Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат медицинских наук Алтухова, Виктория Владимировна

• Алтухова, Виктория Владимировна
• кандидат медицинских наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Алтухова, Виктория Владимировна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика инфекций, вызываемых патогенными 14 буркхольдериями

1.2. Методы лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза

1.3. ПЦР - диагностика патогенных буркхольдерий

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, питательные среды, 43 условия культивирования

2.2. Заражение лабораторных животных

2.3. Патоморфологическое исследование биоптатов

2.4. Подготовка проб для проведения ПЦР-анализа

2.5. Выделение ДНК

2.6. Постановка полимеразной цепной реакции

2.7. Учёт результатов ПЦР

2.8. Секвенирование продуктов амплификации

2.9. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. ВЫБОР ПРАЙМЕРОВ И ОПТИМИЗАЦИЯ 55 ПАРАМЕТРОВ ПЦР

3.1. Характеристика праймеров, сконструированных для 55 обнаружения B.pseudomallei, В.mallei и B.thailandensis.

3.2. Подбор условий постановки реакции амплификации

ГЛАВА 4. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ САПА И 61 МЕЛИОИДОЗА МЕТОДОМ ПЦР

4.1. Определение аналитической чувствительности и специфичности 61 ПЦР с изучаемыми праймерами при выявлении B.pseudomallei и

В.mallei

4.2. Использование мультиплексной ПЦР для идентификации возбу- 69 дителей сапа и мелиоидоза

ГЛАВА 5. ОБНАРУЖЕНИЕ B.pseudomallei, B.mallei и

B.thailandensis in vivo

5.1. Использование ПЦР с праймерами b23-s7/b23-a8 и bfl-ls/bfl-as2 73 для выявления патогенных буркхольдерий при острых формах инфекций

5.2. Обнаружение B.pseudomallei методом ПЦР с праймерами 80 b23-s7/b23-a8 и bfl-ls/bfl-as2 при подострой форме экспериментального мелиоидоза

5.3. Использование реакции амплификации с праймерами 86 b23-s7/b23-a8 и bfl-ls/bfl-as2 для обнаружения B.mallei при подострой форме экспериментального сапа

5.4. Применение ПЦР с праймерами burt-sl/burt-a2 для обнаружения

B.thailandensis у экспериментально заражённых животных

5.5. Исследование продуктов питания и воды, контаминированных 97 B.pseudomallei

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции»

Возбудитель сапа {Burkholderia mallei) и возбудитель мелиоидоза {Burkholderia pseudomallei) - аэробные грамотрицательные неферменти-рующие бактерии, принадлежащие к роду Burkholderia. Выделенный в 1992 году E.Yabuuchi et al. [156] на основе результатов секвенирования нуклеотидных последовательностей 16S рРНК и первично состоящий из семи псевдомонад, этот род в настоящее время включает 28 видов, большинство из которых являются сапрофитами или фитопатогенами.

Из всех видов буркхольдерий только В.mallei, В.pseudomallei - возбудители особо опасных инфекционных заболеваний сапа и мелиоидоза, имеют серьезное значение для медицинской практики [1,2].

Мелиоидоз - эндемичное для Австралии и ряда стран Юго-Восточной Азии инфекционное заболевание людей и животных [82, 93]. В этих регионах распространённость данной инфекции довольно высока. В Таиланде с населением в 60 млн. человек ежегодная заболеваемость ме-лиоидозом составляет 2-3 тысячи случаев [128]. Многообразие клинических проявлений мелиоидоза, тяжёлое течение, высокая летальность, отсутствие специфических средств профилактики существенно затрудняют адекватную диагностику и своевременное лечение этого опасного заболевания. Особую проблему представляет хроническая форма инфекции, при которой даже с использованием бактериологического метода, как «золотого стандарта» идентификации, возможна регистрация отрицательных результатов.

В последние годы интерес исследователей к мелиоидозу значительно возрос, что объясняется расширением ареала инфекции, связанное с изменяющимися климатическими условиями, глобальным потеплением и другими природными факторами, способствующими появлению этой опасной инфекции на ранее неэндемичных территориях и формированию «вторичных очагов» [108]. Распространение и укоренение возбудителя в новых районах его обитания, возможно за счёт завоза больных животных, почвы, воды, а также пищевых продуктов, контаминированных B.pseudomallei [13].

Серьезность отношения мировой медицинской общественности к проблеме мелиоидоза подчеркивается проведением с интервалом в три года международных конгрессов в Бангкоке (1998 г), Перте (2001 г) и Сингапуре (2004г).

К сожалению, малая осведомленность и настороженность органов здравоохранения в отношении этой инфекции приводит к тому, что плановых лабораторных исследований, направленных на выявление B.pseudomallei у туристов и лиц, прибывающих из эндемичных территорий, у нас в стране не проводится. Ситуация может измениться после принятия Правительством Российской Федерации постановления «Об утверждении перечня социально-значимых заболеваний и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих», в которые включены ме-лиоидоз и сап [47].

При эпидемиологическом обследовании территорий эндемичных по мелиоидозу нередко выделяются штаммы микроорганизма, генетически и иммунологически близкого к B.pseudomallei - Burkholderia thailandensis. Основное различие его с возбудителем мелиоидоза состоит в авирулентно-сти для лабораторных животных и более высокой биохимической активности по отношению к моносахаридам из группы пентоз. Штаммы В. thailandensis практически неотличимы от B.pseudomallei при применении стандартных микробиологических и иммунологических методов идентификации, что может приводить к ложноположительным результатам при эпидемиологических исследованиях [14,80,81].

Сап — особо опасная зоонозная инфекция, широко распространённая в начале XX столетия. В настоящее время в мире проблема сапа не стоит так остро как ранее, что связано с уменьшением численности лошадей, являющихся основным резервуаром этой инфекции, усовершенствованием профилактических мероприятий, соблюдением карантинных мер при ввозе животных из эндемичных стран. Однако эта инфекция по-прежнему наносит значительный экономический урон в крупных животноводческих хозяйствах, практикующих разведение и использование непарнокопытных животных [8]. Это обстоятельство, а также известные случаи внутрилабо-раторного заражения свидетельствуют о необходимости более детального изучения В.mallei и усовершенствования методов ее идентификации [119].

Необходимость исследований, направленных на выявление патогенных буркхольдерий, определяется сохранением угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций в результате техногенных катастроф, природных катаклизмов, а также террористических актов с использованием этих возбудителей, относящихся к потенциальным агентам биотерроризма группы В [6, 107, 187].

Среди новых средств диагностики сапа и мелиоидоза следует выделить методы, основанные на обнаружении ДНК микробов. В первую очередь, это полимеразная цепная реакция (ПЦР), как высокочувствительный, специфичный, но, в то же время, доступный и простой в исполнении метод. ПЦР может использоваться как для идентификации микроорганизмов, так и для дифференциации их между собой.

В последние годы зарубежными и отечественными исследователями предпринимались попытки конструирования праймеров для выявления участков генов 16S, 23S рРНК, спейсерной области 16-23S рРНК, а также видоспецифических последовательностей генома B.psendomallei [126,138,147]. Большая часть исследований была направлена на идентификацию B.pseadomallei. В отношении использования метода ПЦР для идентификации В.mallei имеются лишь единичные публикации, в которых приводятся результаты не только выявления, но и дифференциации патогенных буркхольдерий [138]. Отдельными исследователями показана сравнительная эффективность использования нескольких пар праймеров для выявления возбудителя мелиоидоза [90]. Причем, при использовании только одной пары праймеров, отмечалась низкая специфичность ПЦР-анализа. Анализ литературных источников позволяет сделать заключение, что до настоящего времени нет единого мнения и регламентирующих документов, определяющих обязательные ДНК-мишени и необходимые праймеры для идентификации патогенных буркхольдерий.

Остаются открытыми также и вопросы, касающиеся диагностики различных форм сапа и мелиоидоза с использованием ПЦР. Не определены оптимальные сочетания праймеров для выявления возбудителей при инфекционном процессе, поскольку вышеупомянутые амплификационные системы использовались, в основном, для идентификации выделенных культур микроорганизмов от больных или из объектов окружающей среды. Учитывая сказанное, проведение исследований, направленных на поиск оптимальных праймеров для проведения ПЦР-анализа и определения места полимеразной цепной реакции в схеме лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза остаётся актуальным.

Целью настоящей работы являлась

Совершенствование генодиагностической тест-системы для выявления патогенных буркхольдерий, оценка её эффективности при диагностике экспериментального сапа и мелиоидоза.

Задачи исследования

1. Подобрать праймеры на основе нуклеотидных последовательностей флагеллярного и 23S рРНК генов для идентификации типичных и атипичных штаммов патогенных буркхольдерий.

2. Разработать с использованием выбранных праймеров аплифика-ционную тест-систему для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза.

3. Оценить чувствительность и специфичность выбранных пар оли-гонуклеотидных затравок при исследовании чистых культур патогенных буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов.

4. Изучить эффективность сконструированной ПЦР-тест-системы при диагностике различных клинических форм сапа и мелиоидоза у экспериментально заражённых животных.

5. Определить диагностическую ценность ПЦР с выбранными праймерами при исследовании воды и продуктов питания, контаминиро-ванных возбудителем мелиоидоза.

Научная новизна

Для идентификации патогенных буркхольдерий на основе нуклео-тидной последовательности флагеллярного гена сконструированы оригинальные праймеры bfl-ls/bfl-as2. Подобраны оптимальные условия проведения ПЦР, обеспечивающие амплификацию фрагментов ДНК B.pseudomallei и B.mallei с высокой чувствительностью и специфичностью.

Впервые для молекулярной диагностики сапа и мелиоидоза разработана амплификационная тест-система с использованием двух пар прайме-ров - bfl-ls/ bfl-2a и b23-s7/b23-a8, полученных на основе флагеллярного и 23S рРНК генов. Продемонстрирована высокая эффективность использования ПЦР с двумя парами праймеров для диагностики различных клинических вариантов сапной и мелиоидозной инфекций, вызванных типичными и атипичными штаммами B.mallei и В. pseudomallei.

Показана возможность использования разработанной ПЦР-тест-системы для анализа воды и продуктов питания, контаминированных B.pseudomallei.

Для выявления триады буркхольдерий - B.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis впервые предложены группоспецифические олигонуклеотидные затравки burt-sl/burt-a2, являющиеся фрагментами флагеллярного гена.

Впервые показана диагностическая ценность праймеров burt-sl/burt-а2 для идентификации В. thailandensis методом ПЦР при анализе чистых культур микроорганизмов и исследовании биологического материала, полученного от животных, экспериментально зараженных этим микроорганизмом.

Дополнена схема лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза и идентификации патогенных буркхольдерий.

Практическая ценность

Выбранные праймеры используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ для анализа музейных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, изучения генетически измененных штаммов патогенных буркхольдерий, а также в экспериментах для диагностики различных клинических форм инфекций, вызванных типичными и атипичными штаммами В. mallei и B.pseudomallei.

Разработанная ПЦР-тест-система с применением праймеров Ь23-s7/b23-a8 и bfl-1 s/bfl-as2 может быть использована для исследования клинического материала, взятого у лиц с подозрением на заболевание сапом и мелиоидозом, анализа пищевых продуктов и объектов, подозрительных на контаминацию B.pseudomallei. Указанная система праймеров вместе с предложенными олигонуклеотидными затравками burt-sl/burt-a2, может быть применена для установления инфицированности людей В. thailandensis.

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарно-эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации и лабораторной диагностики особо опасных заболеваний.

Материалы диссертации включены в «Программу курсов повышения квалификации бактериологов и эпидемиологов по противодействию биотерроризму», утвержденную Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г.Онищенко 01.02.2001 г.

Материалы диссертационного исследования вошли в «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия биотерроризму» (Волгоград, 2004 г.), утверждённое руководителем Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава России С.И.Ивановым 06.11.2003 г.

По результатам работы проведены внутриинститутские приёмочные испытания (акт утверждён директором Волгоградского НИПЧИ 12.01.2004 г).

Разработан пакет первичной документации: «Инструкция по изготовлению и контролю амплификационной тест-системы для выявления Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei» и «Инструкция по применению амплификационной тест-системы для выявления Burkholderia pseudomallei и Burkholderia mallei», утверждённые директором Волгоградского НИПЧИ 15.03.2005 г.

По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации: «Идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза методом полимеразной цепной реакции», утверждены директором Волгоградского НИПЧИ 29.05.2002 г.; «Использование двух пар праймеров для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза методом ПЦР», утверждены директором Волгоградского НИПЧИ 10.02.2005 г.

Положения, выносимые на защиту

1. Оригинальные праймеры bfl-ls/bfl-as2, сконструированные на основе нуклеотидной последовательности флагеллярного гена патогенных буркхольдерий обеспечивают специфическую амплификацию фрагментов

B.pseudomallei я В. mallei с чувствительностью 1x10 -1x10 м.к./мл.

2. Разработанная амплификационная тест-система с использованием олигонуклеотидных затравок b23-s7/b23-a8, являющихся участком гена 23S рРНК и праймеров bfl-ls/bfl-2a, фланкирующих фрагмент флагеллярного гена (fliC) возбудителей сапа и мелиоидоза, пригодна для идентификации патогенных буркхольдерий, диагностики экспериментальных инфекций и анализа объектов, контаминированных B.pseudomallei.

3. ПЦР-тест-система с двумя парами праймеров bfl-ls/bfl-as2 и Ь23-s7/b23-a8 обладает преимуществом по сравнению с бактериологическим методом при диагностике острых и подострых форм сапа и мелиоидоза и позволяет" обнаруживать патогенных буркхольдерий в крови экспериментально заражённых животных на начальных этапах развития инфекции.

4. Группоспецифические праймеры burt-sl/burt-a2, сконструированные на основе последовательности ДНК флагеллярного гена, обеспечивают идентификацию триады буркхольдерий - B.pseudomallei, В.mallei и

2 о

В. thailandensis методом ПЦР с чувствительностью

1x10 - 1x10 м.к./мл.

5. Праймеры burt-sl/burt-a2, обеспечивают специфическую амплификацию фрагмента ДНК В.thailandensis при анализе чистых культур и биологического материала от экспериментально заражённых животных.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены: на конференции к 100-летию Астраханской противочумной станции «Природно-очаговые особо опасные инфекции на Юге России, их профилактика и лабораторная диагностика» (Астрахань, 2001); VIII съезде Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2002); III Общероссийской конференции «Гомеостаз и инфекционный процесс» (Сочи, 2002); IV Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных заболеваний» (Москва, 2002); международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002); научно- практической конференции, посвященной 75 - летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 2003); IV Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003); XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век» (Саратов, 2004), научных конференциях Волгоградского НИПЧИ.

По теме диссертации опубликовано 19 научных работ.

Структура и объём диссертации

Диссертация изложена на 133 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 193 работы, в том числе 62 отечественных и 131 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 20 таблицами и 14 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Алтухова, Виктория Владимировна

выводы

1. На основе нуклеотидной последовательности флагеллярного гена патогенных буркхольдерий сконструированы оригинальные праймеры bfl-ls/bfl-as2, обеспечивающие амплификацию фрагментов ДНК B.pseudomallei и В.mallei размером 376 п.н. Подобраны оптимальные условия проведения ПЦР, при соблюдении которых можно обнаруживать возбудителей сапа и мелиоидоза с чувствительностью 1x102-1x103 м.к./мл.

2. С целью повышения специфичности ПЦР-анализа для экспресс-диагностики и идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза разработана амплификационная тест-система с использованием двух пар праймеров - bfl-ls/bfl-2a и b23-s7/b23-a8.

3. Для идентификации триады буркхольдерий - B.pseudomallei, В.mallei и B.thailandensis, на основе флагеллярного гена fliC сконструированы группоспецифические олигонуклеотидные затравки burt-sl/burt-a2, обеспечивающие специфическую амплификацию фрагментов ДНК размео ром 242 п.н. и обнаружение микроорганизмов с чувствительностью 1x10 -1x10 м.к./мл.

4. Разработанная ПЦР-тест-система с двумя парами праймеров bfl-ls/ bfl-2a и b23-s7/b23-a8 позволяет обнаруживать патогенные буркхольде-рии в крови экспериментально зараженных животных на ранних стадиях развития инфекций.

5. В сравнительных экспериментах на моделях мелиоидозной и сапной инфекций доказано преимущество ПЦР-анализа в сравнении с бактериологическим методом. При этом диагностическая эффективность ПЦР при анализе биологического материала от животных с острыми формами мелиоидоза и сапа превышала культуральный метод на 9,4 % и 7 %, а при подострых вариантах — на 15 % и 37 %, соответственно.

6. Показана эффективность реакции амплификации с олигонуклео-тидными праймерами burt-sl/burt-a2 при обнаружении B.thailandensis в различных органах и тканях биопробных животных. Установлено, что генодиагностический метод превосходит бактериологический, позволяя выявлять B.thailandensis у морских свинок в 70,6 %, а у белых мышей в 14,29 % случаев.

7. Продемонстрирована возможность использования двух пар праймеров b23-s7/b23-a8 и bfl-ls/bfl-as2 при исследовании воды и образцов продуктов питания, контаминированных возбудителем мелиоидоза, что определяет их диагностическую ценность для эпидемиологического анализа.

113

БЛАГОДАРНОСТИ

Выражаем признательность сотруднику НПФ «ДНК-технология» (г. Москва) Д.Ю.Трофимову за помощь в подборе и синтезе праймеров, использованных в работе.

Глубокую благодарность и признательность выражаем д.м.н., с.н.с. Л.К.Мериновой, д.м.н., с.н.с. Н.Н.Пивню, к.м.н. с.н.с. П.Н.Агеевой за предоставленные мутантные штаммы возбудителей сапа и мелиодиоза.

Выражаем благодарность сотрудникам лаборатории аэрогенного заражения, коллективу лаборатории биологического моделирования особо опасных инфекций Волгоградского НИПЧИ за помощь при выполнении разделов работы, связанных с аэрогенным заражением лабораторных животных

Искреннюю признательность выражаем к.м.н., с.н.с. Т.Н.Вязьминой за помощь при патолого - морфологическом исследовании биологического материала, полученного от экспериментально заражённых животных.

Благодарим коллектив отдела сапа и мелиоидоза Волгоградского НИПЧИ за неоценимую помощь и поддержку в ходе выполнения диссертационной работы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Исследование патогенных микроорганизмов с использованием моле-кулярно-генетических методов открыло новые перспективы в диагностике инфекционных заболеваний. В первую очередь, это относится к полиме-разной цепной реакции, как чувствительному, специфичному и легко применимому в диагностической лаборатории методу, позволяющему обнаруживать микроб независимо от этапа культивирования. Метод ПЦР имеет решающее значение для ранней лабораторной диагностики особо опасных инфекционных заболеваний, в том числе сапа и мелиоидоза, что определяет своевременное назначение антибактериальной терапии и проведение противоэпидемических мероприятий.

Первое сообщение о разработке амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза на основе гена, кодирующего синтез 23S рРНК, сделано A.E.Lew и P.M.Desmarchelier в 1994 г. [130]. В последующих работах в качестве ДНК-мишеней для конструирования специфических праймеров использовались гены, кодирующие синтез 23 S рРНК, 16S рРНК, спейсерная область между этими генами, изучалась возможность использования генетических детерминант, определяющих синтез факторов патогенности, белков и различных поверхностных структур [87,121,126,138,147, 150, 155, 179].

В Волгоградском научно-исследовательском противочумном институте на основе последовательности гена 23S рРНК была разработана ам-плификационная тест-система для идентификации патогенных буркхольдерий [60]. Созданная тест-система обеспечивала специфическую амплификацию фрагментов ДНК возбудителей сапа и мелиоидоза с чувствитель

2 о ностью 1x10 - 1x10 м.к./мл. Для разработанных праймеров показана принципиальная возможность использования для диагностики экспериментального сапа и мелиоидоза и детекции возбудителей в объектах внешней среды. В то же время, учитывая консервативность рибосомальных генов у различных микроорганизмов, имеется вероятность получения лож-ноположительных результатов, в первую очередь при исследовании материала из объектов внешней среды. Кроме того, по данным тайских исследователей, опубликованным в 2000 г [90], применение какой либо одной пары праймеров при исследовании клинического материала не обеспечивает достаточной эффективности анализа. В связи с этим авторы рекомендуют использовать для этих целей несколько пар праймеров [90,179].

Учитывая эти выводы, для идентификации B.pseudomallei, В.mallei в качестве ДНК- матрицы были выбраны последовательность участка гена 23S рРНК и фрагмент флагеллярного гена fliC исследуемых микроорганизмов. При этом олигонуклеотидные затравки b23-s5/ Ь23-а6 и bfl-ls/bfl-2а, сконструированные на основе последовательностей генов 23S рРНК и fliC патогенных буркхольдерий, соответственно, являлись общими для возбудителей сапа и мелиоидоза. После проведения серии экспериментов были определены оптимальные параметры постановки реакции амплификации для всех изучаемых пар праймеров. При соблюдении всех условий проведения анализа в реакции амплификации с использованием праймеров b23-s5/ Ь23-а6 и bfl-ls/bfl-2a и препаратов ДНК B.pseudomallei и В.mallei были получены чёткие специфические ампликоны размерами 666 п.н. и 376 п.н., соответственно. Кроме того, на основе последовательности флагеллярного гена B.pseudomallei, В.mallei и B.thailandensis были подобраны олигонуклеотидные затравки burt-sl/burt-a2, являющиеся общими для всех трёх изучаемых микроорганизмов. Размер специфического фрагмента амплификации при использовании праймеров burt-sl/burt-a2 с ДНК В. thailandensis, B.pseudomallei и В. mallei составлял 242 п.н.

При использовании праймеров bfl-ls/bfl-2a специфические продукты синтезировались только при исследовании ДНК возбудителей сапа и ме3 лиоидоза с чувствительностью 1x10" - 1x10 м.к./мл.

Изучение аналитической специфичности и чувствительности анализируемых олигонуклеотидных затравок показало, что использование в качестве ДНК-затравок праймеров burt-sl/burt-a2 позволяло обнаруживать все типичные штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза и B.thailandensis с чувствительностью

1x10 -1x10 м.к./мл. Аналогичная чувствительность получена в ПЦР и с использованием праймеров b23-s5/ Ь23-а6, при этом специфические продукты амплификации синтезировались с типичными штаммами возбудителей сапа и мелиоидоза. Исключение составлял штамм B.pseudomallei 57576, который не определяли в ПЦР с праймерами b23-s5/ Ь23-а6 даже в диапазоне концентраций 1х10б- 1х108 м.к./мл. В тоже время с остальными праймерами - burt-sl/burt-a2 и bfl-ls/bfl-2a указанный штамм выявляли в ПЦР с чувствительностью 1х103 м.к./мл.

Положительных результатов при исследовании ДНК гетерологичных микроорганизмов при использовании праймеров bfl-ls/bfl-2a и burt-sl/burt-а2 получено не было, что послужило основанием для их апробации в последующих экспериментах. Олигонуклеотидные затравки b23-s5/ Ь23-а6 были исключены из дальнейшей работы.

С помощью изучаемых олигонуклеоидных затравок было проведено исследование культур B.pseudomallei и В.mallei, отличающихся от типичных штаммов патогенных буркхольдерий по культурально - морфологическим, биохимическим и вирулентным свойствам - B.pseudomallei 122 (Vang), В.mallei Олоф и Конный. В результате исследований специфических фрагментов амплификации с ДНК указанных штаммов в ПЦР со всеми сконструированными праймерами обнаружено не было. Полученные данные соответствуют ранее опубликованным результатам исследований, в которыхуказанные штаммы возбудителя сапа отличались по электрофо-ретической картине (метод RAPD), от типичных штаммов В.mallei отсутствием мажорных видоспецифических фрагментов ДНК [19]. По результатам в системе Nefermtest 24 B.mallei Конный и Олоф были отнесены к виду Alcaligenes или Comamonas, a B.pseudomallei 122 (Vang) — к В. cepacia [57].

С целью повышения специфичности ПЦР - анализа при идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза, была изучена возможность использования имеющихся праймеров для постановки реакции амплификации в мультиплексном формате. Однако при постановки мультиплексной ПЦР отмечено снижение чувствительности анализа до 1х104 м.к./мл. Можно предположить, что это связано с образованием вторичных структур, диме-ров праймеров при их использовании в мультиплексной ПЦР. Не исключено, что полученные результаты могут быть также связаны с неадекватно подобранными условиями проведения анализа, так как для проведения мультиплексной реакции необходимы специально разработанные буферные системы.

Известно, что инфекционный процесс при мелиоидозной и сапной инфекциях может протекать в различных формах с возможностью перехода из латентного и хронического в острое состояние [8]. Из особенностей данных инфекций можно отметить многообразие клинических проявлений, определяющих сложности при установлении диагноза. Отсутствие настороженности медицинского персонала в отношении этих инфекций в неэндемичных регионах также может приводить к неадекватной диагностике. Трудности обнаружения персистирующих возбудителей инфекционных заболеваний, в том числе B.pseudomallei и B.mallei, обусловлены низкой концентрацией микроорганизмов в тканях и биологических жидкостях организма-хозяина, а также тем, что в процессе персистенции характерные свойства инфекционного агента могут подвергаться существенным изменениям. При длительном пребывании в многоклеточном организме в персистирующих бактериальных клетках активизируются механизмы адаптации, направленные, прежде всего, на защиту патогена от агрессивного воздействия иммунной системы. Результатом этого процесса может быть маекировка или видоизменение антигенных детерминант, выявление которых служит основой серологических методов микробиологической диагностики [43].

С другой стороны, при использовании серологических методов диагностики, особенно в эндемичных регионах, существует высокая вероятность получения ложноположительных результатов исследования. Бактериологический метод, несмотря на то, что он является «золотым стандартом», может давать отрицательные результаты, особенно в случае хронических и латентных форм инфекций. В этих случаях альтернативным методом диагностики может служить ПЦР. Несмотря на имеющиеся работы по использованию реакции амплификации для идентификации B.pseudomallei и B.mallei, известны лишь единичные работы, в которых ПЦР рекомендована для исследования клинического материала. В отношении сапной инфекции такие исследования не проводились.

Разработанные праймеры на основе гена, кодирующего синтез 23S рРНК [60] и выбранные нами олигонуклеотидные затравки, являющиеся фрагментами гена fliC, обладали одинаковой чувствительностью и специфичностью по отношению к B.pseudomallei и B.mallei. Поэтому в дальнейших исследованиях для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза при проведении ПЦР использовали две пары праймеров - b23-s7/b23-a8 и bfl-ls/bfl-2a.

С помощью предлагаемой системы праймеров были проанализированы биоптаты от лабораторных животных, экспериментально заражённых возбудителями сапа и мелиоидоза. Для этого были смоделированы острые и подострые формы сапной и мелиоидозной инфекций.

В результате проведенных исследований показано преимущество использования ПЦР для диагностики исследуемых инфекций, а также для изучения особенностей распределения возбудителей по органам в разные стадии заболевания.

Эффективность ПЦР для выявления B.pseudomallei при анализе био-птатов от животных с острым мелиоидозом, превышала бактериологический метод на 9,4 %. При диагностике острого сапа ПЦР оказалась результативнее бактериологического метода на 7 %. При острых формах данных инфекций, результаты, полученные в ПЦР с использованием двух пар праймеров, совпадали. При этом, выявление возбудителей с помощью реакции амплификации, оказалось эффективным уже в первые сутки после заражения, тогда как с использованием бактериологического метода культуры B.pseudomallei и B.mallei выделяли лишь на третьи сутки заболевания.

Преимущество ПЦР для диагностики подострых форм мелиоидозной и сапной инфекций было более демонстративным. Использование метода ПЦР при исследовании биоптатов от животных с подострым мелиоидозом и сапом оказалось эффективнее бактериологического метода на 15 % и 37 %, соответственно. Кроме того, учитывая отрицательные результаты бактериологического метода при исследовании подострой сапной инфекции, использование ПЦР позволило сделать предположение о возможной персистенции В. mallei в макроорганизме в виде некультивируемых форм. Полученные результаты согласуются с ранее представленными данными о способности патогенных буркхольдерий к Л - трансформации в условиях макроорганизма при заражении высокими дозами низковирулентных штаммов, не приводящей, однако, к развитию клинических проявлений инфекции-[21,26].

При исследовании биологического материала от животных с подострым мелиоидозом и сапом результаты, полученные при использовании двух пар праймеров, совпадали в 68 % и 74 % случаях, соответственно. По нашему мнению, такие результаты могут объясняться высокой чувствительностью праймеров к различным ингибиторам (остаткам жирных кислот, гемоглобина), находящихся в реакционной смеси. Данное предположение подтверждалось увеличением количества положительных результатов при повторной постановке ПЦР с указанными олигонуклеотидными затравками с разведёнными в 10 и 100 раз препаратами ДНК.

В таких случаях интерпретация результатов при исследовании биологического материала методом ПЦР нам представляется следующей: пробы, при исследовании которых, специфические продукты амплификации синтезируются как с праймерами b23-s7/b23-a8, так и с bfl-ls/bfl-as2, можно считать «истинно положительными». Регистрация лишь одного положительного результата (незивисимо от используемых праймеров) служит основанием для внесения этого образца в разряд «подозрительных на контаминацию возбудителями сапа и мелиоидоза». Дальнейшие манипуляции с данной пробой должны включать разведение нативного препарата ДНК, дополнительную очистку от ингибирующих примесей и повторную постановку реакции. Аналогичные рекомендации в подобных ситуациях давали и другие исследователи [90].

При идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза необходима их дифференциация от близкородственных буркхольдерий. Наибольшим уровнем генетического родства с B.pseudomallei и B.mallei обладает микроорганизм, входящий в группу pseudomallei - B.thailandensis [14,81]. Культуры этой буркхольдерии, выделенные с помощью селективных сред из внешней среды эндемичных территорий, практически неотличимы от возбудителя мелиоидоза при использовании стандартных микробиологических схем и наборов типа API. Дифференциальная диагностика этих двух микроорганизмов включает исследование таких свойств, как ассимиляция L - арабинозы, вирулентность для лабораторных животных. Для постановки этиологического диагноза имеют значение видоспецифические ДНК-зонды, а также ПЦР.

Этот микроорганизм считается авирулентным для человека, хотя и существуют сведения о выделении B.thailandensis от больного [182]. Для лабораторных животных вирулентность B.thailandensis значительно ниже, чем у B.pseudomallei [14,80,81]. В ряде работ показано наличие протектив-ного эффекта B.thailandensis для лабораторных животных, заражённых возбудителем мелиоидоза [14]. Имеются мнения, что серопозитивность на мелиоидоз у населения в эндемичных регионах обусловлена контактом с B.thailandensis [80,81]. В связи с этим, представлял интерес изучение особенностей персистенции этого микроорганизма в организме - хозяине, дис-семинации микробов и возможности их выявления методом ПЦР.

Сконструированные праймеры burt-sl/burt-a2 позволяли обнаруживать в ПЦР не только чистые культуры B.thailandensis, но и ДНК этого микроорганизма у экспериментально заражённых животных. Проведенные исследования позволили установить, что, как и в случае мелиоидозной инфекции, реакция амплификации с праймерами burt-sl/burt-a2 была эффективнее бактериологического метода. При анализе биологического материала от зараженных морских свинок разница в эффективности двух методов составила 56,8 %, а при исследовании проб от белых мышей положительные результаты были получены только в ПЦР (14,29 %). Показано, что с помощью метода ПЦР B.thailandensis обнаруживали в организме лабораторных животных на протяжении всего периода наблюдения, что свидетельствовало о возможной персистенции этого микроорганизма. Следовательно, полученные праймеры burt-sl/burt-a2 могут быть использованы для изучения характера и закономерностей распределения B.thailandensis в макроорганизме.

Мелиоидоз является эндемичным заболеванием территорий Юго-Восточной Азии и Австралии. Однако, в последние годы, это заболевание стали регистрировать далеко за пределами эндемичных регионов. Это связано с возможным формированием «вторичных» очагов инфекции при завозе B.pseudomallei из-за рубежа, техногенных катастрофах, террористических актах. Занос мелиоидозного микроба из эндемичных регионов возмо

Таким образом, предлагаемая амплификационная тест-система, состоящая из двух олигонуклеотидных ДНК- затравок b23-s7b23-a8 и bfl-ls/bfl-as2, позволяет идентифицировать возбудителей сапа и мелиоидоза при изучении чистых культур В.mallei и B.pseudomallei, в ранние сроки устанавливать этиологический диагноз при исследовании клинического материала, а также может быть использована для эпидемиологических целей. Высокая чувствительность и специфичность ПЦР - анализа, обеспечиваемая детекцией двух различных генетических мишеней, позволяет рекомендовать разработанные нами праймеры для включения в схему лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза не только на этапе идентификации чистых культур, но и на стадии исследования клинического материала.

Ill

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Алтухова, Виктория Владимировна, 2005 год

1. Адимов Л.Б., Ширяев Д.Т. Мелиоидоз // Диагностика особо опасных и малоизвестных бактериальных инфекций. Ростов - на - Дону: Изд-во Ростовского ун-та, 1970. - С.225-236.

2. Адимов Л.Б., Ширяев Д.Т. Сап // Диагностика особо опасных и малоизвестных бактериальных инфекций. Ростов - на - Дону: Изд-во Ростовского ун-та, 1970. - С.214-224.

3. Аксёнов М.Ю., Гинсбург А.Л. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993. - №4. - С.3-8.

4. Антонов В.А., Замараев B.C., Илюхин В.И. Группоспецифический ДНК зонд для идентификации патогенных псевдомонад // Биотехнология.-1998. —№ 5. - С.75-84.

5. Ашмарин И.П., Воробьёв А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград: Гос. изд-во мед. лит., 1962. — 181с.

6. Аэрогенные инфекции в аспекте проблемы биотерроризма/Алексеев В.В., Тихонов Н.Г, Липницкий А.В. и др.// Проблемы особо опасных инфекций. Саратов,2003. - Вып.85. - С.20-27.

7. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы // М.: Медицина. 1990.- 224с.

8. Взаимодействие возбудителя мелиоидоза с фагоцитирующими клетками / Мельников Б.И., Попов С.Ф., Лагутин М.П., Курилов В.Я.// Актуальные проблемы и задачи биохимии, диагностики и иммунопрофилактики особо опасных инфекций. Саратов, 1991. - С.132-135.

9. Идентификация возбудителей чумы, сапа и мелиоидоза иммунофер-ментным методом / Яковлев А.Т., Зыкин Л.Ф., Метлин В.Н. и др. // Диагностика и профилактика чумы, холеры, сапа и мелиоидоза. Волго град, 1983. - С.86-87.

10. Илюхин В.И. Мелиоидоз // Эпидемиология и инфекционные болезни. — 1999. №4. - С.49-51.

11. Илюхин В.И., Сенина Т.В., Плеханова Н.Г. Burkholderia thailandensis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция // Мол. генет., микробиол., вирусол. 2002. - №1. - С.7-11.

12. Иммунодиагностика мелиоидоза при помощи твёрдофазного варианта радиоиммунологического анализа (РИА) / Пивень Н.Н., Манолов А.Д., Зыкин Л.Ф. и др.// Журнал микробиол., эпидемиол., иммунобиол. — 1994.-№3-С.69-73.

13. Иммунологическая диагностика мелиоидоза / Храпова П.Н., Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C. и др. // Мелиоидоз: Сб. науч.тр. Волгоград, 1995. -С.57-68.

14. Иммунологическая диагностика сапа / Храпова П.Н., Тихонов Н.Г., Рыбкин B.C. и др. // Сап: Сб. науч.тр.- Волгоград, 1995. С.37-44.

15. Индикация возбудителя сапа методом флюоресцирующих антител / Храпова П.Н., Тихонов Н.Г., Быкова О.И. и др. // Актуальные вопросы эпидемиологии, профилактики и диагностики особо опасн. инф. Ставрополь, 1989. -Ч.2.- С. 115-116.

16. Использование произвольных праймеров (RAPD) для внутривидового типирования возбудителя сапа /Алексеева В.В., Антонов В.А., Ткаченко Г.А. и др.// Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. -2003. №1 (7) - С.49-52.

17. Исследование участков геномов Pseudomonas pseudomallei, ответственных за реализацию патогенных свойств. Отчёт о НИР (заключительный) / Волгоградский н.-и. противочумн. ин-т. Руководитель: Мерино-ваЛ.К.-Волгоград, 1998.-ГР 01.9.50.001336. -45с.

18. Илюхин В.И., Батманов В.П., Лозовая Н.А. Клиника и лечение сапа // Сап: Сб. науч.тр. Волгоград, 1995. - С.84-100.

19. Куличенко А.Н. Конструирование молекулярно генетических систем для детекции возбудителей особо-опасных инфекций: чумы, бруцеллёза и сибирской язвы // Автореф.дис . .докт. мед.наук. - Саратов, 1995. -45с.

20. Кутырев В.В., Смирнова Н.И. Генодиагностика и молекулярное типи-рование возбудителей чумы, холеры и сибирской язвы // Мол. генет., микробиол., вирусол. -2003. -№1. — С.6-14.

21. Л трансформация возбудителей как один из путей реализации хронического носительства бактерий рода Pseudomonas / Замараев B.C., Илюхин В.И., Саямов С.Р., Ряпис Л.А. // Микробиологический журнал. - 1987. -№3.-С.91-96.

22. Лобанов А.Н. Ранняя лабораторная диагностика сапа и мелиоидоза и прогнозирование их исхода: Автореф.дис. .канд.мед.наук. Саратов,1992. - 17с.

23. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - 480с.

24. Манолов А.Д.Твёрдофазные радиоиммунные и иммуноферментные методы для количественного экспресс-анализа в микробиологии // Журнал микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1985. - №4 - С.100 - 107.

25. Мелиоидоз / Илюхин В.И., Замараев B.C., Батманов В.П. и др. // Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Саратов, 1998 - Т.2 - С.115-143.

26. Меринова Л.К.Использование генетического обмена патогенных псевдомонад. // Автореф. дис. . д ра мед. наук. - Волгоград, 1997. — 40с.

27. Меркулов Г.А. Курс патогистологической техники. Л.: Медицина, 1969.-423 с.

28. Методические рекомендации по экспериментальному моделированию легочных форм сапа и мелиоидоза / Алексеев В.В., Курилов В.Я., Савченко С.Т. и др. Волгоград, 1992. - 8с.

29. Молекулярная клиническая диагностика. Методы // под ред. С. Хер-рингтона, Дж. Макги. М.: Мир, 1999. - С.302-383.

30. МУ 3.5.5.1034-01 «Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I-IV групп патогенности, при работе методом ПЦР»-М., 2001.-6 с.

31. МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенно-сти».- М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2003.-39 с.

32. Огарков В.И., Гапочко К.Г. Аэрогенная инфекция. М.: Медицина, 1975.-232 с.

33. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука, 1981. - 286с.

34. Патогенез, патологическая анатомия и патологическая морфология мелиоидоза /Алексеев В.В., Тихонов Н.Г., Вязьмина Т.Н. Попов С.Ф. и др. //Мелиоидоз: Сб. науч.тр. Волгоград, 1995. - С. 91 - 119.

35. Патогенез, патологическая анатомия и патологическая морфология сапа / Вязьмина Т.Н., Тихонов Н.Г., Алексеев В.В., Попов С.Ф. и др. // Сап: Сб. науч. тр. Волгоград, 1995. - С.50-73.

36. Пивень Н.Н. Антигенный анализ возбудителей мелиоидоза и сапа в аспектах идентификации, диагностики и патогенности // Дис. .д-ра мед. наук. Волгоград, 1997. - С. 128-139.

37. Плеханова Н.Г. Экзопротеазы возбудителя мелиоидоза: выделение, очистка, физико-химические и иммунобиологические свойства: Авто-реф. дис. .канд. биол. наук. Саратов. 1994. - 20с.

38. Попов С.Ф., Курилов В.Я., Мельников Б.И. Особенности паразитиро-вания возбудителя мелиоидоза в клетках хозяина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. — 1991. — №10. — С. 12-14.

39. Попов С.Ф., Курилов В.Я., Мешкова Л.Ю. Ультраструктурный аспект паразитирования возбудителя сапа в клетках хозяина // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций: Матер. Рос. науч. конф. Тез.докл. Волгоград, 1992. - С. 121.

40. Постановление Правительства Российской Федерации № 715 «Об утверждении перечня социально-значимых заболеваний и перечня заболеваний, представляющих опасность для окружающих» от 1 декабря 2004 г., г. Москва.

41. Применение хемшпоминисцентного иммуноанализа для ускоренной диагностики особо опасных инфекций / Яковлев А.Т., Коваленко А.А., Липницкий А.В. и др. // Генетика и биохимия возбудителей особо опасн. инф. Волгоград, 1992. - С.262 - 268.

42. Прохватилова Е.В. Моноклональные сапные и мелиоидозные антитела как диагностические реагенты: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Волгоград, 1997. -28с.

43. ПЦР детекция маркеров эпидемической значимости штаммов Vibrio cholerae 0139, изолированных в Сибири / Балахонов С.В., Миронова Л.В., Марамович А.С. и др. // Мол. генет., микробиол., вирусол. — 2001. №2. - С.24-26.

44. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных. М.: Медиа Сфера,2003. - 305 с.

45. Рыбкин B.C. Коагглютинация как метод диагностики природноочаго-вых инфекций // Профилактика природноочаговых инфекций. Ставрополь, 1983. - С.346-348.

46. Самойлова Л.В. Экспериментальная лёгочная чума (определение DCa и LD50 при аэрогенном и интратрахеальном заражении) // Вопросы про-вотивоэпидемической защиты населения: Сб.статей НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи. — 1970. Вып. 17. - С.206 - 211.

47. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285 03. Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности (опасности) // Госсанэпиднадзор России. - М., 2003. - 103с.

48. Сап / Илюхин В.И., Храпова П.Н., Замараев В.С.и др.// Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. Саратов, 1998 - Т.2. -С.101-114.

49. Сенина Т.В. Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике: Автореф. дис. . .канд.биол.наук. Волгоград,2004. - 22 с.

50. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas II Киев: Наукова думка, 1990. 262 с.

51. Ткаченко Г.А. Конструирование амплификационной тест- системы для выявления патогенных буркхольдерий: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Волгоград, 2003. - 24 с.

52. Шиповская П.Н., Меринова Л.К., Ряпис Л.А. Свойства ауксотрофных мутантов Pseudomonas mallei II Журн.микробиол., эпидемиол., имму-нобиолог. 1983. - №4. - С.36-39.

53. A case of imported melioidosis presenting as prostatitis / Heyse A.M., Dierick J., Vanhouteghem H.et al. // Infection. 2003. - Vol.31, № 1. - P.60 -62.

54. A case of nonfatal melioidosis / Thng T.G., Seow C.S., Tan H.H.,Yosi-povitch G.// Cutis 2003. - Vol. 72, №4. - P.310 - 312.

55. Abbink F.C., Orendi J.M. Mother to - child transmission of Burkholderia pseudomallei II N. Engl. J. Med. - 2001. - Vol.344, № 15. - P. 1171 - 1172.

56. Adherence of Burkholderia pseudomallei cells to cultured human epithelial cell lines is regulated by growth temperature / Brown N.F., Boddey J.A.,

57. Flegg C.P., Beacham I.R. // Infect. Immun. 2002. - Vol.70, №2. - P.974 -980.

58. An ultrastructural study of the phagocytosis of Burkholderia pseudomallei / Harley Y.S., Dance D.A.B., Tovey G., McCrossan M.V., Drasar B.S.// Mi-crobios. 1998. - Vol.94. - P.35 - 45.

59. Analysis offliC variation among clinical isolates of Burkholderia cepacia / Winstanley C., Hales B.A., Morgan J.A. et al. // J. Med. Microbiol. 1999. -Vol.48, №7. - P.657-662.

60. Anuntagool N., Rugdech P., Sirisinha S. Identification of specific antigens of Pseudomonas pseudomallei and evaluation of their efficacies for diagnosis of melioidosis // J. Clin.Microbiol. 1993. - Vol.31. - P. 1232-1236.

61. Ashdown L.R. An improved screening technique for isolation of Pseudomonas pseudomallei from clinical specimes // Pathology. — 1979. — Vol.11, №2.- P.293-297.

62. Ashdown L.R. Demonstration of human antibodies to Pseudomonas pseudomallei by indirect fluorescent antibody staining // Pathology. 1981. -Vol.13.-P.597- 601.

63. Ashdown L.R. Relationship and significance of specific immunoglobulin M antibody response in clinical and subclinial melioidosis // J.Clin. Microbiol.- 1981.-Vol.14.-P.361 -364.

64. Ashdown L.R., Guard R.M. The prevalence of human melioidosis in Northern Queeslande // Amer.J.Trop. Med.Hyg. 1984. - Vol.33, №3. - P.474-487.

65. Ashdown L.R., Kochler J.M. Production of hemolysin and other extracellular enzymes by clinical isolates of Pseudomonas pseudomallei II J.Clin.Microbiol. 1990. - Vol.28, №10. -P.2332-2334.

66. Attachment of Burkholderia pseudomallei to pharyngeal epithelial cells: a highly pathogenic bacteria with low attachment ability /Ahmed K., Enriso H.D.R., Masaki H., Tao M. et al. //Am. J. Trop. Med. Ilyg. 1999. - Vol.60.- P.90 93.

67. Biophysical characterization of the catalytic domain of guanine nucleotide exchange factor BopE from Burkholderia pseudomallei / Upadhyay A., Williams C., Gill A.C., Philippe D.L., Davis K. et al.// Biochim. Biophys. Acta.- 2004.-Vol.1698.-P.l 11 119.

68. Brett P.J., Mah D.C., Woods D.E. Isolation and characterization of Pseudomonas pseudomallei flagellin proteins // Infect. Immun. 1994. — Vol.62, №5,- P.1914-1919.

69. Brett P. J., DeShazer D., Woods D.E. Characterization of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia pseudomallei — like strains // Epidemiol. Infect. — 1997. Vol.118. - P. 137-148.

70. Brett P.J., DeShazer D., Woods D.E. Burkholderia thailandensis sp. nov., a Burkholderia pseudomallei — like species // Int. J. Syst. Bacterid., 1998. — Vol.48.-P. 317-320.

71. Brett P.J., Woods D.E. Pathogenesis of and immunity to melioidosis // Acta tropica. Vol.74. - 2000. - P.201-210.

72. Burkholderia pseudomallei'. a case report of a human infection in Ceara, Brazil / Miralles I.S., Maciel M.d.C.A., Angelo M.R.F.et al. // Rew. Inst. Med. trop. S.paulo. 2004. - Vol.46, № 1. - P.51 -54.

73. Burkholderia pseudomallei'. another emerging pathogen in cystic fibrosis / O'Carrol M.R., Kidd T.J., Coulter C. et al. // Thorax. 2003. - Vol.58. -P.1087-1089.

74. Characterization of Pseudomomas pseudomallei antigens by SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and Western blot / Wongratanacheewin S., Tattawasart U., Lulitanond V. et al. // Southeast Asian J. Trop. Med. Pub. Hlth.- 1993.-Vol.24.-P. 107- 113.

75. Chua K.L., Chan Y.Y. and Gan Y.H. Flagella are virulence determinants of Burkholderia pseudomallei II Infect.Immun. 2003. - Vol.71, № 4 - P. 16221629.

76. Cloning and characterisation of malE in Burkholderia pseudomallei / Woo P.C., Leung P.K., Tsoi H.W., Yuen K.Y.// J. Med. Microbiology 2001. -Vol.50, №4.-P.330-338.

77. Comparative genomics of Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei / DeShazer D., Parkhill J., Quail M., Churher C., Titball R., Nierman B. // World Melioidosis Congress. Western Australia, 2001. - Abstract 26.

78. Comparison of the polymerase chain reaction and serologic tests for diagnosis of septicemic melioidosis / Wongratanacheewin R., Wongratanacheewin

79. S., Anuntagool N. // Am. J.Trop. Med. Hyg. 2000. - Vol.63. - P.146 -149.

80. Comparison of three PCR primer sets for diagnosis of septicemic melioidosis / Kunakorn M., Raksakait K., Sethaudom C. et al. // Acta Trop. 2000. — №74. -P.247-251.

81. Currie B.J. Melioidosis: an important cause of pneumonia in residents of and travelers returned from endemic regions // Eur.Respir.J. 2003. - Vol.22, № 3. - P.542-550.

82. Dance D.A.B. Ecology of Burkholderia pseudomallei and the interactions between environmental Burkholderia spp. and human-animal hosts // Acta tropica. 2000. - Vol.74 - P. 159-168.

83. Dance'D.A.B. Melioidosis as an emerging global problem //Acta Trop. -2000.-Vol.74.-P.l 15- 119.

84. Dance D.A.B., Smith M.D., Aucken H.M., Pitt T.L. Imported melioidosis in England and Wales // Research letters. 2004. - Vol.353, № 9148.

85. Detection of Burkholderia pseudomallei DNA in patients with septicemic melioidosis / Dharakul Т., Songsivilai S., Viriyachitra S., Luangwedchakarn V., Tassaneetritap В., Chaowagul W. // J. Clin. Microbiol. 1996. - Vol.34, №3. - P.609 - 614.

86. Detection of Burkholderia pseudomallei in rice fields with PCR-based technique / Kao C.M., Chen S.C., Chen Y.S., Lin H.M. et al.// Folia Microbiol (Praha). 2003. - Vol.48, №4. - P.521 - 524.

87. Detection of Pseudomonas pseudomallei antigen in urine for the diagnosis of melioidosis / Desakorn V., Smith M.D. Wuthiekanum V. et al. // Am. J. Trop.Med. Hyg. 1994. - Vol.51. - P.627-633.

88. Dharakul Т., Songsivilai S. The many facets of melioidosis // Trends Microbiol.- 1999.-№ 4.-P.138-140.

89. Egan A.M., Gordon D.L. Burkholderia pseudomallei activates complement and is ingested but not killed by polymorphonuclear leukocytes // In-fect.Immun. 1996. - Vol.64. - P.4952 - 4959.

90. Endemic melioidosis in tropical northern Australia: a 10-year prospective study and review of the literature / Currie B.J., Fisher D.A., Howard D.M. et al. // Clin. Infect. Dis. 2000. - Vol.31. - P.981-986.

91. Enzyme-linked immunosorbent assay for immunoglobulin M specific antibody for the diagnosis of melioidosis / Kunakorn M., Boonma P., Khupulsup K.et al.// J.Clin. Microbiol. 1990. - Vol.28, №6. - P. 1249-1253.

92. Enzyme-linked immunosorbent assay for the diagnosis of clinical and sub-clinial 'melioidosis /Ashdown L.R., Jonson R.W., Koehler J.M., Cooney C.A.//J. Infect. Dis. 1989. - Vol.160.-P.253-260.

93. Epidemiology of melioidosis in North Eastern Thailand / Wuthiekanunl V.,Cheng A.C., Chierakull W, Chaowagul W.et al. // 4th World Melioidosis Congress. Singapore, 2004. - Abstract 52. - P.34.

94. Evaluation of PCR for diagnosis of melioidosis / Haase A., Brennan M., Barrett S. et al. // J. Clin. Microbiol. 1998. - Vol.36, № 4. - P.1039 - 1041.

95. Extreme weather events and environmental contamination are associated with outbreaks of melioidosis in Northern Australia / Cheng A.C., Jacups S.P., Gaf D., Mayo M. et al.// 4th World Melioidosis Congress. Singapore, 2004. - Abstract 60. - P.38.

96. Flagellin gene and protein variation amongst clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa / Winstanley C., Coulson M.A., Wepner В., Morgan J.A.W., Hart C.A.//Microbiology. 1996. - Vol.142. -P.2145 -2151.

97. Flagellin gene PSR-RFLP analysis of a panel of strains from the Burkholderia cepacia complex / Winstanley C., Desika M.G., Glendinning K.J., Parsons Y.N., Hart C.A.//J. Med. Microbiol. 2001. - Vol.50, №8. -P.728 - 731.

98. Flagellum mediated adhesion by Burkholderia pseudomallei precedes invasion of Acanthamoeba astronyxis / Inglis T.J.J., Robertson T.A., Woods D.E., Dutton N.S., Chang B.J.// Infect.Immun. - 2003. - Vol.71, № 4. -P.2280 - 2282.

99. Fuether evaluation of a rapid diagnostic test for melioidosis an area of en-demicity / O'Brien M., Freeman K., Lum G.et al.// J. Clin. Microbiol. -2004. Vol.42, №5. - P.2239-40.

100. Fundamentals of the polymerase chain reaction: a future in clinical diagnostics? / Rapley R., Theophilus B.D.M., Bevan I.S., Walker M.R. // Medical laboratory sciences. 1992. - Vol.49, №2. - P. 119-128.

101. Gan Y.H., Chan Y.Y., Chua K.L. Flagella is a virulence factor of Burkholderia pseudomallei in mice // World Melioidosis Congress. — Western Australia, 2001. Abstract 37.

102. Genetic diversity of flagellins of Pseudomonas aeruginosa / Spangenberg C., Heuer Т., Burger C., Tummler B. // FEBS Letters. 1996. - Vol.396. -P.213-217.

103. Genomic plasticity of the causative agent of melioidosis, Burkholderia pseu-doomallei / Holden M.T.G., Titball R.W., Peacock S.J. et al. // PNAS. -2004. Vol.101, №39.-P.14241 - 14245.

104. Gray D.I., Kroll R.G. Polymerase chain reaction amplification of the, fly A gene for rapid identification of Listeria spp.ll Lett Appl Microbiol. 1995. -Vol.20.-P.65-68.

105. Identification of the acid phosphatase (acpA) gene homologues in pathogenic and nonpathogenic Burkholderia spp. facilitates Tn phoA mutagenesis / Burtnick M.N., Bolton A.J., Brett P.J. et al. // Microbiology. 2001. -Vol.147.-P.lll-120.

106. In vitro interaction of macrophages and dendritic cells with Burkholderia pseudomallei / Sirisinha S., Kespichayawattana W., Utaisincharven P., Inta-chote P.// World Melioidosis Congress. Western Australia, 2001. - Abstract 52.

107. Jones A.L., Beveridge T.J., Woods D.E. Intracellular Survival of Burkholderia pseudomallei II Infect. Immun. 1996. - Vol. 64, №3. - P.782 -790.

108. Kespichayawattana W., Wanun Т., Sirisinha S. Morphological study of the interaction between Burkholderia pseudomallei and cultured cell lines I I International Congress on Melioidosis. Bangkok, Thailand, 1998. - Abstract P412.-P.107.

109. Kunakorn M., Markham R.B. Clinically practical seminested PCR for Burkholderia pseudomallei quantitated by enzyme immunoassay with and without solution hybridization // J.Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33, №8. -P.2131 -2135.

110. Leelarasamee A. Diagnostic value of indirect hemagglutination method for melioidosis in Thailand // J. Infect. Dis. Antimicrob. Agents. 1985. - Vol.2. - P.214 - 215.

111. Leelarasamee A. Melioidosis in Southeast Asia //Acta tropica. 2000. -Vol.74. -P.129-132.

112. Leelarasamee A., Bovornlcitti S. Melioidosis: review and update // Rew.Infect. Dis. 1989. - Vol. 11.- P.413-425.

113. Lew A.E., Desmarchelier P.M. Detection of Pseudomonas pseudomallei by PCR and hybridization // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol.32, №5. - P. 1326-1332.

114. Mceniry D.W., Gillespie S.H., Felmingham D. Susceptibility of Pseudomonas pseudomallei to new B-lactam and aminoglycoside antibiotics // J. An-timicrob. Chemother. 1988. - Vol.21. -P.171 - 175.

115. Melioidosis in traveller from Thailand: case report / Maccanti O., Pardelli R., Tonziello A., Gracci G. Viaildi I. // J.Chemother. 2004. - Vol.16, №4. -P.404-407.

116. Melioidosis: a major cause of community acquired septicemia in northern Thailand / Chaowagul W., White N.J., Dance D.A.B. et al.// Journal of Infectious Diseases. - 1989. - Vol. 159. - P.890 - 899.

117. Melioidosis: forgotten, but not gone / Koponen M.A., Zlock D., Palmer D.L., Merlin T.L. //Arch. Intern. Med. 1991. - Vol. 137. - P.605 - 608.

118. Melioidotic septic arthritis and its risk factors / Kosuwon W., Taimglang Т., Sirichativapee W. and Jeeravipoolvarn P.// J.Bone Joint Surg.Am. 2003. -Vol.85.-P.1058- 1061.

119. Melioiodosis in northen Australia, 2001- 02 / Cheng A.C., Hanna J.N., Norton R. et al. // Commun. Dis. Intell. -2003. Vol.27, №2. - P.272 - 277.

120. Molecular Cloning: a laboratory manual. 2-nd ed./ Sambrook J., Fritsch E., Maniatis T. N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989. - Vol.2. -479 p.

121. Molecular procedure for rapid detection of Burkholderia mallei and Burkholderia pseudomallei / Bauernfeind A., Roller C., Meyer D., Jungwirth R., Schneider I. // J.of Clin.Microbiol. 1998. - Vol.36, №9. - P.2737 - 2741.

122. Mukhopadhyay A., Lee K.H., Tambyah P.A. Bacteraemic melioidosis pneumonia: impact on outcome, clinical and radiological features // J Infect.- 2004. Vol.48, №4. - P.334-338.

123. Mutagenesis of Burkholderia pseudomallei with Tn5-OT182: isolation of motility mutans and molecular of the flagellin structural gene / DeShaser D., Brett P.J., Carlyon R., and Woods D.E. // J. Bacterid.- 1997.- Vol.179, №7.- P.2116 2125.

124. Naigowit P., Kurata Т., Wangroongsub P. Application of indirect immunofluorescence microscopy to colony identification of Pseudomonas pseudomallei II Asian. Рас. J. Allergy. Immunol. 1993. - Vol.ll, № 2. — P. 149-154.

125. Neonatal melioidosis: a report of 5 cases / Lumbiganon P., Pengsaa K., Puapermpoonsiri S., Puapairoj A. // Pediatr. Infect Dis J. 1988. - Vol.7. -P.634 - 636.

126. Neurological melioidosis: seven cases from the Northern Territory of Australia / Woods M.L., Currie В .J., Howard D.M. et al. // Clin. Infect. Dis. -1992.-Vol.15. -P.163 169.

127. Non septicemic Burkholderia pseudomallei liver abscess in a young man / Ben R.J., Tsai Y.Y., Chen J.C., Feng N.H. // J. Microbiol. Immunol.Infect. -2004. - Vol.37, №4. - P.254-257.

128. Nucleic acid similarities among Pseudomonas pseudomallei, Pseudomonas multivorans and Actinobacillus mallei / Rogul M., Brendle J.J., Haapala D.K. et al. //J. Bacteriol. 1970. - Vol.101. - № 3. - P.827-835.

129. O'Callaghan E.M., Tanner M.S., Boulnois G.J. Development of a PCR probe test for identifying Pseudomonas aeruginosa and Pseudomonas (Burkholderia) cepacia II J. Clin. Pathol. 1994. - Vol.4. - P.222 - 226.

130. Oyofo B.A., Rollins D.M. Efficacy of filter types for detecting Campylobacter jejuni and Campylobacter coli in environmental water samples by polymerase chain reaction // Appl. Environ. Microbiol. 1993. - Vol.59. -P.4090 — 4095.

131. PCR detection of Yersinia pestis on fleas: comparison with mouse inoculation / Engelthaler D.M., Gage K.L., Montenieri J.A. et al. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol.37, №6. - P.1980 -1984.

132. Penn C.W., Luke C.J. Bacterial flagellar diversity and significance in pathogenesis//FEMS Microbiology Letter. 1992. - Vol.100. -P.331-336.

133. Picken R.N. Polymerase chain reaction primers and probes derived from flagellin gene sequences for specific detection of the agents of Lyme disease and North American relapsing fever // J Clin Microbiol. 1992. -Vol.30. -P.99-114.

134. Preliminary evaluation of novel target gene sequences for PCR-based identification of Burkholderia pseudomallei / Merritf A.J., Chidlow G., Harnett G.B., Inglis T.J.J.// 4th World Melioidosis Congress. Singapore, 2004. -Abstract 67. - P.41.

135. Pruksachartvuthi S., Aswapokee N., Thankerngpol K. Survival of Pseudomonas pseudomallei in human phagocytes // J. Med. Microbiol. 1990. — Vol.31. - №2.-P.109- 114.

136. Rainbow L., Hart C.A., Winstanley C. Distribution of type III secretion gene clusters in B.pseudomallei, B.thailandensis and B. mallei II J.Med.Microbiol. 2002. - Vol.51. - P.374-384.

137. Rapid and simple method purification of nucleic acids / Boom R., Sol C.J.A., Salimans M.M. et al. // J. Clin. Microbiol. 1990. - Vol.28, № 3. -P.495-503.

138. Rapid 'identification of Burkholderia pseudomallei by latex agglutination based on an exopolysaccharide-specific monoclonal antibody / Steinmetz I.,

139. Reganzerowski A. et al. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol.37, № 1. -P.225-228.

140. Rapid identification of Burkholderia pseudomallei in blood culture by a monoclonal antibody assay / Pongsunk S., Thirawattanasuk N., Piyasang-thong 1ST. et al. // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol.37, №11.- P.3662-3667.

141. Rattanathongkom A., Sermswan R.W., Wongratanacheewin S. Detection of Burkholderia pseudomallei in blood samples using polymerase chain reaction//Mol. Cell. Probes. 1997. - Vol.11, №1. - P.25-31.

142. Recombinant truncated flagellin of Burkholderia pseudomallei as a molecular probe for diagnosis of melioidosis / Chen Y., Shiuan D., Chen S.C., Chye S.M., Chen Y.L.// Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology. 2003. -Vol.10, №3.-P.423-425.

143. Relapsing melioidosis as cause of iliac mycotic aneurysm: an indigenous case in Taiwan / Luo C.Y., Ко W.C., Lee H.C. and Yang Y.J.// J. Vase. Surg. 2003. - Vol.37, №. 4. -P.882 -885.

144. Relationships among Pseudomonas pseudomallei isolates from patient with recurrent melioidosis / Desmarchelier P.M., Dance D.A., Chaowagul W., Suputtamongkol Y., White N.J., Pitt T.~L.II J.Clin.Microbiol. 1993. -Vol.31, №6.-P.1592-1596.

145. Resent development in laboratory diagnosis of melioidosis / Sirisinha S., Anuntagool N., Dharakul Т., Ekpo P. et al.// Acta tropica. 2000. - Vol.74. - P.235-245.

146. Ribotype analysis of Pseudomonas pseudomallei isolates / Sexton M.M., Goebel L.A., Godfrey A.J. et al. // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol.31. -P.238 - 243.

147. Sangchan A, Mootsikapun P., Mairiang P. Splenic abscess: clinical features, microbiologic finding, treatment and outcome // J.Med. Assoc.Thai. 2003. - Vol.86, № 5. - P.43 6 - 441.

148. Schmidt B.L. PCR in laboratory diagnosis of human Borrelia burdorferi infections // Clin. Microbiol.Reviews. 1997. - Vol.10, №1. - P.185-201.

149. Senkiw M.C., Woods D.E. Replication of Burkholderia pseudomallei in cultured epithelial cells // International Congress on Melioidosis. Bangkok, Thailand, 1998.- AbstractP411.-P. 106.

150. Sequence variation in the flagellin (fliC) gene in human, animal and soil isolates of Burkholderia pseudomallei / See L.H., Phang S.T.W., Yap E.H., Yap E.P.H.// International Congress on Melioidosis. Bangkok, Thailand, 1998. - Abstract S065. - P.59.

151. Serodiagnosis of melioidosis in Malaysia / Vadivelu J., Puthucheary S.D., Gendeh G.S., Parasakthi N. // Singapore Med. J. 1995. - Vol.36. - P.299-302.

152. Serodiagnosis of melioidosis off Singapore by the inderect hemagglutinatio-test / Yap E.N., Chan Y.C, Ti T.Y.et al. // Singapore Med. J. 1991. -Vol.32, №4.-P.211-213.

153. Severe community-acquired pneumonia and sepsis caused by Burkholderia pseudomallei associated with flooding in Puerto Rico // Christenson В., Fux-ench Z., Morales J.A., Suares -Villamil R.A. et al. /Bol. Asoc. Med. P.R. -2003. Vol.95, №6. - P.17-20.

154. Songsivilai S., Dharakul T. Multiple replicons constitute the 6.5 megabase genome of Burkholderia pseudomallei II Acta Trop. — 2000. - Vol.74. -P.169-179.

155. Sonthayanon P., Tungpradabkul S., Panyim S. / PCR baced flagellin sequence for differentiation biotypes of two biotypes of Burkholderia pseudomallei II International Congress on Melioidosis. - Bangkok, Thailand,1998. - Abstract P906.-P.149.

156. Specific detection of Brucella DNA by PCR / Romero C., Gamazo C., Pardo M., Lopes-Goni I. IIJ Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33, №3. - P.615-617.

157. Specific detection of Salmonella spp. by multiplex polymerase chain reaction / Way J.S., Josephson K.L., Pillai S.D. et al.// Appl. Environ. Microbiol. 1993.-Vol.59.-P.1473 - 1479.

158. Strategies for PCR based detection of DNA in paraffin wax embedded tissues / Hagen R.M., Gauthier Y.P., Spraque L.D. et al. // J. Clin. Pathol: Mol. Pathol. 2002. - Vol.55. - P.398 - 400.

159. Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome / Nierman W.C., DeShazer D., Kim S. et al. II PNAS. 2004. - Vol.101, №39. - P.14246-14251.

160. The flagellin gene as a stable marker for detection of Pseudomonas fluores-cens SBW 25 / Denning N., Morgan J.A.W., Whipps J.M., Saunders J.R., Winstanley C. // Lett. Appl. Microbiol. 1997. - Vol.24. - P. 198-202.

161. Trakulsomboon S., Thamlikitkul V. Epidemiology of arabinose assimilation in Burkholderia pseudomallei isolated from patients and soil in Thailand // International Congress on Melioidosis. Bangkok, Thailand, 1998. - P.144.

162. Tungpradabkul S., Senapin S., Panyim S. PCR- based method for isolation of flagellin gene in Pseudomonas species // Journal of General and Applied Microbiology. 1998. - Vol.44. -P.231 - 234.

163. Use of onsite Technology for Rapidly Assessing Environmental Bacillus an-thracis contamination on Surfaces in Buildings // MMWR, CDC. 2002. -Vol.50, №48.-P. 1087.

164. Wang Y.S., Wong C.H., Kurup A. Cutaneous melioidosis and necrotizing fascitis caused by Burkholderia pseudomallei II Emerg Infect Dis. 2003. — Vol.9, №11.-P.1484-1485.

165. Wheelis M. First shots fired in biological warfare // Nature. 1998. - № 395. - P.213.

166. White N.J. Melioidosis // Lancet. 2003. - Vol.361, № 9370. - P.1715-1722.

167. Wilson D.R., Beveridge T.J. Bacterial flagellar filaments and their component flagellins // Can. J. Microbiol. 1993. - Vol.39. - P.451 - 472.

168. Winstanley C., Morgan J.A.W. The bacterial flagellin gene as a biomarker for detection, population genetics and epidemiological analysis // Microbiology. 1997. - Vol.143.-P.3071 - 3084.

169. Winstanley C., Hart C.A. Presence of type III secretion genes in B. pseudomallei correlated with Ara- phenotypes // J. of Clin. Microbiol. 2000. -Vol.38; №2.-P.883-885.

170. Wongratanacheewin S., Tattawasart U., Lulitanond V. An avidin-biotin enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of Pseudomonas pseudomallei antigens // Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1990. - Vol.84. -P.429-430.

171. Yoshimasa K., Hirosawa W. Pseudomonas pseudomallei 16S rRNA gene // GenBank database, National Center for Biotechnology Information, Washington, DC. 1992. - GenBank accession No.D13048, D13049, D13050, D13051 and D13052.