Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus Intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus Subtilis на разных фазах роста тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Михайлова, Екатерина Олеговна

• Михайлова, Екатерина Олеговна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Михайлова, Екатерина Олеговна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Основные принципы классификации протеолитических И ферментов

2. Сериновые протеиназы

2.1 Классификация сериновых протеиназ

2.2. Эволюция сериновых протеиназ

2.3. Субтилазы - субтилизиноподобные сериновые протеиназы

2.4. Структура и механизм катализа субтилизиноподобных протеиназ

2.5. Свойства субтилизиноподобных протеиназ

2.6. Многообразие физиологических функций сериновых протеиназ

4. Применение субтилизиноподобных протеаз

5. Генная инженерия субтилизиноподобных протеаз бацилл 47 Заключение

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Объект исследования и условия его культивирования

2. Определение протеолитической активности

3. Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного штамма

4. Электрофорез в ПААГ

5. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF)

6. Аминокислотный анализ

7. Определение субстратной специфичности

8. Влияние ингибиторов на активность субтилизиноподобной 60 протеиназы

9. Физико-химические и энзиматические свойства 60 субтилизиноподобной протеиназы

10. Спектральный анализ препаратов субтилизиноподобной 62 протеиназы

11. Гель-фильтрация

12. Биоинформационный анализ

13. Математическая обработка результатов 63 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Подбор питательной среды для эффективной продукции 64 протеиназы Bacillus intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis

2. Выделение и очистка и субтилизиноподобной протеиназы В. intermedius, соответствующей разным стадиям роста рекомбинантного штамма

3. Масс-спектрометрический анализ

4. Анализ первичной структуры протеиназы

5. Влияние ингибиторов на активность протеиназы AprBi

6. Субстратная специфичность препаратов фермента

7. Кинетические параметры

8. Температурный оптимум и термостабильность

9. рН-оптимум и рН-стабильность протеиназ

10. Стабильность препаратов протеиназы в присутствие различных 92 агентов

11. Спектральный анализ препаратов протеиназы В. intermedius, 93 соответствующей разным стадиям роста

12. Влияние ионов двухвалентных металлов на препараты 99 протеиназы

13. Гель-фильтрация препаратов протеиназы, соответствующих 101 разным стадиям роста

14. Электрофорез препаратов протеиназы в нативных условиях

15. Гель-фильтрация после исчерпывающего обессоливания 104 препаратов протеиназы В. intermedius

16. Построение модели третичной структуры субтилизиноподобной Ю протеиназы В. intermedins

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

I. Подбор среды культивирования, выделение и очистка 108 протеиназы, соответствующей разным стадий роста

II. Свойства препаратов протеиназы разных стадий роста ИЗ

III. Особенности структуры протеиназы, секретируемой на разных 124 стадиях роста

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Субтилизиноподобная протеиназа Bacillus Intermedius, секретируемая рекомбинантным штаммом Bacillus Subtilis на разных фазах роста»

Актуальность проблемы. Субтилизиноподобные сериновые протеазы - группа протеолитических ферментов, которые обнаружены на всех ступенях эволюционной лестницы: вирусах, бактериях, археях, грибах и высших эукариотах [Rawlings, Barett, 1994]. Несмотря на высокую степень филогенетической удаленности организмов, синтезируемые ими протеиназы имеют немало общего в строении и функциях, что позволяет сделать заключение об эволюционном родстве этих ферментов. Для многих субтилаз известна третичная структура. Распространенность субтилаз в природе свидетельствует о том, что они являются жизненно-важными ферментами. Разнообразие этих белков находит отражение в функционировании субтилаз. Круг процессов, в которые вовлечены эти ферменты, обширен благодаря отсутствию узкой специфичности, сохранению каталитической активности в широких пределах рН и температур, а также различной клеточной локализации. Доказано их участие в процессах эмбриогенеза эукариот, а также в различных патологических состояниях: от болезни Альцгеймера и рака до лихорадки Эбола и ВИЧ [Henrich et al., 2003; Thomas, 2002]. Современная наука располагает данными более чем о 550 прокариотических субтилизиноподобных протеиназ, их число постоянно растет [Siezen et al., 2007]. В клетках прокариот они участвуют в разнообразных физиологических процессах, включая клеточную дифференцировку. Тем не менее, сведения о механизмах вовлечения протеаз в различные процессы, и, в частности, в формирование клеточного ответа в стационарной фазе роста, ограничены. Дальнейшие исследования в этой области будут способствовать пониманию молекулярных механизмов участия этих ферментов в реакциях адаптации микроорганизмов к меняющимся условиям среды.

Ранее показано, что бактерии Bacillus intermedius секретируют различные протеиназы, среди которых доминирует субтилизиноподобная сериновая протеиназа (AprBi); ее доля составляет до 80% от пула внеклеточных протеиназ, выделяемых этими бактериями в среду [Шарипова с соавт., 2000]. Ген субтилизиноподобной протеиназы клонирован в мультикопийную плазмиду pCS9, его экспрессия изучена в рекомбинантном штамме Bacillus subtilis [Sharipova et al., 2007]. Показано, что накопление фермента Bacillus intermedins в культуральной жидкости рекомбинантного штамма достигает максимального значения на 28 (ранняя протеиназа) и 48 ч (поздняя протеиназа) роста. Установлено, что в процессе роста культуры происходит смена механизмов регуляции экспрессии гена протеиназы.

Целью работы явились выделение и характеристика субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedins, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus snbtilis в ранней и поздней стационарной фазе роста.

Основные задачи исследования:

1. Подбор условий культивирования для выделения протеиназы Bacillus intermedins из рекомбинантного штамма Bacillus subtilis на ранней (ранняя протеиназа) и поздней (поздняя протеиназа) стационарной фазе роста культуры.

2. Очистка субтилизиноподобной протеиназы Bacillus intermedins, секретируемой рекомбинантным штаммом Bacillus subtilis на ранней и поздней стационарной фазе роста культуры.

3. MALDI-TOF и BLAST анализ аминокислотных последовательностей протеиназы раннего и позднего стационара.

4. Исследование физико-химических свойств субтилизиноподобной протеиназы, соответствующей разным стадиям роста рекомбинантного штамма.

5. Выяснение роли ионов кальция в стабилизации структуры протеиназы, соответствующей разным стадиям культивирования рекомбинантных бактерий.

Научная новизна. Впервые выделена и охарактеризована внеклеточная субтилизиноподобная протеиназа В. intermedins, соответствующая разным стадиям роста рекомбинантного штамма В. subtilis. Впервые проведена сравнительная характеристика свойств протеиназы, секретируемой бациллами в начале и конце стационарной фазы. Установлено, что, обладая идентичной аминокислотной последовательностью, ферменты различаются по каталитическим свойствам. Получены приоритетные данные о способности протеиназы, секретируемой в позднюю стационарную фазу, образовывать димеры. Предполагается, что ведущая роль в формировании димеров принадлежит ионам кальция в кальций-связывающих центрах на поверхности белковой глобулы. На основании аминокислотной последовательности протеиназы предложена модель третичной структуры.

Практическая значимость результатов: Подобраны условия культивирования бактерий для эффективной продукции фермента, секретируемого на ранней и поздней стационарной фазе роста и разработаны условия очистки этих ферментов. Результаты могут быть использованы при разработке стратегии синтеза ферментов промышленными штаммами бактерий. Получение гомогенных препаратов ферментов увеличивает арсенал белков, используемых в научных исследованиях и в практических целях. Данные по стабильности белка открывают возможность применения протеиназы AprBi в качестве добавок к различным детергентам, фармацевтике и в генноинженерных исследованиях.

Связь работы с научными программами: Работа выполнялась в соответствии с планом НИР КГУ (№ гос. регистрации 01.02.00 104982 «Биосинтез, биогенез, классификация, физиологические функции новых микробных ферментов и возможные области их практического применения»). Исследования поддержаны грантами РФФИ 05-04-48182-а, Академии наук РТ № 03-3.5-20 и Аналитической Ведомственной Целевой Федеральной Программы РНП 2.11.1005. Положения, выносимые на защиту.

1. Выделена и охарактеризована субтилизиноподобная сериновая протеиназа Bacillus intermedius рекомбинантного штамма Bacillus subtilis, секретируемая в раннюю и позднюю стационарную фазу роста.

2. Ранняя и поздняя протеиназы рекомбинантного штамма Bacillus subtilis имеют идентичную аминокислотную последовательность и близкие энзиматические свойства, но отличаются по каталитическим характеристикам.

3. Поздняя протеиназа Bacillus subtilis, в отличие от ранней, образует димеры, в формировании которых участвуют ионы кальция. Апробация работы: Матерйалы диссертации доложены и обсуждены на международных, всероссийских и региональных конференциях: "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005, 2006, 2007), школах-конференциях молодых ученых "Биология - наука XXI века" (Пущино, 2005, 2006), Всероссийской научной конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2004), Всероссийской научной конференции "Ферменты микроорганизмов: структура, функции, применение" (Казань, 2005), V республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Наука. Инновации. Бизнес» (Казань, 2005), Международной конференции аспирантов и молодых ученых «Ломоносов», (Москва, 2005, 2006, 2007), Материалах XLIII международной научной студенческой конференции «Студент и научно-технический прогресс» секция биология (Новосибирск, 2005), BGRS-2006: Proceedings of the fifth international conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure (Novosibirsk, 2006), VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 2007).

Публикации: По теме диссертации опубликовано 19 научных работ. Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, раздела экспериментальных исследований и обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на страницах машинописного текста, включает 10 таблиц, 21 рисунок. Библиография содержит 293 наименований российских и зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Михайлова, Екатерина Олеговна

выводы

1. Подобран состав питательной среды, обеспечивающий высокий уровень активности ранней (28 ч роста) и поздней (48 ч роста) протеиназы Bacillus intermedius в культуральной жидкости рекомбинантного штамма Bacillus subtilis.

2. Из культуральной жидкости рекомбинантного штамма Bacillus subtilis выделена субтилизиноподобная протеиназа Bacillus intermedius, соответствующая разным часам роста, со степенью очистки, составляющей 711 для ранней и 745 - для поздней протеиназы и выходом по активности 9,6 и 16,4%, соответственно.

3. Методом масс-спектрометрии установлено, что ранняя и поздняя протеиназа AprBi имеют идентичную последовательность аминокислот, их N- и С- концы совпадают.

4. Выявлены различия в каталитических свойствах протеиназы AprBi, секретируемой в раннюю и позднюю стационарную фазу роста.

5. Установлено, что поздний фермент образует димеры, в формировании которых участвуют ионы кальция.

Заключение

Субтилизиноподобные сериновые протеазы, обнаруженные у животных и растений, архей и грибов, бактерий и вирусов, представляют собой интереснейший объект как с точки зрения физиологии, так и промышленного применения. Потребность в этих белках у про- и эукариот, а также широкий спектр, выполняемых ими функций, характеризуют субтилизиноподобные протеазы как эволюционно древние ферменты. В течение миллиардов лет физиологическая и молекулярная адаптация прокариотических организмов обеспечили им возможность выживания в любой экологической нише, даже там, где никакие другие формы жизни не могли бы существовать. Определенную роль в этом событии сыграли субтилазы. Участие в патологических состояниях, процессах образования спор и других покоящихся форм могут сделать субтилизиноподобные ферменты незаменимым помощником в решении многих проблем современной биологии и медицины. Обладая разнообразием свойств: широкой субстратной специфичностью, стабильностью при высоких и низких температурах, высокой каталитической активностью в щелочных средах, субтилазы представляют собой основу для создания биотехнологических производств. Микробы - наиболее предпочтительный источник этих ферментов ввиду их быстрого роста, методов культивирования и возможности создания генно-инженерных штаммов и белков. Открытие за последние десятилетия огромного количества прокариотических субтилаз, изучение механизмов экспрессии генов и биохимических свойств этих протеаз, тем не менее, оставляют немало вопросов относительно физиологической роли этих ферментов. Именно поэтому, изучение структурных особенностей субтилизиноподобных протеиназ и механизмов их участия в различных метаболических процессах, включая клеточный ответ в период стационарной фазы, необходимо для понимания функционирования этих белков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 1. Объект исследования и условия его культивирования

Объектом исследования являлся рекомбинантный штамм Bacillus subtilis. Он получен путем трансформации плазмиды pCS9 в протеазо-дефицитный штамм В. subtilis AJ73, из хромосомы которого делегированы гены внеклеточных протеиназ (штамм любезно предоставлен проф. Ю Йомантасом). Мультикопийная плазмида pCS9, сконструированная на основе вектора рСВ22, несет полный ген субтилизиноподобной сериновой протеиназы В. intermedius под собственным промотором (плазмида pCS9 получена в ИМГ, РАН и предоставлена для работы проф. С.В. Костровым).

Pstl(6) НтШ (14)

Ndel (231)

Hindlll (12102)

Ват HI (11276)

Hindlll (11223)

REP 19035

Ndel (10211) J aprBi pCS9

13666 bp

Nco I (9970) Bsp 1191(9583) promoter aprBi

7249(d1) coRV (8281)

Hindlll (7796)

EcoRV (7231) coRI (2649)

Eel 13611 (2657) Kpn I (2665) Sma 1(2667)

EcoRl (3024) Hindlll (3055)

Hindlll (4859) £coRV (5017)

EcoRI (6258)

Sal I (6504)

Рис. 1. Плазмида pCS9 Трансформацию клеток В. subtilis плазмидной ДНК проводили по методу [Anagnostopolous et al., 1961]. Рекомбинатный штамм В. subtilis культивировали в колбах объемом 100 мл при соотношении объема среды к объему колбы 1:5 на качалке 200 об/мин при 30°С. Для культивирования клеток В. subtilis AJ73 (pCS9) были использованы среды следующего состава о): бактериологический пептон («Sigma») - 2, СаС12-2Н20 - 0,06,

MgS04-7H20 - 0,05, NaCl - 0,3, NH4CI - 0,02, MnS04 - 0,01, Na2HP04 - 0,035, pH - 8,5 (пептон-содержащая среда); L-бульон (среда LB, Лурия-Бертани): триптон -10 г/л; дрожжевой экстракт -5 г/л; NaCl -5 г/л; рН 8,5 [Sambrook et al., 1989]. Для получения максимальной продукции субтилизиноподобной протеиназы использовали колламин в концентрации 1, 2% в качестве добавки к среде LB и пептон-содержащей среде. Также производили замену пептона («Sigma») на ферментативный пептон в концентрациях 10-30 г/л. В среды культивирования непосредственно перед посевом добавляли эритромицин в концентрации 20 мкг/мл, так как плазмида pCS9 несет ген устойчивости к данному антибиотику. Посевным материалом служила 18-часовая культура. Среды стерилизовали при 1 атм. Раствор неорганического фосфата стерилизовали при том же давлении и вносили в среды культивирования непосредственно перед посевом.

Контроль за ростом культуры осуществляли, определяя изменение оптической плотности (DonT) культуры. Прирост биомассы определяли нефелометрически на ФЭК-56 ПМ со светофильтром 9 при длине волны 590 нм. За единицу биомассы принимали поглощение в 1-см кювете.

Белок определяли спектрофотометрически (Экспериментальные методы исследования белка и нуклеиновых кислот, 1985), считая, что концентрация белка 1 мг/мл соответствует A2so = 1 оптической единице (опт. ед.) в кювете толщиной 1 см, а также по методу Брэдфорд [Bradford, 1976]. 2. Определение протеолитической активности Определение казеинолитической активности

Протеолитическую активность определяли, используя в качестве субстрата казеин по методу Каверзневой [Каверзнева, 1971]: Казеин в концентрации 2% растворяли в 0,1 М Трис-HCl буфере, рН 9,0. Смесь из 1 мл казеина и 1мл культуральной жидкости инкубировали 15 мин при 37°С, затем добавляли 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали при той же температуре еще 20 мин. Смесь пропускали через фильтр. К 1 мл фильтрата добавляли 5 мл 6%-ной Ыа2СОз и 1 мл реактива Фолина. Смесь ставили на 20 мин в темноту для полного проявления окраски, а затем измеряли оптическую плотность при длине волны 670 нм на ФЭКе. Параллельно ставили контроль на свободный тирозин следующим образом: смешивали 1 мл культуральной жидкости и 2 мл 5%-ной ТХУ и инкубировали 20 мин при 37°С, после чего добавляли 1 мл 2%-ного казеина и выдерживали еще 15 мин при той же температуре. С фильтратом поступали, как описано выше. Протеолитическую активность рассчитывали по формуле:

ПА = (да,где

Do-Dk - разность поглощения опытной и контрольной пробы при 670 нм; 28 - коэффициент, учитывающий все разведения в процессе определения активности,

Р - предварительное разведение ферментного раствора, 15 - время инкубации, мин.

За единицу казеинолитической активности принимали количество фермента, необходимое для образования 1 мкМ тирозина за 1 мин на 1 мл ферментного раствора.

Определение протеолитической активности на азоказеине

Активность на азоказеине определяли по отщеплению красителя от азоказеина («Sigma», США). Субстратом являлся 1% раствор в 0, 05 М Т-НС1 буфере, рН 8,5. К 200 мл фермента добавляли 400 мкл субстрата. Смесь инкубировали при 37°С. Реакцию останавливали 5% ТХУ и выдерживали в ледяной бане в течение 5 мин. Далее центрифугировали при 13000 об/мин в течение 3 мин. Затем к 1200 мкл супернатанта добавляли 240 мкл 4Н NaOH и измеряли поглощение при длине волны 410 нм. Расчет проводили по формуле: -2-дс-ЮОО

A=-iis- где

30-200

2 - пересчет на 1 см кювету

1000 - коэффициент пересчета на 1 мл ферментного раствора 30 - время инкубации, мин х - предварительное разведение

За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в данных условиях 1 мкл субстрата за 1 мин.

Определение специфической протеолитической активности

Специфическую активность субтилизиноподобных протеиназ определяли по расщеплению хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa по методу Люблинской и др. [Люблинская с соавт., 1987]. Реакционная смесь состояла из 500 мкл субстрата (0,5 мг/мл) Z-Ala-Ala-Leu-pNa, растворенного в диметилформамиде, 2 мл 0,05 М Трис-HCl буфера, рН 8,5 и 50 мкл раствора фермента. Смесь инкубировали при 37°С от 2 до 60 минут до появления соломенно-желтого окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл 50%-й уксусной кислоты. В контрольную пробу, содержащую 500 мкл субстрата и 200 мкл уксусной кислоты, после инкубации при 37°С одновременно с опытной пробой добавляли 50 мкл фермента, и измеряли на спектрофотометре SmartSpec Plus (BioRad, USA) оптическую плотность опытной пробы против контрольной при 410 нм в 1 см кювете.

Активность рассчитывали по формуле: где ПА - активность, мкМ/мин на 1 мл ферментного раствора; D - поглощение раствора при 410 нм; Р = 1000 (расчет на 1 мл раствора фермента); К = 0,37 - коэффициент, учитывающий молярную экстинкцию субстрата;

В - объём пробы фермента в реакционной смеси; Т - время инкубации, мин. За единицу активности принимали количество фермента, гидролизующего в условиях эксперимента 1 мкмоль субстрата за 1 мин. Удельную активность выражали в ед/мг белка.

3. Выделение и очистка протеиназы рекомбинантного штамма

Выделение субтилизиноподобной протеиназы В. intermedins, на разных фазах роста культуры, из 1 л культуральной жидкости В. subtilis проводили с помощью ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе и в системе FPLC на колонке Mono S. В культуральной жидкости рН доводили до 6,3. Культуральную жидкость освобождали от клеток центрифугированием в течение 50 мин при 3000 об/мин на центрифуге К-70 (Janetzki, Польша). Супернатант разбавляли дистиллированной водой в 10 раз и добавляли к КМ-целлюлозе, уравновешенной 0,015 М Na-ацетатным буфером, рН 6,3. Ионообменную хроматографию на КМ-целлюлозе проводили в объеме в течение 35-45 мин, постоянно перемешивая ионообменник. Затем КМ-целлюлозу помещали на колонку, промывали тем же буфером и элюировали белки 0,2 М Na-ацетатным буфером, рН 6,3. В собранных фракциях определяли количество белка и специфическую активность. Фракции с высокой протеолитической активностью объединяли, разбавляли водой в 12 раз и наносили на колонку Mono S 5/5 в системе FPLC «Pharmacia» (Швеция), уравновешенную Na-ацетатным буфером, рН 6,3, содержащим 0,5 мМ СаС12. Элюцию проводили линейным градиентом NaCl (0 - 0,5 М) в том же буфере со скоростью 1 мл/мин. В собранных фракциях определяли специфическую протеолитическую активность и количество белка.

4. Электрофорез в ПААГ Электрофорез в денатурирующих условиях

Степень чистоты полученных белковых препаратов и их молекулярную массу определяли электрофоретически. Электрофорез проводили в 12,5% ПААГ в присутствии SDS по методу Лаэммли [Laemmli, 1970].

Концентрация акриламида в геле составляла 12,5%, бисакриламида -0,12%. Электродный буфер содержал 20,6 мМ т-НС1 и 0,24 М глицина, рН 8,3 -8,4. В верхний буфер добавляли SDS до концентрации 0,1 %. Пробу готовили следующим образом: к раствору белка добавляли равный объем раствора, содержащего 24% глицерина, 4% SDS, 10% меркаптоэтанола и инкубировали 5 мин при 100°С. Оптимальное количество белка, наносимого на одну дорожку геля, равно 5 мкг. Электрофорез проводили в следующем режиме: первые 30 мин сила тока была равна 20 мА, затем силу тока увеличили до 40 мА. Фиксировали гель в растворе, содержащем 45 % этанола и 10% уксусной кислоты в течение часа. Затем гель окрашивали Кумасси ярко-голубым (0,2% Кумасси «Serva», 45% метанола или этанола, 10% уксусной кислоты) в течение 15-20 мин, после чего отмывали в 7% уксусной кислоте и высушивали. В качестве маркеров использовали РНКазу (Биназу) (12,3 кДа), лизоцим (14,4 кДа), РНКазу А (15,7 кДа), ингибитор трипсина (21,5 кДа), пероксидазу (40 кДа) и БСА (бычий сывороточный альбумин) (66 кДа).

Электрофорез в нашивных условиях

Электрофорез белков в нативных условиях проводили по методу, описанному на сайте http://wolfson.huji.ac.il/purification/Protocols/PAGEAcidic.html).

Электрофорез белков проводили в кислых условиях, так как изоэлектрическая точка лежит в щелочной области [Balaban et al., 2004]. Концентрация акриламида в геле составляла 10,0%, бисакриламида - 0,8%. Электродный буфер содержал 35 мМ /3-аланин, 14 мМ уксусную кислоту, рН 4,3. Верхний буфер содержал 1,5 М Na-ацетатный буфер, рН 4,3 и 50% глицерин. Пробу готовили следующим образом: к раствору белка добавляли равный объем раствора, содержащего 50 % глицерина, 25 мМ Na-ацетатный буфер, рН 6,8 и метиленовый зеленый. Электрофорез проводили в режиме, аналогичном электрофорезу в денатурирующих условиях. В качестве маркеров использовали лизоцим (14,4 кДа), фосфатазу (56 кДа) и гемоглобин (68 кДа).

5. Масс-спектрометрический анализ (MALDI-TOF)

Очищенные белковые фракции, соответствующие разным стадиям роста культуры (28 и 48 ч), анализировали с помощью метода масс-спектрометрии. Растворы протеиназы В. intermedius обрабатывали трипсином по методике, изложенной на сайте (http://www.biochem.unitzh.ch /services/protocol/ ingeldigestion.pdf). Полученные пептиды различной молекулярной массы идентифицировали на масс-спектрометре Vision 2000 TOF («ThermoBioanalysis», Великобритания). Полученные данные обрабатывали с помощью программ Peptide Mass Fingerprint (http://www.matrixscience.com.) и Peptide Mass (http://cn.expasy.org).

6. Аминокислотный анализ

Аминокислотный состав протеиназ определяли после гидролиза 5,7 Н HCI при 105° в течение 48 часов на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония). Остатки полуцистина и метионина определяли после их окисления надмуравьиной кислотой, триптофан - после гидролиза белка метансульфоновой кислотой в присутствии 0,2%-ного триптамина.

7. Определение субстратной специфичности

Субстратную специфичность полученных фракций ферментов определяли на синтетических и-нитроанилидных субстратах Glp-'Ala-Ala-Leu-pNa, Glp-Phe-Ala-Ala-pNa, Z-Ala-Ala-Val-pNa, Glp-Phe-Gly-pNa, Z-Ala-Ala-Leu-pNa, Z-Glu-pNa, растворенных в 20%-ном ДМФА в конечной концентрации 2 мг/мл, как описано ранее. Расщепление синтетических олигопептидов проводили в 0,05 М Трис-HCI буфере, рН 8,5 при 37°С до появления соломенно-желтого окрашивания. Реакцию останавливали добавлением 200 мкл 50%-й уксусной кислоты.

Специфичность протеиназ изучали по действию на В-цепь окисленного инсулина овцы как описано в работе [Ицкович с соавт., 1997]. К растворам субстратов в концентрации 1 мг/мл в 0,025 М Трис-HCI, рН 8,5 с 5 мМ СаС12 добавляли 10 мкл раствора фермента (1 мкг/мл) в том же буфере и инкубировали 4 часа при 37°С. Высушенные гидролизаты разделяли в режиме FPLC на колонке (4,6 х 250 мм) Ultrasphere Octyl, используя линейный градиент вода - 70% ацетонитрила в присутствии 0,1% CF3COOH. Элюаты регистрировали при 215 и 280 нм и анализировали на аминокислотном анализаторе Hitachi 835 (Япония) [Leshchinskaya et al., 1997].

8. Влияние ингибиторов на активность субтилизиноподобной протеиназы

Влияние различных ингибиторов на активность субтилизиноподобной протеиназы изучали с помощью овомукоида, ингибитора из морской анемоны, ингибитора трипсина и о-фенантролина в соотношении фермент: ингибитор 1:10, а также PMSF, DTT, пХМБ, бензамидина, ЭДТА в соотношении 1:1000. Раствор белка инкубировали с ингибитором в течение 1 ч при 37°С в Трис-HCl буфере, рН 8,5, специфическую протеолитическую активность определяли в отношении хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa, как описано выше.

9. Физико-химические и энзиматические свойства субтилизиноподобной протеиназы рН-оптимум и рН-стабильность

Для определения рН-оптимума активность ферментов по отношению к Z-Ala-Ala-Leu-pNa определяли в 0,1 М универсальном буфере и 0,05 М Трис-HCl буфере. 0,1 М универсальный буфер содержал 0,04 М растворы СНзСООН, Н3Р04 и Н3ВО3, рН доводили 0,2 М NaOH. Для определения рН-стабильности проводили инкубацию растворов белков в универсальном буфере в течение 1 ч при 25°С, далее добавляли раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность при 37°С, как описано выше. Температурный оптимум и термостабилъностъ

Для определения температурного оптимума активность ферментов по отношению к субстрату Z-Ala-Ala-Leu-pNa измеряли при температуре от 0 до 65°С. Для изучения термостабильности растворы ферментов в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,5, инкубировали при температурах от 0 до 70°С в течение 30 мин, затем добавляли раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность при 37°С, как описано выше. Изучение влияния ионов Са2+ на термооптимум и термостабильность белковых фракций проводили в Трис-HCl буфере, содержащем 5 мМ СаС12, как описано выше. Кинетические константы

Кт для полученных белковых фракций В. intermedius, секретируемых В. subtilis определяли по гидролизу специфического хромогенного субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa с использованием двулучевого спектрофотометра Lambda 35 «Perkin Elmer» (США). Расчеты проводили при помощи графика, построенного в координатах Лайнуивера-Берка в программной среде «Excel». Каталитическую константу &кат рассчитывали по формуле: ^кат — Vmax/[E] ■> где [Е] - концентрация фермента. Влияние ионов металлов на активность субтилизиноподобной протеиназы

Для изучения влияния ионов двухвалентных металлов на активность субтилизиноподобной протеиназы растворы ферментов инкубировали в 0,05 М Трис-HCl буфере, рН 8,5, содержащем Mn2+, Ni2+, Cu2+, Со2+, Са2+ и Mg2+ в концентрации от 5 до 20мМ в течение 30 мин при 37°С. Далее добавляли раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность при 37°С, как описано выше. За 100% принята удельная активность фермента без внесения металлов.

Влияние Н2О2 на активность субтилизиноподобной протеиназы

Для изучения влияния Н202 на активность препаратов фермента, соответствующего разным фазам роста, проводили прединкубацию растворов фермента в 0,05 М Трис-НС1-буфере, содержащем 10, 20 и 40 мМ Н202 в течение 1 и 24 ч при 37°С, далее добавляли раствор Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность, как описано выше. Влияние С2Н5ОН на активность субтилизиноподобной протеиназы

Изучение влияния этанола на активность протеиназ проводили в 0,05 М Трис-НС1-буфере, содержащем 5, 10, 25 и 50% С2Н5ОН. После прединкубации ферментных растворов с растворами этанола, активность определяли, как описано выше.

Влияние NaCl на активность субтилизиноподобной протеиназы

Для изучения влияния различных концентраций NaCl на стабильность препаратов протеиназы проводили прединкубацию ферментативных растворов в 0,05 М Трис-НС1-буфере, содержащем 0,5, 1, 2, 5, 10, 15 и 20% NaCl, в течение 1 и 24 ч при 37°С, далее добавляли раствор субстрата Z-Ala-Ala-Leu-pNa в 20%-ном ДМФА и определяли активность, как описано выше.

10. Спектральный анализ фракций субтилизиноподобной протеиназы

Спектры гомогенных препаратов белка снимали на двулучевом спектрофотометре Lambda 35 «Perkin Elmer» (США) в диапазоне от 200 до 500 нм.

11. Гель-фильтрация протеиназы

Гель-фильтрацию ферментных растворов проводили на колонке с сефадексом G-100 («Pharmacia», Швеция). В качестве буфера использовали 50 мМ Трис-HCl, содержащий 120 мМ КС1, рН 8,5. В качестве маркеров использовали лизоцим (14,4 кДа), ингибитор трипсина (21,5 кДа), пероксидазу (40 кДа) и БСА (66 кДа). Свободный объем колонки детектировали с помощью голубого декстрана.

Диализ белковых растворов для удаления ионов Са из ферментных растворов проводили против 50 мМ Трис-HCl буфера, содержащего 1% ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота), рН 8,5.

12. Биоинформационный анализ

Выравнивание аминокислотной последовательности протеиназы AprBi с последовательностями других субтилизиноподобных протеиназ, а также построение филогенетического древа фермента проведено с помощью программы BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Процентное соотношение аминокислот в последовательности субтилизиноподобной протеиназы В. intermedius, а также Индекс нестабильности, алифатический индекс и GRAVY индекс рассчитаны с помощью программы ProtParam (www.expasy.org) [Ikai, 1980; Kyte, Doolittle, 1982; Guruprasad et al., 1990].

Модель третичной структуры построена на основании аминокислотной последовательности протеиназы AprBi в программах SwissProt (www.au.expasy.org/spdbv) и YASARA (www. yasara.org). 13. Математическая обработка результатов

Результаты многофакторных экспериментов обрабатывали с помощью программы STATGRAPHICS для персональных компьютеров, позволяющей выводить на экран уравнение регрессии, степень достоверности модели и графические изображения поверхности отклика.

Математическую обработку результатов проводили с помощью программы Microsoft Excel путем расчета среднеквадратичного отклонения (а). Результаты считали достоверными при среднеквадратичном отклонении а< 10%. В качестве критерия достоверности получаемых разностей использовали критерий Стьюдента, принимая Р<0.05 за достоверный уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Подбор питательной среды для эффективной продукции протеиназы B.intermedius, секретируемой рекомбинантным штаммом В. subtilis

После трансформации плазмиды pCS9, несущей ген сериновой протеиназы В. intermedius в протеазо-дефицитный штамм В. subtilis AJ73 изучали экспрессию гена в рекомбинантном штамме. Накопление протеиназы В. intermedius (протеиназы AprBi) в культуральной жидкости рекомбинантного штамма начинается в фазе замедления роста, достигает максимального значения на 28 и 48 ч роста и зависит от состава питательной среды. Проводили подбор питательной среды для эффективной продукции протеиназы, соответствующей этим часам роста. Для этого варьировали концентрации основных источников азота - пептона и триптона в составе среды культивирования. Наряду с ними использовали колламин в качестве более дешевой замены пептона и триптона в условиях масштабирования процесса очистки. Как видно из таблицы 1, максимальный уровень активности субтилизиноподобной протеиназы в культуральной жидкости отмечен для пептон-содержащей среды и среды LB без внесения дополнительных компонентов и замен одного источника азота на другой: пептона и триптона - на колламин, бактериологического пептона - на ферментативный пептон. Активность фермента в пептон-содержащей среде составила для ранней протеиназы - 0,54 ед/мг, для поздней протеиназы - 1,24 ед/мг, в среде LB - 0,51 и 1,17 ед/мг соответственно. Замена пептона на колламин, а также внесение последнего в качестве дополнительного источника питания снижали активность протеиназы, более чем в 2 раза (0,230,35 ед/мг - для ранней протеиназы, 0,5-0,64 ед/мг - для поздней протеиназы). Использование ферментативного пептона в концентрациях 1030 г/л вместо бактериологического пептона приводило к снижению активности субтилизиноподобной протеиназы, но в меньшей степени, чем при использовании колламина (0,38-0,42 ед/мг - для ранней протеиназы, 0,70,76 ед/мг - для поздней протеиназы). Таким образом, применение колламина и ферментативного пептона в составе питательной среды нецелесообразно. Поэтому для очистки субтилизиноподобной протеиназы из культуральной жидкости рекомбинантного штамма использовали среду LB и пептон-содержащую среду.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Михайлова, Екатерина Олеговна, 2007 год

1. Акайзин Е.О. Гетерогенность популяции Escherichia coli в процессе индуцированного автолиза / Е.О. Акайзин, С.Е. Воскун, Л.А. Панова, С.Г. Смирнов // Микробиология. - 1990. - Т. 59. - С. 283-288.

2. Биосинтез микроорганизмами нуклеаз и протеаз // Под ред. Имшенецкого А.А. М: Наука, 1979. - С. 125-148.

3. Головлёв Е.Л. Другое состояние неспорулирующих бактерий / Е.Л. Головлев // Микробиология. 1998. - Т. 67. - № 6. - С. 725-735.

4. Дилакян Э.А. Цистеиновые протеиназы при неопластической трансформации / Э.А. Дилакян // Материалы конференции «Структура и функции протеолитических ферментов» / Вопросы медицинской химии.- 2000. № 5. / http://www.medi.ru.

5. Иваница В.А. Влияние аминокислот как единственного источника азота на биосинтез экзопротеаз Aspergillus candidus / В.А. Иваница, Н.С. Егоров, М.А. Аль-Нури // Микробиология. 1978. - Т. 74. - № 3. - С. 424-429.

6. Ильинская О.Н. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия /

7. Н. Ильинская, А.И. Колпаков, М.А. М.А. Шмидт, Е.В. Дорошенко, А.Л. Мулюкин, Г.И. Эль-Регистан // Микробиология. 2002. - Т. 71. - №1.-С. 23-29.

8. Люблинская Л.А. р-нитроанилиды пироглутамилпептидов -хромогенных субстратов сериновых протеиназ / Л.А. Люблинская, Т.Л. Воюшина, В.М. Степанов // Биоорганическая химия. 1987. - Т. 13. - № 6.-С. 748-753.

9. Немова Н.И. Эволюция протеолитических ферментов / Н.И. Немова, Л.А. Бондарева, Е.И. Кяйвяряйнен // VI Симпозиум «Химияпротеолитических ферментов». Тезисы докладов и стендовых сообщений. Москва, 2007. - С. 5.

10. Новикова Т.М. Внеклеточная протеаза Bacillus alvei 5-724 / Т.М. Новикова, С.Н. Выборных, Н.С. Егоров // Прикладная биохимия и микробиология. 1986. - Т. 22. - № 6. - С. 772-777.

11. Ротанова Т.В. Энергозависимый внутриклеточный протеолиз // Материалы конференции «Структура и функции протеолитических ферментов» / Т.В. Ротанова // Вопросы медицинской химии. 2001. - № 1. / http://www.medi.ru.

12. Руденская Г.Н. Новые подсемейства субтилизинов / Г.Н. Руденская // Биоорган, химия. 1994. - Т. 20. - № 5. - С. 475-484.

13. Сафонова М.Е. Особенности роста и продукции внеклеточных протеиназ Lactobacillusplantarum ИМ-9/138 / М.Е. Сафонова, Н.И. Астапович, И.А. Буряко // Микробиология. 1999. - Т.68. - № 4. - С. 396-403.

14. Соловьева Н.И. Матриксные металлопротеиназы: регуляция активности и роль в процессе онкогенеза // Материалы конференции «Структура и функции протеолитических ферментов» / Вопросы медицинской химии.- 2000. № 5. / http://www.medi.ru.

15. Степанов В.М. Сериновая протеиназа из Thermoactinomyces vulgaris INMI-4a / В.М. Степанов, Г.Н. Руденская, Н.Г. Нестерова, Т.И. Куприянова, Ю.М. Хохлова, И.А. Усайте, Л.Г. Логинова, Е.А. Тимохина //Биохимия.- 1980. -Т.45.-№ 10.-С. 1871-1880.

16. Хайдарова Н.В. Тиолзависимая сериновая протеиназа Streptomyces thermovulgaris / Н.В. Хайдарова, Г.Н. Руденская, Л.Р. Ревина, В.М.

17. Степанов, Н.С. Егоров // Биохимия. 1990. - Т. 55. - № 6. - С. 11101118.

18. Харвуд К. Бациллы. Генетика и биотехнология. / К. Харвуд // М.: Мир, 1992. С.143-163.

19. Честухина Г.Г., Тиолозависимые сериновые протеиназы / Г.Г. Честухина, А.С. Епремян А.С., Гайда А.В. // Биоорганическая химия. -1982. Т. 8. - № 12. - С. 1649-1658.

20. Шарипова М.Р. Локализация протеолитических ферментов в клетках Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Е.В. Шакиров, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, М.А. Шилова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2000. - Т. 69. - № 5. - С. 660-667.

21. Шарипова М.Р. Гидролитические ферменты и спорообразование у Bacillus intermedius / М.Р. Шарипова, Н.П. Балабан, Л.А. Габдрахманова, М.А. Шилова, Ю.М. Кадырова, Г.Н. Руденская, И.Б. Лещинская // Микробиология. 2002. - Т. 71. - № 4. - С. 494-499.

22. Aizenman E. An Escherichia coli chromosomal "addiction module" regulated by 3', 5'-bispyrophosphate: a model for programmed bacterial cell death / E. Aizenman, H. Engelberg-Kulka, G. Glaser // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1996.-V. 93.-P. 6059-6063.

23. Altschul S.F. Basic local alignment search tool / S.F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E.W. Myers, D.J. Lipman // J. Mol. Biol. 1990. - V. 215. - P. 403410.

24. Amann R.I. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. / R.I. Amann, W. Ludwig, K.H. Schleifer // Microbiol. Rev. 1995. - V. 59. - P. 143-169.

25. Anagnostopolous C. Requirements for transformation in Bacillus subtilis / C. Anagnostopolous, J. Spizizen // J. Bacteriol. 1961. - V. 81. - P. 741-746.

26. Aoyama M. Soybean-milk-coagulating activity of Bacillus pumilus derives from a serine proteinase / M. Aoyama, M. Yasuda, K. Nakachi, N. Kobamoto, H. Oku, F. Kato // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2000. - V. 53. - P. 390395.

27. Arima K. Isolation and characterization of a serine protease from the sprouts of Pleioblastus hindsii / K. Arima, T. Uchikoba, H. Yonezawa, M. Shimada, M. Kaneda // Nakai Phytochemistry. 2000. - V. 54. - № 6. - P. 559-565.

28. Агтоп A. Consurf: An algorithmic tool for the identification of functional regions in proteins by surface mapping of phylogenetic information / A. Armon, D. Graur, N. Ben-Tal // J. Mol. Biol. 2001. - V. 307. - P. 447-463.

29. Arnorsdottir J. Crystal structure of a subtilisin-like proteinase from a psychrotrophic Vibrio species revals structural aspects for cold adaptation / J. Arnorsdottir, M.M. Kristjansson, R. Ficner // FEBS J. 2005. - V. 272. - P. 832-845.

30. Aronson A.J. Regulation of extracellular protease production in Bacillus cereus T. Characterization of mutants producing altered amounts of protease / A.J. Aronson, N. Angelo, S.C. Holt // J. Bacteriol. 1971. - V. 106. - P. 1016-1017.

31. Asif-Ullaha M. Purification and characterization of a serine protease from Cucumis trigonus Roxburghi / M. Asif-Ullaha, K.-S. Kimb, Yu Y. Gyu // Phytochemistry. 2006. - V. 67. - № 9. - P. 870-875.

32. Bagga S. Reconstructing the diversification of subtilisins in the pathogenic fungus Metarhizium anisopliae / S. Bagga, G. Hu, S.E. Screen, RJ.S. Leger // Gene.-2004.-V. 324.-P. 159-169.

33. Baker D. Protease pro region required for folding is a potent inhibitor of the mature enzyme / D. Baker, J.L. Silen, D.A. Agard // Proteins: Struct. Funct. Genet. 1992. - V. 12. - P. 339-344.

34. Barrett A.J. Proteolytic enzymes: serine and cystein peptidases / A.J. Barret // Methods Enzymol. 1994. - V. 244. - P. 1-15.

35. Barett A.J. Proteolytic enzymes: aspartic and metallopeptidases / A.J. Barret // Methods Enzymol. 1995. - V. 248. - P. 183-196.

36. Barrett A.J. Perspectives in biochemistry and biophysics. Familes and clans of serine peptidases / A.J. Barret, N.D. Rawlings // Arch. Biochem. Biophys. -1995. V. 318. - № 2. - P. 247-250.

37. Barros R.J. Enhancement of immobilized protease catalyzed dipeptide synthesis by the presence of insoluble protonated nucleophile / R.J. Barros, Wehtje E., P. Adlercreutz // Enzyme Microb. Technol. 1999. - V. 24. - P. 480-488.

38. Beg Q.K. De-repression and subsequent induction of protease synthesis by Bacillus mojavensis under fed-batch operations / Q.K. Beg, R.K. Saxena, R. Gupta // Process Biochem. 2002. - V. 37. - P. 1103-1109.

39. Beg K.Q. Purification and characterization of an oxidation-stable, thiol-dependent serine alkaline protease from Bacillus mojavensis / Q.K. Beg, R. Gupta // Enzyme Microb. Technol. 2003. - V. 32. - P. 294-304.

40. Berger D. A subtilisin-like serine protease involved in the regulation of stomatal density and distribution in Arabidopsis thaliana / D. Berger, T. Altmann // Genes Dev. 2000. - V. 14. - P. 1119-1131.

41. Bergmann M. The role of specificity in the enzymic synthesis of proteins: synthesis with intracellular enzymes / M. Bergmann, H. Frankel-Conrat // J. Biol. Chem. 1937. - V. 119. - P. 707-720.

42. Betzel C. Three-dimensional structure of proteinase К at 0.15-nm resolution / C. Betzel, G.P. Pal, W. Saenger // Biochemistry. 1988. - V. 27. - P. 155171.

43. Blundell T.L. Comparisons of the sequences, 3-D structures and mechanisms of pepsin-like and retroviral aspartic proteinases / T.L. Blundell, J.B. Cooper, A. Sali, Z. Zhu. // Adv. Exp. Med. Biol. 1991. - V. 306. - P.443-453.

44. Bode W. Natural protein proteinase inhibitors and their interaction with proteinases / W. Bode, R. Huber // Eur. J. Biochem. 1992. - V. 204. - P. 433-451.

45. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.M. Bradford // Anal Biochem. 1976. - V. 72. - P. 248-254.

46. Bromme D. Substrate specificity of thermitase, a thermostable serine proteinase from Thermoactinomyces vulgaris / D. Bromme, R. Kleine // Curr. Microbiol. 1984.-V. 11.-P. 93-100.

47. Brenner S. The molecular evolution of genes and proteins: a tale of two serines / S. Brenner // Nature. 1988. - V. 334. - P. 528-530.

48. Burlini N. A heat stable serine proteinase from the extreme thermophilic archaebacterium Sulfolobus solfataricus / N. Burlini, P. Magnati, A. Villa, F. Macchi, P. Tortora, A. Guerritore // Biochem. Biophys. Acta. 1992. - V. 1122.-P. 283-292.

49. Chan Ch.-K. Cytomegalovirus assemblin (pUL80a): Cleavage at internal site not essential for virus growth; Proteinase absent from virions / Ch.-K. Chan, E.J. Brignole, and W. Gibson // J. Virol. 2002. - V. 76. - № 17. - P. 86678674.

50. Cheng Y.E. Alteration of sporecoat processing and protein turnover in Bacillus cereus mutants with defective postexponential intracellular protease / Y.E. Cheng, A.I. Aronson. // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1977. - V. 74. -P. 1254-1258.

51. Clapes P. Peptide bond formation by the industrial protease, neutrase, in organic media / P. Clapes, E. Pera, J.L. Torres // Biotechnol. Lett. 1997. -V. 19.-P. 1023-1026.

52. Czapinska H. Structural and energetic determinants of the SI-site specificity in serine proteases / H. Czapinska, J. Otlewski // Eur. J. Biochem. 1999. -V. 260. -№3.- P. 571-595.

53. Dalev P.G. Utilization of waste feathers from poultry slaughter for production of a protein concentrate / P.G. Dalev // Bioresour. Technol. 1994. - V. 48. -P. 265-267.

54. Dancer B.N. Production and possible function of serine protease during sporulation of Bacillus subtilis / B.N. Dancer, J. Mandelstam // J. Bacterid. -1975.-V. 121.-P. 406-410.

55. Durham D.D. Novel alkaline and heat-stable serine proteases from alkalophilic Bacillus sp. Strain 6638 / D.D. Durham, D. Stewart, E.J. Stellawg // J. Bacteriol. 1987. - V. 169. - P. 2762-2768.

56. Durham D.R. The Elastolytic properties of subtilisin GX from alkalophilic Bacillus sp. strain 6644 provides a means of differentiation from other subtilisins / D.D. Durham // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. - V. 194.-№3.-P. 1365-1370.

57. Eder J. Folding of subtilisin BPN': role of the pro-sequence / J. Eder, M. Rheinnecker, A.R. Fersht // Mol. Biology. 1993. - V. 233. - P. 293-304.

58. Errington J. Bacillus subtilis sporulation: regulation of gene expressionand control of morphogenesia / J. Errington // Microbiol. Rev. 1993. - V. 57. -P. 1-33.

59. Esposito R.E. The molecular biology of the yeast Saccharomyces. Life cycle and inheritance. In J.N. Strathern, E.W. Jones, J.R. Broach (ed.) / R.E. Esposito, S. Klapholz // NY.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1981. P. 211-287.

60. Exterkate F.A. Role of calcium in activity and stability of the Lactococcus lactis cell envelope proteinase: applied and environmental / F.A. Exterkate, A.C. Alting // Microbiology. 1999. - V. 65. - № 4. - P. 1390-1396.

61. Enzyme Nomenclature / N.Y.: Academ. Press. 1984. - 862 P.

62. Faraco V. A new subfamily of fungal subtilases: structural and functional analysis of a Pleurotus ostreatus member / V. Faraco, G. Palmieri, G. Festa, M. Monti, G. Sannia, P. Giardina 11 Microbiology. 2005. - V. 151. - P. 457466.

63. Fastrez J. Demonstration of the acyl-enzyme mechanism for the hydrolysis of peptides and anilides by chymotrypsin / J. Fastrez, A.R. Fersht // Biochemistry. 1973. - V. 12. - P. 2025-2034.

64. Feller G. Psychrophilic enzymes: hot topics in cold adaptation / G. Feller, C. Gerday // Nat. Rev. Microbiol. 2003. - V. 1. - P. 200-208.

65. Freeman S.-A. Characterization of a chelator-resistant proteinase from Thermus strain Rt4A2 / S.-A. Freeman, K. Peek, M. Prescott, R. Daniel // Biochem. J. 1993. - V. 295. - P. 463-469.

66. Fontanini D. SEP-1 a subtilisin-like serine endopeptidase from germinated seeds of Hordeum vulgare L. / D. Fontanini, B.L. Jones // Planta. - 2002. - V. 215.-№6. -P. 885-893.

67. Fox T. Potent slow-binding inhibition of cathepsin В by its propeptide / T. Fox, E. de Miguel, J.S. Mort, A.C. Storer // Biochemistry. 1992. - V. 31. -P. 12571-12576.

68. Fujiwara N. Purification and properties of the highly thermostable alkaline protease from an alkaliphilic and thermophilic Bacillus sp. / N. Fujiwara, A. Masui, T. Imanaka // J. Biotechnol. 1993. - V. 30. - № 2. - P. 245-256.

69. Georgieva D. Catalytic efficiencies of alkaline proteinases from microorganisms / D. Georgieva, N. Genov, W. Voelter, C. Betzel // Z. Naturforsch С. 2006. - V. 61. - № 5-6. - P. 445-452.

70. Gerze A. Partial purification and characterization of protease enzyme from Bacillus subtilis megatherium / A. Gerze, D. Omay, Y. Guvenilir // Biochem. Biotechnol. 2005. - V. 121-124. - P. 335-345.

71. Giddey K. Closely related dermatophyte species produce different patterns of secreted proteins / K. Giddey, B. Favre, M. Quadroni, M. Monod // FEMS Microbiol Lett. 2007. - V. 267. - № 1. - p. 95-101.

72. Govind N.S. Protease and carotenogenesis in Blakeslea trispora / N.S. Govind, B. Mehta, M. Sharma, V.V. Modi. // Phytochemistry. 1981. - V. 20.-P. 2483-2485.

73. Greer J. Comparative modeling methods: Application to the family of mammalian serine proteases / J. Greer // Proteins Struct. Funct. Genet. 1990. -V.73.-P. 317-334.

74. Gron H. Extensive comparison of the substrate preferences of two subtilisins as determined with peptide substrates which are based on the principle of intramolecular quenching / H. Gron, M. Meldal, K. Breddam // Biochemistry. 1992.-V. 3.-P. 6011-6018.

75. Gould G.W. Role of an expanded cortex in resistance of bacterial endospores. Spores VI / G.W. Gould, G.I. Dring // Washington D.C. Amer. Soc. Microbiol. 1975. - P. 541-546.

76. Guinto E.R. Unexpected crucial role of residue 225 in serine proteases / E.R. Guinto, S. Caccia, T. Rose, K. Futterer, G. Waksman, E. Di Cera // Proc. Natl. Acad. Sci. 1999. - V. 96. - № 5. - P. 1852-1857.

77. Gupta R. Bacterial alkaline proteases: molecular approaches and industrial applications / R. Gupta, Q.K. Beg, P. Lorenz // Applied Microbiology and Biotechnology. 2002. - V. 59. - P. 15-32.

78. Hall M.R.T. Cytomegalovirus assemblin: the amino and carboxyl domains of the proteinase form active enzyme when separately cloned and coexpressed in eukaryotic / M.R.T. Hall, W. Gibson // Cells Journal of Virology. 1996. -V. 70.-№8.-P. 5395-5404.

79. Hamilton J.M.U. Aral2 subtilisin-like protease from Arabidopsis thaliana: purification, substrate specificity and tissue localization / J.M.U. Hamilton,

80. D.J. Simpson, S.C. Hyman, B.K. Ndimba, A.R. Slabas // Biochem. J. 2003. -V. 370.-P. 57-67.

81. Han X.Q. Stability of protease Q against autolysis and in sodium dodecyl sulfate and urea solutions / X.Q. Han, S. Damodaran // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1997. - V. 240. - № 3. - P. 839-843.

82. Hartley B.S. Proteolytic enzymes / B.S. Hartley // Annu. Rev. Biochem. -1960.-V. 29.-P. 45-72.

83. Henner DJ. Expression of cloned protease genes in Bacillus subtilis / D.J. Henner, M. Yang, L. Band, J.A. Wells // Proceedings of the 9th International Spore Conference. 1985. - P. 95-103.

84. Heusipp G. HreP, an in vivo-expressed protease of Yersinia enterocolitica, is a new member of the family of subtilisin/kexin-like proteases / G. Heusipp, G.M. Young, V.L. Miller // J. Bacterid. 2001. - V. 183. - № 12. - P. 35563563.

85. Hibbs M.S. Biochemical and immunological characterization of the secreted forms of human neutrophil gelatinase / M.S. Hibbs, K.A. Hasty, J.M. Seyer, A.H. Kang, C.L. Mainardi // J. Biol. Chem. 1985. - V. 260. - P. 2493-2500.

86. Hodgson J. The changing bulk catalysis market: recombinant DNA techniques have changed bulk enzyme production dramatically / J. Hodgson // Biotechnology. 1994. - V. 12. - P. 789-790.

87. Hoffman B. Disruption of the subtilase gene, albinl, in Ophiostoma piliferum / B. Hoffman, C. Breuil // Applied and Environmental Microbiology. 2004. - V. 70. - № 7. - P. 3898-3903.

88. Hu T.T. Cloning and diversity analysis of microorganism genes from alkalescence soil / T.T. Hu, C.J. Jiang, X. Liang, W.J. Long, B. Wu // Yi Chuan. 2006. - V. 28. - № 10. - P. 1287-93.

89. Inouye M. Intramolecular chaperone: the role of the pro-peptide in protein Folding / M. Inouye // Enzyme. 1991. - V.45. - P. 314-321.

90. Isono Y. Enzymic peptide synthesis using a microaqueous highly concentrated amino acid mixture / Y. Isono, M. Nakajima // Process Biochem. -2000.- V. 36.-P. 275-278.

91. Jacobs M. Cloning, sequencing and expression of subtilisin Carlsberg from Bacillus licheniformis / M. Jacobs, M. Eliasson, M. Uhlen, J.-I. Flock // Nucleic Acids Res. 1985. - V. 13. - P. 8913-8926.

92. Jacobson J.W. Composition for cleaning drains clogged with deposits containing hairs / J.W. Jacobson, J.L. Glick, K.L. Madello // US Patent. -1985.-4, 540,506.

93. Jaeger K.-E. Directed evolution and the creation of enantioselective biocatalysis / K.-E. Jaeger, T. Eggert, A. Eipper, M.T. Reetz // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. - V. 55. - P. 519-530.

94. Jany K.D. Amino acid sequence of proteinase К from the mold Tritirachium album Limber / K.D. Jany, G. Lederer, B. Mayer // FEBS Lett. 1986. - V. 199.-P. 139-144.

95. Jang J.S. Molecular cloning of a subtilisin J gene from Bacillus stearothermophilus and its expression in Bacillus subtilis / J.S. Jang, D.O. Kang, M.J. Chun, S.M. Byun // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1992. -V. 184.-№ l.-P. 277-282.

96. Jin Jang H. A novel subtilisin-like serine protease from Thermoanaerobacter yonseiensis KB-1: its cloning, expression, and biochemical properties / H. Jin Jang, B. Chan Kim, Y. Ryang Pyun, Y. Sam Kim // Extremophiles. 2002. -V. 6.-P. 233-243.

97. Johansen G.T. The degradation of the B-chain of oxidized insulin by two subtilisins and their succinylated and N-carbamylated derivatives / G.T. Johansen, M. Ottesen, I. Svedsen, J. Wylrandt // C.R. Lab.Carlsberg. 1968. -V. 36.-P. 365-384.

98. Johnson D.E. Noncaspase proteases in apoptosis / D.E. Johnson // Leukemia. -2000.-V. 14.-P. 1695-1703.

99. Joo H.S. Optimization of the production of an extracellular alkaline protease from Bacillus horikoshi / H.S. Joo, C.G. Kumar, G.C. Park, K.T. Kim, R.P. Seung, C.S. Chang // Process Biochem. 2002. - V. 38. - P. 155-159.

100. Joo H.S. Oxidant and SDS-stable alkaline protease from Bacillus clausii 152: production and some properties / H.S. Joo, C.G. Kumar, G.C. Park, S.R. Paik, C.S. Chang // J. Appl. Microbiol. 2003. - V. 95. - P. 267-272.

101. Jorda L. Local and systemic induction of two defense-related subtilisin-like protease promoters in transgenic Arabidopsis plants. Luciferin induction of PR gene expression / L. Jorda, P. Vera // Plant Physiol. 2000. - V. 124. - № 3.-P. 1049-1058.

102. Kazan D. Purification and characterization of a serine alkaline protease from Bacillus clausii GMBAE 42 / D. Kazan, A.A. Denizci, M.N.K. Oner, A. Erarslan // J. Indust. Microbiol. Biotechnol. 2005. - V. 32. - № 8. - P. 33544.

103. Kim K. Role of proteases in host cell invasion by Toxoplasma gondii and other Apicomplexa / K. Kim // Acta Trop. 2004. - V. 91. - № 1. - P. 69-81.

104. Kim S.H. Purification and characterization of subtilisin DJ-4 secreted by Bacillus sp. st. DJ-4 screened from Doeng-Jang / S.H. Kim, N.S. Choi // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2000. - V. 64. - № 8. - P. 1722-1725.

105. Kinal H. A Processing and secretion of a virally encoded antifungal toxin in trans-genic tobacco plants: evidence for a kex2p pathway in plants / H. Kinal, C.-M. Park, J.O. Berry, Y. Koltin, J.A. Bruenn // Plant Cell. 1995. - V. 7. -P. 677-688.

106. Kise H. Protease-catalyzed synthetic reactions and immobilization-activation of the enzymes in hydrophilic organic solvents / H. Kise, A. Hayakawa, H. Noritomi // J. Biotechnol. 1990. - V. 14. - P. 239-254.

107. Klenk H.D. Host cell proteases controlling virus pathogenicity / H.D. Klenk, W. Garten // Trends Microbiology. 1994. - V. 2. - P. 39^3.

108. Koide Y. Cloning and sequencing of the major intracellular serine protease gene of Bacillus subtilis / Y. Koide, A. Nakamura, T. Uozumi, T. Beppu // J. Bacterid. 1986. - V. 167.-№1.-P. 110-116.

109. Kojima M. Isolation and characterization of a feather-degrading enzyme from Bacillus pseudofirmus FA30-01 / M. Kojima, M. Kanai, M. Tominaga, S. Kitazume, A. Inoue, K. Horikoshi // Extremophiles. 2006. - V. 10. - P. 229-235.

110. Kraus E. The specificity of proteinase К against oxidized insulin В chain / E. Kraus, H.-H. Kiltz, U.F. Femfert // Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 1976. -V. 357.-P. 233-237.

111. Krem M.M. Molecular markers of serine protease evolution / M.M. Krem, E. Di Cera // EMBO J. 2001. - V. 20. - № 12. - P. 3036-3045.

112. Krem M.M. Ser214 is crucial for substrate binding to serine proteases / M.M. Krem, S. Prasad, E. Di Cera // J. Biol. Chem. 2002. - V. 277. - № 43. - P. 40260-40264.

113. Kumar C.G. Novel enzyme-based detergents: an Indian perspective / C.G. Kumar, R.K. Malik, M.P. Tiwari // Curr. Sci. 1998. - V. 75. - P. 1312-1318.

114. Kumar C.G. Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from alkalophilic Bacillus pumilus / C.G. Kumar // Letters in Applied Microbiology. 2002. - V. 34. - № 1. - p. 13-17.

115. Kurotsu Т. Characterization of an intracellular serine protease from sporulating cells of Bacillus brevis / T. Kurotsu, M.A. Marahiel, K.-D. Muller, H. Kleinkauf // J. Bacterid. 1982. - V. 151. - № 3. - P. 1466-1472.

116. Kyte J. A simple method for displaying the hydropathic character of a protein / J. Kyte, R.F. Doolittle // J. Mol. Biol. 1982. - V. 157. - P. 105-132.

117. Laemmli H.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / H.K. Laemmli // Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

118. Landgraf R. Three-dimensional cluster analysis identifies interfaces and functional residue clusters in proteins / R. Landgraf, I. Xenarios, D. Eisenberg //J. Mol. Biol. -2001. -V. 307. P. 1487-1502.

119. Laplaze L. Characterization of a Casuarina glauca nodule-specific subtilisin-like protease gene, a homolog oiAlnus glutinosa agl2 / L. Laplaze,

120. A. Ribeiro, C. Franche, E. Duhoux, F. Auguy, D. Bogusz, K. Pawlowski // MPMI. -2000. V. 13.-№ l.-P. 113-117.

121. Larcher G. A 33 kDa serine proteinase from Scedosporium apiospermum / G. Larcher, B. Cimon, F. Symoens, G. Tronchin, D. Chabasse, J.-P. Bouchara // Biochem. J. 1996. - V. 315. - P. 119-126.

122. Leduc R. Activation of human furin precursor processing endoprotease occurs by an intramolecular autoproteolytic cleavage / R. Leduc, S.S. Moloy,

123. B.A. Thorne, G. Thomas // Biological Chemistry. 1992. - V. 267. - P. 14304-14308.

124. Leng W.C. Analysis of secreted proteases of Trichophyton rubrum / W.C. Leng, L.L. Wang, C.D. Wei, J. Yang, Q. Jin // Wei Sheng Wu Xue Bao. -2005. V. 45. - № 4. - P. 601-605.

125. Leshchinskaya I.B. Glutamyl endopeptidase of Bacillus intermedius, strain 3-19 / I.B. Leshchinskaya, E.V. Shakirov, E.L. Itskovich et al. // FEBS Lett. -1997.-V. 404.-P. 241-244.

126. Lesk A.M. Conservation and variability in the structures of serine proteinases of the chymotrypsin family / A.M. Lesk, W.D. Fordham // J. Mol. Biol. 1996. - V. 258. - P. 501-537.

127. Lewis J.C. Dormancy. The bacterial spores / J.C. Lewis // London: Academic Press, 1969. P. 301-352.

128. Lim H.A. Hydrolysis of polyesters by serine proteases / H.A. Lim, T. Raku, Y. Tokiwa // Biotechnol Lett. 2005. - V. 27. - № 7. - P. 459-64.

129. Lipkind G.M. A model for the structure of the P domains in the subtilisin-like prohormone convertases / G.M. Lipkind, A. Zhou, D.F. Steiner // Proc. Natl. Acad. Sci. USA Biochemistry. 1998. - V. 95. - P. 7310-7315.

130. Maeda H. Alkaline-resisitance model of subtilisin ALP I, a novel alkaline subtilisin / H. Maeda, O. Mizutani, Y. Yamagata, Ichishima E., T. Nakajima // J. Biochem. 2001. - V. 129. - P. 675-682.

131. Markland F.S. Subtilisins: primary structure, chemical and physical properties. In: The Enzymes, vol. 3 / F.S. Markland, E.L. Smith // London: Academic Press, 1971. P. 561-608.

132. Masui A. Stabilization and rational design of serine protease AprM under highly alkaline and higly temperature conditions / A. Masui, N. Fujiwara, T. Imanaka // Applied and Environmental Microbiology. 1994. - V. 60. - P. 1383-1391.

133. Maxwell K.N. Overexpression of PCSK9 accelerates the degradation of the LDLR in a post-endoplasmic reticulum compartment / K.N. Maxwell, E.A. Fisher, J.L. Breslow // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2005. - V. 102. - № 6. -P. 2069-2074.

134. McCune J.M. Endoproteolytic cleavahe of gpl60 is required for the activation of human immunidificiency virus / J.M. McCune, I.B. Rabin, M.B. Feinberg, M. Lieberman, J.C. Kosek, G.R. Reyes, I.I. Weissman // Cell. -1988.-V. 53.-P. 55-67.

135. McPhalen C.A. Structural comparison of two serine proteinase-protein inhibitor complexes: Eglin-C-subtilisin Carlsberg and CI-2-subtilisin Novo / C.A. McPhalen, M.N.G. James // Biochemistry. 1988. - V. 27. - P. 65826598.

136. Melander W.C. Salt effect on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins: an interpretation of the lyotropic series / W.C. Melander, C. Horvath // Arch. Biochem. Biophys. Acta. 1977. - V. 183. - P. 200-215.

137. Menon A.S. Protein substrates activate the ATP-dependent protease La by promoting nucleotide binding and release of bound ADP / A.S. Menon, A.L. Goldberg. // J. Biol. Chem. 1987. - V. 262. - P. 14929-14934.

138. Miyaji T. Purification and molecular characterization of subtilisin-like alkaline protease BPP-A from Bacillus pumilus strain MS-1 / T. Miyaji, Y.

139. Otta, Т. Nakagawa, Т. Watanabe, Y. Niimura, N. Tomizuka // Lett. Appl. Microbiol. 2006. - V. 42. - № 3. - P. 242-247.

140. Morihara K. Using proteases in peptide synthesis / K. Morihara // Trends Biotechnol. 1987. -V. 5. - P. 164-170.

141. Morinaga N. Two distinct cytoxic activities of subtilases cytoxin produced by shiga toxigenic Escherichia coli / N. Morinaga, K. Yahiro, G.Matsuura, M. Watanabe, F. Nomura, J.Moss, M. Noda // Infect. Immun. 2007. - V. 75. -№ 1.-P. 488-496.

142. Morita Y. Properties of cold-active protease from psychrotrophic Flavobacterium balustinum PI04 / Y. Morita, Q. Hasan, T. Sakaguchi, Y. Murakami, K. Yokoyama, E. Tamiya // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. -V. 50.-P. 669-675.

143. Mulder F.A. Altered flexibility in the substrate-binding site of related native and engineered high-alkaline Bacillus subtilisins / F.A. Mulder, D. Schipper, R. Bott, R. Boelens // J. Mol. Biol. 1999. - V. 292. - № 1. - P. 111-123.

144. Nakagawa A. Method for cleaning a contact lens / A. Nakagawa // US Patent.- 1994.-5, 314, 823.

145. Nakagawa M. Maspin expression and its clinical significance in non-small cell lung cancer / M. Nakagawa, H. Katakura, M. Adachi, К. Takenaka, K. Yanagihara, Y.Otake, H. Wada, F. Tanaka // Ann Surg Oncol. 2006. - V. 13.-№ 11.-P. 1517-1523.

146. Nakamura T. Nucleotide sequence of the subtilisin NAT gene, aprN, of Bacillus subtilis (natto) / T. Nakamura, Y. Yamagata, E. Ichishima // Bioscience Biotechnology Biochemistry. 1992. - V. 56. - P. 1869-1871.

147. Nakashima H. Compositional changes in RNA, DNA and proteins for bacterial adaptation to higher and lower temperatures / H. Nakashima, S. Fukuchi, K. Nishikawa // J. Biochem. 2003. - V. 133. - P. 507-513.

148. Nakayama K. Furin: a mammalian subtilisin/Kex2p-like endoprotease involved in processing of a wide variety of precursor proteins / K. Nakayama // Biochemistry. 1997. - V. 327. - P. 625-635.

149. Narinx E. Subtilisin from psychrophilic antarctic bacteria: characterization and site-directed mutagenesis of residues possibly involved in the adaptation to cold / E. Narinx, E. Baise, C. Gerday // Protein Eng. 1997. - V. 10. - P. 1271-1279.

150. North M.J. Comparative biochemistry of the proteinases of eukaryotic microorganisms / M.J. North // Microbiol. Rev. 1982. - V. 46. - P. 308-340.

151. Ollis D.L. The a/(3 hydrolase fold / D.L. Ollis, E. Cheah, M. Cygler, B. Dijkstra, F. Frolow, S.M. Franken, M. Harel, S.J. Remington, I. Silman, J. Schrag // Protein Eng. 1992. - V. 5. - P. 197-211.

152. Orhan E. Partial purification and characterization of protease enzyme from Bacillus subtilis and Bacillus cereus / E. Orhan, D. Omay, Y. Guvenilir // Appl. Biochem. Biotechnol. 2005. - V. 121-124. - P. 183-194.

153. Реек К. Purification and characterization of a thermostable proteinase isolated from Thermus sp. strain Rt41A / K. Peek, R.M. Daniel, C. Monk, L. Parker, T. Coolbear // Eur. J. Biochem. 1992. - V. 207. - P. 1035-1044.

154. Perea A. Preparation and characterization of whey protein hydrolysates: application in industrial whey bioconversion processes / A. Perea, U. Ugalde, I. Rodriguez, J.L. Serra // Enzyme Microb. Technol. 1993. - V. 15. - P. 418-423.

155. Perona J.J. Structural basis of substrate specificity in the serine proteases / J.J. Perona, C.S. Craik // Protein Sci. 1995. - V. 4. - P. 337-360.

156. Phadatare S.U. Evidence for the involvement of serine protease in the conidial discharge of Conidiobolus coronatus / S.U. Phadatare, M.C. Srinivasan, M.V. Deshpande // Arch. Microbiol. 1989. - V. 153. - P. 47-49.

157. Postemsky C.J. Isolation and characterization of Bacillus megaterium mutants containing decreased levels of spore protease / C.J. Postemsky, S.S. Dignam, P. Setlow // J. Bacterid. 1978. - V. 135. - P. 841-850.1. Л I

158. Rawlings N.D. Evolutionary families of peptidases / N.D. Rawlings, A.J. Barrett // Biochem. J. 1993. - V. 290. - P. 205-218.

159. Rawlings N.D. Introduction: clan SB containing the subtilisin family. In A.J. Barrett, N.D. Rawlings, J.F. Woessner (eds), Handbook of Proteolytic Enzymes // San Diego: Academic Press, 1998. P. 284-288.

160. Rao M.B. Molecular and biotechnological aspects of microbial proteases / M.B. Rao, A.M. Tanksale, M.S. Ghatge, V.V. Deshpande // Microbiology and molecular biology reviews. 1998. - V.62. - № 3. - P.597-635.

161. Rose Th. Substrate recognition drives the evolution of serine proteases / Th. Rose, E. Di Cera // J.Biol.Chem. 2002. - V. 277. - № 22. - P. 19243-19246.

162. Ruppen M.E. of Intracellular Serine Protease Expression in Bacillus subtilis / M.E. Ruppen, G.L. Van Alstine, L. Band // J. Bacterid. 1988. - V. 170. -№ l.-P. 136-140.

163. Sadoff H.L. Heat resistance of spore enzymes / H.L. Sadoff // J. Appl. Bacterid. 1970. - V. 33. - P. 130-140.

164. Saeki K. Novel oxidatively stable subtilisin-like proteases from alkaliphilic Bacillus spp.: enzymatic properties, sequences, and evolutionary relationships / K. Saeki, M. Okuda, Y. Hatada, T. Kobayashi, S. Itu, H. Takami, K.

165. Siezen R.J. Subtilases: The superfamily of subtilisin-like proteases / R.J. Siezen, J.A. Leunissen // Prot. Sci. 1997. - V. 6. - P. 501-523.

166. Siezen R.J. Evolution of prokaryotic subtilases: Genome-wide analysis reveals novel subfamilies with different catalytic residues / R.J. Siezen, B. Renckens, J. Boekhorst // Proteins. 2007. - V. 67. - № 3. - P. 681-94.

167. Silva-Lopez R.E. Leishmania (Leishmania) amazonensis: purification and characterization of a promastigote serine protease / R.E. da Silva-Lopez, S. Giovanni-De-Simone // Experimental Parasitology. 2004. - V. 107. - № 34.-P. 173-182.

168. Shannon J.D. Amino acid sequence of a Crotalus atrox venom metalloprotease which cleaves type IV collagen and gelatin / J.D. Shannon, E.N. Baramova, J.B. Bjarnason, J.W. Fox // J. Biol. Chem. 1989. - V. 264. -P. 11575-11583.

169. Shinde U. Intramolecular chaperones and protein folding / U. Shinde, M. Inouye / // Trends Biochem. Science. 1993. - V. 18. - P. 442-446.

170. Schuliger J.W. Purification and characterization of a novel amylolytic enzyme from ES4, a marine hyperthermophilic archaeum / J.W. Schuliger,

171. H. Brown, J.A. Baross, R.M. Kelly // Mol. Marine Biol. Biotechnol. 1993. -V. 2.-P. 76-87.

172. So J.E. Protease-catalyzed tripeptide (RGD) synthesis / J.E. So, J.S. Shin, B.G. Kim // Enzyme Microb. Technol. 2000. - V. 26. - P. 108-114.

173. Stabile M.R. Probing the specificity of the SI binding site of M222 mutants of subtilisin B. lentus with boronic acid inhibitors / M.R. Stabile, W.G. Lai, G. DeSantis, M. Gold, J.B. Jones. // Bioorg. Med. Chem. Lett. 1996. - V. 6. -P. 2501-2506.

174. Stepanov V.M. A serine proteinase of an archaebacterium Halobacterium mediterranei / V.M. Stepanov, G.N. Rudenskaya, L.P. Revina, Y.B. Gryaznova, E.N. Lysogorskaya, I.Y. Filippova, I.I. Ivanova // Biochem J. -1992.-V. 285.-P. 281-286.

175. Strausberg S.L. Directed coevolution of stability and catalytic activity in calcium-free subtilisin / S.L. Strausberg, B. Ruan, K.E. Fisher, P.A. Alexander, P.N. Bryan // Biochemistry. 2005. - V. 44. - № 9. - P. 32723279.

176. Strongin A.I. Intercellular serine proteinases from spore-forming bacilli / A.I. Strongin, V.M. Stepanov // Biokhimiia. 1981. - V. 46. - P. 1347-1363.

177. Su N.-Y. Pen с 1, a novel enzymic allergen protein from Penicillium citrinum. Purification, characterization, cloning and expression / N.-Y. Su,

178. Suzuki M. A novel member of the subtilisi-like protease family from Streptomyces albogriseolus / M. Suzuki, S. Taguchi, S. Yamada, S. Kojima, K.I. Miura, H. Momose // J. Bacterid. 1997. - V. 179. - P. 430-438.

179. Taguchi S. Engineering of a cold-adapted protease by sequential random mutagenesis and a screening system / S. Taguchi, A. Ozaki, H. Momose // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - V. 64. - P. 492-495.

180. Taguchi S. The complete amino acid substitutions at position 131 that are positively involved in cold adaptation of subtilisin BPN / S. Taguchi, S. Komada, H. Momose // Appl. Environ. Microbiol. 2002. - V. 66. - № 4. -P. 1410-1415.

181. Takami H. Degradation of human hair by a thermostable alkaline protease from alkalophilic Bacillus sp. No. AH-101 / H. Takami, S. Nakamura, R. Aono, K. Horikoshi // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. - V. 56. - P. 1667-1669.

182. Teplyakov A.V. Crystal structure of thermitase at 1.4 A resolution / A.V. Teplyakov, I.P. Kuranova, E.H. Harutyunyan, B.K. Vainshtein // J. Mol. Biol. 1990.-V. 214.-P. 261-279.

183. Tian B. Cloning, expression and deletion of the cuticle-degrading protease BLG4 from nematophagous bacterium Brevibacillus laterosporus G4 / B. Tian, N. Li, L. Lian, J. Liu, J. Yang, K.Q. Zhang // Arch. Microbiol. 2006. -V. 86.-№4. -P. 297-305.

184. Thomas P.G. Tailoring the pH dependence of enzyme catalysis using protein engineering / P.G. Thomas, A.J. Russell, A.R. Fersht // Nature. 1985. - V. 28.-P. 375-376.

185. Thomas G. Furin at the cutting edge: from protein traffic to embriogenesis and disease / G. Thomas // Nature Reviews Molecular Cell Biology. 2002. -V. 3.-№ 10.-P. 753-766.

186. Torsvik V. High diversity in DNA of soil bacteria / V. Torsvik, J. Goksoyr, F.L. Daae // Appl. Environ. Microbiol. 1990. - V. 56. - P. 782-787.

187. Tsuchiya K. Purification and characterization of a thermostable alkaline protease from alkalophilic Thermoactinomyces sp. HS682 / K. Tsuchiya, Y.

188. Nakamura, H. Sakashita, Т. Kimura // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1992. -V. 56.-№2.-P. 246-250.

189. Toogood H.S. Daniel Purification and characterization of Ak.l protease, a thermostable subtilisin with a disulphide bond in the substrate-binding cleft / H.S. Toogood, C.A. Smith, E.N. Bake, R.M. Daniel // Biochem. J. 2000. -V. 350.-P. 321-328.

190. Valbuzzi A. A novel member of the subtilisin-like protease family from Bacillus subtilis / A. Valbuzzi, E. Ferrari, A.M. Albertini // Microbiology. -1999.-V. 145.-P. 3121-3127.

191. Varela H. Skin unhairing proteases of Bacillus subtilis: production and partial characterization / H. Varela, M.D. Ferrari, L. Belobradjic, A. Vazquez, M.L. Loperena // Biotechnol. Lett. 1997. - V. 19. - P. 755-758.

192. Van der Laan J.C. Cloning, characterization and multiple chromosomal integration of a Bacillus alkaline protease gene / J.C. Van der Laan, G. Gerritse, L. Mulleners, R. Van der Hoek, W.J. Quax // Appl. Environ. Microbiol. 1991. -V. 57. - P. 901-909.

193. Vielle C. Hyperthermophilic Enzymes: Sources, Uses, and Molecular Mechanisms for Thermostability / C. Vielle, G.J. Zeikus // Microbiol. Mol. Biol. Rew.-2001.-V. 65.-№ l.-P. 1-43.

194. Von der Osten T. Protein engineering of subtilisins to improve stability in detergent formulations / T. Von der Osten, S. Branner, S. Hastrup, L.

195. Hedegaard, M.D. Rasmussen, H.S. Frantzen, S. Carlsen, J.M. Mikkelsen // J. Biotechnol. 1993. - V. 28. - P. 55-68.

196. Wang L. Prodomain mutations at the subtilisin interface: correlation of binding energy and the rate of catalyzed folding / L. Wang, S. Ruvinov, S. Strausberg, D.T. Gallagher, G.L. Gilliland, P.N. Bryan // Biochemistry. -1995.-V. 34.-P. 15415-15420.

197. Wells J.A. In vivo formation and stability of engineered disulfide bonds in subtilisin / J.A. Wells, D.B. Powers // J. Bid. Chem. 1986. - V. 261. - P. 6564-6570.

198. Wells J.M. Cloning, sequencing and secretion of Bacillus amyloliquefaciens subtilisin in Bacillus subtilis / J.M. Wells, E. Ferrari, D.J. Henner, D.A. Estell, E.Y. Chen // Nucleic Acids Res. 1983. - V. 11. - P. 7911-7925.

199. Wintrode P.L. Cold Adaptation of a Mesophilic Subtilisin-like Protease by Laboratory Evolution / P.L. Wintrode, K. Miyazaki, F.H. Arnold // J. Biol. Chem. 2000. - V. 275. - № 41. - P. 31635-31640.

200. Wright C.S. Structure of subtilisin BPN at 2.5 A resolution / C.S. Wright, R.A. Alden, J. Kraut // Nature. 1969. - V. 221. - P. 235-242.

201. Wong S.S. Chemical crosslinking and the stabilization of proteins and enzymes / S.S. Wong, L.J.C. Wong // Enzyme Microb. Technol. 1992. - V. 14.-P. 866-874.

202. Wu J. Cloning and analysis of WF146 protease, a novel thermophilic subtilisin-like protease with four inserted surface loops / J. Wu, Y. Bian, B. Tang, X. Chen, P. Shen, Z. Peng // FEMS Microbiology Letters. 2004. - V. 230,-№2.-P. 251-258.

203. Yabuta Y. Folding pathway mediated by an intramolecular chaperone. A Functional peptide chaperone designed using sequence databases / Y. Yabuta, E. Subbian, C. Oiry, U. Shinde // J. Biol. Chem. 2003. - V. 278. - № 17. -P. 15246-15251.

204. Yamagata Y. Molecular cloning and nucleotide sequence of the 90k serine protease gene, hspK, from Bacillus subtilis (natto) No. 16 / Y. Yamagata, R. Abe, Y. Fujita, E. Ichishima // Curr Microbiol. 1995. - V. 31. - № 6. - P. 340-344.

205. Yoshimoto Т. Cloning and expression of subtilisin amylosacchariticus gene J / T. Yoshimoto, H. Oyama, T. Honda, H. Tone, T. Takeshita, T. Kamiyama, D. Tsuru // Biochem. (Tokyo). 1988. - V. 103. -№ 6. - P. 1060-1065.

206. Yum D. Y. Purification and characterization of alkaline serine protease from an alkalophilic Streptomyces sp. / D.Y. Yum, H.C. Chung, D.H. Bai, D.H. Oh, J.H. Yu // Biosci. Biotechnol. Biochem. 1994. - V. 58. - № 3. - P. 470-474.

207. Zhao H. Directed evolution converts subtilisin E into a functional equivalent of thermitase / H. Zhao, Arnold F.H. // Protein Engeeniring. 1999. - V. 12. -№ l.-P. 47-53.

208. Zhou R., Wei X., Jiano N., Li H„ Dong Y., His K.-L., and Zhao J. Evidence that HetR protein is an unusual serine protease / R. Zhou, X. Wei, N. Jiano, H. Li, Y. Dong, K.-L. His, J. Zhao // Biochemistry. 1988. - V. 95. - P. 49594963.

209. Zhou A., Webb G., Zhu X., and Steiner D.F. Proteolytic Processing in the Secretory Pathway / A. Zhou, G. Webb, X. Zhu, D.F. Steiner // The J. Biol. Chem. 1999. - V. 274. - № 30. - P. 20745-20748.