Изменение функциональных и структурных характеристик прокариотного сообщества почв под воздействием гербицида глифосата тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Железова Алена Дмитриевна

• Железова Алена Дмитриевна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Железова Алена Дмитриевна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Реакция микробного сообщества почвы на сельскохозяйственную деятельность человека

Глифосат - свойства и применение

Поведение глифосата в почве

Реакция микробного сообщества почвы на внесение глифосата

Микробное сообщество подзолистых почв

Ремедиация загрязненных гербицидами почв

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ

ОБЪЕКТЫ

Отбор образцов почвы

Дизайн экспериментов

МЕТОДЫ

Сукцессии в микрокосмах

Оценка эмиссии СО2 в лабораторных условиях

Измерение численности и биомассы почвенного микробного сообщества методом люминесцентной микроскопии

Оценка количества метаболически активных представителей разных филогенетических групп микроорганизмов методом FISH

Мультисубстратное тестирование почвенного микробного сообщества

Количественная оценка содержания бактерий и архей в почве методом ПЦР в реальном времени

Измерение динамики деградации глифосата в почве

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

РЕЗУЛЬТАТЫ

Эксперимент 1 - изменения в структуре и функциях прокариотного сообщества почвы при длительном воздействии глифосата

Эксперимент 2 - краткосрочный эффект внесения глифосата на прокариотное сообщество почв, находящихся под разными типами сельскохозяйственной обработки

Эксперимент 3 - исследование деградации глифосата в зависимости от сорбционных характеристик почв

Эксперимент 4 - изучение влияния внесения глифосата на прокариотное сообщество почв разного генезиса

ОБСУЖДЕНИЕ

Изменения дыхательной активности почвы

Функциональные характеристики прокариотного сообщества почвы под воздействием глифосата

Деградация глифосата

Изменения в структуре прокариотного сообщества почв и в его метаболически активной части

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выводы

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

В настоящее время наблюдается возрастающее антропогенное воздействие на почву и сопредельные среды, обусловленное интенсификацией сельского хозяйства. Для увеличения продуктивности угодий и экономической выгоды при производстве сельскохозяйственных культур используются органические и минеральные удобрения, химические средства защиты растений и изменение технологии обработки почвы. Сельскохозяйственная деятельность в целом оказывает влияние на физические и химические свойства почвы, что ведет к комплексному воздействию на почвенное микробное сообщество. Экологические функции микробного сообщества почвы имеют большое значение для производства сельскохозяйственных культур, устойчивости почвы, её плодородия и здоровья. Будучи относительно динамичным компонентом экосистемы, почвенные микроорганизмы участвуют в биогеохимических циклах макро- и микроэлементов, обеспечивают растения факторами роста и защитой от патогенов, осуществляют деградацию ксенобиотиков. Ввиду комплексности почвенной среды, включающей в себя микрозоны с контрастно различающимися условиями, микробное сообщество почвы обладает большим разнообразием и функциональным потенциалом (Звягинцев и др., 2005).

Рост числа пестицидов (препаратов и действующих веществ) является одним из последствий интенсификации сельского хозяйства. В настоящее время количество применяемых препаратов составляет более 100 тыс. наименований, основанных на нескольких сотнях действующих веществ. По данным FAO, около 50 % от применяемых пестицидов составляют гербициды - вещества, предназначенные для контроля сорной растительности. По многим из них нет данных об изменениях в результате биотрансформации в почве и дальнейших процессов, происходящих с метаболитами, равно как и об их влиянии на почвенные микроорганизмы. В связи с внедрением генно-модифицированных культур и со снижением эффективности действия препаратов происходит увеличение доз применения гербицидов (Beckie and Hall, 2014). Несмотря на то,

что большинство гербицидов не вносят непосредственно в почву, они могут проникать в почвенную среду при применении в начале сезона или после сбора урожая, путем стока гербицида с поверхности листьев и выщелачивания из растительных остатков (Zabaloy et al., 2011). Становится актуальной проблема загрязнения гербицидами почв и сопредельных сред (Villeneuve et al., 2008). В связи с этим проводится поиск способов уменьшения негативных последствий применения гербицидов и ремедиации загрязненных территорий биологическими, физическими и физико-химическими методами (Morillo and Villaverde, 2017).

Одним из наиболее распространенных гербицидов в мире является глифосат. Этот гербицид был разработан компанией Monsanto и широко применялся в течение более чем сорока лет. Глифосат - (^(фосфонометил)-глицин) - это высокоэффективный малотоксичный системный гербицид, широко использующийся для контроля сорной растительности и в качестве дефолианта. Механизм гербицидного действия глифосата заключается в ингибировании фермента шикиматного пути биосинтеза бензоидных ароматических соединений в растениях (Duke and Powles, 2008). Период полуразложения глифосата в почве варьирует в зависимости от климатических условий и почвенных характеристик. Кроме того, глифосат хорошо адсорбируется в почве, что препятствует его выносу за пределы почвенного профиля. Распространенность глифосата обусловлена его эффективностью и малой токсичностью по отношению к нецелевым организмам. С 1996 года растёт количество генно-модифицированных глифосат-устойчивых культур. В настоящий момент 90 % всех генно-модифицированных культур обладают таким свойством (Duke and Powles, 2008). В соответствии с Государственным каталогом пестицидов и агрохимикатов (2017), на территории Российской Федерации зарегистрировано 106 гербицидных препаратов с глифосатом или его солями в качестве действующего вещества.

Применение гербицидов может приводить к изменению состояния микробного сообщества почвы, и, следовательно, вызывать нарушения его нормального функционирования. Однако действующая система проверки

пестицидов и агрохимикатов включает ограниченное количество тестов, касающихся воздействия на микробиоту почв. В этих тестах обычно оцениваются лишь общие показатели биологической активности почв: утилизация углеродных субстратов и нитрификация (Jacobsen and Hjelms0, 2014). Результаты этих тестов не могут в полной мере охарактеризовать воздействие препаратов на минорные компоненты микробного сообщества. Традиционный подход «доза - эффект», используемый в экотоксикологии для изучения эффекта токсикантов на растения и животных, не вполне подходит для характеристики влияния на микробные сообщества почв ввиду комплексности и избыточности пула почвенных микроорганизмов. С одной стороны, даже при значительных структурных изменениях в микробном сообществе будет проявляться его функциональная избыточность, т.е. потери функции не произойдет ввиду высоких темпов физиологической и эволюционной адаптации микроорганизмов к нарушениям. С другой стороны, существует вероятность того, что незначительные изменения в структуре или функционировании сообщества могут все же уменьшить способность к дальнейшей адаптации или устойчивости к другим стрессовым воздействиям (Rose et al., 2016).

Таким образом, микробное сообщество почвы может являться как биоиндикатором негативного воздействия токсикантов, так и активным агентом ремедиации почвы. В связи с этим возникает необходимость в подробном изучении изменений свойств микробных сообществ почв в результате применения гербицидов и других сельскохозяйственных воздействий, а также поиск способов восстановления исходных характеристик почвы.

Цели и задачи

Целью данной работы являлась характеристика изменений в структуре и функционировании прокариотного сообщества дерново-подзолистой почвы при краткосрочном и длительном воздействии гербицида глифосата.

Были поставлены следующие задачи:

- Оценка структурных и функциональных изменений прокариотного сообщества почвы и его метаболически активной части, происходящих при внесении глифосата в почву в эксперименте с микрокосмами

- Сравнение структуры и активности прокариотных сообществ почв, подвергшихся длительному воздействию глифосата, и ненарушенных прокариотных сообществ

- Оценка деградации глифосата в почве Научная новизна

В настоящей работе впервые было проведено исследование влияния глифосата на метаболически активную часть прокариотного сообщества агротрансформированных дерново-подзолистых почв. Сделан сравнительный анализ структуры и функционирования прокариотного сообщества в условиях микрокосма, в сукцессии, инициированной глифосатом. Проведено биологическое тестирование прокариотного сообщества почв методами люминесцентной микроскопии, FISH и мультисубстратного тестирования, что позволило выявить чувствительные и устойчивые к воздействию глифосата филогенетические и функциональные группы прокариот. Был проведен поиск факторов, влияющих на деградацию глифосата, и изучен способ восстановления исходных микробиологических параметров почвы с помощью внесения биочара.

Практическая значимость

Полученные результаты характеризуют состояние как ненарушенного, так и измененного вследствие применения глифосата микробного сообщества почвы, углубляют представления о воздействии ксенобиотиков на метаболически активную часть прокариотного сообщества дерново-подзолистой почвы, свидетельствуют об изменении его функциональных характеристик.

Изучение реакции микробного сообщества на применение гербицида способствует выявлению диагностических признаков, характеризующих устойчивость и чувствительность прокариотного сообщества к антропогенным воздействиям, и является значимым вкладом в оценку экологических последствий применения глифосата. Материалы исследования могут быть использованы для разработки новых методов почвенно-микробиологического мониторинга для оценки применения гербицидов.

Обоснованность и достоверность результатов

Результаты работы и выводы получены с применением современных методик и оборудования, их достоверность подтверждена статистическими методами обработки данных.

Личный вклад автора

Работа является результатом оригинальных исследований. Автором была выбрана тема исследования, на разных этапах работа проведена автором самостоятельно: выбор пробных площадей, отбор проб, проведение анализов в лабораторных условиях, математическая обработка и интерпретация результатов. Доля личного участия в совместных публикациях пропорциональна числу соавторов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изменение функциональных и структурных характеристик прокариотного сообщества почв под воздействием гербицида глифосата»

Апробация работы

1. 2014 г. XXI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Устный доклад.

2. 2014 г. 18ая Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века». Устный доклад.

3. 2014 г. Международная научная конференция XVII Докучаевские молодежные чтения. Устный доклад.

4. 2015 г. XXII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов». Устный доклад.

5. 2016 г. Workshop on pesticide fate in soil and water in the northern zone. Устный доклад

Публикации

1. Чернов Т. И., Железова А. Д., Манучарова Н. А., Звягинцев Д. Г. Мониторинг хитинолитического микробного комплекса филлопланы // Известия РАН. Серия биологическая, 2013, № 6, с. 682-688.

2. Железова А. Д. Оценка влияния гербицида глифосата на микробный комплекс дерново-подзолистой почвы // в сборнике «Ломоносов-2014: XXI Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых: Секция «Почвоведение», подсекция «Биология почв» - М.: МАКС Пресс, 2014. - 23 с.

3. Железова А. Д. Влияние гербицида глифосата на гидролитический микробный комплекс дерново-подзолистой почвы // Материалы Международной научной конференции XVII Докучаевские молодежные чтения «Новые вехи в развитии почвоведения: современные технологии как средства познания» под ред. Б.Ф. Апарина. - СПб.: Издательский дом С.-Петербургского государственного университета, 2014. - 391 с.

4. Железова А. Д. Изменение структурно-функциональных характеристик микробного комплекса дерново-подзолистой почвы под влиянием гербицида глифосата // Биология - наука XXI века: 18-я Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых. Сборник тезисов. -Пущино: 504 с.

5. Железова А. Д. Микробный комплекс дерново-подзолистой почвы под воздействием гербицида глифосата // в сборнике «Ломоносов-2015: XXII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых: Секция «Почвоведение», подсекция «Биология почв» Тезисы докладов» -М.: МАКС Пресс, 2015.

6. Железова А. Д., Кутовая О. В., Дмитренко В. Н. и др. Оценка количества ДНК разных групп микроорганизмов в генетических горизонтах темно-серой почвы // Бюллетень Почвенного института имени В.В.Докучаева, 2015, № 78, с. 87-98.

7. Чернов Т. И., Тхакахова А. К., Железова А. Д., Кутовая О. В. Метагеном генетических горизонтов почвенного профиля // Основные достижения и перспективы почвенной метагеномики. Монография, под ред. Е.В. Першиной, О.В. Кутовой, Б.М. Когута, Е.Е. Андронова - Информ-Навигатор СПб, 2017, с. 68-87.

8. Железова А. Д., Тхакахова А. К., Ярославцева Н. В. и др. Микробиологические показатели агрегатов типичных черноземов в многолетних полевых опытах // Почвоведение, 2017, № 6, с. 711-717.

9. A. Zhelezova, H. Cederlund, J. Stenstrom «Effect of biochar amendment and ageing on adsorption and degradation of two herbicides» Water, Air, & Soil Pollution, 2017, №6, т.228

10.Железова А. Д., Манучарова Н. А., Горленко М. В. «Структурные и функциональные характеристики прокариотного комплекса дерново-подзолистой почвы под воздействием гербицида глифосата» Вестник МГУ, серия Почвоведение, в печати

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Реакция микробного сообщества почвы на сельскохозяйственную деятельность человека

Влияние применения минеральных и органических удобрений на почвенную микробиоту довольно хорошо изучено как для коротких (менее 1го сезона), так и для длительных временных промежутков. Внесение удобрений приводит к изменениям активности и численности микробного сообщества почв. Наиболее заметные изменения состояния микробиоты происходят в результате применения органических удобрений вследствие увеличения количества доступного органического вещества, что ведет к возрастанию биологической активности (Bunemann et al., 2006; Treonis et al., 2010). Выявлено, что соотношение численности бактерий основных филумов и архей изменяется в зависимости от системы удобрений (Wessén et al., 2010).

Тип землепользования и характер сельскохозяйственных обработок почвы являются ещё одним фактором, изменяющим экологические характеристики почвы как среды обитания микроорганизмов. Традиционная обработка почвы, включающая в себя вспашку с оборотом пласта, приводит к повышению аэрации верхнего горизонта почв, к снижению засоренности посевов сорной растительностью, и в то же время к усилению ветровой и дождевой эрозии, появлению плужной подошвы и обеднению верхнего слоя органическим веществом. Вследствие этого микробное сообщество вспахиваемой почвы отличается по структуре и функционированию от сообществ почв естественных биоценозов (Bissett et al., 2011; Roger-Estrade et al., 2010; Upchurch et al., 2008; Wang et al., 2012). Сейчас существует тренд смены типа обработки почв с традиционной на минимальную или же нулевую, которые считаются более безопасными ресурсосберегающими технологиями. Снижение количества вспашки и других воздействий при переходе от традиционной к минимальной и нулевой обработке приводит к сохранению естественной структуры почвы, к её обогащению органическим веществом и к восстановлению микробного

сообщества (Biederbeck et al., 1997; Simmons and Coleman, 2008; van Capelle et al., 2012). Изменяются микробная биомасса и функциональное разнообразие почвенной микробиоты (Lupwayi et al., 2012; Rahman et al., 2008), а также ее видовое разнообразие (Souza et al., 2013; Yin et al., 2010) и ферментативная активность (Nivelle et al., 2016). Однако негативным последствием такого перехода может быть увеличение количества сорной растительности и, как следствие, возрастание гербицидной нагрузки.

Пестициды, применяемые для защиты растений от фитопатогенов, вредных насекомых и сорной растительности, также могут воздействовать на микробное сообщество почв. Известно, что наиболее выраженным влиянием обладают фунгициды, ввиду действия как на фитопатогенные, так и на остальные почвенные грибы (Lo, 2010). Большинство гербицидов не вызывают настолько однозначно интерпретируемых эффектов на почвенную микробиоту; и, кроме того, при применении в рекомендованных дозах воздействие гербицидов на нецелевые организмы незначительно, а негативное влияние высоких доз является временным, и восстановление исходных свойств происходит в течение 1-2 месяцев (Rose et al., 2016). Однако ввиду разнообразия сопутствующих условий и методов оценки состояния микробного сообщества почв необходимы дальнейшие исследования гербицидного воздействия на нецелевые группы организмов.

Глифосат - свойства и применение

Глифосат был разработан в 1970 году компанией Monsanto, и в настоящий момент является наиболее используемым гербицидом в мире (Duke and Powles, 2008). Более того, прогнозируется увеличение потребления глифосата в связи с распространением устойчивых к нему генно-модифицированных культур (сои, рапса-канолы, кукурузы, хлопка, риса и сахарной свёклы) и возрастающей популярностью технологий нулевой и минимальной обработки почв (Duke, 2014).

Глифосат (^(фосфонометил) глицин, C3H8NO5P) является производным

фосфоновой кислоты. Молекулярная масса глифосата - 169,1 г/моль. Вещество

обладает высокой растворимостью в воде (10500 мг/л) (Lewis et al., 2016). Это

12

высокоэффективный системный малотоксичный гербицид, принцип действия которого основан на ингибировании синтеза аминокислот. При опрыскивании глифосат попадает во флоэму через листья и способен передвигаться по растению, попадая из наземной части в корни. Это гербицид сплошного действия. В препаратах для повышения растворимости глифосат выпускается в форме солей: этаноламинной, калиевой, аммонийной, диметиламинной или изопропиламинной (в основном) (Кузнецова, Чмиль, 2010).

он

Рисунок 1. Структурная формула глифосата

Препараты на основе глифосата применяются для контроля сорной растительности при производстве сельскохозяйственных культур по вегетирующим сорнякам в условиях защиты культуры и на полях, предназначенных под посев, в послеуборочный период. Также этот гербицид используется как дефолиант. Кроме того, глифосат рекомендован к применению в плодовых садах, на виноградниках, посадках цитрусовых, чайных плантациях, в посадках ели и кедра, на землях несельскохозяйственного пользования и в личных подсобных хозяйствах (Куликова, Лебедева, 2010).

Данный гербицид является малотоксичным для пчел, других полезных насекомых и для теплокровных (ЛД50 для крыс 4900 мг/кг, кроликов - 3800 мг/кг, мышей 2060 мг/кг). Препараты на основе глифосата относятся к 3 классу опасности для человека и 3 классу опасности для пчел (Министерство сельского хозяйства Российской Федерации, 2015). ПДК глифосата в почве составляет 0,5 мг/кг (Гигиенические нормативы ГН 1.2.2701 -10, 2010).

Сплошное действие глифосата обусловлено ингибированием синтеза ароматических аминокислот, а именно фермента 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат синтазы (EPSPS). Это фермент шикиматного пути, локализованного в

хлоропластах, принимающий участие в биосинтезе ароматических аминокислот: фенилаланина, тирозина, триптофана (Oliveira et я!., 2007).

Рисунок 2. Схема шикиматного пути биосинтеза ароматических соединений. Взято из (01^епа й а!., 2007)

Рисунок 3. Схема связывания реакционного центра 5-енолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазы (EPSPS) глифосатом (из Oliveira et al., 2007). Пунктирные линии обозначают водородные связи и ионные взаимодействия. Части белка промаркированы согласно номенклатуре Protein Data Bank, W1-4 - молекулы воды.

Фермент EPSPS кодируется геном aroA. В зависимости от устойчивости к ингибированию глифосатом и сходства в нуклеотидных последовательностях гена aroA ферменты EPSPS разных организмов подразделяют на два класса. I класс характеризуется чувствительностью к воздействию глифосата и обнаруживается у Escherichia coli, Aeromonas salmoncida, Petunia hybrida и Arabidopsis thaliana. Ферменты EPSPS II класса обладают менее чем 30% сходства с I классом и функционируют в условиях высоких концентраций глифосата; найдены у Agrobacterium tumefaciens CP4, Pseudomonas sp. strain PG2982, Bacillus subtilis, Ochrobactrum anthropi, Staphylococcus aureus и у некоторых других бактерий (Priestman et al., 2005; Sun et al., 2005; Yi et al., 2016). Ввиду больших различий в нуклеотидных последовательностях генов aroA, изучение данной ферментной системы проводили только для отдельных чистых культур бактерий и растений (Fei et al., 2013; Lv et al., 2016; Mohajeri et al., 2016).

В результате длительной истории применения глифосата появились сорные растения, устойчивые к гербициду. Существует несколько механизмов резистентности к глифосату, обнаруженных у сорных растений: сверхэкспрессия гена aroA, кодирующего фермент, и экспрессия устойчивой формы целевого фермента EPSPS (Wang et al., 2014). Эти же механизмы используются при разработке генно-модифицированных культурных растений, устойчивых к глифосату (Cerdeira and Duke, 2006). Детоксификация глифосата с помощью глициноксидаз - ещё один механизм, использующийся для производства генно-модифицированных культур, устойчивых к этому гербициду (Pollegioni et al., 2011).

Поведение глифосата в почве

При попадании в почву глифосат может потерять гербицидные свойства из-за адсорбции к минеральным или органическим соединениям. Глифосат наиболее сильно связывается с неорганической частью почвы: с глинистыми частицами, а также с оксидами алюминия и железа (A. L. Gimsing et al., 2004; Mamy and Barriuso, 2005; Pessagno et al., 2008; Vereecken, 2005; Yu and Zhou, 2005). Почвы с

тяжелым гранулометрическим составом наиболее сильно адсорбируют глифосат и препятствуют его выносу за пределы профиля (Bergström et al., 2011). Согласно нескольким исследованиям, адсорбция гербицида отрицательно коррелирует с pH почвы: повышение рН может увеличить отрицательный заряд как поверхности почвы, так и самого глифосата, что приводит к ослаблению адсорбции (Albers et al., 2009; Okada et al., 2016). Кроме того, глифосат существует в разных формах в зависимости от pH.

GH,+

рК,=0.В

GH3

рКг=2.23

gh;

рК3=5.48

gh2"

рК^Ю.14

G3"

Рисунок 4. Молекулярная структура глифосата в растворе в зависимости от pH. Взято из Albers et al., 2009

Несмотря на значимую роль минеральной части почвы, для адсорбции глифосата также важна и органическая часть. В результате исследования сорбции глифосата на семи очищенных фракциях почвенного гумуса было выявлено значимое влияние ароматической составляющей гумуса, предположительно фенольных групп. Органическая часть почвы более значима для сорбции глифосата в песчаных почвах по сравнению с глинистыми. Однако десорбция глифосата с гумуса происходит быстрее, чем с аморфных оксидов железа и алюминия (Albers et al., 2009). Сохранение пожнивных остатков на поле также ведет к уменьшению мобильности глифосата и к увеличению его периода полуразложения (Cassigneul et al., 2016).

Согласно многочисленным исследованиям, процесс деградации глифосата в почве может быть описан двухфазной моделью кинетики первого порядка (Doublet et al., 2009; Gimsing et al., 2004; Landry et al., 2005; Stenrod et al., 2006).

Наиболее активное разложение гербицида наблюдается в течение 2-3х недель после внесения в почву, далее происходит замедление процесса. Период полуразложения глифосата в почве сильно варьирует (от 1 до 174 дней) и зависит от гранулометрического и минерального состава почвы, её биологической активности, а также от температуры и влажности (Bergstrom et al., 2011; Tejada, 2009). Выявлено увеличение периода полуразложения глифосата в холодных и сухих условиях в суглинистой почве (Bento et al., 2016). Значительные вариации периода полуразложения могут наблюдаться даже в условиях одной площадки, как было показано для легкосуглинистых почв (Stenrod et al., 2006). Кроме того, глифосат, связанный в растительных остатках, минерализуется медленнее, чем глифосат, непосредственно попавший в почву; разница в периоде полуразложения может составлять несколько месяцев (Mamy et al., 2016).

Микробное сообщество почвы играет важную роль в разложении глифосата; основной путь деградации этого гербицида в почве - биологический. Биомасса и активность почвенного микробного сообщества являются ключевыми факторами, влияющими на разложение глифосата (Stenrod et al., 2006). Глифосат может быть использован микроорганизмами в качестве питательного субстрата (Panettieri et al., 2013) и как источник фосфора в условиях недостатка других источников данного элемента питания (Hove-Jensen et al., 2014). Деградация гербицида почвенным микробным сообществом в основном осуществляется путем ко-метаболизма и зависит от активности многих микроорганизмов (Wardle and Parkinson, 1990). Однако существуют и отдельные виды, способные к разрушению глифосата, такие как бактерии Azospirillum sp (Travaglia et al., 2015) и Pseudomonas sp; в исследовании датских ученых была выявлена корреляция их численности, определяемой методом посева, со скоростью деградации глифосата для шести почв с различными свойствами (Gimsing et al., 2004).

Существует два основных пути биологической деградации глифосата у бактерий и у некоторых растений: с разрывом связи C - N и образованием аминометилфосфоновой кислоты (АМФК), или с разрывом связи C - P с

образованием метилглицин - саркозина (Dick and Quinn, 1995). Грибы также способны к деградации глифосата (Krzysko-Lupicka and Sudol, 2008), однако их пути разложения гербицида изучены недостаточно.

Метаболический путь деградации глифосата с образованием АМФК (аминометилфосфоновая кислота) более распространен среди бактерий. Его способны осуществлять бактерии, выделенные как из загрязненных глифосатом сред, так и из прежде необрабатываемых гербицидом местообитаний. Разрушение C - N связи происходит с помощью фермента глифосат-оксидоредуктазы (ГОР). Этот метаболический путь был обнаружен у Flavobacterium sp. и Arobacterium radiobacter, Arthrobacter atrocyaneus, Geobacillus caldoxylosilyticus и др. (Fan et al., 2012; Zabaloy et al., 2011). Большинство глифосатразрушающих бактерий экстрагируют АМФК во внешнюю среду (Sviridov et al., 2015).

АМФК, как и глифосат, хорошо сорбируется почвой, вследствие чего дальнейшая деградация этого метаболита может быть затруднена. Согласно многим исследованиям, АМФК накапливается в почве в детектируемых количествах через 30-90 дней после внесения глифосата (Gimsing et al., 2004). АМФК также подвергается дальнейшему разрушению, в том числе и с удалением фосфатной группы, но деградация этого метаболита существенно медленнее деградации глифосата (Bento et al., 2016). Есть сведения о фитотоксичных свойствах АМФК, однако механизм действия отличен от глифосатного. При наличии высоких (1 кг/га) концентраций АМФК в почве наблюдалось снижение фотосинтетической активности, количества хлорофилла и интенсивности корневого дыхания у глифосат-чувствительной и глифосат-устойчивой сои (Ding et al., 2011).

Разложение глифосата с помощью разрыва C-P связи и образованием саркозина осуществляется с помощью C-P-лиаз. Эти ферменты были найдены у некоторых представителей родов Pseudomonas, Arthrobacter и Streptomycetes, у Rhizobium meliloti, у Enterobacter cloacae, а также у некоторых представителей

домена Archaea (Fan et al., 2012; Hove-Jensen et al., 2014; Kryuchkova et al., 2014;

18

Pipke and Amrhein, 1988). C-P-лиазы участвуют в катаболизме фосфонатов; обычно в геноме бактерий присутствует один оперон (phn), кодирующий данный метаболический путь. В случае наличия данной ферментной системы, глифосат служит источником фосфора для бактерий при его дефиците, что редко встречается в естественных местообитаниях (Sviridov et al., 2015). Некоторые бактерии не способны использовать глифосат как единственный источник фосфора, однако в условиях низкой концентрации доступных фосфатов они осуществляют разрушение C - P связи глифосата (Dick and Quinn, 1995).

Также существуют бактерии, метаболизирующие глифосат обоими способами, например, Bacillus cereus, Pseudomonas spp, Ochrobactrum anthropi GPK (Fan et al., 2012; Sviridov et al., 2011).

Рисунок 5А. Метаболические пути разложения глифосата с образованием АМФК. Из Sviridov et al., 2015.

Рисунок 5Б. Метаболический путь разложения глифосата с образованием саркозина. Из Sviridov et al., 2015.

Реакция микробного сообщества почвы на внесение глифосата

Известно, что воздействие пестицидов на микробный комплекс почв может быть как стимулирующим, так и подавляющим. Для характеристики изменений, происходящих под воздействием ксенобиотиков, обычно сравнивают дыхательную и ферментную активность, биомассу и численность разных групп микроорганизмов, физиологические профили нарушенных и естественных микробных сообществ.

Дыхательная активность (эмиссия СО2) характеризует микробное сообщество в целом и зачастую используется при тестировании реакции сообщества на новые препараты. Этот общепринятый метод оценки состояния почвенной микробиоты ввиду простоты измерения широко применяется в почвенной биологии и экотоксикологии.

Согласно результатам метаанализа Nguyen et al., воздействие глифосата на дыхание и биомассу микробного сообщества почв зависит от дозы гербицида, почвенных характеристик (pH и процент органического углерода), а также от продолжительности воздействия. Другие факторы, такие как тип эксперимента (лабораторный/полевой), наличие и вид возделываемой культуры, а также конкретный состав применяемого препарата, не оказали значимого влияния на дыхательную активность микробного сообщества почв. Она увеличивалась при концентрации глифосата выше 200 мг/кг почвы, однако при добавлении в

количестве менее 100 мг/кг почвы глифосат не вызывал изменений данного показателя. Кроме того, стимуляция дыхания была выявлена на сроках 2-60 дней, после 60 дней не наблюдалось различия между контрольной почвой и почвой с добавлением глифосата. Выявлено отрицательное воздействие глифосата на дыхание микробного сообщества в почвах с нейтральными значениями pH (5.5 -7.5).

В работе бразильских ученых в краснозёмах была выявлена стимуляция дыхательной активности, вызванная внесением глифосата (2,16 мг/кг почвы). Стоит отметить, что эмиссия СО2 заметнее возрастала в почвах с шестилетней историей внесения гербицида по сравнению с почвами, не подвергавшимися воздействию глифосата (Araujo et al., 2003). Схожие результаты были получены для элювиальных среднесуглинистых почв с различной историей применения глифосата; была выявлена стимуляция дыхательной активности при внесении глифосата в ранее обрабатываемые гербицидом почвы (Lane et al., 2012).

Таким образом, глифосат вызывает кратковременное увеличение дыхательной активности почвенного микробного сообщества, причем эффект более выражен в почвах с историей применения данного гербицида. Стимуляция дыхания может быть вызвана использованием метаболитов глифосата в качестве питательного субстрата или же увеличением количества доступного органического вещества из отмерших частей растений или бактерий.

Численность и биомасса микробов также являются общими

характеристиками почвенной микробиоты и здоровья почвы. Согласно

метаанализу Nguyen et al, реакция биомассы почвенного микробного сообщества

на внесение глифосата оказалась менее выраженной, чем изменения дыхательной

активности. Было обнаружено возрастание показателей биомассы, измеренных с

помощью методов фумигации-экстракции, оценки количества общей ДНК и

анализа фосфолипидных жирных кислот, при высоких концентрациях глифосата

(от 200 мг/кг почвы), в условиях кислой реакции среды (pH менее 5.5) и при

сроках воздействия менее 100 дней. При дозах глифосата 10-100 мг/кг почвы

21

наблюдается снижение показателей микробной биомассы. Следует учитывать почвенные характеристики при определении реакции микробного комплекса на внесение гербицида (Nguyen et al., 2016).

Результаты отдельных исследований также показывают неоднозначную реакцию микробного сообщества почв на внесение глифосата. В некоторых случаях наблюдалось уменьшение микробной биомассы (Gomez et al., 2009; Tejada, 2009), в других, напротив, микробная биомасса возрастала через несколько дней после добавления глифосата в количестве, не превышающих нормальной полевой дозы (Haney et al., 2000; Panettieri et al., 2013; Zabaloy et al., 2011). Возможно, кратковременное возрастание биомассы обусловлено использованием гербицида в качестве источника C, N или P.

Ферментативная активность также является общим показателем состояния микробного сообщества. Ферментативная активность может быть использована в качестве биоиндикатора загрязнения пестицидами (Floch et al., 2011; Jacobsen and Hjelms0, 2014), а также для ремедиации загрязненных почв (Gianfreda and Rao, 2004). В многочисленных исследованиях было выявлено влияние различных гербицидов, в том числе и глифосата, на показатели ферментативной активности почв (Muñoz-Leoz et al., 2011; Singh and Ghoshal, 2013; Zabaloy et al., 2011). Замечено, что уровни активности изменяются как для экзо-, так и для эндоферментов. Изменение ферментативной активности почв после внесения пестицидов происходит достаточно быстро, как и процесс её восстановления до прежнего уровня. При частом применении скорость этих изменений увеличивается, что свидетельствует об адаптации микробного сообщества (Imfeld and Vuilleumier, 2012).

Активность инвертазы, фосфатазы и уреазы была измерена для

поверхностных горизонтов нескольких почв с разными физико-химическими

свойствами и для тех же образцов с внесением глифосата. Несмотря на большую

вариацию ферментной активности в разных почвах было выявлено, что

присутствие глифосата снижает фосфатазную активность и увеличивает

22

активность инвертазы и уреазы (Sannino and Gianfreda, 2001). Фосфатазная активность снижается при применении фосфорных удобрений и, возможно, связана с гранулометрическим составом почвы. Снижение фосфатазной активности в легкосуглинистой почве было более выражено, чем в глинистой почве (Tejada, 2009). Активность фермента дегидрогеназы, ассоциированного с живыми клетками бактерий и не экстрагируемого в окружающую среду, также увеличивалась в присутствии глифосата (Gomez et al., 2009). Согласно результатам разных исследований, глифосат оказывал влияние на Р-глюкозидазную активность: она увеличивалась в случае внесения гербицида в почву под минимальной обработкой (Panettieri et al., 2013), уменьшалась в лабораторном эксперименте с двумя почвами с разным гранулометрическим составом (Tejada, 2009).

Для оценки функционального разнообразия микробного сообщества проводятся тесты в микропланшетах с различными субстратами: CLPP (Community-level physiological profiling, создание физиологического профиля микробного сообщества), или же мультисубстратное тестирование (Горленко, Кожевин, 2005; Garland and Mills, 1991; McLamore et al., 2014). Список субстратов обычно включает в себя органические вещества различных классов: легкодоступные сахара, некоторые полисахариды, аминокислоты и спирты. Помимо интенсивности потребления субстратов, с помощью такого теста можно оценить некоторые экологические характеристики сообщества: функциональное биоразнообразие и устойчивость (Горленко, Кожевин, 2005). С помощью этого метода оценивалось влияние внесения различных гербицидов на почвенную микробиоту: атразина (Ros et al., 2006), нанопромамида (Cycon et al., 2013), и некоторых других.

В нескольких исследованиях выявлено положительное влияние глифосата на функциональное разнообразие микробного сообщества почвы. При высокой дозе глифосата (5000 мг/кг почвы), внесенной в лесную почву, повышалось количество потребляемых субстратов (Ratcliff et al., 2006). Наблюдалось

стимулирующее воздействие этого гербицида на микробное сообщество почвы на 20е и 45е сутки после внесения (Горленко и др., 2012). Однако внесение нормальной полевой дозы гербицида оказывает слабое воздействие на функциональное разнообразие почвенной микробиоты (Zabaloy et al., 2012). С помощью метода PICT (pollution-induced community tolerance - оценка воздействия градиента концентраций загрязняющего вещества на микробное сообщество) было выявлено, что глифосат стимулирует развитие микробного сообщества в небольших дозах (до 1-100 мг/л в растворе) и вызывает негативные эффекты на потребление субстратов при дозе около 1000 мг/л (Allegrini et al., 2015).

Также проводились исследования воздействия глифосата на отдельные экологические и филогенетические группы микроорганизмов. Прямые и косвенные эффекты от применения глифосата могут наблюдаться в функционировании симбиотических ризосферных бактерий, причем как при обработке нормальной полевой дозой гербицида, так и при превышении этой дозы. К косвенным эффектам применения глифосата относятся изменение количества и качества доступного органического вещества в ризосфере с отмиранием корней растений.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Железова Алена Дмитриевна, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Андронов Е.Е. и др. Изучение структуры микробного сообщества почв разной степени засоления с использованием Т-ЯЕЪР и ПЦР с детекцией в реальном времени // Почвоведение. 2012. Т. 2. С. 173-183.

2. Аристовская Т.В. Микробиология подзолистых почв. - М.: Издательство «Наука», 1965, - 188 с.

3. ГН 1.2.2701-10 Гигиенические нормативы содержания пестицидов в объектах окружающей среды (перечень), - М.:, Роспотребнадзор, 2010, - 86с.

4. Горленко М.В. и др. Функциональное биоразнообразие почвенных микробных сообществ при внесении органических субстратов различной природы // Вестник МГУ. Серия 17. Почвоведение. 2012. С. 20-27.

5. Горленко М.В., Кожевин П.А. Мультисубстратное тестирование природных микробных сообществ. М.: МАКС Пресс, 2005, - 88 с.

6. Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, разрешенных к применению на территории Российской Федерации. М.: Минсельхоз России, 2015, - 735 с.

7. Думова В.А. и др. Основные тенденции в формировании почвенного микробного сообщества в условиях стационарного полевого опыта по данным высокопроизводительного секвенирования библиотек гена 16S-рРНК // Сельскохозяйственная микробиология. 2013. Т. 5. С. 1-8.

8. Железова С.В. и др. Влияние разных технологий возделывания озимой пшеницы на урожайность и фитосанитарное состояние посевов (на примере полевого опыта Центра точного земледелия РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева) // Агрохимия. 2017. № 4. С. 65-75.

9. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. - М.:, Издательство МГУ, 2005, - 445 с.

10. Кожевин П.А. Микробные популяции в природе. М.:, Издательство МГУ, 1989, -175 с.

11. Кузнецова Е.М., Чмиль В.Д. Глифосат: поведение в окружающей среде и уровни остатков // Современные проблемы токсикологии. 2010. Т. 1. С. 8795.

12. Куликова Н., Лебедева Г. Гербициды и экологические аспекты их применения. М.: Книжный дом «ЛИБРОКОМ», 2010, - 152 с.

13. Манучарова Н.А. Идентификация метаболически активных клеток прокариот в почвах с применением молекулярно-биологического флуоресцентномикроскопического метода анализа fluorescence in situ hybridization (FISH). М.: Университет и школа, 2008, - 23 с.

14. Манучарова Н.А. и др. Влажность как экологический фактор формирования гидролитического микробного комплекса // Вестник МГУ. Серия 17. Почвоведение. 2012. Т. 1. С. 29-36.

15. Патыка Н.В. и др. Профиль полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ( tRFLP ) комплекса прокариотных микроорганизмов подзолистых почв // Доповщ Нащонально!' академп наук Украши. 2009. Т. 1. С. 187-192.

16. Сазонов С.Н. и др. Естественное восстановление микробиологических свойств дерново-подзолистой почвы в условиях залежи // Почвоведение. 2005. Т. 5. С. 575-580.

17. Тонконогов В.Д., Пастухов А.В., Забоева И.В. Генезис и классификационное положение автоморфных почв на покровных суглинках северной тайги Европы // Почвоведение. 2006. Т. 1. № 2 2006. С. 29-36.

18. Хитров Н.Б. Почвы длительного полевого опыта ТСХА // Известия ТСХА. 2012. № 3. С. 62-78.

19. Ahmad M. et al. Biochar as a sorbent for contaminant management in soil and water: A review // Chemosphere. 2014. (99). p. 19-23.

20. Albers C.N. et al. The influence of organic matter on sorption and fate of glyphosate in soil - Comparing different soils and humic substances // Environmental Pollution. 2009. № 10 (157). p. 2865-2870.

21. Allegrini M., Zabaloy M.C., Gómez E.D. V. Ecotoxicological assessment of soil microbial community tolerance to glyphosate // Science of The Total Environment. 2015. (533). p. 60-68.

22. Amann R.I. et al. Combination of 16S rRNA-Targeted Oligonucleotide Probes with Flow Cytometry for Analyzing Mixed Microbial Populations // Applied and Environmental Microbiology. 1990. № 6 (56). p. 1919-1925.

23. Amann R.I. et al. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol. Rev., 1995, (59). p. 143-169.

24. Anderson T.-H., Domsch K.H. Soil microbial biomass: The eco-physiological approach // Soil Biology and Biochemistry. 2010. № 12 (42). p. 2039-2043.

25. Araújo A.S.F., Monteiro R.T.R., Abarkeli R.B. Effect of glyphosate on the microbial activity of two Brazilian soils // Chemosphere. 2003. № 5 (52). p. 799804.

26. Barriuso J., Mellado R.P. Glyphosate affects the rhizobacterial communities in glyphosate-tolerant cotton // Applied Soil Ecology. 2012. (55). p. 20-26.

27. Barrow C.J. Biochar: Potential for countering land degradation and for improving agriculture // Applied Geography. 2012. (34). p. 21-28.

28. Beckie H.J., Hall L.M. Genetically-modified herbicide-resistant (GMHR) crops a two-edged sword? An Americas perspective on development and effect on weed management // Crop Protection. 2014. (66). p. 40-45.

29. Bento C.P.M. et al. Persistence of glyphosate and aminomethylphosphonic acid

93

in loess soil under different combinations of temperature, soil moisture and light/darkness // Science of The Total Environment. 2016. (572). p. 301-311.

30. Bergstrom L., Borjesson E., Stenstrom J. Laboratory and lysimeter studies of glyphosate and aminomethylphosphonic acid in a sand and a clay soil. // Journal of environmental quality. 2011. № 1 (40). p. 98-108.

31. Biederbeck V.O., Campbell C.A., Hunter J.H. Tillage effects on soil microbial and biochemical characteristics in a fallow-wheat rotation in a dark brown soil // Canadian Journal of Soil Science. 1997. № 2 (77). p. 309-316.

32. Biederman L.A., Stanley Harpole W. Biochar and its effects on plant productivity and nutrient cycling: A meta-analysis // GCB Bioenergy. 2013. № 2 (5). p. 202-214.

33. Bissett A. et al. Long-term land use effects on soil microbial community structure and function // Applied Soil Ecology. 2011. (51). p. 66-78.

34. Bohm G.M.B. et al. Glyphosate- and imazethapyr-induced effects on yield, nodule mass and biological nitrogen fixation in field-grown glyphosate-resistant soybean // Soil Biology and Biochemistry. 2009. № 2 (41). p. 420-422.

35. Brown S.P., Jumpponen A. Contrasting primary successional trajectories of fungi and bacteria in retreating glacier soils // Molecular Ecology. 2014. № 2 (23). p. 481-497.

36. Bunemann E.K., Schwenke G.D., Zwieten L. Van Impact of agricultural inputs on soil organisms - A review // Australian Journal of Soil Research. 2006. № 4 (44). p. 379-406.

37. Capelle P. van, Schrader S., Brunotte J. Tillage-induced changes in the functional diversity of soil biota - A review with a focus on German data // European Journal of Soil Biology. 2012. (50). p. 165-181.

38. Cassigneul A. et al. Fate of glyphosate and degradates in cover crop residues

and underlying soil: A laboratory study // Science of the Total Environment. 2016. (545-546). p. 582-590.

39. Castillo M.A. et al. Biodegradation of the herbicide diuron by streptomycetes isolated from soil // International Biodeterioration and Biodegradation. 2006. № 34 (58). p. 196-202.

40. Cayuela M.L. et al. Biochar's role in mitigating soil nitrous oxide emissions: A review and meta-analysis // Agriculture, Ecosystems and Environment. 2014. (191). p. 5-16.

41. Cerdeira A.L., Duke S.O. The Current Status and Environmental Impacts of Glyphosate-Resistant Crops // Journal of Environment Quality. 2006. № 5 (35). p. 1633-1658.

42. Cycon M., Markowicz A., Piotrowska-Seget Z. Structural and functional diversity of bacterial community in soil treated with the herbicide napropamide estimated by the DGGE, CLPP and r/K-strategy approaches // Applied Soil Ecology. 2013. (72). p. 242-250.

43. Daims H. et al. The domain-specific probe EUB338 is insufficient for the detection of all Bacteria: development and evaluation of a more comprehensive probe set // Systematic and Applied Microbiology. 1999. (444). p. 434-444.

44. Dedysh S.N. et al. Phylogenetic Analysis and In Situ Identification of Bacteria Community Composition in an Acidic Sphagnum Peat Bog Phylogenetic Analysis and In Situ Identification of Bacteria Community Composition in an Acidic Sphagnum Peat Bog // Applied and Environmental Microbiology. 2006. № 3 (72). p. 2110-2117.

45. Dedysh S.N., Panikov N.S., Tiedje J.M. Acidophilic Methanotrophic Communities fromSphagnum Peat Bogs // Applied and Environmental Microbiology. 1998. № 3 (64). p. 922-929.

46. Devers-Lamrani M. et al. Evidence for cooperative mineralization of diuron by Arthrobacter sp. BS2 and Achromobacter sp. SP1 isolated from a mixed culture enriched from diuron exposed environments // Chemosphere. 2014. № 1 (117). p. 208-215.

47. Dick R.E., Quinn J.P. Glyphosate-degrading isolates from environmental samples: occurrence and pathways of degradation // Applied Microbiology and Biotechnology. 1995. № 3 (43). p. 545-550.

48. Ding W. et al. Physiological responses of glyphosate-resistant and glyphosate-sensitive soybean to aminomethylphosphonic acid, a metabolite of glyphosate // Chemosphere. 2011. № 4 (83). p. 593-598.

49. Dobrovol'skaya T.G. et al. The role of microorganisms in the ecological functions of soils // Eurasian Soil Science. 2015. № 9 (48). p. 959-967.

50. Doublet J., Mamy L., Barriuso E. Delayed degradation in soil of foliar herbicides glyphosate and sulcotrione previously absorbed by plants: Consequences on herbicide fate and risk assessment // Chemosphere. 2009. № 4 (77). p. 582-589.

51. Duke S.O. Biotechnology: Herbicide-Resistant Crops // Encyclopedia of Agriculture and Food Systems. 2014. (2). p. 94-116.

52. Duke S.O., Powles S.B. Glyphosate: a once-in-a-century herbicide (minireview) // Pest Management Science. 2008. № February 2008 (64). p. 319-325.

53. Eilers K.G. et al. Shifts in bacterial community structure associated with inputs of low molecular weight carbon compounds to soil // Soil Biology and Biochemistry. 2010. № 6 (42). p. 896-903.

54. Esposito A. et al. A three-scale analysis of bacterial communities involved in rocks colonization and soil formation in high mountain environments // Current Microbiology. 2013. № 4 (67). p. 472-479.

55. Fan J. et al. Isolation, identification and characterization of a glyphosate-degrading bacterium, Bacillus cereus CB4, from soil // The Journal of General and Applied Microbiology. 2012. № 4 (58). p. 263-271.

56. Fei Y.Y., Gai J.Y., Zhao T.J. Identification of regulated genes conferring resistance to high concentrations of glyphosate in a new strain of Enterobacter // FEMS Microbiology Letters. 2013. № 2 (349). p. 135-143.

57. Fierer N. et al. Assessment of soil microbial community structure by use of taxon-specific quantitative PCR assays // Applied and Environmental Microbiology. 2005. № 7 (71). p. 4117.

58. Floch p. et al. Indicators of pesticide contamination: Soil enzyme compared to functional diversity of bacterial communities via Biolog® Ecoplates // European Journal of Soil Biology. 2011. № 4 (47). p. 256-263.

59. Garland J.L., Mills A.L. Classification and characterisation of heterotrophic microbial communities on the basis of pattern of community-level sole-carbon-source utilization // Applied and environmental microbiology. 1991. № 8 (57). p. 2351-2359.

60. Ghosh D. et al. Soil Biology & Biochemistry In-situ enrichment and analysis of atrazine-degrading microbial communities using atrazine-containing porous beads // Soil Biology and Biochemistry. 2009. № 6 (41). p. 1331-1334.

61. Gianfreda L., Rao M. A. Potential of extra cellular enzymes in remediation of polluted soils: A review // Enzyme and Microbial Technology. 2004. № 4 (35). p. 339-354.

62. Gimsing A.L. et al. Chemical and microbiological soil characteristics controlling glyphosate mineralisation in Danish surface soils // Applied Soil Ecology. 2004. № 3 (27). p. 233-242.

63. Gimsing A.L., Borggaard O.K., Bang M. Influence of soil composition on

adsorption of glyphosate and phosphate by contrasting Danish surface soils // European Journal of Soil Science. 2004. № 1 (55). p. 183-191.

64. Gomez E. et al. Impact of glyphosate application on microbial biomass and metabolic activity in a Vertic Argiudoll from Argentina // European Journal of Soil Biology. 2009. № 2 (45). p. 163-167.

65. Guan X. et al. Soil bacterial communities shaped by geochemical factors and land use in a less-explored area, Tibetan Plateau. // BMC genomics. 2013. (14). p. 820.

66. Haney R.L., Senseman S.A., Hons F.M. Effect of roundup ultra on microbial activity and biomass from selected soils. // Journal of Environment Quality. 2000. № 3 (31). p. 730-735.

67. Harter J. et al. Soil biochar amendment shapes the composition of N2O-reducing microbial communities // Science of the Total Environment. 2016. (562). p. 379-390.

68. Hartmann M. et al. Bacterial, archaeal and eukaryal community structures throughout soil horizons of harvested and naturally disturbed forest stands. // Environmental microbiology. 2009. № 12 (11). p. 3045-62.

69. Hartmann M. et al. Significant and persistent impact of timber harvesting on soil microbial communities in Northern coniferous forests // The ISME Journal. 2012. № 12 (6). p. 2199-2218.

70. Herath I. et al. Mechanistic modeling of glyphosate interaction with rice husk derived engineered biochar // Microporous and Mesoporous Materials. 2016. (225). p. 280-288.

71. Hong J.K., Kim H.J., Cho J.C. Novel PCR primers for the archaeal phylum Thaumarchaeota designed based on the comparative analysis of 16S rRNA gene sequences // PLoS ONE. 2014. № 5 (9). p. 20-23.

72. Hove-Jensen B., Zechel D.L., Jochimsen B. Utilization of Glyphosate as Phosphate Source: Biochemistry and Genetics of Bacterial Carbon-Phosphorus Lyase // Microbiology and Molecular Biology Reviews. 2014. № 1 (78). p. 176197.

73. Imfeld G., Vuilleumier S. Measuring the effects of pesticides on bacterial communities in soil: A critical review // European Journal of Soil Biology. 2012. (49). p. 22-30.

74. Imparato V. et al. Stimulation of bacteria and protists in rhizosphere of glyphosate-treated barley // Applied Soil Ecology. 2016. № November (98). p. 4755.

75. Iwamoto T., Nasu M. Current bioremediation practice and perspective // Journal of Bioscience and Bioengineering. 2001. № 1 (92). p. 1-8.

76. Jablonowski N.D. et al. Biochar-mediated [14C]-atrazine mineralization in atrazine-adapted soils from Belgium and Brazil // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2013. № 3 (61). p. 512-516.

77. Jacobsen C.S., Hjelms0 M.H. Agricultural soils, pesticides and microbial diversity // Current Opinion in Biotechnology. 2014. (27). p. 15-20.

78. Janssen P.H. Identifying the Dominant Soil Bacterial Taxa in Libraries of 16S rRNA and 16S rRNA Genes // Applied and Environmental Microbiology. 2006. № 3 (72). p. 1719-1728.

79. Jeffery S. et al. A quantitative review of the effects of biochar application to soils on crop productivity using meta-analysis // Agriculture, Ecosystems and Environment. 2011. № 1 (144). p. 175-187.

80. Jones D.L. et al. Biochar-mediated changes in soil quality and plant growth in a three year field trial // Soil Biology and Biochemistry. 2012. (45). p. 113-124.

81. Jones D.L., Edwards-Jones G., Murphy D. V. Biochar mediated alterations in

herbicide breakdown and leaching in soil // Soil Biology and Biochemistry. 2011. № 4 (43). p. 804-813.

82. Joseph S.D. et al. An investigation into the reactions of biochar in soil // Australian Journal of Soil Research. 2010. № 6-7 (48). p. 501-515.

83. Juretschko S. et al. The microbial community momposition of a nitrifying-denitrifying activated sludge from an industrial sewage treatment plant analyzed by the full-cycle rRNA approach // Systematic and Applied Microbiology. 2002. № 1 (25). p. 84-99.

84. Kelly L.C. et al. Pioneer Microbial Communities of the Fimmvortuhals Lava Flow, Eyjafjallajokull, Iceland // Microbial Ecology. 2014. № 3 (68). p. 504-518.

85. Kielak A.M. et al. The ecology of Acidobacteria: Moving beyond genes and genomes // Frontiers in Microbiology. 2016. № MAY (7). p. 1-16.

86. Kihlberg T. et al. Characteristics of a half century old charcoal rich soil in Sweden // Unpublished manuscript. 2010.

87. Kookana R.S. The role of biochar in modifying the environmental fate, bioavailability, and efficacy of pesticides in soils: A review // Australian Journal of Soil Research. 2010. № 6-7 (48). p. 627-637.

88. Kremer R.J., Means N.E. Glyphosate and glyphosate-resistant crop interactions with rhizosphere microorganisms // European Journal of Agronomy. 2009. № 3 (31). p. 153-161.

89. Kryuchkova Y. V. et al. Isolation and characterization of a glyphosate-degrading rhizosphere strain, Enterobacter cloacae K7 // Microbiological Research. 2014. № 1 (169). p. 99-105.

90. Krzysko-Lupicka T., Sudol T. Interactions between glyphosate and autochthonous soil fungi surviving in aqueous solution of glyphosate // Chemosphere. 2008. № 7 (71). p. 1386-1391.

91. Landry D. et al. Leaching of glyphosate and AMPA under two soil management practices in Burgundy vineyards (Vosne-Romanée, 21-France) // Environmental Pollution. 2005. № 2 (138). p. 191-200.

92. Lane M. et al. The effect of glyphosate on soil microbial activity, microbial community structure, and soil potassium // Pedobiologia. 2012. № 6 (55). p. 335342.

93. Laws E.A. Environmental Toxicology / E.A. Laws, 2013. 733 c.

94. Lehtovirta L.E., Prosser J.I., Nicol G.W. SoilpH regulates the abundance and diversity of Group1.1c Crenarchaeota // FEMS Microbiology Ecology. 2009. p. 110.

95. Leininger S. et al. Archaea predominate among ammonia-oxidizing prokaryotes in soils // Nature. 2006. № August (442). p. 806-809.

96. Lewis K.A. et al. An international database for pesticide risk assessments and management // Human and Ecological Risk Assessment: An International Journal. 2016. № April (7039). p. 1050-1064.

97. Lin Y. Te et al. Bacterial community of very wet and acidic subalpine forest and fire-induced grassland soils // Plant and Soil. 2010. № 1 (332). p. 417-427.

98. Lo C.-C.C.-C. Effect of pesticides on soil microbial community // Journal of Environmental Science and Health - Part B Pesticides, Food Contaminants, and Agricultural Wastes. 2010. № 5 (45). p. 348-359.

99. Lukacheva E.G. et al. Description of the phylogenetic structure of hydrolytic prokaryotic complex in the soils // Biology Bulletin. 2013. № 1 (40). p. 19-25.

100. Lupwayi N.Z. et al. Soil microbial response to nitrogen fertilizer and tillage in barley and corn // Soil and Tillage Research. 2012. (118). p. 139-146.

101. Lv X. et al. Identification and sequence analysis of aroA gene of avibacterium paragallinarum // Int J Clin Exp Med. 2016. № 2 (9). p. 831-837.

102. Makhalanyane T.P., Goethem M.W. Van, Cowan D.A. Microbial diversity and functional capacity in polar soils // Current Opinion in Biotechnology. 2016. № Figure 1 (38). p. 159-166.

103. Mamy L., Barriuso E. Glyphosate adsorption in soils compared to herbicides replaced with the introduction of glyphosate resistant crops // Chemosphere. 2005. № 6 (61). p. 844-855.

104. Mamy L., Barriuso E., Gabrielle B. Glyphosate fate in soils when arriving in plant residues // Chemosphere. 2016. (154). p. 425-433.

105. Manucharova N.A. The microbial destruction of chitin, pectin, and cellulose in soils // Eurasian Soil Science. 2009. № 13 (42). p. 1526-1532.

106. Manz W. et al. Phylogenetic Oligodeoxynucleotide Probes for the Major Subclasses of Proteobacteria: Problems and Solutions // Systematic and Applied Microbiology. 1992. № 4 (15). p. 593-600.

107. Manz W. et al. Application of a suite of 16S rRNA-specific oligonucleotide probes designed to investigate bacteria of the phylum cytophaga-flavobacter-bacteroides in the natural environment // Microbiology. 1996. № 5 (142). p. 10971106.

108. Martin S.M. et al. Marked changes in herbicide sorption-desorption upon ageing of biochars in soil // Journal of Hazardous Materials. 2012. (231-232). p. 70-78.

109. McLamore E.S. et al. Development and validation of an open source O2-sensitive gel for physiological profiling of soil microbial communities // Journal of Microbiological Methods. 2014. № 1 (96). p. 62-67.

110. Meier H. et al. Specific Oligonucleotide Probes for in situ Detection of a Major Group of Gram-positive Bacteria with low DNA G+C Content // Systematic and Applied Microbiology. 1999. № 2 (22). p. 186-196.

111. Mohajeri P. et al. Genotyping of coa and aroa genes of methicillin-resistant staphylococcus aureus strains isolated from nasal samples in western Iran // Jundishapur Journal of Microbiology. 2016. № 1 (9). p. 1-6.

112. Morillo E., Villaverde J. Advanced technologies for the remediation of pesticide-contaminated soils // Science of The Total Environment. 2017. (586). p. 576-597.

113. Munoz-Leoz B. et al. Tebuconazole application decreases soil microbial biomass and activity // Soil Biology and Biochemistry. 2011. № 10 (43). p. 21762183.

114. Neef A. et al. Monitoring a widespread bacterial group: In situ detection of planctomycetes with 16S rRNA-targeted probes // Microbiology. 1998. № 12 (144). p. 3257-3266.

115. Newman M.M. et al. Glyphosate effects on soil rhizosphere-associated bacterial communities // Science of the Total Environment. 2016. (543). p. 155160.

116. Newman M.M. et al. Changes in rhizosphere bacterial gene expression following glyphosate treatment // Science of the Total Environment. 2016. (553). p. 32-41.

117. Nguyen D.B. et al. Impact of glyphosate on soil microbial biomass and respiration: A meta-analysis // Soil Biology and Biochemistry. 2016. (92). p. 5057.

118. Nivelle E. et al. Functional response of soil microbial communities to tillage, cover crops and nitrogen fertilization // Applied Soil Ecology. 2016. (108). p. 147155.

119. Okada E., Costa J.L., Bedmar F. Adsorption and mobility of glyphosate in different soils under no-till and conventional tillage // Geoderma. 2016. (263). p.

78-85.

120. Oliveira J.S., Basso L.A., Filgueira W. The Inhibition of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate Synthase as a Model for Development of Novel Antimicrobials 2007. № 19 (55). p. 445-457.

121. Oyonarte p. et al. The use of soil respiration as an ecological indicator in arid ecosystems of the SE of Spain: Spatial variability and controlling factors // Ecological Indicators. 2012. № 1 (14). p. 40-49.

122. Panettieri M. et al. Glyphosate effect on soil biochemical properties under conservation tillage // Soil and Tillage Research. 2013. (133). p. 16-24.

123. Pankratov T. a et al. Substrate-induced growth and isolation of Acidobacteria from acidic Sphagnum peat. // The ISME journal. 2008. № 5 (2). p. 551-560.

124. Park S.J., Park B.J., Rhee S.K. Comparative analysis of archaeal 16S rRNA and amoA genes to estimate the abundance and diversity of ammonia-oxidizing archaea in marine sediments // Extremophiles. 2008. № 4 (12). p. 605-615.

125. Pesaro M., Widmer F. Identification of novel Crenarchaeota and Euryarchaeota clusters associated with different depth layers of a forest soil // FEMS Microbiology Ecology. 2002. (42). p. 89-98.

126. Pessagno R.C., Torres Sánchez R.M., Santos Afonso M. dos Glyphosate behavior at soil and mineral-water interfaces // Environmental Pollution. 2008. № 1 (153). p. 53-59.

127. Pipke R., Amrhein N. Carbon-phosphorus lyase activity in permeabilized cells of Artrobacter sp. GLP-1 // FEBS Letters. 1988. № 1 (236). p. 135-138.

128. Pollegioni L., Schonbrunn E., Siehl D. Molecular basis of glyphosate resistance-different approaches through protein engineering. // The FEBS journal. 2011. № 16 (278). p. 2753-2766.

129. Powell J.R. et al. Effect of glyphosate on the tripartite symbiosis formed by

Glomus intraradices, Bradyrhizobium japonicum, and genetically modified soybean // Applied Soil Ecology. 2009. № 1 (41). p. 128-136.

130. Preem J.-K. et al. Bacterial community structure and its relationship to soil physico-chemical characteristics in alder stands with different management histories // Ecological Engineering. 2012. № November (49). p. 10-17.

131. Priestman M.A. et al. 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase from Staphylococcus aureus is insensitive to glyphosate // FEBS Letters. 2005. № 3 (579). p. 728-732.

132. Rabus R. et al. Anaerobic utilization of alkylbenzenes and n-alkanes from crude oil in an enrichment culture of denitrifying bacteria affiliating with the beta-subclass of Proteobacteria. // Environmental microbiology. 1999. № 2 (1). p. 145157.

133. Rahman M. et al. Physical, chemical and microbiological properties of an Andisol as related to land use and tillage practice // Soil and Tillage Research. 2008. № 1-2 (101). p. 10-19.

134. Ratcliff A.W., Busse M.D., Shestak C.J. Changes in microbial community structure following herbicide (glyphosate) additions to forest soils // Applied Soil Ecology. 2006. № 2-3 (34). p. 114-124.

135. Roger-Estrade J. et al. Tillage and soil ecology: Partners for sustainable agriculture // Soil and Tillage Research. 2010. № 1 (111). p. 33-40.

136. Rojas C., Gutierrez R.M., Bruns M.A. Bacterial and eukaryal diversity in soils forming from acid mine drainage precipitates under reclaimed vegetation and biological crusts // Applied Soil Ecology. 2016. (105). p. 57-66.

137. Roller p. et al. In situ probing of gram-positive bacteria with high DNA G+C content using 23S rRNA-targeted oligonucleotides // Microbiology. 1994. № 10 (140). p. 2849-2858.

138. Romdhane S. et al. Ecotoxicological Impact of the Bioherbicide Leptospermone on the Microbial Community of Two Arable Soils // Frontiers in Microbiology. 2016. № May (7).

139. Ros M. et al. Molecular and physiological bacterial diversity of a semi-arid soil contaminated with different levels of formulated atrazine // Applied Soil Ecology. 2006. № 2-3 (34). p. 93-102.

140. Rose M.T. et al. Impact of Herbicides on Soil Biology and Function Elsevier Inc., 2016. 133-220 p.

141. Rutz B.A., Kieft T.L. Phylogenetic characterization of dwarf archaea and bacteria from a semiarid soil // Soil Biology and Biochemistry. 2004. № 5 (36). p. 825-833.

142. Safaei Khorram M. et al. Biochar: A review of its impact on pesticide behavior in soil environments and its potential applications // Journal of Environmental Sciences (China). 2016. (44). p. 269-279.

143. Sagarkar S. et al. Monitoring bioremediation of atrazine in soil microcosms using molecular tools // Environmental Pollution. 2013. (172). p. 108-115.

144. Sannino F., Gianfreda L. Pesticide influence on soil enzymatic activities // Chemosphere. 2001. № 4-5 (45). p. 417-425.

145. Santos J.B. Dos et al. Tolerance of Bradyrhizobium strains to glyphosate formulations // Crop Protection. 2005. № 6 (24). p. 543-547.

146. Shen J.-P., Chen C.R., Lewis T. Long term repeated fire disturbance alters soil bacterial diversity but not the abundance in an Australian wet sclerophyll forest. // Scientific reports. 2016. № January (6). p. 19639.

147. Sheng G. et al. Influence of pH on pesticide sorption by soil containing wheat residue-derived char // Environmental Pollution. 2005. № 3 (134). p. 457-463.

148. Simmons B.L., Coleman D.C. Microbial community response to transition

from conventional to conservation tillage in cotton fields // Applied Soil Ecology. 2008. № 3 (40). p. 518-528.

149. Singh A., Ghoshal N. Impact of herbicide and various soil amendments on soil enzymes activities in a tropical rainfed agroecosystem // European Journal of Soil Biology. 2013. (54). p. 56-62.

150. Souza R.C. et al. Soil metagenomics reveals differences under conventional and no-tillage with crop rotation or succession // Applied Soil Ecology. 2013. (72). p. 49-61.

151. Stahl D. A., Amann R. Development and application of nucleic acid probes in bacterial systematics 1991. 205-248 p.

152. Steinbeiss S., Gleixner G., Antonietti M. Effect of biochar amendment on soil carbon balance and soil microbial activity // Soil Biology and Biochemistry. 2009. № 6 (41). p. 1301-1310.

153. Stenrod M. et al. Spatial variability of glyphosate mineralization and soil microbial characteristics in two Norwegian sandy loam soils as affected by surface topographical features // Soil Biology and Biochemistry. 2006. № 5 (38). p. 962971.

154. Sun Y.C. et al. Novel AroA with high tolerance to glyphosate, encoded by a gene of Pseudomonas putida 4G-1 isolated from an extremely polluted environment in China // Applied and Environmental Microbiology. 2005. № 8 (71). p. 4771-4776.

155. Susyan E. a. et al. Forest succession on abandoned arable soils in European Russia - Impacts on microbial biomass, fungal-bacterial ratio, and basal CO2 respiration activity // European Journal of Soil Biology. 2011. № 3 (47). p. 169174.

156. Sviridov A. V et al. Microbial Degradation of Glyphosate Herbicides

(Review) // Applied Biochemistry and Microbiology. 2015. № 2 (51). p. 188-195.

157. Sviridov a V et al. New approaches to identification and activity estimation of glyphosate degradation enzymes. // Biochemistry. Biokhimiia. 2011. № 6 (76). p. 720-725.

158. Tatarkova V., Hiller E., Vaculik M. Impact of wheat straw biochar addition to soil on the sorption, leaching, dissipation of the herbicide (4-chloro-2-methylphenoxy)acetic acid and the growth of sunflower (Helianthus annuus L.) // Ecotoxicology and Environmental Safety. 2013. (92). p. 215-221.

159. Teira E. et al. Combining catalyzed reported deposition-fluorescence in situ hybridization and automicrography to detect substrate utilization by Bacteria and Archaea in the Deep Ocean // Applied and Environmental Microbiology. 2004. № 7 (70). p. 4411-4414.

160. Tejada M. Evolution of soil biological properties after addition of glyphosate, diflufenican and glyphosate+diflufenican herbicides // Chemosphere. 2009. № 3

(76). p. 365-373.

161. Travaglia p. et al. Towards sustainable maize production: Glyphosate detoxification by Azospirillum sp. and Pseudomonas sp. // Crop Protection. 2015.

(77). p. 102-109.

162. Treonis A.M. et al. Effects of organic amendment and tillage on soil microorganisms and microfauna // Applied Soil Ecology. 2010. № 1 (46). p. 103110.

163. Trigo P. et al. Influence of soil biochar aging on sorption of the herbicides MCPA, nicosulfuron, terbuthylazine, indaziflam, and fluoroethyldiaminotriazine // Journal of Agricultural and Food Chemistry. 2014. № 45 (62). p. 10855-10860.

164. Upchurch R. et al. Differences in the composition and diversity of bacterial communities from agricultural and forest soils // Soil Biology and Biochemistry.

2008. № 6 (40). p. 1294-1305.

165. Uroz S. et al. Structure and function of bacterial communities in ageing soils: Insights from the Mendocino ecological staircase // Soil Biology and Biochemistry. 2014. (69). p. 265-274.

166. Vereecken H. Mobility and leaching of glyphosate: A review // Pest Management Science. 2005. № 12 (61). p. 1139-1151.

167. Villeneuve A., Larroudé S., Humbert J.F. Herbicide Contamination of Freshwater Ecosystems : Impact on Microbial Communities 2008.

168. Wang B.-Z. et al. Microbial Community Changes Along a Land-Use Gradient of Desert Soil Origin // Pedosphere. 2012. № 5 (22). p. 593-603.

169. Wang J. et al. Over-expression of the Gr5aroA gene from glyphosate-contaminated soil confers high tolerance to glyphosate in tobacco // Molecular Breeding. 2014. № 1 (33). p. 197-208.

170. Wardle D.A., Parkinson D. Effects of three herbicides on soil microbial biomass and activity 1990. (28). p. 21-28.

171. Weller R., Glockner F.O., Amann R. 16S rRNA-Targeted Oligonucleotide Probes for the in situ Detection of Members of the Phylum Cytophaga-Flavobacterium-Bacteroides // Systematic and Applied Microbiology. 2000. № 1 (23). p. 107-114.

172. Wessén E., Hallin S., Philippot L. Differential responses of bacterial and archaeal groups at high taxonomical ranks to soil management // Soil Biology and Biochemistry. 2010. № 10 (42). p. 1759-1765.

173. Wu X. et al. Bacterial diversity in the foreland of the Tianshan No. 1 glacier, China // Environmental Research Letters. 2012. № 1 (7). p. 14038.

174. Xu Y. et al. Bacterial communities in soybean rhizosphere in response to soil type, soybean genotype, and their growth stage // Soil Biology and Biochemistry.

109

2009. № 5 (41). p. 919-925.

175. Yang Y., Sheng G., Huang M. Bioavailability of diuron in soil containing wheat-straw-derived char // Science of the Total Environment. 2006. № 2-3 (354). p. 170-178.

176. Yi S. et al. A Novel Naturally Occurring Class I 5-Enolpyruvylshikimate-3-Phosphate Synthase from Janibacter sp. Confers High Glyphosate Tolerance to Rice // Scientific Reports. 2016. № September 2015 (6). p. 19104.

177. Yin p. et al. Members of soil bacterial communities sensitive to tillage and crop rotation // Soil Biology and Biochemistry. 2010. № 12 (42). p. 2111-2118.

178. Yu Y., Lee C., Hwang S. Analysis of community structures in anaerobic processes using a quantitative real-time PCR method // Water science and technology : a journal of the International Association on Water Pollution Research. 2005. № 1-2 (52). p. 85-91.

179. Yu Y., Zhou Q.X. Adsorption characteristics of pesticides methamidophos and glyphosate by two soils // Chemosphere. 2005. № 6 (58). p. 811-816.

180. Zabaloy M.C. et al. Herbicides in the Soil Environment : Linkage between Bioavailability and Microbial Ecology 2011. 161-192 p.

181. Zabaloy M.C. et al. Assessment of microbial community function and structure in soil microcosms exposed to glyphosate // Applied Soil Ecology. 2012. (61). p. 333-339.

182. Zablotowicz R.M., Reddy K.N. Nitrogenase activity, nitrogen content, and yield responses to glyphosate in glyphosate-resistant soybean // Crop Protection. 2007. № 3 (26). p. 370-376.

183. Zhang D. et al. Biochar helps enhance maize productivity and reduce greenhouse gas emissions under balanced fertilization in a rainfed low fertility inceptisol // Chemosphere. 2016. (142). p. 106-113.

184. Zhelezova A.D. et al. Microbiological parameters of aggregates in typical chernozems of long-term field experiments // Eurasian Soil Science. 2017. № 6 (50). p. 701-707.

185. Zobiole L.H.S. et al. Effect of glyphosate on symbiotic N2-fixation and nickel concentration in glyphosate-resistant soybeans // Applied Soil Ecology. 2010. № 2 (44). p. 176-180.