Использование метода полимеразной цепной реакции в системе санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды различных водных объектов энтеровирусами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.07, кандидат биологических наук Лаврова, Дарья Вильямовна

• Лаврова, Дарья Вильямовна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Лаврова, Дарья Вильямовна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЧАСТЬ I

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. Введение.

ГЛАВА 2. Использование методов концентрирования для устранения ингибиторов ОТ-ПЦР.

ГЛАВА 3. Использование методов выделения РНК вирусов для устранения ингибиторов ОТ-ПЦР.

ГЛАВА 4. Сравнение методов культуры клеток и ОТ-ПЦР для индикации энтеровирусов в пробах воды.

ГЛАВА 5. Использование метода ОТ-ПЦР, интегрированной с культурой клеток (ИКК ОТ-ПЦР) для анализа энтеровирусного загрязнения проб воды.

ГЛАВА 6. Возможности использования ОТ-ПЦР для контроля инфекционных энтеровирусов в пробах воды, прошедшей обработку

УФО и хлором.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

ЧАСТЬ II

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 1. Использование метода ОТ-ПЦР, интегрированной с культурой клеток, для индикации РНК цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды.

ГЛАВА 2. Отработка метода выделения РНК из концентратов сточных вод и вод поверхностных водоисточников.

ГЛАВА 3. Изучение оптимальных режимов элюции полиовируса для обеспечения высокой эффективности их последующей детекции методом ОТ-ПЦР.

3.1. Изучение оптимальных режимов элюции энтеровирусов для обеспечения высокой эффективности их последующей детекции методом ОТ-ПЦР, используя метод концентрирования на колонках с ионообменной смолой АВ 17-8.

3.2. Изучение оптимальных режимов элюции энтеровирусов для обеспечения высокой эффективности их последующей детекции методом ОТ-ПЦР, используя метод концентрирования на мембранном фильтре ММК.

ГЛАВА 4. Изучение возможности использования ОТ-ПЦР для контроля цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды, прошедшей обработку дезинфектантами.

4.1. Изучение возможности использования ОТ-ПЦР для контроля цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды, прошедшей обработку УФО.

4.2. Изучение возможности использования ОТ-ПЦР для контроля цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды, прошедшей обработку

УФО, хлором и комбинированную обработку УФО и хлором.

ГЛАВА 5. Апробация методов ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР на натурных объектах в условиях вспышечной заболеваемости и в межэпидемический период.—

ГЛАВА 6. Разработка схем санитарно-вирусологического контроля воды с использованием методов ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР.

ГЛАВА 7. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Использование метода полимеразной цепной реакции в системе санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды различных водных объектов энтеровирусами»

Актуальность проблемы Проблема обеспечения эпидемической безопасности населения России при различных видах водопользования является приоритетной государственной задачей в системе предупредительного санитарноэпидемиологического надзора (Рахманин Ю.А., 2005, Онищенко Г.Г., 2005). Будучи одним из ведущих факторов в реализации фекальноорального механизма передачи кишечных вирусных инфекций, водный путь передачи в настоящее время является одним из основных в формировании спорадической и вспышечной заболеваемости (Савилов Е.Д., Мамонтова Л.М., 2005, Недачин А.Е., 2005).Согласно действующим в нашей стране нормативным документам водно-санитарного законодательства, эпидемическая безопасность водных обьектов в отношении кишечных вирусных инфекций обеспечивается отсутствием патогенных вирусов в воде.Отсутствие до настоящего времени мер специфической профилактики в отношении кишечных вирусных инфекций диктует необходимость совершенствования неспецифических мер, ограничивающих циркуляцию вирусов в объектах окружающей среды, важной составляющей которых является контроль за циркуляцией вирусов в окружающей среде.Для индикации цитопатогенных вирусов, распространяющихся водным путем в практической лабораторной слз^ жбе используется метод их выделения на чувствительных культурах клеток. Однако данный метод имеет ряд недостатков, снижающих его практическую значимость: длительность процесса (3-4 недели), невозможность выделения нецитолитических и поврежденных вирусных агентов, не способных вызывать продуктивную цитолитическую инфекцию в системе in vitro, но, тем не менее, представляющих эпидемическую опасность для живого организма (Амвросьева Т.В., 2002). Эти проблемы, возникающие при изучении вирусологического качества вод различных водных объектов, могут быть решены путем использования метода детекции РНК энтеровирусов - полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР), который позволяет в течение 12-24 часов обнаружить в исследуемом материале энтеровирусную РНК (Reynolds К.А., 2004).Целью работы является разработка научно обоснованной схемы санитарно-вирусологического контроля качества воды водных объектов на основе индикации вирусов с помощью метода полимеразной цепной реакции с этапом обратной транскрипции (ОТ-ПЦР).Основные задачи диссертационной работы: 1. Разработать оптимальные режимы элюции энтеровирусов с целью обеспечения высокой эффективности их последующей индикации методом ОТ-ПЦР из проб воды; 2. Разработать эффективный метод выделения РНК энтеровирусов из концентратов проб поверхностных и сточных вод; 3. Отработать методику ОТ-ПЦР, интегрированной с культурой клеток (ИКК ОТ-ПЦР), для индикации РНК цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды; 4. Провести сравнительную, оценку методов индикации вирусного загрязнения воды при ее обеззараживании с использованием культурального, ОТ-ПЦР, ИКК ОТ-ПЦР и метода выделения колифагов; 5. Апробировать используемые методы на натурных объектах в условиях вспышечной заболеваемости и в межэпидемический период; 6. Разработать схему санитарно-вирусологического контроля с использованием метода ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР. Научная новизна работы. Впервые - разработан эффективный метод выделения РНК энтеровирусов из концентратов проб поверхностных и сточных вод; - разработана комплексная схема санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды различных водных объектов энтеровирусами с использованием метода ИКК ОТ-ПЦР; - разработана комплексная схема санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды энтеровирусами при ее обеззараживании с использованием метода ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР; - проведена сравнительная оценка методов индикации вирусного загрязнения воды при ее обеззараживании с использованием культурального, ОТ-ПЦР, ИКК ОТ-ПЦР и метода выделения колифагов.Основные положения, выносимые на защиту - разработанная схема санитарно-вирусологического контроля с использованием метода ИКК ОТ-ПЦР для индикации РНК цитопатогенных энтеровирусов в пробах воды различных водных объектов; разработанная схема санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды энтеровирусами при ее обеззараживании с использованием метода ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР; - разработанный метод выделения РНК из концентратов проб поверхностных и сточных вод для эффективного устранения ингибиторов ОТ-ПЦР; - экспериментальное обоснование применения метода ИКК ОТ-ПЦР при санитарно-вирусологическом анализе проб воды, обработанных дезинфектантами.ЧАСТЫ

Заключение диссертации по теме «Гигиена», Лаврова, Дарья Вильямовна

ВЫВОДЫ

1. В результате проведенных исследований по совершенствованию метода санитарно-вирусологического контроля воды, включающего определение РНК энтеровирусов методом ИКК ОТ-ПЦР, показано, что чувствительность метода ИКК ОТ-ПЦР выше культурального метода и составляет соответственно 101п ТЦД5о/мл и 100пТЦД50/мл.

2. Показано, что применяемые при различных методах концентрирования элюенты: фосфатный буфер (рН 8,2), 3 % мясной экстракт на трис-буфере (рН 9,5), 0,05 М глициновый буфер (рН 11), физиологический раствор (рН 8,3) и мясо-пептонный бульон (рН 9,5) не оказывали влияния на эффективность метода ОТ-ПЦР и не вызывали ингибирования ОТ-ПЦР, что позволяет использовать этот метод для индикации энтеровирусов, после элюирования всеми видами элюентов.

3. Разработан комбинированный метод выделения РНК из концентратов проб воды с использованием методов фенол-хлороформной экстракции и сорбции на частицах силикагеля с целью наиболее эффективного устранения факторов ингибирования ОТ-ПЦР при анализе проб воды с высоким уровнем загрязнения (поверхностных и сточных).

4. Показано, что использование метода ИКК ОТ-ПЦР позволяет сократить время анализа на наличие энтеровирусов в воде до 3 суток по сравнению с общепринятым методом выделения энтеровирусов на культуре клеток (21 сутки), что обеспечивает своевременное проведение профилактических гигиенических мероприятий.

5. На основании исследований, проведенных в натурных условиях, показано, что частота обнаружения цитопатогенных энтеровирусов, определенных методом ИКК ОТ-ПЦР, превышает частоту обнаружения энтеровирусов при определении на культуре клеток и составляет 39,2 и 19,6% соответственно, что свидетельствует о более высокой эпидемиологической значимости метода ИКК ОТ-ПЦР по сравнению с культуральным методом.

6. Разработаны комплексные схемы санитарно-вирусологического контроля загрязнения воды различных водных объектов энтеровирусами с использованием методов ОТ-ПЦР и ИКК ОТ-ПЦР, позволяющие сократить сроки проведения анализа и своевременно принимать профилактические противоэпидемические мероприятия.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Лаврова, Дарья Вильямовна, 2005 год

1. Амвросьева Т.В., Вотяков В.И., Дьяконова О.В., Поклонская Н.В., Богуш З.Ф., Казинец О.Н., Титов Л.П. Современные подходы к изучению и оценке вирусного загрязнения питьевых вод // Гигиена и санитария, 2002, №1, с.76-79.

2. Амвросьева Т.В., Титов Л.П., и др. Водная вспышка серозного менингита, вызванная вирусом ЕСНО-ЗО, в Беларуси // Журн. Микробиол. 2001, №1, с. 21-25

3. Багдасарьян Г.А. Актуальные вопросы санитарной вирусологии некоторых объектов внешней среды. Докт. дисс., М., 1972.

4. Багдасарьян Г.А., Влодавец В.В., Дмитриева P.A., Ловцевич Е.Л. Основы санитарной вирусологии. М., Медицина, 1977,190.

5. Багдасарьян Г.А., Ловцевич Е.Л. Индикация и инактивация кишечных вирусов в объектах внешней среды. М. 1972, 75-86.

6. Белецкая Т.С., Фельдман Э.В., Самойлович Е.О., Счесленок Е.П., Капустик Л. А. Молекулярно-биологический мониторинг циркуляции полиовирусов в Беларуси. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2003. №1, с.29-36.

7. Брок Т. Мембранная фильтрация. М., 1987. 462 с.

8. Ворошилова М.К. Энтеровирусные инфекции человека. М., 1979, 36с.

9. Гирш В.М., Бойко I.I., Плугатир В.М. и др. Новий сорбент для концентраци Bipiciß i3 водного середовища Врач. Дело (Jlkap. справа). - 1995. - №5-65. - с.177-179.

10. Григорьева Л.В. Санитарная бактериология и вирусология водоемов. М.,Медицина, 1975, 182с.

11. Григорьева Л.В., Корчак Г.И. Санитарная вирусология сточных вод и их осадков. Киев, Здоровье, 1976, 149с.

12. Дмитриева P.A. Гигиенические вопросы водного пути передачи вирусных гепатитов // Гигиена и санитария, 1988,8,56-59.

13. Дьяконова О.В. Молекулярная индикация инфекционности контаминирующих воду энтеровирусов и их инфекционные свойства / автореферат к.б.н., Минск, 2003 г, 24с.

14. Зотова В.И. Санитрно-вирусологическая оценка эффективности очистки и обеззараживания сточных вод на очистных сооружениях автореф. к.б.н, М.,1978, 22с.

15. Контарович В.Б., Кашкарова Г.П. Вирусологическое обследование различных вод московского региона // Гигиена и санитария, 2002, №2, с.65-67.

16. Красильников И.В., Борисова В.Н. Адсорбционные и хроматографические свойства модифицированных кремнеземных сорбентов для производства противовирусных препаратов // Хроматография в биологии имедицине. М., 1989, с.95-102.1.l

17. Лепахина H.K. Сравнительная оценка чувствительности некоторых методов индикации вирусов в воде // Сб. Научн. трудов "Гигиенические аспекты охраны окружающей среды". 1977, 92-93.

18. Лепахина Н.К. Сравнительная оценка и усовершенствование методов концентрирования вирусов кишечной группы из водопроводной воды и воды поверхностных водоемов. Дисс. к.б.н., М, 1977.

19. Ловцевич Е.Л., Сергунина Л.А. Обеззараживание питьевой воды, содержащей энтеровирусы, продуктами электролиза поваренной соли // Гигиена и санитария 1968, 9, 22-27.

20. Методические указания 4.2.1018-01 "Санитарно-микробиологический анализ питьевой воды" М., 2001, 43с.

21. Методические рекомендации по санитарно-вирусологическому контролю объектов окружающей среды. М., 1982, 75с.

22. Методические указания "Санитарный надзор за применением ультрафиолетового излучения в технологии подготовки питьевой воды" МУ 2.1.4.719-98. М, 1998, 11с.

23. Мчедлишвили Б.В., Моргунова Е.Е., Михайлов A.M. Хроматографические методы очистки и кристаллизации сферических вирусов // Рост кристаллов 1988, №16, с. 163-177.

24. Попкова М.И. Методические подходы при проведении мониторинга за контаминацией водных объектов вирусом гепатита А // Материалы ВНПК "Окружающая среда и здоровье" 19-22 мая 2005г., г. Суздаль, с. 481-482.

25. Рабышко Э.В., Шарлот Ю.М., Коршунова Н.Г. Роль питьевой воды в распространении энтеровирусов среди населения // сб. "Актуальные вопросы санитарной микробиологии", М.,1979, 79-80.

26. Рекомендации по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде. Женева, 2003г.

27. Санамян А.Г., Колбасникова И.А. Оценка эффективности концентрирования вирусов на мембранном фильтрующем элементе МФЭ 0142 // Материалы ВНПК "Окружающая среда и здоровье" 19-22 мая 2005г., г. Суздаль, с. 190.

28. СанПиН 2.1.5.980-00 "Гигиенические требования к охране поверхностных вод". Минздрав России. Москва. 2000.

29. СанПиН 2.1.4.1074-02 "Питьевая вода. Гигиенические требования к качеству воды централизованных систем питьевого водоснабжения". Контроль качества. Госкомсанэпиднадзор России. Москва. 2002.

30. Сергевнин, В.И., Кудреватых Е.В., и др. Оценка контаминации водных объектов кишечными вирусами в сопоставлении с динамикой заболеваемости населения // Гигиена и санитария 2003, №1, с. 15-17.

31. Тихоненко Т.Н. Методические основы биохимии вирусов. М., 1973. 380с.

32. Шарлот Ю.М. Санитарно-микробиологическая оценка барьерной функции водопроводных сооружений некоторых городов среднего Поволжья. Автореф.к.м.н. М.,1980, 28с.

33. Abad, X.,F., Rosa M. Pinto and Albert Bosch. 1998. Flow Cytometry Detection of Rotavirus in Environmental and Clinical Samples // Appl. Environ. Microbiol, vol. 64, №7, p. 2392-2396.

34. Abbaszadegan, M., Huber, M.S., Gerba, C.P., Pepper, I.L. 1993. Detection of enteroviruses in groundwater with the PCR // Appl. Environ. Microbiol. 59:1318-1324.

35. Abbazadegan, M., Stevard P, Lechevallier M. 1999. A Strategy for Detection of Viruses in Groundwater by PCR // Appl. And Environ. Microbiol., V.65, №2, P.444-449.

36. American Public Health Association. 1995. Standard methods for the examination of water and wastewater, 19th ed. American Public Health Association, Washington, D.C.

37. Anderson, Y., A. Strenstrom. 1987. Waterborne outbreaks in Sweden. Causes and etiology // Water Sci. Technol. 19: 575-580.

38. Ahmed, A.I., D.L.Sorensen. // Water. Environ. Res. 1995. - Vol. 67-p. 143-150.

39. Blackmer F.,Reynolds K, Gerba C, Pepper I. 2000. Use of Integrated Cell Culture-PCR to Evaluate the Effectiveness of Poliovirus Inactivation by Chlorine // Applied and Environmental Microbiology. Vol.66, № 5, pp.2267-2268.

40. Boom R., Sol C, Salimans M., Jansen C., Wertheimvan D., J.Van der Noordaa. 1990. Rapid and Simple Method for Purification of Nucleic Acids // J. Clin. Microbiol. 28:495-503.

41. Bosch, A., Lucena, F., Diez, M., J., Gajardo, R. 1991. Waterborne viruses associated with hepatitis outbreak // Journal AWWA, Research and technology, pp. 80-83.

42. Bosch, A., F.Lucena, R.Girones, J. Jofre. 1986. Survey of Viral Pollution in Besos River (Barselona).Journal Water Pollution Control. V.58, №1, p.87-91.

43. Bosch, A., Rosa M. Pinto, et al. // Wat. Res. 1988. - Vol. 22 -№3 - pp. 343-348.

44. Bosch A., Sanches G., Guyader F., Vanaclocha H., Haugarreau L., Pinto R.M. 2001. Human enteric viruses in Cocuina clams associated with large hepatitis A outbreak// Water Sci. Technol. 43(12):61-65.

45. Buras N. 1974. Recovery of viruses from wastewater and effluent by the direct inoculation method // Water Research. 8,1,19-22.

46. Bziagos Evangelos, Passact Jacques, Crance Jean-Mark, Deloince Robert. 1989. Hepatitis A virus concentration from experimentally contaminated distilled, tap, waste and sea water // Water Sci. and Technol. 1989. Vol.21, №3. p.255-258.

47. Ciulla T.A, Sklar R.M., Hauser S.L. 1988. A simple method for DNA purification from periferal blood // Anal. Biochem. 174:485-488.

48. Chomczynski,P., and N.Sacchi. 1987. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinum thiocyanat-phenol-chloroform extraction // Anal. Biochem. 162:156-159.

49. Chung, H., Jaykus, L.A., and Sobsey, M.D. 1996. Detection of human enteric viruses in oysters by in vitro and in vivo amplification of nucleic acid//Appl. Environ. Microbiol. 62:3772-3778.

50. Dennis, W.H., Olivieri V.P., Krause C.W. 1979. The reaction of nucleotides with aqueous hypochlorous acid // Water Res. 13:357-362.

51. Divizia M., Gabrieli R., Donia D., Ruscio V., Degener A.M., Pana A. 1999. Concominant poliovirus infection during an outbreak of hepatitis A//J. Infect. 39(3):227-230.

52. Enriquez, C.E., Abbaszadegan, M., Pepper, I.L., Richrdson K.J., and Gerba C.P. 1993. Poliovirus detection in water by cell culture and nucleic acid hybridization // Water Res. 27:1113-1118.

53. Enriquez C.E., Abbaszadegan M., Pepper I.L., Richardson K.J., Margolin A.B., Gerba C.P. 1993. Comparison of poliovirus detection in water by cell culture and nucleic acid hybridization // Water Sci. Technol. 27:315-319.

54. Farrah S., Bitton G. 1978. Elution of poliovirus adsorbed to membrane filters // Appl. Environ. Microbiol. 36:982-984.

55. Firestein G.S., Gardner S.M., Roeder W.D. 1987. Quantittive molecular hybridization with unfractionated solubilized cells using RNA probes and polyacrylamide gel electrophoresis // Anal. Biochem. 167:381386.

56. Friedrich F., Da-Silva E.E., Schatzmayr H.G. 1996. Type 2 poliovirus recombinants isolates from vaccine-associated cases from healthy contacts in Brazil // Acta. Virol. 40:27-33.

57. Gajardo R., Bouchrit, R.M.Pinto and A.Bosh. 1995. Genotiping of Rotavirus Isolated from Sewage // Appl. Environ. Microbiol., 61: 34603462.

58. Gajardo,R., Jose M. Diez, Juan Jofre and Albert Bosch.1991. Adsorption-elution with negatively and positively- charged glass powder for the concentration of hepatitis A virus from water // Journal of Virological Metods 31: 345-352.

59. R.Gajardo, R.M.Pinto and A.Bosch. Polymerase Cain Reaction Amplification and Typing of Rotavirus in Environmental Samples // Wat. Sci. Tech., 1995, Vol.31, № 5-6, pp. 371-374.

60. Gantzer, C., Maul, A., Audic, J.M., Schwartzbrod, L. 1998. Detection of infectious enteroviruses, enterovirus genomes, somaticcoliphages, and Bacteroides fragilis phages in treated wastewater // Appl. Environ. Microbiol. 64 (11): 4307-4312.

61. Gantzer, C., Senouci S., Maul, A., Levi, Y., Schwartzbrod, L. 1997. Enterovirus genomes in wastewater: concentration on glass wool and glass powder and detection by RT-PCR // J. Virol. Methods. 65(2): 265271.

62. Gassilloud, B., Schwartzbrod, L., Gantzer, C. 2003. Presence of viral genomes in mineral water: a sufficient condition to assume infectious risk? // Appl. Environ. Microbiol. 69(7): 3965-3969.

63. Gratacap-Cavalier, B., Genoulas, O., et al. 2000. Detection of human and animal rotavirus sequences in drinking water // Appl. Environ. Microbiol. 66: 2690-2692.

64. Greening G.E., Hewitt J., Lewis G.D. 2002. Evaluation of integrated cell culture PCR (C-PCR) for virological analysis of environmental samples // Journal of Applied Microbiology. 93(5): 745-750.

65. Guillot S., Varo V., Cuervo N. 2000 Natural genetic exchanges between vaccine and wild poliovirus straines in humans // J.Virol. 74: 84348443.

66. Han, Y.Q., Zhang M.L., Yang R.F., Chen T.M., Liu Y.J. 1996. Study of the relationship between PCR detection results and infectivity of HAV// Chin. J. Disinfect. 13:133-137.

67. Harley A. Rotbart, M.D. Viral Meningitis. Seminars in Neurology, 2000. V.20, № 3, p.277-292.

68. Hejkal T.W., Keswick B., LaBelle R.L., Gerba C.B., Sanchez Y., Dreesman G., Hafkin B., Melnick J.L. 1982. Viruses in a community water supply associated with an outbreak of gastroenteritis and infectious hepatitis //J. AWWA. 74:318-320.

69. Hosoya M, Honzumi K, Suzuki H. 1997. Detection of enterovirus by polymerase chain reaction and culture in cerebrospinal fluid of childrenwith transient neurologic complications associated with acute febrile illness //J. Infect. Dis. 175 (3): 700-703.

70. Hugues B. Andre M., Champrsaur H. 1991. Virus concentration from waste water: glass wool versus glass powder adsorption methods // Biomed. Left. Vol.46, №182. p.103-107.

71. Hugues B., Andre M., Plantat J.I., Champrsaur H. 1993. Comparison of glass wool and glass powder methods for concentration of viruses from treated waste water // Zentrabl. Hyg. Und Umweltmed. Vol.93, №5. p.440-449.

72. Hurst, C.J. 1997. Sampling viruses from soil, p.400-405. In C.J.Hurst, G.R.Knudsen, Mclnerney M.J., Stetzenbach L.D., Walter M.V.(ed.), Manual of environmental microbiology. ASM Press, Washington, D.C.

73. Jaykus, L.A., R. De Leon, and M.D.Sobsey. 1996. A virion concentration method for detection of human enteric viruses in oysters by PCR and oligoprobe hybridization. Appl. Environ. Microbiol. 62:20742080.

74. Jberste M.S., Maher K., Pallansch M.A. 1999. Specific detection of echovirus 22 and 23 in cell culture supernatants by RT-PCR // J. Med Virol. 58(2): 178-181.

75. Jiang S., Rashel Noble, and Weiping Chu. 2001. Human Adenoviruses and Coliphages in Urban Runoff-Impacted Coastal Waters of Southern California // Appl. Environ. Microbiol. 67: 179-184.

76. Ijzerman, M.M., Dahling, D.R., and Fout, G.S. 1997. A method to remove environmental ingibitors prior to the detection of waterborae enteric viruses by reverse transcriptase-PCR // J. Virol. Methods 63:145-153.

77. Joret J.C. 1986. Some limits in corrent adsorption-elution methods for the defection of viruses in large volumes of tap water // Water Sci. and Technol. Vol.18, №10.p.l33-140.

78. Jothicumar, N., Cliver, D.O., and Mariam T.W. 1998. Immunomagnetic Capture PCR for Rapid Concentration and Detection of Hepatitis A Virus from Environmental Samples // Appl. and Environ. Microbiol. 64:504-508.

79. Katayama, H., Shimasaki, A, Ohgaki, S. Development of a virus concentration method and its application to detection of enterovirus and Norwalk virus from coastal seawater // Appl. and Environ. Microbiol. 68:1033-1039.

80. Keswick B.,Rose J., Yjrwar D. 1989. Detection of rotaviruses in treated drinking water // Meter.Sci.and Technol. 17,1-6.

81. Kopecka,H., Dubrov, S., Prevot, J., Mareshal, J and Lopez-Pila, J.M. 1993 Detection of naturally occuring enteroviruses in waters by reverse transcription, polymerase chain reaction, and hybridization // Appl. and Environ. Microbiol. 59:1213-1219.

82. Krashenyuk A.L., Goretskaya Y.I. 1988. Concentration and purification of Newcastle disease vims by microfiltration and exclusion liquid chromatography // Acta virol. Vol.32, №4. p.353-360.

83. Leclerc, H., Schwartzbrod, L., Die-Cas E. 2002. Microbial agents associated with waterborne diseases // Crit. Rev. Microbiol. 28 (4): 371-409

84. Lee, S.H., Kim S.J., 2002. Detection of infectious enteroviruses and adenoviruses in tap water in urban areas in Korea // Water Res. 36 (1): 248-256.

85. Leveque L., Crance J.M., Beril C., Shwartzbrod L. 1995. Virucidal effect of UV light on hepatitis A virus in seawater: evaluation with cell culture and RT-PCR// Water Sci. Technol. 31: 157-160.

86. Levis, C.D. and Metcalf, T.G. 1998. Polyetilen glicol precipitation for recovery of pathogenic viruses, including hepatitis A virus and human rotavirus, from oyster, water and sediment samples // Appl. Environ. Microbiol. 54:1983-1988.

87. Levis G.D., Molly S.L., Greening G.E., Dawso J. 2000. Influence of environmental factors on virus detection by RT-PCR and cell culture // J. Appl. Microbiol. 88:633-640.

88. Li Jun Wen, Zhong Tao Xin, Xin Wei Wang, Jin Lai Zheng, and Fu Huan Chao. 2002. Mechanism of Inactivation of Hepatitis A Virus by Chlorine // Appled and Environmental Microbiology. Vol. 68, № 10, p.4951-4955.

89. Li J., Zhang L.B., Yoneyama T. 1996. Genetic basis of the neurovirulence of type 1 polioviruses isolated from vaccine-associated paralytic patients // Arch. Virol. 141:1047-1054.

90. Limsawat, S., and Ohgaki. 1997. Fate of liberated viral RNA in wastewater determined by PCR// Appl. Environ. Microbiol.63:2932-2933.

91. Lukasik, J., Scott, T.M., Andryshak, D., Farrah, S.R. 2000. Influence of salts on virus adsorption to microporous filters // Appl. Environ. Microbiol. 66:2914-2920.

92. Ma J.-F., Straub T.M., Pepper I.L., Gerba C.P. 1994. Cell culture and PCR determination of poliovirus inactivation by desinfectants // Appl. Environ Microbiol. 60:4203-4206.

93. Maheshumar S., Goyal Sagor M., Peterson Richard B., Economon Philip P. 1991. Method for the concentration of infectious pancreatic necrosis virus from hatohery water // J. Virol. Meth. Vol.31, №2. p.211-217.

94. Maier, A., D.Tougianidou, A.Wiedenmann and K.Botzenhart. 1995. Detection of Poliovirus by cell culture and PCR after UV disinfection // Water science and technology. Vol. 31, № 5-6, pp. 141-145

95. Marko M.A, Chipperfield R., Birnboim H.C. 1982. A procedure for the large scale isolation of highly purified plasmid DNA using alkaline extraction and binding to glass powder // Anal Biochem.l21:382-387.

96. Matsuura K., Ishikura M. et al. 2000. Assessment of Poliovirus Eradication in Japan: Genomic Analysis of Polioviruses Isolated from River Water and Sewage in Toyama Prefecture // Applied and Environmental Microbiology V.66, №11, p.5087-5091.

97. Matsuura, R Mitsuhiro, I, et al. 2000, Assessment of poliovirus eradication in Japan: genomic analysis of polioviruses isolated from river water and sewage in Toyama prefecture // Appl. Environ. Microbiol. 66:5087-5091.

98. Metcalf T.G., Melnick J.L., Estes M.K. 1995. Environmental virology: from detection of virus in sewage and water by isolation to identification by molecular biology a trip of 50 years // Annu. Rev. Microbiol. 49:461-487.

99. Minor T.E., Allen C.J., Triatis A.A., Nelson D.B., Allesio D.J. -J.Clin.Microbiol., 1981, 13,388-389.

100. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Eds. J. Sambrook, P. MacCallum D. Russell. CSHL Press, London: 2001, p. 2344

101. Monpoeho, S., Maul, A., et al. 2001. Best viral elution mithod available for quantification of enteroviruses in sludge by both cell culture and reverse transcription-PCR // Appl. Environ. Microbiol. 67(6): 24842488.

102. Newton, C.R., Graham, G.A. PCR. Second edition, 1997, 150p.

103. Nupen, E.M., Bateman, B.W. 1985. The recovery of viruses from drinking water by means of an in-line electropositive cartridge filter // Water Sci. Technol. 17:63-69.

104. Papageorgiou, G.T., Moce-Llivina, L., Jofre, J. 2001. New method for evaluation of virucidal activity of antiseptics and disinfectants // Appl. and Environ. Microbiol. 67:5844-5848.

105. Paul J.R., Trask J.D., Gard S. 1940. Polyomyelitis virus in urban sewage // J. exptl. Med., 71, 765.

106. Payment, P., Fortin, S., Trudel, M. 1984. Ferric chloride flocculation for nonflocculating beef extract preparations // Appl. and Environ. Microbiol. 47:591-592.

107. Pinto R.M., Gajardo R., Xavier A.F., Bosch A. 1995. Detection of fastidious infectious enteric viruses in water. Environmental sciece & technology, Vol. 29, №10, pp. 2636-2638.

108. Pinto P.M., J.Jofre, F.X.Abad, J.F.Gjnzalez-Dankaart and A.Bosch Concentration of Fish Enveloped Viruses from Large Volumes of Water// Journal of Virological Methods, 43 (1993), p.31-40.

109. Preston D.R., Farrah S.R., Bilton G. 1989. Remuval of viruses from tapwater by fiberglass filters mod fied with a combination of cationie polymers // Water Sci. and Technol. Vol.21, №3., p.93-98.

110. Puig M J. Jofre, F. Lucena, A. Allard, G. Wadell, R. Girones. 1994. Detection of Adenoviruses and enteroviruses in Poluted Water by Nested PCR Amplification // Appl. Environ. Microbiol., V.60, №8, pp.2963-2970

111. Rao V. Chalapati, Metealf T.G., Melnick J.L. 1986. Development of a method for concentration of rotavirus and its application to recovery of rotaviruses from estuarine water // Appl. And Environ. Microbiol. Vol.52, №3., p.484-488.

112. Reynolds K.A. 2004. Integrated cell culture/PCR for detection of enteric viruses environmental samples // Methods Mol. Biol. 268: 69-78.

113. Reynolds K.A., Gerba C.P., Abbaszadegan M., Pepper L.L.2001. ICC/PCR detection of enteroviruses and hepatitis A virus in environmental samples // Can. J. Microbiol. 47(2): 153-157.

114. Reynolds, A.K., Gerba, C.P. and Papper, I.L. 1996. Detection of Infectious Enteroviruses by an Integrated Cell Culture Procedure // Appl. Environ. Microbiol.62:1424-1427.

115. Reynolds K.A., Roll K., Fujioka R.S., Gerba C.P., Pepper I.L. 1998. Incidence of enteroviruses in Mamala Bay, Hawaii using cell culture and direct polymerase chain reaction methodologies // Can. J. Microbiol. 1998,44(6): 598-604.

116. Reynolds, K.A., Rose, J.B., Giordano, A.T. 1993. Comparison of methods for the recovery and quantification of coliphage and indigenous bacteriophage from marine water and sediments // Water Sci. Technol. 27:115-117.

117. Rose, J.B., Zhou, X., Griffin, D.W., Paul, J.H. 1997. Comparison of PCR and plaque assay for detection and enumeration of coliphage in polluted marine waters // Appl. Environ. Microbiol. 63:4564-4566.

118. Saiki R.K., Gelfland D.H., Stoffel S., Scharf S., Higuchi R., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A.1988. Primer-directed enzimaticamplification of DNA with a thermodtabile DNA polymerase // Science. 239:487-491.

119. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. 1985. Enzymatic amplification of P-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia // Science. 230:1350-1354.

120. Sano, D., Fukushi K., Yoshida, Y., Omura, T. 2003. Detection of enteric viruses in municipal sewage sludge by a combination of the enzymatic virus elution method and RT-PCR // Water Res. 37(14):3490-3498.

121. Santos A.P., Costa E.V., Oliveira S.S., Souza M.C., Da Silva E.E. 2002. RT-PCR based analysis of cell culture negative stools samples from poliomyelitis suspected cases // J. Clin. Virol., 23 (3): 149-152.

122. Sellwuood J., Shore J., Read S., Wyn-Jones P. 1998. The use of reverse transcriptase-polymerase chain reaction to investigate environmental samples for the presence of enteroviruses // Commun. Dis. Public Health, l(l):58-60.

123. Scarpino, P.V., Berg G., Chang S.L., Dahling D, Lucas M.1972. A comparative study of the inactivation of viruses in water by chlorine // Water Res. 6:959-965.

124. Shin G-A., Sobsey, M.D. 2003. Reduction of Norwalk virus, Poliovirus 1, and bacteriofage MS2 by ozone disinfection of water // Appl. and Environ. Microbiol. 69:3975-3978.

125. Schwab, K.J., R. De Leon, M.D.Sobsey. 1996. Immunoafflnity concentration and purification of waterborne enteric viruses for detection by reverse transcriptase PCR // Appl. and Environ. Microbiol. 62:2086-2094.

126. Schwab, K.J., R. De Leon, and M.D.Sobsey. 1995. Concentration and Purification of Beef Extract Mock Eluates from Water Samples for the

127. Detection of Enteroviruses, Hepatitis A Virus and Norwolk Virus by Reverse Transcription-PCR// Appl. and Environ. Microbiol.61:531-537.

128. Schwab, K.J., R. De Leon, Baric,R.S., and M.D.Sobsey. 1991. Detection of rotavirus, enterovirus and hepatitis A virus by reverse transcriptase-polymerase chain reaction // Am. Water Works Assoc. Proc. 1990:475-495.

129. Schwab, K.J., R. De Leon, and M.D.Sobsey. 1993. Development of PCR methods for enteric virus detection in water // Water Sci. Technol. 27:211-218.

130. Shieh, Y.-S.C., Wait, D., Tai, L., and Sobsey M.D. 1995. Methods to remove ingibitors in sewage other fecal waters for enterovirus detection by the PCR// J. Virol. Methods 54:51-66.

131. Shri, N., Gerba, C.P. 1983. Concentration of coliphage from water and sewage with charge-modified filter aid // Appl. Environ. Microbiol.45:232-237.

132. Sobsey, M.D. 1995. Male-specific coliphages as indicators of viral contamination of drinking water. American Water Works Association, Denver, Colo.

133. Sobsey, M.D., Battigelli, D.A., Schin, G.A., Newland, S. 1998. RT-PCR amplification detects inactivated viruses in water and wastewater // Water Sci. Technol. 12:91-94.

134. Sobsey, M.D., Jones, B.L. 1979. Concentration of poliovirus from tap water using positively charged microporous filters // Appl. Environ. Microbiol. 37:588-595.

135. Sobsey, M.D., Oglesbee, S.E., Wait, D.A., Cuenca, A.I. 1985. Detection of hepatitis A virus in drincing water // Water Sci. Technol. 17:23-38.

136. Sobsey, M.D., Wallis, C., Hendersen, M., Melnick, J.L.1973. Concentration of enteroviruses from large volumes of water // Appl. Environ. Microbiol.26:529-534.

137. Straub, M.T., Pepper I.L., Gerba C.P. 1995. Comparison of PCR and cell culture for detection of enteroviruses in sludge-amended field soils and determination of their transport // Appl. Environ. Microbiol. 61(5): 2066-2068.

138. Stetler, R.E., Waltrip, S.C., and Hurst, CJ. 1992. Virus removal and recovery in the drinking water treatment train // Water Res. 26:727-731.

139. Sunny J., Noble R, Chu W. 2001. Human Adenoviruses and Coliphages in Urban Runoff-Impacted Coastal Waters of Southern California//Appl. Environ. Microbiol. 67: 179-184.

140. Thompson J. 1987. Molecular hybridization with RNA probes in concentrated solutions of guanidine thiocyanate // Anal. Biochem. 163:281291.

141. Toranzos G.A., Erdos G.W., Farrah C.R. 1986. Virus adsorption to microporous filters modified by in situ precipitation of metalliosalts // Water Sci. and Technol. Vol.18, №10., p.141-148.

142. Tsai, Y., Sobsey, M.D., Sangermano, L.R., and Palmer C.J. 1993. Simple method of concentrating enteroviruses and hepatitis A virus from sewage and ocean water for rapid detection by reverse transcriptase PCR // Appl. Environ. Microbiol. 59:3488-3491.

143. Wallis C., and Melnik J.L. A portable virus concentrator for use in the field, in Advances in water pollution research, Jenkins S.H., Pergamon press, Elmsford, N.Y., 119, 1973

144. Wallis C., Homma A., and Melnik J.L. 1972. A portable virus concentrator for testing water in the field // Water Res., 6, 1249.

145. Wang C.H., Tschen S.Y., Flehming B. 1995. Antigenisity of hepatitis A virus after ultraviolet inactivation // Vaccine. 13:835-840.

146. Wang, J.X., Yu Y.F., Xu Z.Y., Yu S.Z. 1998. Comparative study of chlorine on the HAV antigen and infectivity // Chin. J. Disinfect. 12:9496.

147. Yahya M.T., Straub T.M., Gerba C.P. 1992. Inactivation of coliphage MS-2 and poliovirus by copper, silver, and chlorine // Can. J. Microbiol. 38:430-435.

148. Yeager, J.G., O'Brien, R.T. 1979. Enterovirus inactivation in soil //Appl. Environ. Microbiol. 38: 694-701.