Исследование стабильности и РНК-связывающих свойств белка HFQ из Pseudomonas aeruginosa тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Мурина, Виктория Николаевна

• Мурина, Виктория Николаевна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Мурина, Виктория Николаевна

Оглавление

ВВЕДЕНИЕ

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Семейство Бш и Эш-подобных белков

Глава 2. Пространственная структура Бт/Бт-подобных белков

2.1. Первичная структура Бш-подобных белков

2.2. Четвертичная структура Бт/Бт-подобных белков

2.2.1. Белок АР-8т2 может быть гексамером и гептамером

2.2.2. Октамерный белок ЬвшЗ

2.2.3. Бактериальные белки - гексамеры

2.2.4. Некоторые Бш-подобные белки эукариот существуют в виде мономеров

2.3. Динамика четвертичной структуры Бт/Бт-подобных белков

2.4. Образование фибрилл

Глава 3. Функции Н1*1 в клетке

3.1. Жд имеет две РНК-связывающие поверхности

3.2. Взаимодействие Hfq с малыми регуляторными и матричными РНК

3.3. Взаимодействие Hfq с белками

3.4. Функции Hfq в нуклеоиде

ЧАСТЬ II. МЕТОДИЧЕСКАЯ

Глава 4. Материалы и методы

4.1. Методы генной инженерии и микробиологии

4.1.1. Электрофорез ДНК в агарозном геле

4.1.2. Получение плазмид с необходимыми мутациями

4.1.3. Полимеразная цепная реакция (ПЦР)

4.1.4. Очистка фрагментов ДНК

4.1.5. Получение компетентных клеток

4.1.6. Трансформация клеток

4.1.7. Выделение плазмидной ДНК

4.2. Биохимические методы при работе с белками

4.2.1. Экспрессия генов дикого типа и его мутантных форм

4.2.2. Выделение белка Шд дикого типа и его мутантных форм

4.2.3. Тепловая коагуляция термолабильных белков

4.2.4. Гидрофобная хроматография

4.2.5. Ионообменная хроматография

4.2.6. Аналитическая гель-фильтрация

4.2.7. Электрофорез белков в ПААГ в присутствии ДСН

4.2.8. Электрофорез белков в ПААГ в неденатурирующих условиях

4.2.9. Кристаллизация белков ЬЮ^

4.3. Определение стабильности белка ЬЩ дикого типа и его мутантных форм

4.3.1. Измерение спектров кругового дихроизма

4.3.2. Термофлуоресцентный анализ

4.3.3. Дифференциальная сканирующая микрокалориметрия

4.4. Определение и уточнение структур белков и комплексов белка ЕЩ с нуклеотидами

ЧАСТЬ III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1. Получение генетических конструкций мутантных белков Жя

Глава 2. Выделение белка Hfq дикого типа и его мутантных форм

Глава 3. Влияние произведенных замен на стабильность и олигомерное состояние белка

3.1. Влияние произведенных замен на стабильность вторичной структуры белка

3.2. Влияние произведенных замен на экспонированность гидрофобных областей на поверхности белка

3.3. Влияние произведенных замен на стабильность мутантных белков

3.4. Влияние произведенных замен на олигомерное состояние белка Н1с1

Глава 4. Кристаллизация мутантных белков

4.1. Использование метода термофлуоресцентного анализа для поиска условий

кристаллизации мутантных форм белка У55А, Б40А и УКНАЛЮБТ РаеНАц

Глава 5. Определение структур белков Hfq

Глава 6. Анализ полученных данных по стабильности и кристаллических структур

белков Шя

Глава 7. Проверка АТФазной активности белка

Глава 8. Кристаллизация препаратов с рибонуклезидтрифосфатами

Глава 9. Определение структур полученных комплексов

9.1. Структура комплекса с АТФ и с его нерасщепляемым аналогом АБР№

9.2. Структура комплекса Шя с ЦТФ

9.3. Структура комплекса Шя с УТФ

9.4. Жд не формирует устойчивых комплексов с ГТФ

Глава 10. Сравнение полученных нами структур комплексов НГц-рибонуклезидтрифосфатов с известными структурами комплексов НГд-олигоРНК

Глава 11. Модель связывания белка Hfq с РНК

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование стабильности и РНК-связывающих свойств белка HFQ из Pseudomonas aeruginosa»

ВВЕДЕНИЕ

Регуляция экспрессии генов (процесса преобразования наследственной информации от гена в белок или нетранслируемую РНК) определяет состояние и функцию каждой живой системы (клетки или организма). Важную роль в регуляции экспрессии генов играют взаимодействия белков с ДНК и РНК, которые определяют скорость и направление происходящих процессов. Структурно-функциональные исследования белков-регуляторов транскрипции и трансляции, а также детализация их взаимодействий со специфически узнаваемыми участками ДНК и РНК, имеет большую значимость для понимания регуляции экспрессии генов во всех живых организмах. Данная работа направлена на структурно-функциональные исследования бактериального РНК-связывающего белка Hfq, определение его стабильности и локализации специфических сайтов связывания РНК.

Белок Hfq был открыт в 1968 г. как клеточный белок E.coli HF-I (Host factor I), участвующий в репликативном цикле бактериофага Qß (Shapiro et al., 1968). Молекулярный вес белка - около 12,5 кДа, активной формой белка является гексамер. При выделении белка использовалась методика прогрева до 85°С для очистки белка HF-I от мезофильных клеточных белков, что показало высокую термостабильность белка (Franze de Fernandez et al., 1972). Однако термостабильность белка Hfq детально не изучалась и впервые была измерена в представленной работе для белка Hfq из мезофильной бактерии Pseudomonas aeruginosa.

Так как белок Hfq в растворе существует в виде гексамеров, где шесть мономеров белка объединены посредством сквозного ß-листа, то можно предположить, что стабильность белка определяется именно его четвертичной структурой. В данной работе исследовано влияние замен консервативных аминокислотных остатков, образующих межсубъединичные водородные связи, на стабильность белка и показано, что их удаление слабо влияет на термостабильность Hfq. Гель-фильтрацией и электрофорезом в «полунативных» условиях нами было показано существование динамического равновесия «мультимер*-»гексамер«->мономер». В комбинации с данными по дифференциальной сканирующей микрокалориметрии это позволило предложить модель плавления белка, в которой сначала происходит диссоциация гексамера до мономеров, а затем уже плавление отдельных мономеров.

Функционально белок Hfq является плейотропным пост-транскрипционным регулятором, который способен выступать в роли как положительного, так и

отрицательного регулятора трансляции многих бактериальных мРНК (Brennan and Link, 2007). Связывание белка Hfq с мРНК приводит к изменению вторичной структуры РНК, что в свою очередь приводит к изменению стабильности или уровня трансляции мРНК (Soper et al. 2010, Basineni et al. 2009). Кроме того, белок Hfq участвует во взаимодействии малых регуляторных РНК (sRNA) с матричными РНК (Valentin-Hansen and Eriksen 2004; Васильева и dp, 2005; Aiba 2007), обеспечивая плавление вторичной структуры обеих молекул РНК. Известно, что белок Hfq влияет на эффективность экспрессии более 40 генов во время стационарной фазы роста клеток E.coli (Васильева и др., 2005; Nogueira and Springer 2000).

Белок Hfq обладает двумя РНК-связывающими поверхностями - проксимальной, где происходит для связывание специфических У-богатых участков регуляторных и матричных РНК, и дистальной, где белок взаимодействует с А-богатыми участками мРНК. На данный момент определены структуры комплексов белка Hfq с короткими олигоА (Link et al., 2009) и олигоУ фрагментами РНК (Schumacher et al., 2002), однако комплексы природных РНК с Hfq быстро диссоциируют и их структуры до сих пор не были получены (Hopkins et al., 2011).

Предполагалось, что белок Hfq обладает АТФазной активностью (Sukhodolets and Garges, 2003, Arluison et al., 2007; Lazar et al., 2010). В данной работе нами определена структура комплекса белка Hfq с АТФ, в которой было видно, что АТФ в структуре сохраняется в виде трифосфата, причем он не имеет контактов с атомами белка. Учитывая недавние биохимические данные (Murina et al., 2014; Hämmerle et al., 2012; Wang et al., 2011) это позволило сделать вывод об отсутствии АТФазной активности у белка Hfq.

При анализе структуры полученного комплекса Hfq с АТФ выяснилось, что положение и ориентация основания и рибозы оказались точно такими же, как в комплексе белка с олигоА РНК (Link et al., 2009). Проверка возможности взаимодействия других рибонуклеотидов с Hfq показала, что белок также образует комплексы с ЦТФ и УТФ, но не связывается с ГТФ. Полученные структурные данные позволили уточнить существующую модель взаимодействия белка Hfq с мРНК и регуляторными РНК.

ЧАСТЬ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Семейство Sm и Sm-подобных белков

Sm белки и Sm-подобные белки (Lsm - Sm-like proteins) обнаружены в бактериях, эукариотах и археях, где они участвуют в метаболизме РНК, в том числе в сплайсинге и распаде мРНК (Wilusz and Wilusz, 2005).

История эукариотических LSm белков началась в 1959 году, когда впервые диагностировали аутоиммунное заболевание - красную системную волчанку. Оказалось, что в ходе развития болезни организм больного продуцирует антитела к собственным РНК-белковым антигенам, локализованным в ядре. Антигены, вызывающие заболевание, в 1966 году были названы "smith antigen" (SmAg) (Notman et al., 1975). Позднее было установлено, что белковая фракция данных антигенов входит в состав сплайсосомы, а также формирует комплексы с малыми ядерными РНК. Найденный белок был назван Sm белком. Помимо семи Sm-белков, которые входят в состав сплайсосомы (Kambach et al., 1999а), в эукариотах было найдено более пятнадцати белков, содержащие Sm домен, близких по последовательности, однако не входящих в состав сплайсосомы. Такие белки были названы Sm-подобными белками (Salgado-Garrido et al., 1999; Séraphin, 1995), они также как Sm белки являются РНК-связывающими белками и выполняют различные функции в процессах транскрипции и трансляции РНК (Tritschler et al., 2007, 2008), принимают участие в созревании гистонов (Strub and Birnstiel, 1986), поддержании структуры теломер (Seto et al., 1999) и деградации мРНК (Bouveret et al., 2000; Не and Parker, 2000).

Впервые бактериальный Sm-подобный белок Hfq был открыт в 1968 г. как клеточный белок E.coli HF-I (Host factor I), участвующий в репликативном цикле бактериофага Q/l (Shapiro et al., 1968). Позднее этот белок был обнаружен во многих грамположительных и грамотрицательных бактериях. В бактериях белок Hfq выполняет роль глобального регулятора экспрессии генов, влияя на уровень трансляции мРНК как напрямую, так и посредством малых регуляторных РНК (Link et al., 2004).

Функции Sm-подобных белков в археях до сих пор подробно не изучены. Архейные Sm-подобные белки были впервые идентифицированы в 1999 г. при системном анализе аминокислотных последовательностей геномов эукариот и архей (Salgado-Garrido et al., 1999). Было найдено по одному или по два различных гена Sm-подобных белков в геномах ряда архей. Отсюда следовало, что архейные геномы кодируют один или два Sm-подобных белка, которые принадлежат двум подсемействам, названным Sml и Sm2

(Salgado-Garrido et al., 1999). Наиболее распространенным типом Sm-подобных белков в археях является Sml. Последним был обнаружен третий тип Sm-подобных архейным белков - Sm3 - отличающийся от Sml и Sm2 подсемейств наличием добавочного С-концевого домена (Mura et al., 2003).

Известно, что архейные Sm-подобные белки взаимодействуют с PNPase Р и У-богатыми последовательностями, что предполагает участие архейных Sm-подобных белков в процессинге тРНК (Brennan and Link, 2007). По своей структуре архейные белки более близки к эукариотическим Sm-подобным белкам, чем к бактериальным: в растворе и кристаллах они формируют гептамеры как эукариотические белки (Collins et al., 2001; Mura et al., 2001; Törö et al., 2001) и, в отличие от бактериальных белков, не содержат длинного С-концевого хвоста (Törö et al., 2001).

Глава 2. Пространственная структура Sm/Sm-подобных белков

Первые данные о структуре белка Hfq из E.coli были получены с помощью электронной микроскопии (Zhang et al., 2002). На электронно-микроскопических изображениях видно, что белок образует симметричные пентамеры или гексамеры диаметром около 70-80 Â (рис. 1). Определение пространственных структур белка Hfq из Staphylococcus aureus (Schumacher et al., 2002), коровой части (1-72 остатки) белка из E.coli (Sauter, 2003) и белка из Pseudomonas aeruginosa (Nikulin et al., 2005) подтвердило формирование белком Hfq четвертичной структуры в виде гексамера (рис. 4). В кристаллах белки Hfq образуют тороиды с внешним диаметром около 70 Â и центральной полостью диаметром 8-10 Â. Формирование четвертичной структуры белков семейства Hfq происходит за счет образования "сквозного" ß-листа путем объединения ß-тяжей соседних мономеров. Водородные связи, образуемые атомами главных цепей соседних ß-тяжей, определяют ориентацию мономеров относительно друг друга в олигомере.

Рис. 1. Электронно-микроскопические фотографии гексамеров Hfq из Е. coli. На рисунке слева видны частицы округлой формы. Изображения отдельных 689 гексамеров были использованы для построения обобщенной модели белка, которая имеет выраженную симметрию 6 порядка (справа) (Zhang et al., 2002).

2.1. Первичная структура Sm-подобпых белков

Сравнение аминокислотных последовательностей бактериальных Sm-подобных (Sm-like, LSm) белков Hfq показало, что они имеют выраженную консервативную центральную область примерно в 80 аминокислотных остатков и вариабельную С-концевую часть переменной длины (рис. 2) (Zhang et al., 2002). В белках Hfq было обнаружено наличие консервативного мотива Sml, характерного для Sm белков эукариот, и, таким образом, выявлена гомология между бактериальными белками Hfq и эукариотическими Sm-подобными и Sm белками (Moller et al., 2002; Sledjeski et al., 2001). Последнее позволило предположить, что бактериальные белки Hfq и эукариотические Sm-подобные белки имеют общего предка (Sun et al., 2002).

Наиболее консервативной частью белков Hfq является мотив Sm2, располагающийся на конце ß4 и начале ß5 тяжей, захватывающий короткую перетяжку между ними (рис. 2). Он включает в себя консенсус [Y/FJKHAI, который сохраняется практически во всех бактериальных белках. Аминокислотные остатки Sm2 мотива участвуют во взаимодействии белка с РНК (Schumacher et al., 2002), и, по всей вероятности, определяют четвертичную структуру белка (Moskaleva et al., 2010; Nikulin et al., 2005; Panja and Woodson, 2012; Sauter, 2003).

Поиск гомологов Hfq среди известных на 2002 г. геномов бактерий давал положительные результаты только для примерно половины из них (Sun et al., 2002). Поскольку гомологи белка не были найдены в некоторых протеобактериях и

грамположительных бактериях, возникло предположение, что для отдельных ветвей эволюции ген белка был потерян (Sun et al., 2002). Однако позже, благодаря применению более совершенных алгоритмов поиска гомологов в сочетании с использованием аминокислотных паттернов, ортологи белка Hfq были обнаружены ещё в ряде геномов, в которых ранее они не были идентифицированы (Valentin-Hansen and Eriksen, 2004). Эти данные позволили заключить, что белки Hfq распространены значительно шире, чем предполагалось ранее, и что они могут иметь значительные вариации по первичной структуре.

Одним из ярких примеров отдаленных ортологов Hfq являются белки из цианобактерий Synechocystis sp. РСС 6803 и Anabaena РСС 7120, которые были выделены в новую группу белков Hfq (Boggild et al., 2009). У представителей этой группы обнаружено 65% сходство по первичной структуре при 30% идентичности аминокислотных остатков между собой. Выделение их в отдельную группу подтверждается при сравнении с другими белками Hfq (рис. 2). В частности, консервативная область Sm2 мотива у белков из цианобактерий отличается от консенсуса [Y/F]KHAI и заменена на последовательность RLAAI в белке из Synechocystis или на WKQAI в белке из Anabaena (Boggild et al., 2009). Отличия в первичной структуре привели к тому, что белки Hfq из Synechocystis sp. РСС 6803 и Anabaena РСС 7120 имеют намного меньшее сродство к РНК, по сравнению с белком Hfq из E.coli. Они не могут регулировать экспрессию генов в клетках E.coli in vivo (Boggild et al., 2009), однако нокаут гена hfq в Synechocystis приводит к потере подвижности клеток и значительно снижает уровень синтеза мРНК ряда генов (Dienst et al., 2008).

hfq ecou HFQSALTY HFQ_ACIC5 HFQ YERPE HFQ VTBC3 Hf 0_P£EPi HFQ_PSEAE HFQ_CLOBL HFQ CLOAB HFQ AQUAE HFQ_BPUAB HFQ_HAEIN HFQ tiEZMA HFO LEGPL HFQ BURPS HFQ XAIJCP

hfq'xanac

HFQ AGRT5 HFQ_RAI.SO HFQ RHILO HFQ_PASMtJ HFQ XYLFA HFQ PBOS1 HFQ THEKA HFQ BACSU HFO BAC.C.7. HFQ BACAN HFQ STAAU

р7г; 1?_syn:—msffdsc q¡) yvd: nosi mai теfcts

70 80 SO 100

SH HS NMA вв GTSSNY-HHG8S AQU TS AQ QOS ЕЕ ТЕ : 1 0 2

SHHSNNAGGGASNNY-HHGSNAQGSTAQODSEETE : 1 02

LHGDHRPGVAGHGAPPISPTPPAGTHSTPGESSGA : 1 06

SHHSNTPSGS-TNNY-HGSNPSAPQQPQQDSDDAE :101

SHHSGDR----------------P AS DR РАЕ KS ЕЕ

RLFSPT-----------------DSEHGDSEPCNA

P.LPSGD---------------------QPAEPGNA

LFVQNP--------------------NGDDYKDKE

LFNQ-------------------------PQQDEE

EI FFE----------------------EAGVPGQG

pOP QMFE---------------------------GEEA

P.fc SHHNNNHHT------------APTEAVENVE 1*QAE

¡VLQHENPKJAA--------PTSTLVQVETVQQPAE

^JKI PAEE------------------SSGE EEG TVAD

K|P NFHPD-------------------------AEAAS

RVGPGGGYV-----------QSNENNQAEDPBVEQ

RVGP GGG YV-----------Q SNEGN QA EDO DV EQ

СИ FES-------------------------EEGAA

NFRVD-------------------------F. AS DA

EQP QMFDG------------------------EESQGA

3H HN MSNNS NQ-------QNY QQEQQTD SNV EK AE

RVGPGGG YV-----------QSGS DT IQ t KD DE VE

KLYE----------------------------GDD

MLMP KKQ--------------ETA QE AE TSE NE GS

------------------------------QLELE

I ! - )

Ши* 'I |.lt■ J »-:-

LW ;JPTC|C|A$:N 3'40ТТ|ИСВА Y§J[- X

87 86 82 85 81 80

78

91 97 85

79

92 92

80 79 81 96 92 77 92 73 7 4

71 77

70

72

ß3 ! ! ß4

ß5

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей некоторых белков Hfq: Escherichia coli (HFQ ECOLI), Salmonella typhimurium (HFQSALTY), Acidobacterium capsulatum (HFQACIC5), Yersinia pestis (HFQ YERPE), Vibrio cholerae serotype Ol (HFQ VIBC3), Pseudomonas putida (HFQPSEPl), Pseudomonas aeruginosa (HFQPSEAE), Clostridium botulinum (HFQ CLOBL), Clostridium acetobutylicum (HFQCLOAB), Aquifexaeolicus (HFQ AQUAE), Brucella abortus (HFQ BRUAB), Haemophilus influenzae (HFQHAE1N), Neisseria meningitides (HFQNE1MA), Legionella pneumophila (HFQ LEGPL), Burkholderia pseudomallei (HFQ BURPS), Xanthomonas campestris pv. campestris (HFQXANCP), Xanthomonas axonopodis (HFQXANAC), Agrobacterium tumefaciens (HFQAGRT5), Ralstonia solanacearum (HFQJRALSO), Rhizobium loti (HFQRHILO), Pasteurella multocida (HFQ PASMU), Xylella fastidiosa (HFQ XYLFA), Rhodobacter sphaeroides (HFQ RHOS1), Thermotoga maritima (HFQTHEMA), Bacillus subtilis (HFQ BACSU), Bacillus cereus (HFQ BACCZ), Bacillus anthracis (HFQBACAN), Staphylococcus aureus (HFQ STAAU), Nostoc sp. (Q8YVD1NOS), Synechocystis sp. (P74112 SYN). Цифры наверху соответствуют последовательности белка из E.coli. Выделение аминокислот в последовательностях черным цветом соответствует их идентичности (или консервативным заменам) по всем последовательностям бактериальных белков (за исключением цианобактерий Nostoc sp. и Synechocys tis sp.), темно-серым цветом - идентичности не менее чем 80%, светло-серым - не менее чем 60%. Внизу показано соотнесение аминокислотных последовательностей с вторичной структурой белка, а также области консервативных мотивов Sml и Sm2. Сравнение последовательностей осуществлено в программе T-Coffee (http://www.tcoffee.org/),

оформление - в программе Genedoc (http://www.nrbsc.org/gfx/genedoc). (Murina and Nikulin, 2011).

Как уже было сказано ранее, архейные белки подразделяют на подсемейства Sml и Sm2 белков. Гомология между белками разных организмов семейства Sml составляет не менее 60% по последовательности, в то время как между Sml и Sm2 белками одного и того же организма сходство не превышает 30% (Того et al., 2001). Архейные Sm-подобные белки имеют ряд характерных отличий от бактериальных и эукариотических Sm-подобных белков, несмотря на то, что область Sml мотива архейных белков гомологична остальным представителей данного семейства. Архейные Sm-подобные белки не имеют длинной С-концевой части, имеющейся у бактериальных и эукариотических белков. Они, как и эукариотические Sm белки, в области Sm2 мотива содержат консенсус RGXX (где X - заряженные аминокислотные остатки), а бактериальные белки - консенсус [Y/FJKHAI. Важной особенностью архейных белков является протяженная петля L4, соединяющая Sml и Sm2 мотивы, имеющаяся также в эукариотических Sm белках, но отсутствующая в белках Hfq. Следует отметить, что позднее в Methanococcus jannaschii был идентифицирован Sm-подобный белок, негомологичный эукариотическим и архейным Sm-подобным белкам, но гомологичный бактериальным белкам Hfq (Nielsen et al., 2007). Тем не менее, в целом архейные Sm-подобные белки значительно ближе к эукариотическим Sm белкам, чем к бактериальным белкам Hfq.

2.2. Четвертичная структура Sm/Sm-подобных белков

Lsm белки характеризуются наличием структурного Sm-фолда, состоящего из двух высококонсервативных участков, так называемых Sml и Sm2 мотивов. Sml мотив включает в себя pi-, Р2-, Р3-тяжи, Sm2 мотив - р5- и р4-тяжи (рис. 3) (Seraphin et al., 1995; Schumacher et al., 2002). Структура Sm-фолда схожа с ОВ-фолдом (Oligonucleotide Binding) (Murzin, 1993), и обладает БНЗ-подобной топологией (Musacchio et al., 1992).

Рис. 3. Ленточная модель укладки мономера представителя Lsm белков (в составе гсксамсра). Синим цветом выделена N-концевая a-спираль; мотив Sml, состоящий из тяжей ß 1, ß2 и ß3, выделен желтым цветом; мотив Sm2, состоящий из тяжей ß5 и ß4, выделен красным цветом.

На N-конце мономера белка находится a-спираль (для белка Hfq из E.coli - остатки с 7 по 18), которая присутствует во всех Sm/Lsm белках, но не относится к Sm фолду. В гексамере a-спираль каждого мономера располагается на одной стороне тора и прикрывает межсубъединичный интерфейс от растворителя (Tsui et al., 1994). Эта сторона гексамера называется проксимальной, а противоположная - дистальной. Вместе с N-концевой а-спиралью ß-тяжи Sm фолда образуют коровую часть белка Hfq (остатки 7— 66), которая наиболее консервативна среди всех известных белков Hfq (рис. 2) (Brennan and Link, 2007; Sauter, 2003). Располагающаяся далее С-концевая часть белка имеет длину от 7 (в Bacillus subtilus) до 36 (в E.coli) преимущественно положительно заряженных остатков и не обладает выраженной гомологией среди известных последовательностей (рис. 2).

Относительно функциональности белка Hfq из E.coli, лишенного С-концевой области, имеются противоречивые данные. С одной стороны показано, что укороченный с С-конца до 65 остатков белок из E.coli способен связывать некодирующие РНК и даже способствовать изменению их вторичных структур, однако не способен связывать мРНК и осуществлять регуляцию экспрессии ряда генов in vivo, включая авторегуляцию экспрессии гена hfq (Veccrek et al., 2008). С другой стороны приводятся данные о наличии негативного и позитивного контроля регуляции экспрессии ряда генов укороченными с С-конца до 65, 66, 69 и 72 остатков белка Hfq из E.coli in vivo (Olsen et al., 2010). Тем не

менее, обе группы авторов согласны с тем, что укороченные варианты белка способны связываться с достаточно большим количеством различных молекул РНК, разногласия же возникают только лишь в отношении оценки сохранения способности к регуляции экспрессии ряда генов. Кроме того, известно много природных укороченных белков Hfq, которые представляют собой практически только коровую часть молекулы белка, однако успешно функционируют. К их числу можно отнести белки Hfq из Synechocystis sp. РСС 6803 и Anabaena РСС 7120 (Boggild et al, 2009), Aquifex aeolicus (Sittka et al., 2007), Listeria monocytogenes (Nielsen et al., 2010).

Олигомеризация через образование межсубъединичного ß-листа характерна не только для Sm-белков, но и для многих других. Различают следующие типы таких взаимодействий: расширение ß-листа, когда ß-тяж одного белка присоединяется к границе ß-листа другого белка, ß-тяжевые вставки, когда ß-тяж одного белка вставляется в ß-лист другого белка, и ß-тяжевой зипперинг, когда неструктурированные петли каждого из связывающихся белков контактируют друг с другом с образованием двутяжевого ß-листа или ß-зиппера. Анализ белковых комплексов, представленных в белковом банке данных, выявил, что олигомеризация через образование сквозного ß-тяжа играет важную роль в различных метаболических процессах (Remaut and Waksman, 2006).

Четвертичная структура архейных и эукариотических Lsm-белков и эукариотических Sm-белков похожа на бактериальную (Valentin-Hansen and Eriksen, 2004). Главное их отличие состоит в том, что бактериальные белки Hfq образуют только гексамеры, в то время как почти все архейные и эукариотические белки - гептамеры, сохранившие при этом тороидальную структуру. Однако имеются единичные примеры пентамеров и октамеров Sm-подобных белков (рис. 4). Объяснение такому разнообразию четвертичных структур при высокой схожести пространственных структур мономеров белка пока еще не приведено в исследованиях. Все Sm-подобные белки формируют аналогичные межсубъединичные контакты, что было трактовано как консервативность структур Sm-подобных белков в процессе эволюции (Valentin-Hansen and Eriksen, 2004).

Рис. 4. Кристаллические структуры Sm-белков и Sm-подобных белков различной степени олигомеризации. (1) Пентамер Sm-подобного белка цианофага (Das et al., 2010), (2) гексамер белка Hfq Pseudomonas aeruginosa (Nikulin et al., 2005), (3) гептамер белка Sml Archaeoglobus fulgidus (Törö et al., 2001), (4) октамер ЬвтЗ-бслка Saccharomyces cerevisiae (Naidoo et al., 2008).

В отличие от гомогептамерных Lsm-белков, эукариотические Sm-белки образуют тороидальные гептамеры из 7 различных субъединиц и входят в состав сплайсосомы (рис. 5). Эукариотические Sm-белки и Sm-подобные белки в растворе существуют в виде мономеров или димеров, формируя гептамеры в присутствии РНК (Kambach et al., 1999а, 1999b; Pomeranz Krümmel et al., 2009).

Рис. 5. Кристаллические структуры коровой части и полной U1 -частицы человека. (1) Коровая часть U1 мяРНП частицы (малой ядерной рибонуклеопротеиновой частицы). Обозначены Sm-белки В, Dl, D2, F, Е, G и D3. Sm-сайт мяРНК представлен 7 нуклеотидами в центральной поре гептамера белков. Показан фрагмент экспериментальной карты электронной плотности (контур по 1о). (2) Модель полной U1 мяРНП частицы. Голубым показана коровая часть U1 мяРНП частицы. Обозначены белки U1A (зеленого цвета), Ul-70k (оранжевого цвета), U1C (красного цвета) и U1 мяРНК (сиреневого цвета) с петлями SL2, SL3 и SL4 (Pomeranz Krümmel et al., 2009)

2.2.1. Белок AF-Sm2 может быть гексамером и гептамером

Исследования архейных Sm-белков показали, что белок Sm2 из Archaeoglobus fulgidus (AF-Sm2) - единственный на данный момент белок, который может существовать как в гексамерной, так и в гептамерной формах в зависимости от состава буферного раствора (Achsel et al., 2001; Törö et al., 2002). Было предположено, что такое свойство белка AF-Sm2 можно объяснить взаимодействием остатков Glul9 и Glu23 (рис. 6) на поверхностях смежных мономеров (Törö et al., 2002). На расстоянии 4 Ä от них находится еще один остаток глутаминовой кислоты - Glu47 (рис. 6), который также может влиять на степень олигомеризации белка AF-Sm2 (Kilic et al., 2006) (рис. 7).

HFQ ACRPE HFQ f CRAC HFO METBÜ WQ MCTAC HFQ METBA HFQ METMA HFQ METTH HFQ PICTO HFO PYRAC HFQ SULAC HFQ SULSO HfQ SULTO HFQ THEAC HFQ THEVO HFQ ARCFU

MAAKGGKOIVNPFKYIKE

matipmkml ее ______

..........mi gsk

mfpnkkvoki vgsr mf pnk kvqk[ vgs mfpnkkvoki vgs . mkgsokefrvnkofikfk mal lpmkmlее si mskaoqvkip spl kvitkwi

Sm1 moW

MOA К . . MOA К MRMTI VOAK

I E WPLKSlKTAl VENPLKSIRTAI IENPLKSLKTAT MKMl EESV MI MPMKH.EESV. MVlPNQMVKSVIVGKI

io

тт UN L 1

EY UN MT

0Y i H IM

9Y MN IH

DY MN LH

DY MN IH

NY . N TV

EY MN MT

GC MN IV

GT MN IV

GT VN IV

GT MN IV

EY MN MV

DY MN MV

0Y MN IY

40

OAI .OAEENGE VDTTEI ADGO V0TMEI VRGE VDTMEI VKGE V0TUEI VKGE OTEE. DDAEESGE

EVAONGTRLVAKI HRV

----- VQRKIBKV

RlRSlESV KVRSlgSV KVRS10SV KVRSlgSV ... SlQ

torklhtv

Sm2 motil

ndaael0k sgepktryhri kocteyregtsopvakyerví roctei regtsepvakyhrv

rdcietregtaepvakyhrv

00v0ensen vsrktstv

D0V0ENSEN TNAUECKGEE

so

A .

VSRKLETV KVRSLEEI

jEFlSFDASTAAEKAlTGV VRÍTTK .

HVPVEN TPVEO. TPI ЕЕ. TPVEO AME

APK . .

[STSEVTP SI OYESI MGKEK SVDYETVMNSEK SVOYEALMGK VPK . .

VPK

OPOEE .

u Si

62

í)

14

Рис. 6. Сравнение аминокислотных последовательностей 8ш2-белков из архей Аегоругиш регшх (НРрАЕЯРЕ), ЕеггорЬвша ас1с1атапи5 (НР()_РЕ11АС), МеЛапосос^ёеБ ЬиПопп (НРС)_МЕТВи), МеЛапозагста acetivorans (НР(^_МЕТАС), МеШапоБагста Ьагсеп (НР()_МЕТВА), МеШапозагста шаге1 (НР(}_МЕТМА), МеШапо Шегтаии^горЫсиБ (НРС^МЕТТН), РюгорЫ1и8 Кн-лёш (НРС)_Р1СТО), РугоЬаси1иш аегорЬПит (НР(2_РУКАЕ), ЗиИЫоЬив ааёосаМапсив (НРОЗиЬАС), ЗиНЫоЬив Бо^апсш (НЕр_8иЬ80), БиИЫоЬиБ Юкоёан (НРр_8иЬТО), ТЬегшорЬБша ас1с!орЫ1ит (НРО_ТНЕАС), ТЬегтор1азша volcanium (НРС>_ТНЕУО), Aгcheaoglobus {и^ёиБ (НК^АРСРи). Нумерация остатков и элементы вторичной структуры указаны для 8т2-белка из АгсИаеоя1оЬш ал^сьдб (ар-8ш2). Консервативные остатки выделены красным цветом, консервативные остатки с небольшими вариациями выделены синим цветом, остатки, в которых выделяется тенденция к консерватизму выделены зеленым. Снизу зелеными стрелками показаны остатки глутаминовой кислоты, участвующие во взаимодействии между соседними олигомерами АР-8т2, красной стрелкой показан остаток глутаминовой кислоты, расположенный близко к вышеупомянутым остаткам в структуре белка (КШс е1 а1., 2006).

1

Т5Я-

gk,1(h &u47 л аиг}

Рис. 7. Пространственное расположение и взаимодействия остатков Glul9/Glu23 и Glu47/Arg55

в гсксамере AF-Sml (Того et al., 2002). (1) Расположение взаимодействующих остатков в гексамере белка AF-Sml. Цветом выделены остатки разных мономеров. Видно, что остатки Glu 19, Glu23 и Glu47 расположены рядом. (2) При рН<7 остатки Glu 19 и Glu23 протонируются и образуют водородные связи, которые вносят положительный вклад в стабильность гексамера. Водородная связь показана зеленым цветом. Остаток Arg55 образует солевой мостик (показан красным цветом) с боковым цепью Glu47 и стабилизирует его ориентацию. Главные цепи Arg55 и Glu47 образуют водородную связь (показана белым цветом) (Kilic et al., 2006, с изменениями).

При помощи метода гель-фильтрации было обнаружено, что степень олигомеризации белка AF-Sm2 зависит от рН и присутствия РНК (рис. 8). При рН=4,5 практически весь белок находится в олигомерном состоянии, в то время как при рН=8,0 олигомеры белка AF-Sm2 не образуются. Данный эффект был объяснен тем, что при рН>7,0 карбоксильные группы глутаминовых кислот депротонированы, что дестабилизирует олигомерную форму через отталкивание близко расположенных отрицательно заряженных групп. При снижении рН боковые цепи глутаминовой кислоты протонируются, устраняя отталкивание близких зарядов, и образование гексамера становится возможным.

Объем элюции (мл) Объем элюции (мл)

рН = 4,5 «>рН = 6,5 — рН = 8,0

Рис. 8. Профили гель-фильтрации для белка АР-8гп2 в присутствии и в отсутствии РНК. Цвет кривых соответствует разной величине рН. (1) Профили элюции в отсутствии РНК, при рН=4,5; 6,5 и 8,0. (2) Профили элюции в присутствии РНК (соотношение РНК:белок = 7:1), при рН=4,5; 6,5 и 8,0. Стрелками обозначены объемы элюции для рибонуклеазы А (13,7 кДа) и альбумина (67 кДа) (КШс е! а1., 2006, с изменениями).

Объем элюции (мл) Объем элюции (мл)

■■рНМ,! ша»рН = 6,5 ■н>рН = 8,0

Рис. 9. Профили гель-фильтрации белка АР-8т2 с заменой Е19А в присутствии и в отсутствии РНК. Цвет кривых соответствует разной величине рН. (1) в отсутствии РНК, (2) в присутствии РНК (соотношение РНК:белок = 7:1). Стрелками обозначены объемы элюции для рибонуклеазы А (13,7 кДа) и альбумина (67 кДа). Для белков АР-8ш2 с заменой Е23А и Е47А профили элюции аналогичны (КШс е! а!., 2006, с изменениями).

Для проверки гипотезы о роли заряженных остатков при олигомеризации были получены мутантные формы белка с единичными заменами Glul9AIa, Glu23Ala или Glu47Ala, и проверена степень олигомеризации в присутствии и отсутствии РНК при разных значениях рН (рис. 9). В отсутствии РНК все мутантные белки показали возросшую стабильность олигомера по сравнению с белком дикого типа, а добавление РНК приводило к полному образованию комплексов белка с РНК при рН=6,5.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мурина, Виктория Николаевна, 2014 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Achsel, Т., Stark, H., and Lührmann, R. (2001). The Sm domain is an ancient RNA-binding motif with oligo(U) specificity. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 98, 3685-3689.

2. Adams, P.D., Afonine, P. V, Bunkôczi, G., Chen, V.B., Davis, I.W., Echols, N., Headd, J.J., Hung, L.-W., Kaprai, G.J., Grosse-Kunstleve, R.W., et al. (2010). PHENIX: a comprehensive Python-based system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66,213-221.

3. Aiba, H. (2007). Mechanism of RNA silencing by Hfq-binding small RNAs. Curr. Opin. Microbiol. 10, 134-139.

4. Altuvia, S., Weinstein-Fischer, D., Zhang, A., Postow, L., and Storz, G. (1997). A small, stable RNA induced by oxidative stress: role as a pleiotropic regulator and antimutator. Cell 90,43-53.

5. Andersen, J., and Delihas, N. (1990). micF RNA binds to the 5' end of ompF mRNA and to a protein from Escherichia coli. Biochemistry 29, 9249-9256.

6. Antal, M., Bordeau, V., Douchin, V., and Felden, В. (2005). A small bacterial RNA regulates a putative ABC transporter. J. Biol. Chem. 280,7901-7908.

7. Argaman, L., Elgrably-Weiss, M., Hershko, T., Vogel, J., and Altuvia, S. (2012). RelA protein stimulates the activity of RyhB small RNA by acting on RNA-binding protein Hfq. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 109,4621^626.

8. Arluison, V., Mura, С., Guzman, M.R., Liquier, J., Pellegrini, O., Gingery, M., Régnier, P., and Marco, S. (2006). Three-dimensional structures of fibrillar Sm proteins: Hfq and other Sm-like proteins. J. Mol. Biol. 356, 86-96.

9. Arluison, V., Mutyam, S.K., Mura, С., Marco, S., and Sukhodolets, M. V (2007). Sm-like protein Hfq : Location of the ATP-binding site and the effect of ATP on Hfq - RNA complexes. 1830-1841.

10. Azam, T. a. (1999). Twelve Species of the Nucleoid-associated Protein from Escherichia coli. SEQUENCE RECOGNITION SPECIFICITY AND DNA BINDING AFFINITY. J. Biol. Chem. 274, 33105-33113.

11. Azam, T.A., and Ishihama, A. (1999). Twelve species of the nucleoid-associated protein from Escherichia coli. Sequence recognition specificity and DNA binding affinity. J. Biol. Chem. 274,33105-33113.

12. Azam, T. a, Hiraga, S., and Ishihama, a (2000). Two types of localization of the DNA-binding proteins within the Escherichia coli nucleoid. Genes Cells 5, 613-626.

13. Basineni, S.R., Madhugiri, R., Kolmsee, T., Hengge, R., and Klug, G. (2009). The influence of Hfq and ribonucleases on the stability of the small non-coding RNA OxyS and its target rpoS in E. coli is growth phase dependent. RNA Biol. 6,584-594.

14. Beisel, C.L., Updegrove, T.B., Janson, B.J., and Storz, G. (2012). Multiple factors dictate target selection by Hfq-binding small RNAs. EMBO J. 31,1961-1974.

15. Bouché, F., and Bouché, J.P. (1989). Genetic evidence that DicF, a second division inhibitor encoded by the Escherichia coli dicB operon, is probably RNA. Mol. Microbiol. 3,991-994.

16. Bouveret, E., Rigaut, G., Shevchenko, A., Wilm, M., and Séraphin, B. (2000). A Sm-like protein complex that participates in mRNA degradation. EMBO J. 19, 1661-1671.

17. Boysen, A., M0ller-Jensen, J., Kallipolitis, B., Valentin-Hansen, P., and Overgaard, M. (2010). Translational regulation of gene expression by an anaerobically induced small non-coding RNA in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 285, 10690-10702.

18. Brennan, R.G., and Link, T.M. (2007). Hfq structure, function and ligand binding. Curr. Opin. Microbiol. 10,125-133.

19. Chao, Y., and Vogel, J. (2010). The role of Hfq in bacterial pathogens. Curr. Opin. Microbiol. 13,24-33.

20. Chen, S., Zhang, A., Blyn, L.B., and Storz, G. (2004). MicC, a second small-RNA regulator of Omp protein expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. 186, 6689-6697.

21. Collins, B.M., Harrop, S.J., Kornfeld, G.D., Dawes, I.W., Curmi, P.M., and Mabbutt, B.C. (2001). Crystal structure of a heptameric Sm-like protein complex from archaea: implications for the structure and evolution of snRNPs. J. Mol. Biol. 309, 915-923.

22. Coornaert, A., Lu, A., Mandin, P., Springer, M., Gottesman, S., and Guillier, M. (2010). MicA sRNA links the PhoP regulon to cell envelope stress. Mol. Microbiol. 76, 467479.

23. Coyer, J., Andersen, J., Forst, S.A., Inouye, M., and Delihas, N. (1990). micF RNA in ompB mutants of Escherichia coli: different pathways regulate micF RNA levels in response to osmolarity and temperature change. J. Bacteriol. 172,4143-4150.

24. Das, D., Kozbial, P., Axelrod, H.L., Miller, M.D., Krishna, S.S., Abdubek, P., Acosta, C., Astakhova, T., Burra, P., Carlton, D., et al. (2010). Crystal structure of a novel Sm-like protein of putative cyanophage origin at 2.60 A resolution. Proteins 75,296-307.

25. Dienst, D., Dühring, U., Mollenkopf, H.-J., Vogel, J., Golecki, J., Hess, W.R., and Wilde, A. (2008). The cyanobacterial homologue of the RNA chaperone Hfq is essential for motility of Synechocystis sp. PCC 6803. Microbiology 154,3134-3143.

26. Douchin, V., Bohn, C., and Bouloc, P. (2006). Down-regulation of porins by a small RNA bypasses the essentiality of the regulated intramembrane proteolysis protease RseP in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 281, 12253-12259.

27. Dupeux, F., Rôwer, M., Seroul, G., Blot, D., and Márquez, J.A. (2011). A thermal stability assay can help to estimate the crystallization likelihood of biological samples. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 67,915-919.

28. Durand, S., and Storz, G. (2010). Reprogramming of anaerobic metabolism by the FnrS small RNA. Mol. Microbiol. 75, 1215-1231.

29. Emsley, P., and Cowtan, K. (2004). Coot: model-building tools for molecular graphics. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 60,2126-2132.

30. Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G., and Cowtan, K. (2010). Features and development of Coot. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66,486-501.

31. Ericsson, U.B., Hallberg, B.M., Detitta, G.T., Dekker, N., and Nordlund, P. (2006). Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies. Anal. Biochem. 357,289-298.

32. Faubladier, M., Cam, K., and Bouché, J.P. (1990). Escherichia coli cell division inhibitor DicF-RNA of the dicB operon. Evidence for its generation in vivo by transcription termination and by RNase III andRNase E-dependent processing. J. Mol. Biol. 212,461-471.

33. Figueroa-bossi, N., Valentini, M., Malleret, L., and Bossi, L. (2009). Caught at its own game : regulatory small RNA inactivated by an inducible transcript mimicking its target. 2004-2015.

34. Franze de Fernandez, M.T., Hayward, W.S., and August, J.T. (1972). Bacterial proteins required for replication of phage Q ribonucleic acid. Pruification and properties of host factor I, a ribonucleic acid-binding protein. J. Biol. Chem. 247, 824-831.

35. Geinguenaud, F., Calandrini, V., Teixeira, J., Mayer, C., Liquier, J., Lavelle, C., and Arluison, V. (2011). Conformational transition of DNA bound to Hfq probed by infrared spectroscopy. Phys. Chem. Chem. Phys. 13,1222-1229.

36. Geissmann, T. a, and Touati, D. (2004). Hfq, a new chaperoning role: binding to messenger RNA determines access for small RNA regulator. EMBO J. 23, 396-405.

37. Gottesman, S. (2004). The small RNA regulators of Escherichia coli: roles and mechanisms*. Annu. Rev. Microbiol. 58, 303-328.

38. Gottesman, S., and Storz, G. (2011). Bacterial small RNA regulators: versatile roles and rapidly evolving variations. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 3, 1-16.

39. Guillier, M., and Gottesman, S. (2006). Remodelling of the Escherichia coli outer membrane by two small regulatory RNAs. Mol. Microbiol. 59,231-247.

40. Guillier, M., and Gottesman, S. (2008). The 5' end of two redundant sRNAs is involved in the regulation of multiple targets, including their own regulator. Nucleic Acids Res. 36,6781-6794.

41. Hämmerle, H., Beich-Frandsen, M., Veöerek, B., Rajkowitsch, L., Carugo, O., Djinovic-Carugo, K., and Bläsi, U. (2012). Structural and biochemical studies on ATP binding and hydrolysis by the Escherichia coli RNA chaperone Hfq. PLoS One 7, e50892.

42. He, W., and Parker, R. (2000). Functions of Lsm proteins in mRNA degradation and splicing. Curr. Opin. Cell Biol. 12, 346-350.

43. Henderson, C.A., Vincent, H.A., Casamento, A., Stone, C.M., Phillips, J.O., Cary, P.D., Sobott, F., Gowers, D.M., Taylor, J.E., and Callaghan, A.J. (2013). Hfq binding changes the structure of Escherichia coli small noncoding RNAs OxyS and RprA, which are involved in the riboregulation of rpoS. RNA 19, 1089-1104.

44. Hengge-Aronis, R. (2002). Signal transduction and regulatory mechanisms involved in control of the sigma(S) (RpoS) subunit of RNA polymerase. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 66,373-95, table of contents.

45. Hermann, H., Fabrizio, P., Raker, V.A., Foulaki, K., Hornig, H., Brahms, H., and Lührmann, R. (1995). snRNP Sm proteins share two evolutionarily conserved sequence motifs which are involved in Sm protein-protein interactions. EMBO J. 14,2076-2088.

46. Hopkins, J.F., Panja, S., and Woodson, S. a (2011). Rapid binding and release of Hfq from ternary complexes during RNA annealing. Nucleic Acids Res. 39, 5193-5202.

47. Inoue, H., Nojima, H., and Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene 96,23-28.

48. Johansen, J., Rasmussen, A.A., Overgaard, M., and Valentin-Hansen, P. (2006). Conserved small non-coding RNAs that belong to the sigmaE regulon: role in down-regulation of outer membrane proteins. J. Mol. Biol. 364,1-8.

49. Johansen, J., Eriksen, M., Kallipolitis, B., and Valentin-Hansen, P. (2008). Down-regulation of outer membrane proteins by noncoding RNAs: unraveling the cAMP-CRP- and sigmaE-dependent CyaR-ompX regulatory case. J. Mol. Biol. 383, 1-9.

50. Kabsch, W. (2010). Xds. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 66,125-132.

5L Kajitani, M., Kato, a, Wada, a, Inokuchi, Y., and Ishihama, a (1994). Regulation of the Escherichia coli hfq gene encoding the host factor for phage Q beta. J. Bacteriol. 176, 531-534.

52. Kalamorz, F., Reichenbach, B., März, W., Rak, B., and Görke, B. (2007). Feedback control of glucosamine-6-phosphate synthase GlmS expression depends on the small

RNA GlmZ and involves the novel protein YhbJ in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 65, 1518— 1533.

53. Kambach, C., Walke, S., Young, R., Avis, J.M., de la Fortelle, E., Raker, V. a, Lührmann, R., Li, J., and Nagai, K. (1999a). Crystal structures of two Sm protein complexes and their implications for the assembly of the spliceosomal snRNPs. Cell 96, 375-387.

54. Kambach, C., Walke, S., and Nagai, K. (1999b). Structure and assembly of the spliceosomal small nuclear ribonucleoprotein particles. Curr. Opin. Struct. Biol. 9,222-230.

55. Kawamoto, H., Koide, Y., Morita, T., and Aiba, H. (2006). Base-pairing requirement for RNA silencing by a bacterial small RNA and acceleration of duplex formation by Hfq. Mol. Microbiol. 61, 1013-1022.

56. Kilic, T., Sanglier, S., Dorsselaer, A.V.A.N., and Suck, D. (2006). Oligomerization behavior of the archaeal Sm2-type protein from Archaeoglobus fulgidus. 23102317.

57. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227,680-685.

58. De Lay, N., and Gottesman, S. (2009). The Crp-activated small noncoding regulatory RNA CyaR (RyeE) links nutritional status to group behavior. J. Bacteriol. 191, 461476.

59. De Lay, N., Schu, D.J., and Gottesman, S. (2013). Bacterial small RNA-based negative regulation: Hfq and its accomplices. J. Biol. Chem. 288,7996-8003.

60. Lazar, P., Kim, S., Lee, Y., and Lee, K.W. (2010). Computational approach to ensure the stability of the favorable ATP binding site in E. coli Hfq. J. Mol. Graph. Model. 29, 573-580.

61. Lease, R. a, and Beifort, M. (2000). A trans-acting RNA as a control switch in Escherichia coli: DsrA modulates function by forming alternative structures. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 97, 9919-9924.

62. Lease, R.A., Cusick, M.E., and Beifort, M. (1998). Riboregulation in Escherichia coli: DsrA RNA acts by RNA:RNA interactions at multiple loci. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 95,12456-12461.

63. Lee, T., and Feig, A.L. (2008). The RNA binding protein Hfq interacts specifically with tRNAs. 514-523.

64. Link, T.M., Valentin-Hansen, P., and Brennan, R.G. (2009). Structure of Escherichia coli Hfq bound to polyriboadenylate RNA. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 106, 19292-19297.

65. Lôpez-Garrido, J., and Casadesus, J. (2010). Regulation of Salmonella enterica pathogenicity island 1 by DNA adenine methylation. Genetics 184, 637-649.

66. Majdalani, N., Cunning, C., Sledjeski, D., Elliott, T., and Gottesman, S. (1998). DsrA RNA regulates translation of RpoS message by an anti-antisense mechanism, independent of its action as an antisilencer of transcription. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 95, 12462-12467.

67. Mandin, P., and Gottesman, S. (2010). Integrating anaerobic/aerobic sensing and the general stress response through the ArcZ small RNA. EMBO J. 29,3094-3107.

68. Massé, E., and Arguin, M. (2005). Ironing out the problem: new mechanisms of iron homeostasis. Trends Biochem. Sei. 30,462-468.

69. Massé, E., and Gottesman, S. (2002). A small RNA regulates the expression of genes involved in iron metabolism in Escherichia coli. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 99,46204625.

70. Massé, E., Escorcia, F.E., and Gottesman, S. (2003a). Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. Genes Dev. 17,2374-2383.

71. Massé, E., Escorcia, F.E., and Gottesman, S. (2003b). Coupled degradation of a small regulatory RNA and its mRNA targets in Escherichia coli. 2374-2383.

72. Mikulecky, P.J., Kaw, M.K., Brescia, C.C., Takach, J.C., Sledjeski, D.D., and Feig, A.L. (2004). Escherichia coli Hfq has distinct interaction surfaces for DsrA, rpoS and poly(A) RNAs. Nat. Struct. Mol. Biol. 11,1206-1214.

73. Mohanty, B.K., Maples, V.F., and Kushner, S.R. (2004). The Sm-like protein Hfq regulates polyadenylation dependent mRNA decay in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 54, 905920.

74. Moll, I., Leitsch, D., Steinhauser, T., and Bläsi, U. (2003a). RNA chaperone activity of the Sm-like Hfq protein. EMBO Rep. 4, 284-289.

75. Moll, I., Afonyushkin, T., Vytvytska, O., and Kaberdin, V.R. (2003b). Coincident Hfq binding and RNase E cleavage sites on mRNA and small regulatory RNAs. 1308-1314.

76. Moller, T., Franch, T., Hojrup, P., Keene, D.R., Bächinger, H.P., Brennan, R.G., and Valentin-Hansen, P. (2002). Hfq: a bacterial Sm-like protein that mediates RNA-RNA interaction. Mol. Cell 9,23-30.

77. Moon, K., and Gottesman, S. (2009). A PhoQ/P-regulated small RNA regulates sensitivity of Escherichia coli to antimicrobial peptides. Mol. Microbiol. 74,1314-1330.

78. Morita, T., Maki, K., and Aiba, H. (2005). RNase E-based ribonucleoprotein complexes : mechanical basis of mRNA destabilization mediated by bacterial noncoding RNAs. 2176-2186.

79. Morita, T., Mochizuki, Y., and Aiba, H. (2006). Translational repression is sufficient for gene silencing by bacterial small noncoding RNAs in the absence of mRNA destruction. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 103,4858^1863.

80. Moskaleva, O., Melnik, B., Gabdulkhakov, A., Garber, M., Nikonov, S., Stolboushkina, E., and Nikulin, A. (2010). The structures of mutant forms of Hfq from Pseudomonas aeruginosa reveal the importance of the conserved His57 for the protein hexamer organization. Acta Crystallogr. F 66, 760-764.

81. Mueller, U., Darowski, N., Fuchs, M.R., Förster, R., Hellmig, M., Paithankar, K.S., Pühringer, S., Steffien, M., Zocher, G., and Weiss, M.S. (2012). Facilities for macromolecular crystallography at the Helmholtz-Zentrum Berlin. J. Synchrotron Radiat. 19, 442-449.

82. Muffler, a, Traulsen, D.D., Fischer, D., Lange, R., and Hengge-Aronis, R. (1997). The RNA-binding protein HF-I plays a global regulatory role which is largely, but not exclusively, due to its role in expression of the sigmaS subunit of RNA polymerase in Escherichia coli. J. Bacteriol. 179,297-300.

83. Mura, C., Cascio, D., Sawaya, M.R., and Eisenberg, D.S. (2001). The crystal structure of a heptameric archaeal Sm protein: Implications for the eukaryotic snRNP core. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 98,5532-5537.

84. Mura, C., Phillips, M., Kozhukhovsky, A., and Eisenberg, D. (2003). Structure and assembly of an augmented Sm-like archaeal protein 14-mer. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 100,4539-4544.

85. Murina, V.N., and Nikulin, A.D. (2011). RNA Binding Sm Like Proteins of Bacteria and Archaea. Similarity and Difference in Structure and Function. Biochem. 76, 133164.

86. Murina, V., Lekontseva, N., and Nikulin, A. (2013). Hfq binds ribonucleotides in three different RNA-binding sites. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 69, 1504-1513.

87. Murina, V.N., Melnik, B.S., Filimonov, V. V., Ühlein, M., Weiss, M.S., Müller, U., and Nikulin, a. D. (2014). Effect of conserved intersubunit amino acid substitutions on Hfq protein structure and stability. Biochem. 79,469-477.

88. Murzin, A.G. (1993). OB(oligonucleotide/oligosaccharide binding)-fold: common structural and functional solution for non-homologous sequences. EMBO J. 12, 861-867.

89. Musacchio, A., Gibson, T„ Lehto, V.P., and Saraste, M. (1992). SH3--an abundant protein domain in search of a function. FEBS Lett. 307, 55-61.

90. Naidoo, N., Harrop, S.J., Sobti, M., Haynes, P. a, Szymczyna, B.R., Williamson, J.R., Curmi, P.M.G., and Mabbutt, B.C. (2008). Crystal structure of Lsm3 octamer from

Saccharomyces cerevisiae: implications for Lsm ring organisation and recruitment. J. Mol. Biol. 377, 1357-1371.

91. Nielsen, J.S., B0ggild, A., Andersen, C.B.F., Nielsen, G., Boysen, A., Brodersen, D.E., and Valentin-Hansen, P. (2007). An Hfq-like protein in archaea: Crystal structure and functional characterization of the Sm protein from Methanococcus jannaschii. 2213-2223.

92. Nielsen, J.S., Lei, L.K., Ebersbach, T., Olsen, A.S., Klitgaard, J.K., ValentinHansen, P., and Kallipolitis, B.H. (2010). Defining a role for Hfq in Gram-positive bacteria: evidence for Hfq-dependent antisense regulation in Listeria monocytogenes. Nucleic Acids Res. 38, 907-919.

93. Nikulin, A., Stolboushkina, E., Perederina, A., Vassilieva, I., Blaesi, U., Moll, I., Kachalova, G., Yokoyama, S., Vassylyev, D., Garber, M., et al. (2005). Structure of Pseudomonas aeruginosa Hfq protein. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 61,141-146.

94. Nogueira, T., and Springer, M. (2000). Post-transcriptional control by global regulators of gene expression in bacteria. Curr. Opin. Microbiol. 3, 154-158.

95. Notman, D.D., Kurata, N., and Tan, E.M. (1975). Profiles of antinuclear antibodies in systemic rheumatic diseases. Ann. Intern. Med. 83,464-469.

96. Ohniwa, R.L., Ushijima, Y., Saito, S., and Morikawa, K. (2011). Proteomjc analyses of nucleoid-associated proteins in Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis, and Staphylococcus aureus. PLoS One 6, el9172.

97. Ohniwa, R.L., Muchaku, H., Saito, S., Wada, C., and Morikawa, K. (2013). Atomic force microscopy analysis of the role of major DNA-binding proteins in organization of the nucleoid in Escherichia coli. PLoS One 8, e72954.

98. Olsen, A.S., Moller-Jensen, J., Brennan, R.G., and Valentin-Hansen, P. (2010). C-terminally truncated derivatives of Escherichia coli Hfq are proficient in riboregulation. J. Mol. Biol. 404,173-182.

99. Opdyke, J.A., Kang, J.-G., and Storz, G. (2004). GadY, a small-RNA regulator of acid response genes in Escherichia coli. J. Bacteriol. 186,6698-6705.

100. Overgaard, M., Johansen, J., Moller-Jensen, J., and Valentin-Hansen, P. (2009). Switching off small RNA regulation with trap-mRNA. Mol. Microbiol. 73, 790-800.

101. Panja, S., and Woodson, S. a (2012). Hexamer to monomer equilibrium of E. coli Hfq in solution and its impact on RNA annealing. J. Mol. Biol. 417,406-412.

102. Panja, S., Schu, D.J., and Woodson, S.A. (2013). Conserved arginines on the rim of Hfq catalyze base pair formation and exchange. Nucleic Acids Res. 41, 7536-7546.

103. Pantoliano, M.W., Petrella, E.C., Kwasnoski, J.D., Lobanov, V.S., Myslik, J., Graf, E., Carver, T., Asel, E., Springer, B.A., Lane, P., et al. (2001). High-density miniaturized thermal shift assays as a general strategy for drug discovery. J. Biomol. Screen. 6,429-440.

104. Papenfort, K., Pfeiffer, V., Mika, F., Lucchini, S., Hinton, J.C.D., and Vogel, J. (2006). SigmaE-dependent small RNAs of Salmonella respond to membrane stress by accelerating global omp mRNA decay. Mol. Microbiol. 62, 1674-1688.

105. Papenfort, K., Pfeiffer, V., Lucchini, S., Sonawane, A., Hinton, J.C.D., and Vogel, J. (2008). Systematic deletion of Salmonella small RNA genes identifies CyaR, a conserved CRP-dependent riboregulator of OmpX synthesis. Mol. Microbiol. 68, 890-906.

106. Papenfort, K., Said, N., Welsink, T., Lucchini, S., Hinton, J.C.D., and Vogel, J. (2009). Specific and pleiotropic patterns of mRNA regulation by ArcZ, a conserved, Hfq-dependent small RNA. Mol. Microbiol. 74, 139-158.

107. Pomeranz Krümmel, D.A., Oubridge, C., Leung, A.K.W., Li, J., and Nagai, K. (2009). Crystal structure of human spliceosomal U1 snRNP at 5.5 A resolution. Nature 458, 475-480.

108. Pulvermacher, S.C., Stauffer, L.T., and Stauffer, G. V (2009a). The small RNA GcvB regulates sstT mRNA expression in Escherichia coli. J. Bacteriol. 191,238-248.

109. Pulvermacher, S.C., Stauffer, L.T., and Stauffer, G. V (2009b). Role of the Escherichia coli Hfq protein in GcvB regulation of oppA and dppA mRNAs. Microbiology 155, 115-123.

110. Rasmussen, A.A., Eriksen, M., Gilany, K., Udesen, C., Franch, T., Petersen, C., and Valentin-Hansen, P. (2005). Regulation of ompA mRNA stability: the role of a small regulatory RNA in growth phase-dependent control. Mol. Microbiol. 58,1421-1429.

111. Reichenbach, B., Maes, A., Kalamorz, F., Hajnsdorf, E., and Görke, B. (2008). The small RNA GlmY acts upstream of the sRNA GlmZ in the activation of glmS expression and is subject to regulation by polyadenylation in Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 36, 25702580.

112. Remaut, H., and Waksman, G. (2006). Protein-protein interaction through betastrand addition. Trends Biochem. Sei. 31,436-444.

113. Salgado-Garrido, J., Bragado-Nilsson, E., Kandels-Lewis, S., and Séraphin, B. (1999). Sm and Sm-like proteins assemble in two related complexes of deep evolutionary origin. EMBOJ. 18, 3451-3462.

114. Sauer, E., and Weichenrieder, O. (2011). Structural basis for RNA 3'-end recognition by Hfq. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 108, 13065-13070.

115. Sauer, E., Schmidt, S., and Weichenrieder, O. (2012). Small RNA binding to the lateral surface of Hfq hexamers and structural rearrangements upon mRNA target recognition. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 109, 9396-9401.

116. Sauter, C. (2003). Sm-like proteins in Eubacteria: the crystal structure of the Hfq protein from Escherichia coli. Nucleic Acids Res. 31, 4091-4098.

117. Schumacher, M. a, Pearson, R.F., Meiler, T., Valentin-Hansen, P., and Brennan, R.G. (2002). Structures of the pleiotropic translational regulator Hfq and an Hfq-RNA complex: a bacterial Sm-like protein. EMBO J. 21, 3546-3556.

118. Séraphin, B. (1995). Sm and Sm-like proteins belong to a large family: identification of proteins of the U6 as well as the Ul, U2, U4 and U5 snRNPs. EMBO J. 14, 2089-2098.

119. Seto, A.G., Zaug, A.J., Sobel, S.G., Wolin, S.L., and Cech, T.R. (1999). Saccharomyces cerevisiae telomerase is an Sm small nuclear ribonucleoprotein particle. Nature 401, 177-180.

120. Shapiro, L., Franze de Fernandez, M.T., and August, J.T. (1968). Resolution of two factors required in the Q-beta-RNA polymerase reaction. Nature 220,478^80.

121. Sharma, C.M., Darfeuille, F., Plantinga, T.H., and Vogel, J. (2007). A small RNA regulates multiple ABC transporter mRNAs by targeting C/A-rich elements inside and upstream of ribosome-binding sites. Genes Dev. 21,2804-2817.

122. Sittka, A., Pfeiffer, V., Tedin, K., and Vogel, J. (2007). The RNA chaperone Hfq is essential for the virulence of Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol. 63,193-217.

123. Sledjeski, D.D., Gupta, A., and Gottesman, S. (1996). The small RNA, DsrA, is essential for the low temperature expression of RpoS during exponential growth in Escherichia coli. EMBO J. 15,3993-4000.

124. Sledjeski, D.D., Whitman, C., and Zhang, A. (2001). Hfq is necessary for regulation by the untranslated RNA DsrA. J. Bacteriol. 183, 1997-2005.

125. Someya, T., Baba, S., Fujimoto, M., Kawai, G., and Kumasaka, T. (2011). Crystal structure of Hfq from Bacillus subtilis in complex with SELEX-derived RNA aptamer : insight into RNA-binding properties of bacterial Hfq. 1-12.

126. Someya, T., Baba, S., Fujimoto, M., Kawai, G., Kumasaka, T., and Nakamura, K. (2012). Crystal structure of Hfq from Bacillus subtilis in complex with SELEX-derived RNA aptamer: insight into RNA-binding properties of bacterial Hfq. Nucleic Acids Res. 40, 18561867.

127. Sonnleitner, E., Moll, I., and Bläsi, U. (2002). Functional replacement of the Escherichia coli hfq gene by the homologue of Pseudomonas aeruginosa. Microbiology 148, 883-891.

128. Soper, T., Mandin, P., Majdalani, N., Gottesman, S., and Woodson, S.A. (2010). Positive regulation by small RNAs and the role of Hfq. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 107, 9602-9607.

129. Storz, G., Opdyke, J.A., and Zhang, A. (2004). Controlling mRNA stability and translation with small, noncoding RNAs. Curr. Opin. Microbiol. 7, 140-144.

130. Strub, K., and Birnstiel, M.L. (1986). Genetic complementation in the Xenopus oocyte: co-expression of sea urchin histone and U7 RNAs restores 3' processing of H3 pre-mRNA in the oocyte. EMBO J. 5,1675-1682.

131. Studier, F.W., Rosenberg, A.H., Dunn, J.J., and Dubendorff, J.W. (1990). Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes. Methods Enzymol. 185, 60-89.

132. Sukhodolets, M. V, and Garges, S. (2003). Interaction of Escherichia coli RNA polymerase with the ribosomal protein SI and the Sm-like ATPase Hfq. Biochemistry 42, 80228034.

133. Sun, X., and Warteil, R.M. (2006). Escherichia coli Hfq binds A18 and DsrA domain II with similar 2:1 Hfq6/RNA stoichiometry using different surface sites. Biochemistry 45,4875-4887.

134. Sun, X., Zhulin, I., and Wartell, R.M. (2002). Predicted structure and phyletic distribution of the RNA-binding protein Hfq. Nucleic Acids Res. 30, 3662-3671.

135. Takada, a, Wachi, M., Kaidow, a, Takamura, M., and Nagai, K. (1997). DNA binding properties of the hfq gene product of Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 236, 576-579.

136. Tétart, F., and Bouché, J.P. (1992). Regulation of the expression of the cell-cycle gene ftsZ by DicF antisense RNA. Division does not require a fixed number of FtsZ molecules. Mol. Microbiol. 6, 615-620.

137. Thompson, K.M., Rhodius, V.A., and Gottesman, S. (2007). SigmaE regulates and is regulated by a small RNA in Escherichia coli. J. Bacteriol. 189,4243-4256.

138. Thore, S., Mayer, C., Sauter, C., Weeks, S., and Suck, D. (2003). Crystal structures of the Pyrococcus abyssi Sm core and its complex with RNA. Common features of RNA binding in archaea and eukarya. J. Biol. Chem. 278, 1239-1247.

139. Törö, I., Thore, S., Mayer, C., Basquin, J., Séraphin, B., and Suck, D. (2001). RNA binding in an Sm core domain: X-ray structure and functional analysis of an archaeal Sm protein complex. EMBO J. 20,2293-2303.

140. Toro, I., Basquin, J., Teo-Dreher, H., and Suck, D. (2002). Archaeal Sm proteins form heptameric and hexameric complexes: crystal structures of the Sml and Sm2 proteins from the hyperthermophile Archaeoglobus fiilgidus. J. Mol. Biol. 320,129-142.

141. Tramonti, A., De Canio, M., and De Biase, D. (2008). GadX/GadW-dependent regulation of the Escherichia coli acid fitness island: transcriptional control at the gadY-gadW divergent promoters and identification of four novel 42 bp GadX/GadW-specific binding sites. Mol. Microbiol. 70,965-982.

142. Tritschler, F., Eulalio, A., Truffault, V., Hartmann, M.D., Helms, S., Schmidt, S., Coles, M., Izaurralde, E., and Weichenrieder, O. (2007). A divergent Sm fold in EDC3 proteins mediates DCP1 binding and P-body targeting. Mol. Cell. Biol. 27, 8600-8611.

143. Tritschler, F., Eulalio, A., Helms, S., Schmidt, S., Coles, M., Weichenrieder, O., Izaurralde, E., and Truffault, V. (2008). Similar modes of interaction enable Trailer Hitch and EDC3 to associate with DCP1 and Me31B in distinct protein complexes. Mol. Cell. Biol. 28, 6695-6708.

144. Tsui, H.T., Leung, H.E., and Winkler, M.E. (1994). Characterization of broadiy pieiotropic phenotypes caused by an hfq insertion mutation in Escherichia coii K-12. 13,35—49.

145. Udekwu, K.I., Darfeuille, F., Vogel, J., Reimegard, J., Holmqvist, E., and Wagner, E.G.H. (2005). Hfq-dependent regulation of OmpA synthesis is mediated by an antisense RNA. Genes Dev. 19,2355-2366.

146. Updegrove, T.B., and Wartell, R.M. (2011). The influence of Escherichia coli Hfq mutations on RNA binding and sRNA'mRNA duplex formation in rpoS riboregulation. Biochim. Biophys. Acta 1809, 532-540.

147. Updegrove, T.B., Correia, J.J., Galletto, R., Bujalowski, W., and Wartell, R.M. (2010). E. coli DNA associated with isolated Hfq interacts with Hfq's distal surface and C-terminal domain. Biochim. Biophys. Acta 1799, 588-596.

148. Urban, J.H., and Vogel, J. (2008). Two seemingly homologous noncoding RNAs act hierarchically to activate glmS mRNA translation. PLoS Biol. 6, e64.

149. Urbanowski, M.L., Stauffer, L.T., and Stauffer, G. V (2000). The gcvB gene encodes a small untranslated RNA involved in expression of the dipeptide and oligopeptide transport systems in Escherichia coli. Mol. Microbiol. 37, 856-868.

150. Valentin-Hansen, P., and Eriksen, M. (2004). MicroReview The bacterial Sm-like protein Hfq: a key player in RNA transactions. Mol. Microbiol. 51, 1525-1533.

151. Vanderpool, C.K., and Gottesman, S. (2004). Involvement of a novel transcriptional activator and small RNA in post-transcriptional regulation of the glucose phosphoenolpyruvate phosphotransferase system. Mol. Microbiol. 54, 1076-1089.

152. Vecerek, В., Moll, I., and Bläsi, U. (2005). Translational autocontrol of the Escherichia coli hfq RNA chaperone gene. RNA 11, 976-984.

153. Vecerek, В., Rajkowitsch, L., Sonnleitner, E., Schroeder, R., and Bläsi, U. (2008). The C-terminal domain of Escherichia coli Hfq is required for regulation. Nucleic Acids Res. 36, 133-143.

154. Vytvytska, O., Moll, I., Kaberdin, V.R., von Gabain, A., and Bläsi, U. (2000). Hfq (HF1) stimulates ompA mRNA decay by interfering with ribosome binding. Genes Dev. 14, 1109-1118.

155. Wadler, C.S., and Vanderpool, C.K. (2007). A dual function for a bacterial small RNA: SgrS performs base pairing-dependent regulation and encodes a functional polypeptide. Proc. Natl. Acad. Sei. U. S. A. 104,20454-20459.

156. Wang, W., Wang, L., Zou, Y., Zhang, J., Gong, Q., Wu, J., and Shi, Y. (2011). Cooperation of Escherichia coli Hfq hexamers in DsrA binding. Genes Dev. 25, 2106-2117.

157. Wang, W., Wang, L., Wu, J., Gong, Q., and Shi, Y. (2013). Hfq-bridged ternary complex is important for translation activation of rpoS by DsrA. Nucleic Acids Res. 41, 59385948.

158. Wilusz, C.J., and Wilusz, J. (2005). Eukaryotic Lsm proteins: lessons from bacteria. Nat. Struct. Mol. Biol. 12,1031-1036.

159. Wilusz, C.J., and Wilusz, J. (2013). Lsm proteins and Hfq: Life at the 3' end. RNA Biol. 10, 592-601.

160. Winn, M.D., Ballard, C.C., Cowtan, K.D., Dodson, E.J., Emsley, P., Evans, P.R., Keegan, R.M., Krissinel, E.B., Leslie, A.G.W., McCoy, A., et al. (2011). Overview of the CCP4 suite and current developments. Acta Crystallogr. D. Biol. Crystallogr. 67,235-242.

161. Zhang, a, Altuvia, S., Tiwari, a, Argaman, L., Hengge-Aronis, R., and Storz, G. (1998). The OxyS regulatory RNA represses rpoS translation and binds the Hfq (HF-I) protein. EMBO J. 17, 6061-6068.

162. Zhang, A., Wassarman, K.M., Ortega, J., Steven, A.C., and Storz, G. (2002). The Sm-like Hfq protein increases OxyS RNA interaction with target mRNAs. Mol. Cell 9, 11-22.

163. Zhang, A., Schu, D.J., Tjaden, B.C., Storz, G., and Gottesman, S. (2013). Mutations in interaction surfaces differentially impact E. coli Hfq association with small RNAs and their mRNA targets. J. Mol. Biol. 425,3678-3697.

164. Васильева, Ю.М, Гарбер, М.Б. (2002). Регуляторная роль белка Hfq в жизнедеятельности бактериальных клеток. Молекулярная биология, 36: 1-9

165. Мурина В.Н., Никулин А.Д. РНК-связывающие Sm-подобные белки бактерий и архей: сходства и различия структур и функций. Успехи биологической химии, 2011,51, 133-64.

166. Мурина В.Н., Мельник Б.С., Филимонов В.В., Улайн М., Вейсс М.С., Мюллер У., Никулин А.Д. Влияние замен консервативных аминокислотных остатков на структуру и стабильность белка Hfq. Биохимия, 2014, 79(5):595-604

БЛАГОДАРНОСТИ.

Огромное спасибо моему научному руководителю Алексею Донатовичу Никулину за руководство, ценные замечания и рекомендации, понимание и уважительное отношение в течение всей работы в группе, а также за полученные знания и плодотворное сотрудничество.

Я благодарна заведующему группы структурного анализа рибосомных белков Станиславу Владимировичу Никонову и заведующей лабораторией структурных исследований аппарата трансляции Марине Борисовне Гарбер за предоставленную возможность выполнения моей диссертационной работы.

Отдельное спасибо сотрудникам как группы, так и лаборатории за помощь в работе и создание доброжелательной атмосферы.