Ионный гомеостаз растительной клетки и механизмы его регуляции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, доктор биологических наук в форме науч. докл. Трофимова, Марина Сергеевна

• Трофимова, Марина Сергеевна
• доктор биологических наук в форме науч. докл.
• 2003

Оглавление диссертации доктор биологических наук в форме науч. докл. Трофимова, Марина Сергеевна

Актуальность проблемы. Живые организмы - термодинамически открытые системы - существуют и поддерживают свою сложную структурную организацию благодаря непрерывному обмену веществом и энергией с окружающей средой (Пригожин, Стенгерс, 1986). В основе их жизнедеятельности в оптимальных и в стрессовых условиях лежит принцип поддержания на относительно постоянном уровне значений внутриклеточных параметров или гомео-стаза. Для растений, которые, в отличие от животных, в большинстве случаев не способны к активным перемещениям в пространстве, требуются эффективные механизмы, позволяющие воспринимать информацию об изменении факторов окружающей среды, трансформировать ее в сигналы биологической природы и соответствующие реакции метаболизма и регулировать, таким образом, обменные потоки.

Ключевую роль в первичном восприятии действующих на растение стимулов экзогенной и эндогенной природы играют "граничные" мембраны растительных клеток: плазмалемма и тонопласт. Информация от их сенсорных систем передается на генетический аппарат с участием сложных каскадов трансакции сигналов. Важная роль в запуске этих систем, а также в обеспечении условий их функционирования, принадлежит таким параметрам ионного го-меостаза цитозоля, как значение рН и концентрация свободных ионов кальция. Полученные в последнее время данные позволяют предполагать, что небольшие изменения в значениях именно этих параметров ионного гомеостаза цитозоля воспринимаются клеткой как сигналы, указывающие на приходящие стимулы (Malho et aJ., 1998; Kurkdjian and Guern, 1989).

Особенность высших растений состоит в том, что основной формой энергии, необходимой для транспорта ионов и метаболитов через плазматические и вакуолярные мембраны, является трансмембранный градиент электрохимических потенциалов протонов (Дцн+) в отличие от градиента ионов натрия (АцКа'), используемого клетками животных и бактерий (Скулачев, 1989). Электрохимический градиент протонов представленный ДрН и A*F и генерируемый Н1"-АТФазой плазмалеммы, служит движущей силой, обеспечивающей перенос ионов и метаболитов внутрь растительной клетки. При этом вторично-активные транспортные процессы, сопряженные с переносом протонов, создают потенциальную угрозу цитоплазматического зачисления. Протоны, как составная часть воды, одновременно служат продуктами и субстратами метаболических реакций. Зависимость метаболизма и функционального состояния мембран от цитоплазматической концентрации протонов определяет необходимость ее строгой регуляции. Таким образом, регулирование pH цитозоля должно включать процессы, участвующие в формировании его стационарного значения, а также способные быстро возвращать этот параметр к исходному уровню после его импульсного смещения, функционального или вызванного извне. Это определяет необходимость существования рН-статирующей системы, активной как в оптимальных физиологических, так и в стрессовых условиях.

Обычно рассматриваются две группы механизмов, отвечающих за такое регулирование в растительной клетке. Это так называемые биофизический и биохимический рН-статирующие механизмы (Smith and Raven, 1979). Первый обусловлен активностью Н^-транспортирующих систем плазмалеммы и тоно-пласта (Felle, 1988; 2002), второй же базируется на рП-чувствительных реакциях карбоксилирования-декарбоксилирования органических кислот и на процессах, связанных с энергетическим метаболизмом (Davies, 1986; Sakano, 1998;

2001). До сих пор не достаточно ясно, каким образом два механизма взаимодействуют друг с другом и тем самым обеспечивают рН-гомеостаз цитозоля.

Другой важный аспект ионного гомеостаза связан с регуляцией концентрации свободного кальция в цитозоле. Изменение факторов окружающей среды обычно приводит к транзиторному возрастанию концентрации кальция, обусловленному активацией и открыванием локализованных в плазмалемме и/или внутриклеточных мембранах Са2+-проводящих каналов (Sanders et al.,

2002). При этом не всегда очевидно, какие клеточные депо ответственны за высвобождение ионов Кальция. Характеристики кальциевого сигнала, включающие амплитуду и д лительность изменений, варьируют в зависимости от воздействия на растение. (Trewavas, 1999). Однако конкретные процессы, выступающие мишенями, активность которых чувствительна к таким изменениям, до сих пор полностью не изучены.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ионный гомеостаз растительной клетки и механизмы его регуляции»

Цель исследования. Выяснение молекулярных механизмов ионного гомеостаза, связанных с регуляцией pH и уровня свободного Са2+ в цитозоле растительной клетки.

Задачи исследования.

1. Установить место и роль ЬГ-АТФазы плазмалеммы в быстродействующем рН-стате растительной клетки.

2. Выяснеть механизмы формирования стационарного значения рН в цитозоле растительной клетки.

3. Определить соотношение между двумя группами механизмов поддержания рН в растительной клетке: биохимическим и биофизическим рН-статами.

4. Исследовать механизм регуляции активности рГ -АТФазы плазмалеммы при осмотическом стрессе.

5. Изучить рН-зависимость формирования комплекса между КГ-АТФазой и ре-гуляторньми 14-3-3 белками.

6. Охарактеризовать осмотическую водную проницаемости плазмалеммы и то-нопласта, выяснить возможности ее рН-зависимой регуляции.

7. Исследовать роль Са-гомеостаза в ответе растительной клетки на тепловой стресс.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для растительной клетки характерна многокомпонентная система регулирования цитоплазматического рН. Величина стационарного значения рН определяется главным образом уровнем активности окислительного метаболизма клетки, так называемым биохимическим рН-статом. На изменения рН цито-золя реагируют быстродействующие механизмы, связанные с активностью мембранных ион-транспортных систем, так называемый биофизический рН-стат.

2. Основной вклад в регулирование цитоплазматического рН вносит электрогенная ЕГ-АТФаза плазмалеммы, переходящая в активное состояние при снижении рН в цитозоле. Такая активация обусловлена усилением сопряжения между транспортом протонов и гидролизом АТФ и реализуется при одновременном шунтировании трансмембранного потенциала.

3. рН-зависимое связывание НГ-АТФазы с регуляторными 14-3-3 белками определяет сродство фермента к протонам и способность реагировать на изменения рН. В стрессовых условиях при низком водном потенциале окружающей среды имеет место сборка комплекса между ЕГ-АТФазой и 14-3-3 белками.

4. Взаимодействие Н'-АТФазы с 14-3-3 белками вызывает активацию фермента, что выражается в усилении протонного транспорта, сопряженного с поглощением ионов и воды, и приводит к восстановлению значения рН цитозо5 ля и тургорного давления растительной клетки. При этом возвращение рН к физиологическим значениям сопровождается диссоциацией комплекса между Н'-АТФазой и 14-3-3 белками.

5. Водная проницаемость плазматических мембран, обусловленная присутствием в них белков аквапоринов, регулируется изменениями рН цитозоля. Захце-лачивание цитозоля, как результат активации Н-АТФазы, вызывает возрастание водной проницаемости плазматических мембран, закисление цитозоля ведет к ее снижению.

6. Синтез клеточных белков при оптимальных температурах находится под контролем Са2+-гомеостаза. При этом важную роль играет внеклеточное депо ионов кальция. Новообразование только определенных индивидуальных белков теплового шока при гипертермии характеризуется выраженной Са2+-зависимостыо. Подавление их синтеза приводит к повреждению клеток при повышенных температурах и указывает на вовлечение Са2+-гомеостаза в развитие термотолерантности.

7. Механизмы ионного гомеостаза, связанные с регулированием рН и уровня свободного кальция в цитозоле, выполняют различную роль в восприятии и передаче внешних сигналов в растительной клетке. Протонная система несет информацию об энергетическом потенциале цитозоля и активности транспортных механизмов. С помощью изменений цитоплазматической концентрации Са2* информация направляется к специфическим клеточным мишеням.

Научная новизна работы. Экспериментально обосновано, что в растительной клетке действует многокомпонентная система регулирования цито-плазматического рН, обеспечивающая надежность работы и скоординированное протекание метаболических процессов. Впервые выявлен механизм регуляция Б^-АТФазы плазмалеммы, обусловленный ее взаимодействием с цитоплаз-матическими 14-3-3 белками. Показано, что такое взаимодействие инициируется в условиях осмотического стресса и приводит к активации Н^-АТФазы плазмалеммы. Механизм активации обусловлен усилением сопряжения между транспортом протонов и гидролизом АТФ. Впервые представлены данные о рН-зависимой регуляции водной проницаемости плазмалеммы, указывающие на то, что регуляция ионного баланса и тургорного давления растительной клеткой осуществляются одновременно. Впервые выявлена роль внеклеточного депо ионов кальция в индукции новообразования индивидуальных белков теп6 лового шока при гипертермии. Проведен сравнительный анализ клеточных систем ионного гомеостаза, связанных с регулированием pH и уровня свободного кальция в цитозоле, и представлена концепция об их разной сигнальной роли в растении.

Практическая значимость исследования. Результаты исследования дают новые представления о механизмах ионного гомеостаза растительной клетки и вносят существенный вклад в современное понимание роли мембранных транспортных белков в этих процессах. Это позволяет не только подойти к решению фундаментальных проблем мембранологии, но и использовать полученные результаты в селекционной работе для целенаправленного получения сортов с высокими адаптивными возможностями.

Материалы диссертации могут быть рекомендованы для включения в лекционные курсы по физиологии растений и биофизике мембран.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на 3-ем Международном симпозиуме "Структура и функция корней" (Нитра, Чехословакия, 1987), 6-ом конгрессе Федерации Европейских обществ физиологов растений (Сплит, Югославия, 1988), 2-ом съезде Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1990), Международном симпозиуме "Рецепция и транс-дукция сигналов гормонов растений" (Москва, 1994), Международном симпозиуме "Стресс и ассимиляция неорганического азота" (Москва, 1996), симпозиуме Всероссийского общества физиологов растений "Физико-химические основы физиологии растений" (Пенза, 1996), 4-ом съезде Всероссийского общества физиологов растений (Москва, 1999), Международном симпозиуме "Растение в условиях стресса" (Москва, 2001) и других научных мероприятиях.

Личный вклад соискателя. Работа выполнена в лаборатории мембран растительных клеток Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН. Из исследований, проведенных в соавторстве с коллегами, в диссертационную работу включены и вынесены на защиту только те результаты, в получении которых автору принадлежит определяющая роль. В экспериментах также участвовали И.М. Андреев, A.B. Бабаков (ВНИИСБ РАСХН), Л.М. Гайворон-ская, И.М. Жесткова, Вл.В. Кузнецов, A.B. Носов, И.Н. Смоленская, Е.М. Сорокин, В.В Челышева. Автор выражает им глубокую благодарность за сотрудничество.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 35 работ, в том числе 18 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных научных журналах.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве основной модельной системы была использована суспензионная культура клеток хранящегося корня сахарной свеклы (Beta vulgaris L., сорт Верхнячская 38) из Российской коллекции культур клеток "Высшие растения" Института физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН.

FT-АТФаза плазмалеммы растительных клеток - электрогенная помпа

БГ-АТФаза плазмалеммы осуществляет сопряжение гидролиза АТФ с транспортом протонов. Это приводит к формированию градиента рН и разности потенциалов через мембрану, которые являются движущей силой для транспорта ионов и метаболитов внутрь клетки (Sze, 1985; Palmgren, 1998; Sze et al., 1999; Morsomme and Boutry, 2000). Везикулярный препарат плазмалеммы, сохранивший барьерные свойства исходных клеточных мембран и способный поддерживать электрохимические градиенты ионов, служит адекватной модельной системой для изучения транспортных процессов через эту мембрану.

Добавление MgAT«J> к суспензии везикул плазмалеммы, полученной из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы методом разделения микро-сом в двухфазной полимерной системе (Larsson et al., 1994), вызывало уменьшение абсорбции АрН-инцикатора акридинового оранжевого, что свидетельствовало о подкислении внутривезикулярной среды (рис. 1, слева). Последующее внесение протонофоров фторметоксикарбонил-цианидфенилгидразона (ФКФ) или грамицидина Д, диссипирую щих рН-градиент, приводило к быстрой релаксации оптического ответа. Максимальный уровень закисления достигался при рН среды 6.5. Субстратом для инициации процесса поглощения протонов везикулами плазмалеммы служил комплекс MgAT<b, транспорт протонов останавливался ЭДТА и не проявлялся в отсутствие ионов Mg2+. АТФ-зависимое закисление внутривезикулярного пространства было чувствительно к М,№-дшшктагексилкарбодшшиду (ДЦКД) - блокатору проводимости протонного канала tf-АТФаз и ортованадату - специфическому ингибитору

Н^-АТФаз Р-типа. Такое подавление активности АТФазы не сказывалось на 8 типа. Такое подавление активности АТФазы не сказывалось на величине рН-градиента, достигнутого к моменту внесения ингибитора, и она сохранялась на протяжении, по крайней мере, 10 мин, что подтверждает низкую пассивную протонную проницаемость везикул плазмалеммы.

Рис. 1. АТФ-зависимая генерация АрН (слева) и влияние анионов на АТФ-зависимую генерацию (справа) в везикулах плазмалеммы из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы. Измерения с АрН-индикатором акридиновым оранжевым и ДЧР-индикагором ДиБа-С4. (Гайворонская и др. 19В7. ДАН СССР. 292, 759-762).

Гидролиз АТФ также был чувствителен к ортованадату, но не изменялся в присутствии специфических ингибиторов митохондриальных АТФаз - олиго-мицина и азида. Неэффективным оказывался и нитрат - ингибитор тонопласт-ной АТФазы (табл. 1).

Доказательства электрогенности переноса протонов БГ-АТФазой были получены в экспериментах с потенциал-чувствительным флуоресцентным зондом ДиБа-С4(5) (рис. 1, справа). В отсутствие проникающих анионов добавление М^АТФ к суспензии везикул вызывало тушение флуоресценции зонда, отражающее генерацию трансмембранного потенциала со знаком "плюс" внутри везикул. Последующее внесение в среду М03~ приводило к восстановлению исходного уровня флуоресценции. Амплитуда и скорость АТФ-зависимого тушения флуоресценции зонда заметно уменьшалась, если в среде присутствовали ионы СГ. Учитывая низкую протонную проницаемость плазматических мембран, следует ожидать, что скорость гидролиза АТФ должна ограничиваться трансмембранным электрохимическим градиентом протонов (Лц.н+), т.е. должна находиться под протонным контролем. Действительно, внесение в среду ФКФ заметно ускоряло гидролиз АТФ (табл. 1). Больший эффект вызывало одновременное добавление ФКФ и валиномицина в присутствии KCl. Нигерицин, осуществляющий электронейтральный обмен К7/Н+ через мембрану, шунтировал ориентированный перенос протонов АТФазой, снимал протонный контроль, и этим определялось его стимулирующее влияние на активность фермента. Детергент Тритон Х-100, нарушая барьерные свойства мембран, увеличивал скорость гидролиза АТФ в тех же пределах. Поскольку детергент, делая доступной для субстрата и внутреннюю поверхность везикул, практически не выявлял дополнительной активности сверх того, что обнаруживалось в присутствии ионо-форов, можно предположить, что большая часть везикул ориентирована цито-плазматической стороной наружу.

Таблица 1. Свойства АТФ-гвдролазной активности везикул плазмалеммы

Вариант Активность, %

Контроль 100

ДЦКД, 15 мкМ 50

ДЭС, 1 мкМ 50

Ыа3\ГО4, 10 мкМ 50

Олигомицин, 4 мкг/мл 97

NaN3,1 мМ 100

NaN03, 50 мМ 100 pH = 8.0 5

ФКФ, 2 мкМ 186

ФКФ + валиномицин, 2 мкМ 195

Нигерицин, 2.5 мкМ 233

Тритон Х-100,0.01 % 262 ронскаяи др.1987. Физиология растений. 34,13-27).

Таким образом, работа электрогенной помпы Н'-АТФазы плазмалеммы, транспортирующей протоны, сопровождается генерацией трансмембранного градиента потенциала, позитивного снаружи и негативного с внутриклеточной стороны, и разности рН между цитозолем и апопластом. Возникает вопрос, каким образом КГ-АТФаза вовлекается в процесс регулирования внутриклеточного рН? рН-оптимум работы фермента лежит в пределах рН 6.0 - 6.5, и поэтому закисление цитозоля способно активировать КГ-АТФазу и, соответственно, транспорт протонов из клетки. Однако это противоречит тому, что в оптимальных условиях КГ-АТФаза работает в клетке при цитоплазматических рН, имеющих нейтральные значения, и с ее активностью связано энергетическое обеспечение процессов поглощения клеткой необходимых ионов и метаболитов. С другой стороны, как показано в экспериментах с везикулярными препаратами мембран, величина генерируемого градиента рН в сильной степени зависит от того, какие ионы транспортируются вместе с прогонами, шунтируя мембранный потенциал и конвертируя ДЧ' в ДрН. Отсюда не совсем понятно, что же регулируется клеткой: активность самого БГ-насоса или вторичные транспортные процессы управляют работой помпы? По-видимому, также не следует исключать возможности того, что везикулярные препараты плазматических мембран в процессе их получения могут терять необходимые для регуляции компоненты.

Измерение цитоплазматического рН методом захваченных флуоресцентных зондов

Постановка задачи требовала адекватного способа оценки быстрых и небольших по величине изменений рН, происходящих непосредственно в цигозо-ле. Дня этого был использован оптический метод измерения внутриклеточного рН с помощью захваченных зондов. Метод основан на том, что оптические свойства флуоресцеина (Ф) и его производного карбоксифлуоресцеина (КФ) изменяются пропорционально значениям рН среды, в которой они находятся. При физиологических значениях рН красители, имея рКа = 6.5, представлены в цитозоле как анионы (Thomas et al., 1982; Graber et al., 1986). В объем цитозоля рН-индикаторы вводятся в виде незаряженных и нефлуоресцирующих, но легко проникающих через мембрану эфиров. В цитозоле под действием неспецифических эстераз предшественники переходят в форму флуоресцирующих зондов.

Из рис. 2 видно, что скорости внутриклеточного накопления Ф и КФ протопластами были близки. Кинетика достигала насыщения за 30 минут инкубации. Скорость утечки захваченного Ф была несколько выше, чем у КФ, но не превышала 14% от его общего содержания в протопластах за час измерений.

Процесс внутриклеточного гидролиза идет только в живых клетках, и такое окрашивание часто используется для оценки их жизнеспособности (Ьагкш, 1976). Основная проблема, которая возникает при работе с захваченными в объеме цитозоля рН-индикаторами, связана с определением их точной локализации в многокомпартментной растительной клетке. Это обусловлено тем, что красители, будучи анионами, могут перераспределяться из цитозоля в орга-неллы (для растительной клетки в большую по объему вакуоль) или выводиться во внешнюю среду в результате работы анионных переносчиков и каналов, локализованных в мембранах. О локализации красителей в клетке можно судить по данным флуоресцентной микроскопии и по определяемому значению внутриклеточного рН. Для обоих красителей флуоресценция была в основном сосредоточена в цигозоле, вакуоль выглядела темным пятном. При этом наблюдали характерную гетерогенность протопластов по интенсивности окрашивания, что отражает, по-видимому, как разные значения рН в цитозоле отдельных, протопластов, так и способность клеток накапливать неодинаковые количества красителей. Определение точного объема протопластов, а тем более объема цитозоля, представляет значительную экспериментальную трудность. Не зная объема щггозоля, нельзя определить концентрацию индикатора и на этом основании калибровать наблюдаемые спектральные изменения в единицах рН. Поэтому для калибровки оптического сигнала обычно использовался специальный прием. Он состоял в том, что проницаемость плазматической мембраны нагруженных красителем протопластов повышалась внесением пермеа-билизующих соединений, которые не нарушали целостность протопластов. Это делалось в средах с разными значениями рН и регистрировались изменения, отражающие установление равновесия между цитозолем и средой (рис. 3). Этот прием получил название метода "нулевой точки" (ВаЪсоск, 1983).

12

Рис. 2. Кинетика накопления (1,2 протопластами и последующег удерживания (3,4) флуоресцеин (1,4) и карбоксифлуоресцеина (2,3) (Трофимова и Молотковский. 1988 Физиология растений. 35,629-640).

Анализ данных обнаруживал различные свойства Ф и КФ при измерении внутриклеточного рН. Это может быть результатом попадания некоторой части индикаторов в разные клеточные компартменты: для Ф - в митохондрии, для КФ - в вакуоль, что следует из стационарных значений рН, определенных методом "нулевой точки" (рис. 3) и представленных в табл. 2. Видно, что обеднение среды инкубации протопластов ионами приводит к снижению измеряемого внутриклеточного рН. Для КФ эта тенденция более выражена, что может свидетельствовать о перераспределении КФ как органического аниона в вакуоль. Поэтому индикаторы использовались в зависимости от состава среды так, чтобы измеряемый рН был ближе к нейтральному значению.

Рис. 3. Определение значения внутриклеточного рН методом "нулевой точки". Протопласты, нагруженные карбоксифлуоресцеином, суспендированы в среде I с разными значениями рН (рН0) (см. табл. 2). Стрелкой указано внесение дипггонина (А). Калибровка спектральных изменений в зависимости от рН*, (Б). (Трофимова и Молот-ковский. 1988. Физиология растений. 35, 629-640).

Флуоресцентное отношение, регистрируемое как отношение интенсивностей флуоресценции при 530 нм, возбуждаемой при 490 и 440 нм соответственно, наиболее чувствительно к изменениям рН и позволяет работать с высокой точностью с менее плотной суспензией нагруженных красителем протопластов. Величина отношения не зависела от внутриклеточной концентрации красителя, что дало возможность применять установленную калибровку в разных экспе

Таблица 2. Влияние состава среды на стационарное значение внутриклеточного рН, определяемого с помощью флуоресцеина (Ф) и карбоксифлуоресцеина (КФ).

Ионный состав среды Ф КФ

I. Макросоли по ЗЬепЫШШеЪгааЛ (24.7 мМКЖ>3, 1.6мММ£804, 2.6 мМ ЬТЦЩРО^ 1.3 мМ СаС12) 7.40±0.04 7.10+0.05

П. 5 мМ СаС12 7.30+0.05 6.95+0.05

Ш. 5 мМСа804 7.10+0.05 6.60±0.06

IV. 1 мМ СаЭО^, 2.5 мМК2804 6.95±0.05 6.45±0.05

Примечание: среды содержали 20 мМ МЕБ-ВТР буфер рН 6.0 и сорбит в концентрациях, дополняющих осмолярность среды до 400 мОсм. риментальных сериях (рис. 4). Флуоресцентное отношение для Ф в составе на-тивных протопластов (кривая 3) в отличие от протопластов пермеабилизован-9

Рис. 4. Флуоресцентное отношение (ЕюоЯЧм) как функция рН среды для флуоресцеина в растворе (1), в пермеабшшзованных в присутствии грамицидина Д (2) и дативных (3) протопластах. (Трофимова и др. 1996. Физиолошя растений. 43,519-526). ных практически не менялось в районе значений наружного рН 5.5-7.8. Эти данные являются прямым подтверждением существования рН-регулирукяцей системы в растительной клетке. Измерение рН цитозоля с помощью захваченных рН-индакаторов позволило регистрировать оптически усредненные значения этого параметра для популяции протопластов, изолированных из клеток суспензионной культуры корнеплода сахарной свеклы.

Протопласты взаимодействуют через плазматические мембраны с внешней средой, с которой они способны обмениваться ионами. Возможность контролировать состав наружной среды и сохранность компонентов цитозоля, имеющего буферную емкость и содержащего компоненты биохимического рН-стата, делают протопласты более адекватной моделью для поиска и выяснения механизмов регуляции внутриклеточного рН с участием транспортных процессов, чем препараты изолированных мембранных везикул.

Стационарное значение рН цитозоля в растительной клетке

Под регулированием рН в цитозоле обычно понимают процессы, участвующие как в формировании стационарного значения рН, величины, устанавливающейся в клетке, когда суммарное потребление и высвобождение протонов находится в равновесии, так и процессы, способные возвращать этот параметр к исходному значению после его смещения (Boron, 1983). В этом смысле рН-стат работает как при нормальных физиологических условиях, так и при стрессе. Для растительных клеток предполагаются две группы механизмов поддержания рН в цитозоле на определенном уровне, способствующем нормальному протеканию метаболических процессов. Это, по определению Smit и Raven (1979), "биохимический" и "биофизический" рН-статы растительной клетки. К первому относятся рН-зависимые реакции метаболизма органических кислот, связанные с высвобождением и связыванием свободных карбоксильных групп (Davies, 1973). Возможности этого механизма в настоящее время пересмотрены Sakano (1998), который для объяснения так называемой биохимической рефляции рН в цитозоле растительной клетки обосновал необходимость вклада процессов энергетического метаболизма, в особенности альтернативного пути дыхания. Ко второму типу рН-стата могут быть отнесены транспортные процессы, удаляющие избыток протонов из цитозоля во внешнюю среду или в органеллы. Такой транспорт протонов сопряжен с транспортом других ионов и не приводит к изменению электронейтральности цитозоля.

Спектральные свойства Ф обнаруживали быстрые и высокоамплитудные изменения в зависимости от условий аэрации суспензии протопластов (рис. 5). Барбатирование суспензии током азота вызывало высокоамплитудное падение оптического сигнала до нового стационарного уровня, соответствующего более низкому значению рН. Этот процесс полностью обращался барбатированием суспензии кислородом и мог быть многократно повторен. Смена аэробных и анаэробных условий сопровождалась зеркально обращенными смещениями рН. По логике регистрируемого явления можно полагать, что изменения отражают

15 включение и выключение дыхательной цепи, акцептирующей кислород и работающей как протонный насос. Согласно Эакапо (1998) основной ЬГ-потреб-ляющий процесс клетки корня - это окислительное фосфорилирование в митохондриях. Подтверждением служат результаты экспериментов с применением ионофоров, ингибиторов дыхания и ЬГ-АТФазы митохондрий. Валиномицин, конвертируя мембранный потенциал в электронейтральный трансмембранный градиент рН, должен вызывать повышение мигохондриального рН, что и реально обнаруживалось. Антимицин А, как ингибитор дыхания, должен имитировать анаэробиоз. Внесение в среду антимицина А вызывало падение рН, не имеющее лаг-фазы и близкое по кинетике и амплитуде с действием азота. Добавление олигомицина, ингибитора РоРгАТФазы, давало слабый, но вполне заметный эффект. Таким образом, можно полагать, что Ф отражает однонаправленные изменения рН, происходящие в митохондриях и в цитозоле. Из полученных данных также можно заключить, что стационарное значение рН цито-золя в растительной клетке определяется, в первую очередь, эффективностью сопряжения процессов окислительного фосфорилирования. 2

Амин

Рис. 5. Кинетика изменений внутриклеточного рН протопластов, нагруженных флуо-ресцеином. Стрелками указан момент добавления валиномицина (1), антимицина А (2), олигомицина (3) или начало барбатирования азотом (4) и кислородом (5). (Трофимова и Молотковский. 1988. Физиология растений. 35,629-640).

Другой важной чертой регулирования цитоплазматического рН растительной клетки является практическое отсутствие его зависимости от внеклеточного рН (рис. 4, кривая 3). С одной стороны, это прямое подтверждение низкой проницаемости шгазмалеммы для протонов. С другой, свидетельство строгой регуляции стационарного значения рН в цитозоле. В клетках животных, адаптированных к гомеостатируемой внеклеточной среде, внутриклеточный рН намного сильнее зависит от изменений величины рН окружения (Массив, 1988).

Следовательно, есть все основания считать, что в растительной клетке действует сложная многокомпонентная система регуляции рН в цитозоле. Высокая чувствительность этого параметра к ингибиторам энергетического метаболизма указывает, в первую очередь, на то, что именно эти процессы участвуют в установлении его стационарного значения.

Роль Н+-АТФазы плазмалеммы в регуляции рН цитозоля

Исследования механизмов функционирования №+/Н+ антипортера в клетках животных, позволили сформулировать необходимые и достаточные условия, позволяющие мембранной транспортной системе эффективно участвовать в регулировании цитоплазматического рН ((Мг^ет й а1., 1988). "Идеальное" рН-статирующее устройство, локализованное в мембране, должно удовлетворять ряду требований: 1) проявлять активность при смещении рН от физиологических значений, 2) активироваться при зачислении цитозоля, так как трансмембранная разность потенциалов и метаболизм редко приводят клетку к заще-лачиванйю, 3) быть чувствительным к значению рН, а не к трансмембранному градиешу АрН, и, кроме того, 4) источник энергии не должен быть связан с параметром, который регулируется, и быть независимым. Действительно, №+/ЕГ антипортер регулирует цитоплазматическин рН, электронейтрально обменивая ионы на КГ. Перенос протонов против градиента концентрации осуществляется в сопряжении с транспортом ионов которые впоследствии удаляются Ка7К+-АТФазой, и цикл замыкается. Практически ни одно из указанных условий не соблюдается, когда с этих позиций в растительной клетке рассматривается работа ВГ-АТФазы плазмалеммы, основной функцией которой является сопряжение гидролиза АТФ с генерацией Однако было проверено, каким образом подавление активности Н^-АТФазы в присутствии ингибиторов сказывается как на стационарном значении рН в цигозоле, так и на возможностях его регулирования.

Традиционным экспериментальным приемом, позволяющим исследовать клеточные рН-статирующие механизмы, является наблюдение за процессами восстановления внутриклеточного рН после его искусственно вызванного смещения в присутствии слабых кислот или ионофоров.

Рис. 6. Изменения рН цито золя (рН,;), индуцированны добавлением нигерицин (а), изобутирата (б) и аце тата (в) к протопластам, на груженным карбоксифлуо ресцеином. Среда измере ния П (см. табл. 2). (Тро фимова. 1992. Физиологи растений. 39, 5-14).

На рис. 6 представлены изменения внутриклеточного рН при некоторых способах кислотной нагрузки протопластов. В кинетике изменений цитоплаз-матического рН, кроме варианта с ацетатом, присутствовало две фазы: быстрое закисление рН цигозояя и более медленное его возвращение к исходному уровню. Ионофорный антибиотик нигерицин в среде без калия и при равенстве рН среды и цитозоля, осуществляет стехиометрический электронейтральный обмен внутриклеточного К+ на внеклеточный Н*". С этим процессом связано наблюдаемое закисление цитозоля. Затем следовала фаза релаксации (кривая а). При рН=7.0 добавление изобутирата в конечной концентрации 10 мМ (70 мкМ концентрация электронейтральной формы кислоты) сначала приводило к быстрому уменьшению внутриклеточного рН (кривая 6). Это связано с переносом через плазмалемму незаряженной формы кислоты и ее диссоциацией в цитозо-ле. Затем следовала фаза релаксации, характеризующая включение рН-регулирующих механизмов. При добавлении к протопластам ацетата в концентрации 12.5 мМ (также 70 мкМ кислота в протонированной форме) наблюдали только фазу закисления цитозоля (кривая в). Плазмаяемма протопластов, по-видимому, проницаема для аниона ацетата. Применение в подобных экспериментах проникающих слабых кислот требует выполнения двух условий: ограниченная проницаемость плазмалеммы для аниона и невозможность использования кислоты в метаболизме, поскольку только в этом случае будет наблюдаться фаза импульсного закисления цитозоля, обусловленная быстрым концентрационным распределением и последующей диссоциацией в цитозоле электронейтральной формы кислоты. В предварительных экспериментах было показано, что в идентичных условиях изобутират, нигерицин и ацетат не влияли на скорость поглощения кислорода протопластами, т.е. скорее всего не вовлекались в биохимический рН-стат клетки. Таким образом, существование фазы релаксации рН (кроме варианта с ацетатом) после импульсного закисления цитозоля не зависело от способа закисления. Активность рН-статирующих механизмов достаточно высока, так как восстановление цитоплазматического рН происходит даже в том случае, если из среды не удалены проникающие слабые кислоты и нигерицин. Присутствие фазы релаксации подтверждает активность быстродействующих механизмов рН-статирования в протопластах.

Предварительная обработка суспензии протопластов ортованадатом натрия подавляла начальную скорость восстановления рН после кислотной нагрузки нигерицином (рис. 7, кривые а и б). Ортованадат является специфическим ингибитором ЕГ-АТФаз Р-типа. Предобработка (15 мин, 600 мкМ ортованадат) не влияла на величину начального уменьшения рН, что свидетельствует о том, что не изменилось стационарное значение рН в цитозоле, и БГ-АТФаза не вовлечена в его установление. Последующее добавление ЫЬЦСЛ (20 тМ) приводило к быстрому защелачиванию, обусловленному диссипацией трансмембранного АрН проникновением в цитозоль ЫН3 и его протонированием (не показано). Это подтверждало то, что за время эксперимента КФ оставался внутри протопластов, а их жизнеспособность и целостность плазмалеммы сохранялись. Эффективное (до 80 %) ингибирование начальной скорости релаксации наблюдалось в присутствии 100 мкМ ДЭС (кривая в). Релаксация также была чувствительна к ингибитору ВГ-канала в составе ЕГ-АТФазы - ЭДАПК (кривая г) и к БН-реагенту №М (кривая д). Предварительное инкубирование протопластов в присутствии ингибитора анионной проводимости ДИДС (750 I

Рис. 7. Влияние ингибиторе НГ-АТФазы плазмалеммы н изменение щггоплазматиче ского рН (рНс), индуцирован ное зачислением цитозоля ни герицином. В среду измерени П (см. табл. 2) нредварительн внесены: ортованадат натри (б), диэтилстилбестрол (в), N этилмалеимид (г), 1-этшг-3(3 метиламинопропил)-1сарбоди-имид (д), 4,4'-диизотиоциа натстильбен-2,2-дисульфоно-вая кислота (е). Стрелкой ука зано внесение нигерицина (Трофимова. 1992. Физиологи растений. 39, 5-14). мкМ) полностью подавляло процесс восстановления pH после кислотной нагрузки нигерицином (кривая е). Частичное сохранение релаксации в присутствии ингибиторов НГ-АТФазы и полное ее ингибирование на фоне высоких концентраций ДИДС указывает на возможное участие в процессах регулирования цитоплазматического pH анион-транспортирующих механизмов.

Представленные эксперименты показывают, что ЕГ-АТФаза плазмалеммы принимает участие в процессах восстановления цитоплазматического pH после его импульсного смещения. При этом ее вклад в поддержание в норме стационарного значения этого параметра оказывается незначительным. Этот парадокс может быть объяснен следующим образом. Стехиометрия, установленная для НГ-АТФазы плазмалеммы высших растений такова - один транспортирующийся протон на одну молекулу гидролизуемой АТФ (Brauer et al., 1989; Briskin and Reynolds-Niesman, 1991). Стехиометрия является характеристикой фермента, отражающей свойства каталитического цикла, и, обычно, величина постоянная. Пределы активности протонного насоса устанавливаются свободной энергией, высвобождаемой при гидролизе АТФ. Если помпа работает в сопряжении, и утечки незначительны, то система достигает равновесия, когда электрохимигаеский градиент уравновешивает химическую движущую силу (АС). Если система переносит п ионов за цикл, то условие равновесия будет соответствовать уравнению:

Ав = п(2.3 К. Т ДрН + г Б V), где г - валентность иона, К. и Р - константы, V - трансмембранный потенциал. Принимая свободную энергию гидролиза АТФ АО = 42 кДж моль"1 и V = -200 мВ, можно показать, что для ЬГ-АТФазы с п = 1 максимальный рН градиент будет равен 4 единицам. При этих значениях помпа остановится. Это соответствует рН = 3 в апопласте. Обычно при рН цитозоля, близких к нейтральным, и рН апопласта, равном приблизительно 5 единицам, величина АрН на плазма-лемме соответствует 2. Отсюда можно сделать заключение, что ЕГ-А ТФаза плазмалеммы работает в растительной клетке далеко от равновесия, но тем самым обладает потенциалом для регуляции и участия в рН-стате. При гидролизе 1 молекулы АТФ высвобождается 1 протон, который собственно и транспортируется против градиента концентрации. Поэтому ингибирование активности помпы не должно приводить к существенным изменениям цитоплазматическо-го рН, что и наблюдается в экспериментах.

НСОз /СГ обмен как компонент рН-стата цитозоля

Равновесие между СС>2 и НС03~ в растворе бикарбоната определяется величиной рН и значением рКа образования НС03~, равной 6.2 (Во\уп, 1985). С помощью уравнения НепсЬкоп-НазБеИзакЬ можно оценить, что внесение Ыа-НСО3 в среду с рН = 6.6 в конечной концентрации 10 мМ сопровождается образованием 2.8 мМ СОг- Протопласты с рН =7.1 служат в качестве "ловушек" для С02, который диффундирует через мембрану в цитозоль по градиенту рН. Образование угольной кислоты и ее диссоциация приводят к закислению цитозоля. Процессы восстановления цитоплазматического рН после кислотной нагрузки в присутствии гообутирата и/или НСОэ~ различались по своей чувствительности к ингибитору КГ-АТФазы плазмалеммы - ДЭС. При кислотной нагрузке бикарбонатом нечувствительная к ингибиторам ЕГ-АТФазы часть релаксации полностью подавлялась в присутствии ДИДС (рис. 8, кривая 3). При номинальном отсутствии в среде НСОГ ДЭС полностью блокировал восстановление рН цитозоля (рис. 9, кривая 4).

РНс

7.2

7.0

6.8

2 мин

Рис. 8. Изменение цитоплазматического рН (рНс), индуцированное добавлением бикарбоната (указано стрелкой) к протопластам, нагруженным флуоресцеином. В среду измерения Ш (1-3) или П (4,5) предварительно внесены ДЭС (2,3,5) и ДИДС (3). (Трофимова и Молотковский. 1993. Физиология растений. 40, 93-99).

Начальная скорость восстановления рН цитозоля после закисления бикарбонатом уменьшалась при внесении в среду измерения ионов хлора (рис. 8, кривая 4). Если это происходило на фоне ДЭС, то процессы релаксации подавлялись полностью (рис. 8, кривая 5). Однако НС037С02 является одним из компонентов, определяющим буферную емкость цитозоля, которая может изменяться при добавлении в среду НС03~.

Проще всего оценить буферную емкость цитозоля по изменению рН, вызванному поступлением в цитозоль и диссоциацией там протонированной формы кислоты. Внесение в суспензию протопластов при рН = 6.6 10 мМ изобути-рата создавало в среде 170 мкМ концентрацию электронейтральной формы кислоты. Это вызывало снижение внутриклеточного рН на 0.5 единиц (рис. 9, кривая 3). Релаксация была чувствительна к ДЭС (кривая 4). Предварительное внесение 5 мМ бикарбоната натрия в среду и инкубация в ней протопластов уменьшали влияние изобутирата - сдвиг составлял 0.4 единицы рН (кривая 1). При этом присутствовала ДЭС-нечувствительная часть релаксации (кривая 2). Можно заключить, что представленные данные, по крайней мере, по двум параметрам - зависимость от градиента ионов хлора через плазмалемму и чувствительность к ДИДС - указывают на возможность работы анионного антипортера в протопластах. Однако основным требованием для эффективной работы этого механизма является присутствие трансмембранного градиента ионов СГ.

7.0

6.8

7-2r II

6.6

РНс

2 мин 1

Рис. 9. Влияние бикарбонат на буферную емкость цитозол и кинетику восстановления р цитозоля (рНс) после закисле ния, индуцированного добав лением изобугарата (указан стрелками) к протопластам нагруженным флуореецеином В среду измерения Ш (см табл. 2) предварительно внесе ны бикарбонат (1,2) и ДЭ (2,4). (Трофимова и Молотков ский. 1993. Физиология расте ний. 40, 93-99).

Величина pH цитозоля, как и трансмембранный потенциал, является интегральным параметром, который отражает суммарное распределение ионов и, в первую очередь, сильных катионов и анионов по обе стороны мембраны (Stewart, 1983). Поток Н4" через мембрану сам по себе не может привести к значительному изменению pH. Только сопряженный с переносом протонов транспорт ионов через мембрану ведет к изменению pH компартмента, что обусловлено, с одной стороны, низкой константой диссоциации воды и ее высокой концентрацией, а с другой - ограниченной электрической емкостью мембраны и необходимостью сохранения в транспортных процессах электронейтральности растворов, разделенных этой мембраной. Так изменение концентрации катионов будет вести к защелачиванию цитозоля, а анионов - к его закислению. Из этого следует, что при работе ТГ-АТФазы плазмалеммы, транспортирующей протоны из клетки, pH не будет изменяться до тех пор, пока не будут котранс-портироваться другие ионы. Это в явном виде было представлено в экспериментах с изолированными препаратами плазмалеммы. Внутривезикулярное за-кисление происходило только при поглощении протонов в симпорте с ионами хлора, хотя при этом одновременно наблюдалась диссипация трансмембранного потенциала (см. рис. 1).

Активация Н+-АТФазы плазмалеммы фузикокцином

Фузикокцин (ФК), дитерпеновый гликозид и токсин паразитического гриба Fusicoccum amygdali (Ballio et al., 1964) - оказывает свое действие практически на все высшие растения (Магге, 1979). Основной молекулярной мишенью фузикокцина служит ИГ-АТФаза хшазмалеммы. Хорошо известно, что БГ-АТФаза в препаратах хшазмалеммы, изолированных из обработанных фузикокцином in vivo растительных тканей находится в активированном состоянии (Aducci et al. 1995). Это активное состояние характеризуется увеличенным значением V^, сниженным значением Кт и сдвигом рН оптимума в область нейтральных значений рН. Говоря другими словами, повышается сродство фермента к протонам, что ведет к смещению его рН оптимума в область, характерную для нейтральных рН цитозоля. Такие же свойства обнаруживает íf-АТФаза, лишенная своего автоингибиторного регуляторного С-домена. И это указывает на то, что взаимодействие с фузикокцином ведет к конформационным перестройкам в Н-АТФазе плазмалеммы (Palmgren et al., 1990).

ФК действовал на клетки суспензионной культуры сахарной свеклы также, как и на большинство других растительных объектов, т.е. активировал ТГ-АТФазу и соответственно ЕГ-транспорт, направленный из клеток в наружную среду (табл. 3).

Таблица 3. Чувствительность ЕГ-транспорта клеток сахарной свеклы к 1 мкМ ФК в зависимости от времени культивирования после переноса на свежую среду

Показатели Возраст культуры, сутки

7 14 21

Закисление наружной среды (-ФК), ДрН 0.012 0.086 0.16

Закисление наружной среды (+ФК), ДрН 0.2 0.41 0.33

ДрН(+ФК)/ДрН(-ФК) 16.6 4.8 2.1

Трофимова и др. 1996. Физиология растений. 43,519-526).

Видно, что относительное воздействие ФК уменьшалось по мере увеличения времени от момента пересадки клеток на свежую среду культивирования. Следует также отметить, что по мере старения культуры активность НГ-транспорта в отсутствие ФК возрастала. Истощение питательной среды к концу культивирования, по-видимому, включает внутренние механизмы клетки, переводящие ЬГ-АТФазу в активированное состояние. Эффекты ФК исследовались на наиболее чувствительных к воздействию клетках, находящихся в логарифмической фазе роста (7-9 дней после пересадки) и изолированных из них протопластах.

Время, мин

Рис. 10. Кинетика связывания [3Н]дигидроФК с протопластами при концентрации меченного лиганда 1 иМ (1) и 0.1 мхМ (2). На вставке показана концентрационная зависимость связывания [3Н]дишдроФК. (Трофимова и др. 1996. Физиология растений. 43, 519-526).

На рис. 10 представлена концентрационная зависимость связывания [Н3]дигидроФК с протопластами, изолированными из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы, и кинетика связывания. Оценка параметров связывания в координатах Скэтчарда выявила присутствие двух сайтов, различающихся по сродству к ФК. Параметры связывания были: для высокоаффинного сайта Кп=0.85±0.12 нМ и Втах=(0.12±0.04)х10б мест/протопласт, для низкоаффинного Ко=200±90 нМ и Вшах=(2.7±0.3)х106 мест/протопласт. Видно также, что насыщение связывающих мест при обеих концентрациях [Н3]дигидроФК завершалось за 15-20 мин.

Протопласты .имели стационарное значение рН=6.9±0.07 и отвечали на экзогенный ФК защелачиванием цитозоля (рис. 11). Этот эффект не обнаруживался в присутствии специфического ингибитора Н'-АТФазы эритрозина В. Также было проверено, каким образом активация НГ-АТФазы в присутствии ФК проявляется в процессах регуляции цитопяазматического рН после кислотной нагрузки. В этих экспериментах выяснилось, что добавление изобутирата к протопластам, предынкубированным с ФК, сопровождалось более значительным закислением цитозоля, но не явной стимуляцией процесса восстановления рН (рис. 12). Это можно объяснить тем, что сдвиг рН в цитозоле определяется pHi ^490/^440

Рис. 11. Кинетика изменений цитоплазмагиче-ского рН (рН;) протопластов, нагруженных флуоресцеином в среде IV (см. табл. 2), в присутствии ФК (7) и инги-бврование эффекта эритрозином В (2). (Трофимова и др. 1997. Физиология растений. 44,652-657). долей проникающей кислоты, которая диссоциирует в зависимости отрН. Более высокое значение цитоплазматического рН в присутствии ФК способствует диссоциации изобутирата в большей степени. Таким образом получалось, что, по-видимому, само закисление уже активировало БГ-АТФазу и определяло ее участие в рН-стате. loo- - изобутират ts о i . о контроль о - • О) u so. ФК

--1-- i о 5 Ю

Время (мин)

Рис. 12. Изменение флуоресценции коетрольных и обработанных в течение 15 мин ФК прото-пластов, нагруженных флуоресцеином в среде IV (см. табл. 2). (Trofimova et al, 1997. Physiol. Plant. 99,221-226).

На рис. 13 представлена концентрационная зависимость эффекта ФК на цитоплазматический рН. Из двух способов оценки, указанных выше, следовало, что величина ЕС50 лежит в диапазоне концентраций ФК 60-80 нМ, которая занимает промежуточное значение между Кс высоко- и низкоаффинных сайтов. Поэтому можно предположить, что для проявления физиологического эффекта ФК необходимо присутствие обоих типов сайтов связывания.

100 I

150 ■8-то iC в О

Рис. 13. Концентрационная зависимость эффекта ФК на протопласты, нагруженные флуоресцеином в среде IV (см. табл. 2), полученная как F490/F440 (°) или как разность AF490 в начальном ответе на изобутират контрольных и обработанных ФК протопластов (•). За 100% принят эффект 1 мкМ ФК за 15 мин. (Trofimova et al. 1997. Physiol. Plant. 99,221-226).

Из приведенных данных следует, что защелачивание цитозоля в присутствии ФК обусловлено активацией ЕГ-АТФазы и действительно связано с его взаимодействием с ФК-связывающими белками. Кроме того, поскольку активация наступает при нейтральных рН цитозоля, это может указывать также на то, что не только значение рН, а еще и изменение конформации фермента, как это происходит при связывании ФК, отвечает за регуляцию щггоплазматического рН при работе Н*-А.ТФазы.

Действительно, исследования последнего времени показали, что ФК связывается с белковым комплексом плазматической мембраны растительных клеток. Этот комплекс включает ЕГ-АТФазу и димер регуляторных белков 14-3-3

0 9 8 7 6 5 4 ФК[-log М ]

Korthout et al., 1994; Marra et al., 1994; Oecking et al., 1994) и обладает уникальным свойством связывать ФК с высокой специфичностью. Регуляторные белки 14-3-3 выполняют в клетках адапторную функцию молекулярных шалеронов в путях трансдукции сигналов (Yaffe, 2002). Кроме того, в настоящее время показано, что димер 14-3-3 белков непосредственно взаимодействуют с С-концевым фрагментом ЕГ-АТФазы (Jahn et al., 1997; Fullone et al., 1998; Piotrovski et al., 1998), и ФК стабилизирует такой комплекс. Аффинность и количество ФК-связывающих сайтов не постоянны и изменяются в мембранах при различных воздействиях, отражая степень и силу взаимодействия между 14-3-3 белками и ЕГ-АТФазой (Бабаков, 1998).

Изменение взаимодействия между 14-3-3 белками и ВГ-АТФазой как способ регуляции ее активности в стрессовых условиях

Первые 14-3-3 белки в растениях были идентифицированы как транскрипты, аккумулирующиеся при воздействии NaCl и низких температур на каллус и проростки риса (Kidou et al. 1993). Однако функции этих белков и возможная роль в активации Р-Г-АТФазы при стрессовом ответе растительной клетки оставались неизвестными. Исходя из данных, что при образовании ФК-связывакяцих сайтов Н -АТФаза плазмалеммы переходит в активированное состояние, и используя связывание ФК с плазматическими мембранами как показатель образования комплекса между димером 14-3-3 белков и АТФазой, было исследовано участие этих белков в регуляции ЬГ-АТФазы при осмотическом стрессе.

Осмотический стресс относится к ситуациям, когда ограничение поступления воды лимитирует рост и развитие растений. Обычно это результат засухи или засоления, однако низкие температуры также могут сопровождаться потерей возможности поглощать воду. Экспериментальный прием создания осмотического стресса - резкое понижение осмотического потенциала наружной среды, был использован в настоящей работе.

На рис. 14 показано, что при переносе клеток суспензионной культуры сахарной свеклы в среды с повышающимися концентрациями сорбита происходило постепенное изменение скорости внеклеточного закисления. Интенсивность выброса Н*, характеризующая транспортную активность Н^-АТФазы, зависела от концентрации сорбита, достигала максимума при 0.3 М, а затем пос

0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7

Сорбит, М

Рис. 14. Транспорт ВТ из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы при осмотическом стрессе в присутствии сорбита Скорость выхода НГ измерялась через 30 мин после внесения сорбита в среду измерения как разность опытного (а) и контрольного (Ь) вариантов (см. вставку). (Babakov et al. 2000. Planta. 211,446-448). тепенно снижалась. Согласно данным микроскопии концентрация сорбита 0.3 М соответствует предельным значениям, еще не вызывающим плазмолиза внутриклеточного содержимого клеток суспензионной культуры сахарной свеклы. Из контрольных и предынкубированных в течение 30 мин в 0.3 М сорбите клеток получали препарат плазматических мембран, который использовали для анализа параметров связывания ФК, оценки содержания 14-3-3 белков и tT-АТФаз в мембранах, определения АТФ-гидролазной активности. Было обнаружено, что АТФазная активность плазмалеммы, изолированной из клеток, подвергнутых действию осмотического стресса, изменялась незначительно и превышала только на 20-30% активность, измеренную в контроле. При повышении осмолярности среды инкубации клеток также не наблюдалось увеличения количества молекул Е^-АТФаз в изолированных плазматических мембранах, однако в них значительно в 4-6 раз возрастало количество высокоаффинных ФК-связывающих сайтов (рис. 15). Аффинность при этом практически не менялась. Аналогичные результаты были получены, когда осмолярность среды изменялась обработкой клеток 0.15М NaCl. Как показано на рис.15, осмотический стресс приводил к возрастанию количества 14-3-3 белков, ассоциированных с плазматическими мембранами. Этот эффект наблюдался при обоих способах воздействия, причем увеличение числа ФК-связывающих сайтов всегда превышало рост количества 14-3-3 белков.

1 2 3 а) домер 14-3-3 згЧг " фб) белки 14-3-3, отн.ед. 1.0 2.3 + 0.5 3.4+0.6 в) ФКСС, пмоль/мг белка 3.1 + 0.5 [11 14.5 + 1,3 [4.7) 15.5 +1.2 (53

Рис. 15. Изменения количества ФК-связывающих сайтов и содержания 14-3-3 белков в плазматических мембранах, изолированных из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы, подвергнутых осмотическому стрессу: 1 - контроль, 2- 0.3 М сорбит в течение 30 мин, 3-0.15 MNaCl в течение 30 мин. а) Вестерн-блог анализ, б) результаты сканирования, в) количество ФК-связывающих сайтов. (Babakov et al. 2000. Planta. 211,446-448).

Привлекая данные о том, что высокоаффинный сайт связывания ФК включает комплекс димера 14-3-3 белков с С-концевым доменом Н^-АТФазы (Baunsgaard et al., 1998; Piotrowski et al., 1998; Oecking and Hagemam, 1999), можно сделать заключение о вовлечении 14-3-3 белков в активацию ЕГ-АТФазы при осмотическом стрессе. Такая активация включает значительное усиление ЬГ-транспорта, но практически не затрагивает гидролитическую активность фермента. Это указывает на то, что взаимодействие 14-3-3 белков с Н^-АТФазой усиливает степень сопряжения между гидролизом АТФ и транспортом протонов. К такому же результату приводят и другие изменения, направленные на С-концевой домен фермента (точечные мутации или его протео-литическое удаление), которые практически не сказываются на параметрах гидролиза АТФ, но значительно усиливают транспортную функцию, т.е. усиливают сопряжение между этими двумя процессами (Johansson et al., 1993; Mosromme et al., 1996). Увеличение {^-транспортирующей активности W-АТФазы необходимо, чтобы адаптировать ионный гомеостаз клетки к новым условиям окружения, создать движущую силу для поглощения ионов и восстановления тургорного давления. Таким образом, в стрессовых условиях происходит перераспределение 14-3-3 белков, т. е. возрастает количество белков, ассоциированных с плазматической мембраной. Увеличение числа образующихся комплексов 14-3-3 белков с ВГ-АТФазой ведет к увеличению ее активности. Это регулирующее взаимодействие, которое активирует НГ-АТФазу, работает как защитная система в стрессовых условиях, сопровождающихся изменением тургорного давления.

Комплекс между 14-3-3 белками и ЕГ-АТФазой как сенсор изменений рН в цитозоле

Стрессовые воздействия на растительную клетку такие, как низкие температуры (Yoshida, 1994), гипоксия (Xia and Roberts, 1996), засуха (Yene Kamp, 1989) и засоление (Niu et al., 1995), сопровождаются зачислением цитозоля. Регулируется ли активность ЕГ-АТФазы непосредственно изменением рН, или работает другой механизм, обусловленный рН-зависимым взаимодействием фермента с 14-3-3 белками? В качестве экспериментального подхода, позволяющего оценить возможное взаимодействие, было использовано связывание фузикокцина, характеризующее число образованных комплексов между диме-рами 14-3-3 белков и КГ-АТФазы и переход фермента в активное состояние.

Из представленных на рис. 16 данных видно, что смещение цитоплазмати-ческого рН в кислую область приводило к существенному и резкому возраста

Рис. 16. Связывание [3Н]дигидроФК (10 нМ) с протопластами в зависимости от внутриклеточного рН (/), выравнивания внутри- и внеклеточного рН (2) и внеклеточного рН (3). 100% соответствовало связыванию 15 10"15 моля [3Н]дигидроФК с 105 протопластов в среде измерения IV с рН 7.0. (Трофимова и др. 1997. Физиология растений. 44,652-657). Яш О о -¿т б00 -

1400 т D. ч 2 \ 200 «К И ¡5 П - х \ 4 -~Т N СЖ N т

1 1 --- ■ i i i ti

2 и ñ 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 рН ншо связывания ФК (кривая /), при выравнивании наружного и внутреннего рН зависимость сохранялась, но теряла кооперативный характер и становилась практически линейной (кривая 2), рН среды инкубации не влиял на связывание (кривая 3).

Чтобы выяснить причину такого возрастания связывания при закислении цитозоля были проанализированы концентрационные зависимости связывания [Н3]дигидрофузикокцина с протопластами в координатах Скэтчарда при добавлении к ним разных количеств изобутирата. Связывание и рН цитозоля измеряли на одних и тех же протопластах.

Из рис. 17 видно, что в стандартных условиях на плазматической мембране присутствовали высоко-и низкоаффинные сайты, различающиеся по сродству к [Н3]дшгидрофузикокцину на два порядка (I). При постепенном закислении цитозоля наблюдался переход низкоаффинных сайтов в высокоаффинные (П иШ) и при рН = 6.6 концентрационная зависимость соответствовала одноместной модели связывания (IV). Величина константы связывания ФК при этом приобретала промежуточное значение между величинами для высоко- и низкоаффинных сайтов -19 + 3 нМ, а общее количество сайтов не менялось. Такое возрастание аффинности носило обратимый характер, поскольку после отмывки изобутирата концентрационная зависимость связывания возвращалась к первоначальному виду (V).

Рнс. 17. Концентрационные зависимости связывания [3Н]дагидроФК с протопластами при изменении рН цитозоля в координатах Скэтчарда. Изменения рН вызывали добавлением изобутирата (1-1У) и его отмывкой (V). I - рН = 7.0, П - рН = 6.9, Ш - рН = 6.75, IV - рН = 6.6, V - рН = 6.95. В - концентрация связанного [ ЩцигидроФК, р -концентрация свободного [3Н]дигидроФК (нМ). (Трофимова и др. 1997. Физиология растений. 44,652-657).

Полученные данные указывают на то, что в плазматических мембранах клеток растений в стандартных условиях существует равновесие между ФК-связывающими сайтами с разной аффинностью. При закислении цитозоля это равновесие смещается в сторону высокоаффинной формы, происходит в узком диапазоне рН и обратимо. Характер изменений аффинности в зависимости от рН цитозоля носит кооперативный характер и отражает, по-видимому, конфор-мационные изменения в ФК-связываюгцем сайте, включающем ЕГ-АТФазу и 14-3-3 белки. Эти процессы менее выражены, когда рН-зависимость связывания ФК измерялась в отсутствие рН градиента, т. е. имитировала ситуацию с изолированными препаратами мембран, с которыми ФК обычно связывается только с высокой аффинностью. Связывание ФК с препаратом плазмалеммы имеет максимум при рН = 6.0 и плавно уменьшается к рН = 7.0 (Schulz et al., 1990, Сос-cuci et al., 1991). Поэтому вполне вероятно, что не только значение рН само по себе, но и конформация ЕГ-АТФазы важны для формирования высокоаффинного связывания.

В нативных протопластах при изменении рН может происходить протони-рование аминокислотных остатков автоингибиторного С-домена НГ-АТФазы, которое способствует связыванию обоих белков димера 14-3-3 с ферментом. Одного с предпоследним, возможно фосфоршшрованным треонином (YpTV), а другого - с аминокислотами (905-922), локализованными ближе к N-концу С-домена ЕГ-АТФазы (Fulsgang et al., 1999; Svennelid et al., 1999; Maudoux et al., 2000; Jelich-Ottmaxm et al. 2001). По-видимому, ФК может имитировать прото-нирование С-домена, увеличивая сродство регуляторных белков 14-3-3 к этому участку молекулы НГ-АТФазы. При кислотной нагрузке протопластов не наблюдалось изменения общего числа ФК-связывающих сайтов, т. е. можно предположить, что переход низкоаффинных сайтов в высокоаффинные определяется изменением характера взаимодействия в уже существующих комплексах. Реакция на осмотический стресс характеризовалась резким увеличением количества связывающих ФК сайтов, что может быть обусловлено тем, что цепь событий, приводящая в результате к активации Ef-АТФазы, оказывается много сложнее и включает еще ряд событий. Вероятно, что не только закисле-ние цитозоля при осмотическом стрессе, но и процессы фосфорилирова-ния/дефосорилирования также включаются в активацию ВГ-АТФазы (Shaller and Sussman, 1988), что и ведет к возрастанию количества потенциальных мест для ассоциации с ней цитоплазматических 14-3-3 белков. Предполагаемый ход событий представлен на схеме (рис. 18).

Рис. 18. Предполагаемая схема событий, приводящая к рН-зависимой активации КГ-АТФазы илазмалеммы в присутствии 14-3-3 белков и фузикокцина. CDPK - Са2+-зависимая прогеинкиназа; двойные стрелки указывают на обратимые процессы, одинарные - на необратимые.

Регуляция тургорного давленая растительной клетки: возможная роль ак-вапоринов

Исследование водного обмена в растениях привело к формированию так называемой композитной модели водного транспорта, в основу которой положено существование путей переноса воды, различающихся по сопротивлению потоку (Steudle and Henzler, 1995). Первый путь, по которому возможно движение воды в обход клеточного содержимого по сосудам ксилемы и клеточным стенкам - внеклеточный или апопластный, имеет высокую гидравлическую проводимость. Второй путь - трансклеточный включает перенос воды через

34 мембраны и плачмодесмы живых клеток. Трансмембранный путь обладает наибольшим сопротивлением потоку воды. Вклады всех возможных путей в общий поток воды в растении неодинаковы и доля их участия может варьировать, в первую очередь, в зависимости от изменяющихся условий среды. Так вклад трансмембранного пути становится значимым, когда основной транспирацион-ный поток по сосудам ксилемы и апопласту заблокирован в условиях водного стресса или когда вода транспортируется из клетки в клетку лигнифицирован-ных или суберинизированных тканей растения. Основной движущей силой транспорта воды в таких случаях выступает градиент осмотического потенциала.

Изучение механизмов трансмембранного транспорта воды долгое время базировалось на представлениях, что водная проницаемость клеточных мембран обусловлена диффузией ее молекул через липидный бислой и не может претерпевать существенных изменений. Однако к настоящему времени накоплено немало данных о том, что процесс транспорта воды через клеточные мембраны во многих случаях обнаруживает характеристики, не свойственные гидравлической проводимости липидного бислоя, а именно: 1) достаточно высокие значения коэффициентов осмотической водной проницаемости (> 100 мкм/с); 2) низкую энергию активации (2-4 ккал/моль); 3) ингибирующее действие соединений ртути (Маиге1,1997) В связи с этим, обнаружение в последние годы в мембранах животных и растительных клеток аквапоринов - белков, облегчающих пассивный трансмембранный перенос молекул воды, в сильной степени стимулировало интерес исследователей к выяснению механизмов, определяющих динамику транспорта воды в растениях (Туеппаа ег а!., 1999). Из-за присутствия аквапоринов в клеточных мембранах их водная проницаемость может варьировать либо в результате изменения активности таких белков, обусловленного открыванием/закрыванием их гидрофильной поры, либо за счет изменения их количества на единицу площади мембраны. Поэтому очевидно, что исследования, связанные с идентификацией, выяснением особенностей функционирования и способов регуляции активности аквапоринов, весьма актуальны для понимания механизмов регуляции транспорта воды в растительных тканях.

На рис. 19 представлена кинетика изменений светорассеяния суспензий везикул тонопласта (А) и плазмалеммы (Б), обусловленных их осмотическим сжатием. Кинетические кривые хорошо аппроксимируются простыми экспоненциальными зависимостями с существенно различающимися константами скорости. Последние были использованы для расчета коэффициентов водной проницаемости мембран. Оказалось, что значение этого параметра для тоно-пласта (165 + 7 мкм сек'1) во много раз превышает соответствующую величину для плазмалеммы (11 ±2 мкм сек"1). Столь существенное различие в коэффициентах водной проницаемости мембран может указывать на функционирование в них различных механизмов транспорта воды.

Рис. 19. Кинетика изменения интенсивности светорассеяния суспензий везикул тоно-пласта (а) и плазмалеммы (б) при их осмотическом сжатии. Измерения проведены в режиме остановленного потока после смешивания равных объемов суспензии везикул в 0.1 М сахарозе с раствором сахарозы. Конечная концентрация сахарозы в среде после смешивания составляла 0.1 (1), 0.2 (2), 0.3 (3) и 0.4 М {4). (Трофимова и др. 2001. Физиология растений 48,341-348).

Рис. 20 показывает, что амплитуды светорассеяния для тонопласта (кривая 3) и плазмалеммы (кривая 2) находятся в прямой зависимости от величины задаваемого трансмембранного осмотического градиента, тогда как соответствующие коэффициенты проницаемости такой зависимости практически не обнаруживают (кривые 1 и 4).

Рис. 20. Зависимость коэффициентов осмотической водной проницаемости (Р) плазмалеммы (4) и тонопласта (У) и амплитуды светорассеяния их везикулярных суспензий (2 и 3, соответственно) от величины осмотического градиента. (Трофимова и др. 2001. Физиологая растений 48, 341-348).

Поскольку одним из факторов, определяющих кинетику транспорта воды через клеточные мембраны, может быть фазовое состояние их липидного бис-лоя, было проверено, не может ли оно лежать в основе наблюдаемого различия в водной проница-емости тонопласта и плазмалеммы. С этой целью была оценена анизотропия флуоресценции липофильного зонда дифенилгексатриена, способного служить индикатором микровязкости углеводородной зоны мембран, причем ее жидкому и твердому состоянию соответствуют значения данного параметра 0.1 и 0.3 соответственно (van Blitterswyk et al. 1981). Температурная зависимость анизотропии флуоресценции дифенилгексатриена в тоно-пласте (кривая 1) ив плазмалемме (кривая 2) представлена на рис. 21. Значения анизотропии близки для обоих типов мембран и не могут быть причиной различий в водной проницаемости.

Рис. 21. Температурная зависимость анизотропии флуоресценции дифенилгексатрие-на, встроенного в везикулы тонопласта (J) и плазмалеммы (2). (Трофимова и др. 2001. Физиология растений 48, 341-348).

Высокая проницаемость тонопласта по сравнению с плазмалеммой, вероятно, существенна для растительной клетки, имеющей большую вакуоль. Когда объем цитозоля не превышает 5-10% от объема клетки, а клетка начинает терять воду при осмотическом стрессе, различие проницаемостей становится значимым. Вакуоль с высокой проницаемостью тонопласта для воды способна тушить резкие изменения малого объема цитозоля. Поэтому время, за которое в результате изменится объем клетки, будет определяться водной проницаемостью плазмалеммы.

На рис. 22 представлена pH-зависимость осмотической водной проницаемости плазмалеммы и тонопласта из корней кукурузы. Проницаемость тонопласта практически не изменялась в широком диапазоне значений pH в отличие от водной проницаемости плазмалеммы, которая увеличивалась в области щелочных значений. Обнаруженная pH-зависимая регуляция водной проницаемости плазмалеммы может быть связана с pH-чувствительность аквапоринов плазматических мембран, которая определяется, скорее всего, значениями pl этих белков, лежащих в щелочной области, в отличие от кислых значений для аквапоринов тонопласта (Johansson et al., 2000).

180 плазмапемма

30 0 , 11 5 6 7 8 9 рН

Рис. 22. рН-зависимость коэффициента осмотической водной проницаемости (Р03) плазмалеммы и тонопласта.

Стрессовые воздействия, приводящие к закисиению цитозоля, могут инги-бировать водную проницаемость плазмалеммы. Отсюда резонно предположить, что существует вероятность регулирования времени потери тургорного давления в клетке при осмотическом стрессе. Когда же условия среды оптимальны для роста, в клетках активно работает ЬГ-АТФаза, и устанавливаются нейтральные значения рН (возможно более щелочные в примембранных областях). Это приводит к повышению водной проницаемости плазмалеммы и ускоряет установление осмотического равновесия в растительной клетке.

Роль изменений Са2+-гомеостаза при тепловом стрессе

Растения, как и все живые организмы, отвечают на повышение температуры активацией экспрессии небольшого числа эволюционно консервативных генов теплового шока и новообразованием так называемых белков теплового шока (БИЛ). Аккумуляция БТШ, один из быстрых ответов на стресс, носит временный характер и коррелирует, как правило, с повышением термотолерантности. При гипертермии БТШ облегчают транспорт макромолекул через мембраны, обеспечивают правильную сборку белков, дезагрегацию неправильно собранных структур, а также распознавание и деградацию денатурированных полипептидов (БсЫектцег, 1990; У1ег1т& 1991). Не вызывает сомнения, что в передаче внешнего сигнала к соответствующим эффекторным системам клетки растений могут играть роль транзиторные изменения уровня свободного кальция в цитозоле. В пользу такой точки зрения свидетельствуют наблюдаемые при повышенных температурах изменения концентрации кальция в цитозоле (Бияшеваи др., 1993; Gong et al. 1998).

В работе была сделана попытка, оценить потенциальную роль Са-гомеостаза в регуляции синтеза БТШ и развитии термотолерантности, а также определить, с каким клеточным депо кальция связаны эффекты теплового шока.

Клетки суспензионной культуры сахарной свеклы в стандартной среде, соч 39°С, обнаруживали ингибирование

Рис. 23. Влияние внеклеточной концентрации кальция на поглощение (вверху) и включение (внизу) [358]метиовина в клетки суспензионной культуры сахарной свеклы при 25 (о) и 39°С (•). Клетки сначала предын-кубировали в стандартной среде, содержащей 1.5 мМ СаС12, в течение 2 ч. Затем переносили на среды, содержащие [358]метионин и различные концентрации СаС1г, и инкубировали 1 ч. Поглощение и включение при 25 (4.28 106 и 1.56 106 срм 10"6 мг'белка ч1) и 39°С (1.86 106 и 0.46 106 срм 10^ мг'белка ч'1) и 1.5 мМ СаОг соответствовало 100%. (Trofimova et al. 1999. Physiol. Plant. 105, 67-73).

0 10 20 30 40 SO Ca", mM синтеза основных белков и активацию синтеза БТШ. Эффекты внеклеточной концентрации кальция на синтез белка и поглощение [358]метионина при нормальной и повышенной температурах представлены на рис. 23. При 25°С оба процесса значительно стимулировались при увеличении концентрации внеклеточного кальция до 10-15 мМ. При 39°С стимуляция выявлялась, но не так выражено. В обоих температурных вариантах поглощение усиливалось в большей степени, что указывает, скорее всего, на высокую чувствительность к внекледержавшей 1.5 мМ СаС1г, при прогреве 1 точному кальцию транспортирующей аминокислоты системы, работающей как протонный симпортер (Ortiz-Lopez et al., 2000).

Однако, как следует из рис. 24, при долговременном просеве клеток в присутствии 15 мМ СаС12 их повреждаемость сильно возрастала. При инкубации же клеток с СаС12, но при 25° С, или при прогреве в стандартных условиях, их жизнеспособность сохранялась на уровне контроля в течение не менее 4 ч.

Рис. 24. Влияние внеклеточного кальция и температуры на повреждение клеток суспензионной культуры сахарной свеклы. Повреждение клеток определяли как включение красителя Эванса голубого (Абоо)- (Трофимова и др. 1997. Физиология растений. 44,511-516).

1 2 3

Время инкубации, ч

Удаление внеклеточного кальция в присутствии ЭГТА (Са-дефицитные клетки) сопровождалось почти 20-кратным ингибированием синтеза бежа, измеренного при 25°С через 1 ч после добавления [358]метионина (табл. 4). Увеличение концентрации внеклеточного кальция до начального уровня (Са-восстановленные клетки) сопровождалось некоторым восстановлением белкового синтеза. Поглощение же не было столь чувствительно к такому воздействию. Для Са-восстановленных клеток при 39°С были характерны как увеличенное поглощение [358]метионина, так и его включение в белок. Другими словами, при повышенных температурах внеклеточное депо кальция (кальций клеточных стенок и апопласта) оказывалось не столь значимым, как это имело место в нормальных условиях.

Денситометрическое сканирование профиля БТШ, синтезированных в Са-обедненных и Са-восстановленных клетках, показало, что основная масса полипептидов была практически идентична для обоих типов клеток (табл. 5).

Можно выделить БТШ96 и 76, которые вообще не обнаруживались в Са-дефицитных клетка.

Таблица 4. Поглощение и включение [358]метионина (срм 10"6 мг'белка ч"1) Са-дефицитиыми и Са-восстановленными клетками суспензионной культуры сахарной свеклы.

Инкубация (° С) Поглощение Включение

Са-дефицитные клетки

25 1.33+0.15 0.0610.03

39 1.16+0.12 0.1910.03

А 23187

25 1.39+0.15 0.07+0.02

39 1.04±0.12 0.1710.04

Са-восстановленные клетки

25 1.67±0.21 0.12+0.03

39 4.04+0.50 1.06+0.14 А 23187

25 1.81±0.20 0.1610.04

39 4.7+0.57 0.7310.08

Са-дефицитные клетки предынкубированы 20 мин с 5 мМ ЭГТА и еще 2 ч в стандартной среде без кальция. Са-восстановленные клетки предынкубированы 20 мин с 5 мМ ЭГТА и еще 2 часа в стандартной среде с 1.5 мМ СаС12. (Trofimova et al. 1999. Physiol. Plant. 105,67

Несмотря на то, что "нормальный" белковый синтез в Са-дефицитных клетках нарушался, это не сказывалось на их жизнеспособности (рис. 25). Однако инкубация в бескальциевой среде при 39°С приводила к значительному увеличению степени их повреждаемости.

Таким образом, нарушение Са-гомеостаза прямо или косвенно отражается на работе белок-синтезирующего аппарата при обычных температурах. Однако обратимость изменений и отсутствие повреждаемости клеток свидетельствуют о том, что не происходит существенной деструкции клеточных, компонентов. Синтез белков теплового шока Са-дефицитных клетках практически не изменялся, однако значительно возрастало повреждающее действие теплового стресса.

Таблица 5. Денситомегрический анализ синтеза индивидуальных БТШ при 39°С в клетках суспензионной культуры сахарной свеклы. кДа Площадь лика, %

Са-дефищпные клетки Са-восстановленные клетки

96 0 4.7

94 0.5 1.2

82 12.2 11.4

76 0 3.9

70 16.8 15.5

67 0.7 2.3

58 1.5 3-5

52 1.8 3.9

38 3 2.9

32 5.8 10.7

30 7.5 15.1

26 6.1 12.5

22 1 2.2

17 15.2 15.5

Представлены площади под 14 наиболее выраженными пиками. (Trofímova et al. 1999. Physiol. Plant 105,67-73).

Рис. 25. Влияние ЭГТА (5 мМ) и температуры на повреждение клеток суспензионной культуры сахарной свеклы. (Трофимова и др. 1997. Физиология растений. 44,511-516).

0 12 3 4

Время инкубации, ч

Полученные данные свидетельствуют о том, что синтез белка при повышенной температуре не обнаруживает высокой Са2+-чувствительности в отличие от синтеза нормальных клеточных белков. Однако следует подчеркнуть, что наиболее важный результат настоящей работы состоит в обнаружении выраженной избирательности Са2+-чувствительности синтеза индивидуальных БТШ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сигнальная роль, которая отводится изменениям рН и уровня свободного кальция в цитозоле, обусловлена, в первую очередь, тем, что значения этих параметров ионного гомеостаза поддерживаются клеткой на низком уровне по сравнению с концентрациями других ионов и, соответственно, существуют ре-гуляторные механизмы, позволяющие это осуществлять.

Рис. 26. Схема механизмов ионного гомеостаза, связанных с ре1улированием рН и уровня свободного кальция в цитозоле.

Различные механизмы представлены в виде стрелок разной длины и направления, указана их локализация в разных компартментах клетки. Прерывистые стрелки на модуле слева обозначают процессы, приводящие к закислению щггозоля (гликолиз и сопряженные с переносом 1-Г транспортные системы), справа - направленную диффузию вторичных посредников Са2+-сигнала в цитозоле.

В растительной клетке, находящейся в состоянии покоя в стационарных условиях и в отсутствии какого-либо воздействия, концентрации протонов и свободных ионов кальция очень низки и обычно лежат в диапазоне 100 нМ. Приходящие к клетке стимулы экзогенной или эндогенной природы могут вызывать как увеличение, так и уменьшение концентрации протонов в 2-3 раза. Для концентрации же свободных ионов кальция в цитозоле при тех же воздействиях характерно транзиторное возрастание в 10-100 раз. Такая реакция ионного гомеостаза на изменение условий достаточно обычна, в большинстве случаев затрагивает оба иона и характерна для ответа на многие факторы, включающие действие фитогормонов, света, температуры, влажности и т.д.

Протоны обладают высокой подвижностью в цитозоле. Это их свойство позволяет изменениям рН распространяться по всей клетке и легко передавать информацию к различным клеточным системам. В этом заключается основное различие между протонами и ионами кальция. Для ионов кальция свойственна очень низкая подвижность в цигозоле. Поэтому информация об изменении их концентрации может передаваться только локально к конкретным мишеням-сенсорам: Са2+-акцептирующим доменам регуляторных или связывающих белков. На рис. 26 эти различия подвижности отображены стрелками разной длины. Таким образом, изменение концентрации кальция в цитозоле происходит, главным образом, в местах его высвобождения из вне- или внутриклеточных депо. По-видимому, при восприятии сигналов начальным событием является открывание каналов в плазмалемме. За поступление Са2+ из внутриклеточных депо отвечают вторичные мессенджеры, такие как инозитол-1,4,5-трифосфат, циклическая аденозин дифосфорибоза, аденин динуклеотид фосфат никотиновой кислоты, фосфатидная кислота и т.д., подвижность которых в цигозоле не лимитирована. Именно они способствуют открыванию Са2+-проводящих каналов в разных районах клетки и передают информацию об изменении условий. Отсюда Са2+-сигнал приобретает пространственную локализацию и проявляет характер специфического Са2+-следа. В его создании координирование участвуют мембранные транспортные системы, включающие Са2+-проводящие каналы, Са2+-АТФ-азы и Са27НГ ангипортеры. Обнаруженная выраженная избирательность Са2+-чувствительности синтеза индивидуальных БТШ характеризует, по-видимому, именно эти свойства механизмов Са2+-гомеостаза. Тепловой стресс является интегральным воздействием на клетку. При нормальной температуре истощение внеклеточного Са2+-депо, связанного с апопластом, воспри

45 нимается клеткой как информация, приводящая к полному ингибированию синтеза белка. То же воздействие при повышенной температуре в основном характеризуется тем, что сохраняется синтез БТШ, что может быть обусловлено открыванием внутриклеточных депо кальция, но избирательно выключается синтез нескольких индивидуальных полипептидов, чувствительных к внеклеточному кальцию.

Изменение же значения рН в цитозоле под воздействием приходящих стимулов может быть связано как с метаболическими, так и с транспортными процессами. Известно достаточно хорошо, что гипоксия приводит к устойчивому сниженному значению рН в клетке. Однако транспорт анионов в клетку с участием анион-лрогояного симпортера также может вызывать кратковременное закисление цитозоля. Поэтому, в отличие от Са2+ -сигнала, обусловленного и всегда связанного с открыванием проводящих каналов разной локализации, достаточно сложно дифференцировать, какой из механизмов рН-стата - биофизический или биохимический отвечает за изменения рН при том или ином воздействии. В то же время, обнаруженный механизм изменения сопряжения между гидролизом АТФ и транспортом протонов, осуществляемый П^-АТФазой плазмалеммы и чувствительный к значениям рН цитозоля, оказывается крайне важным для растительной клетки, поскольку позволяет ей экономно расходовать энергию АТФ в стрессовых условиях окружения. Определяющая роль систем окислительного метаболизма в установлении стационарного значения рН в цитозоле также указывает на то, что посредством протонной системы клетка получает важную информацию об энергетическом потенциале в цитозоле.

Однако нельзя исключить из рассмотрения и информацию о том, что обе системы ионного гомеостаза взаимодействуют между собой. Активность Са2+-транспортирующих систем тонопласта определяется величиной градиента рН через вакуояярную мембрану. Активность ВГ-АТФазы плазмалеммы может регулироваться Са2+-зависимым фосфорияированием/дефосфорилированием.

Установленная в работе роль ЕГ-АТФазы плазмалеммы в поддержании тургорного давления и обнаруженная взаимосвязь между цигоплазматическим рН и водной проницаемостью клеточных мембран, обусловленной присутствием в них специфических белков - аквалоринов, открывает еще один механизм ионного гомеостаза цитозоля растительной клетки. Регулирование водной проницаемости позволяет клетке управлять временем установления тургорного давления, что может быть крайне важно как для ростовых процессов, так и для адаптационных.

ВЫВОДЫ

1. В растительной клетке функционирует система быстродействующего рН-стата, реагирующего на изменения рН цитозоля. Основной вклад в регулирование цигоплазматического рН вносит Н^-АТФаза плазмалеммы, работающая в электрогенном режиме и переходящая в активное состояние при снижении рН в цитоплазме. Другими компонентами являются вторично-энергизованные транспортные системы, доля участия которых определяется трансмембранными градиентами соответствующих ионов.

2. Для рН-стата растительной клетки характерна многокомпонентность. Величина стационарного значения цитоплазматического рН определяется, в основном, процессами окислительного метаболизма. Кратковременное инги-бирование НГ-АТФазы плазмалеммы, стехиометрия которой не превышает значения 1 НГ/1 АТФ, не приводит к смещению уровня рН цитозоля.

3. Активация Н^-АТФазы плазмалеммы может приводить к защелачиванию цитозоля. Такая активация обусловлена усилением сопряжения между транспортом протонов и гидролизом АТФ и реализуется при одновременном поступлении ионов калия в клетку.

4. Один из механизмов регуляции ЕГ-АТФазы плазмалеммы основан на ее взаимодействии с цитоплазматическими регуляторными 14-3-3 белками. Сродство фермента к протонам и способность реагировать на изменения рН в цитозоле определяется рН-зависимым связыванием рГ-АТФазы с 14-3-3 белками. Такое взаимодействие носит обратимый характер и происходит в узком диапазоне рН, что позволяет рассматривать именно этот комплекс в качестве одного из рН-сенсоров растительной клетки.

5. В стрессовых условиях при низком водном потенциале окружающей среды происходит сборка комплекса между Н*ЧАТФазой и 14-3-3 белками. Это вызывает активацию КГ-АТФазы, что выражается в усилении протонного транспорта, сопряженного с поглощением ионов и воды, и приводит к восстановлению рН цитозоля и тургорного давления растительной клетки. При этом возвращение рН к физиологическим значениям сопровождается диссоциацией комплекса между КГ-АТФазой и 14-3-3 белками.

47

6. Водная проницаемость плазматической мембраны чувствительна к изменениям рН. Защелачивание цитозоля, как результат активации ГГ-АТФазы и поглощения ионов калия, сопровождается возрастанием водной проницаемости плазмалеммы. Это свойство позволяет растительной клетке управлять временем восстановления тургорного давления, что может быть существенно как для процессов роста, так и для адаптации растений в стрессовых условиях.

7. Синтез белков при оптимальной температуре, в отличие от новообразования полипегггидов, преобладающих при повышенных температурах, строго зависит от уровня внеклеточного калыщя. В условиях теплового шока индукция синтеза только нескольких индивидуальных полипептидов строго привязана к уровню кальция во внеклеточной среде и определяется его поступлением в цитозоль извне. Выраженная избирательность Са2+-чувстви-тельности синтеза индивидуальных белков теплового шока коррелирует с выживаемостью клеток при гипертермии и свидетельствует в пользу вовлечения Са2+ -опосредованного новообразования этих белков в развитии термотолерантности растений.

8. На основании полученных данных предложена концепция, рассматривающая разную сигнальную роль систем ионного гомеостаза растительной клетки, связанных с регуляций рН и уровня свободного кальция в цитозоле.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРИАЦИИ

1. Гайворонская Л.М., Трофимова М.С., Молотковский Ю.Г. Протонный контроль элеюрогенной КГ-АТФазы в везикулах плазматических мембран из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы. Докл. АН СССР. 1987. Т. 292. С. 759-762.

2. Гайворонская Л.М., Тимонина ВН., Трофимова М.С., Дзюбенко B.C. Получение и характеристика везикул плазматической мембраны с низкой протонной проницаемостью из клеток суспензионной культуры сахарной свеклы. Физиология растений. 1987. Т. 34. С. 13-27.

3. Gaivoronskaya L.M., Trofimova M.S., Timonina V.N. Active ion transport in sealed plasma membrane vesicles from suspension cells of sugar beet root. Abst. 3 rd International Symposium "Structure and Function of roots". Nitra. 1987. P. 43.

4. Gaivoronskaya L.M., Tiofimova M.S., Timonina V.N., Molotkovsky Jur. G. Ion transport systems of plasma membrane involved in pH regulation. Abst. 6th congress of FESPP. Split. 1988. 5-05.

5. Трофимова M.C., Молотковский Ю.Г. pH цигозоля изолированных протопластов и его искусственное изменение. Физиология растений. 1988. Т. 35. С. 629-640.

6. Трофимова М.С. ВГ-АТФаза плазмалеммы как компонент рН-стата цигозоля изолированных протопластов. Физиология растений. 1992. Т. 39. С. 5-14.

7. Трофимова М.С., Молотковский Ю.Г. Роль НС037СГ обмена в регулировании рН цитозоля. Физиология растений. 1993. Т. 40. С. 94-100.

8. Trofimova M.S. Auxin-induced cytoplasmic pH changes in the outer layers of Zea mays coleoptile cells. Abst. International Symposium on Plant hormone perception and transduction. Moscow. 1994. P. 96.

9. Трофимова M.C., Драбкин A.B., Смоленская И.Н. Бабаков А.В. Действие фузи-кокцина на протопласты, полученные из суспензионной культуры сахарной свеклы. Физиология растений. 1996. Т. 43. С. 519-526.

10. Trofimova M.S., Dxabkin A.V., Babakov A.V. Are protein kinases involved in plasma membrane iT-ATPase activation by fiisicoccin? Abst. Annual Symposium Physical-chemical basis of Plant physiology. Pensa. 1996. P. 56.

11.Drabkin A.V., Trofimova M.S., Babakov A.V. Investigation of fusicoccin-binding sites lability on the protoplasts from sugar beet suspension culture. Abst. Annual Symposium Physical-chemical basis of Plant physiology. Pensa. 1996. P. 45.

12.Kuznetsov VI., Litonova G., Shevyakova N., Trofimova M., Rakitin V., Yatsenko I. Plant tolerance to salinity and high temperature: protective systems, protein synthesis and possible regulatory signals. Abst. German-Russian Workshop IV Plant Molecular Biology, Genetics and Biotechnology. St. Peterburg. 1996. P. 39.

13. Drabkin A.V., Trofimova M.S., Babakov A.V. Fusicoccin-binding proteins as a pH-sensors in stress. Abst International Symposium Stress and inorganic nitrogen assimilation. Moscow. 1996. P. 16.

14. Trofimova M.S., Smolenskaya I.N., Drabkin A.V., Galkin A.V., Babakov A.V. Does plasma membrane НГ-ATPase activation by fiisicoccin involve protein kinase? Physiol. Plantarum. 1997. V. 98. P. 215-221.

15. Drabkin A.V., Trofimova M.S., Smolenskaya I.N., Klychnikov O.I., Chelysheva V.V., Babakov A.V. Plant pH-static curcuit mediated by fusicoccin-binding proteins. FEBS Lett. 1997. V. 405. P. 145-147.

16. Трофимова M.C., Андреев И.М., Кузнецов Вл.В. Кальций как регулятор синтеза БТШ в клетках растений при гипертермии. Докл. РАН. 1997. Т. 354. С. 416-418.

П.Трофимова М.С., Драбкин A3., Клычников О.И., Зоринянц С.Э., Авдолфи А.А., Эвиденте А., Бабков А.В. Предполагаемая роль фузикокцин-связывающих белков в адаптации растений к стрессовым воздействиям. Физиология растений. 1997. Т. 44. С. 652-657.

18. Трофимова М.С., Андреев И.М., Кузнецов Вл. В. Кальций как внутриклеточный регулятор синтеза БТШ96 и термотолерантности клеток при гипертермии. Физиология растений. 1997. Т. 44. С. 511 -516.

19. Трофимова М.С., Клычников О.И., Бабаков А.В. 14-3-3 рецепторы фузикокцина как сенсоры внешних сигналов в растениях. Тез. 3го Симпозиума Физико-химические основы физиологии растений и биотехнология. Москва. 1997. С. 17.

20. Chelysheva V.V., Drabkin A.V., KJychnikov O.I., Trofimova M.S., Babakov A.V. Large Supramolecular Complexes involving 14-3-3 proteins in plant plasma membrane: possible role in adaptation to stress. Abst. 1 Iй1 International Workshop on Plant Membrane Biology. Cambridge. 1998. P. 341.

21.Бабаков A.B., Драбкин A.B., Челышева B.B., Клычников О.Й., Трофимова М.С. О возможной роли надмолекулярных белковых комплексов в плазматических мембранах высших растений, связывающих фиготоксин - фузикокцин. Тез. Конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация». Пущино. 1998. С. 206-207.

22.Клычников О.И., Драбкин А.В., Василенко О.В., Павлов Ю.С., Трофимова М.С., Смоленская И.Н., Розенкранц А.А., Соболев А.С., Бабаков А.В. Организация рецептора фузикокцина в плазматических мембранах высших растений: взаимосвязь между аффинностью и молекулярной массой. Биохимия. 1998. М. 63. С. 12691278.

23.Kuzaetsov Vl.V., Andreev I.M., Trofimova M.S. The synthesis of HSPs in sugar beet suspension culture cells under hyperthermia exhibits differential sensitivity to calcium. Biochem. Molecular Biology. 1998. V. 45. P. 269-278.

24.Трофимова M.C., Клычников О.И., Носов A.B., Бабаков А.В. Активация дополнительных сайтов связывания фузикокцина на плазматической мембране протопластов осмотическим шоком. Физиология растений. 1999. Т. 46. С. 9-15.

25. Trofimova M.S., Andreev I.M., Kuznetsov Vl.V. Calcium is involved in regulation of synthesis of HSPs in suspension-cultured sugar beet cells under hypertermia. Physiol. Plantarum. 1999. V. 105. P. 67-73.

26. Chelysheva V.V., Smolenskaya I.N., Trofimova M.S., Babakov A.V. Role of 14-3-3 proteins in the regulation of H^-ATPase activity in the plasma membrane of suspension-cultured sugar beet cells under cold stress. FEBS Lett. 1999. V. 456. P. 22-26.

27.Сорокин Е.М., Трофимова М.С., Жесткова И.М., Бобылев Ю.С. Водная проницаемость плазматических и вакуолярных мембран, изолированных из корней кукурузы. Тез. 4госъезда ВОФР. Москва. 1999. С. 463.

28. Трофимова М.С., Жесткова И.М., Холодова В.П., Круглова А.Г., Сорокин Е.М., Кузнецов Вл. В. Водная проницаемость мембран M. crystallinum L. при стресс-индуцированном переключении СЗ типа фотосинтеза на САМ. Тез. 4го съезда ВОФР. Москва. 1999. С. 478.

29. Челышева В.В., Смоленская И.Н., Зоринянц С.Э., Клычников О.И., Трофимова М.С., Бабаков А.В. Регулязщя ЕГ-АТФазы в плазматических мембранах высших растений при абиотическом стрессе. Тез. 4го съезда ВОФР. Москва. 1999. С. 490.

30.Babakov A.V., Chelysheva V.Y., Klychnikov 01., Zorinyanz S.E., Trofimova M.S., de Boer A.H. Involvement of 14-3-3 proteins in osmotic regulation of КГ-ATPase in plant plasma membrane. Planta. 2000. V. 211. P. 446-448.

31. Сорокин E.M., Трофимова M.C., Жесткова И.М. Рассеяние света везикулами в осмотических процессах. Весшик Нижегородского университета. Серия Биология. 2001. С. 95-98.

32. Трофимова М.С., Жесткова ИМ., Сорокин Е.М., Андреев И.М. Место и роль азква-поринов в транспорте воды в растениях. Вестник Нижегородского университета. Серия Биология. 2001. С. 99-101.

33. Трофимова М.С., Жесткова И.М., Андреев И.М., Свинов М.М., Бобылев Ю.С., Сорокин Е.М. Осмотическая водная проницаемость вакуолярных и плазматических мембран, изолированных из корней кукурузы. Физиология растений. 2001. Т. 48. С. 341-348.

34. Kuznetsov VI.V., Trofimova M.S., Zhestkova I.M., Sorokin E.M., Cholodova V.P. Do aquaporins participate in regulation of water fluxes across cell membranes in plant under stress? Abst. International Symposium "Plant under Environmental Stress". Moscow. 2001. P. 153.

35. Trofimova M.S., Zhestkova I.M., Bozhko K.N., Sorokin E.M. Osmotic water permeability of plant cell membranes, isolated from maize roots. Abst. International Symposium "Plant under Environmental Stress". Moscow. 2001. P. 302.