Исследование свойств полимерных матриц-носителей для культивированных лимбальных стволовых клеток в эксперименте тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.07, кандидат наук Карпович Вадим Валерьевич

• Карпович Вадим Валерьевич
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Карпович Вадим Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ЛИМБАЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ И МЕТОДЫ ЕЕ УСТРАНЕНИЯ (обзор литературы)

1.1. Сведения о частоте и причинах возникновения лимбальной недостаточности

1.2. История изучения и современные представления о патогенезе лимбальной недостаточности

1.3. Методы хирургического лечения пациентов с лимбальной недостаточностью

1.4. Клеточные технологии как перспективное направление в лечении лимбальной недостаточности

1.5. Материалы, потенциально перспективные в создании носителей для культивирования и трансплантации лимбальных стволовых клеток

1.5.1. Биологические материалы для создания матриц-носителей для культивирования и трансплантации лимбальных стволовых клеток

1.5.2. Синтетические материалы для создания матриц-носителей для

культивирования и трансплантации лимбальных стволовых клеток

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Методика изготовления синтетических полимерных матриц

2.2. Общая характеристика исследования

2.3. Методика исследования прозрачности синтетических полимерных матриц из поли(лактид-гликолида), поли(лактид-капролактона), поли-е-капролактона и амниотической мембраны

2.4. Методика исследования механических свойств синтетических полимерных матриц из поли(лактид-гликолида), поли(лактид-капролактона), поли-е-капролактона и амниотической мембраны

2.5. Методики оценки биосовместимости синтетических полимерных матриц из поли(лактид-гликолида), поли(лактид-капролактона) и поли-е-капролактона с лимбальными стволовыми клетками человека и кролика, с клетками трансформированной линии эпителия роговицы человека

2.5.1. Методика забора биоптатов роговичной части лимба, выделения и культивирования лимбальных стволовых клеток человека и кролика

2.5.2. Методика иммуногистохимического исследования лимбальных стволовых клеток человека и кролика

2.5.3. Методика посева лимбальных стволовых клеток человека и кролика, клеток трансформированной линии эпителия роговицы человека на синтетические полимерные матрицы

2.5.4. Методика оценки жизнеспособности и способности лимбальных стволовых клеток человека и кролика, клеток трансформированной линии эпителия роговицы человека к адгезии на синтетических полимерных матрицах

2.5.5. Методика оценки пролиферативной активности лимбальных стволовых клеток человека и кролика, клеток трансформированной линии эпителия роговицы человека на поверхности синтетических полимерных матриц

2.5.6. Методика оценки организации актинового цитоскелета лимбальных стволовых клеток человека и кролика, клеток трансформированной линии эпителия роговицы на поверхности синтетических полимерных матриц

2.6. Методика оценки способности клеток к миграции с поверхности матриц в условиях in vitro

2.7. Методика оценки сроков биодеградации синтетических полимерных матриц в условиях in vivo

2.8. Статистические методы исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И СРАВНИТЕЛЬНОЙ ОЦЕНКИ ПРОЗРАЧНОСТИ И МЕХАНИЧЕСКИХ СВОЙСТВ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТРИЦ

3.1. Результаты исследования прозрачности синтетических полимерных матриц из поли(лактид-гликолида), поли(лактид-капролактона), поли-е-капролактона и амниотической мембраны

3.2. Результаты исследования механических свойств синтетических полимерных матриц из поли(лактид-гликолида), поли(лактид-

капролактона), поли-е-капролактона и амниотической мембраны

ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И СРАВНИТЕЛЬНОЙ ОЦЕНКИ БИОСОВМЕСТИМОСТИ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПОЛИМЕРНЫХ МАТРИЦ С РАЗЛИЧНЫМИ КУЛЬТИВИРУЕМЫМИ КЛЕТКАМИ И СРОКОВ БИОДЕГРАДАЦИИ

4.1. Результаты выделения лимбальных стволовых клеток человека и кролика

4.2. Результаты иммунофенотипирования лимбальных стволовых клеток человека и кролика

4.3. Результаты исследования биосовместимости синтетических полимерных матриц с лимбальными стволовыми клетками человека и кролика, с клетками трансформированной линии эпителия роговицы человека

4.4. Результаты оценки способности клеток к миграции с поверхности матриц в условиях in vitro

4.5. Результаты исследования сроков биодеградации матриц из поли(лактид-гликолида), поли(лактид-капролактона) и поли-е-

капролактона в условиях in vivo

ОБСУЖДЕНИЕ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

79

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование свойств полимерных матриц-носителей для культивированных лимбальных стволовых клеток в эксперименте»

Актуальность исследования

По данным отечественных и зарубежных авторов, в настоящее время в мире насчитывается около 36 миллионов слепых и 216 миллионов слабовидящих людей [16, 93, 112]. Заболевания и повреждения роговицы занимают четвертое место (4%) в структуре глазной патологии, уступая лишь катаракте (51%), глаукоме (8%) и возрастной макулярной дегенерации (5%) [95, 123]. Наиболее распространенными из них являются язвы и помутнения роговицы после перенесенной инфекционной патологии, травм или ожогов, а также ксерофтальмия в детском возрасте [107].

По данным отечественных авторов [12], число слепых и слабовидящих в Российской Федерации, зарегистрированных Всероссийским обществом, составляет 213 тыс. человек, а уровень слепоты и слабовидения - 101,9 на 100 тыс. населения. Удельный вес патологии роговицы среди слепых и слабовидящих людей находится в диапазоне от 4 до 5% [16].

Во время современных локальных вооруженных конфликтов [17, 23] взрывные поражения органа зрения составляют до 80-90% от всех огнестрельных повреждений глаз и в большинстве случаев сопровождаются механическими повреждениями и ожогами роговицы, которые могут привести к потере зрительных функций, а при неблагоприятном течении даже к потере органа зрения [36, 39]. Ожоги глаз у военнослужащих составляют 6,4% (тяжелые ожоги -9,5%, особо тяжелые ожоги - 1,0%.) [18] случаев всех травм и в большинстве случаев приводят к развитию сосудистых помутнений роговицы с различной степенью выраженности [43].

Основным методом хирургического лечения такой патологии роговицы в настоящее время является сквозная кератопластика [7, 10, 11, 20, 27, 33, 91, 133]. Однако выполнение пересадки роговицы при наличии тотального сосудистого бельма практически всегда обречено на неудачу в связи с неизбежным его рецидивированием [13, 14, 27, 30, 36, 39, 43].

Одной из главных причин сосудистых помутнений роговицы является дисфункция лимбальных стволовых клеток (ЛСК), клинически проявляющаяся состоянием, получившим название лимбальной недостаточности [43, 100]. В настоящее время в качестве одного из способов устранения лимбальной недостаточности (ЛН) исследуется возможность трансплантации на роговицу культивируемых in vitro ЛСК [96]. Наиболее распространенным в мире носителем для культивирования ЛСК является амниотическая мембрана (АМ) [96, 110]. В то же время риск передачи гемотрансмиссивных заболеваний при использовании АМ для вышеуказанных целей обусловливает необходимость поиска новых видов матриц-носителей, изготавливаемых из биологических или синтетических материалов.

Степень разработанности темы исследования

По данным литературы, необходимыми характеристиками матриц-носителей для культивирования ЛСК являются: прозрачность (дающая возможность оценки адгезии и жизнеспособности клеток на поверхности матрицы, а также возможность наблюдения за глазной поверхностью после ее трансплантации), прочность (достаточная для подшивания матрицы к глазной поверхности), эластичность и низкая жесткость (для равномерного распределения матрицы на глазной поверхности без формирования складок), а также способность к биодеградации в пределах 3-4 недель [19, 28]. Такими свойствами, необходимыми для трансплантации на роговицу культивированных клеток, обладает АМ.

В настоящий момент ведутся активные исследования материалов природного происхождения, которые могут быть использованы в качестве матрицы для культивирования ЛСК: коллаген, фибрин, хитозан с желатином, фиброин шелка, кератин [28, 136]. Однако процесс изготовления данных материалов достаточно трудоемкий, а также несет в себе риски передачи трансмиссивных заболеваний.

По данным литературы, большой перспективностью в области регенеративной медицины обладают синтетические материалы, что обусловлено

широким диапазоном их механических, физических и химических свойств [15]. Имеются публикации о возможности использования в качестве материалов для изготовления матриц-носителей ЛСК таких синтетических материалов, как поли(лактид-гликолид) [141, 154] и поли-е-капролактон [66]. Однако данные исследования имеют малочисленный характер и лишь описывают свойства и характеристики одного конкретного материала без сравнения с другими.

Таким образом, исследование возможности использования различных синтетических материалов, а также поиск оптимального среди них с целью создания матриц-носителей для ЛСК, является важной задачей современной офтальмологии и определяет актуальность данной работы.

Цель исследования

Изучить в эксперименте свойства трех видов синтетических полиэфирных матриц, провести их сравнительную оценку и определить оптимальную в качестве носителя для культивирования и трансплантации лимбальных стволовых клеток.

Задачи исследования

1. Изучить оптические и механические свойства матриц, изготовленных на основе синтетических полиэфиров: поли(лактид-гликолид) (85/15), поли(лактид-капролактон) (85/15) и поли-е-капролактон в сравнении с амниотической мембраной.

2. Исследовать в условиях in vitro биосовместимость различных клеточных культур (лимбальных стволовых клеток человека и кролика, а также клеток трансформированной линии эпителия роговицы человека) с изучаемыми полимерными матрицами.

3. Исследовать и сравнить сроки биодеградации изучаемых матриц на глазной поверхности лабораторных животных в эксперименте in vivo.

4. На основании полученных результатов определить вариант матрицы-носителя для культивирования in vitro лимбальных стволовых клеток с целью трансплантации на роговицу при устранении лимбальной недостаточности.

Научная новизна работы

1. Впервые выполнено сравнительное исследование оптических и механических свойств синтетических полиэфирных матриц, изготовленных на основе поли(лактид-гликолида), поли(лактид-капролактона) и поли-е-капролактона различной толщины и амниотической мембраны.

2. Впервые установлены сроки биодеградации матриц из поли(лактид-гликолида), поли(лактид-капролактона) и поли-е-капролактона различной толщины в условиях in vivo на глазной поверхности лабораторных животных.

3. Впервые установлена биосовместимость синтетических матриц на основе поли(лактид-гликолида), поли(лактид-капролактона) и поли-е-капролактона с различными клеточными культурами (лимбальными стволовыми клетками человека и кролика, а также с клетками трансформированной линии эпителия роговицы человека).

4. Впервые по результатам сравнительного экспериментального исследования обосновано использование поли(лактид-капролактона) толщиной 5 мкм в качестве материала матрицы-носителя культивированных лимбальных стволовых клеток - как наиболее подходящей из рассмотренных для трансплантации на роговицу с целью устранения лимбальной недостаточности.

Теоретическая и практическая значимость

1. Результаты исследований в условиях in vitro позволили получить данные об оптических и механических свойствах, биосовметимости с различными клеточными культурами матриц, изготовленных из трех видов синтетических материалов различной толщины.

2. Результаты исследований в условиях in vivo продемонстрировали сроки биодеградации синтетических матриц различной толщины, что позволило определить материал и необходимую толщину матрицы-носителя с минимальными сроками лизиса на глазной поверхности лабораторных животных.

3. Результаты работы позволили определить вариант синтетической матрицы-носителя для культивирования и трансплантации лимбальных

стволовых клеток на роговицу для целей устранения лимбальной недостаточности.

Методология и методы исследования

Методологической основой диссертационной работы явилось последовательное применение методов научного исследования. Работа выполнена в дизайне сравнительного открытого экспериментального исследования с использованием клинических, инструментальных, цитологических и аналитических методов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. По оптическим и механическим свойствам наиболее приближенными к предъявляемым требованиям характеристиками обладают матрицы из поли(лактид-капролактона).

2. Исследованные синтетические матрицы являются перспективными носителями культивированных лимбальных стволовых клеток, так как биосовместимы с различными клеточными культурами роговицы и имеют способность к биодеградации, а по оптическим и механическим свойствам превосходят амниотическую мембрану.

3. Матрица, изготовленная из поли(лактид-капролактона), толщиной 5 мкм может рассматриваться как оптимальный вариант носителя лимбальных стволовых клеток для трансплантации их на роговицу с целью устранения лимбальной недостаточности.

Степень достоверности и апробация результатов исследования

Степень достоверности результатов проведенных исследований определяется количеством наблюдений, использованием адекватных методов исследования и подтверждается в процессе анализа материала. Значимость различий количественных показателей в трех и более группах оценивалась с помощью метода дисперсионного анализа с использованием методики LSD теста Фишера, а также непараметрического метода Краскела-Уоллиса. Научные положения, выводы и рекомендации, сформулированные в диссертации, строго аргументированы и логически вытекают из результатов исследования.

Апробация результатов исследования

Основные положения работы представлены в виде докладов и обсуждены на итоговой конференции военно-научного общества курсантов и слушателей Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2018 г.), итоговой конференции военно-научного общества слушателей I факультета руководящего медицинского состава Военно-медицинской академии (Санкт-Петербург, 2018, 2019 г.), XIII Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (2018 г.), XX Всероссийском конгрессе с международным участием «Современные технологии катарактальной, роговичной и рефракционной хирургии» (2019 г.).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационного исследования используются в учебном процессе и научной работе на кафедре офтальмологии ВМедА имени С.М. Кирова.

Полученные экспериментальные данные являются основой для разработки на базе Института цитологии РАН биомедицинского клеточного продукта, представляющего собой культивированные ЛСК, трансплантируемые на глазную поверхность на матрице-носителе, перспективного для внедрения в клиническую практику.

Личный вклад автора

Автором лично разработаны дизайн и программа исследования. Личный вклад автора в выполнении сложных исследований - 80%. Самостоятельно осуществлен сбор полученных данных. Автором освоены методики, применяемые для получения и оценки результатов, выполнен анализ и описание результатов основных исследований, сформулированы выводы и основные положения, выносимые на защиту.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 9 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки

Российской Федерации для опубликования основных результатов диссертаций на соискание учёной степени кандидата медицинских наук. Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 99 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4 глав, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 158 источников (из них 46 отечественных и 112 иностранных). Работа содержит 9 таблиц и 36 рисунков.

ГЛАВА 1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ЛИМБАЛЬНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ И МЕТОДЫ ЕЕ УСТРАНЕНИЯ

(обзор литературы)

1.1. Сведения о частоте и причинах возникновения лимбальной недостаточности

Ввиду разнообразности этиологических факторов и отсутствия четких клинических признаков, оценить распространенность лимбальной недостаточности (ЛН) среди людей с патологическими состояниями роговицы представляется достаточно проблематичной задачей. В современной литературе встречаются лишь единичные публикации об эпидемиологии по данной проблеме. По данным A. Shortt с соавт. [139], основными причинами возникновения ЛН в Великобритании являются химические и термические ожоги глаз, синдром Стивенса-Джонсона, глазной рубцовый пемфигоид. Заболеваемость данными состояниями составляет 1:25000 населения в год и в 10% всех случаев развивается ЛН, что составляет 240 случаев в год [139]. В 2017 г. были опубликованы исследования S. Bobba [118], согласно которым в Австралии и Новой Зеландии ежегодно возникает до 63 новых случаев ЛН тяжелой степени. Основными причинами возникновения ЛН авторы считают ношение мягких контактных линз (21% случаев), глазной рубцовый пемфигоид (21% случаев), химические и термические ожоги глаз (14% случаев). По данным S. Ghosh [50], частота возникновения ЛН, требующей выполнения операции лимбальной трансплантации (ЛТ), при ожогах глаз в Великобритании составляет около 147 случаев в год.

В 2012 году в международном роговичном обществе («The Cornea Society») была создана рабочая группа исследователей по изучению проблем ЛН («Limbal Stem Cell Working Group»), по результатам работы которой в 2019 г. году был создан и опубликован документ под названием «глобальный консенсус по определению, классификации, диагностике и стадированию лимбальной недостаточности» [94]. Согласно данному документу, предлагается следующее

определение ЛН: «заболевание глазной поверхности, вызванное снижением популяции и/или функции лимбальных стволовых клеток, приводящим к нарушению процессов репарации эпителия роговицы. Данное состояние характеризуется развитием конъюнктивализации роговицы и/или наличием других признаков эпителиальной дисфункции, таких как персистирующие или рецидивирующие эрозии роговицы с неоваскуляризацией или без нее, воспаление и рубцевание глазной поверхности».

По мнению исследователей «Limbal Stem Cell Working Group», при диагностике ЛН наряду с биомикроскопией глазной поверхности должны проводиться такие методы исследования, как импрессионная цитология и прижизненная конфокальная сканирующая лазерная микроскопия. Эти методы обеспечивают точную диагностику наличия или отсутствия ЛН, в том числе и при решении вопроса о показаниях к хирургическому лечению [94].

1.2. История изучения и современные представления о патогенезе лимбальной недостаточности

Первое сообщение о роли лимбальной зоны в процессах регенерации роговицы сделала Ida Mann в 1941 г. [113]. В проведенных ею экспериментальных исследованиях на лабораторных животных впервые было высказано предположение о возможной миграции клеток зоны лимба в область дефекта эпителия роговицы. Это предположение нашло развитие в исследованиях M. Davanger и A. Evensen [79], показавших, что поддержание нормального эпителиального покрова роговицы в течение жизни и его регенерация при повреждениях происходит за счёт базальных клеток эпителия, расположенных в складках палисада (палисадах) Vogt роговичной части лимба. Однако лишь спустя 40 лет открытие нашло подтверждение в исследованиях R.C. Buck на мышах [62] и A.J.W. Huang на кроликах [101].

В работах R. Thoft в 1983 г. была окончательно сформулирована «x, y, z» гипотеза регенерации эпителия роговицы [147]. Согласно этой гипотезе,

базальные клетки эпителия роговичной части лимба являются стволовыми клетками эпителия роговичного фенотипа (лимбальные стволовые клетки - ЛСК). В результате ассиметричного деления ЛСК образуются базальные эпителиоциты роговой оболочки - транзиторные амплифицирующие клетки (ТА-клетки). Последние смещаются по базальной мембране центрипетально и дифференцируются в супрабазальные поверхностные клетки, обеспечивая восполнение нормального эпителиального покрова роговицы [63, 69]. ЛСК являются также естественным барьером для нарастания на роговицу конъюнктивального эпителия.

Полная гибель ЛСК (в результате травм, ожогов и заболеваний) клинически проявляется состоянием, получившим название лимбальной недостаточности. При этом в виду отсутствия источника регенерации роговичного эпителия на роговицу начинает медленно «покрываться» эпителием конъюнктивы с врастанием в строму поверхностных и глубоких сосудов (конъюнктивализация). Это сопровождается хроническим воспалением глазной поверхности, рецидивирующими и персистирующими эрозиями, изъязвлением и процессами рубцевания в роговице с формированием тотального фиброваскулярного паннуса (сосудистого бельма). Зрительная реабилитация пациентов с такими бельмами посредством традиционной оптической кератопластики обречена на рецидив помутнения [14, 36, 39]. Она возможна только после восстановления нормального эпителиального покрова роговицы посредством операции ЛТ в различных модификациях [37, 40, 45].

1.3. Методы хирургического лечения пациентов с лимбальной недостаточностью

Первые попытки восстановления эпителиального покрова при персистирующей эрозии роговицы были выполнены К ТИой в 1984 г. [148]. В исследовании проводилась трансплантация кадаверных донорских корнеосклеральных лоскутов, покрытых роговичным эпителием, в зону лимба. В

отдаленном периоде наблюдения отмечали эпителизацию роговицы в зоне эрозии. В 1989 г. K. Kenyon и S. Tseng [103] была предложена и клинически апробирована оригинальная операция аутологичной лимбальной трансплантации, ставшая на долгое время основным эффективным способом лечения односторонней ЛН. С развитием технологий различными исследователями разрабатывались новые модификации операции ЛТ, которые впоследствии в 1996 г. систематизировались в работе E. Holland и G. Schwarz [98], а в 2011 г. международным комитетом по реабилитации пациентов с заболеваниями глазной поверхности была сформирована классификация хирургических операций по восстановлению глазной поверхности, имеющая актуальность и в настоящее время [81]. Основные положения данной классификации отражены в таблице 1.

Таблица 1

Международная классификация хирургических

операций по восстановлению глазной поверхности (S. Daya, E. Holland, 2011 г.)

Методика трансплантации Аббревиатура Донор Ткань для трансплантации

Конъюнктивально- лимбальная аутотрансплантация CLAU Парный глаз пациента Лимб и конъюнктива

Конъюнктивально-лимбальная аллотрансплантация (от мертвого донора) c-CLAL Кадаверный глаз Лимб и конъюнктива

Конъюнктивально-лимбальная аллотрансплантация (от живого донора-родственника) lr-CLAL Глаз живого родственника Лимб и конъюнктива

Конъюнктивально-лимбальная аллотрансплантация (от живого донора (не родственника)) lnr-CLAL Глаз живого донора (не родственника) Лимб и конъюнктива

Кератолимбальная аутотрансплантация KLAU Парный глаз пациента Лимб и роговица

Кератолимбальная аллотрансплантация KLAL Кадаверный глаз Лимб и роговица

Наибольшее распространение в мире получила операция конъюнктивально-лимбальная аутотрансплантация (Conjunctival Limbal Autograft - CLAU). Данную операцию выполняют по технологии, предложенной K. Kenyon и S. Tseng в 1989 г. с возможными незначительными модификациями [42, 43, 44, 103]. Источником донорской ткани является второй глаз пациента при условии отсутствия на нем признаков воспаления, полной интактности роговицы и лимба, а также отсутствия в анамнезе каких-либо повреждений и хронических заболеваний глазной поверхности. Недостатками данной методики является площадь «забираемого» донорского материала - до половины окружности лимба, что несет в себе все же определенный риск развития ятрогенной ЛН.

В случае двухсторонней лимбальной недостаточности, когда выполнение операции CLAU невозможно ввиду отсутствия жизнеспособного аутологичного источника тканей лимба, возможно выполнение конъюнктивально-лимбальной аллотрансплантации (CLAL) [42, 43]. Источником донорской ткани могут быть живые родственники (lr-CLAL), не родственники (lnr-CLAL) и кадаверные глаза (c-CLAL). Недостатками данной операция является высокий риск отторжения пересаженного аллогенного роговично-конъюнктивального трансплантата, что требует применения продолжительной иммуносупрессивной терапии.

1.4. Клеточные технологии как перспективное направление в лечении лимбальной недостаточности

ЛТ, являясь важнейшим звеном зрительной реабилитации пациентов с патологией роговицы, обусловленной дисфункцией столовых клеток лимба, связана все же с определенными рисками для живых доноров. В последние годы в экспериментальной и клинической офтальмологии все больше внимания уделяется изучению новой технологии, которая позволила бы практически исключить эти риски [42, 43, 99, 100]. В 1997 г. G. Pelligrini с соавт. [110] впервые были опубликованы результаты успешного устранения односторонней ЛН путем трансплантации аутологичных лимбальных стволовых клеток, культивированных

in vitro на фидерном слое фибробластов линии 3Т3, с последующей их трансплантацией на роговицу на амниотической мембране (АМ) (cultivated limbal epithelium transplantation - CLET). В данной методике достаточная площадь донорской лимбальной ткани составляет до 1 часа условного циферблата, что позволяет практически полностью избежать риска возникновения ятрогенной ЛН и других осложнений на донорском глазу. Положительные результаты клинического применения данной операции получены и в исследованиях R. Tsai с соавт. и P. Rama с соавт. [109, 152]. В данных работах была доказана важность наличия как можно большего числа ЛСК, экспрессирующих транскрипционный фактор ANp63a (маркер стволовых эпителиальных клеток), что оказывает положительное влияние на долгосрочную эффективность применения технологии CLET. В настоящее время разработаны и успешно применяются на практике методы культивирования лимбальных стволовых клеток на АМ, исключающие использование для этого среды 3Т3 фибробластов ввиду возможных серьезных побочных последствий, поскольку клетки постоянных трансформированных линий обладают свойствами малигнизации [76]. Наряду с этим, разработаны методики устранения двухсторонней ЛН путем трансплантации культивированных аллогенных ЛСК [72, 145]. По данным литературы, эффективность операции CLET в настоящий момент составляет 45 - 100% и зависит от исходной степени ЛН и имеющихся сопутствующих патологических состояний глазной поверхности [110, 122].

Источником клеточного материала для операции CLET являются ауто- и аллогенные, а также кадаверные фрагменты лимбальной ткани, из которых в условиях in vitro миграционным или ферментативным путем происходит выделение ЛСК [22, 31, 108, 109, 110]. ЛСК представляют собой клеточную популяцию с высоким пролиферативным потенциалом, которая обеспечивает эффективную регенерацию и восстановление роговицы [87, 105, 119, 134]. Данный тип клеток обладает способностью к длительному поддерживанию процессов восстановления эпителия роговицы, что продемонстрировано в экспериментах по трансплантации ЛСК на глазную поверхность с целью

устранения ЛН [109]. При выделении в условиях in vitro ЛСК представляют собой не монокультуру, содержащую лишь стволовые клетки роговичного эпителия, а смешанную культуру клеток, содержащую мезенхимально-подобные фибробласты стромы лимба, меланоциты, клетки Лангерганса, макрофаги, клетки эндотелия сосудов [65, 90, 106, 116]. В результате различных исследований в условиях in vitro были обнаружены маркеры, подтверждающие как наличие признаков стволовости, так и возможности эпителиальной дифференцировки у ЛСК. К таким иммуногистохимическим маркерами относятся: Abcg2 [49, 121], Abcb5 [48, 108], Cytokeratin 15 [78], Lgr5 [114], Tcf4 [149], CD 157 [67], CD 71 low/Integrin a6 high [89], TrkA [120], N-Cadherin [116].

Альтернативный способ устранения ЛН, не требующий культивирования ЛСК in vitro, позволяющий избежать больших затрат и необходимости наличия оснащенной по современным требованиям лаборатории клеточных технологий, впервые был описан в 2012 г. в работе V. Sangwan с соавт. [140]. Способ заключается в заборе донорского биоптата лимбальной ткани размерами 2 на 2 мм, его измельчении и размещении на АМ с последующей трансплантацией на глазную поверхность (simple limbal epithelial transplantation - SLET). В 2013 г. этой же командой специалистов было опубликовано исследование успешной трансплантации на АМ микроучастков аллогенной лимбальной ткани с одновременной иммуносупрессией в случае двухсторонней ЛН [59]. Проведенные клинические исследования доказали простоту исполнения, эффективность и экономичность операции SLET. Однако данная методика исключает возможность проведения анализа количества ЛСК, экспрессирующих транскрипционный фактор ANp63a, что не позволяет провести предоперационный прогноз сохранения долгосрочного эффекта после операции.

В настоящее время особое внимание уделяют нерешенной пока проблеме выбора оптимального носителя для трансплантации культивированных ex vivo ЛСК [81]. Таким самым распространенным в мире носителем является АМ человека [9, 28, 73, 96, 110, 124, 150].

АМ - внутренняя оболочка плодного мешка. Первые упоминания об использовании АМ в клинической практике относятся к работам J. Davis от 1910 г. [80]. В офтальмологии АМ впервые применил A. De Roth в 1940 г. при устранении симблефарона путем конъюнктивальной пластики [82]. В нашей стране первым возможность применения АМ в клинической офтальмологии описал в своих работах Ю. Батманов с соавт. [2]. АМ использовалось как покрытие при герпетических язвах роговицы и ожогах. Тем не менее, достаточно продолжительное время применение АМ не получало широкого распространения в офтальмологии. Лишь после работ J. Kim и S. Tseng [104] об успешном устранении ЛН в эксперименте на лабораторных животных стало наблюдаться повышение интереса к экспериментальному и клиническому применению АМ в офтальмохирургии, в том числе как материала для трансплантации культивированных in vitro ЛСК [38, 41, 42, 43].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Карпович Вадим Валерьевич, 2020 год

- 22 с.

33. Федоров, С.Н. Сквозное протезирование роговой оболочки при ожоговых бельмах / С.Н. Федоров, В.К. Зуев // Вестн. офтальмологии. - 1976. - № 4. - С. 39-44.

34. Флетчер, Р. Клиническая эпидемиология. Основы доказательной медицины / Р. Флетчер, С. Флетчер, Э. Вагнер; пер. с англ. - М.: Медиа Сфера, 1998. - 352 с.

35. Халимов, А.Р. Офтальмологический раствор для кросслинкинга коллагена роговицы с рибофлавином и хитозаном / А.Р. Халимов // Вестн. Оренбург. гос. ун-та. - 2012. - № 12 (148). - С. 223-224.

36. Черныш, В.Ф. О современных возможностях лечения и зрительной реабилитации при тяжелом ожоге глаза. Клиническое наблюдение / В.Ф. Черныш // Материалы Х съезда офтальмологов России - М., 2015. - С. 227.

37. Черныш, В.Ф. Лимбальная трансплантация в остром и отдаленном периодах ожоговой болезни глаз (боевые повреждения органа зрения) / В.Ф. Черныш, Э.В. Бойко, М.М. Шишкин // Материалы юбил. науч.-практ. конф., посвящ. 185-летию основания первой в России кафедры офтальмологии 20-летию создания науч.-исслед. лаб. микрохирургии глаза и контакт. коррекции зрения при кафедре. - СПб.: Изд-во ВМедА, 2003. - С. 105-106.

38. Черныш, В.Ф. О показаниях к применению амниотической мембраны в лечении повреждений роговицы при ожогах глаз (боевые повреждения органа зрения) / В.Ф. Черныш, Э.В. Бойко // Материалы юбил. науч.-практ. конф., посвящ. 185-летию основания первой в России кафедры офтальмологии 20-летию создания науч.-исслед. лаб. микрохирургии глаза и контакт. коррекции зрения при кафедре. - СПб.: Изд-во ВМедА, 2003. - С. 102-104.

39. Черныш, В.Ф. О тактике лечения и зрительной реабилитации при остром тяжелом щелочном ожоге глаза. Случай из практики / В.Ф. Черныш, Э.В. Бойко // Офтальмохирургия. - 2013. - № 4. - С. 56-59.

40. Черныш, В.Ф. Об эффективности пересадки стволовых клеток роговичного эпителия в лечении пациентов с тотальными послеожоговыми бельмами роговицы / В.Ф. Черныш, Э.В. Бойко, В.М. Долгих // Федоровские чтения - 2007: Сб. тез. юбил. науч.-практ. конф. - М., 2007. - С. 201-202.

41. Черныш, В.Ф. Об эффективности трансплантации амниотической мембраны как метода лечения ожоговых повреждений роговицы с частичной лимбальной недостаточностью / В.Ф. Черныш, Э.В. Бойко // Федоровские чтения - 2004. Новые технологии в лечении забол. роговицы: Сб. Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. - М., 2004. - С. 384-390.

42. Черныш, В.Ф. Ожоги глаз. Состояние проблемы и новые подходы / В.Ф. Черныш, Э.В. Бойко. - СПб.: ВМедА, 2008. - 136 а

43. Черныш, В.Ф. Ожоги глаз. Состояние проблемы и новые подходы / В.Ф. Черныш, Э.В. Бойко. - М.: ГОТАР-Медиа, 2017. - 184 а

44. Черныш, В.Ф. Пересадка стволовых клеток роговичного эпителия при лечении тяжелых химических ожогов глаз в эксперименте / В.Ф. Черныш, М.М.

Шишкин, Р.Д. Березин // Офтальмология на рубеже веков: Сб. науч. ст. юбил. науч. конф., посвящ. 80-летию проф. В.В. Волкова. - СПб., 2001. - С. 389.

45. Черныш, В.Ф. Сквозная кератопластика в сочетании с лимбальной трансплантацией в реабилитации пациентов с тотальными бельмами роговицы ожогового генеза / В.Ф. Черныш, Э.В. Бойко, В.М. Долгих // Вестн. офтальмологии. - 2007. - Т. 123, № 1. - С. 14-17.

46. Юнкеров, В.И. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований / В.И. Юнкеров, С.Г. Григорьев. - СПб.: ВМедА, 2005. - 292 с.

47. A contact lens-based technique for expansion and transplantation of autologous epithelial progenitors for ocular surface reconstruction / N. Di Girolamo, M. Bosch, K. Zamora [et al.] // Transplantation. - 2009. - Vol. 87, № 10. - P. 1571-1578. -DOI 10.1097/TP.0b013e3181a4bbf2.

48. ABCB5 is a limbal stem cell gene required for corneal development and repair / B.R. Ksander, P.E. Kolovou, B.J. Wilson [et al.] // Nature. - 2014. - Vol. 511, № 7509. - P. 353-357. - DOI 10.1038/nature13426.

49. ABCG2 transporter identifies a population of clonogenic human limbal epithelial cells / C.S. de Paiva, Z. Chen, R.M. Corrales [et al.] // Stem Cells. - 2005. -Vol. 23, №1. - P. 63-73. - DOI 10.1634/stemcells.2004-0093.

50. Acute chemical eye injury and limbal stem cell deficiency - A prospective study in the United Kingdom / S. Ghosh, B. Salvador-Culla, A. Kotagiri [et al.] // Cornea. - 2019. - Vol. 38, № 1. - P. 8-12. - DOI 10.1097/IC0.0000000000001739.

51. Adhesion and metabolic activity of human corneal cells on PCL based nanofiber matrices / P. Stafiej, F. Küng, D. Thieme [et al.] // Mater. Sci. Eng. C. Mater. Biol. Appl. - 2017. - Vol. 71. - P. 764-770. - DOI 10.1016/j.msec.2016.10.058.

52. Amniotic epithelial stem cell biocompatibility for electrospun poly(lactide-co-glycolide), poly(e-caprolactone), poly(lactic acid) scaffolds / V. Russo, L. Tammaro, L. Di Marcantonio [et al.] // Mater. Sci. Eng. C. Mater. Biol. Appl. - 2016. - Vol. 69. -P. 321-329. - DOI 10.1016/j.msec.2016.06.092.

53. Amniotic membrane transplantation for partial limbal stem cell deficiency / D.F. Anderson, P. Ellies, R.T. Pires, S.C. Tseng // Br. J. Ophthalmol. - 2001. - Vol. 85, № 5. - P. 567-575. - DOI 10.2147/OPTH.S181035.

54. Ashkenas, J. The Extracellular Matrix in Epithelial Biology: Shared Molecules and Common Themes in Distant Phyla / J. Ashkenas, J. Muschler, M.J. Bissell // Dev. Biology. - 1996. - Vol. 180, № 2. - P. 433-434. - DOI 10.1006/dbio.1996.0317.

55. Autologous fibrin-cultured limbal stem cells permanently restore the corneal surface of patients with total limbal stem cell deficiency / P. Rama, S. Bonini, A. Lambiase [et al.] // Transplantation. - 2001. - Vol. 72. - P. 1478-1485. - DOI 10.1097/00007890-200111150-00002.

56. Autologous transplantation of rabbit limbal epithelia cultured on fibrin gels for ocular surface reconstruction / M. Talbot, P. Carrier, C.J. Giasson [et al.] // Mol. Vis. - 2006. - Vol. 12. - P. 65-75.

57. Baradaran-Rafii, A. Cellular Response of Limbal Stem Cells on Polycaprolactone Nanofibrous Scaffolds for Ocular Epithelial Regeneration / A. Baradaran-Rafii, E. Biazar, S. Heidari-keshel // Cur. Eye Res. - 2016. - Vol. 41, № 3. -P. 326-333. - DOI 10.3109/02713683.2015.1019004.

58. Barradon, Y. The epidermal stem cells: an overview / Y. Barradon // Dev. Biol. - 1993. - Vol. 4. - P. 209-215.

59. Bhalekar, S. Successful management of immunological rejection following allogeneic simple limbal epithelial transplantation (SLET) for bilateral ocular burns / S. Bhalekar, S. Basu, V.S. Sangwan // BMJ Case Rep. - 2013. - P. 1-4. - DOI 10.1136/bcr-2013-009051.

60. Biological efficacy of silk fibroin nanofiber membranes for guided bone regeneration / K.H. Kim, L. Jeong, N.H. Park [et al.] // J. Biotechnol. - 2005. - Vol. 120, № 3. - P. 327-339. - DOI 10.1016/j.jbiotec.2005.06.033.

61. Bone tissue engineering using polycaprolactone scaffolds fabricated via selective laser sintering / J.M. Williams, A. Adewunmi, R.M. Schek [et al.] //

Biomaterials. - 2005. - Vol. 26, № 23. - P. 4817-4827. - DOI 10.1016/j.biomaterials.2004.11.057.

62. Buck, R.C. Cell migration in repair of mouse corneal epithelium / R.C. Buck // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 1979. - Vol. 18. - P. 767-784.

63. Buck, R.C. Measurement of centripetal migration of normal corneal epithelial cells in the mouse / R.C. Buck // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 1985. - Vol. 26. - P. 1296-1299.

64. Carbodiimide cross-linked amniotic membranes for cultivation of limbal epithelial cells / D.H. Ma, J.Y. Lai, H.Y. Cheng [et al.] // Biomaterials. - 2010. - Vol. 31, № 25. - P. 6647-6658. - DOI 10.1016/j.biomaterials.2010.05.034.

65. Cell adhesion molecules and stem cell niche interactions in the limbal stem cell niche / N. Polisetti, M. Zenkel, J. Menzel-Severing [et al.] // Stem Cells. 2016. -Vol. 34, № 1. - P. 203-219. - DOI 10.1002/stem.2191.

66. Cellular response of limbal epithelial cells on electrospun poly-e-caprolactone nanofibrous scaffolds for ocular surface bioengineering: a preliminary in vitro study / S. Sharma, S. Mohanty, D. Gupta [et al.] // Molecular Vision. - 2011. -Vol.17. - P. 2898-2910.

67. CD38 and CD157 ectoenzymes mark cell subsets in the human corneal limbus / A.L. Horenstein, F. Sizzano, R. Lusso [et al.] // Mol. Med. - 2009. - Vol. 15, № 3-4. - P. 76-84. - DOI 10.2119/molmed.2008.00108.

68. Characterization and functionality of CXCR4 chemokine receptor and SDF-1 in human corneal fibroblasts / T. Bourcier, T. Berbar, S. Paquet [et al.] // Mol. Vis. - 2003. - Vol. 9. - P. 96-102.

69. Chen, J.J. Corneal epithelial wound healing in partial limbal deficiency / J.J. Chen, S.C.G. Tseng // Invest. Ophtalmol. Vis. Sci. - 1990. - Vol. 31. - P. 13011314.

70. Chitosan-gelatin biopolymers as carrier substrata for limbal epithelial stem cells / A. De la Mata, T. Nieto-Miguel, López-Paniagua [et al.] // J Mater Sci. Mater. Med. - 2013. - Vol. 24, № 12. - P. 2819-2829. - DOI 10.1007/s10856-013-5013-3.

71. Clinical outcomes of xeno-free expansion and transplantation of autologous ocular surface epithelial stem cells via contact lens delivery: a prospective case series / S. Bobba, S. Chow, S. Watson, N. Di Girolamo // Stem Cell Res. Ther. - 2015. - Vol. 12, № 6. - P. 1-17. - DOI 10.1186/s13287-015-0009-1.

72. Comparison of human denuded amniotic membrane and porcine small intestine submucosa as scaffolds for limbal mesenchymal stem cells / L.I. Sous Naasani, C. Rodrigues, J.G. Azevedo [et al.] // Stem Cell Rev. 2018. - 2018. - Vol. 10. - P. 12015-12018. - DOI 10.1007/s12015-018-9819-8.

73. Comparison of intact and denuded amniotic membrane as a substrate for cell-suspension culture of human limbal epithelial cells / N. Koizumi, H. Rigby, N.J. Fullwood [et al.] // Graefes Arch. Clin. Exp. Ophthalmol. - 2007. - Vol. 245. - P. 123134. - DOI 10.1007/s00417-005-0095-3

74. Composite cell support membranes based on collagen and polycaprolactone for tissue engineering of skin / N.T. Dai, M.R. Williamson, N. Khammo [et al.] // Biomaterials. - 2004. - Vol. 25. - P. 4263-4271. - DOI 10.1016/j.biomaterials.2003.11.022.

75. Cultivation and characterization of limbal epithelial stem cells on contact lenses with a feeder layer: toward the treatment of limbal stem cell deficiency / A. Gore, V. Horwitz, H. Gutman [et al.] // Cornea. - 2014. - Vol. 33, № 1. - P. 65-71. - DOI 10.1097/ITO.0000000000000002.

76. Culture of limbal stem cells on human amniotic membrane / M.E. Rendal-Vázquez, A. San-Luis-Verdes, M.T. Yebra-Pimentel-Vilar [et al.] // Cell Tissue Bank. -2012. - Vol.13. - P. 513-519. - DOI 10.1007/s10561-012-9300-x.

77. Cultured human ocular surface epithelium on therapeutic contact lenses / N.D. Girolamo, J. Chui, D. Wakefield, M.T. Coroneo // Br. J. of Ophthalmol. - 2007. -Vol. 91, № 4. - P. 459-464. - DOI 10.1136/bjo.2006.103895.

78. Cytokeratin 15 can be used to identify the limbal phenotype in normal and diseased ocular surfaces / S. Yoshida, S. Shimmura, T. Kawakita [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2006. - Vol. 47, № 11. - P. 4780-4786. - DOI 10.1167/iovs.06-0574.

79. Davanger, M. Role of the pericorneal papillary structure in renewal of corneal epithelium / M. Davanger, A. Evensen // Nature. - 1971. - Vol. 229. - P. 560561.

80. Davis, J. Skin transplantation with a review of 550 cases at the Johns Hopkins Hospital / J. Davis // Johns Hopkins Med. J. - 1910. - Vol. 15, - P. 307-396.

81. Daya, S.M. Cornea Society nomenclature for ocular surface rehabilitative procedures / S.M. Daya, C.C. Chan, E.J. Holland // Cornea. - 2011. - Vol. 30., № 10 -P. 1115-1119. - DOI 10.1097/IC0.0b013e318207f135.

82. De Roth, A. Plastic repair of conjunctival defects with fetal membranes / A De Roth // Arch. Ophthalmol. - 1940. - Vol. 23. - P. 522-525.

83. Decellularized corneal lenticule embedded compressed collagen: toward a suturable collagenous construct for limbal reconstruction / H. Hong, M.I. Huh, S.M. Park [et al.] // Biofabrication. - 2018. - Vol. 10, № 4. - P. 23. - DOI 10.1088/1758-5090/aad1a4.

84. Design of poly-epsilon-caprolactone nanospheres coated with bioadhesive hyaluronic acid for ocular delivery / S. Barbault-Foucher, R. Gref, P. Russo [et al.] // J. Control Release. - 2002. - Vol. 83. - P. 365-375. - DOI 10.1016/s0168-3659(02)00207-9.

85. Development of a surface-modified contact lens for the transfer of cultured limbal epithelial cells to the cornea for ocular surface diseases / P. Deshpande, M. Notara, N. Bullet [et al.] // Tissue Eng. Part A 15. - 2009. - P. 2889-2902. - DOI 10.1089/ten.TEA.2008.0528.

86. Dua, H.S. Allo-limbal transplantation in patients with limbal stem cell deficiency / H.S. Dua, A. Azuara-Blanco // Br. J. Ophthalmol. - 1999. - Vol. 83, № 4. -P. 414-419. - DOI 10.1136/bjo.83.4.414

87. Ebato, B. Comparison of limbal and peripheral human corneal epithelium in tissue culture / B. Ebato, J. Friend, R.A. Thoft. // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. -1988. - Vol. 29, № 10. - P.1533-1537.

88. Electrospun poly(epsiloncaprolactone)/gelatin nanofibrous scaffolds for nerve tissue engineering / L. Ghasemi-Mobarakeh, M.P. Prabhakaran, M. Morshed [et

al.] // Biomaterials. - 2008. - Vol. 29. - P. 4532-4539. - DOI 10.1016/j.biomaterials.2008.08.007.

89. Enrichment of corneal epithelial stem/progenitor cells using cell surface markers, integrin alpha6 and CD71 / R. Hayashi, M. Yamato, T. Saito [et al.] // Biochem. Biophys. Res. Com. - 2008. - Vol. 367, № 2. - P. 256-263. - DOI 10.1016/j.bbrc.2007.12.077.

90. Existence of small slow-cycling Langerhans cells in the limbal basal epithelium that express ABCG2 / W. Chen, K. Hara, Q. Tian [et al.] // Exp. Eye Res. -2007. - Vol. 84, № 4. - P. 626-634. - DOI 10.1016/j.exer.2006.11.006.

91. Forrester, J.V. Corneal Transplantation: An Immunological Guide to the Clinical Problem / J.V. Forrester, L. Kuffova. - London: Imperial College Press, 2004. - P. 194.

92. Geggel, H.S. Collagen gel for ocular surface. Invest Ophthalmol / H.S. Geggel, J. Frienid, R.A. Thoft // Vis. Sci. - 1985. - Vol. 26, № 6- P. 901-905.

93. Global causes of blindness and distance vision impairment 1990-2020: a systematic review and meta-analysis / S.R. Flaxman, R.R.A. Bourne, S. Resnikoff [et al.] // Lancet Glob. Health. - 2017. - Vol. 5, № 12. - P. 1221-1234. - DOI 10.1016/S2214-109X(17)30393-5.

94. Global consensus on definition, classification, diagnosis, and staging of limbal stem cell deficiency / S.X. Deng, V. Borderie, C.C. Chan [et al.] // Cornea. -2019. - Vol. 38, № 3. - P. 364-437. - DOI 10.1097/ITO.0000000000001820.

95. Global data on visual impairments 2010 / World Health Organization, Geneva. - 2012. - P. 14.

96. Grueterich, M. Ex vivo expansion of limbal epithelial stem cells: amniotic membrane serving as a stem cell niche / M. Grueterich, E.M. Espana, S.C. Tseng // Surv. Ophthalmol. - 2003. - Vol. 4, № 6. - P. 631-646. - DOI 10.1016/j.survophthal .2003.08.003.

97. Higa, K. Recent advances in cultivated epithelial transplantation / K. Higa, J. Shimazaki // Cornea. - 2008. - Vol. 27, Suppl. 1. - P. 41-47. - DOI 10.1097/ICO.0b013e31817f358e.

98. Holland, E.J. The evolution of epithelial transplantation for severe ocular surface disease and a proposed classification system / E.J. Holland, G.S. Schwartz // Cornea. - 1996. - Vol. 15. - P. 549-556.

99. Holland, E.J. Epithelial stem-cell transplantation for severe ocular-surface disease / E.J. Holland, G.S. Schwartz // N. Engl. J. Med. - 1996. - Vol. 340, № 22. - P. 1752-1753.

100. Holland, E.J. Ocular Surface Disease. Medical and Surgical Management / E.J. Holland, M.J. Mannis. - NY: Springer, 2002. - P. 29-31.

101. Huang, A.J. Corneal wound healing in the absence of limbal epithelium / A.J. Huang, S.C.G Tseng // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 1991. - Vol. 32, № 1. - P. 96-105.

102. In vitro characterization and ex vivo surgical evaluation of human hair keratin films in ocular surface reconstruction after sterilization processing / M. Borrelli, S. Reichl, Y. Feng [et al.] // J. Mater. Sci. Mater. Med. - 2013. - Vol. 24, № 1. - P. 221230. - DOI 10.1007/s10856-012-4774-4.

103. Kenyon, K.R. Limbal autograft transplantation for ocular surface disorders / K.R Kenyon, S.C.G. Tseng // Ophthalmology. - 1989. - Vol. 96, № 5. - P. 709-722.

104. Kim, J.C. Transplantation of preserved human amniotic membrane for reconstruction in severely damaged rabbit corneas / J.C. Kim, S.C.G. Tseng // Cornea. -1995. - Vol. 14. - P. 473-484.

105. Lehrer, M.S. Strategies of epithelial repair: modulation of stem cell and transit amplifying cell proliferation / M.S. Lehrer, T.T. Sun, R.M. Lavker // J. Cell Sci. - 1998.- Vol. 111, № 19. - P. 2867-2875.

106. Mesenchymal stem cells derived from human limbal niche cells / G.G. Li, Y.T. Zhu, H.T Xie [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2012. - Vol. 53, № 9. - P. 5686-5697. - DOI 10.1167/iovs.

107. Lim, A.S. Mass blindness has shifted from infection (onchocerciasis, trachoma, corneal ulcers) to cataract / A.S. Lim // Ophthalmologica. - 1997. - Vol. 211. № 4. - P. 270. - DOI 10.1159/000310806.

108. Limbal stem cells: identity, developmental origin, and therapeutic potential / G. Gonzalez, Y. Sasamoto, B.R. Ksander [et al.] // Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol.

- 2018. - Vol. 7, № 2. - P. 1-23. - DOI 10.1002/wdev.303.

109. Limbal stem-cell therapy and long-term corneal regeneration / P. Rama, S. Matuska, G. Paganoni [et al.] // N. Engl. J. Med. - 2010. - Vol. 363, № 2. - P. 147-155.

- DOI 10.1056/NEJMoa0905955.

110. Long-term restoration of damaged corneal surfaces with autologous cultivated corneal epithelium / G. Pellegrini, C.E. Traverso, A.T. Franzi [et al.] // Lancet. - 1997. - Vol. 349, № 9057. - P. 990-993. - DOI 10.1016/S0140-6736(96)11188-0.

111. Lynn, A.K. Antigenity and immunogenicity of collagen / A.K. Lynn, I.V. Yannas, W. Bonfield // J. Biomed. Mater. Res. B. Appl. Biomater. - 2004. - Vol. 71, № 2. - P. 343-353. - DOI 10.1002/j bm.b.30096.

112. Magnitude, temporal trends, and projections of the global prevalence of blindness and distance and near vision impairment: a systematic review and meta-analysis / R.R. Bourne, S.R. Flaxman, T. Braithwaite [et al.] // Lancet Glob. Health 5. -2017. - P. 888-897. - DOI 10.1016/S2214-109X(17)30293-0.

113. Mann, I. Study of epithelial regeneration in the living eye / I. Mann // Br. J. Ophthalmol. - 1944. - Vol. 28. - P. 26-40.

114. Molecular profile of organ culture-stored corneal epithelium: LGR5 is a potential new phenotypic marker of residual human corneal limbal epithelial stem cells / J. Brzeszczynska, K. Ramaesh, B. Dhillon, J.A. Ross // Int. J. Mol. Med. - 2012. - Vol. 29, № 5. - P. 871-876. - DOI 10.3892/ijmm.2012.904.

115. Morrison, S.J. Regulatory mechanisms in stem cell biology / S.J. Morrison, N.M. Shah, D.J. Anderson // Cell. - 1997. - Vol. 88, № 3. - P. 287-298. - DOI 10.1016/s0092-8674(00)81867-x.

116. N-Cadherin is expressed by putative stem/progenitor cells and melanocytes in the human limbal epithelial stem cell niche / R. Hayashi, M. Yamato, H. Sugiyama [et al.] // Stem Cells. - 2007. - Vol. 25, № 2. - P. 289-296. - DOI 10.1634/stemcells.2006-0167.

117. Native and synthetic scaffolds for limbal epithelial stem cell transplantation / K.N. Nguyen, S. Bobba, A. Richardson [et al.] // Acta Biomater. - 2018. - Vol. 65. -P. 21-35. - DOI 10.1016/j.actbio.2017.10.037.

118. Nature and incidence of severe limbal stem cell deficiency in Australia and New Zealand / S. Bobba, N. Di Girolamo, R. Mills [et al.] // Clin. Exp. Ophthalmol. -2017. - Vol. 45, № 2. - P. 174-181. - DOI 10.1111/ceo.12813.

119. Navigating Market Authorization: The Path Holoclar Took to Become the First Stem Cell Product Approved in the European Union / G. Pellegrini, D. Ardigo, G. Milazzo [et al.] // Stem Cells Transl. Med.- 2018. - Vol. 7, № 1. - P. 146-154. - DOI 10.1002/sctm. 17-0003.

120. Nerve growth factor and its receptor TrkA serve as potential markers for human corneal epithelial progenitor cells / H. Qi, D.Q. Li, H.D. Shine [et al.] // Exp. Eye Res. - 2008. - Vol. 86, № 1. - P. 34-40. - DOI 10.1016/j.exer.2007.09.003.

121. Ocular surface epithelia contain ABCG2-dependent side population cells exhibiting features associated with stem cells / M.T. Budak, O.S. Alpdogan, M.J. Zhou [et al.] // Cell Sci. - 2005. - Vol. 118, №8. - P. 1715-1724. - DOI 10.1242/jcs.02279.

122. Ocular surface reconstruction using stem cell and tissue engineering / T. Nakamura, T. Inatomi, C. Sotozono [et al.] // Prog. Retin. Eye Res. - 2016. - Vol. 51. -P. 187-207. - DOI 10.1016/j.preteyeres.2015.07.003.

123. Pascolini, D. Global estimates of visual impairment: 2010 / D. Pascolini, S.P. Mariotti // Br. J. Ophthalmol. - 2012. - Vol. 96, № 5. - P. 614-618. - DOI 10.1136/bjophthalmol-2011-300539.

124. Phenotypic study of a case with successful transplantation of ex vivo expanded human limbal epithelium for unilateral total limbal stem cell deficiency / M. Grueterich, E.M. Espana, A. Touhami [et al.] // Ophthalmology. - 2002. - Vol. 109. -P. 1547-1552. - DOI 10.1016/s0161-6420(02)01105-3.

125. Physicochemical characterization of chitosan nanoparticles: electrokinetic and stability behavior / T. Lopez-Leon, E.L. Carvalho, B. Seijo [et al.] // Colloid Interface Sci. - 2005. - Vol. 283, № 2. - P. 344-351. - DOI 10.1016/j.jcis.2004.08.186.

126. Plastic compression of a collagen gel forms a much improved scaffold for ocular surface tissue engineering over conventional collagen gels / S. Mi, B. Chen, B. Wright, S.J. Connon // J. Biomed. Mater. Res. A. - 2010. - Vol. 95, № 2. - P. 447-453. - DOI 10.1002/jbm.a.32861.

127. Poly(ethylene glycol)-modified silk fibroin membrane as a carrier for limbal epithelial stem cell transplantation in a rabbit LSCD model / Y. Li, Y. Yang, L. Yang [et al.] // Stem Cell Res. Ther. - 2011. - Vol. 8, № 1. - P. 1-23. - DOI 10.1186/s13287-017-0707-y.

128. Porous silk fibroin film as a transparent carrier for cultivated corneal epithelial sheets / K. Higa, N. Takeshima, F. Moro [et al.] // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. - 2011. - Vol. 22, № 17. - P. 2261-2276. - DOI 10.1163/092050610X538218.

129. Propagation of limbal stem cells on polycaprolactone and polycaprolactone/gelatin fibrous scaffolds and transplantation in animal model / Sanie-F. Jahromi, M. Eghtedari, E. Mirzaei [et al.] // Bioimpacts. - 2020. - Vol. 10, № 1. - P. 45-54. - DOI 10.15171/bi.2020.06.

130. Properties of porcine and recombinant human collagen matrices for optically clear tissue engineering applications / Y. Liu, M. Griffith, M.A. Watsky [et al.] // Biomacromolecules. - 2006. - Vol. 7, № 6. - P. 1819-1828. - DOI 10.1021/bm060160o.

131. Puangsricharen, V. Cytologic evidence of corneal diseases with limbal stem cell deficiency / V. Puangsricharen // Ophthalmology. - 1995. - Vol. 102, № 10. -P. 1476-1485.

132. Recombinant human collagen for tissue engineered corneal substitutes / W. Liu, K. Merrett, M. Griffith [et al.] // Biomaterials. - 2008. - Vol. 29, № 9. - P. 11471158. - DOI 10.1016/j.biomaterials.2007.11.011.

133. Reinhard, T. Corneal Disease: Recent Developments in Diagnosis and Therapy / T. Reinhard, F. Larkin. - Heidelberg: Springer, 2013. - P. 121.

134. Relative proliferative rates of limbal and corneal epithelia. Implications of corneal epithelial migration, circadian rhythm, and suprabasally located DNA-

synthesizing keratinocytes / R.M. Lavker, G. Dong, S.Z. Cheng [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 1991. - Vol. 32, № 6. - P. 1864-1875.

135. Retinal tissue engineering using mouse retinal progenitor cells and a novel biodegradable, thin-film poly (ecaprolactone) nanowire scaffold / S. Redenti, S. Tao, J. Yang [et al.] // Ocul. Biol. Dis. Infor. - 2008. - Vol. 1, № 1. - P. 19-29. - DOI 10.1007/s12177-008-9005-3.

136. Review of alternative carrier materials for ocular surface reconstruction / Y. Feng, M. Borrelli, S. Reichl [et al.] // Cur. Eye Res. - 2014. - Vol. 39, № 6. - P. 541-552. - DOI 10.3109/02713683.2013.853803.

137. Sefat, F. Production, sterilisation and storage of biodegradable electospun PLGA membranes for delivery of limbal stem cells of the cornea / F. Sefat // Procedia Engineering. - 2013. - Vol. 59. - P. 101-116.

138. Seyed, M.A. Evaluation of an improved chitosan scaffold cross-linked with polyvinyl alcohol and amine coupling through 1-Ethyl-3-(3-Dimethyl Aminopropyl)-Carbodiimide (EDC) and 2 N-Hydroxysuccinimide (NHS) for corneal applications / M.A. Seyed, K. Vijayaraghavan // Open Access Maced J. Med. Sci. - 2018. - Vol. 6, № 9. - P. 1561-1570. - DOI 10.3889/oamjms.2018.322.

139. Shortt, A.J. Corneal stem cells in the eye clinic / A.J. Shortt, S.J. Tuft, J.T. Daniels // Br. Med. Bull. - 2011. - Vol. 100. - P. 209-225. - DOI 10.1093/bmb/ldr041.

140. Simple limbal epithelial transplantation (SLET): a novel surgical technique for the treatment of unilateral limbal stem cell deficiency / V.S. Sangwan, S. Basu, S. MacNeil, D. Balasubramanian // Br. J. Ophthalmol. - 2012. - Vol. 96. - P. 931-934. -DOI 10.4103/ijo.IJO_117_19.

141. Simplifying corneal surface regeneration using a biodegradable synthetic membrane and limbal tissue explants / P. Deshpande, C. Ramachandran, F. Sefat, [et al.] // Biomaterials. - 2013. - Vol. 34, № 21. - P. 5088-5106. - DOI 10.1016/j.biomaterials.2013.03.064.

142. Surface-modified electrospun poly(epsilon-caprolactone) scaffold with improved optical transparency and bioactivity for damaged ocular surface

reconstruction / S. Sharma, D. Gupta, S. Mohanty [et al.] // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2014. - Vol. 55, № 2. - P. 899-907. - DOI 10.1167/iovs.

143. The control of epidermal stem cells (holoclones) in the treatment of massive full-thickness burns with autologous keratinocytes cultured on fibrin / G. Pellegrini, R. Ranno, G. Stracuzzi [et al.] // Transplantation. - 1999. - Vol. 768, № 6. -P. 868-879.

144. The development of a serum-free derived bioengineered conjunctival epithelial equivalent using an ultrathin poly (s-caprolactone) membrane substrate / L.P. Ang, Z.Y. Cheng, R.W. [et al.] // Beuerman Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 2006. -Vol. 47. - P. 105-112. - DOI 10.1167/iovs.05-0512.

145. The effect of culture medium and carrier on explant culture of human limbal epithelium: A comparison of ultrastructure, keratin profile and gene expression / M. Pathak, O.K. Olstad, L. Drolsum [et al.] // Exp. Eye Res. - 2016. - Vol. 153. - P. 122-132. - DOI 10.1016/j.exer.2016.09.012.

146. Thermosensitive chitosan-based hydrogels releasing stromal cell derived factor-1 alpha recruit MSC for corneal epithelium regeneration / Q. Tang Q, C. Luo, B. Lu [et al.] // Acta Biomater. - 2017. - Vol. 61. - P. 101-113. - DOI 10.1016/j.actbio.2017.08.001.

147. Thoft, R.A. The X, Y, Z hypothesis of corneal epithelial maintenance / R.A. Thoft, J. Friend // Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. - 1983. - Vol. 24. - P. 1442-1443.

148. Thoft, R.A. Keratoepithelioplasty / R.A. Thoft // Am. J. Ophthalmol. -1984. - Vol. 97, № 1. - P. 1-6.

149. Transcription factor TCF4 maintains the properties of human corneal epithelial stem cells / R. Lu, Y. Qu, J. Ge [et al.] // Stem Cells. - 2012. - Vol. 30, № 4. - P.753-761. - DOI 10.1002/stem.1032.

150. Transplantation of human limbal epithelium cultivated on amniotic membrane for the treatment of severe ocular surface disorders / J. Shimazaki, M. Aiba, E. Goto [et al.] // Ophthalmology. - 2002. - Vol. 109. - P. 1285-1290. - DOI 10.1016/s0161 -6420(02)01089-8.

151. Treatment of severe ocular-surface disorders with corneal epithelial stem-cell transplantation / K. Tsubota, Y. Satake, M. Kaido [et al.] // N. Engl. J. Med. - 1999. - Vol. 340, № 22. - P. 1697-703. - DOI 10.1056/NEJM199906033402201.

152. Tsai, R.J. Reconstruction of damaged corneas by transplantation of autologous limbal epithelial cells / R.J. Tsai, L.M. Li, J.K. Chen // N. Engl. J. Med. -2000. - Vol. 343, № 2. - P. 86-93. - DOI 10.1056/NEJM200007133430202.

153. Tseng, S.C.G. Regulation and clinical implication of corneal epithelial stem cell / S.C.G. Tseng // Mol. Biol. Rep. - 1996. - Vol. 23. - P. 47-58.

154. Using poly(lactide-coglycolide) electrospun scaffolds to deliver cultured epithelial cells to the cornea / P. Deshpande, R. McKean, K.A. Blackwood [et al.] // Regen. Med. - 2010. - Vol. 5, № 3. - P. 395-401. - DOI 10.2217/rme.10.16.

155. Wagoner, M.D. Chemical injuries of the eye: current concepts in pathophysiology and therapy / M.D. Wagoner // Surv. Ophthalmol. - 1997. - Vol. 41, №4. - P. 275-313. - DOI 10.1016/s0039-6257(96)00007-0.

156. World Medical Association. World Medical Association Declaration of Helsinki: ethical principles for medical research involving human subjects // JAMA. -2013. - Vol. 310, №20. - P. 2191-2194. - DOI 10.1001/jama.2013.281053.

157. Xu, T. Efficacy, safety, and biodegradation of a degradable scleral buckle of chitosan-gelatin polymer in rabbits / T. Xu, Y. Yang, Y. Yu // Retina. - 2013. - Vol. 33, № 5. - P. 1062-1069. - DOI 10.1097/IAE.0b013e3182733a64.

158. Yamauchi, K. Cultivation of fibroblast cells on keratin coated substrata / K. Yamauchi, M. Maniwa, T. Mori // J. Biomater. Sci. Polym. Ed. - 1998. - Vol. 9, № 3. -P. 259-70. - DOI 10.1163/156856298x00640.