Цинк-зависимые гистондеацетилазы (HDAC) – терапевтические мишени для лечения гепатита С тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Щербакова Анастасия Сергеевна

• Щербакова Анастасия Сергеевна
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Щербакова Анастасия Сергеевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Историческое развитие анти-ВГС терапии

1.2. Геном и протеом ВГС

1.3. Модели для изучения репликации и жизненного цикла ВГС

1.4. Антивирусные агенты, направленные против гепатита С

1.4.1. Агенты прямого действия (DAA)

1.4.2. HTA - противовирусные агенты, нацеленные на клеточные мишени

1.5. Цинк-зависимые гистондеацетилазы (HDAC)

1.5.1. Классификация HDAC, клеточная локализация и субстратная специфичность

1.5.2. Механизм каталитического действия цинк-зависимых HDAC

1.5.3. Строение активного центра HDAC

1.6. Ингибиторы гистондеацетилаз (HDACi)

1.6.1. Строение фармакофора HDACi

1.6.2. Роль элементов ZBG, Linker и Сар в селективности ингибирования HDAC

1.7. Участие HDAC в эпигенетической регуляции клеточного метаболизма

при ВГС

1.7.1. ВГС-индуцированный окислительный стресс и его роль в активации HDAC

1.7.1.1. Роль HDAC3 в эпигенетической регуляции экспрессии гепсидина

1.7.1.2. HDAC6 регулирует активность пероксиредоксинов Prx I и Prx II

1.7.2. ВГС активирует глюконеогенез в гепатоцитах через FoxO1-зависимый путь

1.7.2.1. Транскрипционный фактор FoxOl и его посттрансляционные

модификации

1.7.2.2. HDAC IIa класса (HDAC4/5/7/9) в регуляции гомеостаза глюкозы

1.7.3. Репликация ВГС сопровождается интенсификацией липидного обмена

1.7.3.1. ВГС регулирует метаболизм липидов через активацию

SREBP-1^ PPARa и FASN

1.7.3.2. HDAC3 регулирует активность FASN на посттрансляционном уровне

1.8. Эпигенетические механизмы противовирусного действия

ингибиторов HDAC

1.8.1. Анти-ВГС активность селективных и мультипотентных ингибиторов HDAC

1.8.2. Анти-ВГС активность ингибиторов HDAC6 - производных бензогидроксамовых

и пиридингидроксамовых кислот

1.8.3. Ингибиторы HDAC9 в подавлении репликации ВГС и транскрипции генов глюконеогенеза

1.9. Взаимосвязь клеточного старения (сенесцентности) и гепатита С

1.10. Циклинзависимые киназы CDK4 и CDK6 в регуляции клеточного цикла

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Клеточные линии и плазмиды

2.2. Используемые в работе низкомолекулярные соединения и факторы роста

2.3. Культивирование клеток

2.4. Анализ люциферазной активности

2.5. Анализ цитотоксического действия

2.6. Индукция клеточного старения с помощью пальбоциклиба

2.7. Анализ содержания ДНК

2.8. Получение лентивирусных частиц

2.9. Получение клеточной линии со стабильной экспрессией лентивирусной конструкции

2.10. Выделение РНК и синтез кДНК

2.11. Количественная полимеразная реакция в реальном времени (qRT-PCR)

2.12. Измерение активных форм кислорода (АФК)

2.13. Окрашивание клеток субстратом X-Gal

2.14. Определение протеасомной активности

2.15. Пробоподготовка для вестерн-блот анализа

2.15.1. Выделение цитоплазматических белковых фракций

2.15.2. Выделение ядерных белковых фракций

2.16. Вестерн-блот анализ

2.17. Конфокальная микроскопия

2.18. Статистическая обработка данных

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Исследование механизмов анти-ВГС активности коричных гидроксамовых кислот (CHA) в зависимости от их строения и селективности в отношении HDAC

3.1.1. Определение противовирусной активности и цитотоксичности CHA

3.1.2. Предварительный анализ взаимосвязи противовирусной активности и цитотоксичности CHA

3.1.3. Поиск взаимосвязи между подавлением репликации ВГС и ингибированием

HDAC I/IIb классов

3.1.3.1. Ингибирование HDAC I класса (HDAC1/2/3)

3.1.3.2. Ингибирование HDAC IIb класса (HDAC 6)

3.1.3.3. Ингибирование HDAC8

3.1.3.4. Анти-ВГС активность пара-СНА не связана с ингибированием

изученных HDAC

3.2. Сравнительное исследование селективности гидроксамовых ингибиторов HDAC и их N-пропилгидразидных аналогов, и их влияния на репликацию ВГС

3.2.1. Исследование селективности ингибирования HDAC бензогидроксамовыми кислотами (ВНА) и их #-пропилгидразидными аналогами

3.2.2. Сравнительное изучение лекарственных пан-ингибиторов HDAC - vorinostat

и belinostat, и их #-пропилгидразидных аналогов

3.3. Индукция клеточного старения в ВГС-инфицированных клетках гепатомы и изучение противовирусного потенциала ингибиторов HDAC

3.3.1. Изучение влияния пальбоциклиба и TGF-ß1 на репликацию ВГС

3.3.2. Пальбоциклиб эффективно переводит клетки гепатомы в состояние

клеточного старения

3.3.3. Пальбоциклиб вызывает накопление липидных капель и

блокирует липофагию

3.3.4. Сравнительное тестирование DAA препаратов в свободно пролиферирующих и

в предсенесцентных клетках гепатомы

3.3.5. Сравнительное тестирование ингибиторов HDAC в свободно пролиферирующих

и в предсенесцентных клетках гепатомы

3.3.6. Сравнение антивирусной активности структурных аналогов

Cmpd12a и Tubastatin А

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВГС - вирус гепатита С

ХГС - хронический гепатит С

ГЦК - гепатоцеллюлярная карцинома

JFH1 - фульминантная форма вирусного гепатита типа

HCVcc - транзиторная инфекционная система ВГС

DAA - direct acting antivirals - препараты прямого действия

HTA - host targeting agents - агенты, нацеленные на клеточные мишени

HDAC - гистондеацетилазы

HDACi - ингибиторы гистондеацетилаз

HAT - гистонацетилтрансферазы

SVR - устойчивый вирусологический ответ

Peg-IFN-a - пегилированный интерферон-а

ORF - открытая рамка считывания

IRES - внутренний сайт посадки рибосомы

ЭР - эндоплазматический ретикулум

SRBI - рецептор-мусорщик типа B класса I

INF - сигнальный путь активации интерферонов

DMV - двухмембранные везикулы

RdRp - РНК-зависимая РНК-полимераза

G-418 - неомицин

EMCV IRES - вирус мышиного энцефаломиокардита

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

Luc - ген люциферазы светлячка

ЛР - лекарственная резистентность

EGFR - рецептор эпидермального фактора роста

PPI - пептидил-пролил-цис-транс-изомераза

FDA - управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов

ПТМ - посттрансляционная модификация

NCoR - ко-репрессор ядерных рецепторов

NLS - последовательность сигнала ядерной локализации

NES - последовательность ядерного экспорта

AMPK - АМР-зависимая протеинкиназа

LKB1 - киназа печени B1

AKT - протеинкиназы типа B

HDLP - гистондеацетилазо-подобный белок термофильной бактерии Aquifex aeolicus ZBG - группа связывания иона цинка

Cap - группа, взаимодействующая с аминокислотными остатками на входе в активный центр фермента HDAC

SPG - боковой субкарман HDAC

LPG - нижний субкарман HDAC 4/5/7/9

FPG - foot-карман HDAC 1/2/3

FASN - синтаза жирных кислот

ОС - окислительный стресс

АФК - активные формы кислорода

HAMP - гепсидин

IP4 - 1,4,5,6-тетрафосфат инозитола

PEPCK - фосфоенолпируваткарбоксикиназа

G6Pase - глюкозо-6-фосфатаза

IGF-1 - инсулиноподобный фактор роста

ЛПНП - липопротеины низкой плотности

ЛПОНП - липопротеины очень низкой плотности

ТГ - триглицериды

PI4P - фосфатидилинозитол-4-фосфат

LVP - липовирусная частица

SREBP-1c - белок 1c, связывающий регуляторный элемент стерола

PPARa - рецептор, активируемый пероксисомным пролифератором a

ApoA1 - аполипопротеин А1

VPA - вальпроевая кислота

SA-ß-Gal - ß-галактозидазная активность

SASP - секреторный фенотип, ассоциированный со старением

TGF-ß1 - трансформирующий фактора роста-ß1

CDK - циклинзависимые киназы

RB - белок ретинобластомы

СП - свободно пролиферирующие клетки

ПС - предсенесцентные клетки

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Цинк-зависимые гистондеацетилазы (HDAC) – терапевтические мишени для лечения гепатита С»

Актуальность темы и степень ее разработанности

Вирус гепатита С (ВГС) является широко распространённым и опасным заболеванием, хронической формой которого (ХГС) страдает 58 миллионов человек по всему миру и ежегодно происходит около 1,5 миллиона новых случаев инфицирования. По данным ВОЗ, смертность от гепатита С и вызванных им заболеваний составляет примерно 300 000 человек в год [1]. Бессимптомное течение острой фазы гепатита С и переход заболевания в хроническую форму, с риском развития цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК), наряду с отсутствием вакцины, представляют серьезную проблему для всемирного здравоохранения. Острый гепатит C развивается в течение 4-12 недель после инфицирования и протекает практически бессимптомно. В 80% случаев острый гепатит переходит в ХГС и сопровождается риском развития цирроза печени [2]. Кроме того, ХГС является основным фактором развития гепатоцеллюлярной карциномы наряду с инфицированием вирусом гепатита В, чрезмерным потреблением алкоголя и воздействием афлатоксина В1 [3]. Оценки ежегодной заболеваемости ГЦК колеблются от 0,5% до 10% для пациентов, страдающих циррозом печени [4]. В дополнение к поражению печени, ВГС-инфекция может быть связана с внепеченочными проявлениями, а именно диабетом 2 типа и сердечно-сосудистыми заболеваниями [5].

За последние несколько лет анти-ВГС терапия претерпела революционные изменения, связанные с одобрением к использованию нескольких противовирусных препаратов прямого действия (DAA - direct acting antivirals), направленных на белки вируса. Применение комбинаций из двух или трех DAA позволило отказаться от интерфероновой терапии и резко повысило значения устойчивости вирусологического ответа. Сегодня DAA - стандарт лечения ВГС. Наиболее успешным препаратом является sofosbuvir (SOVALDI®), показавший высокую эффективность в сочетании с другими DAA (ledipasvir, daclatasvir и др.) вместе с пегилированным интерфероном-a (Peg-IFN-a) или без него. Sofosbuvir является пролекарством и действует как аналог UTP для РНК-зависимой РНК-полимеразы NS5B ВГС, вызывая обрыв растущей цепи РНК и, следовательно, прекращение репликации РНК [6]. Тем не менее, в DAA-терапии остается много ограничений, и прежде всего - риск развития ГЦК после излечения у пациентов с выраженным фиброзом [7] и сопутствующими заболеваниями, лекарственная резистентность, а также низкая эффективность терапии у части пациентов из-за высокой частоты мутаций и генотипической вариабельности вируса [8]. Существующие ограничения и отсутствие вакцины стимулируют поиск новых анти-ВГС агентов. Препараты, подавляющие репликацию вируса за счет ингибирования клеточных мишеней (HTA - host targeting agents), участвующих в жизненном цикле ВГС, в перспективе могли бы решить существующие проблемы и открыть

новые возможности для пангенотипических противовирусных агентов с высоким барьером для лекарственной устойчивости [9]. Поскольку действие HTA- и DAA-агентов проходит по разным и взаимодополняющим механизмам - они могут действовать синергетически, эффективно снижая вирусную нагрузку на организм и сокращая длительность курса лечения, и, как следствие, вероятность развития устойчивости к DAA. Однако, несмотря на значительное количество клинических испытаний различных HTA, ни один из них не был одобрен для практического применения против ВГС, что, вероятно, связано со сложными физиологическими эффектами таких соединений [10] и отсутствием адекватных клеточных тест-систем [11].

В качестве мишеней для анти-ВГС терапии значительный интерес вызывают гистондеацетилазы (HDAC), поскольку их функциональная активность заключается в регуляции экспрессии генов, обеспечивающих эффективную репликацию вируса. Дело в том, что вирусная инфекция, в частности ВГС, разнонаправленно меняет экспрессию многих генов клетки-хозяина, что позволяет вирусу репрограммировать гепатоциты в состояние пермиссивности, причем экспрессия некоторых генов меняется многократно [12]. Ингибиторы гистондеацетилаз (HDACi) также действуют разнонаправленно, эффективно подавляя сверхэкспрессию "провирусных" генов и восстанавливая до нормы гипоэкспрессию "антивирусных" генов [13]. В связи с этим HDACi представляют многообещающий класс анти-ВГС агентов, которые не только ингибируют репликацию ВГС in vitro и in vivo [13, 14], но и замедляют развитие ГЦК [15].

В связи с поздним диагностированием заболевания, чаще всего именно хроническая форма гепатита С, когда одновременно протекают три патологических процесса — вирусная инфекция, вызванная ею хроническая воспалительная реакция и клеточное старение, сопровождающие репликацию вируса, требует особого внимания [16-18]. Развитие и последующее прогрессирование клеточного старения (сенесцентности) является следствием хронического воспаления, вызванного ВГС-инфекцией, при котором стареющие гепатоциты могут накапливаться как в результате прямого действия вируса, так и за счет паракринной передачи сигналов компонентами SASP - секреторного фенотипа, ассоциированного со старением. Проблема репродукции вируса в стареющих гепатоцитах до сих пор мало изучена, хотя может иметь принципиальное значение для понимания динамики развития инфекции и ее лечения на поздних стадиях заболевания. Обычно, при скрининге противовирусных соединений используют быстро пролиферирующие клетки гепатоцеллюлярной карциномы, что часто приводит к обнаружению ложноположительных результатов, поскольку исследуемые соединения могут блокировать деление клеток, а не ингибировать репликацию вируса. Для повышения эффективности скрининга HTA-агентов функциональный статус клеток гепатомы необходимо приблизить к статусу хронически ВГС-инфицированных гепатоцитов. Индукция

предварительного старения в клетках, несущих репликон ВГС, решает проблему тестирования на раковых клетках гепатомы HTA-агентов, представленных в данной работе ингибиторами гистондеацетилаз [19, 20]. Важной характеристикой сенесцентности является арест клеточного цикла в G1 фазе. Весьма вероятно, что в условиях остановки клеточного цикла HDACi проявляют свой истинный противовирусный потенциал, поскольку их противоопухолевая активность, усложняющая интерпретацию результатов, сводится к минимуму. В настоящей работе мы оценили возможность использования пальбоциклиба - ингибитора циклинзависимых киназ 4/6 (CDK 4/6) - для индуцирования процесса старения в клетках гепатомы человека, и изучили как сенесцентность влияет на репликацию ВГС и эффективность репрезентативных анти-ВГС агентов.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы являлось изучение механизмов анти-ВГС действия ингибиторов гистондеацетилаз в клетках гепатомы человека в условиях свободной пролиферации и клеточного старения.

В ходе выполнения работы были решены следующие задачи:

1. Изучение корреляции между подавлением репликации гепатита С и ингибированием гистондеацетилаз I/IIb классов структурными изомерами коричных гидроксамовых кислот (CHA);

2. Сравнение селективности действия и противовирусной активности гидроксамовых ингибиторов HDAC и их N'-пропилгидразидных аналогов;

3. Характеризация клеточного старения, индуцированного ингибитором циклинзависимых киназ 4/6 - пальбоциклибом, в ВГС-инфицированных клетках гепатомы человека;

4. Изучение репликации ВГС в свободно пролиферирующих и предсенесцентных клетках;

5. Сравнительное тестирование ингибиторов гистондеацетилаз различной селективности в свободно пролиферирующих и предсенесцентных клетках.

Научная новизна работы

В настоящей работе установлена строгая корреляция между подавлением репликации гепатита С и ингибированием HDAC I/IIb классов на примере 15 структурных изомеров CHA, классифицированных на три группы -орто, -мета и пара-производных. Показано, что анти-ВГС активность CHA достоверно коррелирует с ингибированием HDAC8 в случае орто-CHA, тогда как в случае мета-CHA с ингибированием HDAC1/2/3 и HDAC6. Изучено влияние N'-пропилгидразидной цинк-связывающей группы (ZBG) на селективность действия HDACi I/IIb классов. Показано, что ZBG обеспечивает селективное ингибирование HDAC I класса независимо от строения линкера исходного гидроксамового ингибитора и даже сор-фрагмента, взаимодействующего с аминокислотными остатками на входе в активный центр фермента.

Изучено влияние старения клеток гепатомы человека Huh7-luc/neo, индуцированное с помощью пальбоциклиба, на репликацию вируса гепатита С. Установлено, что клеточное старение способствует репликации ВГС за счет увеличения количества липидных капель и неполного течения липофагии, как частного случая аутофагии. Впервые исследовано влияние сенесцентности на активность противовирусных препаратов прямого и опосредованного действия (ингибиторы NS3, NS5B и HDACi). Оценен антивирусный потенциал как селективных (tubastatin А и другие), так и мультипотентных ингибиторов гистондеацетилаз (vorinostat, belinostat и другие). Впервые получены указания на HDAC10 как на потенциально новую мишень для анти-ВГС терапии.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные в данной работе результаты демонстрируют уникальные возможности предложенного подхода для сравнительного изучения и оценки противовирусного потенциала HDACi в свободно пролиферирующих и предсенесцентных ВГС-инфицированных клетках гепатомы человека. Препараты, подавляющие репликацию вируса за счет ингибирования клеточных мишеней, участвующих в жизненном цикле ВГС, в частности HDACi, в перспективе могут преодолеть существующие ограничения DAA-препаратов и открыть новые возможности для создания пангенотипических противовирусных агентов с более высоким барьером для лекарственной устойчивости.

В настоящей работе показано, что пальбоциклиб не только запускает процессы клеточного старения в клетках гепатомы, включая остановку клеточного цикла в Gl-фазе, но и способствует усиленной репликации ВГС. Индукция предварительного старения в раковых клетках гепатомы, несущих репликон ВГС, решает проблему противовирусного тестирования HTA-агентов, представленных в данной ингибиторами гистондеацетилаз. В условиях остановки

клеточного цикла ингибиторы проявляют свою истинную противовирусную активность, поскольку присущая им противоопухолевая активность, усложняющая интерпретацию результатов испытаний, сводится к минимуму.

Основные положения, выносимые на защиту

1) Обнаружена корреляция между подавлением репликации ВГС и ингибированием HDAC I/IIb классов 15 структурными изомерами коричной гидроксамовой кислоты (CHA). Показано, что анти-ВГС активность CHA достоверно коррелирует с ингибированием HDAC8 в случае орто-CHA, тогда как в случае мета-CHA она коррелирует с ингибированием HDAC1/2/3 и HDAC6.

2) Изучено влияние #-пропилгидразидной ZBG-группы на селективность действия HDACi I/IIb классов и показано, что ZBG обеспечивает селективное ингибирование HDAC I класса (HDAC 1/2/3) вне зависимости от структуры линкера исходного гидроксамового ингибитора и наличия сор-фрагмента, взаимодействующего с аминокислотными остатками на входе в активный центр фермента.

3) С помощью ингибитора циклинзависимых киназ 4/6 - пальбоциклиба - индуцировано старение в клетках гепатомы человека и охарактеризованы его основные признаки. Пальбоциклиб эффективно останавливал клетки в G1 фазе клеточного цикла, инициировал в них продукцию АФК, последовательно увеличивал количество и размер лизосом, обладающих Р-галактозидазной активностью.

4) Изучено влияние старения в клетках гепатомы человека на репликацию вируса гепатита С. Показано, что пальбоциклиб повышает содержание вирусных белков и РНК в клетках, чему способствует увеличение количества и размера жировых капель с одной стороны, и блокирование полного течения аутофагии, с другой стороны.

5) Оценен антивирусный потенциал ингибиторов различной селективности и показано, что переход клеток Huh7-luc/neo из свободно пролиферирующего в предсенесцентное состояние значительно влияет на противовирусную активность HDACi. Мультипотентные ингибиторы HDAC - vorinostat и belinostat, также, как и селективный ингибитор HDAC6 - Cmpd12, резко снижали свою активность. С другой стороны, в предсенесцентных клетках ингибирование вирусной репликации двунаправленным ингибитором HDAC6/10 - tubastatin А - заметно возрастало. HDAC10 впервые была предложена в качестве новой мишени для анти-ВГС терапии.

Личный вклад соискателя

Основные результаты диссертационной работы получены автором лично или при его непосредственном участии.

Степень достоверности и апробация результатов

Основные положения диссертационной работы опубликованы в рецензируемых научных журналах, а также представлены на научных конференциях и школах в виде стендовых и устных докладов.

Публикации по теме диссертации

По материалам диссертации опубликовано 4 печатные работы (включая 2 статьи в журналах, входящих в Q1) и 4 тезиса международных и российских конференций, в том числе в изданиях, индексируемых Scopus, WOS или РИНЦ и рекомендованных ВАК для опубликования материалов диссертаций на соискание ученой степени. Научные статьи:

1. Щербакова А. С., Кочетков С. Н., Козлов М. В. Как гистондеацетилаза 3 контролирует экспрессию гепсидина и репликацию вируса гепатита С // Молекулярная биология. - 2023. - Т. 57, № 3. - С. 427-439.

2. Malikova A. Z., Shcherbakova A. S., Konduktorov K. A., Zemskaya A. S., Dalina A. A., Popenko V. I., Leonova O. G., Morozov A. V., Kurochkin N. N., Smirnova O. A., Kochetkov S. N., Kozlov M. V. Pre-Senescence Induction in Hepatoma Cells Favors Hepatitis C Virus Replication and Can Be Used in Exploring Antiviral Potential of Histone Deacetylase Inhibitors // Int J Mol Sci. - 2021. - Т. 22, № 9. - С. 4559.

3. Kozlov M. V., Konduktorov K. A., Malikova A. Z., Kamarova K. A., Shcherbakova A. S., Solyev P. N., Kochetkov S. N. Structural isomers of cinnamic hydroxamic acids block HCV replication via different mechanisms // Eur. J. Med. Chem. - 2019. - Т. 183. - С. 111723.

4. Kozlov M.V., Konduktorov K. A., Shcherbakova A. S., Kochetkov S. N. Synthesis of N'-propylhydrazide analogs of hydroxamic inhibitors of histone deacetylases (HDACs) and evaluation of their impact on activities of HDACs and replication of hepatitis C virus (HCV) // Bioorg Med Chem Lett. - 2019. - Т. 29. - С. 2369-2374.

Материалы научных конференций:

1. Щербакова А. С., Кондукторов К. А., Кочетков С. Н., Козлов М. В. Структурные изомеры коричных гидроксамовых кислот блокируют репликацию ВГС по разным механизмам // XXXV зимняя молодёжная международная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва, Россия - 2023. - С. 242.

2. Щербакова А.С. Негидроксамовые ингибиторы HDAC8 подавляют репликацию вируса гепатита С // XXVIX Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2022». Москва, Россия - 2022. ISBN 978-5-317-06824-0

3. Щербакова А. С., Земская А. С., Кочетков С. Н., Козлов М. В. Ингибирование циклин-зависимых киназ 4 и 6 в клетках гепатомы человека имитирует действие хронической инфекции вируса гепатита С // XXXIII зимняя молодёжная международная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". Москва, Россия. - 2021. - С. 229.

4. Щербакова А. С. N'-пропилгидразиды алифатических и ароматических кислот ингибируют гистондеацетилазы 1/2/3 и блокируют репликацию вируса гепатита С // XXVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов 2021» Москва, Россия. -2021. ISBN 978-5-317-06593-5

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 113 страницах машинописного текста, включает 7 таблиц, 40 рисунков, и состоит из введения, литературного обзора, результатов и их обсуждения, выводов, заключения и списка цитируемой литературы из 241 наименования.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Обзор литературы содержит подробную информацию о структуре и регуляторных функциях гистондеацетилаз, а также их непосредственном участии в эпигенетической регуляции клеточного метаболизма при ВГС-инфекции. Описаны механизмы противовирусного действия широко применяемых HDACi. В обзоре приведена краткая информация о геноме ВГС и функциях его белков. Последняя глава обзора посвящена ВГС-индуцированному клеточному старению.

1.1. Историческое развитие анти-ВГС терапии

До начала 2010 годов для лечения гепатита С преимущественно применяли пегилированный интерферон-а в комбинации с нуклеозидным аналогом - рибавирином. Данная схема терапии сопровождалась многочисленными побочными эффектами и только в 50% случаев приводила к устойчивому вирусологическому ответу (SVR). Прорыв в лечении произошел в 2011 году, когда к применению были одобрены два пероральных DAA-препарата - boceprevir и telaprevir (ингибиторы NS3/4A протеазы ВГС). Эти препараты также применялись в сочетании с Peg-IFN-a и ribavirin, и повышали SVR до 70 % у пациентов, инфицированных вирусом генотипа 1. Однако, данная схема терапии также сопровождалась неблагоприятными побочными эффектами и повышенными режимами дозирования. 2013 год ознаменовал начало эры безинтерфероновой DAA-терапии с использованием комбинаций нуклеозидных (sofosbuvir) и ненуклеозидных (daclatasvir, ledipasvir, simeprevir, dasabuvir, telaprevir и др.) препаратов, ингибирующих репликацию вируса. Новая схема лечения приводила к SVR в 95-99% случаев и легче переносилась пациентами. Важно, что сокращение длительности терапии до 8 недель препятствовало отбору резистентных штаммов ВГС. Наиболее эффективной схемой терапии, подходящей для самого распространенного генотипа 1, являлась комбинация с коммерческим названием Harvoni (sofosbuvir / ledipasvir), которая приводила к SVR в 99% случаев [21, 22].

1.2. Геном и протеом ВГС

ВГС принадлежит семейству Flaviviridae род Hepacivirus и представляет собой одноцепочечный (+)РНК-вирус. Размер вирусного генома составляет 9,6 т.п. нуклеотидов, единственная открытая рамка считывания (ORF) кодирует полипротеин, предшественник вирусных белков, длиной около 3000 аминокислотных остатков. ORF фланкируется с 5'-конца нетранслируемой областью (5'-UTR), которая выполняет роль внутреннего сайта для посадки рибосомы (IRES) и инициирует кэп-независимую трансляцию. С 3'-конвд ORF фланкируется высококонсервативной последовательностью (3'-UTR), необходимой для инициации синтеза (-)-цепи РНК вируса. Продуктом трансляции вирусной (+)РНК является первичный

полипротеин, N-концевую область которого составляют структурные белки, а неструктурные белки располагаются в С-концевой части [23].

Первоначально полипротеин подвергается протеолитическому расщеплению сигнальными клеточными пептидазами с образованием структурных белков (core, E1 и E2), а затем вирусной аутопротеазой NS2 и протеазой NS3/NS4A с образованием неструктурных белков (p7, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A и NS5B), соответственно (рис.1).

Рисунок 1. Трансляция ВГС и процессинг полипротеина. Полипептид подвергается ко- и посттрансляционному процессингу в эндоплазматическом ретикулуме (ЭР) с образованием зрелой формы вирусных белков. Сайты протеолиза обозначены символами (нижняя панель) [23].

ВГС кодирует два гликопротеина E1 и E2, образующие гетеродимерный комплекс, локализующийся в эндоплазматическом ретикулуме. Гликопротеины формируют внешнюю оболочку вириона ВГС и обеспечивают проникновение вируса в клетку, за счет связывания с рецептором-мусорщиком BI (SR-BI), тетраспанином CD81 [25] и трансмембранными белками -клаудином-1 (CLDN1) и окклюдином (OCLN) [26, 27].

Структурная функция белка капсида Core заключается в формировании вирусного нуклеокапсида, окружающего и защищающего геномную РНК вне клетки, а также в процессе ее упаковки и продукции вирионов [28]. В цитоплазме Core ВГС находится в мембранно-

ассоциированной форме с ЭР, митохондриями и липидными каплями, незначительное количество Core обнаруживается в ядре [29].

p7 и NS2 не принимают участия в репликации вирусной РНК. NS2 - трансмембранная аутопротеаза, состоящая из N-концевого мембранного анкера и C-концевой цистеиновой протеазы, необходима для инфекционной активности ВГС и его продукции при культивировании [30]. p7 - мембранно-ассоциированный белок, относящийся к группе виропоринов. Виропорины представляют собой небольшие гидрофобные мембранные вирусные белки, которые олигомеризуются и модулируют свойства мембран, облегчая размножение вируса. p7 формирует неселективные катионные каналы, например, кальциевые, которые изменяют проницаемость мембран ЭР и играют важную роль на заключительных этапах сборки капсида и высвобождения вирионов [31].

Комплекс протеазы NS3 с кофактором NS4A обладает тремя ферментативными активностями: протеазной (N-концевой домен), хеликазной (С-концевой домен) и фосфатазной активностью [32]. Кроме того, протеаза NS3/NS4A задействована в ингибировании сигнальных путей активации интерферонов (INF), а именно транскрипционного фактора IRF-3. Показано, что гиперэкспрессия NS3/NS4A нарушает олигомеризацию белка MAVS, обеспечивающего активацию IRF3 в противовирусном врожденном иммунном ответе [33].

NS4B - высококонсервативный белок, который связывается с мембраной ЭР клетки-хозяина, модифицирует ее и участвует в формировании мембранной сети, которая, в свою очередь, обеспечивает платформу для сборки репликационного комплекса вируса в составе двухмембранных везикул (DMV), так называемых реплисом, о чем подробнее будет сказано далее [34, 35]. NS4B взаимодействует с большим количеством мембранных белков: интегринами (ITGA2B, ITGAL, ITGB1, ITGB3), транспортерами (ABCA1, ABCA6, ATP5G2) и трансмембранными белками (TMX2, TMCO1) [36].

NS5A - фосфопротеин, играющий важную роль на стадии репликации и сборки вирионов ВГС. NS5A участвует в формировании реплисом, обеспечивая обволакивание липидных капель двойными мембранами, происходящими из ЭР, с образованием зрелых DMV. Такая способность NS5A обусловлена его взаимодействием с многочисленными мембранными клеточными белками: фосфатидилинозитол 4-киназой, VAP-A/B, Rab18 и другими [37, 38]. Функциональная активность NS5A регулируется степенью его фосфорилирования, в основном казеинкиназами 1 (гиперфосфорилирование) и 2 (базальное фосфорилирование) [39]. В клетках NS5A присутствует в трех формах - нефосфорилированный, базально фосфорилированной (р56) и гиперфосфорилированной (р58) [40]. Форма p56 необходима для репликации РНК, в то время как p58 участвует в сборке вирионов [41].

NS5B РНК-зависимая РНК-полимераза (RdRp) - является главной функциональной единицей репликативного комплекса. ВГС, как и другие (+)РНК-вирусы, использует свою геномную РНК в качестве матрицы для синтеза комплементарной (-)РНК, которая, в свою очередь, служит матрицей для синтеза (+)РНК [42]. NS5B осуществляет in vivo синтез вирусного генома совместно с другими белками - NS3, NS4A, NS4B, NS5A и некоторыми клеточными факторами [43, 44]. NS5B способна катализировать in vitro синтез РНК по праймер-зависимому и праймер-независимому (de novo) механизмам. При синтезе вирусной (-)РНК de novo NS5B использует в качестве матрицы специфическую последовательность 3'UTR (+)РНК длиной 98 нуклеотидов (Х-РНК) [45]. Активность NS5B полимеразы модулируется взаимодействием с белком NS5A, который в нефосфорилированном состоянии ингибирует праймер-зависимую активность фермента, а в гипер-фосфорилированном - праймер-независимую [46]. 1.3. Модели для изучения репликации и жизненного цикла ВГС

Для изучения репликации ВГС используются пермиссивные клеточные линии гепатомы Huh7 или Huh7.5, несущие автономно реплицирующиеся полноразмерные или субгеномные РНК ВГС, называемые репликонами. В 1999 году группой ученых во главе с Ральфом Бартеншлягером путем трансфекции РНК-последовательностей вирусного генома в клетки гепатомы человека линии Huh7 была получена первая клеточная линия, воспроизводящая вирусные белки и РНК [47]. Однако, в самых первых экспериментах из-за низкой эффективности трансляции и репликации, в культуре происходило накопление нетрансфицированных клеток. Проблема была решена в результате селекции клеток, несущих адаптивные мутации в отношении стабильности репликона. Введение дополнительного гена устойчивости к антибиотику неомицину (Neo, G-418), кодирующего аминогликозид 3'-фосфотрансферазу (АФТ-3'), позволило создать линии клеток, стабильно поддерживающие размножение как субгеномных, так и полноразмерных вирусных репликонов [47]. В структуру каждого из репликонов, с 5'-конца помимо гена Neo включали также ген люциферазы светлячка Luc, что позволяло оценивать соотношение между уровнем трансляции репликона и содержанием вирусной РНК в клетке, используя хемолюминисценцию и количественную полимеразную цепную реакцию (ПЦР) в реальном времени соответственно (рис. 2 А, В) [48].

Субгеномный репликон ВГС кодирует гены неструктурных белков NS3-NS5B, которые формируют активный репликационный комплекс, обеспечивающий репликацию вируса (рис. 2 А) [48]. Клетки, содержащие субгеномный репликон оказались исключительно полезными для скриннга DAA. Полноразмерный репликон содержит гены всех вирусных белков, что позволяет изучать клеточный ответ на присутствие структурных белков, главным образом Core, и

разрабатывать многие HTA (рис. 2 B). Однако более информативной в этом смысле оказалась инфекционная клеточная система HCVcc.

Рисунок 2. Схематическое изображение репликонов ВГС, стабильно экспрессируюущихся в клетках линии Huh7. Первый цистрон вирусного репликона IRES HCV продолжен N-концевой последовательностью 341-389 белка Core ВГС, что гарантирует высокую эффективность связывания с рибосомой и инициацию трансляции. После окончания трансляции Luc-Ubi-Neo, РНК остается связанной с рибосомой и транслируется со второго цистрона - 1RES вируса мышиного энцефаломиокардита (EMCV 1RES). Такой «перескок» в трансляции обеспечивает синтез первичного полипротеина ВГС в стехиометрическом соотношении с репортерной люциферазой. Высококонсервативная последовательность 3'-UTR необходима для инициации синтеза (-)-цепи РНК вируса [23]. (А) Субгеномный репликон I389/NS3-3'/LucUbiNeo-ET (B) Полноразмерный репликон ВГС c изображением структурных белков вируса, p7 и аутопротеазы NS2 [50].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Щербакова Анастасия Сергеевна, 2023 год

- — —

---

1.00 2.46 1.99 7.34 10.6 1.63 4.92 8.86 1.00 0.64 0.80 3.53 4.34 0.52 0.50 2.55 1.00 0.50 0.69 3.33 7.72 0.86 3.73 6.35

Conc. (цМ) a-TubK40ac Ac-Tub/Tub a-Tub

Рисунок 23. Вестерн-блот анализ накопления ацетилированной формы а-тубулина (a-TubK40аc) в клетках Huh7-luc/neo, после 24 часов инкубации в присутствии производных CHA.

Корреляция между накоплением а-TubK40ac и значением рЕС50 для полного набора соединений была слабой и незначимой (г = 0.509, Р <0.1), однако для группы '5m+2M' она резко усиливалась и становилась достоверной (гш = 0.838, Р <0.05). Также, как и в случае H3K9/14ac, между а-ТиЬК40ас и рСС50 прослеживалась сильная и значимая корреляция (г = 0.865, Р <0.001), которая существенно не изменялась для группы соединений '5ш+2М' (гш = 0.919, Р <0.005).

A

Б

chas rm = 0.838

P<0.05 * m-BnO p-BnO '' m-PEGO • p-PEGO «» *

p-MeO

* "phe0 " " г = 0 509 *m-PhO* —■ 1 m-MeO'" * ^ " P<01

o-MeO, o-PhO o-BnO *• • o-PEGO o-PHEO • • p-PHEO p.ph0

chas

Гт= 0.919 Р< 0.005

т-ВпО,-'

У s

р-ВпО

р-МеО

• 'm-PEGO • p-PEGO

m-PhO

•у

г = 0.865

, ^ т-РНЕО

<V.m-МеО Р< 0.001

, p-PhO р-РНЕО

' .'о-МеО ^ «о-PEGO

0-ВпО ,

•РНЕО 0-PhO

6.50 6.75 РЕС50

7.25 7.50

4.50

4.75 рСС50

5.00

5.25

Рисунок 24. Точечная диаграмма рассеяния содержания a-TubK40ac от значений pECso (А) и рССзо (Б) для всех исследуемых соединений в концентрации 3 цМ; r - коэффициент корреляции Пирсона, рассчитанный для всех CHA; rm - коэффициент корреляции Пирсона, рассчитанный для '5m+2M' группы соединений (жета-MeO/PhO/BnO/PHEO/PEGO-CHA и орто- и пара-MeO-CHA); P - значимость найденной корреляции.

Таким образом, с большой вероятностью можно считать, что ингибирование HDAC1/2/3/6 является главной причиной цитотоксического действия всех исследованных CHA, в то время как для группы соединений '5m+2M' оно еще определяет и анти-ВГС активность.

3.1.3.3. Ингибирование HDAC8

В виду того, что для фенилсодержащих орто-производных СНА корреляция между подавлением репликации ВГС и ингибированием HDAC1/2/3/6 отсутствовала, нами была проверена ключевая из возможных мишеней - HDAC8, так как по отношению именно к ней орто-изомеры СНА обладают повышенной селективностью [223].

Эффективность ингибирования HDAC8 была оценена по содержанию ацетилированной формы белка когезинового комплекса SMC3 (SMC3K105/106ac) с помощью вестерн-блот анализа. Количественным параметром ингибирования HDAC8 служило отношение содержания SMC3K105/106ac к содержанию SMC3, нормированное на то же отношение в отсутствии исследуемого ингибитора (SMC3K105/SMC3) (рис. 25). Действительно, из всего набора проверенных фенилсодержащих производных ингибирование HDAC8 наблюдалось только для орто-изомеров CHA, за единственным исключением - мета-PEGO-CHA в концентрации 10 ^M.

Рисунок 25. Вестерн-блот анализ накопления ацетилированной формы SMC3 (SMC3K105/106ac) в клетках Huh7-luc/neo, после 24 часов инкубации в присутствии орто-производных CHA.

При исследовании корреляции между подавлением репликации ВГС и ингибированием HDAC8, накопление SMC3K105/106ac в клетках в присутствии орто-CHA было дополнительно оценено при концентрациях соединений 3 и 10 |iM. Как показано на рисунке 26 A, сигнал вестерн-блоттинга проявлялся, начиная с концентрации 0.1^M для всех орто-CHA, и затем возрастал параллельно с подавлением репликации вируса. Только в случае орто-BnO-CHA ингибирование активности репликона значительно опережало накопление SMC3K105/106ac. Интересно, что именно орто-BnO-CHA в отличие от других орто-производных заметно ингибировал активность и HDAC1/2/3, и HDAC6. Возможно, что именно полипотентное действие этого соединения и является причиной наблюдаемого гэп-эффекта.

Точечная диаграмма рассеяния, построенная для исследуемых соединений, подтвердила наличие сильной статистической связи (r = 0.832, Р <0.001) между ингибированием HDAC8 и анти-ВГС активностью орто-CHA (рис. 26 Б).

A

Б

Рисунок 26. (А) Взаимосвязь между ингибированием HDAC8 и подавлением репликации ВГС орто-производными CHA. Клетки обрабатывали различными концентрациями соединений в диапазоне от 0,1 до 10 цМ в течение 72 часов. Ингибирование активности репликона ВГС выражено в процентах (шкала справа); значения ингибирования HDAC8 представлены как отношение Ac-SMC3/SMC3 (шкала слева). (Б) Точечная диаграмма рассеяния относительного содержания SMC3K105/106ac после 24 часов инкубации в присутствии орто-PhO/BnO/PHEO/PEGO-CHA (в концентрациях 0, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 цМ и) в зависимости от ингибирования репликона (%); r - коэффициент корреляции Пирсона, P - значимость корреляции.

3.1.3.4. Анти-ВГС активность пара-СНА не связана с ингибированием изученных HDAC

На основании полученных результатов можно заключить, что противовирусная активность фенилсодержащих пара-производных СНА не связана с ингибированием HDAC I/IIb классов. Действительно, на графике зависимости подавления репликации ВГС и накопления H3K9/14ac и a-TubK40a от концентраций пара-CHA, (рис. 27) видно, что в присутствии 0.3цМ любого из соединений уже наблюдалось 80-90% ингибирование активности репликона, в то время как уровень ацетилирования белков-субстратов только начинал возрастать, причем ни скорость этого роста, ни максимально достигаемые значения не коррелировали с соответствующими значениями ЕС50.

Рисунок 27. Анализ взаимосвязи между накоплением Н3К9/14ас и а-ТиЬК40а - субстратов НОАС1/2/3 и НОАС6, и ингибированием репликации ВГС производными пара-СНА. Ингибирование репликона ВГС после 72 часов выражено в процентах (левая ось); значения

ингибирования HDAC1/2/3 и HDAC6 после 24 часов инкубации рассчитывали, как нормализованные отношения Ac-H3/H3 и Ac-Tub/Tub (правая ось).

Очевидно, что ингибирование HDAC1/2/3/6 пара-CHA при концентрации 0.3цМ и выше вносит отдельный вклад в подавление репликации ВГС. Однако, демонстрируя значения ЕС 50 на уровне концентраций 40-60 нМ, пара-производные CHA, вероятно, ингибируют более чувствительную антивирусную мишень, которая не принадлежит к исследованной группе HDAC.

Данное предположение хорошо объясняет, почему фенилсодержащие пара-CHA, как и метокси производные, демонстрировали схожие закономерности анти-ВГС действия и формировали отдельную группу соединений '5m+2M' (рис. 20, 22, 24). Дело в том, что фенилсодержащие мета-производные не обладали необходимой молекулярной геометрией, а метокси производные CHA не содержали ароматический заместитель. Таким образом, все эти соединения могли ингибировать исключительно HDAC1/2/3/6, но ни HDAC8 - мишень для орто-CHA, и ни гипотетическую мишень для пара-CHA.

3.2. Сравнительное исследование селективности гидроксамовых ингибиторов HDAC и их N-пропилгидразидных аналогов, и их влияния на репликацию ВГС

Известно, что #-пропилгидразидная ZBG-группа определяет селективность действия ингибиторов в отношении HDAC1/2/3 [224]. Нами была поставлена задача - установить приоритет влияния двух элементов фармакофора: сар-группы и ZBG-группы на селективность ингибирования HDAC. С этой целью мы провели сравнительное исследование гидроксамовых ингибиторов HDAC различной селективности c их #'-пропилгидразидными аналогами (рис. 28). Кроме того, было изучено, как природа ZBG-группы влияет на ингибирование репликации ВГС.

В результате проделанной работы была обнаружена общая закономерность, что N'-пропилгидразидные аналоги, как селективных ингибиторов HDAC6 (tubastatin А и другие), так и мультипотентных ингибиторов HDAC (vorinostat, belinostat и другие), приобретают ярко-выраженную селективность действия по отношению к HDAC1/2/3. Оказалось, что «фиксация» новой селективности происходит независимо от строения линкера исходного гидроксамового ингибитора и даже сар-фрагмента, взаимодействующего с аминокислотными остатками на входе в активный центр фермента. Соединения, представленные в данной части работы были синтезированы научным руководителем М. В. Козловым.

CONHX

ВНА (X=OH) ВМН (X=NHMe) ВЕН (X=NHEt) BPH (X=NHPr)

CONHX

3-cpPHA (X=OH) 3-фРРН (X=NHPr)

N

U

CONHX

4-фВНА (X=OH) 4-cpBPH (X=NHPr)

CONHX

Cmpd12a (X=OH) Cmpd12a-PH (X=NHPr)

CONHX

Tubastatin А (X=OH) Tubastatin-PH (X=NHPr)

CONHX

Vorinostat (X=OH) Vorinostat-PH (X=NHPr)

CONHX

СНА (X=OH) CPH (NHPr)

CONHX

Belinostat (X=OH) Belinostat-PH (X=NHPr)

Рисунок 28. Структуры исследуемых гидроксамовых кислот (x=OH) и их #-пропилгидразидных аналогов (x=NHPr).

3.2.1. Исследование селективности ингибирования HDAC бензогидроксамовыми кислотами (ВНА) и их N'-пропилгидразидными аналогами

Ранее в нашей лаборатории была показано, что BHA демонстрирует умеренную анти-ВГС активность на фоне селективного ингибирования HDAC6 [20, 225]. В данной работе были изучены низшие #'-алкилзамещенные гидразидные аналоги BHA - BMH, BEH и BPH (алкил = Me, Et и Pr). Было установлено, что BMH и BEH не обладают анти-ВГС действием и не ингибируют HDAC I/IIb классов. Однако, #-пропилгидразид бензогидроксамовой килоты BPH уже обладал противовирусной активностью даже большей, чем исходная BHA, и эффективно ингибировал HDAC1/2/3, но не HDAC6 (рис. 29). Таким образом, для #-алкилзамещенных бензогидразидов ингибирование HDAC1/2/3 и подавление репликации ВГС были тесно взаимосвязаны и демонстрировали одну и ту же зависимость от длины линкера алкильного заместителя. Важно отметить, что BMH, BEH и BPH являются ближайшими гомологами, и трудно ожидать существования какой-либо дополнительной противовирусной мишени с таким же профилем чувствительности к удлинению алкильного радикала. В этой серии экспериментов BHA, BMH, BEH и BPH служили контрольными соединениями, не содержащими шр-элемент,

что позволило оценить селективность их действия без дополнительного конкурирующего влияния этого элемента (табл. 4).

Эффективность ингибирования НОАС1/2/3 и НОАС6 была изучена, как и в ранее описанных экспериментах, с помощью вестерн-блот анализа по накоплению в клетках НиЬ7/1ис-пео ацетилированной формы белков-субстратов - гистона Н3 и а-тубулина (рис. 29). Количественным параметром ингибирования НОАС6 и НОАС1/2/3 служило отношение содержания а-ТиЬК40ас к содержанию а-ТиЬ и Н3К9/14ас к содержанию гистона Н3, нормированные на те же отношения в отсутствии исследуемого ингибитора (Ас-ТиЬ/ТиЬ и Ас-Н3/Н3 соответственно).

Рисунок 29. Вестерн-блот анализ накопления ацетилированной формы а-тубулина (a-TubK40ac) и гистона H3 (H3K9/14ac) в клетках Huh7-luc/neo после 24 часов инкубации в присутствии бензогидроксамовых кислот и их N'-пропилгидразидных аналогов.

Далее мы протестировали три соединения, содержащие ароматический или гетероциклический cap-заместитель в положении 4 бензольного кольца линкера, а именно 4-фенил-бензогидроксамовую кислоту (4-фВНA), бензимидазольное производное (Cmpd12a) и индольное производное (Tubastatin A) (табл. 4). По литературным данным Cmpd12a и Tubastatin A демонстрировали высокоселективное ингибирование HDAC6 за счет гетероциклических cap-заместителей [220], что было подтверждено нами с помощью вестерн-блот анализа отношения

Ас-Tub/Tub и Ас-Ю/Н3 (рис. 29). Однако, все три N'-пропилгидразидных аналога - 4^BPH, Cmpd12a-PH и Tubastatin-РН эффективно ингибировали HDAC 1/2/3, но не HDAC6. Таким образом, jV'-пропилгидразидная ZBG-группа полностью изменяла селективность ингибирующего действия, а cap-заместители, которые отвечали за селективное ингибирование HDAC6 гидроксамовыми предшественниками, не могли этому воспрепятствовать.

Таблица 4. Тестирование пара-замещенных бензогидроксамовых кислот и их пропилгидразидных аналогов в качестве антивирусных агентов. Клетки НиИ7-1ис/пео и НиЬ7 обрабатывали указанными соединениями в соответствующем диапазоне концентраций 72 часа. ЕС50 и СС50 представлены как среднее значение, как минимум, из трех независимых измерений. Терапевтический индекс (Т1) = СС50/ЕС50.

Интересно отметить, что Cmpd12а-PH обладал максимальной противовирусной активностью (ЕС50 = 25пМ) среди пула всех соединений, но при этом ингибирование НОАС1/2/3 наблюдалось только, начиная с концентрации 0,1цМ. Вероятно, подавление репликации ВГС этим соединением происходило через НОАС-независимый механизм или могло быть связано с ацетилированием не детектированной нами формы гистона Н3 - Н3К9/27ас.

3.2.2. Сравнительное изучение лекарственных пан-ингибиторов HDAC - vorinostat и belinostat, и их N-пропилгидразидных аналогов

Мы провели сравнение широко применяемых в медицинской практике гидроксамовых пан -ингибиторов HDAC - vorinostat и belinostat, с их N'-пропилгидразидными аналогами -vorinostat-PH и belinostat-PH. В этой серии экспериментов гидроксамовые и N'-пропилгидразидные производные 3-фенилпропановой кислоты (3-фРНА и 3-фРРН) и коричной кислоты (CHA и CPH) служили контрольными соединениями, линкер которых напоминал линкер vorinostat или belinostat, а cap-элемент отсутствовал вовсе (табл. 5). Как видно из результатов вестерн-блот анализа (рис. 30), все четыре гидроксамовых HDACi обладали мультипотентным эффектом, в то время как их N'-пропилгидразидные аналоги избирательно ингибировали только HDAC1/2/3. Таким образом, «фиксация» новой селективности с помощью N-пропилгидразидной ZBG-группы происходила, как в отсутствие, так и в присутствии cap-структуры, что полностью согласуется с результатами, полученными и для бензогидроксамовых ингибиторов.

Рисунок 30. Вестерн-блот анализ накопления ацетилированной формы а-тубулина (а-ТиЬК40ас) и гистона Н3 (Н3К9/14ас) в клетках Huh7-luc/neo после 24 часов инкубации в присутствии гидроксамовых кислот и их №-пропилгидразидных аналогов.

Потеря ингибирующего эффекта в отношении НОАС6 у гидразидов 3-фРРН и вориностат-РН сопровождалась изменением противовирусной активности (табл. 5) в противоположных направлениях - значение ЕС50 уменьшилось в 1,4 раза и увеличилось в 2,3 раза, по сравнению с

соответствующими значениями для 3-фРНА и уоппо81а1;. Уоппов1а1;-РН оказался в 11 раз менее цитотоксичным, чем его гидроксамовый предшественник. Интересно, что пропилгидразиды коричной кислоты - СРН и ЬеНпо81а1;-РН теряли антивирусную активность по сравнению с СНА и ЬеНпо81а1;, но сохраняли силу цитотоксического эффекта. В случае ЬеНпо81а1;-РН это означало полную потерю избирательного подавления репликации ВГС (табл. 5).

Ингибитор Сар Линкер гвс Мишень ИБЛС ЕС50 (М СС50 (М Т1

3-фРНА нет НА 1/2/3/6 5.2 110 21

3-фРРН РН 1/2/3 3.8 96 25

Уоппо81а1 -(СН2)б- НА 1/2/3/6 0.56 0.64 1.1

Уоппо81а1;-РН 8 РН 1/2/3 1.3 7.0 5.4

СНА нет НА 1/2/3/6 2.0 20 10

СРН РН 1/2/3 5.4 18 3.3

ВеПпо8Ш ГГ" НА 1/2/3/6 0.19 0.65 3.4

ВеПпо81а1;-РН и РН 1/2/3 0.55 0.68 1.2

Таблица 5. Тестирование гидроксамовых кислот и их У-пропилгидразидных аналогов в качестве антивирусных агентов. Клетки обрабатывали указанными соединениями в соответствующем диапазоне концентраций 72 часа. ЕС50 и СС50 представлены как среднее значение, как минимум, из трех измерений. Терапевтический индекс (Т1) = СС50/ЕС50.

3.3. Индукция клеточного старения в ВГС-инфицированных клетках гепатомы и изучение противовирусного потенциала ингибиторов ИБАС

Хроническое воспаление, вызванное ВГС-инфекцией, индуцирует в пораженных гепатоцитах состояние клеточного старения или сенесцентности, важной характеристикой которой является арест клеточного цикла в G1 фазе [17, 197, 200]. Заметим, что проблема репликации вируса в сенесцентных гепатоцитах может иметь принципиальное значение для борьбы с инфекцией на поздних стадиях заболевания. С помощью трансформирующего фактора роста-Р1 [208], который входит в состав секреторного фенотипа, ассоциированного со старением, или его низкомолекулярного аналога пальбоциклиба - ингибитора СБК4/6 [213], мы активировали процессы старения в клетках Huh7-luc/neo и провели сравнительное изучение вирусной репликации и анти-ВГС активности агентов прямого и опосредованного действия.

3.3.1. Изучение влияния пальбоциклиба и TGF-pl на репликацию ВГС

Для первоначальной оценки влияния TGF-P1 и пальбоциклиба на функционирование вирусного репликона в клетках линии НиЬ7-1ис/пео была определена репортерная люциферазная активность в присутствии каждого из агентов. Инкубация клеток в присутствии и ТОБ-Р1, и пальбоциклиба приводила к снижению люциферазного сигнала, но по-разному. Уровень содержания репликона монотонно снижался для TGF-P1 (рис. 31 А), но не для пальбоциклиба, для которого люциферазный сигнал выходил на плато значений 50% в диапазоне концентраций 0,3-3 мкМ (рис. 31 Г). Измерение цитотоксического/цитостатического эффектов обоих агентов показало, что кривая концентрации клеточной жизнеспособности для TGF-P1 постепенно достигала плато МТТ-сигнала в диапазоне концентраций 0,1-1 нг/мл (рис. 31 Б). В случае пальбоциклиба кривая выглядела совсем иначе. После резкого первоначального снижения присутствие ингибитора в диапазоне концентраций 0,3-3 мкМ не оказывало существенного влияния на жизнеспособность клеток, которая оставалась на уровне 60% от исходного значения (рис. 31 Д).

TGF-pi (нг/мл) TGF-pi (нг/мл) TGF-|31 (нг/мл)

<=■ Пальбоциклиб (мкМ) Пальбоциклиб (мкМ) Пальбоциклиб (мкМ)

Рисунок 31. (А, Г) Гистограммы значений люциферазной активности и (Б, Д) цитотоксичности для TGF-pi и пальбоциклиба в культуре клеток Huh7-luc/neo. (В, Е) Графики, нормализованной по количеству клеток люциферазной активности (Luc), и уровня содержания репликона (Rep) (РНК ВГС/мРНК Actin). Клетки обрабатывали указанными концентрациями TGF-pi и пальбоциклиба в течение 48 и 72 часов соответственно. Статистическая значимость оценена по t-критерию Стьюдента: *** (p < 0,001), ** (0,001 < p < 0,01), * (0,01 < p < 0,05), # (0,05 < p < 0,1), ns - незначимо.

При скрининге низкомолекулярных соединений на противовирусную активность уровень люциферазного сигнала в лизатах клеток НиЬ7-1ис/пео чаще всего является надежным индикатором содержания РНК ВГС [225]. Однако, сложные эффекты, которые ТОБ-Р1 и пальбоциклиб оказывают на клеточные сигнальные пути, потребовали дополнительного определения уровня вирусной РНК с помощью ПЦР-анализа, чтобы получить более детальную информацию о функционировании вирусного репликона. Мы обнаружили, что в присутствии как ТОБ-Р1, так и пальбоциклиба баланс между уровнями репликона и люциферазной активности существенно менялся. В случае ТОБ-Р1 кривая уровня вирусной РНК имела обратную 8-образную форму, в то время как кривая нормализованного по количеству клеток сигнала люциферазы была сдвинута в сторону более низких концентраций фактора роста (рис. 31 В). Напротив, в присутствии пальбоциклиба в диапазоне концентраций 0,3-3 мкМ содержание вирусной РНК резко возрастало, в то время как нормализованный сигнал люциферазы выходил на плато значений (рис. 31 Е). Таким образом, как ТОБ-Р1, так и пальбоциклиб повышали содержание репликона по отношению к люциферазному сигналу в 2-2,5 раза. Полученный результат можно объяснить ускоренной деградацией фермента люциферазы. Действительно, поскольку репортерная люцифераза светлячка связана с убиквитином в полипротеине, транслируемом с первого цистрона репликона ВГС [226], убиквитин-зависимый путь протеасомной деградации люциферазы является наиболее предпочтительным.

Затем мы определили, как пальбоциклиб влияет на стехиометрическое соотношение между РНК ВГС и вирусными ферментами — протеазой/хеликазой NS3 и РНК-зависимой РНК-полимеразой NS5B, которые транслируются со второго цистрона репликона ВГС. По результатам вестерн-блот анализа (рис. 32 А) были построены зависимости №3/а-ТиЬ и №5В/а-ТиЬ, которые указывали на увеличение уровней обоих белков в присутствии пальбоциклиба в диапазоне концентраций 0,3-3 мкМ (рис. 32 Б). Количественным параметром накопления белков служило отношение содержания N83 и КБ5В к содержанию а-тубулина, нормированное на то же отношение в отсутствии исследуемого ингибитора ^83/ТиЬ, NS5В/Tub). Для того, чтобы корректно сравнить между собой уровни люциферазной активности и содержания вирусных белков NS3 и NS5B, необходимо было выполнить дополнительное нормирование, рассчитав рост или падение концентрации белков относительно общего знаменателя - содержания репликона. В соответствии с этим, в диапазоне концентраций пальбоциклиба 0,3-3 мкМ были получены и-образные кривые уровня люциферазы (0,4) и №3 (0,8), а в случае №5В, после начального падения, кривая достигла плато значений на уровне 0,75-0,70 (рис. 32 В). Далее с помощью мечения протеасом флуоресцентной пробой Me4BodipyFL-Ahx3Leu3VS, мы обнаружили, что инкубация клеток в присутствии 0,3 мкМ пальбоциклиба увеличивала количество активных

протеасом в 1,6 раза, но дальнейшее возрастание концентрации ингибитора элиминировало первоначальный эффект. Зеркально-симметричный вид кривой активации протеасом по отношению к кривым содержания люциферазы и NS3 указывал на то, что для обоих этих белков протеасомный путь деградации являлся основным (рис. 32 В).

Из литературы известно, что времена полужизни NS3 и NS5B почти одинаковы - 14,5 и 12 часов соответственно [227]. Для того, чтобы определить предпочтительные пути деградации белков NS3 и NS5B в клетках Huh7-luc/neo мы поочередно останавливали в них общий синтез белка, а также протеосомальную и лизосомальную протеазную активности, используя циклогексимид (CHX) - ингибитор трансляции, MG132 - ингибитор протеасомной активности, и гидроксихлорохин (CHL) - лизосомотропный агент, соответственно (рис. 32 Г). Результаты исследования показали, что 18-часовая инкубация клеток в присутствии CHX приводила к резкому падению содержания обоих белков. При этом, накопление NS3 наблюдалось в основном при подавлении протеасомной активности, тогда как содержание NS5B увеличивалось в одинаковой степени при подавлении активности как протеасомных, так и лизосомальных протеаз.

Рисунок 32. (A) Вестерн-блот анализ содержания вирусных белков NS3 и NS5B в клетках Huh7-luc/neo, обработанных указанными концентрациями пальбоциклиба после 72 часов инкубации. (Б) Графическая интерпретация результатов вестерн-блот анализа. (В) Кривые накопления Luc, NS3 и NS5B, нормализованные к значениям РНК ВГС, и активности протеасом (исходные значения Luc и Rep соответствуют данным из рисунка 31 Е, тогда как значения NS3 и NS5B

соответствуют данным из рисунка 32 Б. (Г) Оценка путей деградации NS3 и NS5B методом вестерн-блот анализа после 18 часовой обработки клеток Huh7-luc/neo циклогексимидом (CHX), ингибитором трансляции, MG132 (MG), ингибитором протеасомной активности, и гидроксихлорохином (CHQ), лизосомотропным рН-нейтрализующим агентом. Статистическая значимость оценена по t-критерию Стьюдента: *** (p < 0,001), ** (0,001 < p < 0,01), * (0,01 < p < 0,05), # (0,05 < p < 0,1), ns— незначимо.

3.3.2. Пальбоциклиб эффективно переводит клетки гепатомы в состояние клеточного старения

Остановка пролиферации является ключевым признаком клеточного старения, также, как и накопление активных форм кислорода, и увеличение среднего размера и количества лизосом с повышенной ß-галактозидазной активностью (SA-ß-Gal).

С помощью метода проточной цитометрии нами было установлено, что присутствие 1 мкМ пальбоциклиба уже через 24 часа вызывает значительное накопление клеток в Gl-фазе клеточного цикла (~90%). В присутствии TGF-ß1 аналогичное распределение клеток достигалось на 24 часа позже и при концентрации фактора 10 нг/мл (рис. 33 А). Таким образом, использование TGF-ß1 для остановки клеточного цикла и индукции старения в клетках Huh7-luc/neo оказалось неприемлемым для наших целей, также ввиду резкого падения содержания вирусного репликона.

Из литературы известно, что запускаемое TGF-ß1 клеточное старение ассоциировано с индукцией Nox4 и накоплением АФК [208], и что опосредованное пальбоциклибом ингибирование CDK4/6 также увеличивает продукцию АФК [228]. Судя по усилению флуоресцентного сигнала DCFH-DA, уровень АФК в клетках, обработанных пальбоциклибом, возрастал. Более того, одновременная обработка клеток агентом и N-ацетил-Ь-цистеином (NAC) - ингибитором АФК, значительно подавляла интенсивность флуоресценции, что подтверждало специфичность наблюдаемого эффекта (рис. 33 Б).

Рисунок 33. (А) Анализ распределения клеток по фазам клеточного цикла методом проточной цитометрии. Клетки Huh7-luc/neo были обработаны указанными концентрациями пальбоциклиба и TGF-P1 в течение 24 и 48 часов соответственно. (Б) Определение продукции АФК в клетках

А

Б

TGF-I31 (нг/мл) Пальбоциклиб (мкМ)

Пальбоциклиб (мкМ)

после 24 часов инкубации в присутствии пальбоциклиба с использованием флуоресцирующего красителя DCFH-DA (2',7'-дихлородигидрофлуоресцеин диацетат).

По мере развития старения клетки претерпевают морфологические изменения - клеточное ядро и размер клеток увеличиваются, а их форма становится уплощенной. Кроме того, происходит резкое увеличением количества и размера лизосом, обладающих повышенной ß-галактозидазной активностью (SA-ß-Gal) [201]. Окрашивание клеток Huh7-luc/neo специфическими красителями лизосом Acridine Orange и Lyso Tracker Red показало, что в присутствии пальбоциклиба в коцентрации 1 мкМ и 10 мкМ, количество лизосом в клетках последовательно и многократно возрастает (рис. 34). После попадания в клетку пальбоциклиб концентрируется в лизосомах - кислых везикулах, в которых происходит протонирование слабоосновных структурных элементов препарата - пиперазина (pKa 7,4) и пиридина (pKa 3,9) (рис. 37) [229], что препятствует его обратному переходу в цитозоль (явление лизосомального захвата). Одновременное флуоресцентное окрашивание клеток красителями Hoechst (синий сигнал флуоресценции в ядрах), LTR (красный сигнал флуоресценции в лизосомах) и пальбоциклибом (зеленый сигнал аутофлуоресценции) стало возможным благодаря успешному сочетанию спектральных характеристик всех трех соединений. Пальбоциклиб и Hoechst возбуждались одной длиной волны (405 нм), а флуоресцировали на разных. Используя это обстоятельство, мы идентифицировали совместную локализацию LTR и пальбоциклиба в клетках Huh7-luc/neo и обнаружили, что наибольшее накопление лизосом происходит в 1-10 мкМ диапазоне концентраций ингибитора (рис. 34).

Ctrl 0 рт 75 Ctrl 0 рт 75 Ctrl • 0 рт 75 Ctrl • 0 рт 75

1.0 0 рт 75 1.0 0 рт 75 1.0 0 рт 75 1.0 0 рт 75

10 . : 0 рт 75 10 0 |jm 75 10 0 рт 75 10 V Ч W-' ч д, * * - ■'$ V'* '«< "ж 1 \ /г Ч4 • 0 рт 75

О) ü er

Ol

о

Ol

00 -C

Acridine O.

Hoechst / Palbo

Hoechst/LTR

Merge

Рисунок 34. Изображения клеток Huh7-luc/neo, окрашенных акридиновым оранжевым (Acridine O), Hoechst и Lyso Tracker Red (LTR) после 48 часов инкубации в присутствии пальбоциклиба (Palbo) (концентрации показаны в верхнем левом углу), полученные методом конфокальной микроскопии.

Активность ассоциированной со старением лизосомальной ß-галактозидазы (SA-ß-Gal) является одним из наиболее широко используемых маркеров для идентификации старения в клетках и тканях [201]. Чтобы оценить динамику индукции старения в клетках Huh7-luc/neo, обработанных пальбоциклибом, мы окрашивали клетки после 3 и 7 дней инкубации, используя стандартный хромогенный субстрат ß-галактозидазы - X-Gal. Через 3 дня размер клеток увеличивался, они становились более округлыми и уплощенными, но активность ß-галактозидазы оставалась на уровне контроля, что указывало на предсенесцентное состояние клеток (рис. 35). После 7 дней инкубации обработанные клетки еще больше увеличивались в размерах и интенсивно окрашивались в присутствии X-Gal, что подтверждало их переход в состояние старения. Стоит отметить, что конфлюэнтность клеток резко снижалась, как при увеличении концентрации пальбоциклиба, так и при увеличении продолжительности времени инкубации, наглядно иллюстрируя сильные цитостатические, а также цитотоксические эффекты препарата.

Рисунок 35. Изображения клеток, обработанных указанными концентрациями пальбоциклиба (P) и окрашенных X-Gal после 3 и 7 дней инкубации. Сине-зеленый цвет указывает на положительное окрашивание и активность ß-галактозидазы. Изображения получены с помощью светового микроскопа (увеличение х10).

3.3.3. Пальбоциклиб вызывает накопление липидных капель и блокирует липофагию

Многочисленные данные указывают на то, что репликация вирусной РНК и сборка вирусных частиц происходят в органеллоподобных реплисомах ВГС, которые представляют собой липидные капли, декорированные двойными мембранами (DMV) [167]. Окрашивание клеток Huh7-luc/neo флуоресцентными красителями жировых капель и лизосом (рис. 36 A), BODIPY 493/503 (зеленый сигнал флуоресценции) и LTR соответственно, показало, что в присутствии пальбоциклиба в концентрациях 1 мкМ и 10 мкМ, площадь, занимаемая в клетке липидными каплями (ЛК) и лизосомами (ЛС) увеличивается, равно как и интенсивность их окрашивания (рис. 36 Б). Слияние ЛК с ЛС, характерное для селективного вида макроаутофагии - липофагии, нами не наблюдалось. Профиль линейного сканирования LTR+BODIPY сигнала ясно свидетельствует о накоплении в клетках ЛК и ЛС, увеличении среднего размера органелл и о полном отсутствии признаков их слияния (рис. 36 А). Интересно, что действие пальбоциклиба в этом случае напоминает ингибирование аутофагии хлорохином и гидроксихлорокином [230]. Вероятно, такой эффект является следствием сходства молекулярной структуры обоих соединений, где гетероциклическое ядро и алкиламмониевый остаток связаны друг с другом через короткий линкер (рис. 3 7).

A

48ч контроль Р (1мкМ) Р (ЮмкМ)

□ 0 |jrn 75 г ^ т ;4 г 0 (jm 75

» • V' v* •• : V. .у v .• Jfc > • .

0 pm 10 0 pm 10 ••,..■• . л - • 0 |im 10

LTR /Bodipy

sJÄAh . Л

Б

Рисунок 36. Накопление липидных капель (ЛК) и лизосом (ЛС) в клетках Huh7-luc/neo в присутствии пальбоциклиба (P). (А) Изображения клеток Huh7-luc/neo, окрашенных Hoechst, LTR и BODIPY, после 48 часов инкубации в присутствии пальбоциклиба, полученные с помощью конфокальной микроскопии; совместная колокализация сигналов флуоресценции BODIPY (ЛК) и LTR (ЛС), обозначенная профилем LTR+BODIPY сигнала (красный-зеленый). (Б) Площадь (мкм2 на клетку), занимаемая зеленой меткой (ЛК) и красной меткой (ЛС) в участке клеток, показанных на рисунке 36 A; Интенсивность зеленого (ЛК) и красного (ЛС) флуорохромов; эмиссию на ячейку рассчитывали, как сумму интенсивностей (0-255) всех зеленых и красных пикселей в ячейке и выражали в относительных единицах (RU). Площадь 1 пикселя составляет 0,0574 мкм2.

Н

рКа = 3.9

Пальбоциклиб

Хлорохин

Рисунок 37. Молекулярные структуры пальбоциклиба и хлорохина.

Далее с помощью вестерн-блот анализа мы показали, что нарушение липофагии не было вызвано ингибированием процесса образования аутофагосом [231]. Пальбоциклиб дозозависимым образом способствовал накоплению фосфатидилэтаноламинового белка LC3 В(LC3-II) - маркера созревающих аутофагосом и белка-рецептора p62/SQSTM1, обеспечивающего селективность доставки цитоплазматических «грузов» в аутофагосомы [232]. В диапазоне концентраций пальбоциклиба 0,3-10 мкМ наблюдалось увеличение уровней как р62, так и LC3-II (рис. 38 A), что согласуется с неполным течением аутофагии. Таким образом, разобщение процесса липофагии в присутствии пальбоциклиба, характеризующиеся отсутствием слиянии жировых капель с лизосомами, можно рассматривать как частный случай общего нарушения течения аутофагии.

Рисунок 38. Формирование аутофагосом в присутствии пальбоциклиба (P). (A) Вестерн-блот анализ накопления LC3-I, LC3-II и p62 в клетках Huh7-luc/neo в присутствии пальбоциклиба после 48 часов инкубации. (Б) Оценка содержания клеток Huh7, стабильно экспрессирующих GFP-LC3, после 48 часов обработки 10 мкМ пальбоциклиба (P). (В) Изображения клеток Huh7, стабильно экспрессирующих GFP-LC3 после 48 часов инкубации в присутствии пальбоциклиба (P), полученные с помощью конфокальной микроскопии.

Для того, чтобы подтвердить накопление аутофагосом в присутствии пальбоциклиба, с помощью лентивирусной конструкции была создана клеточная линия Huh7, стабильно экспрессирующая белок GFP-LC3. Максимальная эффективность трансфекции клеток после первого этапа селекции составила примерно 60% (рис. 38 Б). Трансфицированные клетки демонстрировали хорошо определяемый, но диффузный цитоплазматический сигнал белка GFP-LC3, в то время как в присутствии пальбоциклиба флуоресцентный сигнал становился более ярким и сосредоточенным, что указывало на рост экспрессии GFP-LC3 и его релокализацию из цитозоля в мембраны аутофагосом (рис. 38 В).

3.3.4. Сравнительное тестирование DAA препаратов в свободно пролиферирующих и в предсенесцентных клетках гепатомы

Полученные нами данные о том, что развитие состояния предсенесцентности в клетках Huh7-luc/neo оказывало стимулирующее влияние на репликацию вируса, стали предпосылкой создания тест-системы для скрининга соединений в условиях, характерных для клеточного старения. Использование пальбоциклиба позволило имитировать эффект TGF-P1 и индуцировать КС, избежав негативного влияния на репликацию ВГС фактора роста. Предварительная 24-часовая инкубация в присутствии 1 мкМ пальбоциклиба останавливала пролиферацию и повышала концентрацию АФК в клетках. Тестирование соединений проводилось в следующие 48 часов и также в присутствии 1мкМ пальбоциклиба. В этот промежуток времени менялась морфология клеток, в них активно накапливались лизосомы, аутофагосомы и жировые капли, при этом течение аутофагии было неполным, а липофагия - заблокированной.

Чтобы установить, как статус предсенесцентности клеток Huh7-luc/neo влияет на противовирусное действие DAA, мы выбрали четыре соединения: telaprevir [233] - ингибитор вирусной протеазы NS3/4A, аналог нуклеозида/нуклеотида - 2'-Me-Ad [234], sofosbuvir [235] и ribavirin [236] (табл. 6). Дозозависимое ингибирование репликона ВГС препаратами telaprevir и 2'-Me-Ad было одинаковым как в свободно пролиферирующих (СП), так и в обработанных пальбоциклибом клетках. Полученный результат был ожидаемым, поскольку сила ингибирующего действия DAA в отношении вирусных ферментов не зависит от статуса клетки. Следовательно, значения EC50, полученные в обеих тест-системах, должны быть сопоставимы, что и наблюдалось в случае этих двух соединений, которые можно рассматривать в качестве

эталонных для сравнения результатов, полученных в условиях свободной пролиферации и сенесцентности.

Неожиданно, но в предсенесцентных клетках активность анти-ВГС агентов sofosbuvir и ribavirin снижалась в 2,5 и 3 раза, соответственно, что, весьма вероятно, было связано с влиянием клеточных факторов. Действительно, в случае препарата sofosbuvir превращение пролекарства фосфорамидата в промежуточный нуклеозид-5'-монофосфат осуществляется клеточными ферментами катепсином А (CatA) и нуклеотид-связывающим белком, кодируемым геном HINT1 [237]. Таким образом, противовирусное действие препарата зависит от активности этих ферментов и не является прямым. Аналогичный вывод можно сделать и для препарата ribavirin, противовирусный эффект которого, помимо прямого ингибирования репликации ВГС, состоит в ингибировании инозинмонофосфат-дегидрогеназы клетки-хозяина (IMPDH) [236].

Ингибитор Молекулярная структура Мишень ВГС Статус клетки ECso(M Р CCso(M Р TI

Telaprevir 0 И сАн н о VNH ° н ^^ NS3/4A протеаза СП ПС 0.21 ± 0.02 0.20 ± 0.05 ns 100 ± 15 230 ± 59 480 1150

2'-Me-Ad /=n но \_г т « но он NS5B СП ПС 0.14 ± 0.01 0.12 ± 0.02 ns 140 ± 41 110 ± 5.0 1000 920

Sofosbuvir \ о н Уо ; Vv° 0 hn' р-0 \_Г" ^^ а6 v NS5B СП ПС 0.063±0.00 2 0.15 ± 0.03 ** >300 >300 >4800 >2000

Ribavirin но4 'он NS5B СП ПС 30 ± 5.0 92 ± 8.0 *** >1000 >1000 >33 >11

Таблица 6. Тестирование DAA в свободно пролиферирующих (СП) и предсенесцентных (ПС) клетках Huh7-luc/neo и Huh7. Клетки были обработаны различными концентрациями исследуемых соединений в присутствии пальбоциклиба или без него, в течение необходимого времени. Измеряли концентрации ингибитора, вызывающие 50% ингибирование репликации ВГС (EC50; n = 4) и 50% снижение жизнеспособности клеток (CC50; n = 6). Индекс селективности (SI) = CC50/EC50. Статистическая значимость оценена по t-критерию Стьюдента: *** (р < 0,001), ** (0,001 < р < 0,01), ns — незначимо.

3.3.5. Сравнительное тестирование ингибиторов HDAC в свободно пролиферирующих и в предсенесцентных клетках гепатомы

Описанные выше результаты явно продемонстрировали, что HDACi, нацеленные на HDAC I, IIb классов, эффективно подавляют репликацию ВГС в свободно пролиферирующих клетках гепатомы. Следующим шагом работы было изучение активности ингибиторов в условиях клеточного старения. Нами были протестированы в предсенесцентных клетках гепатомы Huh7-luc/neo и Huh7 мультипотентные ингибиторы HDACi - vorinostat [183] и belinostat [218]; ингибиторы HDAC 1/2/3 и HDAC8 I класса — CI-994, SR-3212 и орто-PhO-CHA [13, 224, 217]; ингибиторы HDAC IIa класса - Cmpd13 и TMP-269 [218]; селективный ингибитор HDAC6 IIb класса - Cmpd12a; и двойные ингибиторы HDAC6/10 IIb класса - tubastatin A и bufexamac [218, 239, 240] (табл. 7).

Было обнаружено, что пан-ингибиторы vorinostat, belinostat и селективный ингибитор HDAC6 - Cmpd12 резко снижают свою активность. Это наблюдение прежде всего указывает на то, что сенесцентность может значительно влиять на противовирусную активность HDACi. Действительно, свободно пролиферирующие клетки гепатомы представляют собой не самый подходящий объект для интерпретации противовирусного действия агентов vorinostat и belinostat, поскольку оба соединения обладают высокой противораковой активностью. Таким образом, использование предсенесцентных клеток впервые позволило оценить анти-ВГС активность этих соединений в условиях отсутствия клеточной пролиферации. Удивительно, но предсенесцетные клетки в отличие от свободно пролиферирующих оказались более чувствительны к действию ингибиторов самой различной селективности: орто-PhO-CHA (HDAC8 I класса), TMP-269 (HDAC IIa класса) и tubastatin А (HDAC IIb класса). Сравнение результатов, полученных для Cmpd12 и tubastatin А, указывают на то, что HDAC10 и HDAC6 в совокупности являются более уязвимой мишенью, чем HDAC6, в условиях клеточного старения. Следует отметить, что анти-ВГС активность SR-3212 и Cmpd13 снижалась, хотя и умеренно (в 2 и 3 раза соответственно) (табл. 7).

Ингибитор Молекулярная структура Мишень HDAC Статус клетки ECso(M Р CCofrM) Р TI

Vorinostat I и II класс СП ПС 0.62 ± 0.03 10 ± 1.8 *** 1.2 ± 0.22 >30 1.9 >3

Belinostat ^^nh 0 I и II класс СП ПС 0.23 ± 0.06 2.8 ± 0.25 *** 0.68 ± 0.02 >30 3.0 >11

CI-994 ^Oip h2n I класс 1/2/3 СП ПС 8.3 ± 0.46 7.2 ± 1.9 ns 630 ± 35 480 ± 60 76 67

SR-3212 4=7 hn-nh I класс 1/2/3 СП ПС 1.3 ± 0.22 2.6 ± 0.72 * 20 ± 1.6 >100 15 >39

o-PhO-CHA а „ ^J^^nhoh I класс 8 СП ПС 0.56 ± 0.088 0.39 ± 0.065 * 160 ± 10 170 ± 10 290 440

Cmpd13 IIa класс 4/5/7 СП ПС 0.85 ± 0.059 2.5 ± 0.57 ** 630 ± 40 760 ± 40 740 300

TMP-269 n^s 0 n-0 (TsV^ IIa класс 4/5/7/9 СП ПС 5.1 ± 0.20 4.1 ± 0.20 *** 70 ± 7.0 >100 14 >24

Cmpd12a IIb класс 6 СП ПС 0.270.08 2.8 ± 0.45 *** 13 ± 1.8 >30 43 >11

Tubastatin А vrn Wv ^V^nhoh Ч-» о IIb класс 6/10 СП ПС 1.0 ± 0.15 0.63 ± 0.11 * 24 ± 2.8 >30 20 >48

Bufexamac IIb класс 6/10 СП ПС 5.3 ± 0.98 4.3 ± 0.43 ns >300 >300 >57 >70

Таблица 7. Тестирование HDACi в свободно пролиферирующих (СП) и предсенесцентных (ПС) клетках Huh7-luc/neo и Huh7. Клетки были обработаны различными концентрациями исследуемых соединений в присутствии пальбоциклиба или без него, в течение необходимого времени. Измеряли концентрации ингибитора, вызывающие 50% ингибирование репликации ВГС (EC50; n = 4) и 50% снижение жизнеспособности клеток (CC50; n = 6). Индекс селективности (SI) = CC50/EC50. Статистическая значимость оценена по t-критерию Стьюдента: *** (р < 0,001), ** (0,001 < р < 0,01), ns — незначимо.

3.3.6. Сравнение антивирусной активности структурных аналогов

Cmpd12a и Tubastatin А

Ранее в нашей лаборатории для tubastatin А, высокоселективного ингибитора HDAC6/10, была обнаружена строгая концентрационная корреляция между ингибированием ВГС и накоплением ацетилированной формы а-тубулина (a-TubK40ac) - субстрата HDAC6. Обнаруженное в этой работе различие между противовирусной активностью в предсенесцентных клетках близких структурных аналогов, tubastatin A и селективного ингибитора HDAC6 Cmpd12a, явно указывало на разные механизмы действия этих соединений. Одной из возможных причин снижения эффективности ингибирования репликона Cmpd12a в условиях предсенесцентности могла быть сверхэкспрессия HDAC6, индуцированная Cmpd12a, но не tubastatin А. Чтобы проверить эту гипотезу мы оценили эффективность ингибирования HDAC6 с помощью вестерн-блот анализа по накоплению ацетилированной формы а-тубулина (Ас-Tub/Tub) в присутствии каждого из соединений в СП и ПС клетках Huh7-luc/neo. Оказалось, что tubastatin А и Cmpd12a с равной силой ингибировали HDAC6 (рис. 39).

Рисунок 39. Ингибирование НОАС6 в свободно пролиферирующих (СП) и предсенесентных (ПС) клетках Huh7-luc/neo, обработанных указанными концентрациями ингибиторов после 24 часов инкубации. Ингибирование НОАСб оценено с помощью вестерн-блот анализа по содержанию ацетилированной формы а тубулина - а-ТиЬК40ас в лизатах клеток; N0 — не определено.

В соответствии с литературными данными tubastatin А одновременно связывается с каталитическим центром НОАС6 и НОАСШ [241]. Аффинность связывания tubastatin А с активным центром НОАСШ обеспечивается взаимодействием третичной аминогруппы кэпа ингибитора с карбоксильной группой остатка Glu272 фермента. При флуоресцентном

окрашивании клеток Huh7-luc/neo акридиновым оранжевым (Acridine O), мы обнаружили, что tubastatin А вызывает существенный рост количества лизосом, в то время как присутствие Cmpd12a не оказывает такого эффекта. Кроме того, мы показали, что Cmpd12a не препятствует увеличению площади, занимаемой лизосомами, в присутствии пальбоциклиба (рис. 40). Накопление лизосом в присутствии tubastatin А могло быть результатом ингибирования HDAC10, как это было описано ранее для клеток нейробластомы [239]. Являясь нейтральным аналогом tubastatin А, Cmpd12a не способен образовывать ионную пару с карбоксильной группой остатка Glu272 HDAC10 и, следовательно, не обладает высокой аффинностью для связывания с этим ферментом. Важно отметить, что при одновременном ингибировании HDAC6 и HDAC10 в присутствии tubastatin А наблюдается сохранение противовирусной активности соединения в обеих тест-системах. Таким образом, мы впервые смогли предложить HDAC10 в качестве уязвимой мишени против ВГС, и, хотя эти результаты являются предварительными, они демонстрируют уникальные возможности предложенного подхода для изучения и оценки противовирусного потенциала HDACi.

48 ч Контроль P(1MKM) C12a (ЗмкМ) С12а(ЗмкМ) + P(1mkM) Tub А (ЗмкМ) Tub А (ЗмкМ)+Р(1мкМ)

• * * V* Г * !.■ f |t * • / ■ # в |«l V • iV Л • • 9 я ( w 0 ♦ TT • #.■ 41 * ф • m 0 • • * i • 1 § Ш 1 •

.%• щ 0 pm 75 Vife jgg. j 0 pm 75 • 0 9 «t о ■ 0 . m n г г .¡Йь 0 pm 75 % 0 pm 75 * •Я. 7.

Acridine О.

Рисунок 40. Изображения клеток, окрашенных Acridine O, после 48 часов инкубации в присутствии Cmpd12a (C12a), Tubastatin A (Tub A) и пальбоциклиба (P), полученные с помощью конфокальной микроскопии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

За последние несколько лет анти-ВГС терапия претерпела революционные изменения, связанные с использованием сразу нескольких противовирусных препаратов прямого действия (DDA), направленных на белки вируса. Как было описано выше, применение комбинаций из двух или трех таких препаратов позволило отказаться от интерфероновой терапии и повысило значения устойчивости вирусологического ответа. Однако, в DAA-терапии до сих пор остается много ограничений, главным образом, развитие лекарственной резистентности. Агенты опосредованного действия (НТА), представленные в данной работе ингибиторами гистондеацетилаз, подавляют репликацию вируса за счет ингибирования клеточных мишеней, участвующих в жизненном цикле ВГС, что принципиально позволяет преодолеть эту проблему.

В настоящей работе нами была показана строгая корреляция между ингибированием активности ядерных и цитоплазматических HDAC I/IIb классов и подавлением репликации ВГС коричными гидроксамовыми кислотами (СНА). Для того, что увеличить достоверность корреляционных зависимостей были получены и протестированы 15 структурных изомеров СНА, разделенных на три группы: орто-, мета- и пара-производных. При изучении взаимосвязи между подавлением вирусной репликации и эффективностью ацетилирования белков-субстратов HDAC I/IIb классов был показано, что анти-ВГС активность структурных изомеров CHA достоверно коррелировала с ингибированием HDAC8 в случае орто-CHA, тогда как в случае мета-CHA она коррелировала с ингибированием HDAC1/2/3 и HDAC6. При этом, противовирусная активность пара-СНА не была связана с ингибированием HDAC I/IIb класса.

В результате проведенной работы был установлен приоритет влияния двух элементов фармакофора HDACi: сар-группы и ZBG-группы, представленной N-пропилгидразидом, на селективность ингибирования HDAC. Сравнительное исследование гидроксамовых ингибиторов HDAC различной селективности c их N-пропилгидразидными аналогами показало, что N'-пропилгидразидная ZBG-группа полностью перенаправляет селективность ингибирования в сторону HDAC 1/2/3. При этом, влияние сар-заместителей на смену селективности оказалось минимальным.

Как известно, вирус гепатита С индуцирует в пораженных гепатоцитах печени развитие клеточного старения. Важной и неотъемлемой характеристикой клеточного старения является арест клеточного цикла в G1 фазе. При использовании TGF-P1 для индукции сенесцентности в клетках гепатомы Huh7-luc/neo, поддерживающих репликацию ВГС, было обнаружено, что арест клеточного цикла в G1 фазе происходит только при концентрациях фактора, сильно угнетающих репликацию вируса. Использование низкомолекулярного аналога TGF-P1 - ингибитора CDK4/6, пальбоциклиба, позволило решить эту проблему. Пальбоциклиб вызывал ускоренное развитие

признаков клеточного старения, включая G1-арест клеточного цикла, и при этом увеличивал содержание вирусных белков и РНК. Наблюдаемый эффект был связан с увеличением количества жировых капель, с одной стороны, и с нарушением полного течения аутофагии, с другой. В целом, использование пальбоциклиба позволило создать первую функциональную модель сенесцентных клеток гепатомы, поддерживающих репликацию ВГС, которую мы использовали для оценки эффективности противовирусных препаратов на поздних стадиях заболевания.

Переход из свободно пролиферирующего в предсенесцентное состояние клеток Huh7-luc/neo в присутствии пальбоциклиба мало отражается на силе антивирусных агентов прямого действия. Полученный результат был ожидаемым, поскольку сила ингибирующего действия DAA в отношении вирусных ферментов не зависит от статуса клетки. Наоборот, оказалось, что сенесцентность может значительно влиять на противовирусную активность HDACi. Весьма вероятно, что в условиях остановки клеточного цикла НОАС проявляют свой истинный противовирусный потенциал, поскольку их противоопухолевая активность, усложняющая интерпретацию результатов, сводится к минимуму. Было обнаружено, что пан-ингибиторы HDAC - vorinostat и belinostat, также как и селективный ингибитор HDAC6 - Cmpd12 - резко снижают свою активность. С другой стороны, в предсенесцентных клетках ингибирование вирусной репликации двунаправленным ингибитором НОАСб/Ш - tubastatin А - возрастало, что указывает на перспективность НОАСШ в качестве уязвимой мишени для терапии гепатита С на поздних стадиях заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Изучена взаимосвязь между подавлением репликации ВГС и ингибированием HDAC I/IIb классов. Показано, что анти-ВГС активность 15 структурных изомеров CHA достоверно коррелировала с ингибированием HDAC8 в случае орто-CHA, тогда как в случае мета-CHA она коррелировала с ингибированием HDAC1/2/3 и HDAC6.

2. Изучено влияние N'-пропилгидразидной ZBG-группы на избирательность действия селективных ингибиторов HDAC6 и мультипотентных ингибиторов HDAC. Показано, что N'-пропилгидразидная группа обеспечивает селективное ингибирование HDAC I класса (HDAC 1/2/3) независимо от структуры линкера и наличия сар-фрагмента исходного гидроксамового ингибитора.

3. Впервые создана функциональная модель сенесцентных клеток гепатомы, инфицированных ВГС. С помощью пальбоциклиба - ингибитора циклинзависимых киназ 4/6 - индуцировано клеточное старение и охарактеризованы его основные признаки. Пальбоциклиб эффективно останавливает клетки в G1 фазе клеточного цикла, инициирует в них продукцию АФК, последовательно увеличивает количество и размер лизосом, обладающих Р-галактозидазной активностью.

4. Изучено влияние старения в клетках гепатомы человека Huh7-luc/neo на репликацию вируса гепатита С. Показано, что пальбоциклиб повышает содержание вирусных белков и РНК в клетках, за счет увеличения жировых капель с одной стороны, и блокирования процесса липофагии как частного случая аутофагии, с другой стороны.

5. Показано, что антивирусная активность ингибиторов HDAC изменяется при переходе клеток Huh7-luc/neo из свободно пролиферирующего в предсенесцентное состояние. Мультипотентные ингибиторы HDAC - vorinostat и belinostat, также, как и селективный ингибитор HDAC6 -Cmpd12 - резко снижают свою активность. С другой стороны, в предсенесцентных клетках ингибирование вирусной репликации двунаправленным ингибитором HDAC6/10 - tubastatin А -возрастало. HDAC10 впервые была предложена в качестве потенциальной мишени против ВГС.

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаю глубокую благодарность научному руководителю к.х.н. Козлову Максиму Викторовичу, под руководством которого выполнялась данная работа, за вдохновение к воплощению поставленных целей и неоценимый вклад в формирование научных взглядов, за переданный опыт и помощь, оказанные при планировании экспериментов и написании диссертации.

Выражаю благодарность коллективу Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений и ее бывшим сотрудникам, в особенности Земской Анастасии Сергеевне за помощь при проведении экспериментов и поддержку, заведующему лабораторией академику РАН Кочеткову Сергею Николаевичу за ценные советы и замечания при оформлении работы, Кондукторову Константину Андреевичу за переданный опыт, знания и умения.

Выражаю благодарность коллективу Лаборатории биохимии вирусных инфекций, в особенности к.б.н. Валуеву-Эллистону Владимиру Треворовичу за помощь в планировании экспериментов и к.б.н. Смирновой Ольге Александровне за помощь в измерении уровня АФК в клетках.

Выражаю благодарность сотруднику Лаборатории пролиферации клеток Далиной Александре Александровне за помощь в трансфекции клеток и получении лентивирусных частиц, сотрудникам Лаборатории клеточных основ развития злокачественных заболеваний Попенко Владимиру Ивановичу и Леоновой Ольге Геннадьевне за помощь в конфокальной микроскопии, сотруднику Лаборатории регуляции внутриклеточного протеолиза Морозову Алексею Владимировичу за измерение протеасомной активности.

Выражаю благодарность сотруднице Лаборатории дизайна и синтеза биологически активных соединений к.х.н. Зенченко Анастасии Андреевне за помощь и поддержку.

Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (проект № 20-04-00504) и РНФ (проект № 23-24-00542).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. World Health Organization [Электронный ресурс]. https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/hepatiti s-c/ (дата обращения: 04.12.2022).

2. Maasoumy B., Wedemeyer H. Natural history of acute and chronic hepatitis C // Best Pract Res Clin Gastroenterol. - 2012. - Т. 26, № 4. - С. 401-412.

3. Ozakyol A. Global Epidemiology of Hepatocellular Carcinoma (HCC Epidemiology) // J Gastrointest Cancer. 2017. - Т. 48, № 3. - С. 238-240.

4. Kulik L., El-Serag, H. B. Epidemiology and Management of Hepatocellular Carcinoma // Gastroenterol. - 2019. - Т. 156, № 2. - С. 477-491.

5. Nevola R., Acierno C., Pafundi P. C., 1, Adinolfi L. E. Chronic hepatitis C infection induces cardiovascular disease and type 2 diabetes: mechanisms and management // Minerva Med. - 2021. -Т.112, № 2. - С. 188-200.

6. Noell B. C., Besur S. V., de Lemos A. S. Changing the face of hepatitis C management - the design and development of sofosbuvir // Drug Des Devel Ther. - 2015. - Т. 9. - С. 2367-2374.

7. Baumert T. F., Juhling F., Ono A., Hoshida Y. Hepatitis C-related hepatocellular carcinoma in the era of new generation antivirals // BMC Med. - 2017. - Т. 15, № 52.

8. Nelson D. R., Cooper J. N., Lalezari J. P., Lawitz E., Pockros P. J., Gitlin N., Freilich B. F., Younes Z. H., Harlan W., Ghalib R., Oguchi G., Thuluvath P. J., Ortiz-Lasanta G., Rabinovitz M., Bernstein D., Bennett M., Hawkins T., Ravendhran N., Sheikh A. M., Varunok P., Kowdley K. V., Hennicken D., McPhee F., Rana K., Hughes E. A. All-oral 12-week treatment with daclatasvir plus sofosbuvir in patients with hepatitis C virus genotype 3 infection: ALLY-3 phase III study // Hepatology. - 2015. - Т. 61, №4. - С. 1127-1135.

9. Crouchet, E., Wrensch, F., Schuster, C., Zeisel, M. B., Baumert, T. F. Host-targeting therapies for hepatitis C virus infection: Current developments and future applications // Ther Adv Gastroenterol. -2018. - Т. 11. - С. 1-15.

10. Stanciu C., Trifan A., Muzica C., Sfarti C. Efficacy and safety of alisporivir for the treatment of hepatitis C infection // Expert Opin Pharmacother. - 2019. - Т. 20, №4. - С. 379-384.

11. Catanese M. T., Dorner M. Advances in experimental systems to study hepatitis C virus in vitro and in vivo // Virology. - 2015. - Т. 479-480. - С. 221-33.

12. Щербакова А.С., Кочетков С.Н., Козлов М.В. Как гистондеацетилаза 3 контролирует экспрессию гепсидина и репликацию вируса гепатита С // Молекулярная биология. - 2023. - Т. 57, № 3.

13. Zhou Y., Wang Q., Yang Q., Tang J., Xu C., Gai D., Chen X., Chen J. Histone Deacetylase 3 Inhibitor Suppresses Hepatitis C Virus Replication by Regulating Apo-A1 and LEAP-1 Expression // Virol Sin. - 2018. - Т. 33, № 5. - С. 418-428.

14. Kim K., Lee Y., Jeong S., Kim D., Chon S., Pak Y.K., Kim S., Ha J., Kang I., Choe W. A Small Molecule, 4-Phenylbutyric Acid, Suppresses HCV Replication via Epigenetically Induced Hepatic Hepcidin // Int J Mol Sci. - 2020. - Т. 21, № 15. - С. 5516.

15. Yeo W., Chung H. C., Chan S. L., Wang L. Z., Lim R., Picus J., Boyer M., Mo F. K. F., Koh J., Rha S. Y., Hui E. P., Hei C. J., Roh J. K., Yu S. C. H., To K. F., Tao Q., Ma B. B., Chan A. W. H., Tong J. H. M., Erlichman С., Chan A. T. C., Goh B. C. Epigenetic therapy using belinostat for patients with unresectable hepatocellular carcinoma: A multicenter phase I/II study with biomarker and pharmacokinetic analysis of tumors from patients in the mayo phase II consortium and the cancer therapeutics research group // J Clin Oncol. - 2012. - Т. 30, № 27. - С. 3361-3367.

16. Blackard J.T., Shata M. T., Shire N. J., Sherman K. E. Acute hepatitis C virus infection: A chronic problem // Hepatology. - 2007. - Т. 47, № 1. - С. 321-331.

17. Zampino R., Marrone A., Restivo L., Guerrera B., Sellitto A., Rinaldi L., Romano C., Adinolfi L. E. Chronic HCV infection and inflammation: Clinical impact on hepatic and extra-hepatic manifestations // World J. Hepatol. - 2013. - Т. 5, № 10. - С. 528-540.

18. Aravinthan A. D., Alexander G. J. M. Senescence in chronic liver disease: Is the future in aging? // J Hepatol. - 2016. - Т. 65, № 4. - С. 825-834.

19. Ai T., Xu Y., Qiu L., Geraghty R. J., Chen L. Hydroxamic acids block replication of hepatitis C virus // J Med Chem. - 2015. - Т. 58, № 2. - С. 785-800.

20. Kozlov M. V., Kleymenova A. A., Romanova L. I., Konduktorov K. A., Kamarova K. A., Smirnova O. A., Prassolov V. S., Kochetkov S. N. Pyridine hydroxamic acids are specific anti-HCV agents affecting HDAC6 // Bioorg Med Chem Lett. - 2015. - Т. 25, 2382-2382

21. Gritsenko D., Hughes G. Ledipasvir/Sofosbuvir (harvoni): improving options for hepatitis C virus infection // P T. - 2015. - Т. 40, № 4. - С. 256-276.

22. Ghany M. G., Morgan T. R. Hepatitis C Guidance 2019 Update: American Association for the Study of Liver Diseases-Infectious Diseases Society of America Recommendations for Testing, Managing, and Treating Hepatitis C Virus Infection // Practice Guideline. - 2020. - T. 71, № 2. - C. 686-721.

23. Bartenschlager R., Lohmann V. Replication of hepatitis C virus // J Gen Virol. - 2000. - T. 81, № 7. - C. 1631-1648.

24. Atoom A. M., Taylor N. G., Russell R. S. The elusive function of the hepatitis C virus p7 protein // Virology. - 2014. - T. 462-463. - C. 377-387.

25. Owsianka A. M, Timms JM, Tarr A. W., Brown R. J., Hickling T. P., Szwejk A., Bienkowska-Szewczyk K., Thomson B. J., Patel A. H., Ball J. K. Identification of conserved residues in the E2 envelope glycoprotein of the hepatitis C virus that are critical for CD81 binding // J Virol. - 2006. - T. 80, № 17. - C. 8695-8704.

26. Evans M. J., von Hahn. T., Tscherne D. M., Syder A. J., Panis M., Wölk B., Hatziioannou T., McKeating J. A., Bieniasz P. D., Rice C. M. Claudin-1 is a hepatitis C virus co-receptor required for a late step in entry // Nature. - 2014. - T. 446, № 7137. - C. 801-805.

27. Ploss A., Evans M. J., Gaysinskaya V. A., Panis M., You H., de Jong Y. P., Rice C. M. Human occludin is a hepatitis C virus entry factor required for infection of mouse cells // Nature. - 2009. - T. 457,

№ 7231. - C. 882-886.

28. Boulant S., Vanbelle C., Ebel C., Penin F., Lavergne J. P. Hepatitis C virus core protein is a dimeric alpha-helical protein exhibiting membrane protein features // J Virol. - 2005. - T. 79, № 17. - C. 1135311365.

29. Suzuki R., Sakamoto S., Tsutsumi T., Rikimaru A., Tanaka K., Shimoike T., Moriishi K., Iwasaki T., Mizumoto K., Matsuura Y., Miyamura T., Suzuki T. Molecular determinants for subcellular localization of hepatitis C virus core protein // J Virol. - 2005. - T. 79, № 2. - C. 1271-1281.

30. Lorenz I.C., Marcotrigiano J., Dentzer T. G., Rice C. M. Structure of the catalytic domain of the hepatitis C virus NS2-3 protease // Nature. - 2006. - T. 443. - C. 831-835.

31. Gentzsch J., Brohm C., Steinmann E., Friesland M., Menzel N., Vieyres G., Perin P. M., Frentzen A., Kaderali L., Pietschmann T. Hepatitis c Virus p7 is critical for capsid assembly and envelopment // PLoS Pathog. - 2005. - T. 9, № 5. - C. e1003355.

32. Li H. C., Lo S. Y. Hepatitis C virus: Virology, diagnosis and treatment // World J Hepatol. - 2015. - T. 7, № 10. - T. 1377-1389.

33. Baril M., Racine M. E., Penin F., Lamarre D. MAVS dimer is a crucial signaling component of innate immunity and the target of hepatitis C virus NS3/4A protease // J Virol. - 2009. - T. 83. - C. 1299-1311.

34. Gosert R., Egger D., Lohmann V., Bartenschlager R., Blum H. E., Bienz K., Moradpour D. Identification of the hepatitis C virus RNA replication complex in Huh-7 cells harboring subgenomic replicons // J Virol. - 2003. - T. 77, № 9. - C. 5487-5492.

35. Tabata K., Prasad V., Paul D. et al. Convergent use of phosphatidic acid for hepatitis C virus and SARS-CoV-2 replication organelle formation // Nat Commun. - T. 12, № 1. - C. 7276.

36. Tripathi L.P., Kataoka C., Taguwa S., Moriishi K., Mori Y., Matsuura Y., Mizuguchi K. Network based analysis of hepatitis C virus core and NS4B protein interactions // Mol Biosyst. - 2010. - T. 6. -C. 2539- 2553.

37. Lee J. Y, Cortese M., Haselmann U., Tabata K., Romero-Brey I., Funaya C., Schieber N. L., Qiang Y., Bartenschlager M., Kallis S., Ritter C., Rohr K., Schwab Y., Ruggieri A., Bartenschlager R. Spatiotemporal Coupling of the Hepatitis C Virus Replication Cycle by Creating a Lipid Droplet-Proximal Membranous Replication Compartment // Cell Rep. - 2019. - T. 27, №12. - C. 3602-3617.

38. Vieyres G., Pietschmann T. HCV Pit Stop at the Lipid Droplet: Refuel Lipids and Put on a Lipoprotein Coat before Exit // Cells. - 2019. - T. 8, №3. - C. 233.

39. Franck N., Le Seyec J., Guguen-Guillouzo C., Erdtmann L. Hepatitis C virus NS2 protein is phosphorylated by the protein kinase CK2 and targeted for degradation to the proteasome // J Virol. -2005. - T. 79, №5. - C. 2700-2708.

40. Tanji Y., Kaneko T., Satoh S., Shimotohno K. Phosphorylation of hepatitis C virus-encoded nonstructural protein NS5A // J Virol. - 1995. - T. 69, № 7. - C. 3980-3996.

41. Yin C., Goonawardane N., Stewart H., Harris M. A role for domain I of the hepatitis C virus NS5A protein in virus assembly // PLoS Pathog. - 2018. - T. 14, № 1. - C. e1006834.

42. Buck K. W. Comparison of the replication of positive-stranded RNA viruses of plants and animals // Adv Virus Res. - 1996. - T. 47. - C. 159-251

43. Romero-Brey I., Lohmann V. The HCV Replicase Complex and Viral RNA Synthesis // Hepatitis C Virus I. - 2016. - C. 149-196.

44. Lupberger J., Brino L., Baumert T. F. RNAi: a powerful tool to unravel hepatitis C virus-host interactions within the infectious life cycle // J Hepatol. - 2008. - T. 48, № 3. - C. 523-525.

45. Oh J. W., Sheu G. T., Lai M. M. Template requirement and initiation site selection by hepatitis C virus polymerase on a minimal viral RNA template // J Biol Chem. - 2000. - T. 275, № 23. - C. 1771017717.

46. Ivanov A. V., Korovina A. N., Tunitskaya V. L., Kostyuk D. A., Rechinsky V. O., Kukhanova M. K., Kochetkov S. N. Development of the system ensuring a high-level expression of hepatitis C virus nonstructural NS5B and NS5A proteins // Protein Expr Purif. - 2006. - T. 48, № 1. - C. 14-23.

47. Lohmann V., Korner F., Koch J., U. Herian., Theilmann L., Bartenschlager R. Replication of subgenomic hepatitis C virus RNAs in a hepatoma cell line // Science. - 1999. - T. 285, № 5424. - C. 110-113.

48. Koutsoudakis G., Kaul A., Steinmann E., Kallis S., Lohmann V., Pietschmann T., Bartenschlager R. Characterization of the Early Steps of Hepatitis C Virus Infection by Using Luciferase Reporter Viruses // J Virol. - 2006. - T. 80, № 11. - T. 5308-5320.

49. Ikeda M., Yi M., Li K., Lemon S. M. Selectable subgenomic and genome-length dicistronic RNAs derived from an infectious molecular clone of the HCV-N strain of hepatitis C virus replicate efficiently in cultured Huh7 cells // J Virol. - 2002. - T. 76, № 6. - T. 2997-3006.

50. Krönke J., Kittler R., Buchholz F., Windisch M. P., Pietschmann T., Bartenschlager R., Frese M. Alternative Approaches for Efficient Inhibition of Hepatitis C Virus RNA Replication by Small Interfering RNAs // J Virol. - 2002. - T. 78, № 7. - C. 3436-3446.

51. Kato T., Date T., Miyamoto M., Furusaka A., Tokushige K., Mizokami M., Wakita T. Efficient replication of the genotype 2a hepatitis C virus subgenomic replicon // Gastroenterol. - 2003. - T. 125. - C. 1808-1817.

52. Wakita T., Pietschmann T., Kato T., Date T., Miyamoto M., Zhao Z., Murthy K., Habermann A., Kräusslich H. G, Mizokami M., Bartenschlager R., Liang T. J. Production of infectious hepatitis C virus in tissue culture from a cloned viral genome // Nat Med. - 2005. - T. 11, № 7. - C. 791-796.

53. Gottwein J. M., Scheel T. K. H., Jensen T. B., Lademann J. B., Prentoe J. C., Knudsen M. L., Hoegh A. M., Bukh J. Development and characterization of hepatitis C virus genotype 1-7 cell culture systems:

Role of CD81 and scavenger receptor class B type I and effect of antiviral drugs // Hepatol. - 2009. - T. 49, № 2. - C. 364-377

54. Bourliere M., Pietri O. Hepatitis C virus therapy: No one will be left behind // Int J Antimicrob Agents. - 2019. - T. 53, № 6. - C. 755-760.

55. Dietz J., Spengler U., Müllhaupt B., Schulze Zur Wiesch J., Piecha F., Mauss S., Seegers B., Hinrichsen H., Antoni C., Wietzke-Braun P., Peiffer K. H., Berger A., Matschenz K., Buggisch P., Backhus J., Zizer E., Boettler T., Neumann-Haefelin C., Semela D., Stauber R., Berg T., Berg C., Zeuzem S., Vermehren J., Sarrazin C. European HCV Resistance Study Group. Efficacy of Retreatment After Failed Direct-acting Antiviral Therapy in Patients With HCV Genotype 1-3 Infections // Clin Gastroenterol Hepatol. - 2021. - T. 19, № 1. - C. 195-198.

56. Baumert T. F., Berg T., Lim J. K., Nelson D. R. Status of Direct-Acting Antiviral Therapy for Hepatitis C Virus Infection and Remaining Challenges // Gastroenterol. - 2019. - T. 156, № 2. - C. 431445.

57. Vermehren J., Susser S., Dietz J., von Hahn T., Petersen J., Hinrichsen H., Spengler, U., Mauss S., Berg C., Zeuzem S., Sarrazin, C. Retreatment of Patients who Failed Daa-Combination Therapies: Real-World Experience from a Large Hepatitis C Resistance Database // J Hepatol. - 2016. - T. 64, № 2. -C. 183-212.

58. Zhao F., Liu N., Zhan P., Liu X. Repurposing of HDAC inhibitors toward anti-hepatitis C virus drug discovery: teaching an old dog new tricks // Future Med Chem. - 2015. - T. 7, № 11. - C. 1367-1371.

59. Benkheil K. M., Paeshuyse J., Neyts J., Van Haele M., Roskams T., Liekens S. HCV-induced EGFR-ERK signaling promotes a pro-inflammatory and pro-angiogenic signature contributing to liver cancer pathogenesis // Biochem Pharmacol. - 2008. - T. 155. - C. 305-315.

60. Satoh T., Akira S. Toll-Like Receptor Signaling and Its Inducible Proteins // Microbiol Spectr. -2016. - T. 4, № 6.

61. Grigorov B., Molle J., Rubinstein E., Zoulim F., Bartosch B. CD81 large extracellular loop-containing fusion proteins with a dominant negative effect on HCV cell spread and replication // J Gen Virol. - 2017. - T. 98, № 7. - C. 1646-1657.

62. Domovitz T., Gal-Tanamy M. Tracking Down the Epigenetic Footprint of HCV-Induced Hepatocarcinogenesis // J Clin Med. - 2021. - T. 10, № 3. - C. 551.

63. Kim K., Lee Y., Jeong S., Kim D., Chon S., Pak Y. K., Kim S., Ha J., Kang I., Choe W. A Small Molecule, 4-Phenylbutyric Acid, Suppresses HCV Replication via Epigenetically Induced Hepatic Hepcidin // Int J Mol Sci. - 2020. - T. 21, № 15. - C. 5516.

64. Zeisel M. B., Lupberger J., Fofana I., Baumert T. F. Host-targeting agents for prevention and treatment of chronic hepatitis C - perspectives and challenges // J Hepatol. - 2013. - T. 58, № 2. - C. 375-384.

65. Lim Y. S., Tran H. T., Park S. J., Yim S. A., Hwang S. B. Peptidyl-prolyl isomerase Pin1 is a cellular factor required for hepatitis C virus propagation // J Virol. - 2011. - T. 85, № 17. - C. 8777-8788.

66. Fernandes F., Ansari I. U., Striker R. Cyclosporine inhibits a direct interaction between cyclophilins and hepatitis C NS5A // PLoS One. - 2010. - T. 5, № 3. - C. e9815.

67. Watashi K., Hijikata M., Hosaka M., Yamaji M., Shimotohno K. Cyclosporin A suppresses replication of hepatitis C virus genome in cultured hepatocytes // Hepatol. - 2003. - T. 38, № 5. - C. 1282-1288.

68. Paeshuyse J., Kaul A., De Clercq E., Rosenwirth B., Dumont J. M., Scalfaro P., Bartenschlager R., Neyts J. The non-immunosuppressive cyclosporin DEBI0-025 is a potent inhibitor of hepatitis C virus replication in vitro // Hepatol. - 2006. T. 43, № 4. - C. 761-770.

69. Daelemans D., Dumont J. M., Rosenwirth B., De Clercq E., Pannecouque C. Debio-025 inhibits HIV-1 by interfering with an early event in the replication cycle // Antiviral Res. - 2010. - T. 85, № 2.

- C. 418-421.

70. Hopkins S., Scorneaux B., Huang Z., Murray M. G., Wring S., Smitley C., Harris R., Erdmann F., Fischer G., Ribeill Y. SCY-635, a novel nonimmunosuppressive analog of cyclosporine that exhibits potent inhibition of hepatitis C virus RNA replication in vitro // Antimicrob Agents Chemother. - 2010.

- T. 54, № 2. - C. 660-672.

71. Stanciu C., Trifan A., Muzica C., Sfarti C. Efficacy and safety of alisporivir for the treatment of hepatitis C infection // Expert Opin Pharmacother. - 2019. - T. 20, № 4. - C. 379-384.

72. Jopling C.L. Regulation of hepatitis C virus by microRNA-122 // Biochem Soc Trans. - 2008. - T. 36, № 6. - C. 1220-1223.

73. Gebert L. F, Rebhan M. A, Crivelli S. E., Denzler R., Stoffel M., Hall J. Miravirsen (SPC3649) can inhibit the biogenesis of miR-122 // Nucleic Acids Res. - 2014. - T. 42, № 1. - C. 609-621.

74. Li Y. P., Gottwein J. M., Scheel T. K., Jensen T. B., Bukh J. MicroRNA-122 antagonism against hepatitis C virus genotypes 1-6 and reduced efficacy by host RNA insertion or mutations in the HCV 5' UTR // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2011. - T. 108, № 12. - C. 4991-4996.

75. Peymani P., Yeganeh B., Sabour S., Geramizadeh B., Fattahi M. R., Keyvani H., Azarpira N., Coombs K. M., Ghavami S., Lankarani K. B. New use of an old drug: chloroquine reduces viral and ALT levels in HCV non-responders (a randomized, triple-blind, placebo-controlled pilot trial) // Can J Physiol Pharmacol. - 2016. - T. 94, №6. - C. 613-619.

76. Zeisel M.B., Crouchet E., Baumert T.F., Schuster C. Host-targeting agents to prevent and cure hepatitis C virus infection // Viruses. - 2015. - T. 7. - C. 5659-5685.

77. Gallinari P., Di Marco S., Jones P., Pallaoro M., Steinkühler C. HDACs, histone deacetylation and gene transcription: from molecular biology to cancer therapeutics // Cell Res. - 2007. - T. 17, № 3. - C. 195-211.

78. Seto E., Yoshida M. Erasers of Histone Acetylation: The Histone Deacetylase Enzymes // Cold Spring Harb Perspect Biol. - 2014. - T. 6, № 4. - C. a018713.

79. Lin H. Y., Chen C. S., Lin S. P., Weng J. R., Chen C. S. Targeting histone deacetylase in cancer therapy // Med Res Rev. - 2006. - T. 26, № 4. - C. 397-413.

80. Martin M., Kettmann R., Dequiedt F. Class IIa histone deacetylases: regulating the regulators // Oncogene. - 2007. - T. 26. - C. 5450-5467.

81. Haberland M., Montgomery R. L., Olson E. N. The many roles of histone deacetylases in development and physiology: implications for disease and therapy // Nat Rev Genet. - 2009. - T. 10, № 1. - C. 32-42.

82. McDonel P., Costello I., Hendrich B. Keeping things quiet: roles of NuRD and Sin3 co-repressor complexes during mammalian development // Int J Biochem Cell Biol. - 2009. - T. 41, №1. - C. 108116.

83. You A., Tong J. K., Grozinger C. M., Schreiber S. L. CoREST is an integral component of the CoREST- human histone deacetylase complex // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2001. - T. 98, №4. - C. 1454-1458.

84. Mondal B., Jin H., Kallappagoudar S., Sedkov Y., Martinez T., Sentmanat M. F., Poet G. J., Li C., Fan Y., Pruett-Miller S. M., Herz H. M. The histone deacetylase complex MiDAC regulates a

neurodevelopmental gene expression program to control neurite outgrowth // Elife. - 2020. - T. 9. - C. 9:e57519.

85. Jonas B. A., Varlakhanova N., Hayakawa F., Goodson M., Privalsky M. L. Response of SMRT (silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptor) and N-CoR (nuclear receptor corepressor) corepressors to mitogen-activated protein kinase kinase kinase cascades is determined by alternative mRNA splicing // Mol Endocrinol. - 2007. - T. 21, № 8. - C. 1924-1939.

86. Ito A., Kawaguchi Y., Lai C. H., Kovacs J. J., Higashimoto Y., Appella E., Yao T. P. MDM2-HDAC1 -mediated deacetylation of p53 is required for its degradation // EMBO J. - 2002. - T. 21, № 22. - C. 6236-6245.

87. Gaughan L., Logan I. R., Cook S., Neal D.E., Robson C. N. Tip60 and histone deacetylase 1 regulate androgen receptor activity through changes to the acetylation status of the receptor // J Biol Chem.

- 2002. - T. 277, № 9.

88. Yan B., Yang J., Kim M. Y., Luo H., Cesari N., Yang T., Strouboulis J., Zhang J., Hardison R., Huang S., Qiu Y. HDAC1 is required for GATA-1 transcription activity, global chromatin occupancy and hematopoiesis // Nucleic Acids Res. - 2021. - T. 49, № 17. - C. 9783-9798.

89. Clocchiatti A., Florean C., Brancolini C. Class IIa HDACs: from important roles in differentiation to possible implications in tumourigenesis // J Cell Mol Med. - 2011. - T. 15, № 9. - C. 1833-1846.

90. Jayathilaka N., Han A., Gaffney K. J., Dey R., Jarusiewicz J. A., Noridomi K., Philips M. A., Lei X., He J., Ye J., Gao T., Petasis N. A., Chen L. Inhibition of the function of class IIa HDACs by blocking their interaction with MEF2 // Nucleic Acids Res. - 2012. - T. 40, № 12. - C. 5378-5388.

91. Pon J. R, Marra M. A. MEF2 transcription factors: developmental regulators and emerging cancer genes // Oncotarget. - 2016. - T. 7, № 3. - C. 2297-2312.

92. Mihaylova M. M., Vasquez D. S., Ravnskjaer K., Denechaud P. D., Yu R. T., Alvarez J. G., Downes M., Evans R. M., Montminy M., Shaw R. J. Class IIa histone deacetylases are hormone-activated regulators of FOXO and mammalian glucose homeostasis // Cell. - 2011. - T. 145, № 4. - C. 607-621.

93. Lahm A., Paolini C., Pallaoro M., Nardi M. C., Jones P., Neddermann P., Sambucini S., Bottomley M. J., Lo Surdo P., Carfi A., Koch U., De Francesco R., Steinkuhler C., Gallinari P. Unraveling the hidden catalytic activity of vertebrate class IIa histone deacetylases // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2007.

- T. 104, № 44. - C. 17335-17340.

94. Haggarty S. J., Koeller K. M., Wong J. C., Grozinger C. M., Schreiber S. L. Domain-selective small-molecule inhibitor of histone deacetylase 6 (HDAC6)-mediated tubulin deacetylation // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2003. - T. 100, № 8. - C. 4389-4394.

95. Zou H., Wu Y., Navre M., Sang B. C. Characterization of the two catalytic domains in histone deacetylase 6 // Biochem Biophys Res Commun. - 2006. - T. 341, № 1. - C. 45-50.

96. Kovacs J. J., Murphy P. J., Gaillard S., Zhao X., Wu J. T., Nicchitta C. V., Yoshida M., Toft D. O., Pratt W. B., Yao T. P. HDAC6 regulates Hsp90 acetylation and chaperone-dependent activation of glucocorticoid receptor // Mol Cell. - 2005. - T. 18, № 5. - C. 601-607.

97. Parmigiani R. B., Xu W. S., Venta-Perez G., Erdjument-Bromage H., Yaneva M., Tempst P., Marks P. A. HDAC6 is a specific deacetylase of peroxiredoxins and is involved in redox regulation // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2008. - T. 105, № 28. - C. 9633-9638.

98. Li Y., Zhang X., Polakiewicz R. D., Yao T. P., Comb M. J. HDAC6 is required for epidermal growth factor-induced beta-catenin nuclear localization // J Biol Chem. - 2008. - T. 283, № 19. - C. 1268612690.

99. Hai Y., Shinsky S. A., Porter N. J., Christianson D. W. Histone deacetylase 10 structure and molecular function as a polyamine deacetylase // Nat Commun. - 2017. - T. 8. - C. 15368.

100. Guardiola A. R., Yao T. P. Molecular cloning and characterization of a novel histone deacetylase HDAC10 // J Biol Chem. - 2001. - T. 277, № 5. - C. 3350-3356.

101. Gao L., Cueto M. A., Asselbergs F., Atadja P. Cloning and functional characterization of HDAC11, a novel member of the human histone deacetylase family // J Biol Chem. - 2002. - T. 277, № 28. - C. 25748-25755.

102. Moreno-Yruela C., Galleano I., Madsen A. S., Olsen C. A. Histone Deacetylase 11 Is an e-N-Myristoyllysine Hydrolase // Cell Chem Biol. - 2018. - T. 25, № 7. - C. 849-856.

103. Cao J., Sun L., Aramsangtienchai P., Spiegelman N. A., Zhang X., Huang W., Seto E., Lin H. HDAC11 regulates type I interferon signaling through defatty-acylation of SHMT2 // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2019. - T. 116, № 12. - C. 5487-5492.

104. Finnin M. S., Donigian J. R., Cohen A., Richon V. M., Rifkind R. A., Marks P. A., Breslow R., Pavletich N. P. Structures of a histone deacetylase homologue bound to the TSA and SAHA inhibitors // Nature. - 1999. - T. 401, № 6749. - C. 188-193.

105. Cheshmazar N., Hamzeh-Mivehroud M., Charoudeh H. N., Hemmati S., Melesina J., Dastmalchi S. Current trends in development of HDAC-based chemotherapeutics // Life Sci. - 2022. - T. 308. - C. 120946.

106. West A. C., Johnstone R. W. New and emerging HDAC inhibitors for cancer treatment // J Clin Invest. - 2014. - T. 124, № 1. - C. 30-39.

107. Chuang D. M., Leng Y., Marinova Z., Kim H. J., Chiu C. T. Multiple roles of HDAC inhibition in neurodegenerative conditions // Trends Neurosci. - 2009. - T. 32, № 11. - C. 591-601.

108. Duvic M., Talpur R., Ni X., Zhang C., Hazarika P., Kelly C., Chiao J. H., Reilly J. F., Ricker J. L., Richon V. M., Frankel S. R. Phase 2 trial of oral vorinostat (suberoylanilide hydroxamic acid, SAHA) for refractory cutaneous T-cell lymphoma (CTCL) // Blood. - 2007. - T. 109, № 1. - C. 31-39.

109. Lee H. Z., Kwitkowski V. E., Del Valle P. L., Ricci M. S., Saber H., Habtemariam B. A., Bullock J., Bloomquist E., Li Shen Y., Chen X. H., Brown J., Mehrotra N., Dorff S., Charlab R., Kane R. C., Kaminskas E., Justice R., Farrell A. T., Pazdur R. FDA Approval: Belinostat for the Treatment of Patients with Relapsed or Refractory Peripheral T-cell Lymphoma // Clin Cancer Res. - 2015. - T. 21, № 12. - C. 2666-2670.

110. Lu X., Ning Z., Li Z., Cao H., Wang X. Development of chidamide for peripheral T-cell lymphoma, the first orphan drug approved in China // Intractable Rare Dis Res. - 2016. - T. 5, № 3. - C. 185-191.

111. Raedler L. A. Farydak (Panobinostat): First HDAC Inhibitor Approved for Patients with Relapsed Multiple Myeloma // Am Health Drug Benefits. - 2016. - T. 9. - C. 84-87.

112. VanderMolen K. M., McCulloch W., Pearce C. J., Oberlies N. H. Romidepsin (Istodax, NSC 630176, FR901228, FK228, depsipeptide): a natural product recently approved for cutaneous T-cell lymphoma // J Antibiot (Tokyo). - 2011. - T. 64, № 8. - C. 525-531.

113. Choi M. A., Park S. Y., Chae H. Y., Song Y., Sharma C., Seo Y. H. Design, synthesis and biological evaluation of a series of CNS penetrant HDAC inhibitors structurally derived from amyloid-P probes // Sci Rep. - 2019. - T. 9, № 1. - C. 13187.

114. Melesina J., Simoben C. V., Praetorius L., Bulbul E. F., Robaa D., Sippl W. Strategies To Design Selective Histone Deacetylase Inhibitors // ChemMedChem. - 2021. - T. 16, № 9. - C. 1336-1359.

115. Hu E., Dul E., Sung C. M., Chen Z., Kirkpatrick R., Zhang G. F., Johanson K., Liu R., Lago A., Hofmann G., Macarron R., de los Frailes M., Perez P., Krawiec J., Winkler J., Jaye M. Identification of

novel isoform-selective inhibitors within class I histone deacetylases // J Pharmacol Exp Ther. - 2003. - T. 307, № 2. - C. 720-728.

116. Zhang L., Zhang J., Jiang Q., Zhang L., Song W. Zinc binding groups for histone deacetylase inhibitors // J Enzyme Inhib Med Chem. - 2018. - T. 33, №1. - C. 714-721.

117. Wang Y., Stowe R. L., Pinello C. E., Tian G., Madoux F., Li D., Zhao L. Y., Li J. L., Wang Y., Wang Y., Ma H., Hodder P., Roush W. R., Liao D. Identification of histone deacetylase inhibitors with benzoylhydrazide scaffold that selectively inhibit class I histone deacetylases // Chem Biol. - 2015. - T. 22, № 2. - C. 273-284.

118. Lecube A., Hernández C., Genescá J., Simó R. Glucose abnormalities in patients with hepatitis C virus infection: Epidemiology and pathogenesis // Diabetes Care. - 2006. - T. 29, № 5. - C. 1140-1149.

119. Ivanov A.V., Valuev-Elliston V. T., Tyurina D. A., Ivanova O. N., Kochetkov S.N., Bartosch B., Isaguliants M. G. Oxidative stress, a trigger of hepatitis C and B virus-induced liver carcinogenesis // Oncotarget. - 2017. - T. 8. - C. 3895-3932.

120. Gutowski M., Kowalczyk S. A study of free radical chemistry: their role and pathophysiological significance // Acta Biochim Pol. - 2013. - T. 60, № 1. - C. 1-16.

121. Ivanov A.V., Smirnova O.A., Ivanova O.N., Masalova O.V., Kochetkov S.N., Isaguliants M.G. Hepatitis C virus proteins activate NRF2/ARE pathway by distinct ROS-dependent and independent mechanisms in HUH7 cells // PLoS One. - 2011. - T. 6. - C. e24957.

122. Gong G., Waris G., Tanveer R., Siddiqui A. Human hepatitis C virus NS5A protein alters intracellular calcium levels, induces oxidative stress, and activates STAT-3 and NF-kappa B // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2001. - T. 98, № 17. - C. 9599-9604.

123. Pal S., Polyak S. J., Bano N., Qiu W. C., Carithers R. L., Shuhart M., Gretch D. R., Das A. Hepatitis C virus induces oxidative stress, DNA damage and modulates the DNA repair enzyme NEIL1 // J Gastroenterol Hepatol. - 2010. - T. 25, № 3. - C. 627-634.

124. Benali-Furet N. L., Chami M., Houel L., De Giorgi F., Vernejoul F., Lagorce D., Buscail L, Bartenschlager R., Ichas F., Rizzuto R., Paterlini-Bréchot P. Hepatitis C virus core triggers apoptosis in liver cells by inducing ER stress and ER calcium depletion // Oncogene. - 2005. - T. 24, № 3. - C. 49214933.

125. Bedard K., Krause K. H. The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology // Physiol Rev. - 2007. - T. 81, №1. - C. 245-313.

126. de Mochel N. S., Seronello S., Wang S. H., Ito C., Zheng J. X., Liang T. J., Lambeth J. D., Choi J. Hepatocyte NAD(P)H oxidases as an endogenous source of reactive oxygen species during hepatitis C virus infection // Hepatology. - 2010. - T. 52, № 1. - C. 47-59.

127. Miura K., Taura K., Kodama Y., Schnabl B., Brenner D. A. Hepatitis C virus-induced oxidative stress suppresses hepcidin expression through increased histone deacetylase activity // Hepatology. -2008. - T. 48, № 5. - C. 1420-1429.

128. Verga Falzacappa M. V., Vujic Spasic M., Kessler R., Stolte J., Hentze M. W., Muckenthaler M. U. STAT3 mediates hepatic hepcidin expression and its inflammatory stimulation // Blood. - 2007. - T. 109, № 1. - C. 353-358.

129. Pasricha S. R., Lim P. J., Duarte T. L., Casu C., Oosterhuis D., Mleczko-Sanecka K., Suciu M., Da Silva A. R., Al-Hourani K., Arezes J., McHugh K., Gooding S., Frost J. N., Wray K., Santos A., Porto G., Repapi E., Gray N., Draper S. J., Ashley N., Soilleux E., Olinga P., Muckenthaler M. U., Hughes J. R., Rivella S., Milne T. A., Armitage A. E., Drakesmith H. Hepcidin is regulated by promoter-associated histone acetylation and HDAC3 // Nat Commun. - 2017. - T. 8, № 1. - C. 403.

130. You S. H., Lim H. W., Sun Z., Broache M., Won K. J., Lazar M. A. Nuclear receptor co-repressors are required for the histone-deacetylase activity of HDAC3 in vivo // Nat Struct Mol Biol. - 2013. - T. 20, № 2. - C. 182-187.

131. Watson P. J., Fairall L., Santos G. M., Schwabe J. W. Structure of HDAC3 bound to co-repressor and inositol tetraphosphate // Nature. - 2012. - T. 481, № 7381. - C. 335-340.

132. Kong Y., Zhou W., Sun Z. Nuclear receptor corepressors in intellectual disability and autism // Mol Psychiatry. - 2020. - T. 25, № 10. - C. 2220-2236.

133. Yu J., Li Y., Ishizuka T., Guenther M. G., Lazar M. A. A SANT motif in the SMRT corepressor interprets the histone code and promotes histone deacetylation // EMBO J. - 2003. - T. 22, № 13. - C. 3403-3410.

134. Yoon H. G., Chan D. W., Huang Z. Q., Li J., Fondell J. D., Qin J., Wong J. Purification and functional characterization of the human N-CoR complex: the roles of HDAC3, TBL1 and TBLR1 // EMBO J. - 2003. - T. 22, № 6. - C. 1336-1346.

135. Giraud S., Bienvenu F., Avril S., Gascan H., Heery D. M., Coqueret O. Functional interaction of STAT3 transcription factor with the coactivator NcoA/SRC1a // J Biol Chem. - 2002. - T. 277, № 10. - C. 8004-8011.

136. Seo J. H., Lim J. C., Lee D. Y., Kim K. S., Piszczek G., Nam H. W., Kim Y. S., Ahn T., Yun C. H., Kim K., Chock P. B., Chae H. Z. Novel protective mechanism against irreversible hyperoxidation of peroxiredoxin: Nalpha-terminal acetylation of human peroxiredoxin II // J Biol Chem. - 2009. - T. 284, № 20. - C. 13455-13465.

137. Heo S., Kim S., Kang D. The Role of Hydrogen Peroxide and Peroxiredoxins throughout the Cell Cycle // Antioxidants. - T. 9, № 4. - C. 280.

138. Wood Z. A., Schröder E., Robin Harris J., Poole L. B. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins // Trends Biochem Sci. - 2003. - T. 28, № 1. - C. 32-40.

139. Wood Z. A., Poole L. B., Karplus P. A. Peroxiredoxin Evolution and the Regulation of Hydrogen Peroxide Signaling // Science. - T. 300, № 5619. - C. 650-653.

140. Jian W., Wei X., Chen L., Wang Z., Sun Y., Zhu S., Lou H., Yan S., Li X., Zhou J., Zhang B. Inhibition of HDAC6 increases acetylation of peroxiredoxin1/2 and ameliorates 6-OHDA induced dopaminergic injury // Neurosci Lett. - 2017. - T. 658. - C. 114-120.

141. Biddinger S. B., Kahn C. R. From mice to men: insights into the insulin resistance syndromes // Annu Rev Physiol. - 2006. - T. 68. - C. 68-123.

142. Magnuson M. A., Matschinsky F. M. Glucokinase as a glucose sensor: past, present, and future // Glucokinase and Glycemic Disease: From Basics to Novel Therapeutics (Frontiers in Diabetes). - S. Karger AG, Basel. - 2004. - C. 18-30.

143. Kasai D., Adachi T., Deng L., Nagano-Fujii M., Sada K., Ikeda M., Kato N., Ide Y. H., Shoji I., Hotta H. HCV replication suppresses cellular glucose uptake through down-regulation of cell surface expression of glucose transporters // J Hepatol. - 2009. - T. 50, № 5. - C. 883-894.

144. Petersen M. C., Vatner D. F., Shulman G. I. Regulation of hepatic glucose metabolism in health and disease // Nat Rev Endocrinol. - 2017. - T. 13, № 10. - C. 572-587.

145. Nakae J., Biggs W. H. 3rd, Kitamura T., Cavenee W. K., Wright C. V., Arden K. C., Accili D. Regulation of insulin action and pancreatic beta-cell function by mutated alleles of the gene encoding forkhead transcription factor Foxo1 // Nat Genet. - 2002. T. 32, № 2. - C. 245-253.

146. Deng L., Shoji I., Ogawa W., Kaneda S., Soga T., Jiang D. P., Ide Y. H., Hotta H. Hepatitis C virus infection promotes hepatic gluconeogenesis through an NS5A-mediated, FoxO1-dependent pathway // J Virol. - 2011. - T. 85, № 17. - C. 8556-8568.

147. Calnan D. R., Brunet A. The FoxO code // Oncogene. - 2008. - T. 27, № 16. - C. 2276-2288.

148. Chen J., Lu Y., Tian M., Huang Q. Molecular mechanisms of FOXO1 in adipocyte differentiation // J Mol Endocrinol. - 2019. - T. 62, № 3. - C. R239-R253.

149. Matsumoto M., Han S., Kitamura T., Accili D. Dual role of transcription factor FoxO1 in controlling hepatic insulin sensitivity and lipid metabolism // J Clin Invest. - 2006. - T. 116, № 9. - C. 2464-72.

150. Huang H., Tindall D. J. Dynamic FoxO transcription factors // J Cell Sci. - 2007. - T. 120, № 15.

- C. 2479-2487.

151. Van Der Heide L. P., Hoekman M. F., Smidt M. P. The ins and outs of FoxO shuttling: mechanisms of FoxO translocation and transcriptional regulation // Biochem J. - 2004. - T. 380, № 2. - C. 297-309.

152. Brunet A., Kanai F., Stehn J., Xu J., Sarbassova D., Frangioni J. V., Dalal S. N., DeCaprio J. A., Greenberg M. E., Yaffe M. B. 14-3-3 transits to the nucleus and participates in dynamic nucleocytoplasmic transport // J Cell Biol. - 2002. - T. 156, № 5. - C. 817-828.

153. Obsil T., Obsilova V. Structure/function relationships underlying regulation of FOXO transcription factors // Oncogene. - 2008. - T. 27, 16. - C. 2263-2275.

154. Wang Y., Zhou Y., Graves D. T. FOXO transcription factors: their clinical significance and regulation // Biomed Res Int. - 2014. - C. 925350.

155. Matsuzaki H., Daitoku H., Hatta M., Aoyama H., Yoshimochi K., Fukamizu A. Acetylation of Foxo1 alters its DNA-binding ability and sensitivity to phosphorylation // Proc Natl Acad Sci U S A. -2005. - T. 102, № 32. - C. 11278-11283.

156. Martin M., Kettmann R., Dequiedt F. Class IIa histone deacetylases: regulating the regulators // Oncogene. - 2007. - T. 26, № 37. - C. 5450-5467.

157. Lahm A., Paolini C., Pallaoro M., Nardi M. C., Jones P., Neddermann P., Sambucini S., Bottomley M. J., Lo Surdo P., Carfi A., Koch U., De Francesco R., Steinkühler C., Gallinari P. Unraveling the hidden catalytic activity of vertebrate class IIa histone deacetylases // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2007.

- T. 104, № 44. - C. 17335-17340.

158. Mihaylova M. M., Vasquez D. S., Ravnskjaer K., Denechaud P. D., Yu R. T., Alvarez J. G., Downes M., Evans R. M., Montminy M., Shaw R. J. Class IIa histone deacetylases are hormone-activated regulators of FOXO and mammalian glucose homeostasis // Cell. - 2011. - T. 145, № 4. - C. 607-621.

159. Mihaylova M. M., Shaw R. J. Metabolic reprogramming by class I and II histone deacetylases // Trends Endocrinol Metab. - 2013. - T. 24, № 1. - C. 48-57.

160. Wang X., Wei X., Pang Q., Yi F. Histone deacetylases and their inhibitors: molecular mechanisms and therapeutic implications in diabetes mellitus // Acta Pharm. Sin. B. - 2012. - T. 2, № 4. - C. 387395.

161. Chen C. S., Weng S. C., Tseng P. H., Lin H. P., Chen C. S. Histone acetylation-independent effect of histone deacetylase inhibitors on Akt through the reshuffling of protein phosphatase 1 complexes // J Biol Chem. - 2005. - T. 280, № 46. - C. 38879-38887.

162. Qiang L., Banks A. S., Accili D. Uncoupling of acetylation from phosphorylation regulates FoxO1 function independent of its subcellular localization // J Biol Chem. - 2010. - T. 285, № 35. - C. 2739627401.

163. Huang H., Sun F., Owen D. M., Li W., Chen Y., Gale M Jr., Ye J. Hepatitis C virus production by human hepatocytes dependent on assembly and secretion of very low-density lipoproteins // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2007. - T. 104, № 35. - C. 5848-5853.

164. Wrensch F., Crouchet E., Ligat G., Zeisel M. B., Keck Z. Y., Foung S. K. H., Schuster C., Baumert T. F. Hepatitis C Virus (HCV)-Apolipoprotein Interactions and Immune Evasion and Their Impact on HCV Vaccine Design // Front Immunol. - 2018. - T. 9. - C. 1436.

165. Welte M. A. Expanding roles for lipid droplets // Curr Biol. - 2015. - T. 25, № 11. - C. R470-R481.

166. Sundaram M., Yao Z. Recent progress in understanding protein and lipid factors affecting hepatic VLDL assembly and secretion // Nutr Metab. - 2010. - T. 27, № 7. - C. 35.

167. Tabata K., Neufeldt C. J., Bartenschlager R. Hepatitis C Virus Replication // Cold Spring Harb Perspect Med. - 2020. - T. 10, № 3. - C. a037093.

168. Berger K. L., Kelly S. M., Jordan T. X., Tartell M. A., Randall G. Hepatitis C virus stimulates the phosphatidylinositol 4-kinase III alpha-dependent phosphatidylinositol 4-phosphate production that is essential for its replication // J Virol. - 2011. - T. 85, № 17. - C. 8870-8883.

169. Vieyres G., Pietschmann T. HCV Pit Stop at the Lipid Droplet: Refuel Lipids and Put on a Lipoprotein Coat before Exit // Cells. - 2019. - T. 8, № 3. - C. 233.

170. Rubbia-Brandt L., Quadri R., Abid K., Giostra E., Male P. J., Mentha G., Spahr L., Zarski J. P., Borisch B., Hadengue A., Negro F. Hepatocyte steatosis is a cytopathic effect of hepatitis C virus genotype 3 // J Hepatol. - 2000. - T. 33, № 1. - C. 106-115.