Разработка технологии биосинтеза антибиотика вирджиниамицина тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат наук Савушкин Вячеслав Алексеевич

• Савушкин Вячеслав Алексеевич
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Савушкин Вячеслав Алексеевич

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Общая информация о вирджиниамицине

1.2 Области применения вирджиниамицина

1.2.1. Медицина

1.2.2. Промышленность

1.2.3. Ветеринария и сельское хозяйство

1.3 Регуляция биосинтеза вирджиниамицина

1.4 Промышленное производство вирджиниамицина

1.4.1. Получение штаммов-продуцентов

1.4.2. Оптимизация условий ферментации

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы исследований

2.1.1.Штамм-продуцент Streptomyces virgin iae

2.1.2. Лабораторные ферментационные установки

2.1.2.1.Описание ферментационной установки №1

2.1.2.2.Описание ферментационной установки №2

2.2. Методы исследований

2.2.1. Приготовление и стерилизация питательных сред

2.2.2. Идентификация штаммов

2.2.3. Культивирование штамма Streptomyces virginiae

2.2.4. Методика приготовления посевного материала для проведения процесса биосинтеза антибиотика вирджиниамицина в лабораторной ферментационной установке

2.2.5. Методика культивирования штамма Streptomyces virginiae и биосинтеза антибиотика вирджиниамицина в

лабораторных ферментационных установках

2.2.6. Определение содержания биомассы в культуральной жидкости

2.2.7. Определение содержания восстанавливающих сахаров

в культуральной жидкости

2.2.8. Определение содержания вирджиниамицина в культуральной жидкости

2.2.8.1. Метод тонкослойной хроматографии (ТСХ)

2.2.8.2. Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Глава 3. Результаты исследования

3.1 Штамм-продуцент Б^вр^тусвз у^шав

3.2 Идентификация исходного и полученного штаммов

3.3 Устойчивость штамма ЗМт&тав к антибиотикам

3.4 Оптимизация состава питательных сред для культивирования штамма ^1гвр1отусв8 virginiaв 1В

3.4.1. Влияние различных источников углерода на биосинтез вирджиниамицина (факторов М1 и Б1)

3.4.2. Влияние различных источников азота на биосинтез вирджиниамицина (факторов М1 и Б1)

3.4.3. Влияние минеральных веществ (макроэлементов) на биосинтез вирджиниамицина (факторов М1 и Б1)

3.4.3.1. Макроэлементы

3.4.4. Влияние синтетических адсорбирующих смол на рост и продуцирующую способность штамма Б^вр^тусвз virginiaв

1В

3.5 Культивирование штамма Б^вр^тусвз virginiaв 1В 25-8 в лабораторной ферментационной установке

3.5.1. Культивирование штамма Streptomyces virginiae IB 25-8 в ферментационной среде в режиме регистрации основных технологических и биохимических параметров

3.5.2. Продуктивность штамма Streptomyces virginiae IB 25-8 на ферментационной среде в режиме контроля параметра

рН

3.5.3. Продуктивность штамма Streptomyces virginiae IB 25-8 на ферментационной среде в режиме контроля по параметрам рН и рО2

3.5.4. Продуктивность штамма Streptomyces virginiae IB 25-8 на ферментационной среде с добавлением дополнительного источника углерода

3.5.5. Продуктивность штамма Streptomyces virginiae IB 25-8 на ферментационной среде, содержащей адсорбирующую смолу

3.6 Масштабирование технологии биосинтеза вирджиниамицина

высокоактивным штаммом Streptomyces virginiae IB 25-8 в

ферментационной установке объемом 100 л

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка технологии биосинтеза антибиотика вирджиниамицина»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Надёжное обеспечение населения мясной и молочной продукцией, являющейся основным источником животного белка, представляет собой одно из важнейших условий достижения продовольственной безопасности государства. Удовлетворить потребности населения в мясе и молочных продуктах в значительной степени можно за счёт наращивания объемов их производства в регионах страны. Одним из способов решения данной проблемы является применение биологически активных веществ, в частности, антибиотиков с целью повышения продуктивности сельскохозяйственных животных, профилактики их заболеваемости и сохранения доброкачественности кормов.

Необходимость применения антибиотических лекарственных препаратов в животноводстве обусловлено несколькими причинами. Так, большие животноводческие и птицеводческие хозяйства характеризуются тем, что огромное поголовье птиц или же животных выращивается на сравнительно небольших площадях, что, в свою очередь, создает риск масштабного распространения всевозможных заболеваний. Также, выращивание и содержание животных подразумевает использование различных обработок с помощью медицинских препаратов, в том числе антибиотических. Наконец, применение антибиотиков в качестве профилактики рекомендовано в ряде случаев при перевозке птицы и животных для снижения стресса. Так же можно отметить и тот факт, что некоторые антибиотические препараты применяются в качестве стимуляторов роста сельскохозяйственных животных (Черенков, 2011).

Общемировой объем выпускаемых антибиотиков для животноводства

оценивается в 4 миллиарда долларов США. В Соединенных Штатах Америки

каждый год выпускается около 2,7 тысяч тонн препаратов данного

предназначения. В денежном эквиваленте использование таких препаратов

только для животноводства составляет 250 миллионов долларов США или же

порядка 45% от всего производства антибиотиков в стране. Так, один доллар,

5

потраченный в Соединенных Штатах Америки на изготовление и выпуск ветеринарных антибиотических препаратов, гарантирует прибыль в 2-5 долларов. (Горлов, 2008). На территории РФ на сегодняшний день применяют порядка 58-60 препаратов.

Среди наиболее распространённых препаратов в ветеринарии представлены антибиотики дестомициновой, тетрациклиновой, аминогликозидной, цефалоспориновой и вирджиниамициновой групп. Именно последняя группа имеет особое значение, обоснованное уникальными биологическими свойствами данных соединений, не являющихся мутагенными и токсичными, не способными накапливаться в органах животных и птиц. Однако, они способными к биодеградации и имеют узкий спектр действия в отношении стафилококков. Вирджиниамицины успешно применяются в ветеринарии как терапевтические вещества для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта птиц, свиней и крупного рогатого скота.

Первый препарат на основе вирджиниамицина (Stafac 500), был произведен еще в 1966 г. в Бельгии компанией Pfizer, а в продаже появился уже в 1972 г. В 2001 г. компания Phibro Animal Health Corporation (PAHC, США) выкупила права на торговую марку Stafac. На сегодняшний день, владельцем или лицензиатом таких торговых марок препаратов как Stafac (свиньи, КРС, куры и индейки); Lactrol (спиртовая промышленность); V-Max (мясной скот); Eskalin (молочный скот) является компания PAHC. Все перечисленные препараты содержат в своем составе вирджиниамицин.

Ведущие производственные площадки препаратов на основе вирджиниамицина, расположены на бразильских фабриках компании PAHC; также, существует ряд других иностранных американских, индийских и китайских компаний, выпускающих подобные препараты.

На территории РФ разрешены для использования в животноводстве и

птицеводстве препараты Стафак 44, Стафак 110 и Стафак 500. Ввоз

препаратов Стафака в Российскую Федерацию сравнительно невелик и

6

организован лишь небольшим количеством компаний. Кроме Стафака необходимо также отметить и импорт в РФ вирджиниамицин-содержащего препарата Лактрол, применяемого при производстве спирта. В России отсутствует собственное производство вирджиниамицина. При этом заболеваемость с/х животных и птиц различными болезнями желудочно-кишечного тракта, в последние годы в РФ составляет порядка 42,7-51,2% от оборота стада (Жиганова, 2014).

Большинство производственных фондов российских изготовителей антибиотиков были созданы 30-40 лет назад. На сегодняшний день износ этих предприятий составляет порядка 80% (Даниленко, 2005). До 1990 г. на территории РФ изготавливали около 18 субстанций различных антибиотиков; затем выпуск субстанций снизился до буквально абсолютной остановки их изготовления в 2004 г. В связи с этим, основную массу используемых в РФ антибиотических препаратов и других лекарственных средств необходимо импортировать из-за рубежа, что является экономически не выгодным решением.

Низкая эффективность производства антибиотических субстанций в РФ обусловлена следующими причинами:

1) отсутствие или низкое качество сырьевой базы;

2) устаревшие отечественные технологии;

3) проблемы с компьютеризацией производственных циклов и наличием современных контрольно-измерительных приборов;

4) сильная конкуренция зарубежных производителей фармацевтических субстанций (Китай, Индия и др.),

5) слабый менеджмент предприятий;

6) отсутствие поддержки государства в области биотехнологии.

Решить данную проблему можно путем создания передового

конкурентоспособного отечественного производства субстанций антибиотиков, в частности, вирджиниамицина.

Цель и задачи исследования. Целью данной работы была разработка эффективной лабораторной технологии биосинтеза антибиотика вирджиниамицина.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) Определить оптимальный состав питательной среды, способствующий максимальной продуктивности штамма-продуцента $>1гер1отусе8 virginiae.

2) Подобрать оптимальные технологические параметры ферментации, способствующие максимальной продуктивности штамма-продуцента ^1гвр1отусв8 virginiae.

3) Разработать оптимальную технологическую схему биосинтеза вирджиниамицина в лабораторной ферментационной установке.

Научная новизна. Впервые методом индуцированного

ненаправленного мутагенеза и селекции получен новый высокоактивный

штамм Б^ер^тусез virginiae 1В 25-8 - продуцент антибиотика

вирджиниамицина, обладающий повышенной устойчивостью к

собственному антибиотику (4,5 мг/мл М+S форм вирджиниамицина) и

антибиотику тилозину; исследованы его морфолого-биохимические и

культуральные признаки; определены основные питательные потребности

штамма-продуцента (источники углерода, азота, макроэлементов),

определены оптимальные условия культивирования данного штамма,

способствующие максимальному накоплению вирджиниамицина, а также

изучено влияние синтетических адсорбирующих смол на рост и

продуцирующую способность штамма БгерЮтусез virginiae 1В 25-8 в

процессе его глубинного культивирования.

На основании полученных результатов впервые была разработана

оптимальная технологическая схема биосинтеза вирджиниамицина в

лабораторной ферментационной установке, позволяющая значительно

повысить накопление вирджиниамицина в культуральной жидкости.

Теоретическая и практическая значимость. Полученный

высокопродуктивный штамм Streptomyces virginiae 1В 25-8 депонирован в

8

ВКМ под регистрационным номером ВКМ Ac2738D. Проведенное масштабирование технологии биосинтеза вирджиниамицина при глубинном культивировании штамма virginiaв 1В 25-8 продемонстрировало возможность проведения процесса биосинтеза вирджиниамицина с использованием данного штамма в лабораторных и опытно-промышленных ферментационных установках.

Подбор оптимального состава питательной среды, параметров и условий глубинного культивирования данного штамма, позволяют в дальнейшем разработать технологию получения антибиотика вирджиниамицина на опытно-промышленном и промышленном уровне.

На основе данных, полученных в результате исследования, получен патент на изобретение № ЯШ 637 857 С1 «Штамм Б^вр^тусвз virginiaв -продуцент вирджиниамицина и способ получения вирджиниамицина».

Методология и методы исследования. При выполнении диссертационной работы использовались микробиологические методы, методы лабораторного культивирования микроорганизмов, методы микроскопии, различные методы количественного определения веществ. Более детальное описание представлено в разделе «Материалы и методы». Положения, выносимые на защиту

1) Определен оптимальный состав питательной среды, способствующий максимальной продуктивности штамма-продуцента Б^вр^тусвз virginiaв.

2) Подобраны оптимальные технологические параметры ферментации, способствующие максимальной продуктивности штамма-продуцента Б^вр^тусвз virginiaв.

3) Разработана оптимальная технологическая схема биосинтеза вирджиниамицина в лабораторной ферментационной установке с использованием дополнительного источника углеводного питания и синтетической адсорбирующей смолы.

4) Проведено успешное масштабирование процесса культивирования

штамма virginiaв 1В 25-8 и тем самым продемонстрирована возможность

9

проведения процесса биосинтеза вирджиниамицина с использованием данного штамма в опытно-промышленном масштабе.

Степень достоверности и апробация работы. Диссертационная работа выполнена на современном оборудовании с использованием современных общепринятых и адаптированных для данной работы методик.

Материалы работы были представлены на: V Научно-практической конференции «Биотехнология: наука и практика», 2017г., г. Ялта (Крым); XXXXI международной научно-практической конференции «Достижения и проблемы современной науки», 2019 г., г. Санкт-Петербург; XXXIII международной научно-практической конференции «Вопросы современной науки: проблемы, тенденции и перспективы», 2019г, г. Москва.

Личный вклад диссертанта. Представленные в диссертационной работе экспериментальные данные получены лично автором, либо при его непосредственном участии на всех этапах исследований, включая планирование и проведение экспериментов, обработку, оформление и публикацию результатов.

Публикации. По теме научно-квалификационной работы опубликовано 9 работ, из них 5 статей в рецензируемых научных изданиях, входящих в международные реферативные базы данных и системы цитирования Scopus и/или Web of Science, 3 тезиса в сборниках российских и международных научных конференций, а также получен патент на изобретение RU2637857 C1.

Благодарности. Автор выражает благодарность за помощь при выполнении и подготовке работы своему научному руководителю, к.б.н. Камионской А.М.; сотрудникам лаборатории молекулярной диагностики (ЦКП "Биоинженерия") за помощь при идентификации штамма; сотрудникам отдела молекулярной биологии ФГБНУ ВНИИ Фитопатологии за помощь в разработке высокоактивного штамма; сотрудникам лаборатории биотехнологии физиологически активных веществ Института Биоинженерии

ФИЦ «Биотехнологии» РАН за помощь в проведении ферментаций и поддержку.

Структура и объем работы. Научно-квалификационная работа имеет стандартную структуру и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования, заключение, список публикаций по теме диссертации, список литературы и приложение. Работа изложена на 100 страницах машинописного текста, содержит 18 рисунков, 14 таблиц, 1 приложение. Список литературы включает 79 работ, в том числе 64 иностранных авторов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая информация о вирджиниамицине

Вирджиниамицин - это циклический полипептидный антибиотический комплекс, продуцируемый мутантным штаммом Streptomyces virginiae и относящийся к антибиотикам группы стрептограминов. Продуцирующий микроорганизм Streptomyces virginiae был впервые выделен из образца почвы в Бельгии в 1954 г.; в коллекции АТСС при депонировании, ему был присвоен номер 13161. Описание способа получения из этой культуры антибиотика № 899 впервые было опубликовано в журнале Antibiotics and Chemotherapy (DeSomer P., 1955) и одновременно в заявке на патент US758483. Затем по новой международной номенклатуре антибиотик 899 получил наименование вирджиниамицин.

Вирджиниамицин представляет собой природную смесь макроциклических пептидолактонов М и S (рисунок 1). Фактор М вирджиниамицина - макроциклический лактон, содержащий оксазолиновое кольцо и, в свою очередь, состоит из компонентов М1 и M2, фактор S -состоит из циклопептидного лактонового кольца и содержит компоненты S1, S2, S3, S4 и S5. Основными компонентами являются М1 (VM) и S1 (VS).

Рисунок 1. - Химическая структура вирджиниамицина М1 (а) и вирджиниамицина S1 (б)

а

б

Структурные формулы вирджиниамицина S1 (VS) и вирджиниамицина М1 (VM) достаточно сильно похожи на таковые для антибиотиков квинупристина и дальфопристина, соответственно. Данные соединения проявляют сходную бактерицидную активность и высокую степень риска развития перекрестной устойчивости.

Коммерческий препарат вирджиниамицина содержит ~75% VM и ~5-25% VS. Именно в таком соотношении компоненты проявляют синергизм в подавлении синтеза белка в клетках чувствительных микроорганизмов, нарушая трансляцию РНК (Mast Y., 2014). В высоких концентрациях вирджиниамицин обладает бактерицидным, а в малых дозах -бактериостатическим действием, в отношении большинства грамположительных и некоторых грамотрицательных бактерий, в том числе Clostridium perfringens, Campylobacter spp, Staphylococcus spp., Listeria spp., Microccocus spp., микоплазм (M pneumoniae) и хламидий (С. trachomatis, C. pneumoniae). Небольшая чувствительность грамотрицательных бактерий к нему объясняется непроницаемостью их оболочки для антибиотика.

Контроль роста микроорганизмов, обусловленный действием

вирджиниамицина, заключается в воздействии на биохимические процессы в

клетках бактерий, такие как синтез белка, ингибирование элонгации

Methanobacterium и Escherichia coli, или снижение синтеза бактериями

молочной кислоты в 10-20 раз (Parks, 2001). Вирджиниамицин ингибирует

синтез бактериальных белков путем связывания с 50S рибосомальной

субъединицей, что приводит к блокированию нормального формирования

белка (Cocito C, 1974). Это позволяет вирджиниамицину воздействовать на

широкий спектр бактерий. Особенно эффективен вирджиниамицин (точнее,

его М-фактор) в отношении стафилококков и стрептококков, устойчивых к

другим антибиотикам - пенициллину, стрептомицину, эритромицину,

тетрациклину и др. VS более активен в отношении бацилл, но малоактивен в

отношении кокковых культур; его активность в этом случае составляет

только 3-4% от общей активности VM. Однако потенциальная активность

13

вирджиниамицина является результатом комбинации двух факторов. Максимальное синергетическое воздействие вирджиниамицина происходит при концентрации VS на уровне 25-40%, при этом активность фактора VM увеличивается в 3,5-4 раза. Эта уникальная черта синергического взаимодействия важна для объяснения отсутствия значительной резистентности микроорганизмов к вирджиниамицину после многих лет интенсивного его использования в животноводстве.

Вирджиниамицин обладает не только ярко выраженным антимикробным действием, он также имеет свойства стимулятора роста. Как и многие другие антибактериальные препараты, вирджиниамицин оптимизирует абсорбцию и метаболизм питательных веществ, улучшая состояние эпителия тонкого кишечника и подавляя синтез кишечной микрофлорой токсинов и метаболитов, вредных для организма (Feighner S.D., 1987). Антибиотики, подобные вирджиниамицину, угнетают молочнокислые бактерии, преобладающие в верхнем отделе желудочно-кишечного тракта цыплят-бройлеров (Hoyzman A., 2011). Несмотря на то, что молочнокислые бактерии помогают предотвратить развитие Salmonella, они также в значительной мере приводят к замедлению роста свиней и птицы (Hoyzman A., 2011). Снижение популяции бактерий увеличивает доступность питательных веществ корма за счет уменьшения конкуренции за них между животным и микрофлорой (Cervantes H., 2002).

Вирджиниамицин характеризуется очень низкой токсичностью. При пероральном введении он не всасывается в желудочно-кишечном тракте и не подвергается воздействию пищеварительных ферментов, что обеспечивает его высокую концентрацию и способствует длительному антимикробному действию в желудочно-кишечном тракте. Вирджиниамицин не накапливается в органах и тканях, из организма выводится в неизменном виде с фекалиями.

Вирджинамицин занесен в реестр пищевых добавок, имеет обозначение Е711. Тем не менее, непосредственно в пищевой промышленности он не используется с 1998 года.

1.2. Области применения вирджиниамицина

1.2.1. Медицина

Согласно обзору (Cocito C., 1979), антибиотики вирджиниамициновой группы ранее применялись в целом ряде областей медицины. Так, эти антибиотики применяли для лечения коклюша и стафилококковых инфекций детей; в хирургии - для терапии остеомиелита и острого артрита, устойчивых к иным видам терапии; лечения открытых абсцессов и перитонитов, профилактической обработки культей ампутированных конечностей и хирургических ран во избежание суперинфекции; в стоматологии - для обработки абсцессов и профилактики сепсиса; в отоларингологии - для лечения абсцессов, устойчивых к химиотерапии; в дерматологии - для лечения стафилококковых инфекций, экзем, предотвращения инфицирования ожогов и т.п. Существует также патент США, предполагающий использование вирджиниамицина М1 и его аналогов для лечения расстройств, вызванных паникой и беспокойством у млекопитающих, в первую очередь людей (Freidinger R.M., 1993).

Несмотря на то, что вирджиниамицин показал себя достаточно эффективным антибиотиком в определенных областях применения, существуют некоторые ограничения, препятствующие более широкому его использованию. Так, принципиальным ограничением на использование вирджиниамицина в терапевтических целях является его плохая растворимость в воде (т.е. данный антибиотик может использоваться только в составе препаратов для орального применения); кроме того, существует ограничение, связанное со сложностями распределения антибиотика в таргетных органах и частях тела. Следующее ограничение связано с тем, что вирджиниамицины с трудом образуют конъюгаты с прочими терапевтическими агентами, что затрудняет создание новых препаратов на основе вирджиниамицина, которые бы обладали большей эффективностью и более широким спектром биологической активности.

Наконец, еще одним ограничением на использование натуральных вирджиниамицинов является проблема присоединения к антибиотикам А-типа (куда входит вирджиниамицин) реактивных групп, таких как аффинные метки, с одновременным сохранением их антибиотической активности. Возможность использования таких меток позволила бы детально исследовать механизм действия вышеупомянутых антибиотиков; полученная в результате таких исследований информация могла бы быть использована для повышения эффективности действия антибиотиков и разработки улучшенных препаратов, а также для дальнейшего исследования структуры и функций рибосом, являющихся естественной мишенью для данных антибиотиков.

Вследствие вышеупомянутых причин вирджиниамицин в настоящее время в медицине не используется.

1.2.2. Промышленность

В промышленном производстве топливного спирта существует проблема предотвращения контаминации материалов, используемых на этапе брожения, посторонней микрофлорой, способной негативно повлиять на качество конечного продукта. Для предотвращения контаминации используются антибиотики, в т.ч. вирджиниамицин (Hynes S.H., 1997, Arshad M., 2011). Добавление в ферментеры препаратов, содержащих вирджиниамицин, оздоравливает микрофлору (дрожжи), подавляя рост молочнокислых бактерий (Bayrock D.P., 2006, Fowlie D.A., 2010).

Одобрение FDA получили следующие содержащие вирджиниамицин препараты, предназначенные для использования в спиртовой промышленности:

1) LACTROL (PhibroChem, Бельгия). Торговая марка зарегистрирована в

1996 г. компанией Pfizer; впервые продукт появился на рынке в 1994 г.

Активным компонентом Лактрола является антибиотик вирджиниамицин,

эффективно действующий против широкого спектра бактерий; также

присутствует декстроза. Представляет собой порошок, слабо растворимый в

16

воде и хорошо растворимый в спирте. Особенно высокую активность проявляет в отношении молочнокислых бактерий.

2) LACTOSIDEV и LACTOSIDE 247 (Lallemand Biofuels & Distilled Spirits, Canada). В первом случае в состав препарата помимо вирджиниамицина входит карбонат кальция и карбоксиметилцеллюлоза, во втором -пенициллин, декстроза и сульфат цинка.

1.2.3 Ветеринария и сельское хозяйство

Высокая эффективность вирджиниамицина делает его применение особенно ценным в животноводстве в качестве антибиотической кормовой добавки для сельскохозяйственных животных и птиц, которая способствует не только снижению заболеваемости и выживаемости молодняка, но и повышению ежедневной прибавки в весе и улучшению эффективности питания (Ives, S.E., 2002, Singh M., 2008). Вирджиниамицин соответствует современным требованиям, предъявляемым к биологическим стимуляторам: активность, ограниченная грамположительными микроорганизмами, стабильность в кислотном рН, низкая растворимость в воде, малая вероятность возникновения резистентных форм микроорганизмов к антибиотику, отсутствие токсичности или остаточных явлений при его применении.

С 1975 г. вирджиниамицин используется в США в качестве стимулятора роста птицы и свиней, а также одобрен FDA в качестве кормовой добавки для домашней птицы, свиней и КРС для профилактики или лечения некоторых болезней, таких как дизентерия свиней, воспаление печени у КРС, ацидоз у овец, ламинит и некротический энтерит кур (Hoyzman A., 2011, Hedde R.D., 1988, Rowe J.B., 1988, Godfrey S.I., 1995, Hofacre C.L., 1998, Shojadoost B., 2013, Hoyzman A., 2010).

По данным некоторых исследований, существует возможность

взаимосвязи между интенсивностью использования вирджиниамицина в

качестве стимулятора роста и появлением устойчивых к

дальфопристину/квинупристину штаммов Enterococcus faecum у

17

сельскохозяйственных животных и людей (Kieke A.L., 2006). В связи с этим использование вирджиниамицина в качестве стимулятора роста было запрещено сначала в Норвегии (1998 г.) и Дании (1999 г.), а затем и в ЕС.

На территории Российской Федерации антибиотик вирджиниамицин допущен к применению в составе противобактериальных препаратов для с/х животных и птиц. Доля импорта в РФ препаратов, содержащих вирджиниамицин, в первом полугодии 2014 г. составила 8,32% от суммарного объема поставок антибактериальных ветеринарных препаратов.

Существуют также сведения о селективной инсектицидной активности вирджиниамицинов S1 и M1 в отношении колорадского жука Leptinotar sadecemlineata, сравнимой по эффекту с действием органофосфатного пестицида метатиона, а также об акарицидной активности в отношении яиц паутинного клеща Tetranychusurticae (Prikrylova V., 1992).

1.3. Регуляция биосинтеза вирджиниамицина

Одной из уникальных особенностей биосинтеза вирджиниамицина является тот факт, что S. virginiae продуцирует одновременно оба фактора (VS и VM), причем в соотношении, обеспечивающем максимальную синергическую активность (DiGiambattista M., 1989). Регуляторный механизм, обеспечивающий такую синхронизацию, до сих пор остается неясным. В целом, гены, вовлеченные в регуляцию процесса биосинтеза вирджиниамицина, могут быть разделены на два типа (Pulsawat N., 2009). Первый тип включает в себя высокоуровневые регуляторы, играющие роль передатчика сигналов, поступающих из внешней среды. Как правило, такие гены не входят в кластеры биосинтетических генов. Второй тип (низкоуровневые регуляторы) включает в себя регуляторы, специфичные для определенных биосинтетических путей, которые управляют процессами транскрипции структурных биосинтетических генов, отвечающих за синтез того или иного антибиотика; эти гены обычно входят в соответствующие биосинтетические кластеры.

Биосинтез VM и VS в клетках S. virginiae запускается путем синтеза вирджинибутанолида (VB), небольшой сигнальной молекулы, связывающейся с VB-специфичным рецепторным белком BarA, способным связываться с ДНК и подавлять ее транскрипцию (Yamada Y., 1987, Kondo K., 1989). Фланкирующие регионы гена barA (см. рисунок 2) включают в себя другие важные гены, связанные с биосинтезом VB (barX, barS1 и barS2) и механизмами устойчивости продуцента к вырабатываемому им антибиотику (varM, varR и varS) (Namwat W., 2001, Kawachi R., 2000). Все эти гены находятся в одном регионе размером 10 килобаз, включающем один специфичный регуляторный ген vmsR, важный для регуляции биосинтеза как VM так и VS; транскрипция этого гена контролируется генами-регуляторами более высокого уровня, такими как barA (Kawachi R., 2000). Одиннадцать генов (virA - virK), расположенных между генами bkdB и varL, относятся к биосинтетическому кластеру VM, а два гена virM и virN предположительно кодируют ферменты, участвующие в его посттрансляционной модификации. Биосинтетический кластер VS представлен генами семейства vis (visA-visG); из них последний (visG) играет критическую роль в синтезе VS (Ningsih F., 2011).

Рисунок 2. Кластер генов Streptomyces virginiae, связанных с биосинтезом вирджиниамицина. Предполагаемые регуляторные гены показаны серыми стрелками (Pulsawat N., 2009)

Еще один биосинтетический кластер вирджиниамицина размером 62

килобаз располагается во фланкирующем регионе вышеописанного

«регуляторного островка» (Pulsawat N., 2007). Этот кластер кодирует шесть

19

многофункциональных ферментов и 14 дополнительных белков, необходимых для биосинтеза вирджиниамицина, а также включает в себя два регулятора экспрессии генов (vmsS и vmsT), контролируемых упомянутым выше регуляторным геном vmsR. Экспрессия генов этого кластера также регулируется факторами более высокого уровня (BarA и BarX), участвующими во множестве процессов, происходящих в клетках S. virginiae.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Савушкин Вячеслав Алексеевич, 2019 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Антонова С., Воейкова Т., Тяглов Б., Барсуков Е., Лобанов К., Малахова И., Сизова И., Красиков В. Экспресс-анализ антибиотиков вирджиниамицина, мономицина и биалафоса в культуральных жидкостях штаммов-продуцентов микроорганизмов методом электроосмотической тонкослойной хроматографии // Аналитика. - 2012. - № 5. - С. 22-29.

2. Безбородов А.М. Биохимические основы микробного синтеза. -М.: Легкая и пищевая промышленность, 1984. - 304

3. Беккер М.Е. Биотехнология / Беккер М.Е., Лиепиныш Г.К., Райпулис Е.П. // М: Агропромиздат, 1990. - 334.

4. Билай В.И. Биологически активные вещества микроскопическх грибов и их применение. - К.: Наук. Думка, 1965. - 265 с.

5. Бирюков В.В. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / Бирюков В.В. Кантере В.М. // М: Наука. -1985. - 296.

6. Бочкарев В.В., Троян А.А. Оптимизация химико-технологических процессов. Практикум. Издательство ТПУ. - 2016. -160с.

7. Булыгина Е.С. Изучение нуклеотидных последовательностей nif H генов у представителей метанотрофных бактерий. / Булыгина Е.С., Кузнецов Б.Б., Марусина А.И., Кравченко И.К., Быкова С.А., Колганова Т.В., Гальченко В.Ф. //М: Микробиология. - 2002. - 71(4). - с. 500-508.

8. Воробьева Л.И. Промышленная микробиология /Воробьева Л.И. // Учеб. пособие — М.: Изд-во МГУ, 1989. —294 с.

9. Горбунова В.Н. Медицинская генетика /Горбунова В.Н.// СПб.: СПб ГПМУ, 2005. -357.

10. Горлов И.Ф., Шалимова O.A. Особенности формирования и регулирования современного мясного рынка // Вестник Орловского ГАУ. -2008. - Т. 11. - № 2. - С. 32-35.

11. Даниленко В.Н. Перспективы создания на пространстве СНГ конкурентоспособного производства субстанций антибиотиков/ Перспективы и проблемы развития биотехнологии в рамках единого экономического пространства стран Содружества: Материалы Междунар. науч.- практ. Конференции (25-28 мая 2005 г., Минск-Нарочь). - Минск: РИВШ. - 2005. -С. 57-58.

12. Жиганова Л.П. Использование антибиотиков в сельскохозяйственном производстве США и стран Европейского Сообщества.

13. Звенигородский В.И., Владимирова Е.С., Жданов В.Г., Тяглов Б.В. Штамм Streptomyces virginiae - продуцент антибиотика вирджиниамицина // Патент RU2007458. - 1994.

14. Обзор импорта противобактериальных препаратов для животных в I полугодии 2013 г. и I полугодии 2014 г. / Ежегодный сборник «БИЗНЕС ПАРТНЕР. Сельское хозяйство России». - М., Изд-во «Сельскохозяйственные Технологии», 2014. -С. 34-36.

15. Черенков А.Д., Ляшенко Г.А., Курченко А.Г., Черепнев И.А. Основные факторы экологического давления на составляющие агропромышленного комплекса // Системы обработки информации. - 2011. -Вып. 8. - С. 290-302.

16. Arshad M., Asghar M., Bhatti H., Anjum Z.M. Improving bio-ethanol yield: using virginiamycin and sodium flouride at a Pakistani distillery // African J. Biotechnol. - 2011. - Vol. 10(53). - P. 11071-11074.

17. Barrere G., Lacroix P., Sabatier A., Jumel C., Lehmann C. Streptomyces strains and process to produce single streptogramin component // Patent US6180392. -2001.

18. Bayrock D.P. Method of reducing the growth of lactobacilli in a process of ethanol production by yeast fermentation comprising adding a prystinamycin-type antimicrobial agent and/or a polyether ionophore antimicrobial agent dissolved in an organic solvent // Patent CA2655301. - 2006.

19. Biot A.M. Biotechnology of Industrial Antibiotics /VandammeE.J. (ed.). New York-Basel: Dekker. - 1984. - P. 695-720.

20. Carson D.W., Fahrenholz C.H., Chapin F.W. Virginiamycin mixture // PCT Application W09800136. - 1998.

21. Cervantes, H., Ewing P., Bakalli R., Bafundo K., Pesti G. Dietary supplementation with virginiamycin or phytase improves phosphorus utilization in broiler chicks // Poult. Sci. - 2002. - V. 81 (Suppl. 1). - P. 150.

22. Chapin F., Petka L., Wishousky T., Biot A., Towner D., Wang R., Villani A., Menon G. Purified. Cvirginiamycin // J. Liquid Chromatogr. - 1988. -V.11. - No. 11. - P. 2367-2373.

23. Cocito, C., VoormaH.O., Bosch L. Interference of virginiamycin M with the initiation and the elongation of peptide chains in cell-free systems. // Biochem. Biophis. Acta. - 1974. - V. 340. - P. 285-298.

24. Cocito C. Antibiotics of the Virginiiamycin family, inhibitors which contain synergistic components // Microbiol. Rev. - 1979. - V. 43. - № 2. - P. 145-198.

25. De Somer P., Van DijckP. A preliminary report on antibiotic number 899, astreptogramin-like substance. // Antibiotics & Chemotherapy. - 1955. -V. 5. - P. 632.

26. De Somer P., van Dijck P., Vanderhaeghe H., van de Voorde H. Antibiotic factor S and compositions containing same // Patent US3325359. -1967.

27. Demain A.L. Biotechnology of industrial antibiotics. New York-Basel: Dekker. - 1984. - P. 33-47

28. Di Giambattista M., Cocito C., Chinali G. The molecular basis of the inhibitory activities of type A and type B synergimycins and related antibiotics on ribosomes // J. Antimicrob. Chemother. - 1989. - V. 24. - P. 485-507.

29. Feighner, S.D., Dashkevicz M.P. Subtherapeutic levels of antibiotics in poultry feeds and their effects on weight gain, feed efficiency, and bacterial cholytaurine hydrolase activity // Appl. Environ. Microbiol. - 1987. - V. 53, P. 331-336.

30. Fowlie D.A., Bayrock D.P., Mattsfield W. Use of pre-dissolved prystinamycin-type and polyether ionophore type antimicrobial agents in the production of ethanol // Patent CA2801358. - 2010.

31. Freidinger R.M., Bock M.G., Lam Y.-K.T., Chang R.S., Hensens O.D., Schwartz C.D., Zink D.L. Fermentation analogs of virginiamycin M1 to treat panic and anxiety disorders // Patent US5189050. - 1993.

32. Garcia-Ochoa F., Gomez E. (2009) Bioreactor scale-up and oxygen transfer rate in microbial processes: an overview. Biotechnol. Adv. 27:153-176.

33. Godfrey S.I., Boyce M.D., Rowe J.B., Speijers E.J., Thorniley G.R. Virginiamycin to protect sheep fed wheat, barley or oats from grain poisoning under simulated drought feeding conditions // Austr. J. Agr. Res. - 1995. - V. 46(2). - P. 393-401.

34. Gossele F., Marneffe T., Biot A., Blain P. High-performance liquid chromatographic determination of virginiamycin in Stafac, premixes and animal feeds // Analyst. - 1991. - V. 116. - P. 1373-1380.

35. Guo J., Zhang F., Li H., Cao W. Virginiamycin microemulsion and preparation method thereof // Patent CN104208656. - 2014.

36. Han F., Huang L., Zou J., Li G., Deng J. Method for biosynthesizing virginiamycin by streptomycete // Patent CN102943102. - 2013.

37. Hedde R.D., Quach R.H.N. Prevention and treatment of liver abscesses in animals //Patent EP0356192. - 1988.

38. Hofacre C.L., Brown J., George B., Froyman R., Goodwin M.A. Use

of Aviguard, virginiamycin, or bacitracin MD against Clostridium perfringens-

94

associated necrotizing enteritis // J. Appl. Poultry Res. - 1998. - V. 7. - P. 412418.

39. HoyzmanA., StaroselskyA., AshbashU., Тарасова К.С., Елисова Т.В. Влияние препарата Stafac®110 на продуктивность цыплят-бройлеров в промышленных условиях России // Птицеводство. - 2011. - № 7. - С. 30-32.

40. HoyzmanA. Использование Стафака (Вирджиниамицита) для борьбы со стрессом птиц, обусловленным их скученностью и высокой температурой окружающей среды. // БИО. -2010. - № 10. - C. 8-11.

41. Hynes S.H., Ingledew W.M., Kjarsgaard D.M., Thomas K.C. Use of virginiamycin to control the growth of lactic acid bacteria during alcohol fermentation // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. - 1997. - V. 18. - P. 284-291.

42. Ives, S.E., Bindel D.J., Nagaraia T.G., Titgemeyer E.C., del Barrio A., and Hollis L.C. Effect of virginiamycin and monensin plus tylosin on ruminal protein metabolism in steers fed corn-based finishing diets with or without wet corn gluten feed // J. Anim. Sci. - 2002.-V. 80. - P. 3005-3015.

43. Kieke A.L., Jawahir S.L., Borchardt M.A., Vandermause M.F., Kieke B.A., Belongia E.A., Spencer S.K., Smith K.E. Use of streptogramin growth promoters in poultry and isolation of streptogramin-resistant Enterococcus faecium from humans // J. Infect. Dis. - 2006. - V. 194. - P. 1200-1208.

44. Kawachi R., Wangchaisoonthorn U., Akashi T., Sy A., Kamitani Y., Nihira T., Yamada Y. Identification of an AfsA homologue(BarX) from Streptomyces virginiae as a pleiotropic regulator controlling autoregulator biosynthesis, virginiamycin biosynthesis and virginiamycin M1 resistance // Mol.Microbiol. - 2000а. - V. 36. - P. 302-313.

45. Kawachi R., Yamada Y., Nihira T., Wangchaisoonthorn U. Identification by gene deletion analysis of a regulator, VmsR, that controls virginiamycin biosynthesis in Streptomyces virginiae// J.Bacteriol. - 2000b. - V. 182. - P. 6259-6263.

46. Kondo K., Higuchi Y., Sakuda S., Nihira T., YamadaY. New virginiaebutanolide from Streptomyces virginiae // J.Antibiot. - 1989. - V. 42. - P. 1873-1876.

47. Lam K.S., Forenza S., Lowe S.E., Veitch J.A. 1995. Effect of neutral resins on the production of dynemicins by Micromonospora chersina. J Ind Microbiol 15:453-456.

48. Lane D.J. 16S/23S sequencing / Lane D.J., Stackebrandt E. a. Goodfellow M. // Nucleic acid techniques in bacterial systematics, 1991. - P. 115175.

49. Lanoot B., Swings J.,Vancanneyt M., Cnockaert M.C., Hoste B., Gossele F., Piecq M. Phenotypic and genotypic characterization of mutants of the virginiamycin producing strain 899 and its relatedness to the type strain of Streptomyces virginiae // System. Appl.Microbiol. - 2005. - V. 28. - P.77-84.

50. Li H., Zhang F., Cao W., Guo J. Virginiamycin soluble powder and preparation method thereof // Patent CN104208657. - 2014.

51. Mast Y., Wohlleben W. Streptogramins - two are better than one! // Int. J. Med. Microbiol. - 2014. - V. 304. - No. 1. - P. 44-50.

52. Mattanovich D., Gasser B., Hohenblum H., Sauer M. (2004) Stress in recombinant protein producing yeasts. J Biotechnol 113:121-135.

53. Namwat W., Nihira T., Lee C.K., Yamada Y., Kinoshita H. (2001)Identification of the varR gene as a transcriptional regulator of virginiamycin S resistance in Streptomyces virginiae// J.Bacteriol. - 2001. - V. 183. - P. 2025-2031.

54. NingsihF., Kitani S., Fukushima E., Nihira T. VisG is essential for biosynthesis of virginiamycin S,a streptogramin type B antibiotic, as a provider ofthe nonproteinogenic amino acid phenylglycine // Microbiology. - 2011. - V. 157. - P. 3213-3220.

55. Nomura H., Kimura K., Sasao K., Okabe M., A method for enhancing the yield of depsipeptide antibiotics by fermentation // Patent EP0247587. - 1990.

56. Nott K., Ishikura T., Paquot M., Gossel F., Heilporn S., Giard J.,Gerbaux P., Wathelet B., Lognay G. A fast and reliable chromatographic procedure for the purification of virginiamycin M1factor // Chromatographia. -2002. - V. 56. - P. 331-335.

57. Parks, C.W., Fairchild A.S., Ferket P.R., Grimes P.R. The effect of mannanoligosaccharides, bambermycins, and virginiamycin on performance of large white male market turkeys // Poult. Sci. - 2001. - V. 80. - P. 718-723.

58. Phillips T., Michels P., Chase M., Powell M., Wagner S., Renzi C., DeAngelo J. 2013. Use of in situ solid-phase adsorption in microbial natural product fermentation development. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 40: 411-425.

59. Prikrylova V., Samoukina G.V., Kandybin N.V., Ujhelyova L., Varkonda S. Pesticidal activity of Virginiamycins S1 and M1 // Folia Microbiol. -1992. - Vol. 37(5). - P. 386-388.

60. Prikrylova V., Kristan V., Blumauerova M., Vanek Z., Sedmera P., Marsalek J. Strain development in Streptomyces virginiae, a producer of virginiamycyn //Biotechnol.Bioind. - 1987. - V. 2. - No. 2. - P. 20-22.

61. Pulsawat N., Nihira T., Fukushima E., Kitani S. Hierarchical control of virginiamycin production in Streptomyces virginiae by three pathway-specific regulators: VmsS, VmsT and VmsR // Microbiology. - 2009. - V. 155. - P. 12501259.

62. Pulsawat N., Nihira T., Kitani S. Characterization of biosynthetic gene cluster for the production of virginiamycin M, a streptogramin type A antibiotic, in Streptomyces virginiae // Gene. - 2007. - V. 393. - P. 31-42.

63. Rowe J.B. Method for treating laminitis in equine livestock //Patent US5204361. - 1988.

64. Sanger F. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors / Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R., // Proc. Natl. Acad. Sci., 1977. - Vol. 84. - P. 54635467.

65. Schmidt F. R. Optimization and scale up of industrial fermentation

processes / Applied Microbiology and Biotechnology, 2005. - 68(4). - P. 425-435

97

66. Sharma N.K., Anteunis M.J.O., Hosten N. Isolation of factor A (virginiamycin M1) and factor B (mixture of VS1 and VS4) from a commercial feed additive formulation// Bull. Soc. Chim. Belg. - 1988. - V. 97. - No. 3. - P. 185-192.

67. Shioya S., Shimizu Y., Kajihara Y., Morikawa M. Optimization of agitation and aeration conditions for maximum virginiamycin production // Appl. Microbiol. Biotechnol. - 1999. - V. 51. - P. 164-169.

68. Shojadoost B., Nikpiran H., Peighambari S.M. Effects of virginiamycin against experimentally induced necrotic enteritis in broiler chickens vaccinated or not with an attenuated coccidial vaccine // J. Appl. Poult. Res. -2013. - V. 22. - P. 160-167.

69. Singh M., Kumar P., Chauhan S.S. Effect of supplementation on diets with BMD and virginiamycin on the growth performance, carcass characteristics and bacterial population in broiler chickens // Vet World. - 2008. - V. 1(5). - P. 141-143.

70. Singh M.P., McDonald L.A., Leighton M.M., Urbance S.E., Barbieri L.R., Hoshan L., Roll D.M. 2010. Fermentative production of self-toxic fungal secondary metabolites. J Ind Microbiol Biotechnol 37:335-340.

71. Takuya N., Shigeru K. Gene for biosynthesis of Virginiamycin M, their gene cluster and use thereof // Patent JP2007061045. - 2007.

72. Tyaglov B.V., Zvenigorodskii V.I., Sizova I.A., Zdanov V.G. Quantitative determination of virginiamycin antibiotics in cultural broths // J. Planar Chromatogr. - 1995. - V. 8. - P. 374-378.

73. Warr G.A., Lam K.S., Veitch J.A., Medina I.A., Walsh A.W., Leet J.E., Hesler G.A., McBrien K.D., Pirnik D.M., Lin P.F.MForenza A., Clark J.M.1996. BMS-182123, a fungal metabolite that inhibits the production of TNF-a by macrophages and monocytes. J. Antibiot. 49(3):234-240.

74. Yamada Y., Okada H., Kondo K., Sugamura K., Yanagimoto M. The structure of inducing factors for virginiamycin production in Streptomyces

virginiae // J. Antibiot. - 1987. - V. 40. - P. 496-504.

98

75. Yang Y.K., Yamada Y.,Shimizu H., Suga K., Shioya S., Nihira T. Optimum autoregulator addition strategy for maximum virginiamycin production in batch culture of Streptomyces virginiae // Biotechnol.Bioeng. - 1995. - V. 46. -P. 437-442.

76. Yang Y.K., Yamada Y., Morikawa M., Suga K., Shimizu H., Shioya S., Nihira T. Maximum virginiamycin production by optimization of cultivation conditions in batch culture with autoregulator addition // Biotechnol. Bioeng. -1996. - V. 49. - P. 437-444.

77. Yong R. Culture medium for producing virginiamycin through Streptomyces virginiae fermentation and feeding method of culture medium // Patent CN104480174. - 2015.

78. Zhao W., Cheng Q., Zhang Z. Culture medium for biosynthesis of vigriniamycin M // Patent CN101538539. - 2011.

79. Zvenigorodskii V.I., Voeikova T.A., Tyaglov B.V. Isolation of components of the peptide antibiotic virginiamycin and breeding of their producer, Streptomyces virginiae // Appl.Biochem.Microbiol. - 2001. - V. 37. - No. 3. - P. 260-266.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Приложение 1

Таблица 7

Количество (в .«*) глюкозы и мальтозы, соответствующее количеству меди (по Бертрану)

Медь Медь Медь

Сахар для ал« Са кар Д.1Я для Сахар для для

глюкозы мальтозы глюкозы мальтозы глюкозы мальтозы

10 20,4 11.2 40 77,5 44,1 70 129,8 76,5

11 22,4 12.3 41 79,3 45,2 71 131,4 77,6

12 24,3 13,4 42 81.1 46,3 72 133,1 78,6

13 26,3 14,5 43 82,9 47.4 73 134,7 79,7

14 28,3 15,6 44 84,7 48,5 74 136.3 80.8

15 30.2 16,7 45 86,4 49.5 75 137,9 81,8

16 32.2 17,8 46 88,2 50,6 76 139,6 82,9

17 34,2 18,9 47 90,0 51.7 77 141,2 84,0

18 36.2 20,0 48 91.8 52,8 78 142,8 85,1

19 38.1 21.1 49 93,6 53.9 79 144,5 86.1

20 40.1 22,2 50 95,4 55.0 80 146,1 87,2

21 42,0 23,3 51 97,1 56,1 81 147.7 88.3

22 43,9 24.4 52 98,9 57,1 82 149.3 89.4

23 45,8 25.5 &3 100,6 58,2 83 150,9 90,4

24 47,7 26,6 54 102.3 59,3 84 152,5 91.5

25 49.6 27,7 55 104,1 60,3 85 154,0 92,6

26 51.5 28.9 56 105.8 61.4 86 155,5 93,7

27 53.4 30,0 57 107,6 62,5 87 157.2 94.8

28 55,3 31.1 58 109,3 63,5 88 158,8 95,8

29 57,2 32,2 59 111,1 64,6 89 160,4 96,9

30 59,1 33.3 60 112,8 65.7 90 168,0 98.0

31 60.9 34.4 61 114,5 66.8 91 163,6 99,0

32 62,8 35.5 62 116,2 67,9 92 165,2 100.1

33 64,6 36,5 63 117.9 68,9 93 166,7 101,1

34 66,5 37,7 64 119,6 70,0 94 168,3 102,2

35 68,3 38.7 65 121,3 71,1 95 169,9 103.2

36 70.1 39,8 66 123,0 72,2 96 171,5 104.2

37 72,0 40,9 67 124.7 73,3 97 173,1 105,3

38 73.8 41.9 68 126.4 74,3 98 174,6 106,3

39 75,7 43,0 69 128,1 75,4 99 100 176,2 177,8 107,4 108,4