Генотипирование штаммов Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат медицинских наук Савченко, Сергей Сергеевич

• Савченко, Сергей Сергеевич
• кандидат медицинских наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Савченко, Сергей Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Внутривидовое типирование патогенных микроорганизмов на 13 основе фенотипических признаков

1.2. Использование молекулярно-генетических методов для внутри- 19 видового типирования возбудителей бактериальных инфекций

1.3. Дифференциация штаммов патогенных буркхольдерий с использованием молекулярно-биологических методов

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Штаммы микроорганизмов, питательные среды, 42 условия культивирования

2.2. Подготовка проб для ПЦР

2.3. Выделение ДНК

2.4. Полимеразная цепная реакция

2.4.1. Реакция амплификации с произвольными праймерами

2.4.2. Реакция амплификации со специфическими праймерами

2.4.3. Реакция амплификации для мультилокусного сиквенс- 49 типирования

2.5. Детекция продуктов амплификации и определение размеров 50 фрагментов ДНК

2.6. Секвенирование продуктов амплификации и анализ полученных 50 нуклеотидных последовательностей

2.7. Статистическая обработка результатов

2.8. Заражение лабораторных животных

ГЛАВА 3. ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ ПА- 53 ТОГЕННЫХ БУРКХОЛЬДЕРИЙ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЕК-ВЕНИРОВАНИЯ

3.1. Монолокусное типирование штаммов патогенных буркхоль- 53 дерий с использованием секвенирования флагеллярного и рибосо-мальных генов

3.2. Мультилокусное сиквенс-типирование штаммов патогенных 63 буркхольдерий.

ГЛАВА 4. ГЕНОТИПИРОВАНИЕ ШТАММОВ ПАТОГЕННЫХ 69 БУРКХОЛЬДЕРИЙ НА ОСНОВЕ АМПЛИФИКАЦИИ С ПРОИЗВОЛЬНЫМИ ПРАЙМЕРАМИ (RAPD)

4.1. Стандартизация условий постановки реакции амплификации и 69 подбор праймеров для RAPD-типирования патогенных буркхольде-рий.

4.2. Анализ генетического полиморфизма возбудителя сапа с ис- 72 пользованием произвольных праймеров.

4.3. RAPD-типирование штаммов возбудителя мелиоидоза

4.4. RAPD-типирование мутантных и выделенных от эксперимен- 84 тально зараженных животных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генотипирование штаммов Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei»

Увеличение заболеваемости мелиоидозом в эндемичных очагах, расширение ареала этой инфекции и ее регистрация во многих странах мира [67, 88, 89, 124, 137], появление новых случаев сапа [98], в том числе обусловленных внутрилабораторным заражением [118], определяют возможности возникновения в любом регионе неблагоприятной эпидемической ситуации по этим инфекциям и таят в себе угрозу их распространения. Возросший интерес к В.mallei и B.pseudomallei, возбудителям сапа и мелиоидоза, в последнее время также обусловлен возможностью их использования в качестве потенциальных агентов биотерроризма [179].

В современных условиях, когда эпидемиологические закономерности распространения опасных инфекций существенно изменились, возникает необходимость пересмотра и усовершенствования системы внутривидового типирования их возбудителей, которая, являясь ключевым звеном в расшифровке вспышек бактериальных инфекций, направлена на определение штамма - источника заражения.

Для многих видов микроорганизмов, в том числе возбудителей особо опасных инфекций, разработаны оптимальные схемы дифференциации штаммов, основанные на вариабельности либо фенотипических, либо ге-нотипических признаков. Однако в отношении возбудителей сапа и мелиоидоза исследования, направленные на поиск простых и высокоэффективных методов внутривидовой дифференциации штаммов, продолжаются до настоящего времени.

Возможности методов внутривидового типирования патогенных буркхольдерий на основе фенотипических признаков ограниченны ввиду их относительно низкой вариабельности. Предпринимались попытки разработать схему типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза на основе их антигенной структуры [70, 104, 105], чувствительности к бактериофагам [18, 26], спектров суммарных клеточных белков [11], однако эффективность дифференциации во всех этих случаях оставалась крайне низкой.

Проблемы, связанные с недостатками фенотипических методов ти-пирования, стимулировали развитие способов внутривидовой дифференциации, основанных на исследовании структуры ДНК. Предназначенные первоначально только для научных исследований, в настоящее время гено-типические методы начинают занимать доминирующее место в решении различных проблем медицинской микробиологии и эпидемиологии.

На сегодняшний день общепринято, что результаты генотипирова-ния характеризуются большей однозначностью по сравнению с морфологическими, биохимическими или иммунологическими методами дифференциации микроорганизмов и предоставляют непосредственную информацию для выяснения эволюционных и эпидемиологических связей различных изолятов бактерий. При отсутствии корреляции между генотипом и частью фенотипа, которая может быть определена существующими микробиологическими методами, предпочтение отдается генотипическим методам [10].

Для молекулярного типирования штаммов возбудителя мелиоидоза использовали рестрикционный анализ хромосомной ДНК (ПДРФ) [79, 178], метод риботипирования [138, 176] и пульс-электрофореза [111, 185], различные модификации полимеразной цепной реакции [102, 170, 194] и мультилокусное сиквенс-типирование (MJICT) [152]. С помощью данных методов удалось показать клональность вспышек мелиоидоза среди аборигенов Папуа-Новой Гвинеи и Австралии [86, 87], расшифровать водную вспышку заболевания в Австралии [81], подтвердить рецидивы заболеваний после проведенной антибиотикотерапии [111, 190]. Кроме того, была показана высокая близость геномов этих бактерий и высказано мнение о том, что возбудитель сапа является клоном возбудителя мелиоидоза [152].

В последние годы появились работы, связанные с секвенированнием последовательностей нуклеотидов, направленные на идентификацию и внутривидовую дифференциацию патогенных буркхольдерий [113, 114]. Однако в настоящий момент развитие генотипических методов, основанных на прямом секвенировании, сдерживаются достаточно высокой стоимостью исследований.

Необходимость исследований, направленных на генотипирование В.mallei и B.pseudomallei определяется сохранением угрозы возникновения чрезвычайных биологических ситуаций в результате техногенных катастроф, природных катаклизмов, а также террористических актов с использованием этих возбудителей, относящихся к потенциальным агентам биотерроризма группы В [205].

Успех противодействия биотерроризму во многом зависит от разработки новейших технологий и комплексного подхода к лабораторным исследованиям по обнаружению и дифференциации штаммов патогенных агентов при сочетанном применении нескольких взаимодополняющих генотипических методов. Анализ фенотипических и генотипических характеристик обнаруженного патогена позволит определить его эпидемиологическую значимость и объем противоэпидемических мероприятий.

Несмотря на достигнутые успехи в области генотипирования, проблема определения штаммовой гетерогенности патогенных буркхольдерий по-прежнему существует. Актуальность исследования обусловлена отсутствием единого мнения и регламентирующих документов для дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза. Кроме того, основная масса исследований в области генотипирования патогенных буркхольдерий направлена на разработку схем внутривидовой дифференциации B.pseudomallei, в то время как в отношении В.mallei имеются лишь единичные публикации [102, 111, 120, 123].

Целью настоящей работы являлся

Анализ геномного полиморфизма коллекционных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и выбор оптимальных методов внутривидовой дифференциации патогенных буркхольдерий. Задачи исследования

1. Провести анализ современных методов генотипирования и оценить возможность их использования для внутривидовой дифференциации коллекционных штаммов патогенных буркхольдерий

2. Проанализировать нуклеотидные последовательности, представленные в доступных генетических базах данных, для выбора ДНК-мишеней и проведения внутривидового типирования штаммов В. pseudomallei и В. mallei с использованием монолокусного секве-нирования.

3. Оценить разрешающую способность метода мультилокусного сик-венс-типирования для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий.

4. Подобрать произвольные праймеры и оптимизировать условия проведения реакции амплификации для эффективной и воспроизводимой дифференциации штаммов В. pseudomallei и В. mallei с использованием ПЦР-типирования (RAPD, Rep-ПЦР).

Научная новизна

Впервые проведен анализ изолятов возбудителя сапа на основе реакции амплификации с произвольными праймерами и предложен оригинальный набор олигонуклеотидных затравок для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий.

Впервые показана высокая эффективность метода RAPD для внутривидового типирования штаммов возбудителя сапа, в то время как для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза — мультилокусного сик-венс-типирования и ПЦР-типирования (RAPD, Rep-ПЦР).

Использование алгоритма eBURST для анализа результатов мультилокусного сиквенс-типирования позволило впервые установить, что штаммы коллекционного центра живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института B.pseudomallei 100, С-141, а также B.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, относятся к Юго-Азиатской группе.

Оценена возможность использования фрагментов генов 16S рРНК, 23S рРНК и fliC в качестве ДНК-мишеней для генотипирования возбудителей сапа и мелиоидоза и показана их низкая эффективность для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий.

Выявлено, что сочетание реакции амплификации и последующего секвенирования фрагментов генов 16S рРНК, 23S рРНК и fliC является алгоритмом ускоренной идентификации В. mallei и В. pseudomallei. Показано, что для повышения специфичности при идентификации патогенных буркхольдерий необходимо использовать секвенирование двух локусов геномной ДНК - фрагмента гена 16S рРНК и участков генов 23S рРНК или fliC.

Показано, что разработанный нами метод выделения ДНК из объектов окружающей среды (почва, вода), контаминированных возбудителями особо опасных микозов (патент №2295569), эффективен для экстракции ДНК патогенных буркхольдерий.

Практическая ценность

Предлагаемые схемы ПЦР-типирования с выбранными наборами произвольных праймеров и мультилокусного сиквенс-типирования используются в лабораториях Волгоградского НИПЧИ для анализа музейных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза и изучения генетически измененных штаммов патогенных буркхольдерий, а также могут быть востребованы для проведения эпидемиологического расследования вспышек сапа и мелиоидоза как при исследовании материала от больных, так и из объектов окружающей среды.

Результаты, полученные в ходе выполнения диссертационной работы, включены в лекционный материал, предназначенный для врачей, биологов и лаборантов учреждений санитарно-эпидемиологического профиля и клинических диагностических лабораторий при проведении первичной специализации и курсов усовершенствования по вопросам специфической индикации и лабораторной диагностики особо опасных заболеваний, проводимых на базе ВолгоградНИПЧИ.

По материалам диссертационной работы составлены методические рекомендации: «Молекулярно-биологические подходы к идентификации и внутривидовому типированию возбудителей сапа и мелиоидоза», утвержденные директором Волгоградского НИПЧИ 06.03.2006 г.

Положения, выносимые на защиту

1. Набор произвольных олигонуклеотидных затравок, обозначенных Jeffreys, PR 6, PR 7 и RA позволяет проводить внутривидовое типиро-вание штаммов возбудителя сапа, а набор праймеров PR 7, PR 16, PR 13, и RA - эффективен для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза.

2. Мультилокусное сиквенс-типирование эффективно для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от штаммов В. mallei, которые объединяются в единый сиквенс-тип, входящий в клональный комплекс штаммов В. pseudomallei.

3. Использование алгоритма eBURST для анализа результатов мультило-кусного сиквенс-типирования позволяет достоверно устанавливать географическую принадлежность штаммов возбудителя мелиоидоза с неизвестным источником выделения.

4. Секвенирование двух локусов ДНК - фрагмента гена 16S рРНК и участков 23SрРНК или fliC позволяет проводить ускоренную идентификацию возбудителей сапа и мелиоидоза, а секвенирование участка гена, кодирующего 16S рРНК патогенных буркхольдерий — дифференцировать В. mallei от В. pseudomallei.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены на итоговых научных конференциях Волгоградского НИПЧИ (Волгоград, 2004, 2005); на V Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004),. XI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2004), VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств участников содружества независимых государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005), Научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2006), Межгосударственной научно- практической конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств»» (Оболенск, 2006), XI Региональной конференции молодых исследователей Волгоградской области (Волгоград, 2006), 65-й юбилейной открытой научно-практической конференции молодых ученых с международным участием «Актуальные проблемы экспериментальной и клинической медицины» (Волгоград, 2007).

По теме диссертации опубликовано 9 научных работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 123 станицах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 208 источников, в том числе 55 отечественных и 153 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 25 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Савченко, Сергей Сергеевич

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что секвенирование участка гена, кодирующего ген 16S рРНК патогенных буркхольдерий, фланкированного праймерами U33/OL731, позволяет идентифицировать возбудителей сапа и мелиоидоза, а также дифференцировать их на основе единичной нук-леотидной замены в позиции 42 анализируемого фрагмента.

2. Выявлено, что сочетание реакции амплификации и секвенирования фрагментов генов 16S рРНК, 23S рРНК и fliC является алгоритмом ускоренной идентификации В. mallei и В. pseudomallei в сравнении с традиционными методами, основанными на анализе фенотипических признаков.

3. Показана высокая эффективность мультилокусного сиквенс-типирования для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от штаммов В. mallei, формирующих единый клональ-ный комплекс, филогенетически связанный со штаммами В. pseudomallei.

4. Использование алгоритма eBURST для анализа результатов MJICT позволило установить, что штаммы коллекционного центра живых культур Волгоградского научно-исследовательского противочумного института B.pseudomallei 100, С-141, а также B.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, относятся к Юго-Азиатской группе.

5. Предложен набор олигонуклеотидных затравок, обозначенных Jeffreys, PR 6, PR 7 и RA для проведения внутривидового типирования штаммов возбудителя сапа и праймеров PR 7, PR 16, PR 13, и RA — для возбудителя мелиоидоза методом RAPD.

6. При сравнительном анализе RAPD-профилей исходных штаммов патогенных буркхольдерий, культивируемых на плотных питательных средах и субкультур, полученных после пассажа на лабораторных животных, не выявлено различий в спектре амплификационных фрагментов, что свидетельствует о стабильности используемых ДНК-маркеров.

7. Установлено, что распределение штаммов патогенных буркхольдерий по кластерным группам, полученным при помощи метода RAPD, не коррелировало с географическим регионом выделения штаммов и характерными фенотипическими свойствами, в том числе вирулентностью.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Использование молекулярно-генетических методов в диагностике и внутривидовом типировании патогенных микроорганизмов открыло новые перспективы в таксономических исследованиях при уточнении их систематического положения, а в молекулярной эпидемиологии - установлении источника заражения и дифференциации природных вспышек бактериальных инфекций от вспышек искусственного происхождения [74, 150, 206].

На данный момент можно выделить три группы наиболее распространенных методов внутривидовой дифференциации штаммов. Первая группа основана на использовании информации о секвенировании генома микроорганизмов, хранящейся в компьютерных базах данных. Вторая группа методов генетического типирования основана на изучении полиморфизма размеров рестрикционных фрагментов бактериальной ДНК. Третью группу составляют методические подходы на основе ПЦР [52].

Несмотря на широкий выбор методов внутривидового типирования микроорганизмов, до сих пор не существует «золотого стандарта» и, как правило, используются различные комбинации генетических методов для каждого вида бактерий [77].

Для патогенных буркхольдерий в последние годы зарубежными и отечественными исследователями предлагались различные схемы дифференциации штаммов. Большая часть исследований была направлена на ге-нотипирование B.pseudomallei [102, 176, 207]. В отношении использования методов дифференциации штаммов В.mallei имеются лишь единичные публикации [120, 152]. Анализ литературных источников позволяет сделать заключение, что до настоящего времени нет единого мнения и регламентирующих документов, определяющих алгоритм внутривидового типирования штаммов патогенных буркхольдерий.

При выборе способов генотипирования возбудителей сапа и мелиоидоза мы исходили из возможности проведения в короткие сроки анализа большого количества штаммов. Метод должен обладать высокой дифференцирующей (разрешающей) силой и воспроизводимостью, а также легким учетом получаемых результатов и интерпретацией данных без привлечения дополнительной экспертизы [52].

Первично для типирования штаммов патогенных буркхольдерий апробирован метод прямого сравнения секвенированных фрагментов генома как наиболее современный и высокоточный метод исследования, позволяющий сопоставлять полученные результаты с базами данных во всемирной сети Internet. В качестве ДНК-мишеней нами были выбраны участки генов 23S рРНК, fliC и 16S рРНК, наиболее широко представленные в различных генетических базах данных. Амплификация этих локусов проводилась с использованием анализированных ранее в нашей лаборатории оли-гонуклеотидных затравок b23-s5/b23-a6 и bfl-ls/bfl-2a [4], а также праймеров U33/OL731, предложенных Т. Dharakul [163] для амплификации участка гена 16S рРНК.

В результате ПЦР с данными праймерами получены специфические фрагменты размерами 717 п.н. (для U33/OL731), 666 п.н. (для b23-s5/b23-аб) и 376 п.н. (bfl-ls/bfl-2a). Анализ секвенированных последовательностей фрагментов подтвердил специфичность ранее сконструированных в нашей лаборатории амплификационных тест-систем для обнаружения патогенных буркхольдерий при исследовании чистых культур, экспериментального клинического материала и проб объектов внешней среды, конта-минированных возбудителями сапа и мелиоидоза [4, 49].

При сравнении секвенированных фрагментов гена 16S рРНК 28 штаммов возбудителя мелиоидоза, представленных в генетических базах данных, выявлено 3 нуклеотидных замены на секвенированном участке в 717 п.н. в позициях 124, 405 и 618. Кластерный анализ полученных нуклеотидных последовательностей при помощи программы TreeCon for Windows с использованием алгоритма Т.Н. Jukes и C.R. Cantor [131], позволил сформировать 3 группы штаммов В. pseudomallei. Все исследуемые нами штаммы возбудителя мелиоидоза оказались в одной кластерной группе. Анализ этих групп показал, что формирование кластеров не было связано ни с источником, ни с географическим регионом выделения штаммов.

На основе гена 16S рРНК анализируемые нами штаммы возбудителя сапа не удалось дифференцировать ни между собой, ни от общей группы штаммов В. mallei, представленных в генетических базах данных. За исключением 2-х штаммов, у которых обнаружено по 1 замене в составе нуклеотидных последовательностей данной ДНК-матрицы, все штаммы возбудителя сапа оказались идентичными и образовывали единую группу.

На основании этих исследований нами сделано заключение, что внутривидовое типирование штаммов В. mallei и В. pseudomallei с использованием секвенирования гена 16S рРНК оказалось малоэффективным ввиду его высокой консервативности. В то же время, выявленная единичная нуклеотидная замена в позиции 42 секвенированной области позволяет дифференцировать данные виды патогенных буркхольдерий.

При анализе секвенированных последовательностей гена 23S рРНК, представленных в генетических базах данных, выявлены нуклеотидные замены в позициях 19-22 п.н. секвенированной области у штаммов возбудителя мелиоидоза К96324 и 668, что позволило сформировать 2 группы штаммов В. pseudomallei. В одну группу вошли 10 анализируемых штаммов возбудителя мелиоидоза и 8 штаммов возбудителя сапа. Вторую группу составили два штамма возбудителя мелиоидоза К96324 и 668. При сравнении секвенированных нами последовательностей фрагментов гена 23S рРНК патогенных буркхольдерий не было обнаружено отличий ни у штаммов В. mallei, ни у штаммов В. pseudomallei, т.е. все штаммы вошли в одну кластерную группу, которая сформирована большинством представленных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза.

При анализе 36 штаммов возбудителя мелиоидоза и 14 штаммов возбудителя сапа в реакции амплификации с праймерами b23-s5/ Ь23-а6 были получены специфические фрагменты ДНК у всех анализируемых штаммов за исключением штамма B.pseudomallei 57576, который не выявлялся даже в диапазоне концентраций 1x106- 1х108 м.к./мл. По этой причине олиго-нуклеотидные затравки b23-s5/ Ь23-а6 не были использованы при конструировании амплификационной тест-системы для обнаружения патогенных буркхольдерий [4], а выбраны праймеры, обозначенные b23-s7/ Ь23-а8, с которыми получен положительный результат ПНР при анализе всех штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза [49].

В то же время, отсутствие специфического ампликона у коллекционного штамма B.pseudomallei 57576 позволяет отнести его ко 2 кластерной группе штаммов возбудителя мелиоидоза, представленной штаммами B.pseudomallei К96324 и 668, поскольку замены в последовательности ДНК гена 23SрРНК расположены в 3' концевой области посадки праймера b23-s5.

При проведении сиквенс-анализа fliC генов также выявлены единичные различия в нуклеотидных последовательностях патогенных буркхольдерий, в результате чего были сформированы 3 кластерные группы. Две группы составили штаммы возбудителя мелиоидоза, в третью группу вошли как штаммы B.pseudomallei, так и штаммы В. mallei. Исследованные нами штаммы патогенных буркхольдерий также вошли в третью кластерную группу.

Результаты проведенных исследований показали, что внутривидовая дифференциация на основе нуклеотидных замен в анализируемых генах обладает низкой разрешающей способностью и является малоэффективной при генотипировании возбудителей сапа и мелиоидоза, что диктует необходимость либо выбора других, более вариабельных ДНК-мишеней, либо секвенирования нескольких локусов генома. В то же время сочетание ПЦР и секвенирования позволяет значительно повысить специфичность идентификации патогенных буркхольдерий. Причем, наибольшая эффективность отмечена при использовании двух ДНК мишеней - 165" рРНК и 23SpPHK либо fliC. Учитывая, что идентификация возбудителей сапа и мелиоидоза на основе биохимических тестов, в том числе полуавтоматических систем типа API 20NE, занимает 2-3 дня, а общее время проведения исследований с помощью молекулярно-биологических методов составляет порядка 9 часов, такой алгоритм, в котором параллельно проводится амплификация двух локусов с последующим их секвенированием, вполне оправдан.

Оценка разрешающей способности мультилокусного сиквенс-типирования, впервые предложенного для дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза D. Godoy с соавторами в 2003 году [152], для анализа штаммов коллекционного центра живых культур ВолгоградНИП-ЧИ была проведена при анализе В. mallei 10230 и V-120, а также В. pseudomallei 100, С -141 и 107. В результате проведенного исследования штаммы возбудителя мелиоидоза удалось дифференцировать друг от друга: штамм B.pseudomallei 107 принадлежал к 51 сиквенс-типу, В. pseudomallei 100 - к 219 сиквенс-типу, а В. pseudomallei С-141 к — 162 сиквенс-типу, в отличие от штаммов В. mallei, которые имели одинаковый 40 сиквенс-тип.

При использовании алгоритма eBURST, предложенного J.E. Feil с соавторами в 2003 году [96] для филогенетического анализа результатов мультилокусного сиквенс-типирования, определены клональные комплексы, позволяющие оценить филогенетические взаимоотношения как исследуемых нами штаммов B.pseudomallei и В.mallei, так и представленных в международной базе данных. В результате работы был подтвержден географический регион выделения штаммов В. pseudomallei 100 и С-141, а также впервые определен ранее неизвестный регион выделения штамма

В. pseudomallei 107. Установлено, что все анализируемые штаммы возбудителя мелиоидоза относятся к Юго-Азиатской группе. Штаммы возбудителя сапа, несмотря на различный источник выделения, формировали единый клональный комплекс, филогенетически связанный со штаммами В. pseudomallei.

Таким образом, метод мультилокусного сиквенс-типирования позволил дифференцировать штаммы возбудителя мелиоидоза, а также провести филогенетический анализ патогенных буркхольдерий. Однако данный метод оказался недостаточно эффективным для внутривидового типирования возбудителя сапа, поскольку все штаммы В. mallei представлены одним сиквенс-типом.

Поэтому для дальнейшего исследования был использован метод амплификации с произвольными праймерами (RAPD), позволяющий оценивать полиморфизм всего генома микроорганизма, отличающийся простотой в исполнении и высокой дифференцирующей способностью. По литературным данным этот метод, однако, имеет существенный недостаток, заключающийся в крайне низкой воспроизводимости, что исключает возможность сопоставления результатов анализа с ранее полученными данными. Так, даже при изменении лишь одного из компонентов реакционной смеси - увеличении концентрации ДНК-матрицы, праймеров или изменении состава буферного раствора, происходили значительные изменения электрофоретической картины продуктов амплификации.

Для получения высокоинформативных и воспроизводимых ДНК-профилей в нашей лаборатории оптимизированы параметры ПЦР - отработаны температурные режимы, определены необходимые концентрации праймеров, исследуемой ДНК, Taq-полимеразы и состав ПЦР-буфера. Это позволило добиться высокой воспроизводимости ПЦР-типирования и проводить сравнение RAPD-паттернов, полученных в различное время.

Для проведения внутривидовой дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий методом RAPD нами первично было проанализировано 15 различных праймеров и их сочетаний. Ранее 10 из них были предложены для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза. Данных о применении метода RAPD для дифференциации штаммов возбудителя сапа в доступной литературе обнаружить не удалось.

При генотипировании штаммов возбудителя сапа наибольшую дифференцирующую способность показали праймеры Jeffreys, PR 6, PR 7 и RA. Для RAPD-анализа возбудителя мелиоидоза, эффективными оказались праймеры RA, PR 13, PR 16 и PR 7.

При анализе продуктов амплификации ДНК, в зависимости от прай-мера и штаммов, было зарегистрировано 7-18 фрагментов ДНК размером от 100 до 1500 п.н., как характерных для всех анализированных штаммов, так и вариабельных, позволяющих группировать штаммы по сходству ДНК-профилей внутри вида. Причем, большее количество вариабельных ампликонов было отмечено у возбудителя мелиоидоза. Штаммы возбудителя сапа характеризовались меньшей гетерогенностью, что выражалось в превалировании консервативных фрагментов.

Праймер PR7 оказался наиболее предпочтительным для внутривидового типирования возбудителя сапа, так как формировал большее количество кластерных групп — 6 (коэффициент генетической дистанции -0,06). На основе результатов ПЦР с использованием праймеров RA и PR6 удалось разделить штаммы возбудителя сапа на 5 групп (коэффициент генетической дистанции - 0,05 и 0,08, соответственно).

При типировании штаммов возбудителя мелиоидоза все использованные праймеры обладали высокой эффективностью дифференцировки. В зависимости от праймеров формировалось различное количество кластерных групп. Сформированные кластерные группы отражали гетерогенность популяции возбудителя мелиоидоза, при которой каждый штамм имел свой характерный RAPD-тип.

Культуры В .thailandensis, которые ранее относили к авирулентным штаммам B.pseudomallei-like, формировали паттерны, сходные между собой, но значительно отличались от паттернов штаммов возбудителя мелиоидоза, в результате чего образовывали отдельную кластерную группу.

При сравнительном анализе RAPD профилей выявлено, что с помощью данного методического подхода можно дифференцировать штаммы патогенных буркхольдерий от культур филогенетически близкого вида В. thailandensis.

Апробированный нами для анализа штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза метод Rep-ПЦР оказался эффективным для дифференциации штаммов B.pseudomallei. С помощью Rep-ПЦР все исследуемые штаммы возбудителя мелиоидоза разделены на 10 кластерных групп (80% сходства). Однако для возбудителя сапа этот праймер оказался не достаточно эффективным. Все штаммы формировали лишь две кластерные группы, причем из 14 штаммов в одну группу вошли 12.

Анализ штаммов, проведенный внутри каждого кластера, показал, что, при использовании разных праймеров формируются независимые группы. Однако чёткой корреляции с географическим регионом выделения штаммов патогенных буркхольдерий, характерными биохимическими свойствами, вирулентностью, чувствительностью к антибиотикам, уровнем спонтанной фагопродукции и распределением штаммов по группам отмечено не было.

Стабильность RAPD-профилей патогенных буркхольдерий изучена при пассаже культур на лабораторных животных в условиях моделирования сапного и мелиоидозного инфекционного процесса. При сравнительном анализе исследуемых культур патогенных буркхольдерий методом

RAPD, были достоверно идентифицированы выделенные от павших животных штаммы, с помощью которых производили заражение.

Этот методический прием использован и при дифференциации му-тантных штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза от их производных, что свидетельствовало о возможности выявления генетических перестроек, обусловленных направленными или спонтанными мутациями.

Амплификация с произвольными праймерами (RAPD) несомненно является наиболее простым способом дифференциации штаммов, однако данный метод требует не только строгой стандартизации подготовки культур, но и условий проведения ПЦР. Этот методический прием может быть рекомендован для проведения эпидемиологического расследования вспышек сапа и мелиоидоза, анализа культур патогенных буркхольдерий, выделенных как при обследовании больных, так и из объектов окружающей среды.

Таким образом, из всех анализированных методов генотипирования для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза могут быть использованы методы мультилокусного сиквенс-типирования и амплификации с произвольными праймерами в то время как для внутривидового разграничен штаммов возбудителя сапа может быть применен метод ПЦР-типирования.

Секвенирование является референтным методом идентификации возбудителей, однако на сегодняшний день его применение сдерживается достаточно высокой стоимостью исследований. Учитывая, что окончательная идентификация культур патогенных буркхольдерий проводится в специализированных учреждениях, обладающих современным диагностическим оборудованием, сочетание генетических методов типирования, включая секвенирование, вполне оправдано.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Савченко, Сергей Сергеевич, 2008 год

1. Адамов А.К., Карпузиди К.С., Акулова Н.Ф. Антигенное строение возбудителей сапа и мелиоидоза // Генетика, биохимия и иммунохимия особо опасн. инф. Ростов н/Д. - 1967. - С.335-339.

2. Адимов Л.Б., Ширяев Д.Т. Мелиоидоз // Диагностика особо опасных и малоизвестных бактериальных инфекций. — Ростов на - Дону: Изд-во Ростовского ун-та, 1970. - С.225-236.

3. Аклан Набилы Шаеф Мохаммед Распространенность и биологические свойства клебсиелл в условиях техногенной нагрузки крупного промышленного города: Автореф. дис. канд. биол. наук. Волгоград, 2006. -23 с.

4. Алтухова В.В. Использование полимеразной цепной реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза при экспериментальной инфекции: Автореф. дис. канд. мед. наук. Волгоград, 2005. - 25 с.

5. Анализ плазмидного состава штаммов Yersinia pseudotuberculosis и его применение для типирования возбудителя псевдотуберкулеза / Шубин Ф.Н., Гинзбург А.Л., Китаев В.М. и др. // Мол. генет., микробиол. ви-русол.- 1989.-N6.- С.20-25.

6. Антонов В.А. Первичная характеристика плазмид возбудителя мелиоидоза // Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1995. - 22 с.

7. Антонов В.А., Илюхин В.И. Молекулярно-биологические подходы к диагностике и внутривидовому типированию возбудителей сапа и мелиоидоза//Мол. генет. микробиол. вирусол.- 2005.-N2.- С.3-9.

8. Аэрогенные инфекции в аспекте проблемы биотерроризма / Алексеев В.В., Тихонов Н.Г, Липницкий А.В. и др. // Проблемы особо опасных инфекций. 2003. - Вып.85. - С.20-27.

9. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы // М.: Медицина. 1990. -224с.

10. Ю.Блохина И.Н., Леванова Г.Ф. Геносистематика бактерий и ее природное значение // Успехи микробиологии. М.: Наука, 1990. - Т.24. — С.3-25.

11. П.Будченко А.А. Сравнительный электрофоретический анализ белков патогенных псевдомонад И Автореф. дис. канд.биол.наук. Саратов, 1995.-24с.

12. Васкоренко З.П., Фролов А.Ф., Смирнов В.В., Рубан Н.М. Жирно-кислотные профили бактерий, патогенных для человека и животных // Киев. — Наукова думка. 1992. - С.264.

13. Выделение и первичная характеристика плазмид Pseudomonas (Burkholderia) pseudomallei / Замараев B.C., Антонов В.А., Илюхин

14. B.И., Захарова И.Б.// Мол. генет., микробиол. вирусол. 1998. —№4.1. C.28-33.

15. Выявление и характеристика плазмид чумного микроба, детерминирующих синтез пестицина I, антигена фракции I и экзотоксина "мышиного" токсина / Проценко О.А., Анисимов П.И., Можаров О.Т. и. др. // Генетика. 1983.- Т. 19,N7. - С.1081-1090.

16. Горшков О.В. Геномный полиморфизм коллекционных штаммов Yersiniapestis: Автореф. дис. канд. биол. наук. Саратов, 2000. — 25 с.

17. Гришкина Т.А., Меринова JI.K. Изучение спонтанной фагопродукции Pseudomonas pseudomallei и круга хозяев мелиоидозных фагов средипредставителей рода Pseudomonas // Микробиол. журн. 1993.- Т.55, №4. - С.43-47.

18. Илюхин В.И. Антигенная структура и серология псевдомонад. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1986. -N 5. - С.88-93.

19. Илюхин В.И. Фагоцитабельность Ps. pseudomallei II Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. — 1978. №2. - С.130-132.

20. Илюхин В.И., Поповцева Л.Д., Пивень Н.Н. Идентификация Pseudomonas pseudomallei II Лаб. дело. — 1983. №7. - С.61-62.

21. Манзенюк О.Ю., Воложанцев Н.В., Светоч Э.А. Идентификация бактерий Pseudomonas mallei с помощью бактериофагов Pseudomonas pseudomallei II Журн. микробиол. 1994. -№3. - С.537-544.

22. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии // Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - 480с.

23. МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенно-сти». — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2003. 39с.

24. Мультилокусный VNTR-анализ в изучении популяционной структуры Yersinia pestis в природных очагах / Сучков И. Ю., Водопьянов А. С., Водопьянов С. О., и др. // Мол. генет., микробиол. вирусол. — 2004. — №4.-С. 19-28.

25. Перспективы применения генотипирования Bacillus anthracis в эпидемиологическом анализе / Цыганкова О. И., Еременко Е. И., Рязанова А. Г., Цыганкова Е. А. // Эпидемиология и инфекционные болезни. 2006. — №1. - С.24-28.

26. Петере М.К. Молекулярная биология и генетика возбудителей особо опасных инфекций // Научно-тематический сборник. Саратов, 1982. -4.1 - С.53-54.

27. Пивень Н.Н. Антигенная структура возбудителя мелиоидоза // Мелио-идоз Под ред. Н.Г. Тихонова. - Волгоград. - 1995. - С.47-57.

28. Поповцева Л.Д., Фарбер С.М., Луценко Л.В. К вопросу о значении экс-трацеллюлярных ферментов в дифференциальной диагностике псевдо-монадных инфекций // Профилактика природноочаг. инфекций. Ставрополь. -1983. - С.38-40.

29. Порин А.А., Бойцов А.Г. Бета-лактамазы кампилобактеров и их использование в качестве эпидемиологических маркеров // Антибиотики и химиотерапия. 1994. - №9-10. - Т.39. - С.36-39.

30. Разработка технологии ПЦР для индикации возбудителей бруцеллеза и сибирской язвы / Фаизов Т.Х., Алимов A.M., Гришкевич Н.М., Равилов А.З. // Второй съезд Биохим. о-ва РАН: Тез. стендовых сообщ. -Пущино, 1997. 4.2. - С.540-541.

31. Роль поверхностных антигенов Pseudomonas pseudomallei в патогенезе мелиоидоза / Пивень Н.Н., Смирнова В.И., Каплиев В.И. и др. // Журн. мик-робиол., эпидемиол., иммунобиол. -1991.—N10. С.8-12.

32. Рубан E.JI. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas //М.: Наука, 1986.-200 с.

33. Рысков А.П. Мультилокусный ДНК-фингерпринтинг в генетико-популяционных исследованиях биоразнообразия // Молекуляр. биология. 1999. - Т. 33, № 6. - С. 880-892.

34. Ряпис Л.А., Ширяев Д.Т., Акулова М.Ф. О диссоциации возбудителя мелиоидоза // Пробл. особо опасных инф. 1970. - Вып.6(16). - С. 183187.

35. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.1285-03. Безопасность работы с микроорганизмами I II групп патогенности (опасности) // Госсанэпиднадзор России. - М., 2003. - 103с.

36. Санитарные правила: 1.2. Эпидемиология. СП 1.2. 001 94. Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности // Госсанэпиднадзор России. — М., 1994. - 152с.

37. Саркисова Н.В. Характеристика штаммов сибиреязвенного микроба, выделенных на территории СНГ: Автореф. дис. канд. мед. наук. Волгоград, 2003. - 25 с.

38. Семистрочев В.А. 4 группы вида Vibrio Cholerae, имеющие различную эпидемиологическую значимость // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1990. - №4. - С.54-58.

39. Сенина Т.В. Биологические свойства и дифференциальная диагностика буркхольдерий, имеющих значение в медицинской практике: Автореф. дис. канд.биол.наук. Волгоград,2004. - 22 с.

40. Слизистые варианты мелиоидозного микроба / Орлова Т.М., Кудрякова Т.А., Ряпис JI.A. Черкасова JT.P. // Вопросы теоретической и прикладной микробиологии. — Ростов-н/Д. 1973. - С. 104-106.

41. Смирнов В.В., Киприанова Е.А. Бактерии рода Pseudomonas II Киев: Наукова думка, 1990. 262 с.

42. Сравнительная характеристика ультраструктуры возбудителей сапа и мелиоидоза / Ряпис JI.A., Фарбер С.М., Голубинский Е.П., Токарев С.А. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1975. - №5 - С.41-43.

43. Тапальский Д.В., Осипов В.А., Жаворонок С.В. Фенотипическое и мо-лекулярно-генетическое типирование сальмонелл: реалии и перспективы // Журнал микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 2005. — №6. — С.88-93.

44. Ткаченко Г.А. Конструирование амплификационной тест- системы для выявления патогенных буркхольдерий: Автореф. дис. канд. мед. наук. -Волгоград, 2003. 24 с.

45. Шагинян И.А. Роль и место молекулярно-генетических методов в эпидемиологическом анализе внутрибольничных инфекций // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. — 2000. Том 2, №3. — С.82-95.

46. Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. ПЦР-генетическое типирование возбудителей бактериальных инфекций // Генетика. 1995. - №31. - Р.600-610.

47. Шагинян И.А., Гинцбург А.Л. Геномный полиморфизм возбудителей бактериальных инфекций // Мол. генет., микробиол., вирусол. —, 1991. — №12. — С. 1-9.

48. Ширяев Д.Т., Ряпис JT.A., Кочеткова А.П. Методы обнаружения возбудителя мелиоидоза в объектах внешней среды и другом материале // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1976. — №4 - С.91-95.

49. A test for concordance between the multilocus genealogies of genes and mi-crosatellites in the pathogenic fungus Coccidioides immitis / Fisher M.C, Koenig G., White T.J., Taylor J.W. // Mol. Biol. Evol. 2000. - Vol.17, №8.-P. 1164-1174.

50. Antibiotic susceptibility of Burkholderia pseudomallei from tropical northern Australia and implications for therapy of melioidosis / Jenney A.W., Lum G., Fisher D.A., Currie B.J. // Int. J. Antimicrob. Agents. 2001. -Vol.17, №2.-P.l09-113.

51. Arbeit R.D. Laboratory procedures for the epidemiologic analysis of micro-oranisms // Manual Clin. Microbiol. ASM Press. 1996. - P. 190-208.

52. Arbeit R.D., Maslow J.N., Mulligan M.E. Polymerase chain reaction-mediated genotyping in microbial epidemiology // Clin. Infect. Dis. 1994. -Vol.18.-P.1018-1019.

53. Bacterial genome adaptation to niches: Divergence of the potential virulence genes in three Burkholderia species of different survival strategies / Kim H.S., Schell M.A., Yu Y. et al. // BMC Genomic. 2005. - Vol.6. - P. 174.

54. Barnini S., Dodi С., Campa, M. Enhanced resolution of random amplified polymorphic DNA genotyping of Pseudomonas aeruginosa II Lett. Appl. Microbiol. 2004. - Vol.39, №3. - P. 274-277.

55. Bennett D.E., Cafferkey M.T. Multilocus restriction typing: a tool for Neisseria meningitidis strain discrimination // J. Med. Microbiol. 2003. -Vol.52, №9.-P.781-787.

56. Caetano-Anolles G., Bassam B.J., Gresshoff P.M. DNA amplification fingerprinting using very short arbitrary oligonucleotide primers // Bio/Technol. 1991. - Vol.9. - P.553-557.

57. Chambon L. Serological analysis of the somatic antigen of Malleomyces pseudomallei II Ann Inst. Pasteur. Paris. - 1960. - Vol.98. - P.405-415.

58. Characterisation and molecular typing of Burkholderia pseudomallei: are disease presentations of melioidosis clonally related? / Norton R., Roberts В., Freeman M. et al. // FEMS Immunol. Med. Microbiol.- 1998.- Vol.20.-P.37—44.

59. Characterization of a repetitive element polymorphism-polymerase chain reaction chromosomal marker that discriminates Bacillus anthracis from related species / Cherif A., Borin S., Rizzi A., et al. // J. Appl. Microbiol. -2002. Vol.93, №3. - 456^162.

60. Characterization of Burkholderiapseudomallei isolated in Thailand and Malaysia / Radua S., Ling O.W., Srimontree S. et al. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2000. - Vol.38, №3. -P.141-145.

61. Clonal lines of Salmonella enterica serotype Enteritidis documented by IS200-, ribo-, pulsed-field gel electrophoresis and RFLP typing / Olsen J.E., Skov M.N., Threlfall E.J., Brown D.J. // J. Med. Microbiol. 1994. -Vol.40, №1.-P. 15-22.

62. Comparative genomics tools applied to bioterrorism defence / Slezak Т., Kuczmarski Т., Ott L., et al. // Brief. Bioinform. 2003. - Vol.4, №2. - P. 133-149.

63. Comparative typing of Pseudomonas species isolated from the aquatic environment in Greece by SDS-PAGE and RAPD analysis / Sazakli E., Leotsinidis M., Vantarakis A., Papapetropoulou M. // J. Appl. Microbiol. -2005.-Vol.9, №5.-P. 1191-1203.

64. Comparison of Pseudomonas pseudomallei from humans, animals, soil and water by restriction endonuclease analysis / Yap E.H., Thong T.W., Tan A.L. et al. // Singapore Med. J. 1995. - Vol36, №1. -P.60-62.

65. Comparison of rapid, automated ribotyping and DNA macrorestriction analysis of Burkholderia pseudomallei / Inglis T.J., O'Reilly L., Foster N. et al. // J. Clin. Microbiol. 2002. - Vol.40, №9. - P.3198-3203.

66. Comparison of SSCP analysis for mutation detection in the human iduroro-nate 2-sulfatase gene / Maddox L.O., Li P., Bennett A., et al. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1997. - Vol.43. - 1163-1171.

67. Computer identification of Shigella species by rRNA gene restriction patterns / Coimbra R. S., Nicastro G., Grimont P. A., Grimont F. // Res. Microbiol. 2001. - Vol.152, №1. - p. 47-55.

68. Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism / Botstein D., White R.L., Skolnick M., Davis R.W. // Am. J. Hum. Genet. 1980. - Vol.32. - P.314-331

69. Cravitz L., Miller W.R. Immunologic studies with Malleomyces mallei and Malleomyces pseudomallei. I. Serological relationships between M. mallei and M. pseudomallei. И J. Infect. Dis. 1950. - Vol.86. - P.46-51.

70. Currie B. Melioidosis in Papua New Guinea: is it less common than in tropical Australia? // Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1993. - Vol.87, №4. - P. 417.

71. Dance D.A. Melioidosis as an emerging global problem // Acta Trop. -2000.-Vol.74.-P.l 15-119.

72. Dance D.A.B. Ecology of Burkholderia pseudomallei and the interactions between environmental Burkholderia spp. and human-animal hosts // Acta tropica. 2000. - Vol.74 - P.l59-168.

73. DeShazer D. Genomic diversity of Burkholderia pseudomallei clinical isolates: subtractive hybridization reveals a Burkholderia mallei-specific prophage in B. pseudomallei 1026b // J. Bacteriol. 2004. - Vol.186, №12. -P.3938-3950.

74. Determination of hepatitis С virus genotype in the United States by cleavase fragment length polymorphism analysis / Marshall D.J., Heisler L.M., Ly-amishev V., et al. // J. Clin. Microbiol. 1997. - Vol.35. - P.3156-3162.

75. Differentiation between types and strains of Clostridium botulinum by ribo-printing / Skinner G.E., Gendel S.M., Fingerhut G.A., et al. // J. Food. Prot. 2000. -Vol.63, №10. -P.1347-1352.

76. DNA fingerprinting of pathogenic bacteria by fluorophore-enhanced Repetitive sequence-based polymerase chain reaction / Versalovic J., Kapur V., Koeuth Т., et al. // Arch. Pathol. Lab. Med. 1995. - Vol.119. - P.23-29.

77. Dodin A., Fournier J. Precipitating and agglutinating antigens of Pseudomonas pseudomallei (Whitmore's В.). I. Thermostable and thermolabile complexes. Serological typing // Ann Inst. Pasteur. Paris. - 1970. - Vol.2. -P.211-221.

78. Epidemiological investigation of Pseudomonas aeruginosa nosocomial bac-teraemia isolates by PCR-based DNA fingerprinting analysis / Liu Y., Davin-Regli A., Bosi C. et al. // J. Med. Microbiol. 1996. - Vol.45, №5. -P.359-365.

79. Equine glanders in Turkey / Arun S., Neubauer H., Gurel A. et al. // Vet. Rec. 1999. - Vol. 144. - P.255-258.

80. Evolution of antimicrobial resistance and nosocomial infection. Lessons from the Vanderbilt experience / Schaberg D.R., Rubens C.E., Alford R.H. et al. // Am. J. Med. 1981. - Vol.70, №2. - P.445-448.

81. Fisher M.C., White T.J., Taylor J.W. Primers for genotyping single nucleotide polymorphisms and microsatellites in the pathogenic fungus Coc-cidioides immitis II Mol. Ecol. 1999. - Vol.8, №6. - P.l082-1084.

82. Fournier J., Bussy G. Thermostable antigens of Pseudomonas pseudomallei and of Malleomyces mallei and their characteristics in common // Ann. Inst. Pasteur. (Paris). 1967. - Vol.l 12, №1. -P.93-104.

83. Fournier J., Chambon L. La melioidose, maladie d'actualite et le bacilli de Whitmore //Paris: Ed. Med. Flammarion, 1958. -P.47-90.

84. Francisella tularensis strain typing using multiple-locus, variable-number tandem repeat analysis / Farlow, J., Smith K.L., Wong J. et al. // J. Clin. Microbiol. 2001. - Vol.39, №9. - P.3186-3192.

85. Further evidence that genotypically closely related strains of Legionella pneumophila can express different serogroup specific antigens / Harrison ~ T.G., Saunders N.A. Haththotuwa, A. et al. // J. Med. Microbiol. 1992. -Vol.37, №3.-P.155-161.

86. Genetic and physical characterization of IncM plasmid pBWHl and its variance among natural isolates / Hopkins J.D., Mayer K.H., Gilleece E.S. et al. // J. Bacteriol. 1986. - January; 165 (1) - P. 47-52.

87. Genetic relationships between clinical and environmental Vibrio cholerae isolates based on multilocus enzyme electrophoresis / Farfan M., Minana D., Fuste M.C., Loren J.G. // Microbiology. 2000. - Vol.146, №10. - P.2613-2626.

88. Genetic variability among Chlamydia trachomatis reference and clinical strains analyzed by pulsed-field gel electrophoresis / Rodriguez P., Allardet-Servent A., de Barbeyrac B. et al. // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol.32, №12.-P.2921-2928.

89. Genome fingerprinting by pulsed-field gel electrophoresis of isolates of Burkholderia pseudomallei from patients with melioidosis in Thailand / Koonpaew S., Ubol M.N., Sirisinha S. et al. // Acta Tropica. 2000. -Vol.74.-P. 187-191.

90. Genome sequence alterations detected upon passage of Burkholderia mallei ATCC 23344 in culture and in mammalian hosts / Romero C.M., DeShazer D., Feldblyum Т., et al. // BMC Genomics. 2006. - Vol.7. -P.228.

91. Genome-wide comparison reveals great inter- and intraspecies variability in B. pseudomallei and B. mallei pathogens / Monastyrskaya G.A., Fushan A., Abaev I. et al. // Res. Microbiol. 2004. - Vol.155, №9. - P.781-793.

92. Genome-wide identification and mapping of variable sequences in the genomes of B. mallei and B. pseudomallei / Fushan A., Monastyrskaya G.A., Abaev I. et al. // Res. Microbiol. 2004. - Vol.156, №2. - P.278-288.

93. Genomic plasticity of the causative agent of melioidosis, Burkholderia pseudomallei / Holden M.T., Titball R.W., Peacock S.J. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2004. - Vol.101, №39. - P. 14240-14245.

94. Glanders in a military research microbiologist / Srinivasan A., Kraus C.N., DeShazer, D. et al. // N. Engl. J. Med. 2001. - Vol.345, №4. -P.256-568.

95. Harvey S.P., Minter J.M. Ribotyping of Burkholderia mallei isolates // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 2005. - Vol.44, №1. - P.91-97.

96. Howe C., Sampath A., Spotnitz M. The pseudomallei group: a review // J.Infect. Dis. 1971. - Vol.124. -P.598-606.

97. Hulton C.S., Higgins C.F., Sharp P.M. ERIC sequences: a novel family of Repetitive elements in the genomes of Escherichia coli, Salmonella typhi-murium and other enterobacteria // Mol. Microbiol. 1991. - Vol.5. -P.825-834.

98. Imported melioidosis in England and Wales / Dance D.A., Smith M.D., Aucken H.M. et al. // Lancet 1999. - Vol. 353. - P. 208.

99. Integrative genomic, transcriptional, and proteomic diversity in natural isolates of the human pathogen Burkholderia pseudomallei / Ou K., Ong C., Koh S.Y. et al. //J. Bacterid. -2005. Vol.177, №12. -P.4276-4285.

100. Interpreting chromosomal DNA restriction patterns produced by pulsed-field gel electrophoresis: criteria for bacterial strain typing / Tenover F.C., Arbeit R.D., Goering R.V., et al. // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33. -P.2233-2239.

101. Isolation and characterization of the outer membrane proteins of Burkholderia (Pseudomonas) pseudomallei / Gotoh N., White N. J., Chaowagul W. et al. // Microbiology. 1994. - Vol.140. - P.797-805.

102. Jeffreys A.J., Wilson V., Thein S.L. Hypervariable 'minisatellite' regions in human DNA. // Nature. 1985. - Vol.314, №6006. - P. 67-73.

103. John J.F. Jr, Twitty J.A. / Plasmids as epidemiologic markers in nosocomial gram-negative bacilli: experience at a university and review of the literature // Rev. Infect. Dis. 1986. - Vol.8, №5. - 693-704.

104. Jukes, Т.Н., Cantor, C.R. Evolution of protein molecules // In: Munro H.H. (ed.), Mammalian protein metabolism. Academic Press, New York. -1969. P.21-132.

105. Kanai К., Deysirilert L. Pseudomonas pseudomallei and melioidosis with special reference to the status in Thailand. // Jpn. J. Med.Biol. — 1988. — Vol.41.-P.123-157.

106. Kanai K., Kondo E. Recent advances in biomedical sciences of Burkholderia pseudomallei (basonym: Pseudomonas pseudomallei) // Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1994. - Vol.47. - P.M5.

107. Khoodoo M.H., Issack M.I., Jaufeerally-Fakim Y. Serotyping and RAPD profiles of Salmonella enterica isolates from Mauritius // Lett. Appl. Microbiol. 2002. - Vol.35, №2. - P. 146-152.

108. Koeuth Т., Versalovic J., Lupski J.R. Differential subsequence conservation of interspersed Repetitive Streptococcus pneumoniae BOX elements in diverse bacteria// Genome. Res. 1995. - Vol.5. -P.408-418.

109. Layne S.P., Beugelsdijk T.J. High-throughput laboratories for Homeland and National Security // Biosecurity and bioterrorism. 2003. - Vol.1, №2. -P.123-130.

110. Leelarasamee A., Bovornkitti S. Melioidosis: review and update // Rew. Infect. Dis. 1989. - Vol.11. - P.413-425.

111. Lew A.E., Desmarchelier P.M. Molecular typing of Pseudomonas pseudomallei: restriction fragment length polymorphisms of rRNA genes // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol.31. -P.533-539.

112. Li L., He Y.W. Pseudomonas pseudomallei and melioidosis in China // Chin. Med. J. 1992. - Vol.105, №9. -P.775-779.

113. Li W.H. Simple method for constructing phylogenetic trees from distance matrices // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1981. - Vol.78. -P.1085-1090.

114. Lomholt J.A., Poulsen K., Kilian M. Epidemic population structure of Pseudomonas aeruginosa: evidence for a clone that is pathogenic to the eye and that has a distinct combination of virulence factors // Infect. Immun.-2001. Vol.69, №10. -P.6284-6295.

115. Lowe C.A., Diggle M.A., Clarke S.C. A single nucleotide polymorphism identification assay for the genotypic characterisation of Neisseria meningitidis using MALDI-TOF mass spectrometry // Br. J. Biomed. Sci. 2004. -Vol.61, №1.-P.8-10.

116. Marmur J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from microorganisms// J.Mol.Biol.- 1961. Vol.3. -P.208-218.

117. Mayer H. Pseudomonas mallei and Pseudomonas pseudomallei II In: Handb. bakt. Infekt. Tieran, Jena. - 1981. - Vol.3. - P.l 11-153.

118. Mayer L.W. / Use of plasmid profiles in epidemiologic surveillance of disease outbreaks and in tracing the transmission of antibiotic resistance // Clin. Microbiol. Rev. 1988. - April; Vol.1, №2. - P.228-243.

119. Melioidosis: an emerging infection in Taiwan? / Hsueh P.R., Teng L.J., Lee L.N. et al. // Emerg. Infect. Dis. 2001. - Vol.7, №3. - P.428-33.

120. Molecular approaches to identify and differentiate Bacillus anthracis from phenotypically similar Bacillus species isolates / Marston C.K., Gee J.E., Popovic Т., Hoffmaster A.R. // BMC Microbiol. 2006. - Vol.6. -P.22.

121. Molecular epidemiology of recent United Kingdom isolates of Neisseria meningitidis serogroup С / Yakubu D.E., Abadi F.J., Pennington Т.Н. // Epidemiol. Infect. 1994. - Vol.113, №1. -P.53-65.

122. Molecular evolution, species distribution, and clinical consequences of an endemic aminoglycoside resistance plasmid / Mayer K.H., Hopkins J.D., Gilleece E.S. et al. // Antimicrob. Agents. Chemother. 1986. - April; 29, №4. — P.628-633.

123. Molecular genotyping of methicillin-resistant Stahylococcus aureus via fluorophore-enhanced Repetitive-sequence PCR / DelVecchio V.G., Petro-ziello J.M., Gress M.J., et al. // J. Clin. Microbiol. 1995. - Vol.33. -P.2141-2144.

124. Multilocus sequence typing of Klebsiella pneumoniae nosocomial isolates / Diancourt L., Passet V., Verhoef J. et al. // J. Clin. Microbiol. 2005. -Vol.43, №8.-P.4178-4182.

125. Multilocus sequence typing scheme for bacteria of the Bacillus cereus group / Helgason E., Tourasse N.J., Meisal R., et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2004. - Vol.70, №1. - P. 191-201.

126. Multilocus sequence typing: a portable approach to the identification of clones within populations of pathogenic microorganisms / Maiden M.C., Bygraves J.A., Feil E., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - Vol. 95, №6. -P.3140-3145.

127. Multiple-locus variable-number tandem repeat analysis reveals genetic relationships within Bacillus anthracis / Keim P., Price L.B., Klevytska A.M., et al. // J. Bacteriol. 2000. - Vol.182, №10. -P.2928-2936.

128. Olive D.M., Bean P. Principles and application of methods for DNA-based typing of microbial organisms // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol.37. — P.1661-1669.

129. Optimization of randomly amplified polymorphic DNA-polymerase chain reaction for molecular typing of Salmonella enterica serovar Typhi / Quin-taes B.R., Leal N.C., Reis E.M., Hofer E. // Rev. Soc. Bras. Med. Trop. -2004. Vol.37, №2. - P. 143-147.

130. Outbreak of joint and soft-tissue infections associated with injections from a multiple-dose medication vial / Kirschke D.L., Jones T.F., Stratton C.W., et al. // Clin. Infect. Dis. 2003. - Vol.36, №11. -P.1369-1373.

131. Palleroni N.J. Bergey's Manual of systematic bacteriology // Ed. Krieg N.R., Holt J.G. Baltimore. - 1984. - Vol.1 - P. 141-199.

132. Pitt T.L., Trakulsomboon S., Dance D.A. Molecular phytogeny of Burkholderia pseudomallei II Acta. Trop. 2000. Vol.74, №2 - P.181-185.

133. Plague pandemics investigated by ribotyping of Yersinia pestis strains / Guiyoule A., Grimont F., Iteman I. et al. // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32, №3. -P.634-641.

134. Preliminary development of a diagnostic test for Brucella using polymerase chain reaction/ Fekete A., Bantle J.A., Hailing S.M., Sanborn M.R. // J. Appl. Bacterid. 1990. - Vol.69, №2. - P.216-227.

135. Premier cas de melioidose pulmonaire humaine en Iran / Pourtaghva M.A., Dodin A., Portovi M. et al. // Bull. Soc. Pathol. Exot. Filiales1977. Vol.70, №2. - P. 107-109.

136. Pulsed-field gel electrophoresis as a discriminatory typing technique for the biothreat agent Burkholderia mallei / ChantratitaN., Vesaratchavest M., Wuthiekanun V. et al. // Am. J. Trop. Med. Hyg. Vol.74, №3. 2006. -P.345-347.

137. Pulsed-field gel electrophoresis as an epidemiological tool for clonal identification of Aeromonas hydrophila / Talon D., Dupont M.J., Lesne J. et al. // J. Appl. Bacteriol. 1996. - Vol.80, №3. - P.277-282.

138. RAPD analysis of isolates of Burkholderia pseudomallei from patients with recurrent melioidosis / Haase A., Melder A., Smith-Vaughan H. et al. // Epidemiol. Infect. 1995. Vol. 115, № 1. - P. 115-121.

139. Re-evaluating prokaryotic species / Gevers D., Cohan F.M., Lawrence J.G. et. al. //Nat. Rev. Microbiol. 2005. - Vol.3, № 9. - P.733-739.

140. Regional dissemination of Salmonella enterica serovar Enteritidis is season dependent / Biendo M., Laurans G., Thomas D. et al. // Clin. Microbiol. Infect. 2003. - Vol.9, №5. - P.360-369.

141. Repetitive element sequence based polymerase chain reaction for typing of Brucella strains / Tcherneva E., Rijpens N., Naydensky C., Herman L. // Vet. Microbiol. 1996. - Vol.51, №1. - P. 169-178.

142. Restriction endonuclease analysis of chromosomal DNA from Listeria monocytogenes strains / Casolari C., Facinelli В., Fabio U. et al. // Eur. J. Epidemiol. 1990. - Vol.6, №3. - P.319-322.

143. Ribotype analysis of Pseudomonas pseudomallei isolates / Sexton M.M., Goebel L.A., Godfrey A.J. et al. // J. Clin. Microbiol. 1993. - Vol. 31.-P.23 8-243.

144. Ribotype differences between clinical and environmental isolates of Burkholderia pseudomallei / Trakulsomboon S., Dance D.A., Smith M.D. et al. // J. Med. Microbiol. 1997. - Vol.46, №7. - P.565-570.

145. Ribotyping of Burkholderia pseudomallei from clinical and soil isolates in Thailand / Sermswan R.W., Wongratanacheewin S., Trakulsomboon S., Thamlikitkul V. // Acta Trop. 2001. - Vol.80, №3. - P.237-244.

146. Rotz L.D., Khan A.S., Lillibridge S.R. et al. Public health assessment of potential biological terrorism agents // Emerg. Infect. Dis. 2002. — Vol.8, №2. -P.225-230.

147. Sanger F., Coulson A.R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase // J. Mol. Biol. 1975. -Vol.94, №3. -P.441-448.

148. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. - Vol.74, №12. - P.5463-5467.

149. Schwartz D.C., Cantor C.R. Separation of yeast chromosome-sized DNAs by pulsed field gradient gel electrophoresis // Cell. 1984. - Vol.37. - P.67-75.

150. Seman M., Torres M.J., Palomares J.C. Subspecific classification of 11 clinical strains of Klebsiella pneumoniae based on their biochemical, antibiotic and plasmid profiles // Epidemiol. Mikrobiol. Imunol. 1997. - Vol.46, №1.-P. 18-22.

151. Sneath P.H., Sokal R.R. Numerical taxonomy: Principles and practice of numerical classification // San Francisco: Freeman. 1973. - 573 P.

152. Songsivilai S., Dharakul T. Multiple replicons constitute the 6.5-megabase genome of Burkholderia pseudomallei II Acta Trop. — 2000. -Vol.74, №2.-P. 169-179.

153. Southern E.M. Detection of specific sequences among DNA fragments separeted by gel electrophoresis // J. Mol. Biol. 1975. - Vol.98. - P.503-517.

154. Spratt B.G. Exploring the concept of clonality in bacteria // Methods Mol. Biol. 2004. - Vol.266. - P.323-352.

155. Spratt B.G. Multilocus sequence typing: molecular typing of bacterial pathogens in an era of rapid DNA sequencing and the internet // Curr. Opin. Microbiol. 1999. - Vol.2, №3. - P.312-316.

156. Srinivasan A. Epidemiology and Prevention of Infections Related to Endoscopy // Curr. Infect. Dis. Rep. 2003. - Vol.5, №6. - P.467-472.

157. Stability of strain genotypes of Burkholderia pseudomallei from patients with single and recurrent episodes of melioidosis / Vadivelu J., Puthucheary S.D., Drasar B.S. et al. // Trop. Med. Int. Health. 1998. - 3(7) - P.518-521.

158. Stanton A.T., Fletcher W. Melioidosis and its relation to glanders // J. Hyg. 1925. - Vol.23. - P.347-363.

159. Streptococcus pyogenes collected in Torino (northwest Italy) between 1983 and 1998: survey of macrolide resistance and trend of genotype by RAPD / Avanzini C., Bosio K., Volpe G. et al. // Microb. Drug. Resist. -2000. Vol.6, №4. - P.289-295.

160. Structural flexibility in the Burkholderia mallei genome / Nierman W.C., DeShazer D., Kim H.S. et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004. -Vol.101, №39.-P.14246-14251.

161. Suitability of partial 16S ribosomal RNA gene sequence analysis for the identification of dangerous bacterial pathogens / Ruppitsch W., Stoger A., Indra A. et al. // J. Appl. Microbiol. 2007. - Vol.102, №3. - P.852-859.

162. Tanphaichitra D. Tropical disease in the immunocompromised host: melioidosis and pythiosis // Rev. Infect. Dis. — 1989. Vol.7. - P. 16291643.

163. Threlfall E.J., Frost J.A. The identification, typing and fingerprinting of Salmonella: laboratory aspects and epidemiological applications // J. Appl. Bacteriol. 1990. - Vol.68, №1. - P.5-16.

164. Typing of Pseudomonas aeruginosa strains in Turkish cystic fibrosis patients / Yagci A., Ciragil P., Over U. et al. // New Microbiol. 2003. -Vol.26, №1.-P. 109-114.

165. Urwin R., Maiden M.C. Multilocus sequence typing: a tool for global epidemiology // Trends Microbiol. 2003. - Vol.11. - P. 479-487.

166. Use of 16S rRNA gene sequencing for rapid identification and differentiation of Burkholderia pseudomallei and B. mallei / Gee J.E., Sacchi C.T., Glass M.B. et al. // J. Clin. Microbiol. 2003. - Vol.41, №10. - P.4647-4654.

167. Vieu I.F. Marcodores bacteria unas J. epidemiologiae de las infectous di-gestivas por enterobacterias // Laboratorio. 1983. - Vol.75, - №449. -P.655-663.

168. Wetmore P.W., Gochenour W.S. Comparative studies of the genus Mal-leomyces and selected Pseudomonas species. I. Morphological and cultural characteristics. // J. Bact. 1956. - Vol.72. - P.79.

169. Wheelis M. First shots fired in biological warfare // Nature. 1998. — №395. -P.213.

170. Wigley P., Burton N.F. Genotypic and phenotypic relationships in Burkholderia cepacia isolated from cystic fibrosis patients and the environment // J. Appl. Microbiol. 1999. - Vol.86, №3. - 460-468.

171. Wongratanacheewin S., Komutrin K., Sermswan R.W. Use of multiplex PCR patterns as genetic markers for Burkholderia pseudomallei II Acta Trop. 2000. - Vol.74, №2. - P.193-199.

172. Zierdt C., Marsh H. Identification of Pseudomonas pseudomallei II Amer. J. Clin. Pathol. 1971. -№55. - P. 596-603.