54 (aN). Mol. Microbiol. 10:903-909.

133. Miller, J. H. 1972. Experiments in molecular genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

134. Miller, H. I., M. Kirk, and H. Echols. 1981. SOS induction and autoregulation of the himA gene for site-specific recombination in E. coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:67546758.

135. Mizuno, T., and S. Mizushima. 1990. Signal transduction and gene regulation through the phosphorylation of two regulatory components: the molecular basis for the osmotic regulation of the porin genes. Mol. Microbiol. 4:1077-1082.

136. Moreau, P., A. Bailone, and R. Devoret. 1976. Prophage X induction in Escherichia coli K12 envA uvrB: a highly sensitive test for potential carcinogens. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:3700-3704.

137. Mulvey, M. R., and P. C. Loewen. 1989. Nucleotide sequence of katF of Escherichia coli suggests KatF protein is a novel a transcription factor. Nucleic Acids Res. 17:99799991.

138. Nakashima, K., K. Kanamaru, H. Aiba, and T. Mizuno. 1991. Signal transduction and osmoregulation in Escherichia coli: a novel type of mutation in the phosphorylation domain of the activator protein, OmpR, results in a defect in its phosphorylation-dependent DNA binding. J. Biol. Chem. 266:10775-10780.

139. Ninfa, A. J., and R. L. Bennett. 1991. Identification of the site of autophosphorylation of the bacterial protein kinase/phosphatase NRh. J. Biol. Chem. 266:6888-6893.

140. Ninfa, A. J., and B. Magasanik. 1986. Covalent modification of the glnG product, NRi, by the glnL product, NRh, regulates the transcription of the glnALG operon in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5909-5913.

141. Ninfa, A. J., L. J. Reitzer, and B. Magasanik. 1987. Initiation of transcription at the bacterial glnAp2 promoter by purified E. coli components is facilitated by enhancers. Cell 50:1039-1046.

142. Ninfa, A. J., A. Stock, S. Mowbray, and J. Stock. 1991. Reconstitution of the bacterial chemotaxis signal transduction system from purified components. J. Biol. Chem. 266:9764-9770.

143. Ogava, T., and J. I. Tomizava. 1967. Abortive lysogenization of bacteriophage lambda b2 and residual immunity of non-lysogenic segregants. J. Mol. Biol. 23:225-245.

144. Olsen, A., A. Arnqvist, S. Sukupolvi, and S. Normark. 1993. The RpoS sigma factor relieves H-NS-mediated transcriptional repression of csgA, the subunit gene of fibronectin-binding curli m Escherichia coli. Mol. Microbiol. 7:523-536.

145. Olsen, A., A. Jonsson, and S. Normark. 1989. Fibronectin binding mediated by a novel class of surface organells of Escherichia coli. Nature (London) 338:652-655.

146. Oosawa, K., J. F. Hess, and M. I. Simon. 1988. Mutations defective in bacterial chemotaxis show modified protein phosphorylation. Cell 53:89-96.

147. Ozaki, M., A. Wada, N. Fujita, and A. Ishihama. 1991. Growth phase-dependent modification of RNA polymerase in Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 230:17-23.

148. Parker, B., and M. G. Marinus. 1988. A simple and rapid method to obtain substitution mutations in Escherichia colv. isolation of a dam deletion/insertion mutation. Gene 73:531535.

149. Parkinson, J. S. 1993. Signal transduction schemes of bacteria. Cell 73:857-871.

150. Parkinson, J. S., and E. C. Kofoid. 1992. Communication modules in bacterial signaling proteins. Annu. Rev. Genet. 26:71-112.

151. Phizicky, E. M., and J. W. Roberts. 1981. Induction of SOS functions: regulation of proteolytic activity of E. coli RecA protein by interaction with DNA and nucleoside triphosphate. Cell 25:259-267.

152. Popham, D. L., D. Szeto, J. Keener, and S. Kustu. 1989. Function of a bacterial activator protein that binds to transcriptional enhancers. Science 243:629-635.

153. Preiss, J. 1989. Chemistry and metabolism of intracellular reserves, p. 189-258. In J. C. Poindexter and E. R. Leadbetter (ed.), Bacteria in Nature. Plenum Press, New York.

154. Preiss, J., and T. Romeo. 1989. Phisiology, biochemistry and genetics of bacterial glycogen synthesis. Adv. Microbiol. Phys. 30:183-238.

155. Quiliardet, P., O. Huisman, R. D'Ari, and M. Hofnung. 1982. SOS chromotest, a direct assay of induction of an SOS function in Escherichia coli K-12 to measure genotoxicity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79:5971-5975.

156. Radding, C. M. 1982. Homologous pairing and strand exchange in genetic recombination. Annu. Rev. Genet. 16:405-437.

157. Radman, M. 1975. SOS repair hypothesis: phenomenology of an inducible DNA repair which is accompanied by mutagenesis, p. 355-367. In P. Hanawalt and R. B. Setlow (ed.), Molecular mechanisms for repair of DNA, part A. Plenum Publishing Corp., New York.

158. Raina, S., D. Missakas, and C. Georgopoulos. 1995. The rpoE gene encoding the sigma E (sigma 24) heat shock sigma factor of Escherichia coli. EMBO J. 14:1043-1055.

159. Rampersaud, A., and M. Inouye. 1991. Procaine, a local anesthetic, signals through the EnvZ receptor to change the DNA binding affinity of the transcriptional activator protein OmpR. J. Bacteriol. 173:6882-6888.

160. Rampersaud, A., S. Norioka, and M. Inouye. 1989. Characterization of OmpR binding sequences in the upstream region of the ompF promoter essential for transcriptional activation. J. Biol. Chem. 264:18693-18700.

161. Retallack, D. M., and D. I. Friedman. 1995. A role for a small stable RNA in modulating the activity of DNA-binding proteins. Cell 83:227-235.

162. Roberts, J., and R. Devoret. 1983. Lysogenic induction, p. 123-144. In R. W. Hendrix, J. W. Roberts, F. W. Stahl and R. A. Weisberg (ed.), Lambda II. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

163. Roland, K. L., and J. W. Little. 1990. Reaction of LexA repressor with diisopropyl fluorophosphate. A test of the serine protease model. J. Biol. Chem. 265:12828-12835.

164. Roland, K. L., M. H. Smith, J. A. Rupley, and J. W. Little. 1992. In vitro analysis of mutant LexA proteins with an increased rate of specific cleavage. J. Mol. Biol. 228:395408.

165. Roman, S. J., M. Meyers, K. Volz, and P. Matsumura. 1992. A chemotactic signaling surface on CheY defined by suppressors of flagellar switch mutations. J. Bacteriol. 174:6247-6255.

166. Ronson, C. W., B. T. Nixon, and F. M. Ausubel. 1987. Conserved domains in bacterial regulatory proteins that respond to environmental stimuli. Cell 49:579-581.

167. Russo, F. D., and T. J. Silhavy. 1991. EnvZ controls the concentration of phosphorylated OmpR to mediate osmoregulation of the porin genes. J. Mol. Biol. 222:567-580.

168. Sak, B. D., A. Eisenstark, and D. Touati. 1989. Exonuclease III and the catalase hydroperoxidase II in Escherichia coli are both regulated by the katF product. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3271-3275.

169. Salles, B., and M. Defais. 1984. Signal of induction of RecA protein in Escherichia coli. Mutat. Res. 131:53-59.

170. Sambrook, J., E. F. Fritsch, and T. Maniatis. 1989. Molecular cloning: a laboratory manual; 2-nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

171. Sanders, D. A., C. B. Gillece, A. L. Burlingame, and D. E., Jr. Koshland. 1992. Phosphorylation site of NtrC, a protein phosphatase whose covalent intermediate activates transcription. J. Bacteriol. 174:5117-5122.

172. Sanders, D. A., B. L. Gillece-Castro, A. M. Stock, A. L. Burlingame, and D. E., Jr. Koshland. 1989. Identification of the site of phosphorylation of the chemotaxis response regulator protein, CheY. J. Biol. Chem. 264:21770-21778.

173. Sassanfar, M., and J. W. Roberts. 1990. Nature of the SOS-inducing signal in Escherichia coli. The involvement of DNA replication. J. Mol. Biol. 212:79-96.

174. Sasse-Dwight, S., and J. D. Gralla. 1988. Probing the Escherichia coli glnALG upstream activation mechanism in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8934-8938.

175. Segall, J. E., S. M. Block, and H. C. Berg. 1986. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8987-8991.

176. Segall, J. E., A. Ishihara, and H. C. Berg. 1985. Chemotactic signaling in filamentous cells of Escherichia coli. J. Bacteriol. 161:51-59.

177. Segall, J. E., M. D. Manson, and H. C. Berg. 1982. Signal processing times in bacterial Chemotaxis. Nature (London) 296:855-857.

178. Shapiro, L. 1993. Protein localization and asymmetry in the bacterial cell. Cell 73: 841855.

179. Shepley, D. P., and J. W. Little. 1996. Mutant LexA proteins with specific defects in autodigestion. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 93:11528-11533.

180. Shurvinton, C. E., and R. G. Lloyd. 1982. Damage to DNA induces expression of the ruv gene of Escherichia coli. Mol. Gen. Genet. 185:352-355.

181. Siegel, E. 1983. The Escherichia coli uvrD gene is inducible by DNA damage. Mol. Gen. Genet. 191:397-400.

182. Siegele, D. A., and Kolter, R. 1992. Life after log. J. Bacterid. 174:345-348.

183. Silhavy, T. J., M. L. Berman, and L. W. Enquest. 1984. Experiments with gene fusions. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.

184. Slauch, J. M., F. D. Russo, and T. J. Silhavy. 1991. Suppressor mutations in rpoA suggest that OmpR controls transcription by direct interaction with the alpha subunit of RNA polymerase. J. Bacteriol. 173:7501-7510.

185. Slauch, J. M., and T. J. Silhavy. 1989. Genetic analysis of the switch that controls porin gene expression in Escherichia coli K-12. J. Mol. Biol. 210:281-292.

186. Sledjeski, D., and S. Gottesman. 1995. A small RNA acts as antisilencer of the H-NS-silenced rcsA gene of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 92:2003-2007.

187. Sledjeski, D., A. Gupta, and S. Gottesman. 1996. The small RNA, DsrA, is essential for the low temperature expression of RpoS during exponential growth in Escherichia coli. EMBO J. 15:3993-4000.

188. Spassky, A., S. Rimsky, H. Garreau, and H. Buc. 1984. HI a, an E, coli DNA-binding protein which accumulates in stationary phase, strongly compacts DNA in vitro. Nucl. Acids Res. 12:5321-5340.

189. Stewart, R. C. 1993. Activating and inhibitory mutations in the regulatory domain of CheB, the methylesterase in bacterial Chemotaxis. J. Biol. Chem. 268:1921-1930.

190. Stewart, R. C., A. F. Roth, and F. W. Dahlquist. 1990. Mutations that affect control of the methylesterase activity of CheB, a component of the Chemotaxis adaptation system in Escherichia coli. J. Bacteriol. 172:3388-3399.

191. Stock, J. B., G. S. Lukat, and A. M. Stock. 1991. Bacterial Chemotaxis and the molecular logic of intracellular signal transduction networks. Annu. Rev. Biophys. Biophys. Chem. 20:109-136.

192. Stock, A. M., J. M. Mottonen, J. B. Stock, and C. E. Schutt. 1989a. Three-dimensional structure of CheY, the response regulator of bacterial Chemotaxis. Nature (London) 337:745-749.

193. Stock, J. B., A. J. Ninfa, and A. M. Stock. 19896. Protein phosphorylation and regulation of adaptive responses in bacteria. Microbiol. Rev. 53:450-490.

194. Stock, J. B., A. M. Stock, and J. M. Mottonen. 1990. Signal transduction in bacteria. Nature 344:395-400.

195. Stout, V., and S. Gottesman. 1990. RcsB and RcsC: a two-component regulator of capsule synthesis in Escherichia coli. J. Bacteriol. 172:659-669.

196. Stout, V., A. Torres-Cabassa, M. R. Maurizi, D. Gutnick, and S. Gottesman. 1991. RcsA, an unstable positive regulator of capsular polysaccharide synthesis. J. Bacteriol. 173:1738-1747.

197. Su, W., S. Porter, S. Kustu, and H. Echols. 1990. DNA-looping and enhancer activity: association between DNA-bound NtrC activator and RNA polymerase at the bacterial glnA promoter. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:5504-5508.

198. Swanson, R. V., R. B. Bourret, and M. I. Simon. 1993. Intermolecular complementation of the kinase activity of CheA. Mol. Microbiol. 8:435-441.

199. Tokishita, S., A. Kojima, H. Aiba, and T. Mizuno. 1991. Transmembrane signal transduction and osmoregulation in Escherichia coli: functional importance of the periplasmic domain of the membrane-located protein kinase, EnvZ. J. Biol. Chem. 266:6780-6785.

200. Toman, Z, C. Dambly-Chaudiere, L. Tenenbaum, and M. Radman. 1985. A system for detection of genetic and epigenetic alterations in Escherichia coli induced by DNA-damaging agents. J. Mol. Biol. 186:97-105.

201. Torres-Cabassa, A. S., and S. Gottesman. 1987. Capsule synthesis in Escherichia coli K-12 is regulated by proteolysis. J. Bacteriol. 169:981-989.

202. Torres-Cabassa, A. S., S. Gottesman, R. D. Frederick, P. J. Dolph, and D. L. Coplin. 1987. Control of extracellular polysaccharide synthesis in Erwinia stewartii and Escherichia coli K-12: a common regulatory function. J. Bacteriol. 169:4525-4531.

203. Trisler, P., and S. Gottesman. 1984. Ion transcriptional regulation of genes necessary for capsular polysaccharide synthesis in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 160:184-191.

204. Vales, L. D., J. W. Chase, and J. B. Murphy. 1980. Effect of ssbAl and lexC113 mutations on lambda prophage induction, bacteriophage growth, and cell survival. J. Bacteriol. 143:887-896.

205. van Laere, A. 1989. Trehalose, reserve and/or stress metabolite? FEMS Microbiol. Rev. 63:201-210.

206. Vieira, J., and J. Messing. 1982. The pUC plasmids, an M13 mp7-derived system for insertion mutagenesis and sequencing with synthetic universal primers. Gene 19:259-268.

207. Volz, K., and P. Matsumura. 1991. Crystal structure of Escherichia coli CheY refined at 1.7-Ä resolution. J. Biol. Chem. 266:15511-15519.

208. Wada, A., Y. Yamazaki, N. Fujita, and A. Ishihama. 1990. Structure and probable genetic location of a "ribosome modulation factor" associated with 100S ribosomes in stationary-phase Escherichia coli cells. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 87:2657-2661.

209. Walker, G. C. 1984. Mutagenesis and inducible responses to DNA damage in Escherichia coli. Microbiol. Rev. 48:60-93.

210. Walker, G. C. 1985. Inducible DNA repair systems. Annu. Rev. Biochem. 54:425-457.

211. Walker, G. C. 1996. The SOS response of Escherichia coli, p. 1400-1416. In F. C. Neidhardt, R. Curtiss III, J. L. Ingraham, E. C. Lin, K. B. Low, B. Magasanic, W. S. Reznikoff, M. Riley, M. Schaechter and H. E. Umbarger (ed.), Escherichia coli and Salmonella, Cellular and Molecular Biology. American Society for Microbiology, Washington, D. C.

212. Wanner, B. L. 1992. Is cross regulation by phosphorylation of two-component response regulator proteins important in bacteria? J. Bacteriol. 174:2053-2058.

213. Way, J. C., M. S. Davis, D. Morisato, D. E. Roberts, and N. Kleckner. 1984. New TnlO derivatives for transposon mutagenesis and for construction of lacZ operon fusions by transposition. Gene 32:369-379.

214. Wedel, A., D. S. Weiss, D. Popham, P. Droge, and S. Kustu. 1990. A bacterial enhancer functions to tether a transcriptional activator near a promoter. Science 248:486490.

215. Weiss, D. S., J. Batut, K. E. Klose, J. Keener, and S. Kustu. 1991. The phosphorylated form of the enhancer-binding protein NTRC has an ATPase activity that is essential for activation of transcription. Cell 67:155-167.

216. Weiss, D. S., F. Claverie-Martin, and B. Magasanik. 1992. Phosphorylation of nitrogen regulator I of Escherichia coli induces strong cooperative binding to DNA essential for activating of transcription. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89:5088-5092.

217. Weiss, D. S., and B. Magasanik. 1988. Phosphorylation of nitrogen regulator I (NRi) of Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85:8919-8923.

218. Whittier, R. F., and J. W. Chase. 1983. DNA repair properties of Escherichia coli tif-1, recAo281 and lexAl strains deficient in single-strand DNA binding protein. Mol. Gen. Genet. 190:101-111.

219. Witkin, E. M. 1976. Ultraviolet mutagenesis and inducible deoxyribonucleic acid repair in Escherichia coli. Bacteriol. Rev. 40:869-707.

220. Wolfe, A. J., and R. Stewart. 1993. The short form of the Che A protein restores kinase activity and chemotactic ability to kinase-deficient mutants. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:1518-1522.

221. Wootton, J. C., and M. H. Drummond. 1989. The Q-linker: a class of interdomain sequences found in bacterial multidomain regulatory proteins. Protein Eng. 2:535-543.

222. Wylie, D., A. M. Stock, C. Y. Wong, and J. B. Stock. 1988. Sensory transduction in bacterial Chemotaxis involves phosphotransfer between Che proteins. Biochem. Biophys. Res. Commun. 151:891-896.

223. Yang, Y., and M. Inouye. 1991. Intermolecular complementation between two defective mutants of Escherichia coli signal-transducing receptors. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 88:11057-11061.

224. Yim, H. H., and M. Villarejo. 1992. osmY, a new hyperosmotically inducible gene, encodes a periplasmic protein in Escherichia coli. J. Bacteriol. 174:3637-3644.

225. Yura, T., H. Nagai, and H. Mori. 1993. Regulation of heat-shock response in bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 47:321-350.

226. Zaug, A. J., and T. R. Cech. 1986. The intervening sequence RNA of Tetrahymena is an enzyme. Science 231:470-475.

227. Zinkevich-Peotti, K., and J. M. Fraser. 1988. New locus for exopolysaccharide overproduction in Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 170:1405-1407.

228. Zissler, J., E. Signer, and F. Schaffer. 1971. The role of recombination in growth of bacteriophage lambda. I. The gamma gene, p. 455-468. In A. D. Hershey (ed.), The bacteriophage lambda. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York.