Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Богун, Александр Геннадьевич

• Богун, Александр Геннадьевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Богун, Александр Геннадьевич

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Методы генотипирования микроорганизмов

1.2 Генотипирование микобактерий туберкулёзного комплекса

1.2.1 Сполиготипирование штаммов М. tuberculosis

1.2.2 ПДРФ-18б)//0 генотипирование штаммов М. tuberculosis

1.2.3 MIRU-VNTR генотипирование штаммов М. tuberculosis

1.2.4 SNP генотипирование штаммов М. tuberculosis

1.2.5 Анализ геномных делеций как метод генотипирования штаммов М. tuberculosis

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Бактериальные культуры

2.2 Питательные среды.

2.3 Определение видовой принадлежности клинических бактериальных культур.

2.4 Выделение хромосомной ДНК

2.5 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis методом MIRU-VNTR.

2.5.1 Полимеразная цепная реакция

2.5.2 Определение числа повторов в MIRU-VNTR локусах

2.5.3 Оценка аллельного разнообразия MIRU-VNTR локусов

2.5.4 Оценка разнообразия генотипов

2.5.5 Филогенетический анализ клинических изолятов М. tuberculosis

2.6 Анализ точечных мутаций в геномах клинических изолятов М. tuberculosis

2.7 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis методом ПДРФ-1867/0.

2.8 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis методом сполиготипирования

2.8.1 Полимеразная цепная реакция

2.8.2 Гибридизация

2.8.3 Детекция

2.9 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis

2.9.1 Определение лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis in vitro

2.9.2 Изучение мутаций в генерпсА

2.9.3 Изучение мутаций, детерминирующих устойчивость к лекарственным препаратам

Глава 3. Результаты

3.1 Подбор оптимальных условий для амплификации локусов MIRU-VNTR.

3.1.1 Оценка влияния концентрации MgCb на ПЦР

3.1.2 Изучение влияния дополнительных компонентов на ПЦР

3.1.3 Подбор температурных и временных параметров реакции

3.2 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, методом MIRU-VNTR

3.3 Анализ сполигопаттернов клинических изолятов

М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

3.4 Анализ результатов SNP-типирования клинических изолятов

М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

3.5 Анализ клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, методом ПДРФ

3.6 Сравнение данных, полученных при генотипировании клинических изолятов М. tuberculosis разными методами

3.6.1 Сопоставление результатов, полученных при анализе клинических изолятов М. tuberculosisi методами MIRU-VNTR и SNP

3.6.2 Сопоставление результатов, полученных при анализе клинических изолятов М. tuberculosis методами MIRU-VNTR и сполиготипирования

3.6.3 Сопоставление результатов, полученных при анализе клинических изолятов М. tuberculosis методами MIRU-VNTR и ПДРФ-IStf /10.

3.6.3.1 Эффективность дифференциации клинических изолятов М. tuberculosis, кластеризованных методом MIRU-VNTR, при анализе их методом ПДРФ-IS

3.6.3.2 Эффективность дифференциации клинических изолятов М. tuberculosis, кластеризованных методом ПДРФ-IS(57 7 0, при анализе их мeтoдoм'MIRU-VNTR

3.6.4 Сопоставление результатов, полученных при анализе клинических изолятов М. tuberculosis методами

SNP и ПДРФ-18<5770.

3.6.5 Сопоставление результатов, полученных при анализе клинических изолятов М. tuberculosis методами

SNP и сполиготипирования

3.7 Исследование особенностей использования различных наборов локусов MIRU-VNTR и способов построения дендрограмм генетического родства для филогенетического анализа изолятов М. tuberculosis

3.8 Лекарственная устойчивость клинических изолятов М. tuberculosis

3.8.1 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis группы MIRU-VNTR

3.8.2 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов

M. tuberculosis группы MIRU-VNTR

3.8.3 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов М tuberculosis группы MIRU-VNTR-3a

3.8.4 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis группы MIRU-VNTR-3b

3.8.5 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis группы MIRU-VNTR

3.8.6 Сравнение лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis, относящихся к разным геногруппам

Глава 4. Обсуждение

4.1 Молекулярно-генетические характеристики клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

4.2 Особенности использования различных вариантов метода MIRU-VNTR, для анализа клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе Российской Федерации

4.3 Анализ принадлежности клинических изолятов М. tuberculosis к геногруппам, выявленным при сполиготипировании, MIRU-VNTR и SNP-типировании

4.4 Анализ лекарственной устойчивости клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ

4.5 Изучение мутаций, детерминирующих устойчивость к лекарственным препаратам

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование молекулярно-генетических методов для комплексного анализа штаммов Mycobacterium tuberculosis»

В настоящее время туберкулёз является главным фактором инвалиди-зации и смертности во всём мире, имеющим бактериальную природу [9, 11, 13]. Эпидемия ВИЧ-инфекции во многих странах привела к значительному увеличению заболеваемости туберкулёзом [14], а увеличение количества штаммов Mycobacterium tuberculosis, устойчивых к антибактериальным препаратам, создало дополнительные трудности при лечении данного заболевания [11, 15,52].

Существует множество работ, показывающих особенности циркуляции штаммов возбудителя туберкулёза в различных регионах мира [12, 37, 69, 75, 91]. Между населением отдельных регионов и субпопуляциями М. tuberculosis существуют длительные ассоциации, которые начали существенно изменяться в двадцатом веке в связи с усилением миграции и активизацией туристических и деловых поездок [47]. Невозможно изучать такие изменения, не имея четких критериев, позволяющих разграничивать разные группы М. tuberculosis. Многими исследователями показано, что популяци-онная структура микобактерий носит клональный характер [8, 126, 132, 141]. В настоящее время* для анализа микобактерий используется несколько методов генотипирования, но результаты, получаемые при этом, часто противоречат друг другу [50, 63, 85, 89, 129, 133].

Наиболее перспективной для филогенетического анализа многих микроорганизмов является классификация, основанная на использовании муль-тилокусного секвенирования для анализа точечных мутаций [77]. Так, например, успешно проводится межвидовая дифференциация нетуберкулёзных микобактерий на основании последовательности гена lóSrRNA [17]. Однако для эффективной дифференциации штаммов М. tuberculosis необходимо анализировать большое количество генов, ввиду того, что для микобактерий туберкулёзного комплекса характерен низкий уровень полиморфизма генома. В современных исследованиях при проведении филогенетического анализа штаммов секвенированию подвергается до 89 генов М. tuberculosis [44]. Необходимость определения последовательностей такого количества генов значительно усложняет процедуру анализа, что ограничивает применение муль-тилокусного секвенирования для генотипирования штаммов М. tuberculosis.

Классификация микобактерий, использующая метод SNP, основана на анализе полиморфизма нуклеотидов, обнаруженных в разных участках генома [57, 68]. Данная классификация была разработана в результате полногеномного секвенирования штаммов М. tuberculosis H37Rv, 1551, 210 и штамма Mycobacterium bovis AF2122/97. Определение точечных мутаций в исследуемых штаммах в данном случае проводится с применением аллель-специфичной ПНР [72]. Этот метод сравнительно прост в использовании, но имеет низкую разрешающую способность и не позволяет проводить эффективную дифференциацию клинических штаммов. Кроме того, по мнению ряда авторов [63], филогенетическая схема, построенная на основании SNP-типирования, не полностью отражает. особенности эволюции возбудителя туберкулёза. Это происходит из-за того, что выбор детектируемых точечных мутаций был проведён лишь на основании сравнения ДНК штаммов, для которых известна последовательность всего генома, а такой подход заведомо предполагает, что максимальное число обнаруживаемых различий будет равно числу различий между эталонными штаммами (штаммами с секвени-рованными геномами). При проведении данного анализа невозможно выявить генетические модификации, появившиеся в эволюционно более молодых штаммах. Кроме того, штаммы М. tuberculosis CDC1551 и H37Rv, использованные для обнаружения полиморфных нуклеотидов, являются филогенетически близкими, так как относятся к Европейско-Американскому семейству. Это может приводить к искусственному разделению данного семейства на две эволюционные ветви, что противоречит данным, полученным на основании анализа геномных делеций. Также невозможно выявить ранее неизвестные подгруппы М. tuberculosis только на основании SNP-анализа с помощью аллель-специфичной ПЦР, так как в данном методе используется небольшое число горячих точек, которые являются полиморфными у изученных штаммов, но могут не отражать полиморфизма, присущего другим штаммам. Методы генетического анализа, традиционно используемые для идентификации микобактерий туберкулёзного комплекса, такие как ПДРФ-IS6110, сполиготипирование и MIRU-VNTR [23, 113], также, по ряду причин, не являются совершенными.

Для практического здравоохранения важной задачей является быстрое обнаружение штаммов М. tuberculosis, устойчивых к лекарственным препаратам, а также выявление источников и путей распространения таких штаммов [106, 109]. Наибольшим потенциалом для этих исследований обладают молекулярно-генетические методы, основанные на полимеразной цепной реакции, поскольку они позволяют быстро проводить анализ с использованием небольшого количества анализируемой бактериальной культуры [4, 6, 21].

Эффективный мониторинг штаммов М. tuberculosis и оперативный обмен информацией между разными лабораториями невозможен без единой системы идентификации. Так как в настоящее время ни один из существующих методов генотипирования штаммов М. tuberculosis не удовлетворяет всем требованиям, то возникает необходимость разработки комплексного подхода, основанного на использовании оптимальной комбинации методов.

Актуальность. Актуальность работы определяется тем, что в настоящее время отсутствует алгоритм генетической идентификации штаммов М. tuberculosis, удовлетворяющий всем необходимым требованиям. Такой алгоритм должен базироваться на методах, использующих для анализа небольшое количество тестируемого материала, обладающих высокой разрешающей способностью, чувствительностью, специфичностью, воспроизводимостью, и, кроме того, позволять легко сравнивать данные, полученные в разных лабораториях.

Цель данной работы - комплексное исследование клинических изо-лятов М. tuberculosis молекулярно-биологическими методами, широко использующимися в настоящее время для генетической идентификации возбудителя туберкулёза, и выявление закономерностей между данными, полученными при использовании этих методов.

Задачи исследования:

1. Изучение клинических изолятов М. tuberculosis методом сполиготи-пирования.

2. Изучение клинических изолятов М. tuberculosis методом ПДРФ-Ш110.

3. Изучение клинических изолятов М. tuberculosis методом MIRU-VNTR.

4. Определение принадлежности клинических изолятов М. tuberculosis к филогенетическим линиям на основании анализа точечных мутаций.

5.Изучение лекарственной устойчивости и мутаций, детерминирующих лекарственную устойчивость клинических изолятов М. tuberculosis, относящихся к разным геногруппам.

6. Анализ информативности разных методов генотипирования М. tuberculosis и выявление взаимосвязей между данными, полученными в результате их использования.

Научная новизна результатов. Впервые проведён анализ клинических изолятов М. tuberculosis с помощью метода MIRU-VNTR, основанного на анализе 35 локусов. Впервые проведён анализ большой выборки клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ с использованием четырёх методов генотипирования - ПДРФ-18б/70, SNP, сполиготипирования и MIRU-VNTR. Впервые показано полное соответствие между геногруппами, выявленными на основании данных, полученных с помощью методов MIRU-VNTR и SNP-типирования.

Практическая значимость работы. Полученные данные о генотипи-ческих особенностях клинических изолятов М. tuberculosis, циркулирующих в Центральном регионе РФ, необходимы для разработки эффективной системы мониторинга возбудителя туберкулёза. Разработан алгоритм генотипиро-вания клинических изолятов М. tuberculosis, основанный на анализе точечных мутаций и результатов MIRU-VNTR, позволяющий выявлять источник и отслеживать пути распространения штаммов, в том числе обладающих лекарственной устойчивостью, среди пациентов лечебных учреждений. Кроме того, использование данного подхода делает возможным установление принадлежности изолята к большим филогенетическим группам, что позволяет отслеживать распространение штаммов из других регионов. Особенностью данного подхода является возможность быстрого сравнения и обработки данных, полученных в разных лабораториях.

Положения, выносимые на защиту.

1. Разработан вариант метода MIRU-VNTR, основанный на анализе 35 ло-кусов в геноме туберкулезного микроба.

2. Разработан алгоритм генотипирования клинических изолятов М. tuberculosis, включающий анализ 35 локусов MIRU-VNTR и SNP-типирование, позволяющий проводить эффективную межштаммовую дифференциацию и определять принадлежность штаммов к филогенетической линии.

3. Использование разработанного алгоритма позволяет выявлять филогенетические связи между штаммами, обладающими лекарственной устойчивостью.

Апробация работы. Результаты работы доложены на Научно-практической конференции молодых учёных и специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Российской Федерации «Биологическая безопасность в современном мире» (п. Оболенск 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, в том числе три печатных работы в изданиях, рекомендованных ВАК Российской Федерации.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 179 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, методической части, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы и 9 приложений.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Богун, Александр Геннадьевич

Выводы

1. Подобраны условия проведения анализа, позволяющие тестировать 35 ло-кусов MIRU-VNTR, в том числе локусов, обладающих наибольшим полиморфизмом.

2. Показано, что клинические изоляты М. tuberculosis, выделенные от пациентов г. Тулы, распределились между SNP группами следующим образом: SCG-2 - 33,7%, SCG-3 - 14,1%, SCG-5 - 43,6% и SCG-6 - 8,6%.

3. Подтверждена самостоятельность филогенетических линий SCG-4, SCG-5 и SCG-6 М. tuberculosis.

4. Установлено, что все основные ветви дендрограммы, построенной для клинических изолятов М. tuberculosis (г. Тула, 2001-2002 г.) на основании результатов анализа 35 локусов MIRU-VNTR, однозначно отождествлены с ге-ногруппами, определёнными на основании анализа точечных мутаций.

5. Выявлено, что клинические изоляты М. tuberculosis (г. Тула, 2001-2002 г.), принадлежащие к сполигосемействам Beijing, Haarlem и LAM, относятся к кластерным группам SCG-2, SCG-3 и SCG-5 соответственно, в то время, как изоляты, принадлежащие к сполигосемейству Т, относятся к трём различным кластерным группам - SCG-3, SCG-5 и SCG-6.

6. Показано, что совместное использование методов MIRU-VNTR и SNP позволяет проводить межштаммовую дифференциацию М. tuberculosis и определять принадлежность изолятов к отдельным филогенетическим линиям.

7. Установлено, что метод MIRU-VNTR обладает преимуществом перед методом ПДРФ-18£>770 при выявлении изолятов М. tuberculosis, принадлежащих к одной клональной линии, в то время как метод ПДРФ-lSóJJO обладает большей разрешающей способностью при анализе близкородственных изолятов М. tuberculosis.

8. Показано, что для клинических изолятов М. tuberculosis, относящихся к кластерным группам SCG-2 и SCG-5, характерны различные мутации, приводящие к формированию лекарственной устойчивости.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Богун, Александр Геннадьевич, 2010 год

1. Приказ № 558, от 8 июня 1978 г. Об унификации микробиологических методов исследования при туберкулёзе. Министерство Здравоохранения СССР.

2. Приказ № 109, МЗ РФ, от 21 марта 2003 г. "О совершенствовании противотуберкулёзных мероприятий в Российской Федерации".

3. Баранов А. А., Марьяндышев О. А. Применение методов молекулярной биологии для исследования микобактерий туберкулёза //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. 2008. - № 4. - С.3-7.

4. Богун А. Г., Анисимова В. А., Степашина В. Н., Шемякин И. Г. Структура делеций, выявленных в геномах клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. 2007. -№12. - С.42-47.

5. Земскова 3. С., Андреевская С. Н., Смирнова Т. Г., Ларионова Е. Е., Черноусова JI. Н. Экспериментальный туберкулёз, вызванный штаммами М. tuberculosis, генотипических кластеров W, AI и HD //Туберкулёз и болезни лёгких. 2010. - № 3. - С.41-46.

6. Золотарёва JI. В., Шаханина И. Д., Золотых С. В. Эпидемиология и профилактика туберкулёза в пенитенциарных учреждениях Орловской области //Эпидемиология и инфекционные болезни. 2010. - № 1. — С.20-24.

7. Исакова Ж. Т. Распространённость и молекулярно-генетическая характеристика штаммов М. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью в Кыргызской Республике //Эпидемиология и инфекционные болезни. -2008. №6. - С. 18-19.

8. Кисличкина А. А., Степаншина В. Н., Шемякин И. Г. Микобактериозы //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. 2009. -№5. - С.3-9.

9. Кононец А. С., Хорошилова Н. Е., Голубева Л. И. Туберкулёз лёгких с множественной лекарственной устойчивостью возбудителя к основным и резервным препаратам //Эпидемиология и инфекционные болезни. -2010. — №1. — С.24-29.

10. Корнилова 3. X., Луконина И. В., Алексеева Л. П. Туберкулёз в сочетании с ВИЧ-инфекцией //Туберкулёз и болезни лёгких. 2010. - №3. -С.3-9.

11. Крапина Н. Л., Коссий Ю. Е., Фёдорова В. И., Абдулаев Р. Ю., Комиссарова О. Г. Эфферентная терапия в лечении больных туберкулёзомлёгких с лекарственной устойчивостью микобактерий //Туберкулёз и болезни лёгких. 2010. - №3. - С.28-33.

12. Майорова А. А., Степаншина В. Н., Шемякин И. Г. Микобактерии -общая характеристика и таксономия //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. -№ 11.- 2008. С.3-7.

13. Маркелов Ю. М., Нарвская О. В. Циркуляция штаммов возбудителя туберкулёза с множественной лекарственной устойчивостью на территории Республики Карелия //Туберкулёз и болезни лёгких. 2010. -№2. - С.54-56.

14. Салина Т. Ю., Морозова Т. И. Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени в диагностике тубёркулёза лёгких //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. 2008. - № 6. - С. 12-18.

15. Стамболцян Е. П., Сафарян М. Д., Улумян А. К. Эпидемиология, клиническая структура и исходы туберкулёзного менингита в Армении //Туберкулёз и болезни лёгких. 2010. - №2. - С. 20-23.

16. Степаншина В. Н., Липин М. Ю., Дубилей С. А., Игнатова А. Н. Доминирующие генотипы штаммов Mycobacterium tuberculosis от заключённых в посёлке озерки //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2007. -№3. - С.27-33.

17. Черноусова J1. Н., Андреевская С. Н., Смирнова Т. Г., Земскова 3. С., Ларионова Е. Е. Биологические свойства штаммов М. tuberculosis, кластера W //Проблемы туберкулёза и болезней лёгких. 2008. - № 10.1. C.45-50.

18. Achtman M. Evolution, Population Structure, and Phylogeography of Genetically Monomorphic Bacterial Pathogens //Annual Review of Microbiology. 2008. - Vol. 62. - p.53-70.

19. Alland, D., Whittam T. S., Murray M. В., Cave M. D., Hazbon M. H., Dix К., Kokoris M., Duesterhoeft A., Eisen J. A., Fraser С. M., Fleischmann R.

20. D. Modeling bacterial evolution with comparative-genome-based markersystems: application to Mycobacterium tuberculosis evolution and pathogenesis //Journal of Bacteriology. 2003. - Vol. 185. - p.3392-3399.

21. Allix C., Supply P., Fauville-Dufaux M. Utility of Fast Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable Number Tandem Repeat Genotyping in Clinical Mycobacteriological Analysis //Clinical Infectious Diseases. -2004. Vol. 39. - p.783-789.

22. Andersson D. I., Levin B. R. The biological cost of antibiotic resistance //Current Opinion in Microbiology. 1999. - Vol. 2. - p.489-493.

23. Baker L., Brown T., Maiden M. C., Drobniewski F. Silent nucleotide polymorphisms and a phylogeny for Mycobacterium tuberculosis //Emerging Infectious Disease. -2004. Vol. 10. - p. 1568-1577.

24. Caws M., Thwaites G., Dunstan S., Hawn T. R., Lan N. T. N., Thuong N. T. T., Stepniewska K., Huyen M. N. T., Bang N. D., Loc T. H., Gagneux S., van Soolingen D., Kremer K., van der Sande M., Small P., Anh P. T. H.,

25. Cohen T., Colijn C., Murray M. Modeling the effects of strain diversity and mechanisms of strain competition on the potential performance of new tuberculosis vaccines //PNAS. 2008. - Vol. 105. - p.16302-16307.

26. Comas I., Gagneux S. The Past and Future of Tuberculosis Research //PLoS Pathogens. 2009. - Vol.5. - Issue 10. - el000600.

27. Comas I., Homolka S., Neiman S., Gagneux S. Genotyping of Genetically Monomorphic Bacteria: DNA Sequencing in Mycobacterium tuberculosis Highlights the Limitations of Current Methodologies //PLoS ONE. 2009. -Vol.4.-Issue 11. -e7815.

28. Cox H. S., Kubica T., Doshetov D., Kebede Y., Rüsch-Gerdess S., Niemann S. The Beijing genotype and drug resistant tuberculosis in the Aral Sea region of Central Asia //BMC Respiratory Research. 2005. - 6. - 134.

29. Eisenach K. D., Crawford J. T., Bates J. H. Repetitive DNA sequences as probes for Mycobacterium tuberculosis //Journal of Clinical Microbiology. -1988.-Vol. 26. -p.2240-2245.

30. Ernst J. D., Lewinsohnb D. M., Beharc S., Blythed M., Schlesingere L. S., Kornfeldf H., Setteg A. Meeting Report: NIH Workshop on the Tuberculosis Immune Epitope Database //Tuberculosis (Edinb). 2008. - Vol. 88. -p.366-370.

31. Fitzgerald J. R., Musser J. M. Evolutionary genomics of pathogenic bacteria //TRENDS in Microbiology. -2001. Vol. 9. -p.547-553.

32. R., Jr., Venter J. C., and Fräser C. M. Whole-genome comparison of Mycobacterium tuberculosis clinical and laboratory strains //Journal of Bacteriology. 2002. - Vol. 184. - p.5479-5490.

33. Frothingham R., Meeker-O'Connell W.A. Genetic diversity in the Mycobacterium tuberculosis complex based on variable numbers of tandem DNA repeats//Microbiology. 1998. - Vol. 144.-p.l 189-1196.

34. Gagneux S., Long C. D., Small P. M., Van T., Schoolnik G. K., Bohannan B. J. M. The Competitive Cost of Antibiotic Resistance in Mycobacterium tuberculosis //Science. 2006. - Vol. 312. - p. 1944-1946.

35. Gagneux S., Small P. M. Global phylogeography of Mycobacterium tuberculosis and implications for tuberculosis product development //Lancet Infection Diseases. 2007. - Vol. 7. - p.328-337.

36. Hatfull G. F., Jacobs W. R. Molecular Genetics of Mycobacteria. ASM Press. - Washington, D.C. - 2000. - 363 p.

37. Hazbon M. H., Alland D. Hairpin Primers for Simplified Single-Nucleotide Polymorphism Analysis of Mycobacterium tuberculosis and Other Organisms //Journal of Clinical Microbiology. 2004. - Vol. 42. - p.1236-1242.

38. Hazbon M. H., Motiwala A. S., Cavatore M., Brimacombe M., Whittam T. S., Alland D. Convergent Evolutionary Analysis Identifies Significant Mutations in Drug Resistance Targets of Mycobacterium tuberculosis

39. Animicrobial Agents and Chemotherapy. 2008. - Vol. 52. - p.3369-3376.

40. Heidelberg J. F., Nelson W. C., Schoenfeld T., Bhaya D. Germ Warfare in a Microbial Mat Community: CRISPRs Provide Insights into the Co-Evolution of Host and Viral Genomes //PLoS ONE. 2009. - Vol.4. - Issue 1. - e4169.

41. Iwamoto T., Fujiyama R., Yoshida S., Wada T., Shirai C., Kawakami Y. 2009. Population Structure Dynamics of Mycobacterium tuberculosis Beijing Strains during Past Decades in Japan //Journal of Clinical Microbiology. 2009. - Vol. 47. - p.3340-3343.

42. Jassal M., Bishai W. R. Extensively drug-resistant tuberculosis //Lancet Infectious Diseases. -2009. Vol. 9. - p. 19-30.

43. Le Fleche P., Fabre M., Denoeud F., Koeck J. L., Vergnaud G. High resolution, on-line identification of strains from the Mycobacterium tuberculosiscomplex based on tandem repeat typing //BMC Microbiology. 2002. - 2. -37.

44. Maisnier-Patin S., Andersson D. I. Adaptation to the deleterious effects of antimicrobial drug resistance mutations by compensatory evolution //Research in Microbiology. 2004. - Vol. 155. - p.360-369.

45. Michener C. D., Sokal R. R. A quantitative approach to a problem in classification//Evolution. 1957.-Vol. 11.-p. 130-162.

46. Murase Y., Mitarai S., Sugawara I., Kato S., Maeda S. Promising loci of variable numbers of tandem repeats for typing Beijing family Mycobacterium tuberculosis //Journal of Medical Microbiology. 2008. - Vol. 57. - p.873-880.

47. Nei M., Maruyama T., Wu C. I. Models of Evolution of Reproductive Isolation//Genetics. 1983.-Vol. 103. - p.557-579.

48. Nei M., Tajima F., Tateno Y. Accuracy of estimated phylogenetic trees from molecular data. II. Gene frequency data //Journal of Molecular Evolution. -1983.-Vol. 19. -p.153-170.

49. Nei M., Stephens J. C., Saitou N. Methods for Computing the Standard Errors of Branching Points in an Evolutionary Tree and Their Application to Molecular Data from Humans and Apes //Molecular Biology and Evolution. 1985.-Vol. 2. - p.66-85.

50. Nikolayevskyy V., Gopaul K., Balabanova Y., Brown T., Fedorin I., Drob-niewski F. Differentiation of Tuberculosis Strains in a Population with Mainly Beijing-family Strains //Emerging Infectious Diseases. 2006. -Vol. 12. -p.1406-1413.

51. Salamon H., Kato-Maeda M., Small P. M., Drenkow J., Gingeras T. R. Detection of Deleted Genomic DNA Using a Semiautomated Computational Analysis of GeneChip Data //Genome Research. 2000. - Vol. 10. -p.2044-2054.

52. Salmoniere Y.-O. L. G., Kim C. C., Tsolaki A. G., Pym A. S., Siegrist M. S., Small P. M. High-Throughput Method for Detecting Genomic-Deletion Polymorphisms //Journal of Clinical Microbiology. 2004. - Vol. 42. -p.2913-2918.

53. Scott A. N., Menzies D., Tannenbaum T.-N., Thibert L., Kozak R., Joseph L., Schwartzman K., Behr M. A. Sensitivities and Specificities of Spoligotyping and Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit-Variable-Number

54. Tandem Repeat Typing Methods for Studying Molecular Epidemiology of Tuberculosis //Journal of Clinical Microbiology. 2005. - Vol. 43. - p.89-94.

55. Sebban M., Mokrousov I., Rastogi N., Sola C. A data-mining approach to spacer oligonucleotide typing of Mycobacterium tuberculosis //Bioinformatics. 2002. - Vol. 18. - p.235-243.

56. Seiander R. K., Caugant D. A., Ochman H., Musser J. M., Gilmour M. N., Whittam T. S. Methods of multilocus enzyme electrophoresis for bacterial population genetics and systematics //Applied and Environmental Microbiology. 1986.-Vol. 51. -p.873-884.

57. Smittipat N., Palittapongarnpim P. Identification of possible loci of variable number of tandem repeats in Mycobacterium tuberculosis //Tubercle and Lung Disease. 2000. - Vol. 80. - p.69-74.

58. Stewart T. C., Eisenach K. D., McMurray D. N., Jacobs W. R. J., Tuberculosis and Tubercle Bacillus. ASM PRESS. - Washington, DC. 2005. - 5841. P

59. Supply P., Mazars E., Lesjean S., Vincent V., Gicquel B., Locht C. Variable human minisatellite-like regions in the Mycobacterium tuberculosis genome //Molecular Microbiology. 2000. - Vol. 36. - p.762 -771.

60. Proposal for Standardization of Optimized Mycobacterial Interspersed Repetitive Unit—Variable-Number Tandem Repeat Typing of Mycobacterium tuberculosis //Journal of Clinical Microbiology. 2006. - Vol. 44. - p. 4498—4510.

61. Thierry D., Cave M. D., Eisenach K. D., Crawford J. T., Bates J. H., Gicquel

62. B., Guesdon J. L. \S6110, an IS-like element of Mycobacterusm tuberculosis complex //Nucleic Acids Research. 1990. - Vol. 18. - p.188.

63. Vultos T. D., Mestre O., Rauzier J., Golec M., Rastogi N., Rasolofo V., Tonjum T., Sola C., Matic I., Gicque B. Evolution and Diversity of Clonal Bacteria: The Paradigm of Mycobacterium tuberculosis //PLoS ONE. -2008. 3. - el538.

64. Wada T., Maeda S., Hase A., Kobayashi K. Evaluation of variable numbers of tandem repeat as molecular epidemiological markers of Mycobacterium tuberculosis in Japan //Journal of Medical Microbiology. — 2007. Vol. 56. -p.1052-1057.

65. LAM9 777477607760771 5 811 Т1 774000000760771 58

66. LAM9 777477607760771 5 807 Т1 775740003760771 5 803 LAM9 777477607760771 5 785 LAM9 777477607760771 5-802 LAM9 777477607760771 51 '-711.I-- 779 LAI

67. LAM 777600000060771 5 779 LAM9 777477607760771 5

68. LAM9 407777607760771 5 939 LAM9 003777607760771 51125 LAM 777763007760771 5 19 777777207760771 5 -f 1063 U 777777600000000 5

69. T1 777777777760771 6 1100X770000737760751 6 870 T1 777777777760771 6

70. Г 941T1 777777777760771 6 940 T1 777777777760771 6 846 T4 777777377760771 6-922 T1 777777777760771 6

71. T 777775077760771 6 "963 T1 777777777760771 6-• 881 T3 377737777760771 6- 1057 T1 777777777760771 6

72. Haarlem4 774777777420771 3 816 Haarlem4 774777777420771 3---983 Haarlem 760377777420771 3

73. Haarlem 760377777420771 3 -■ 896 Haarlem4 674777377420771 3980 Haarlem 777677777420771 3ra

74. Няяг!ят4 777737777420771 31096 Haarlem4 777777777420771 3-850 HaarlerrvJ 777777777420771 3

75. Haar1em4 777777777420771 3 771 Haaflem4 777777777420771 3ь0.0SН