Разработка технологии производства ферментного препарата из молока овец, трансгенных по гену химозина крупного рогатого скота тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Ермолаев, Владимир Игоревич

• Ермолаев, Владимир Игоревич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Ермолаев, Владимир Игоревич

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Биохимические свойства химозина

1.1.1. Химический состав химозина.

1.1.2. Разделение и очистка реннина.

1.1.3. Влияние внешних условий на активность химозина.

1.1.4. Молокосвертывающие свойства нативного и рекомбинантного реннина.

1.2. Генетическая организация химозина.

1.3. Сычужный фермент

1.3.1. Активность сычужного фермента.

1.3.2. Состав сычужного фермента.

1.3.3. Методы очищения реннина.

1.3.4. Сырье и химические реагенты

1.3.5. Производство жидкого сычужного фермента.

1.3.6. Производство сычужного порошка.

1.4. Заменители химозина

1.5. Синтез рекомбинантного химозина

1.6. Трансгенные животные, продуцирующие с молоком биологически активные вещества.

1.7. Экологическая экспертиза рекомбинантных пищевых белков.

1.8. Производство и переработка овечьего молока

1.8.1. Состав овечьего молока.

1.8.2. Гигиенические требования к овечьему молоку

1.8.3. Отары дойных овец.

1.8.4. Доильные пункты.

1.8.5. Доение овец.

1.8.6. Анализ молока

2. Материалы и методы исследований.

2.1. Условия проведения опытов.

2.2. Определение молокосвертывающей активности сыворотки молока трансгенных овец, пастообразной и порошковой формы молокосвертывающего препарата.

2.3. Определение молокосвертывающей активности химозина из молока трансгенных овец, выделенного с использованием ионнообменной хроматографии.

2.4. Экспресс-метод определения присутствия прохимозина в молоке трансгенных овец.

2.5. Определение зависимости протеолитческой активности трансгенного химозина от рН по расщеплению белкового субстрата гемоглобина.

2.6. Определение активности трансгенного химозина по расщеплению казеината натрия.

2.7. Определение массовой, доли поваренной соли.

2.8. Определение количества микроорганизмов

2.9. Выделение и концентрирование фермента химозина из молока трансгенных овец.

3. Результаты исследований.

3.1. Предварительное изучение возможности активации прохимозина в молоке трансгенных овец.

3.2. Влияние уровня рН и добавления пепсина к сыворотке молока трансгенных овец на молокосвертывающую активность.

3.3. Выявление оптимальных значений рН для превращения прохимозина в химозин в молоке трансгенных овец.

3.4. Изучение влияния количества колониеобразующих бактерий сыворотки молока трансгенных овец на ее молокосвертывающую активность при различных значениях рН и времени хранения.

3.5. Изучение влияния концентрации ЫаС1 в сыворотке молока трансгенных овец при выделении химозина на выход стандартного продукта.

3.6. Влияние температуры хранения на поддержание молокосвертывающей активности фермента и рост количества колониеобразующих бактерий в пастообразной форме ферментного продукта.

3.7. Влияние времени хранения порошкового препарата химозина на его молокосвертывающую активность.

3.8. Разработка экспресс-метода определения присутствия прохимозина в молоке трансгенных овец в условиях сельскохозяйственного производства.

3.9. Изучение динамики экспрессии гена химозина у трансгенных овец в течение лактации.

3.10. Доказательство идентичности химозина, выделенного из молока трансгенных овец химозину теленка.

3.10.1. Выделение химозина из молока трансгенных овец с помощью хроматографии.

3.10.2. Исследование химозина из молока трансгенных овец, очищенного с помощью афинной хроматографии.

3.10.3. Определение зависимости протеолитческой активности трансгенного химозина от рН по расщеплению белкового субстрата гемоглобина.

3.10.4. Определение активности трансгенного химозина по расщеплению казеината натрия.

4. Экономическая эффективность производства молокосвертывающего ферментного препарата из молока трансгенных овец.

5. Обсуждение результатов исследований.

6. Выводы.

7. Практические предложения. 142 Приложения. 143 Использованная литература.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии производства ферментного препарата из молока овец, трансгенных по гену химозина крупного рогатого скота»

В настоящее время одним из самых перспективных направлений получения трансгенных сельскохозяйственных животных является интегрирование генов, которые обуславливают продуцирование ряда биологически-активных веществ, необходимых в медицине и технологии переработки продуктов сельского хозяйства.

Большинство лекарственных и других крайне важных для человека биологически активных веществ будучи белковыми соединениями не могут быть получены путем химического синтеза. С развитием молекулярной генетики созданы так называемые рекомбинантные микроорганизмы, которые в специальных биореакторах способны производить такие ценные вещества, как инсулин, человеческий гормон роста и др. Однако этот метод дорог. К тому же биологическая активность веществ, полученных с помощью микроорганизмов понижена йли может быть утрачена вовсе. В связи с этим решение проблемы нашли в создании трансгенных животных, в геном которых вводится чужеродный ген, позволяющий затем получать с молоком любые необходимые для человека биологически активные вещества, главным образом медицинского назначения.

В пользу использования молочной железы как места производства чужеродных протеинов могут быть приведены многие аргументы.

Экспрессия чужеродных протеинов в молоко позволяет получать необходимый продукт общепринятым способом, - путем выдаивания и без нанесения какого-либо вреда животным. Протеиновая синтетическая продуктивность молочной железы огромна. Общая концентрация эндогенных молочных протеинов в зависимости от вида лежит в пределах 4-6%, что реально позволяет получать до 10 грамм рекомбинантного протеина из 1 литра молока. Молоко является гигиенически чистым продуктом, поэтому при очистке чужеродного протеина из молока не должно возникать неразрешимых проблем.

Себестоимость фармакологических средств, получаемых от трансгенных животных, примерно в 50-100 раз ниже, чем при использовании клеточных ферментеров, а стоимость на рынке очень высока: один литр молока трансгенного животного дает человеческий белок С стоимостью 10 тысяч долларов, антитромбин -14 тысяч долларов, а от одной овцы получают с молокам за лактацию альфа1-антитрипсин на сумму 250 тысяч долларов.

Исследования в этой области имеют стратегическое значение для народного хозяйства страны, а полученные результаты даже на современном этапе специалисты расценивают как прорыв в биотехнологии.

Наша страна теряет не только приоритет в этой области, но и будет вынуждена в ближайшие годы покупать лекарственные вещества по баснословным ценам и более того не сможет их производить в дальнейшем, так как эти технологии будут запатентованы за рубежом.

Одним из биологически активных белков, в которых нуждается промышленность, является фермент химозин. Химозин (реннин) является основным компонентом в технологии производства сыра, а также творога и белковой пасты. Традиционно его получают из сычугов молочных телят. Однако получаемые в стране препараты молокосвертывающих ферментов отличаются низким содержанием химозина из за повышения возраста забиваемых телят. В последние годы в нашей стране резко снизился объем заготовок сычугов телят, практически прекратились поставки сычугов ягнят из стран СНГ.

Второе назначение химозина - получение лекарственного препарата -абомина, используемого в гастроэнтерологии и особенно незаменимого в лечении желудочно-кишечных заболеваний детей. Молокосвертывающие белки на основе пепсина, производимые из сычугов взрослых животных, не содержат химозин и не обеспечивают получение сыров высокого качества. Производство сыров длительных сроков созревания вообще невозможно без применения химозина.

В ряде европейских стран налажено производство рекомбинантного химозина, получаемого из бактерий. Вследствие дефицита фермента в России импортный рекомбинантный химозин стал проникать на российский рынок.

Использование химозина бактериального происхождения повышает себестоимость производимого сыра более чем на 10%, а также сопровождается ухудшением качества продукции, о чем свидетельствуют претензии ряда сыроваренных заводов.

Проблема получения химозина может быть решена путем получения его от трансгенных животных, продуцирующих фермент с молоком. Преимущество этого метода - небольшие затраты на получение молока, высокое качество фермента, простота его выделения по сравнению с рекомбинантным бактериальным химозином. Фермент, продуцируемый с молоком, по структуре полностью аналогичен получаемому традиционно из сычугов телят, что и обеспечивает его высокое качество. При получении молокосвертывающих ферментов из молока трансгенных животных практически не требуется очистка, т.к. молоко не содержит посторонних белков, не участвующих в процессе сыроделия.

Целью представленных исследований было доказательство идентичности фермента химозина, выделенного из молока трансгенных овец и разработка оптимальных условий для промышленного получения ферментных молокосвертывающих препаратов, содержащих трансгенный химозин.

Для достижения этих целей нами были поставлены следующие задачи:

1. Изучить возможность активации прохимозина в молоке трансгенных овец и определить оптимальные значения рН для максимального перехода прохимозина в химозин в молоке трансгенных овец.

2. Изучить влияние сроков инкубации сыворотки молока трансгенных овец на ее молокосвертывающую активность при различных значениях рН и температуре.

3. Изучить возможность экстрагирования фермента химозина из молока трансгенных овец путем насыщения раствора №С1 и определить оптимальную концентрацию №С1 для получения максимального количества продукта.

4. Изучить влияние условий хранения на характеристики пастообразной и порошковой форм молокосвертывающего ферментного препарата из молока трансгенных овец.

5. Разработать метод определения присутствия прохимозина в молоке трансгенных овец в условиях сельскохозяйственного производства и изучить динамику экспрессии гена химозина у трансгенных овец в течение лактации.

6. Выделить химозин из молока трансгенных овец с помощью хроматографических методов и исследовать химозин, выделенный из молока трансгенных овец для доказательства его идентичности химозину теленка.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Переход прохимозина в химозин в молоке трансгенных овец начинается при рН 4,0 с максимумом при рН 2,5-1,0.

2. Выделение химозина из сыворотки молока трансгенных овец в производственных условиях возможно путем насыщения ее ИаС1. Выход фермента увеличивается с 3887 тыс.у.е до 7903-8240 тыс.у.е. с увеличением концентрации №С1 в сыворотке молока с 10 до 2530%, от 30 до 35% соответственно с 7903 до 15338 тыс.у.е./г.

3. При хранении в течение 30 суток пастообразной ферментной массы, полученной из молока трансгенных овец, молокосвертывающая активность при температуре хранения -5°С практически не изменяется, а при +5°С и +22°С снижается.

4. Активность порошковой формы препарата химозина, полученного из молока трансгенных овец, в случае хранения при комнатной температуре практически не изменилась в течение 6 месяцев хранения.

5. Выделение химозина из молока трансгенных овец с применением ионнообменной и афинной хроматографии и сравнение его с химозином, выделенным из сычугов телят с помощью диск9 электрофореза доказало идентичность трансгенного химозина А-форме химозина теленка.

6. Аминокислотный состав трансгенного химозина соответствует составу химозина теленка.

7. Протеолитическая активность трансгенного химозина по молоку, казеинату натрия и гемоглобину сопоставимы с активностью химозина теленка по этим субстратам.

1. Обзор литературы

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Ермолаев, Владимир Игоревич, 1999 год

1. Алексеенко Л.П. Современные методы биохимии. - М. - Медицина. -1967.-с. 120.

2. Антипова JI.B. Разработка биотехнологий получения специальных препаратов ферментов из микроорганизмов и животных тканей для обработки сырья мясной и молочной промышленности. М. - 1994. -С. 78-79.

3. Брем Г., Зиновьева Н., Эрнст Л. «Генные фермы» новый путь производства биологически активных протеинов трансгенными животными. // С.-х. биол. - 1993. - 6: 3-27.

4. Брем Г., Кройслих X., Штранцингер Г. Эксперементальная генетика в животноводстве. Москва. - 1996.

5. Гоголевский П.А., Гольдман И.Л., Башкеев Е.Д. и др. Цитологические вопросы технологии получения трансгенных овец. // Докл. РАСХН. -1993.-5: 23-26.

6. Гольдман И.Л., Башкеев Е.Д., Гоголевский П.А. и др. Прогрессивная биотехнология получения трансгенных овец. // Докл. РАСХН. 1993. -9-10: 25-30.

7. Гольдман И.Л., Захарова Е.С., Кадулин С.Г. и др. Химозин новый биотехнологический продукт. // Биотехнология. - 1996. - 12:3-16.

8. Гольдман И.Л., Эрнст Л.К., Брем Г. и. др. Получение трансгенных овец- продуцентов молока, содержащего физиологически активные белки, в условиях племенной фермы. // С.-х. биотех. 1994. - 6: 46-53.

9. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов Агропромиздат. -1987.

10. Дурова Ж.И. Исследование возможности применения ферментов из Aspergillus Candidus шт. 11 и Bacillus Mesentericus-renninus в сыроделии.- Автореф. дис. Вологда-Молочное - 1967.

11. Заяс Ю.Ф., Иноземцева М.А., Способ получения сычужного фермента из сычугов телят и ягнят. ВНИИ МП. - 1981.

12. Зиновьева H.A. Получение и молекулярно-генетический анализ трансгенных кроликов с тканеспецифическими для молочной железы генными конструкциями: Автореф. канд. дис. Дубровицы. - 1994.

13. Зиновьева H.A., Безенфельдер У., Брем Г. // Онтогенез. 1996. - Т.27. -N3.-С. 214-217.

14. Каюкова Н.В. Овечье молоко и продукты его переработки. ТСХА1995. 15 С.

15. Коцарев В.Е., Винников Н.И., Белинский В.Е. Производство и переработка овечьего молока. Приложение к журналу «Овцеводство» - М. - Агропромиздат. - 1988. - 56 с.

16. Михайлусь И.А. Влияние различных сред растворения сычужного фермента , полученного от живых телят и убитых животных, на продолжительность свертывания молока. Автореферат на соискание уч. степени к.б.н. - Львов - 1961. - С. 4-15.

17. Прокофьев М.И., Эрнст Л.К., Гольдман И.Л. и др. Получение трансгенных овец, продуцирующих с молоком прохимозин. // Тез. Международной конф., посвященной памяти акад. А.А.Баева. М.1996. -С.241.

18. Романовское овцеводство. М. - 1987.

19. Сеитов 3. Исследование белков, жира молока и фермента реннина. -Автореферат на соискание уч. степени д.б.н. -Алма-ата - 1971. - С. 2633.

20. Соловьева Т.А., Беляев C.B., Степанов В.М. // Химия природных соединений. 1997. - вып.З. - с. 398-403.

21. Степанов В.М., Руденская Г.Н., Янонис В.В. и др. // Биоорганическая химия. 1987. - Т. 4. - №9., с. 1256-1263.

22. Строган А.Я., Борухов С.И., Боргуш В.Г. и др. Природные и генноинженерные белки сходство и отличия. // Биотехнология. - 1987. -3(3): 325-331.

23. Сунданская JI.B. // Выделение, очистка и изучение свойств реннина телят: Автореферат. Краснодар. - 1980.

24. Теплы М., Машек Я., Гавлова Я. Молокосвертывающие ферменты животного и микробиологического происхождения. М.: Пищевая промышленость. - 1980.

25. Томилин Н.В. Новые системы генетической трансформации соматических клеток млекопитающих. // Биотехнология. 1987. - 3(3): 343-351.

26. Устинов М.Н. Совершенствование технологии сушки препарата сычужного фермента с целью увеличения его выхода. Москва. - 1980.- Автореферат.

27. Устинов М.Н., Щедушнова Т.Н., Шпитонкова Л.И. Производство и использование молокосвертывающих ферментных препаратов в СССР и за рубежом. Обзорная информация. М.: АгроНИИТЗИММП. - 1990.- 32с.

28. Фомин Д.П. Молочно-маслодельная промышленность 1939. - Т.9. - С 16.

29. Эрд Т.А., Торп A.A., Кольмер М.Й. // Биотехнология 1987. - Т.З. - N3. -С.307-311.

30. Эрнст Л.К., Гальдман И.Л., Зиновьева Н. и др. // Докл. Акад. Наук. -1995. Т.345. - №4. - С.5.55 -558.

31. Эрнст Л.К., Гольдман И.Л., Кадулин С.Г. Генная инженерия в животноводстве: трансгенные сельскохозяйственные животные, кормовые растения, микроорганизмы рубца. // Биотехнология. 1993 -№5 - С.2-14.

32. Югова Л.В., Дорохов В.В. Микробные заменители сычуясного фермента: производство и применение продуктов микробиологических34