Роль трансмембранного транспорта анионов в регуляции прорастания пыльцевого зерна покрытосеменных растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.12, кандидат биологических наук Брейгина, Мария Александровна

• Брейгина, Мария Александровна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Брейгина, Мария Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Общие закономерности прорастания пыльцевого зерна и роста трубки.

И. Ионная регуляция прорастания пыльцевого зерна и роста пыльцевой трубки.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Участие трансмембранного переноса анионов в регуляции прорастания пыльцевого зерна и роста трубки.

2. Выявление выхода анионов из пыльцевых зерен.

3. Нарушение функциональной компартментации цитоплазмы пыльцевой трубки в условиях блокирования трансмембранного переноса анионов.

4. Вклад анионных каналов в регуляцию мембранного потенциала на плазмалемме вегетативной клетки в ходе активации пыльцевого зерна и в растущей трубке.

5. Выявление анионных каналов в изолированных митохондриях.

6. Изменение состояния митохондрий в пыльцевых трубках в условиях блокирования трансмембранного переноса анионов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль трансмембранного транспорта анионов в регуляции прорастания пыльцевого зерна покрытосеменных растений»

Актуальность темы

Мужской гаметофит покрытосеменных растений обеспечивает образование и доставку спермиев к зародышевому мешку, и этим определяется его центральное место в исследованиях физиологии репродуктивных процессов. В то же время, благодаря сравнительно простой организации, микроспора, пыльцевое зерно и пыльцевая трубка являются удобными модельными объектами для изучения фундаментальных проблем физиологии растительной клетки, включая регуляцию морфогенеза и обратимого перехода в состояние физиологического покоя.

Важной особенностью мужского гаметофита является способность к апикальному росту, в основе которого лежит структурная и функциональная асимметрия цитоплазмы. Многочисленные исследования выявили ряд общих механизмов регуляции полярного роста пыльцевой трубки и корневых волосков, ризоидов папоротников, гифов грибов и аксонов нервных клеток животных (Geitmann, Emons, 2000; Palanivelu, Preuss, 2000; Bushart, Roux, 2007).

Центральную роль в организации полярного роста отводят неорганическим ионам (Hepler et al., 2006). Неоднородность в распределении ионных токов, наличие внутриклеточных ионных градиентов и их связь с морфогенезом к концу 80-х годов была показана для самых разных клеток, включая растущие гифы грибов, ооциты лягушек и рыб, яйцеклетки бурых водорослей и дрозофилы (Nuccitelli, 1988). Ещё в 1975 году с помощью неселективных электродов было обнаружено, что активация пыльцевого зерна лилии приводит к появлению ионных токов, причем входной ток локализован преимущественно в области будущего прорастания, а выходной ток - на противоположном полюсе (Weisenseel et al., 1975). После прорастания полярная организация токов сохранялась. В последнее время эти данные получили подтверждение с применением ионоселективных электродов. Установлено, что калий, кальций и протоны входят в трубку в апикальной части (Michard et al., 2009), выход протонов происходит в более удаленных от кончика зонах, причем интенсивность тока изменяется по длине трубки (Michard et al., 2008, 2009).

Вопрос о возможности пространственных и/или временных изменений мембранного потенциала в процессе прорастания пыльцевого зерна и роста трубки обсуждался в литературе (Holdaway-Clarke, Hepler, 2003; Robinson, Messerli, 2003), однако в рамках микроэлектродных исследований ответ на него не был получен. Существенный прогресс в исследовании этого вопроса может быть достигнут с использованием флуоресцентных методов, разработанных для изучения клеток животных.

Роль трансмембранного транспорта анионов в регуляции прорастания пыльцевого зерна и роста трубки остается наименее изученной. Данные ингибиторного анализа демонстрируют подавление этих процессов в условиях блокирования анионных каналов (Zonia et al., 2002; Матвеева и др., 20036). Однако не установлена локализация этих каналов - в плазмалемме или в мембранах органелл - и механизмы реализации указанных эффектов. Остается предметом дискуссии и вопрос о токах С1 в пыльцевом зерне и в пыльцевой трубке (Hepler et al., 2006; Moreno et al., 2007). Попытки выявить в плазмалемме вегетативной клетки пыльцевого зерна и трубки анионные каналы электрофизиологическими методами не дали результатов (Dutta, Robinson, 2004), хотя данные транскриптомного анализа указывают на высокий уровень экспрессии двух специфичных для пыльцы генов хлоридных каналов (Moreno et al., 2007). Эксперименты по регистрации хлоридных потоков, выходящих из апекса пыльцевой трубки, с помощью ионоселективных электродов (Zonia et al., 2002) допускают неоднозначную интерпретацию (Messerli et al., 2004). В связи с этим возникает необходимость поиска иных методических подходов. Хорошей альтернативой использованным ранее методам являются оптические методы, в частности, флуориметрия.

Анионные каналы плазмалеммы в соматических клетках растений, как и в клетках животных, участвуют в процессах осморегуляции, транспорта и компартментации метаболитов, в поддержании электрохимических градиентов, трансдукции сигналов и регуляции мембранного потенциала (Jentsch et al., 2002). Можно предположить, что аналогичные функции выполняют анионные каналы в прорастающем пыльцевом зерне. Однако для понимания их роли в запуске прорастания пыльцевого зерна и в организации полярного роста пыльцевой трубки наиболее важно исследовать вклад этих каналов в регуляцию мембранного потенциала и контроль компартментации органелл и осмотического баланса.

Самостоятельный интерес представляет вопрос о внутриклеточных анионных каналах мужского гаметофита, прежде всего, каналах митохондриальных мембран. В соматических клетках растений анионные каналы обнаружены во внутренней и внешней мембранах митохондрий. Они обеспечивают транспорт ионов и метаболитов между цитозолем и матриксом и, работая в тесной связи с калиевыми каналами, поддерживают потенциал на внутренней митохондриальной мембране (O'Rourke, 2007; Laus et al.} 2008). Анионные каналы митохондрий служат также для выхода в цитозоль активных форм кислорода, которые образуются в дыхательной цепи (Godbole et al., 2003; Han et al., 2003). Возможно, функционирование митохондрий мужского гаметофита также зависит от активности анионных каналов -митохондриальных и/или каналов плазмалеммы. Однако эти вопросы оставались вне поля внимания исследователей.

Цель и задачи исследования

Исследование роли трансмембранного переноса анионов в инициации прорастания пыльцевого зерна и регуляции роста пыльцевой трубки.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

• Изучение прорастания пыльцевого зерна и роста пыльцевой трубки в условиях блокирования трансмембранного переноса хлорид-ионов и подавления активности анионных каналов.

• Изучение возможного выхода анионов из пыльцевых зерен в окружающую среду на начальном этапе прорастания.

• Установление возможной взаимосвязи между активностью анионных каналов и компартментацией органелл в пыльцевой трубке.

• Анализ динамики трансмембранного потенциала в прорастающем пыльцевом зерне и его пространственного распределения вдоль плазмалеммы с целью установления вклада анионных каналов в регуляцию этого показателя.

• Изучение действия на митохондрии, выделенные из пыльцевых трубок, ингибиторов анионных каналов.

Научная новизна работы

В работе впервые проведено комплексное исследование изменений мембранного потенциала в пространстве и во времени в процессе прорастания пыльцевого зерна и роста пыльцевой трубки. Выявлена гиперполяризация плазматической мембраны вегетативной клетки при активации пыльцевого зерна. Проведено картирование распределения потенциала на поверхности протопласта, выделенного из пыльцевого зерна, и растущей пыльцевой трубки, и выявлена неоднородность этого распределения.

Показана важная роль анионных каналов, чувствительных к NPPB ((5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid), в регуляции мембранного потенциала в прорастающем пыльцевом зерне и в поддержании структурной и функциональной компартментации пыльцевой трубки.

В митохондриях пыльцевых трубок впервые обнаружены анионные каналы, контролирующие их мембранный потенциал и содержание в них активных форм кислорода.

Научно-практическая ценность работы

Представляемая работа вносит существенный вклад в исследования многоуровневой системы контроля прорастания мужского гаметофита, расширяя представления о механизмах регуляции полового размножения высших растений. Вместе с тем выявленные закономерности, а также предложенные в работе методы избирательного блокирования выхода хлорид-ионов из клеток и картирования мембранного потенциала на клеточной поверхности могут быть использованы в исследованиях процессов клеточной поляризации и полярного роста на других объектах растительного и животного происхождения. Полученные результаты могут быть использованы при обсуждении фундаментальных проблем физиологии и эмбриологии растений в курсах лекций, читаемых студентам биологических специальностей.

Апробация работы

Материалы диссертации были доложены на Международных конференциях студентов и аспирантов "Ломоносов" (Москва, 2006, 2007), на международной конференции «Genetic and physiological fundamentals of plant growth and productivity» (Литва, 2006), на VI съезде Общества физиологов растений России «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007), на III Международной школе для молодых учёных «Эмбриология, генетика и биотехнология» (Саратов, 2009) и на IV Международной конференции «Conference of Polish Society of Experimental Plant Biology» (Польша, 2009).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 9 работ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I. Общие закономерности прорастання пыльцевого зерна и роста трубки

Мужской гаметофит покрытосеменных растений выполняет функции образования, хранения и транспорта мужских гамет. Пыльца многих видов растений выходит из пыльников в дегидратированном состоянии. Снижение метаболической активности повышает устойчивость мужского гаметофита к стрессовым воздействиям со стороны окружающей среды. После регидратации пыльцевого зерна на рыльце пестика в вегетативной клетке происходит активация метаболических процессов и структурная реорганизация цитоплазмы, связанная с формированием оси полярности. После этого образуется цитоплазматический вырост, пыльцевая трубка, которая растёт по направлению к зародышевому мешку, где находится яйцеклетка, и может достигать в длину нескольких сантиметров. Проблемы регуляции прорастания пыльцевого зерна и роста пыльцевой трубки обсуждались в большом числе обзоров (Heslop-Harrison, 1987; Taylor, Hepler, 1997; Franklin-Tong, 1999; Holdaway-Clarke, Hepler, 2003; Hepler et al., 2006; Cheung, Wu, 2008).

Представления о поляризации пыльцевого зерна в значительной мере сформировались на основании цитологических исследований. Ряд авторов методами электронной микроскопии изучали прорастание in vivo пыльцы пасленовых (томата, петунии и табака), для которых характерно влажное рыльце с липидным вязким экссудатом (Herrero, Dickinson, 1981; Cresti et al., 1985). В этих работах использовали трансмиссионную электронную микроскопию с альдегидной фиксацией проб. Были обнаружены изменения ультраструктуры цитоплазмы вегетативной клетки, отражающие активацию ее метаболизма в период, предшествующий образованию пыльцевой трубки. Установлено, что массивные стопки цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулюма, которые в зрелом пыльцевом зерне занимали центральную часть цитоплазмы вегетативной клетки, соседствуя с генеративной клеткой и вегетативным ядром, при гидратации распадались на отдельные цистерны. Одновременно с этим появлялись полисомы и обнаруживались признаки активации диктиосом (Cresti et al., 1985). Выходу трубки предшествовали процессы миграции генеративной клетки, вегетативного ядра, везикул Гольджи и других органелл по направлению к функциональной поре.

Мазина с соавторами (2002) исследовали закономерности выбора функциональной поры и направления оси полярности в пыльцевом зерне Nicotiana tabacum L. в условиях in vivo (Мазина и др., 2002). С этой целью использовали методы сканирующей и трансмиссионной электронной микроскопии с применением различных способов фиксации опыленных рылец (глутаральдегид, пары осмия и криофиксация). Анализ динамики ультраструктуры пыльцевого зерна табака на ранних этапах его активации на рыльце позволил выявить комплекс признаков, отличающих будущую функциональную пору до начала процесса выхода пыльцевой трубки. Оказалось, что это пора, ближайшая к комплексу генеративной клетки и вегетативного ядра. В процессе гидратации пыльцевого зерна в области этой поры в интине выявлялся дополнительный внутренний слой и резко увеличивалась поверхность плазматической мембраны и части интины за счет формирования глубоких впячиваний. Наряду с этим в области указанной поры выявлялось зональное распределение органелл (везикул диктиосом, митохондрий и коротких цистерн ЭР), отражающее активацию механизмов построения новой стенки. На основании этих данных авторы пришли к выводу о том, что выбор будущей функциональной поры определяется пространственной организацией пыльцевого зерна, а не его ориентацией относительно рыльца.

Роль рыльцевого экссудата в определении функциональной поры пыльцевого зерна в условиях in vitro была исследована у Nicotiana alata с использованием двухфазной экспериментальной системы, включающей водную фазу и масляную фазу, представленную экссудатом или заменяющей его липидной средой (Lush et al., 1998). Было обнаружено, что пыльца, внесенная в масляную фазу, прорастала по направлению к границе фаз. В этой связи авторы предположили, что выбор функциональной поры и направление роста пыльцевой трубки определяются градиентом концентрации воды в масляной фазе. Было высказано предположение о том, что и в условиях in vivo выбор функциональной поры определяется направлением водного градиента (Lush et al., 1998; Wolters-Arts et al., 1998). Однако рассмотренные выше данные электронной микроскопии (Мазина и др., 2002) не подтвердили это предположение. Как полагают Мазина с коллегами (2002), влияние внешних факторов, в том числе водного градиента, на направление роста пыльцевой трубки in vivo может сказываться на более поздних этапах, когда начинается врастание трубки в ткань рыльца.

Пыльцевая трубка является одним из наиболее изученных объектов в исследованиях закономерностей полярного роста (Taylor, Helper, 1997; Michard et al., 2009). Одним из ключевых механизмов является разделение цитоплазмы растущего объекта на функциональные компартменты (схема 1). В клетках растений и грибов, растущих кончиком, выделяют апикальную зону (схема 1, зона А), свободную от крупных органелл (Geitmann, Emons, 2000). В ней сосредоточены секреторные везикулы, несущие мембранный и стеночный материал к апикальной мембране. D В mitochondria callose plug vesicfes containing cell wall precursors vegwatfva nucleus generative cell f< dear голе* везикулы, несущие материал дня строительства стенки мпкр о фила менты днктиосоыа наружная стенка внутренняя стенка везикулы, сливающиеся с плазматической мембраной

Схема 1. Ультраструктура пыльцевой трубки (Mascarenhas, 1993; Franklin-Tong, 1999)

А - апикальный домен в форме обращенного конуса, заполненный секреторными везикулами, обычно обозначают как "прозрачную зону (clear zone)";

В - субапикальный домен содержит большое количество метаболически активных органелл, таких, как митохондрии, диктиосомы (golgi), эндоплазм этический ретикулюм (ER);

С - ядерный домен содержит ядро вегетативной клетки и генеративную клетку;

D - вакуолярный домен с крупными вакуолями, растущими по мере удлинения трубки.

Каллозная пробка (callose plug) изолирует растущую часть трубки от отмирающего пыльцевого зерна. Вакуолярный домен и каллозная пробка присутствуют лишь в длинных трубках. На начальном этапе роста пыльцевое зерно и трубка не разделены крупными вакуолями и каллозой и представляют собой единое целое.

На нижнем рисунке более крупно показаны зоны А и В.

Более дистальная часть клеток заполнена крупными органеллами -митохондриями, комплексами Гольджи и др. В ней выделяют субапикальную зону (схема 1, зона В). Важное свойство растущей пыльцевой трубки - движение цитоплазмы в субапикальном компартменте по траектории "обращенного фонтана": органеллы движутся к кончику трубки по кортикальной части трубки, разворачиваются, не заходя в апикальную зону, и затем движутся в обратном направлении по центру трубки. Некоторые авторы выделяют в пыльцевой трубке также ядерный компартмент, который содержит ядро вегетативной клетки и генеративную клетку или два спермия (схема 1, зона С). Дальше по длине клетки, как правило, располагается более или менее вакуолизированная зона (схема 1, зона D) (Geitmann, Emons, 2000).

Отмечены черты сходства в структуре цитоскелета различных клеток, растущих кончиком. В субапикальном компартменте пыльцевых трубок и корневых волосков актин формирует тяжи, более или менее параллельные направлению роста, которые служат для передвижения органелл. В апикальной же зоне тяжи отсутствуют, а короткие актиновые филаменты формируют сеть (Geitmann, Emons, 2000). Следует отметить динамичность цитоплазматических зон и структуры цитоскелета. Выявлены периодические колебания в размерах везикулярного конуса, в структуре апикальной актиновой сети и в положении точки разворота крупных органелл (Cheung, Wu, 2008). Принято считать, что эти осцилляции определяют колебательный характер роста трубки. Достаточно давно при изучении роста пыльцевых трубок лилии было обнаружено, что скорость их роста колеблется от 100 до 500 нм/сек и с периодом 15-50 сек (Pierson et al., 1996).

Актиновый цитоскелет является важным структурным фактором, контролирующим полярную компартментацию цитоплазмы и движение в ней органелл — особенности, необходимые для полярного роста (Chebli,

Geitmann, 2007). Показано, что полярный рост, скопление везикул в апикальной зоне и движение цитоплазмы нарушаются в присутствии ингибиторов взаимопревращений F- и G-актина (Parton et al., 2001; Geitmann et al., 1996; Hepler et al., 2001).

He менее важным структурным фактором является клеточная стенка пыльцевой трубки (Chebli, Geitmann, 2007). Основным компонентом стенки трубки является пектин, который откладывается в апексе путем экзоцитоза. Целлюлоза и каллоза откладываются в более дистальных зонах за счет работы соответствующих синтаз, локализованных в плазматической мембране. В пыльцевой трубке Nicotiana tabacum отложения целлюлозы начинаются на расстоянии 5-15 мкм от кончика, а каллоза появляется лишь на расстоянии 30 мкм (Ferguson et al., 1998). Таким образом, состав полимерного матрикса стенки в апексе и в других зонах трубки значительно различается. Отличие состоит ещё и в том, что конфигурация пектинов постепенно изменяется по мере того, как они становятся частью зон, расположенных дальше от кончика (Chebli, Geitmann, 2007).

Иммуноцитохимические исследования показали, что пектины, расположенные в кончике растущей пыльцевой трубки, в значительной мере этерифицированы, а пектины в зонах, удаленных от кончика, деэтерифицированы (Li et al. 1995; Jauh, Lord, 1996). Установлено, что градиент степени этерификации пектинов коррелирует с повышением жесткости и снижением эластичности стенки по мере удаления от кончика. Этот градиент образуется за счет упорядоченного везикулярного транспорта в растущей трубке. Этерифицированные пектиновые остатки, образовавшиеся в аппарате Гольджи, секретируются в экстремуме апекса и встраиваются в клеточную стенку (Hasegawa et al., 1998). После встраивания они начинают постепенно деэтерифицироваться под действием фермента пектинметилэстеразы (РМЕ) (Geitmann, 1999). Деэтерификация позволяет ионам кальция сшивать между собой кислые остатки пектинов с образованием полужесткого пектатного геля (Carpita, Gibeaut, 1993), который, предположительно, обеспечивает механическую поддержку дистальным частям растущей трубки. Этерифицированные и потому не образующие геля пектины, которые локализованы преимущественно в апексе, не должны препятствовать удлинению трубки, движущей силой которого является тургор (Franklin-Tong 1999; Geitmann 1999).

Изменения цитомеханических свойств стенки вдоль оси трубки были экспериментально обнаружены методом микровдавливаний (Geitmann, Parre, 2004). В работах этих авторов впервые было показано, что количество и конфигурация пектинов является ключевым фактором, определяющим физические свойства апикальной клеточной стенки (Parre, Geitmann, 2005).

Современные представления о регуляции роста пыльцевой трубки удобнее всего суммировать, пользуясь схемой, представленной в недавнем обзоре Cheung и Wu (2008) (схема 2), которая демонстрирует сложность картины регуляции роста пыльцевой трубки. В этой схеме представлены также некоторые элементы ионной регуляции роста трубки, которые будут подробнее рассмотрены в следующем разделе данного обзора.

Ape* ttttn lltft.

4JIH*

ЦИ1*

Щ Gotgi Н--ЛТР«и

• EndOttma ^ Fomwi

VnldM * GTP-fl«c/Rop

R»b2 ♦ GDPRecJRop

Ж R»b8 ■ PIP2

Ж RaM1 P-ADF

OCX Achn ADF

I ) C»*- grwMnt Щ VHInfealMkn H' fcot M PR К C^'Rux ^ GEF

• Profilin я GO' GAP

Схема 2. Ключевые структурные, регуляторные и сигнальные элементы пыльцевой трубки (Cheung, Wu, 2008).

Желтым цветом выделена область трубки, где локализован сфокусированный в ее кончике кальциевый градиент. Концентрация кальция изменяется от 10 цМ в кончике до 150-200 пМ в основании прозрачной зоны (clear zone). a) Актиновый цитоскелет и инвертированный конус везикул. Показаны движущиеся диктиосомы, эндосомы: новосинтезированные (голубые) и рециклированные (розовые), а также Rab ГТФазы. Длинные актиновые тяжи заострены в направлении движения органелл. Микротрубочки не показаны. b) Потоки ионов кальция и протонов и гипотетическая модель, объясняющая их действие на белки, которые связываются с актином (actin binding proteins - ABPs) и регулируют процессы его сборки и разборки. К числу этих белков относятся фактор деполимеризации актина (actin depolymerizing factor - ADF), гельсолин, виллин и профилин. Светлая окраска белков означает их сравнительно низкую активность. c) Организация актинового цитоскелета в апикальном и субапикальном районах трубки. Диаметр актиновых нитей на рисунке отражает, хотя и не строго количественно, толщину актиновых пучков. Рост актиновых филаментов стимулируют формины, локализованные на периферии клетки. Согласно рабочей модели, появляющиеся короткие нити реконструируются под действием окружающих актин-связывающих белков (ABPs). При этом происходит деполимеризация актина с участием актин-деполимеризующего фактора (ADF) и гельсолина, появляются новые растущие нити и происходит сборка нитей в структуры высшего порядка. Конфигурация актина в апексе трубки окончательно не установлена; на схеме актиновые нити расположены случайным образом. Необходимо подчеркнуть динамичность этих структур: процессы их сборки и разборки определяются цитоплазматическим окружением. Эти процессы включают разборку актиновых тяжей, несущих органеллы к апикальной зоне, сборку актиновых тяжей, которые обеспечивают движение органелл в обратную сторону, а также сборку актина, выстилающего периферию клетки в апикальной и субапикальной зонах. К этому следует добавить встраивание формирующихся тяжей с периферии в субапикальную цитоплазму, где короткие нити объединяется в структуры высшего порядка. d) Сигнальный аппарат, включающий специфичную для пыльцы рецепторную киназу (pollen-specific receptor kinase - PRK) и Rac/Rop-ГТФазы. Изображены PRK, гуанин-нуклеотидный обменник (guanine nucleotide exchange factor - GEF), молекулярный переключатель Rac/Rop и три мишени: Са2+, сборка апикального актина и инактивация ADF. Также показаны факторы, участвующие в поддержании активности Rac/Rop в кончике: белок, активирующий ГТФазы (GTPase activating protein - GAP), ингибитор диссоциации гуанин-нуклеотидов (guanine nucleotide dissociation inhibitor - GDI) и фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфат в апикальной мембране. Красная, розовая и черная стрелки, которые отходят от сигнального аппарата Rac/Rop, обозначают пути, опосредованные белками 3 и 4, содержащими CRIB (ROP-interactive Cdc42/Rac-interactive binding) мотив (RIC3 и RIC4), и ещё не обнаруженными эффекторами. Сигнальный аппарат PRK-Rac/Rop и цикл GDP-GTP-Rac/Rop показаны с большим увеличением.

II. Ионная регуляция прорастания пыльцевого зерна и роста пыльцевой трубки

Ионная регуляция прорастания мужского гаметофита представляет собой сеть взаимосвязанных процессов. Например, С а" , широко известный медиатор в трансдукции сигналов в эукариотических клетках, играет важную роль в пыльцевых зернах и трубках: потенциальные мишени, реагирующие на изменение его концентрации, включают белки, обеспечивающие внутриклеточную подвижность, цитоскелет, экзо- и эндоцитоз, структуру клеточной стенки - важнейшие компоненты поляризации и апикального роста. Протоны также участвуют во многих фундаментальных процессах; пожалуй, наиболее важным из них является поддержание трансмембранных градиентов рН, вносящих существенный вклад в энергизацию мембран и транспортные процессы, которое обеспечивается работой НГ-АТФаз (Hepler et al., 2006).

На следующей схеме (схема 3) представлена упрощенная картина ионных токов, пересекающих апекс пыльцевой трубки. alkaline band

KEY t-ч

С1 £ гипотетический

Н* неспецифический

АТР

4—-Щ-н~ катионныи канал к*

О анионный канал калиевый канал протонная помпа кальциевый канал

Схема 3. Ионные токи, обнаруженные в пыльцевой трубке (Holdaway-Clarke, Hepler, 2003). Пунктирным кружочком обозначен механочувствительный и/или потенциал-зависимый кальциевый канал. Предположение о том, что кальций и протоны выходят в апекс через неспецифический катионный канал, может объяснить имеющиеся данные о практически полном совпадении фаз колебаний концентрации кальция и протонов в цитозоле. Кроме того, транспортная система, которая обеспечивает поступление протонов в кончик, до сих пор не была обнаружена. Анионные каналы также не были обнаружены электрофизиологическими методами.

Исследования роли Са в прорастании пыльцевого зерна и регуляции роста пыльцевой трубки

Более 40 лет назад было доказано, что присутствие ионов кальция в среде инкубации необходимо для прорастания пыльцы (Brewbaker, Kwack, 1963). В недавнем обзоре функций кальция при оплодотворении у покрытосеменных растений (Ge et al., 2007) отмечается, что кальций присутствует в трех формах: 1) ковалентно связанный; 2) слабо связанный, обычно ассоциированный с фиксированными или подвижными анионами (ионная связь); и 3) цитозольный свободный кальций — важный вторичный меессенджер в процессах передачи сигналов. Рост пыльцевой трубки в условиях in vivo обычно зависит от внешних источников кальция, находящихся в тканях пестика. Кальций играет ключевую роль в поддержании полярного роста трубки и его пульсаций. Полагают также, что кальций играет важную роль в детерминации направления роста трубки. И, наконец, как показали исследования процесса оплодотворения в экспериментах in vitro, кальций нужен для слияния гамет. Слияние гамет в процессе двойного оплодотворения in vitro запускает осцилляции концентрации Са2+ в зиготе и первичном эндосперме, подобно тому, как это происходит при оплодотворении у животных.

В современных исследованиях динамики ионов кальция в пыльце и папиллах рыльца Arabidopsis thaliana при опылении, благодаря использованию флуоресцентного индикатора этого иона (yellow cameleon), было установлено, что вскоре после гидратации в месте возможного у | выхода трубки возрастает концентрация Са" в цитоплазме (Iwano et al., 2004). В папиллах опыленного рыльца непосредственно под местом прикрепления пыльцевого зерна также происходило существенное увеличение внутриклеточной концентрации Са" . Наблюдали три волны возрастания концентрации Са2+ в папиллах: первая — вскоре после гидратации пыльцы, вторая — после появления выпячиваний в поровых областях, и третья, наиболее выраженная, - когда пыльцевая трубка проникала в папиллярную клетку.

Роль Са2+ в прорастании пыльцы in vitro исследовали с помощью различных ингибиторов, включая ионофор А23187, хелатор EGTA, блокатор кальциевых каналов хлорид лантана и др. (Zhang et al., 2007). Все они ингибировали прорастание пыльцы и рост пыльцевых трубок и, что особенно важно, эти воздействия полностью снимали кальциевый градиент в пыльцевых трубках, о котором пойдет речь ниже.

Один из наиболее известных кальций-связывающих белков, который, предположительно, также участвует в становлении и поддержании полярности при прорастании - кальмодулин (СаМ). С использованием кальмодулина, конъюгированного с зеленым флуоресцентным белком, Тао с соавторами (2004) методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в реальном времени отслеживали перемещения кальмодулина в цитоплазме пыльцевого зерна и пыльцевой трубки табака. Они обнаружили, что до начала прорастания кальмодулин сосредоточен во всех апертурных областях, затем он собирается к одной апертуре, из которой позднее появляется трубка. В пыльцевой трубке наблюдался нисходящий градиент концентрации кальмодулина в направлении от кончика к пыльцевому зерну (Тао et al., 2004).

Shang с сотрудниками (2005) провели комплексное исследование роли Са2+ в прорастании пыльцевого зерна лилии, применив методы конфокальной лазерной сканирующей микроскопии в сочетании с методом пэтч-кламп. Они показали, что под действием EGTA и ряда б локаторов кальциевых каналов внутриклеточная концентрация Са2+ снижается, что указывает на поступление ионов кальция в клетку извне. В плазматической мембране протопластов, изолированных из пыльцевых зерен, эти авторы обнаружили кальциевые каналы, которые активировались в условиях гиперполяризации плазмалеммы. Установлено, что активность этих каналов контролируется внеклеточным кальмодулином.

В большом числе работ, благодаря использованию флуоресцентных у I индикаторов Са , в кончике пыльцевой трубки был обнаружен крутой градиент концентрации этого катиона (Taylor, Hepler, 1997). Концентрация Са2+ в апикальной области трубки составляла от 0,8 до 3 мкМ, что на порядок больше, чем в более дистальных областях (200-300 нМ) (Camacho et al., 2000; Michard et al., 2008). Исследования профиля пространственного распределения Са2+ показали, что его концентрация максимальна в области, непосредственно примыкающей к плазмалемме в апексе трубки у I

Camacho et al., 2000). Установлено, что Са входит в цитоплазму в очень небольшой зоне апекса - в его экстремуме (Taylor, Hepler, 1997). Измерение активности кальциевых каналов показало, что в растущей трубке их активность максимальна в кончике и затем снижается, выходя на плато на расстоянии 30 мкм от кончика (Malho et al, 1995). В трубках, рост которых был заблокирован присутствием в среде 100 мкМ La3+, активность каналов практически отсутствовала, как и кальциевый градиент (Malho et al, 1995). Авторы отмечают, что при этом происходила деполяризация плазматической мембраны трубки, которая могла подавлять активность потенциал-зависимых каналов. Возможно, кальций входит в трубку через механочувствительные каналы. Такие каналы выявлены в протопластах, выделенных из пыльцевых зерен и кончиков пыльцевых трубок лилии (Dutta, Robinson, 2004). f\ I

Уровень Са в высшей точке градиента флуктуирует, при этом его концентрация изменяется в четыре раза (Taylor, Hepler, 1997). Скорость роста трубки осциллирует с той же частотой, однако те и другие осцилляции не совпадают по фазе: максимальная концентрация Са2+ в цитозоле немного запаздывает по отношению к максимальной скорости роста (Holdaway-Clarke, Hepler, 2003).

В упомянутой выше работе Iwano с сотрудниками (2004) осцилляции концентрации Са2+ в кончике пыльцевой трубки наблюдали в условиях ее роста in vivo. Отмечено, что частота осцилляций и средняя концентрация внутриклеточного Са2+ были выше, чем соответствующие значения в условиях in vitro.

Наличие градиента ионов кальция в кончике пыльцевой трубки напрямую связано с процессом ее удлинения. При нарушениях кальциевого градиента рост трубки прекращается, и наоборот, восстановление градиента снимает блок роста трубки (Hepler et al., 2006). Имеющиеся данные указывают на важное значение этого градиента для таких процессов, как организация движения цитоплазмы в трубке, сборка клеточной стенки, везикулярный транспорт и секреция, а также реализация реакции самонесовместимости и определение направления роста трубки (Holdaway-Clarke, Hepler, 2003).

В пыльцевой трубке имеется обширная эндомембранная сеть. Как полагают, внутриклеточные депо также принимают участие в гомеостазе Са2+ в цитоплазме пыльцевой трубки (Cheung, Wu, 2008).

Градиент концентрации кальция поддерживается за счёт выброса этого иона через плазматическую мембрану и, возможно, его накопления в органеллах. Установлено, что работа Са2+-АТФазы (АСА9) необходима для роста пыльцевой трубки и нормального оплодотворения (Schiott et al., 2004). Предполагают, что этот фермент участвует в поддержании кальциевого градиента. АСА9 принадлежит к семейству аутоингибируемых Са -АТФаз, экспрессируется, преимущественно, в мужском гаметофите и локализована на плазмалемме пыльцевой трубки (Schiott et al., 2004). Найдена также Са -АТФаза, ассоциированная с эндомембранами пыльцевой трубки. Мутанты Arabidopsis по этому ферменту характеризуются сниженной скоростью роста пыльцевых трубок in vitro и уменьшенным количеством семян (Cheung, Wu, 2008).

Следует отметить, что наличие градиента концентрации Са является универсальным свойством клеток, растущих кончиком (Geitmann, Emons, 2000; Palanivelu, Preuss, 2000; Bushart, Roux, 2007).

Известно, что в пыльце экспрессируется большое количество Са -связывающих сигнальных белков, но до сих пор не установлено, каким образом изменения концентрации Са2+ в цитоплазме регулируют полярный рост пыльцевой трубки (Cheung, Wu, 2008). Среди потенциальных кальциевых сенсоров следует отметить кальций-зависимые киназы (CDPKs - calmodulin-like domain protein kinase). Оверэкспрессия Pi CDPK1, локализованной на плазмалемме вегетативной клетки пыльцевого зерна Petunia inflata, или экспрессия модифицированного фермента приводила к остановке роста трубок, нарушению полярной организации цитоплазмы и градиента концентрации Са" в цитозоле (Yoon et al., 2006). Такие же операции с PiCDPK2, локализованной во внутриклеточных мембранах, приводили к остановке роста, но не вызывали нарушений полярности (Yoon et al., 2006). Авторы данной работы отметили как важное обстоятельство тот факт, что ViCDPKl может взаимодействовать с ингибитором диссоциации гуанина GDI. Дело в том, что GDI является негативным регулятором активности ГТФаз Rac/Rop (Ras-related Rho-type GTPases), которые локализованы в районе апикальной мембраны. Изменения в активности, экспрессии или локализации этих ферментов приводят к нарушениям полярной организации цитоплазмы трубки и ее роста. GDI играет важную роль в обеспечении апикальной локализации Rac/Rop ГТФаз (Cheung, Wu, 2008). Возможно, продолжение этих работ даст объяснение тесной связи между концентрацией

Са2+ и структурными факторами, обеспечивающими полярный рост трубки.

Более простой механизм влияния кальциевого градиента на полярный рост, возможно, обеспечивается актин-миозиновым комплексом. Yokota с соавторами (1999) исследовали in vitro подвижность актинмиозинового комплекса, выделенного из пыльцевых трубок лилии. Они показали, что повышение концентрации кальция выше 10"6 М резко снижало подвижность комплекса. Если эта закономерность соблюдается и в кончике трубки, можно понять, почему крупные органеллы, такие, как митохондрии, не заходят в кончик трубки.

Кальциевый градиент тесно связан со структурной компартментацией цитоплазмы, лежащей в основе полярного роста. Воздействия, нарушающие рост трубок и зонирование цитоплазмы, рассеивают также кальциевый градиент в кончике трубки. Таким действием обладал, например, спирт бутан- 1-ол, снижающий внутриклеточную концентрацию важнейшего вторичного мессенджера — фосфатидной кислоты (Monteiro et al., 2005). Влияние кальция на актиновый цитоскелет в растительных клетках опосредовано актин-связывающими белками, чувствительными к концентрации кальция, такими, как виллин, гельсолин и профилин (Hussey et al., 2006). Активность кальциевых каналов в пыльцевых трубках, в свою очередь, регулируется актиновыми микрофиламентами (Wang et al., 2004), т.е. имеет место регуляция по принципу обратной связи.

Н+-АТФаза, рН цитозоля и протонные токи в пыльцевом зерне и в пыльцевой трубке

Прорастание пыльцы зависит от активности Н^-АТФазы плазмалеммы - этот вывод базируется на различных экспериментах, в ходе которых наблюдали корреляции между прорастанием пыльцевых зерен или скоростью роста трубки, с одной стороны, и показателями, отражающими активность Н+-АТФазы плазмалеммы, - с другой. Одна из первых работ такого рода была проведена на оливе (Rodrfguez-Rosales et al., 1989), где измеряли рН среды, в которой прорастала пыльца, и эффективность прорастания в условиях стимулирования работы протонной помпы фузикокцином или ее ингибирования ванадатом.

Матвеева соавторами (2003а) показали, что закисление цитозоля пропионовой кислотой существенно снижало процент проросших пыльцевых зерен вплоть до полного ингибирования процесса прорастания. Заметный эффект обнаруживался при снижении величины внутриклеточного рН до 6,8. В то же время защелачивание цитозоля при стимуляции работы НГ-АТФазы фузикокцином приводило к резкому возрастанию интенсивности прорастания. Подавление активности НГ-АТФазы плазматической мембраны ортованадатом снижало величину внутриклеточного рН примерно на 0,1 ед., что не оказывало существенного влияния на эффективность прорастания пыльцы. Этот результат понятен, если принять во внимание тот факт, что величину внутриклеточного рН вегетативной клетки пыльцевого зерна контролирует не только протонная помпа, но и альтернативная оксидаза (Матвеева и др., 2002). В условиях блокирования обоих ферментов величина внутриклеточного рН снижалась до 6,8, и этого было достаточно для ингибирования прорастания пыльцы.

Прямые доказательства активности протонной помпы в пыльце были получены на протопластах, выделенных из пыльцевых зерен, с использованием комбинации методов пэтч-кламп, ПЦР (полимеразной цепной реакции) и иммунохимии (Gehwolf et al., 2002). Авторы наблюдали индуцированный фузикокцином ток, отражающий увеличение интенсивности работы протонной помпы. Они установили, что ЕГ-АТФаза плазмалеммы экспрессируется только в вегетативной клетке. Отсутствие этого фермента в плазмалемме генеративной клетки авторы связывают с ее уникальным положением, полагая, что протонные помпы генеративной клетки могли бы закислять цитоплазму вегетативной клетки.

Механизмы регуляции активности протонной помпы интенсивно изучались в последние 10 лет. В частности, Pertl с соавторами (2001) с помощью моноклональных антител охарактеризовали в микросомальной фракции пыльцы лилии 14-3-3 белок, который способен связываться с Н4"-АТФазой и, по-видимому, участвует в регуляции её активности. Ранее было показано, что активатор протонной помпы фузикокцин связывается с рецепторным комплексом, который, помимо ЕГ-АТФазы, включает 14-3-3 белок (Sze et al., 1999). Известно, что активность ЕГ-АТФазы в растительных клетках может регулироваться путём фосфорилирования и дефосфорилирования. Эти модификации могут влиять на связь Н+-АТФазы с 14-3-3 белком.

В растущей пыльцевой трубке лилии выявлен протонный градиент необычной формы: в апикальной зоне рН слабо кислый (6,8), по мере удаления от кончика рН переходит в щелочную область и на границе перехода прозрачной зоны в субапикальный домен (см. схему 1) достигает максимального значения (рН 7,5). В более дистальных областях трубки рН нейтральный (Feijo et al., 1999). Было показано, что кислый рН в апикальной зоне присутствует только в растущих трубках, тогда как щелочной рН субапикальной зоны наблюдается, даже если удлинения трубки не происходит. Эти же авторы обнаружили, что внеклеточные токи протонов соответствуют распределению в цитоплазме зон с различными значениями рН: в апексе обнаружены интенсивные входные протонные токи, а в щелочном поясе — наиболее интенсивные выходные токи (Feijo et al., 1999). Естественно было предположить, что выходные протонные токи обеспечиваются Н^-АТФазой, причем по длине трубки изменяется ее содержание в плазмалемме и (или) активность.

Obermeyer с сотрудниками (1992) с помощью флуоресцентно меченых моноклональных антител пытались выявить неоднородность в распределении Н^-АТФазы в плазмалемме пыльцевого зерна и трубки. В ходе этого исследования БГ-АТФаза была обнаружена на поверхности протопласта, выделенного из пыльцевого зерна, однако флуоресцентный сигнал практически не выявлялся в пыльцевой трубке (Obermeyer et al., 1992).

В работах последних лет получены данные о том, что протонные помпы отсутствуют в апикальной плазмалемме пыльцевой трубки (Michard et al., 2009). В пыльцеArabidopsis экспрессируется несколько изоформ Н*-АТФазы плазмалеммы (семейство генов AHA), включая АНА6, которая является специфичной для пыльцы и характеризуется высоким уровнем экспрессии (Pina et al., 2005; Bock et al., 2006). Предполагаемый ортолог этого гена обнаружен в пыльцевых трубках Nicotiana plumbaginifolia (Michard et al., 2009). Показано, что он интенсивно экспрессируется в пыльце, и, с использованием иммунолокализации, выявлена неоднородность распределения соответствующего белка на плазмалемме трубки: он отсутствовал в кончике трубки. В более поздней работе был клонирован другой ортолог из пыльцы табака, NtAHA (.Nicotiana Н+-ATPase; Certal et al., 2008). Субклеточную локализацию NtAHA изучали, используя его конъюгат с зеленым флуоресцентным белком (green fluorescent protein — GFP). Было установлено, что NtAHA отсутствует в апикальной плазмалемме трубки (на расстоянии 0-5 мкм от кончика) даже в условиях оверэкспрессии (Certal et al., 2008). Количество меченого белка постепенно увеличивалось по мере удаления от кончика (5-15 мкм) и выходило на плато на расстоянии 15-20 мкм от кончика. Распределение протонных токов вдоль трубки хорошо соответствовало локализации Н*-АТФазы. Интенсивный вход протонов постепенно снижался на участке 510 мкм от кончика, на расстоянии 15 мкм начинался выход протонов, который достигал максимума на расстоянии примерно 25 мкм от кончика, что в целом подтверждает более ранние данные (Feijo et al., 1999). Дополнительное свидетельство в пользу ведущей роли РГ-АТФазы в поддержании полярных протонных токов было получено с помощью ингибиторного анализа: ортованадат натрия снижал интенсивность выходного протонного тока на 60-80% (Certal et al., 2008).

Каким образом поддерживается полярное распределение Н^-АТФаз в мембране трубки, пока не ясно. С помощью методики FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) Certal с соавторами (2008) показали, что белок NtAHA-GFP движется в мембране по направлению к кончику. Таким образом, встраивание в мембрану везикул, несущих этот белок, происходит не в кончике, а в более дистальных зонах. Эти же авторы показали, что полярное распределение КГ-АТФазы происходит ещё на уровне трансляции: мРНК NtAHA отсутствует в кончике трубки, хотя присутствует в больших количествах в более дистальных областях (Certal et al., 2008).

Нерешенным остается вопрос о входе протонов в апексе пыльцевой трубки. В литературе было высказано предположение о том, что и кальций, и протоны входят в кончик трубки по градиенту концентрации через неспецифический катионный (кальциевый) канал. Косвенно это предположение подтверждают данные о практически полном совпадении фаз колебаний концентраций протона и кальция в цитоплазме пыльцевой трубки (Holdaway-Clarke, Hepler, 2003).

Помимо белков, транспортирующих через плазмалемму протоны, в регуляции внутриклеточного рН в пыльцевом зерне участвуют анионные каналы. Матвеева с соавторами (200За) показали, что в присутствии ингибиторов анионных каналов величина рН в пыльцевом зерне табака поддерживается на низком уровне, и в этих условиях прорастание блокировано. Ранее связь анионного и протонного транспорта была показана для харовой водоросли Chara corallina, где анионные каналы плазмалеммы также участвовали в регуляции рН цитозоля (Johannes et al., 1998). Открывание хлоридных каналов в условиях искусственного закисления цитозоля вызывало деполяризацию мембраны и активацию протонной помпы (Johannes et al., 1998).

Взаимосвязь между анионным и протонным транспортом была исследована в модельных экспериментах на везикулах, полученных из плазмалеммы клеток корня ячменя (Yamashita et al., 1996). Закисление везикул зависело от присутствия анионов, таких, как хлорид и нитрат. В присутствии ингибитора анионных каналов нифлумовой кислоты закисления везикул не происходило.

В соматических клетках протонный и анионный транспорт играют ключевую роль в регуляции мембранного потенциала. Н^АТФаза является главной электрогенной силой плазмалеммы, а анионы и, в частности, С1 , выполняют функции противоионов. Кроме того, и протонная помпа, и анионные каналы могут регулироваться величиной мембранного потенциала по принципу обратной связи. В пыльцевом зерне и трубке эта система практически не изучена, однако представляется весьма вероятным, что она имеет большое значение для запуска и поддержания ростовых процессов.

Калиевые каналы в пыльцевом зерне и участие калия в его прорастании

В ранней работе Bashe и Mascarenhas (1984) было установлено, что в процессе гидратации пыльцевого зерна Tradescantia paludosa концентрация К+ в нём снижается. Одновременно с этим рибосомы собираются в полисомы и начинается синтез белка. Влияние концентрации К+ на синтез белка эти авторы показали в бесклеточной трансляционной системе. Установлено, что оптимальная концентрация К+ для синтеза белка составляет 100-130 мМ, при её повышении до 220 мМ синтез полностью прекращается. Высокие концентрации К+ препятствуют связыванию РНК с рибосомами и сборке инициального комплекса. Концентрация ионов калия в гидратированном пыльцевом зерне находится в пределах оптимума для синтеза белка, тогда как в покоящемся пыльцевом зерне она превышает 280 мМ. Кроме того, эксперименты на бесклеточной системе показали, что чувствительность трансляции разных мРНК к высоким концентрациям К+ и других одновалентных ионов различна. Это позволяет предполагать, что в процессе гидратации пыльцевого зерна на рыльце пестика постепенное снижение концентрации калия снимает блок с трансляции различных мРНК не одновременно. В первые минуты гидратации пыльцевого зерна Brassica на рыльце синтезируются исключительно белки, отвечающие за определение совместимости пыльцы и рыльца (Bashe, Mascarenhas, 1984). Возможно, это связано с избирательной трансляцией мРНК в присутствии высоких концентраций одновалентных ионов.

Rehman с сотрудниками (2004) с использованием метода рентгеноспектрального микроанализа обнаружили неравномерное распределение калия в стенке и в цитоплазме пыльцевого зерна ячменя в период гидратации. Высокие концентрации калия были отмечены в области апертуры и в цитоплазме, прилегающей к апертуре. Этот вывод был подтвержден методом конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (Rehman, Yun, 2006). Авторы предположили, что К+ участвует в формировании осмотического градиента на мембране в апертурной области, и тем самым способствует быстрой гидратации пыльцевого зерна.

В классической работе Weisenseel с коллегами (1975) с применением неселективных микроэлектродов (vibrating probe) впервые было показано, что в пыльцевом зерне лилии есть входные и выходные ионные токи, причем в процессе прорастания токи появляются не сразу, а только после 30-80 минут инкубации. Сначала токи слабые и неустойчивые, но после 1-3 часов инкубации становились сильными и устойчивыми. Максимальный входной ток до прорастания зерна наблюдался на том полюсе, откуда в дальнейшем появлялась трубка, а максимальный выходной ток - на противоположном полюсе. В проросшем пыльцевом зерне интенсивный входной ток распределен вдоль пыльцевой трубки, а выходной ток локализован в основании трубки и в пыльцевом зерне (Weisenseel et al., 1975). На основании экспериментов по изменению состава наружного раствора Weisenseel и Jaffe (1976) пришли к заключению, что основной вклад в обнаруженный входной ионный ток вносит К+.

В более поздней работе Fan с сотрудниками (2001) проводили исследования входных ионных токов на протопластах, выделенных из пыльцевого зерна арабдопсиса, с помощью неселективного электрода. Природу входящего катиона авторы определяли по величине обращенного потенциала, который был близок к равновесному калиевому потенциалу. Подтверждением того, что ток проходит через калиевые каналы, служила выраженная зависимость потока от концентрации калия в наружном растворе, а также влияние на данный поток ингибиторов калиевых каналов Ва2+ и ТЕА+(tetraethyl ammonium).

Messerli с соавторами (1999) с помощью ионоселективных электродов показали, что калий входит в пыльцевую трубку через ее кончик. В последующих работах в пыльце были идентифицированы различные калиевые каналы (Mouline et al., 2002; Fan et al., 2003; Dutta, Robinson, 2004; Becker et al., 2004).

Dutta и Robinson (2004) обнаружили в пыльцевых зёрнах Liliiun longiflorum калиевые каналы двух типов: активируемые при растяжении мембраны и нечувствительные к растяжению. Каналы обоих типов были локализованы в плазмалемме протопласта, выделенного из пыльцевого зерна, исключая определенную область (предположительно, область апертуры). Они также отсутствовали в субпротопластах, полученных из апикальной части пыльцевой трубки.

Mouline с сотрудниками (2002) идентифицировали у Arabidopsis ген входного калиевого канала SPIK1 (Shaker Pollen Inward К ), который специфически экспрессируется в мужском гаметофите. Этот ген экспрессировался в пыльцевых зернах и в пыльцевых трубках на разных стадиях их роста in vivo и in vitro. Данный канал, как показала экспрессия в гетерологичной системе, активируется при гиперполяризации плазмалеммы, он чувствителен к рН среды, но нечувствителен к внеклеточной концентрации Са2+. Инсерция Т-ДНК, нарушающая формирование канального белка, приводила к значительному снижению интенсивности калиевого тока, входящего в пыльцевое зерно (Mouline et al., 2002), Авторы отмечают, что в протопластах присутствовал также выходной калиевый ток, который не был связан с данными каналами. Прорастание и рост пыльцевых трубок in vitro у мутанта spik-1 были в значительной мере подавлены по сравнению с диким типом, однако не были блокированы полностью (Mouline et al., 2002). Весьма вероятно, что это остаточное прорастание, как и остаточный ток К+, поддерживается за счет активности других К+ каналов, например, ТРК4 (tandem gore К+ channel).

Эти потенциал-независимые калиевые каналы были обнаружены в плазмалемме пыльцевой трубки арабидопсиса (Becker et al., 2004). Полагают, что эти каналы участвуют в поддержании калиевого гомеостаза и регуляции мембранного потенциала. Активность ТРК4, в отличие рассмотренного выше канала SPIK1, модулируется внеклеточным Са и концентрацией протонов в цитоплазме (Becker et al., 2004). Благодаря своей слабой зависимости от потенциала, AtTPK4 активен при всех значениях мембранного потенциала более положительных, чем -100 мВ, SPIK1 же, напротив, открывается при значениях потенциала более отрицательных, чем -100 мВ. Мгновенное закрытие AtTPK4 при закислении цитоплазмы может минимизировать неконтролируемый выход калия в определенных зонах, например, в кончике трубки, где наблюдается кислый рН, и таким образом способствовать неоднородному распределению потенциала на мембране (Becker et al., 2004). Взаимодополняющие свойства двух калиевых каналов могут обеспечивать тонкую регулировку мембранного потенциала и осмотических свойств пыльцевой трубки.

Анионный транспорт в пыльцевом зерне и в трубке

В соматических клетках растений и в клетках животных анионные каналы являются важной составляющей общей системы ионной регуляции физиологических процессов. Активность анионных каналов тесно связана с повышением концентрации ионов кальция в цитозоле. Наиболее детально эта взаимосвязь исследована в связи с регуляцией устьичных движений (De Angeli et al., 2007) и реализацией ответа на внедрение патогена (Ebel et al., 1995; Wendehenne et al., 2002). Следует также отметить связь анионного транспорта с трансмембранным переносом К+, которую наглядно иллюстрируют процессы осморегуляции при адаптации к осмотическому стрессу (Shabala et al., 2000), росте растяжением (Heslop-Harrison, Reger, 1985) и регуляции устьичных движений (Barbier-Brygoo et al., 2000). Вопрос о том, в какой мере эти представления распространяются на мужской гаметофит, остается открытым.

Данные об участии анионного транспорта в прорастании весьма немногочисленны и противоречивы. Zonia с соавторами (2002) исследовали хлоридные токи в растущей пыльцевой трубке Lilium longiflorum. Они показали, что хлорид-ионы в апикальной зоне пыльцевой трубки выходят из цитоплазмы, а вход начинается на расстоянии 12 мкм от кончика трубки, т.е. поток хлорид-ионов в пыльцевой трубке направлен от базальной части к апикальной. Интересно, что колебания потока СГ совпадают по фазе с колебаниями скорости роста. В связи с этим Zonia с соавторами (2002) исследовали временную корреляцию потоков С1 со структурными изменениями в пыльцевой трубке Nicotiana tabacum, обеспечивающими её рост. Были получены данные об увеличении количества везикул и органелл в апикальной области (3-4 мкм от апикальной стенки) в момент, когда скорость роста максимальна. Выявлена временная корреляция между выходом С1 и движением везикул и органелл по направлению к растущему кончику трубки.

В этой связи важно отметить, что в исследованиях, проведенных на клетках животных, обнаружена зависимость процессов везикулярного транспорта от концентрации С1 в цитозоле и от активности анионного транспорта через мембраны везикул (Faundez, Hartzell, 2004). В ранней работе Xie с соавторами (1983) было показано, что активность Н^-АТФазы на мембране везикул зависит от концентрации С1 в цитоплазме, а ингибитор анионных каналов DIDS блокирует закисление клатриновых везикул. Однако для установления возможной связи между этими процессами в пыльцевой трубке требуются дополнительные исследования.

Messerli с сотрудниками (2004) поставили под сомнение результаты, полученные Zonia с соавторами (2002). Согласно данным Messerli с сотрудниками (2004), осциллирующие хлоридные токи являются артефактом и обусловлены колебаниями рН в среде, окружающей кончик трубки. Ионоселективный электрод, использованный в работах этих авторов, был в такой же мере специфичен к NO3 , как и к С1 . Кроме того, он реагирует на изменение концентрации 2-(М-морфолин)-этансульфоновой кислоты (MES), цвиттерионного компонента буферов, используемых в экспериментах с пыльцевыми трубками. Из-за колебаний рН происходит протонирование и депротонирование MES, что может имитировать изменение концентрации хлорид-ионов.

По мнению Hepler с соавторами (2006), нельзя исключить, что различия в результатах, полученных в этих двух научных группах, обусловлены техническими особенностями постановки эксперимента. По-видимому, ограничения микроэлектродного метода не позволяют однозначно ответить на вопрос об участии С1 в росте пыльцевой трубки. Очевидна необходимость применения альтернативного метода, например, флуоресцентного. Этот метод, хотя и не позволяет регистрировать потоки тех или иных ионов, дает возможность выявить изменения интегрального параметра ионной регуляции - мембранного потенциала.

Данные, полученные с применением ингибиторного анализа, указывают на важную роль трансмембранного переноса анионов в процессе прорастания. Матвеева с соавторами (20036) исследовали вклад трансмембранного переноса хлорид-ионов в прорастание пыльцевого зерна табака с применением ионоселективных электродов. При этом было показано, что ингибиторы анионных каналов (NPPB - 5-nitro-2-(3-phenylpropylamino) benzoic acid, DIDS - 4,4'-diisocyanato-stilbene-2,2'-disulfonic acid и нуфлимовая кислота), в отличие от блокаторов симпортеров и антипортеров, полностью подавляют прорастание (Матвеева и др., 20036). Наиболее эффективно действовал NPPB, который в концентрации 50 мкМ снижал скорость выхода С1 более чем в 3 раза. Таким образом, был обнаружен выход хлорид-ионов из пыльцевых зерен, однако чувствительность ионоселективных электродов такова, что выход С1 можно наблюдать только при очень высокой концентрации пыльцы в среде. Эти условия не оптимальны для прорастания, и для подтверждения этих данных в ситуации, более приближенной к условиям in vivo, требуется применение альтернативного метода с более высокой чувствительностью.

Zonia с соавторами (2002) исследовали действие ингибиторов анионных каналов на рост пыльцевой трубки и её тургорные свойства. Они показали, что различные ингибиторы (NPPB, нуфлимовая кислота, DIDS) в концентрациях 20, 40 и 80 мкМ, соответственно, полностью блокируют рост трубки. При этом объём трубок увеличивается почти в два раза, и более чем у 90% трубок в присутствии 80 мкМ DIDS происходит разрыв апикальной мембраны в течение 5-10 минут. В эксперименте с инозитол-3,4,5,6-тетрафосфатом (1Р4) было показано, что введение этого соединения в цитоплазму пыльцевой трубки вызывает замедление роста (на 85%) и патологическое увеличение клеточного объёма (Zonia et al., 2002). Это позволило предположить, что анионные каналы в апикальной части пыльцевой трубки лилии и табака работают аналогично хлоридным каналам в клетках человека. Каналы этого типа активируются ионами кальция и негативно регулируются 1Р4. На основании полученных данных эти авторы высказали предположение о том, что главная функция анионных каналов в пыльцевой трубке — регуляция осмотического баланса.

Интересным примером участия анионного транспорта в осморегуляции в процессе клеточного роста может служить рост тканей пестика Pennisetum americamim. В ранней работе Heslop-Harrison и Reger (1985) было показано, что высокое тургорное давление в трихомах рыльца обеспечивается притоком в клетки пестика К+ и СГ. При этом в направлении от завязи к верхней части рыльца концентрация этих ионов заметно возрастает. В соответствии с этим градиентом вода движется к верхней части рыльца, обеспечивая быстрое растяжение клеток.

Участие анионного транспорта в осморегуляции и изменении клеточного объема достаточно подробно исследовано на соматических клетках. К числу наиболее изученных объектов относятся замыкающие клетки устьиц. Показано, что анионные каналы в этих клетках активируются в ответ на обработку АБК (Schroeder et al., 1993). Выход хлорид-иона и малата через анионные каналы ведёт к деполяризации плазматической мембраны, которая, в свою очередь, активирует потенциал-зависимые калиевые каналы, и в то же время служит движущей силой для выхода К+ (Barbier-Brygoo et al., 2000). Выход анионов и калия приводит к снижению тургорного давления и закрыванию устьиц.

Регуляция объёма пыльцевой трубки включает несколько сигнальных механизмов, связанных с фосфолипидной системой (Zonia, Munnik, 2004). Гипоосмотический стресс вызывал быстрое увеличение концентрации фосфатидной кислоты и уменьшение концентрации фосфатидилинозитолдифосфата (РГРг)- Гиперосмотический стресс при добавлении в среду инкубации 0.1-0.4 М NaCl, напротив, вызывал повышение концентрации Р1(3,5)Р2 и Р1(4,5)Р2 и уменьшение концентрации фосфатидной кислоты. Р1(4,5)Р2 является важным фактором, регулирующим активность ADF (actin depolymerizaing factor). Высокая концентрация Р1Р2 в апикальной мембране, предположительно, должна препятствовать высокой активности ADF в примембранной области, что имеет большое значение для сборки актиновых филаментов (Cheung, Wu, 2008). Таким образом, фосфолипидная система играет важную роль в поддержании таких жизненно важных функций пыльцевой трубки, как регуляция клеточного объема и конфигурации актинового цитоскелета (Zarsky et al., 2006). Вместе с тем, эта система связана с ионными механизмами осморегуляции, в том числе, с анионными каналами (Zarsky et al., 2006), однако эта связь ещё мало изучена.

Следует отметить, что в исследованиях роли анионных каналов в трансдукции сигналов в соматических клетках растений весьма продуктивным оказалось использование специфических ингибиторов этих каналов. В качестве примеров можно привести работы по изучению роста гипокотилей и взаимодействия растения с патогеном.

Cho и Spalding (1996) с применением ингибиторного анализа показали участие анионных каналов в регуляции удлинения гипокотиля у проростков Arabidopsis. Остановке роста гипокотиля при действии синего света предшествовала деполяризация плазматической мембраны. В присутствии ингибитора анионных каналов NPPB оба эффекта были подавлены. На основании этих данных был сделан вывод о том, что анионные каналы являются важным звеном в цепи трансдукции сигнала от флавопротеинового фоторецептора.

Позднее Thomine с соавторами (1997) с помощью ингибиторного анализа показали участие анионных каналов в регуляции роста гипокотиля ауксинами. Ауксины ингибируют удлинение гипокотилей, вызывают дезинтеграцию кортикальных слоев клеток и формирование адвентивных корней на гипокотилях Arabidopsis, выращенных в темноте. DIDS и другие блокаторы анионных каналов способны с различной эффективностью подавлять указанные ответы на ауксины. Этот компонент сигнального каскада, по-видимому, является специфичным для ауксинов, поскольку ингибиторы не способны снимать аналогичный ответ гипокотиля на этилен или цитокинины.

Быстрая реакция на внедрение патогена или обработку клеток элиситором, предшествующая экспрессии генов защиты от патогена, как правило, включает изменения мембранного потенциала и ионных токов (Ward et al., 1995). Например, сигнальный каскад в клетках сои, индуцированный элиситором Р-глюканом, который ведёт к активации фитоалексиновой защиты, включает изменения проницаемости мембраны для Са2+ и It. Блокаторы анионных каналов подавляли продукцию фитоалексинов и индуцибельные ионные токи в ответ на действие (3-глюкана (Ebel et al., 1995). В суспензии клеток табака элиситор криптогеин индуцировал быстрый и интенсивный выход анионов (Wendehenne et al., 2002). В то же время концентрация кальция в цитозоле изменялась сложным образом: быстрый пик сопровождался снижением и затем долговременным повышением [Са ]. Блокаторы анионных каналов, такие, как нифлумовая кислота и NPPB, подавляли эффект элиситоров на разных уровнях, включая выход анионов, активацию MAP (mitogen activated protein)-KHHa3Horo каскада и индуцированную транскрипцию генов защиты от патогенов (Wendehenne et al., 2002).

Исследования соматических клеток растений показали, что важнейшей функцией анионных каналов является контроль величины потенциала на плазматической мембране (Jentsch et al., 2002). Так, в рассмотренных выше примерах анионные каналы участвовали в изменении потенциала при трансдукции сигналов от фитогормонов (Thomine et al., 1997; Barbier-Brygoo et al., 2000), элиситоров (Ebel et al., 1995; Wendehenne et al., 2002) и фоторецепторов (Cho, Spalding, 1996). Вместе с тем, активность некоторых каналов зависит от величины мембранного потенциала, что делает возможным их регуляцию по принципу обратной связи (Roberts, 2006).

В исследованиях анионных каналов мужского гаметофита совершенно не затронутыми остались вопросы, относящиеся к внутриклеточным анионным каналам. В то же время результаты, полученные в последние годы на соматических клетках растений и клетках животных, свидетельствуют о том, что эти каналы присутствуют во всех органеллах и могут выполнять жизненно важные функции (Faundez, Hartzell, 2004).

Наиболее изучены анионные каналы митохондрий и транспортных везикул. В наружной митохондриальной мембране обнаружены потенциал-зависимые анионные каналы (voltage-dependent anion channel - VDAC) (Kusano et al., 2009). Они найдены в клетках грибов, животных и растений. VDAC представляют собой каналы большого диаметра (2,5-3 нм в полностью открытом состоянии) (Rapizzi et al., 2002). В открытом состоянии эти каналы проницаемы для анионных метаболитов, таких, как АТФ, АДФ и неорганический фосфат, но через них также могут проходить катионы, включая Са2+, К+, и Na+, и макромолекулы (<3 нм в диаметре; <6 кДа) (O'Rourke, 2007). Когда канал находится в закрытом состоянии, диаметр поры сокращается до 1,8 нм, но она продолжает быть I проницаемой для катионов: проницаемость для К снижается на 60%, Са проходит свободно, а поток АТФ, НРО4 " и сукцината оказывается в значительной мере подавлен (Vander Heiden et al., 2000; O'Rourke, 2007). Предполагают, что VDAC регулируют обмен метаболитами между митохондриями и цитозолем (O'Rourke, 2000). Наиболее детально изучена функция VDAC, связанная с программируемой клеточной смертью у животных и растений: этот канал входит в состав РТР (permeability transition роге), через которые в цитозоль выходят факторы апоптоза (Godbole et al., 2003; Полесская, 2007). Заслуживает внимания тот факт, что ингибитор анионных каналов DIDS предотвращал программируемую клеточную смерть в семядолях огурца (Godbole et al., 2003).

Физиологическая роль анионных каналов внутренней мембраны митохондрий IMAC (inner membrane anion channel), обнаруженных в клетках животных, ещё до конца не выяснена. Предполагают, что IMAC вместе с К+/КГ антипортером участвует в поддержании объема митохондрий (Beavis, 1992), служит для выхода из митохондрий супероксид-радикала (Vanden Hoek et al. 1998) и вносит вклад в колебания мембранного потенциала митохондрий (O'Rourke 2000).

Сходные по свойствам с IMAC анионные каналы были обнаружены в митохондриях клубней картофеля (Beavis, Vercesi, 1992) и твердой пшеницы (Laus et al., 2008) и названы PIMAC (plant inner membrane anion channel). Важное отличие этих каналов от IMAC заключается в том, что активность PIMAC не блокируют ионы Mg , присутствующие в матриксе. Через эти каналы проходят хлорид-ионы, ди-, три- и оксодикарбоновые кислоты, а также неорганический фосфат (Laus et al., 2008).

Принято считать, что анионный транспорт через PIMAC играет важную роль в регуляции объема митохондрий (Beavis, Vercesi 1992). В митохондриях, поддерживаю щих высокий потенциал, PIMAC может служить для выхода из матрикса анионов, и в том числе малата, внося вклад в функционирование малат/оксалоацетатного шаттла (Beavis, Vercesi

1992). По данным других авторов, высокая концентрация АТФ и высокий потенциал на внутренней митохондриальной мембране, напротив, поддерживают РШАС в неактивном состоянии (Laus et al., 2008).

Участие анионных каналов в регуляции везикулярного транспорта изучалось, в основном, на клетках животных. Подробный анализ результатов их исследований дан в обзоре Faundez и Hartzell (2004). Эти исследования показали, что трансмембранный анионный транспорт регулирует образование и созревание везикул, а также их слияние с плазматической мембраной за счёт модуляции мембранного потенциала, активности Н^-АТФазы и, возможно, других, ещё не выясненных механизмов. Можно предположить, что сходные регуляторные механизмы присутствуют и в растительных клетках с интенсивным везикулярным транспортом, к числу которых относятся вегетативная клетка активированного пыльцевого зерна и пыльцевая трубка.

Мембранный потенциал вегетативной клетки пыльцевого зерна и пыльцевой трубки

В ряде работ, посвященных изучению электрических свойств плазматической мембраны вегетативной клетки пыльцевого зерна и активности калиевых каналов, приводятся значения потенциала на этой мембране, а также на плазмалемме пыльцевой трубки растений разных видов. К наиболее ранним относится работа Weisenseel и Wenisch (1980). Значение мембранного потенциала невакуолизированных пыльцевых зёрен лилии на начальном этапе прорастания составляло от -90 до -130 мВ. В более позднем исследовании, проводившемся с использованием усовершенствованных микроэлектродных методов, получены сходные значения потенциала для пыльцы лилии (от -110 мВ до -150 мВ) (Obermeyer, Blatt, 1995). В обзоре Feijo с соавторами (1995) приводятся значения мембранного потенциала для пыльцевых зёрен Petunia hybrida (

30 мВ) и Narcissus (-37 мВ). Мембранный потенциал протопластов, выделенных из пыльцевых зёрен Brassica chinensis, измеренный Fan с сотрудниками (2003) с помощью микроэлектродов, составлял -79 мВ. Значение мембранного потенциала пыльцевого зерна табака на самом начальном этапе активации, по данным Матвеевой с сотрудниками (2004), составляло -16 мВ. В этой работе для определения величины мембранного потенциала была использована количественная флуоресцентная микроскопия.

Данные о мембранном потенциале пыльцевой трубки также противоречивы, однако при анализе этих данных следует учитывать специфику объектов. Так, в работе Malho с сотрудниками (1995) было получено значение мембранного потенциала пыльцевой трубки Agapanthus umbellatus, равное -55 мВ. Мембранный потенциал пыльцевых трубок Arabidopsis был равен -100 ± 2 мВ (Mouline et al., 2002).

Впервые вопрос о возможных изменениях мембранного потенциала при прорастании был поставлен в ранних работах Weisenseel и Wenisch (1980) и Obermeyer и Blatt (1995). Obermeyer и Blatt (1995) исследовали мембранный потенциал и трансмембранный перенос калия в пыльцевом зерне лилии. При этом рост пыльцевых трубок был ингибирован отсутствием в среде бора. Было показано, что популяцию пыльцевых зерен, культивируемых в одинаковых условиях, можно подразделить на две группы. Значение мембранного потенциала в первой группе очень близко к значению равновесного калиевого потенциала, а в другой группе он сдвинут в область отрицательных значений. Авторы предположили, что на мембране клеток второй группы активно работает электрогенная АТФ-аза, т.к. при добавлении 1мМ NaCN, блокирующего электронтранспортную цепь дыхания и, как следствие, подавляющего синтез АТФ, происходит деполяризация в пыльцевых зёрнах второй группы до уровня первой группы. Аналогичный ответ у пыльцевых зёрен первой группы отсутствовал. После отмывания клеток средой инкубации мембранный потенциал возвращался к исходному значению.

Аналогичные данные были получены ранее Weisenseel и Wenisch (1980). В этом исследовании также была обнаружена гетерогенность популяции пыльцевых зёрен по величине мембранного потенциала, причем понижение температуры вызывало деполяризацию в клетках группы с более отрицательным потенциалом. Авторы сделали вывод об участии протонной помпы в регуляции потенциала на плазматической мембране вегетативной клетки пыльцевого зерна.

Результаты этих работ можно также рассматривать как косвенное свидетельство в пользу предположения об изменении мембранного потенциала при прорастании. Однако воздействия цианидом и температурой не являются специфическими, поэтому для установления этих фактов требуются дополнительные исследования. Не было исследовано также распределение мембранного потенциала на поверхности пыльцевого зерна и трубки. Можно было ожидать, что полярное распределение ионных токов, рассмотренное в данной главе, приводит к возникновению областей высокого и низкого потенциала и (или) градиента потенциала. Для выявления участия анионных каналов в регуляции этого показателя необходимо было провести измерения мембранного потенциала в нескольких временных точках и на разных участках клеточной поверхности.

Обобщая результаты рассмотренных выше исследований прорастания пыльцевого зерна и роста трубки, мы приходим к заключению, что протекание этих процессов существенным образом определяется характером транспорта ионов через плазматическую мембрану. Наиболее изучен в этом отношении транспорт ионов кальция и протонов. Меньше известно о трансмембранном переносе ионов калия. Анионный транспорт остается наименее изученным. Противоречивость данных, полученных с помощью микроэлектродов, указывает на необходимость новых методических подходов к решению данного вопроса. *

Целью настоящей работы явилось исследование роли трансмембранного переноса анионов в инициации прорастания пыльцевого зерна и регуляции роста пыльцевой трубки.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи.

• Изучение прорастания пыльцевого зерна и роста пыльцевой трубки в условиях блокирования трансмембранного переноса хлорид-ионов и подавления активности анионных каналов.

• Изучение возможного выхода анионов из пыльцевых зерен в окружающую среду на начальном этапе прорастания.

• Установление возможной взаимосвязи между активностью анионных каналов и компартментацией органелл в пыльцевой трубке.

• Анализ динамики трансмембранного потенциала в прорастающем пыльцевом зерне и его пространственного распределения вдоль плазмалеммы с целью установления вклада анионных каналов в регуляцию этого показателя.

• Изучение действия на митохондрии, выделенные из пыльцевых трубок, ингибиторов анионных каналов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследования

Растительный материал. Растения лилии Lilum longiflorum Thunb. сорта White Europe в срезанном виде приобретали в магазине. Растения табака Nicotiana tabacum L. сорта Petit Havana SRI выращивали из семян в климатической камере (25°С, 16-часовой световой день), поливая их раствором минеральных солей (Nitsch, 1965). Пыльники извлекали из цветков накануне их раскрывания и помещали в термостат (25°С) на двое суток. Таким образом достигались стандартные условия созревания пыльцы. Сухую пыльцу собирали в пробирки из раскрывшихся пыльников и хранили при -20°С. После размораживания пыльцевые зерна промывали гексаном или диэтиловым эфиром для удаления липофильных покровных материалов и высушивали на воздухе. Навески пыльцы инкубировали во влажной камере при 25°С (1 ч для лилии и 2 ч для табака), после чего их использовали для получения культур пыльцевых зерен или протопластов.

Культивирование пыльцевых зерен in vitro проводили при 25°С в стандартной питательной среде, содержащей 0,3 М сахарозы, 1,6 мМ Н3ВО3, 3 мМ Ca(N03)2, 0,8 мМ MgS04 и 1 мМ KN03 в 25 мМ MES-Tris буфере, рН 5,9 (Benito Moreno et al., 1988). Для выделения протопластов пыльцу лилии инкубировали в стандартной среде с добавлением ферментов целлюлазы и пектиназы (по 1%), рН 5,8 и 0,5 М сахарозой (Tanaka et al., 1987) в течение 2 ч при 30°С, затем отмывали той же средой без ферментов и немедленно использовали для окрашивания, либо фиксировали. Выделение протопластов контролировали общепринятым методом (Tanaka et al., 1987), окрашивая пробы флуоресцентным красителем Calcofluor White M2R (Fluorescent Brightener 28, Sigma), который выявляет присутствие клеточной стенки. Среду с высокой концентрацией хлорид-иона получали добавлением 4М НС1, доводя рН до

5,9 бис-трис-пропаном (0,5 М). Среду готовили на дистиллированной воде, используя химически чистые реактивы.

При необходимости пыльцевые зерна и трубки по окончании культивирования фиксировали 2% раствором параформальдегида в Na-фосфатном буфере рН 7,4, добавляя его к культуре пыльцевых зерен в соотношении 1:1. Пробы фиксировали при 6°С в течение 15 часов. Перед окраской пробы отмывали от фиксатора. Эта процедура включала двукратную смену 50 мМ Na-фосфатного буфера, рН 7,4, с осаждением клеток центрифугированием (90 сек, 3000 g), инкубацию в течение 30 мин в стандартной среде и перенос клеток в свежую порцию той же среды.

Определение эффективности прорастания пыльцы.

Для подсчёта эффективности прорастания пыльцевые зёрна инкубировали 60 минут и затем фиксировали. Подсчёт вели в камере Горяева, на каждом препарате просчитывали 500 клеток. Проросшими считали пыльцевые зёрна с трубкой длиной не менее радиуса.

Определение скорости роста и диаметра пыльцевых трубок.

Среднюю скорость роста трубок определяли как разность между средними длинами трубок из одной суспензии пыльцы, фиксированных после 70 и 85 минут инкубации, деленную на временной интервал (15 минут). Выборка включала пыльцевые трубки длиной не менее радиуса пыльцевого зерна. Ингибитор добавляли в опытный вариант после 60 минут инкубации. Для определения диаметра трубки измеряли её ширину на расстоянии 5 мкм от кончика. Длину и ширину трубок определяли с помощью компьютерной морфометрии.

Флуоресцентная микроскопия

Определение величины мембранного потенциала

Принцип метода. Величину мембранного потенциала определяли с использованием анионного красителя DiBAC4(3) (Bis(l,3-dibutylbarbituric acid(5)) trimethine oxonol) (Molecular probes, Нидерланды), поступление которого в клетку зависит от потенциала на плазматической мембране (Emri et al., 1998). Расчет значений потенциала в мВ проводили по методу Emri с соавторами (1998), используя формулу:

Е = (RT/F)Tn(I/Io) где R — универсальная газовая постоянная, 8,31 Дж/К-моль; Т — абсолютная температура, К; F - число Фарадея, 96,490 Дж/мВ-моль, I — интенсивность флуоресценции тестируемой клетки; 10 - интенсивность флуоресценции полностью деполяризованной клетки в фиксированной пробе. Для пыльцевых зёрен две последних величины включали поправку на неспецифическое связывание липофильного красителя с наружным слоем оболочки пыльцевого зерна (экзиной). Эта поправка была получена при измерении интенсивности флуоресценции фрагментов отмытой от трифины и содержимого цитоплазмы оболочки. Вклад оболочки составлял около 15% от интенсивности флуоресценции фиксированных клеток. Для получения фрагментов оболочки пыльцевые зёрна разрушали с помощью электрического гомогенизатора (Heidolph, Германия). Поскольку стенка пыльцевой трубки лишена липофильного слоя, в этом случае не было необходимости вводить поправку.

Оптимизация условий окрашивания. Для определения оптимальной концентрации красителя изучали зависимость интенсивности флуоресценции фиксированных пыльцевых зерен от концентрации красителя и находили линейный участок. На рисунке представлены две кривые, соответствующие 10 и 30 минутам инкубации пыльцевых зёрен в стандартной среде. Из рисунка видно, что в диапазоне концентраций 5-10 мкМ эти кривые линейны и практически совпадают. Оптимальная концентрация красителя (5 мкМ) была выбрана в середине линейного участка. В дальнейшем в каждом опыте наряду с живыми клетками окрашивали тем же раствором красителя пыльцевые зерна или трубки, фиксированные накануне.

Процедура окрашивания. Окрашивание живых клеток проводили при 25°С в течение 10 минут, добавляя краситель в конце инкубации. Фиксированные клетки после отмывания (см. выше) окрашивали аналогичным образом. Конечная концентрация красителя составляла 5 мкМ.

5000 в s ts аз

4>

Я U 4> а о a н о

4000

3000

2000

1000 д

10 минут -а--- 30 минут

I-1-1-1-1-1-1

2 4 6 8 10 12 14 концентрация красителя, мкМ

Рисунок. Зависимость интенсивности флуоресценции фиксированных пыльцевых зёрен от концентрации DiBAC4(3) в стандартной среде инкубации. Время инкубации 10 и 30 минут.

Картирование мембранного потенциала на поверхности клеток Для картирования мембранного потенциала на поверхности клеток использовали Di-4-ANEPPS (3-(4-(2-(6-(dibutylamino)-2-naphthyl)-trans-ethenyl)pyridmium)propanesulfonate) - краситель, который встраивается в мембрану и изменяет спектральные характеристики в зависимости от потенциала (Loew, 1996). При его использовании, как правило, измеряют интенсивность флуоресценции, возбуждаемой в двух диапазонах (синей и зеленой областях спектра). Их отношение (Fb/Fg) является мерой мембранного потенциала на данном участке мембраны. Таким образом, использование этого красителя позволяет выявлять локальные изменения мембранного потенциала в пределах одной клетки.

Протопласты суспендировали в растворе Di-4-ANEPPS и после осаждения центрифугированием (250 g) немедленно микроскопировали. Пыльцевые трубки окрашивали в капле на предметном стекле, смешивая суспензию проросших пыльцевых зерен с раствором красителя и немедленно микроскопировали. В опытах с двойной окраской протопласты сначала окрашивали DiBAC4(3), затем к суспензии добавляли раствор Di-4-ANEPPS. Конечная концентрация красителя составляла 5 мкМ для пыльцевых трубок и 10 мкМ для протопластов.

Выявление транспортных везикул и митохондрий в пыльцевых трубках

Транспортные везикулы выявляли по методу Parton с соавторами (2001), окрашивая пыльцевые трубки липофильным красителем FM4-64 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(6-(4-(diethylamino)phenyl) hexatrienyl) pyridinium dibromide) (Molecular probes), который проникает в живую клетку только путем эндоцитоза и окрашивает различные популяции везикул (Samaj, 2005). Конечная концентрация красителя составляла 8 мкМ.

Митохондрии выявляли, окрашивая пыльцевые трубки флуоресцентным красителем NAO (10-N-nonyl acridine orange) (Molecular probes), который специфически связывается с кардиолипином митохондриальных мембран (Mileykovskaya et al., 2001), либо DiOC5(3) (3,3'-dipentyloxacarbocyanine iodide (Molecular probes), который накапливается в митохондриях в зависимости от их потенциала. Конечная концентрация красителей составляла 5 мкМ и 1 мкМ, соответственно. Клетки окрашивали в течение 10 минут.

Микроскопия, фотографирование и компьютерный анализ изображения.

В работе использовали моторизованный микроскоп Axioplan 2 imaging MOT (Zeiss, Германия) с программным обеспечением AxioVision 4.5 - 4.7, оснащенный цифровой камерой AxioCam HRc. Флуоресценцию возбуждали в диапазоне длин волн 359-371 нм и регистрировали при длинах волн больше 397 нм (в случае Calcofluor White M2R, DIDS), или возбуждали в диапазоне 475-495 нм и регистрировали при 515-565 нм (DiBAC4(3), NAO, DiOC3(3)), либо возбуждали в синей (475-495 нм) или зеленой (540-552 нм) области спектра, а регистрировали при длинах волн, больших 590 нм (Di-4-ANEPPS). Флуоресценцию FM4-64 возбуждали в диапазоне длин волн 540-552 нм, регистрировали при длинах волн, больших 590 нм. Препараты фотографировали с использованием скоростной автоматической заслонки, которая позволяла освещать препарат только в момент съёмки и делать серии фотографий с определенным временным интервалом и заданной выдержкой. Денситометрию и морфометрию объектов проводили с помощью указанного пакета программ.

Спектрофлуориметрия

Выход анионов из пыльцевых зерен.

Выход анионов из пыльцевых зерен в раствор выявляли с помощью флуоресцентного индикатора MEQ (6-methoxy-N-ethylquinolinium iodide) (Molecular Probes), флуоресценция которого тушится С1 без образования устойчивого комплекса с ионом (Verkman et al., 1989). Стандартные навески пыльцевых зёрен инкубировали в среде, содержащей 5 мкМ MEQ, в течение 2 или 10 мин. Затем пыльцу осаждали центрифугированием (60 сек, 3000 g) и измеряли интенсивность флуоресценции красителя. В работе использовали спектрофлуориметр RF-5301PC (Shimadzu, Япония). Флуоресценцию возбуждали при 344 нм, регистрировали при 445 нм.

Выход активных форм кислорода из митохондрий.

Выход активных форм кислорода из пыльцевых зерен в раствор выявляли с помощью деэтерифицированной формы красителя DCFH (Cathcart et al., 1983, Смирнова и др., 2009).

Электронная микроскопия

Проросшие пыльцевые зерна (75 мин инкубации) фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом в стандартной среде прорастания с последующей постфиксацией 1%-ным тетроксидом осмия и 2%-ным уранилацетатом в 70%-ом этаноле (Миронов и др., 1994). После обезвоживания материал заливали в эпоксидную смолу. Изготовленные алмазным ножом на ультратоме LKB Ultratome V и смонтированные на медных сеточках ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца по Рейнолдсу (Гайер, 1974). Образцы исследовали на электронном трансмиссионном микроскопе JEM - 100В (Jeol, Япония).

Проточная цитофлуориметрия суспензии изолированных митохондрий

Получение изолированных митохондрий (по Romagnoli et al., 2007, с изменениями).

Митохондрии выделяли из пыльцы табака, которая прорастала в стандартной среде в течение 2,5 часов. Проросшую пыльцу собирали на 40 мкм нейлоновом фильтре с помощью вакуумного насоса и промывали буфером для промывки, который включал 0,3 М маннит, 2 мМ ЭГТА, 2 мМ MgCl2 в 25 мМ HEPES буфере, рН 7,2. Затем пыльцу переносили в буфер для выделения следующего состава: 0,3 М маннит, 2 мМ ЭГТА, 2 мМ MgCl2> 4 мМ цистеин, 0,4 мМ PMSF, 1 мкл/мл ингибиторный коктейль Sigma в 25 мМ HEPES буфере, рН 7,5. Пыльцу разрушали с помощью электрического гомогенизатора Diax 900 (Heidolph, Германия) при 17000 об/мин в течение 45 сек. Очистку от неразрушенных клеток и крупных фрагментов производили путем двухступенчатого центрифугирования: 5 минут при 1500g, затем 10 минут при 6000g.

Митохондрии осаждали центрифугированием в течение 10 минут при 12000g. Полученный осадок растворяли в буфере для выделения и наносили на Перколл. Градиент Перколла включал два слоя: нижний - 40% и верхний - 23%. Центрифугирование в градиенте Перколла проводили при 12000g в течение 30 мин. Митохондриальная фракция образовывала полосу в верхнем слое Перколла. Её переносили на мембранный фильтр 0,22 мкм (Millipore, США), отмывали от Перколла буфером для промывки, затем смывали с фильтра и хранили в буфере для промывки в настольном холодильнике Therma System (Eppendorf, Германия) в течение 2-5 часов. Все операции проводили при 4°С. Буфер для промывки и хранения митохондрий, а также для приготовления рабочих растворов красителей и ингибиторов фильтровали через мембранный фильтр 0,22 мкм (во избежание попадания частиц пыли в проточный цитометр).

Проточная цитометрия изолированных митохондрий.

В работе использовали проточный цитометр FACSCalibur, оснащенный 488-нм аргоновым лазером (Becton Dickinson, США). Популяцию митохондрий идентифицировали, используя специфичный краситель NAO. Конечная концентрация красителя составляла 1 мкМ, окрашивание длилось 10 минут при температуре 4°С. В каждой пробе просчитывали 10.000 частиц, попавших в выделенный регион. Флуоресценция всех использованных красителей считывалась в канале F-1 (530 ±15 нм). Обработку данных производили с помощью программы FlowJo (Treestar Inc, США). Средняя концентрация митохондриального белка в исследованных пробах составляла 114 мкг белка/мл, определение проводили по методу Лоури.

Выявление изменений мембранного потенциала митохондрий.

Для обнаружения изменений потенциала на внутренней митохондриальной мембране использовали краситель DiOC5(3) (Molecular Probes, Нидерланды). Суспензию изолированных митохондрий окрашивали в течение 10 минут при 4°С. В экспериментах с разобщителем дыхательной цепи СССР (carbonyl cyanide m-chlorophenylhydrazone) и ингибиторами анионных каналов NPPB и DIDS эти реагенты добавляли к суспензии за 5 минут до начала окрашивания в концентрациях 20, 40 и 80 мкМ, соответственно.

Выявление активных форм кислорода в митохондриях.

Для определения содержания активных форм кислорода в изолированных митохондриях использовали краситель DCFH-DA (2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate, Molecular Probes), который проникает через мембрану в форме диацетата, гидролизуется под действием эстераз до DCFH и затем окисляется различными активными формами кислорода во флуоресцентную форму DCF, имеющую максимум возбуждения в синей области (Halliwell, Whiteman, 2004). Таким образом, интенсивность флуоресценции зависит от баланса продукции и ликвидации активных форм кислорода. Концентрация красителя составляла 10 мкМ, суспензию митохондрий окрашивали в течение 60 минут при 4°С.

Статистическая обработка

Все опыты проводили не менее чем в пяти биологических повторностях. Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента при уровне значимости 0,05 или 0,01. На рисунках и в таблице приведены средние значения и их стандартные ошибки.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Заключение диссертации по теме «Физиология и биохимия растений», Брейгина, Мария Александровна

выводы

1. Выявлена активация анионного транспорта через плазматическую мембрану в первые минуты прорастания пыльцевых зерен. Подавление активности анионных каналов специфичным ингибитором NPPB и избирательное блокирование выхода из клеток хлорид-ионов вызывали остановку прорастания и роста трубок. Ингибитор анионного транспорта DIDS вызывал разбухание пыльцевых трубок с последующим их разрывом, что свидетельствует об осморегуляторной роли DIDS-чувствительных транспортных белков плазмалеммы трубки.

2. Ключевые процессы полярного роста - компартментация органелл в цитоплазме и их упорядоченное движение - нарушаются в условиях блокирования NPPB-чувствительных анионных каналов пыльцевых трубок.

3. Изучена динамика трансмембранного потенциала при прорастании пыльцевых зерен и проведено картирование его распределения на плазмалемме. Обнаружено, что при активации метаболизма в процессе прорастания происходит гиперполяризацией плазматической мембраны вегетативной клетки. Выявлена неоднородность в распределении мембранного потенциала на поверхности плазмалеммы протопласта, выделенного из пыльцевого зерна, и растущей пыльцевой трубки. Блокирование NPPB-чувствительных анионных каналов нарушает как динамику мембранного потенциала при активации, так и его распределение на поверхности пыльцевой трубки.

4. DIDS-чувствительные анионные каналы обнаружены в мембранах митохондрий, изолированных из проросшей пыльцы: выявлено действие DIDS, но не NPPB, на мембранный потенциал митохондрий и их способность накапливать и выделять АФК.

5. Выявленная взаимосвязь анионного транспорта, мембранного потенциала и функциональной компартментации цитоплазмы свидетельствует о важной роли анионных каналов в ионной регуляции активации пыльцевого зерна и полярного роста пыльцевой трубки.

БЛАГОДАРНОСТИ

Я хотела бы выразить огромную благодарность

Во-первых, моему научному руководителю профессору Ермакову Игорю Павловичу и моему наставнику на тропе науки Матвеевой Наталии Павловне. Без них этой работы бы никогда не было. Во-вторых, тем, кто помогал нам в экспериментальной работе.

• Моей коллеге и подруге Смирновой Анне, совместно с которой были поставлены эксперименты с протопластами и с оценкой выхода АФК из митохондрий.

• Профессору Балнокину Юрию Владимировичу, любезно предоставившему нам краситель MEQ.

• Моему другу Абрамочкину Денису, предоставившему нам краситель Di-4-ANEPPS.

• Моему мужу Масленникову Максиму, который вместе с нами проводил эксперименты на проточном цитометре.

А также всем тем, кто не отказывался критически обсудить полученные данные, поддерживал меня и помогал в решении технических вопросов. Это сотрудники нашей кафедры Лазарева Екатерина, доц. Харитонашвили Елена Владимировна, Горяева Ольга Васильевна, Махмудова Елена Алексеевна, и др.

Работа выполнена при поддержке РФФИ (гранты № 05-04-49370-а и № 08-04-00746-а).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе благодаря использованию оптических методов впервые выявлены пространственные и временные изменения величины мембранного потенциала в процессе прорастания мужского гаметофита покрытосеменных растений. Обнаружена гиперполяризация плазмалеммы вегетативной клетки при активации пыльцевого зерна - при подготовке к прорастанию или после удаления клеточной стенки. Ранее явление гиперполяризации плазматической мембраны было показано при изучении клеточной дифференциации и морфогенеза как растительных (Kropf, 1992), так и животных клеток (Zhang et al., 1998). Сравнительно недавно на примере стволовых клеток было установлено, что гиперполяризация плазмалеммы предшествует клеточной дифференциации и запускает ее (Sundelacruz et al., 2008). Нам удалось заблокировать процессы гиперполяризации вегетативной клетки пыльцевого зерна, воздействуя на NPPB-чувствительные анионные каналы ее плазмалеммы. Следствием такого воздействия стало подавление прорастания, т.е. остановка реализации морфогенетической программы.

Результаты картирования распределения мембранного потенциала вдоль плазмалеммы пыльцевой трубки дополняют известные данные микроэлектродных исследований о неоднородном распределении в ней трансмембранных ионных токов (Holdaway-Clarke, Hepler, 2003; Hepler et al., 2006; Michard et al., 2009). Изменение величины мембранного потенциала вдоль пыльцевой трубки, как показал ингибиторный анализ, поддерживается с участием Н+-АТФазы и NPPB-чувствительных анионных каналов плазмалеммы. Эти каналы играют важную роль в регуляции мембранного потенциала на разных этапах прорастания пыльцевого зерна. Однако их блокирование не нарушает осмотический баланс пыльцевой трубки. Функции осморегуляции, наряду с другими ион-транспортными белками плазмалеммы, выполняют DIDS-чувствительные белки.

Обнаруженное полярное распределение мембранного потенциала в пыльцевой трубке дополняет картину функциональной асимметрии этого объекта: апикальный компартмент отличается от более дистальных частей трубки как содержимым цитоплазмы (состав органелл, строение цитоскелета, концентрации ионов), так и свойствами мембранно-стеночного комплекса состав стенки, распределение в плазмалемме ион-транспортных белков и Десегрегацию апикального компартмента в растущей трубке, как правило, связывают с существованием крутого кальциевого градиента в апикальной зоне трубки (Hepler et al., 2006; Michard et al., 2009). Проведенный в работе анализ взаиморасположения и движения транспортных везикул и митохондрий показал, что не менее важным условием функциональной компартментации цитоплазмы трубки является активность NPPB-чувствительных анионных каналов плазмалеммы. Таким образом, эти каналы выступают как фактор, связывающий в пыльцевой трубке ионную компартментацию с функциональной компартментацией органелл.

Анализ митохондрий, выделенных из прорастающего пыльцевого зерна, позволил впервые установить, что их функционирование зависит от активности DIDS-чувствительных анионных каналов.

Таким образом, в прорастающей пыльце выявлено два типа различных по фармакологическим характеристикам (чувствительности к ингибиторам) и по функциям анионных каналов плазмалеммы, а также митохондриальные анионные каналы. Полученные результаты подтверждают представления о биоэлектрической регуляции прорастания пыльцевого зерна и роста трубки (Michard et al., 2009) и свидетельствуют о том, что вклад анионных каналов в эти процессы не ограничивается регуляцией клеточного объема, как это предполагали ранее (Zonia et al., 2002). Анионные каналы контролируют величину и распределение мембранного потенциала на плазмалемме и мембранах митохондрий и тем самым влияют на активность потенциалзависимых транспортных белков. Являясь важной частью системы ионной регуляции ростовых процессов, они контролируют функциональную и структурную компартментацию цитоплазмы, без которой невозможны поляризация и полярный рост.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Брейгина, Мария Александровна, 2009 год

1. Андреюк Д.С., Матвеева Н.П., Тукеева М.И, Ермаков И.П. Внутриклеточные концентрации калия, хлорида и протонов в процессе дифференциации мужского гаметофита табака // Физиол. Раст. 2001. Т. 48. С. 455-460.

2. Гайер Г. Электронная гистохимия / М.: Мир. 1974. 488 с.

3. Гамалей И.А., Кирпичникова К.М., Ищенко A.M., Жахов И.В., Клюбин И.В. Механизм гиперполяризации плазматической мембраны макрофагов и астроцитов при активации // Цитология. 1998. Т. 40. С. 773778.

4. Мазина С.Е., Матвеева Н.П., Ермаков И.П. Детерминация положения функциональной поры в пыльцевом зерне табака // Цитология. 2002, Т. 44. С. 33-39.

5. Матвеева Н.П., Андреюк Д.С., Войцех О.О., Ермаков И.П. Регуляторные изменения внутриклеточного рН и выход из пыльцевых зёрен СГ на начальном этапе прорастания in vitro II Физиол. Раст. 2003а. Т. 50. С. 360-365.

6. Матвеева Н.П., Андреюк Д.С., Ермаков И.П. Трансмембранный перенос хлорида при прорастании пыльцевого зерна табака // Биохимия. 20036. Т. 68. С. 1550-1555.

7. Матвеева Н.П., Андреюк Д.С., Лазарева Е.А. Влияние конканавалина А на величину мембранного потенциала и внутриклеточный рН в процессе активации пыльцевого зерна табака in vitro II Физиол. Раст. 2004. Т. 51. С. 549-554.

8. Матвеева Н.П., Войцех О.О., Андреюк Д.С., Ермаков И.П. (2002) Роль Н^-АТФазы и альтернативной оксидазы в регуляции величины внутриклеточного рН на разных стадиях развития мужского гаметофита табака// Онтогенез. Т. 33. С. 436-443.

9. Миронов А.А. и др. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине / 1994. 356 с.

10. Плюснина Т.Ю., Лаврова А.И., Ризниченко Г.Ю., Рубин А.Б. Моделирование неоднородного распределения и колебаний трансмембранного потенциала и рН вблизи внешней стороны мембраны клетки водоросли Chara coralline И Биофизика. 2005. Т. 50. С. 492-499.

11. Полесская О.Г. Растительная клетка и активные формы кислорода / М.^Университет. 2007. 139 с.

12. Смирнова А.В., Матвеева Н.П., Полесская О.Г., Ермаков И.П. Образование активных форм кислорода при прорастании пыльцевого зерна // Онтогенез. 2009. Т. 40. С. 425-435.

13. Barbier-Brygoo Н., Vinauger М., Colcombet J., Ephritikhine G., Frachisse J., Maurel C. Anion channels in higher plants: functional characterization, molecular structure and physiological role // Biochim. Biophys. Acta. 2000. V. 1465. P. 199-218.

14. Bashe D., Mascarenhas J.P. Changes in potassium ion concentration during pollen dehydration and germination in relation to protein synthesis // Plant Science Letters. 1984. V. 35. P. 55-60.

15. Beavis A.D. Properties of the inner membrane anion channel in intact mitochondria // J. Bioenerg. Biomembr. 1992. V. 24. P. 77-90.

16. Beavis A.D., Davatol-Hag H. The mitochondrial inner membrane anion channel is inhibited by DIDS // J. Bioenerget. Biomembr. 1996. V. 28. P. 207214.

17. Beavis A.D., Vercesi A.E. Anion uniport in plant mitochondria is mediated by a Mg2J>insensitive inner membrane anion channel. // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 3079-3087.

18. Bedlack R.S., Wei M., Loew L.M. Localized membrane depolarizations and localized calcium influx during electric field-guided neurite growth // Neuron. 1992. V. 9. P. 393-403.

19. Benito Moreno R.M., Маске F., Alwen A., Heberle-Bors E. In situ seed production with in viti-o matured, isolated pollen // Planta. 1988. V. 176. P. 145148.

20. Bock K.W., Honys D., Ward J.M., Padmanaban S., Nawrocki E.P. Hirschi K.D., Twell D., Sze H. Integrating membrane transport with male gametophyte development and function through transcriptomics // Plant Physiol.2006. V. 140. P. 1151-1168.

21. Boldogh I.R., Pon L.A. Mitochondria on the move. Tr. Cell Biol. 2007. V. 17. P. 502-510.

22. Brauner Т., Hulser D.F., Strasser R.J. Comparative measurements of membrane potentials with microelectrodes and voltage-sensitive dyes // Biochim. Biophys. Acta. 1984. V. 771. P. 208-216.

23. Brewbaker J.L., Kwack B.H. The essential role of calcium ion in pollen germination and pollen tube growth // Am. J. Bot. 1963. V. 50. P. 859-865.

24. Bullen A., Saggau P. Fast quantitative measurements with voltage-sensitive dyes // Biophys. J. 1999. V. 76. P. 2272-2287.

25. Bushart T.J., Roux S.J. Conserved features of germination and polarized cell growth: a few insights from a pollen-fern spore comparison // Ann. Bot.2007. V. 99. P. 9-17.

26. Camacho L., Parton R., A. Trewavas J., Malho R., Imaging cytosolic free-calcium distribution and oscillations in pollen tubes with confocal microscopy: a comparison of different dyes and loading methods // Protoplasma. 2000. V. 212. P. 162-173.

27. Carpita N., Gibeaut D. Structural models of primaiy cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the wall during growth // Plant J. 1993. V. 3. P. 1-30.

28. Cathcart R., Schwiers E., Ames B.N. Detection of picomole levels of hydroperoxides using a fluorescent dichlorofluorescein assay // Anal. Biochem. 1983. V. 134. P. 111-116.

29. Chebli Y., Geitmann A. Mechanical principles governing pollen tube growth // Functional Plant Science Biotechnol. 2007. Vol. 1. P. 232-245.

30. Cheung A.Y., Wu H.-M. Structural and signaling networks for the polar cell growth machinery in pollen tubes // Annu. Rev. Plant Biol. 2008. V. 59. P. 547-572.

31. Cheung A.Y., Wu H.-M. Structural and functional compartmentalization in pollen tubes // J. Exp. Bot. 2007. V. 58. P. 75-82.

32. Cho H.C., Spalding E.P. An anion channel in Arabidopsis hypocotyls activated by blue light // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 8134-8138.

33. Cresti M., Ciampolini F. Mulcahy D.L.M., Mulcahy G. Ultrastructure of Nicotiana alata pollen, its germination and early tube formation // Amer. J. Bot. 1985. V. 72. P. 719-727.

34. De Angeli A., Thomine S., Frachisse J.-M., Ephritikhine G., Gambale F., Barbier-Brygoo H. Anion channels and transporters in plant cell membranes //FEBS Letters. 2007. V. 58. P. 2367-2374.

35. Dutta R., Robinson K.R. Identification and characterization of stretch-activated ion channels in pollen protoplasts // Plant Physiol. 2004. V. 135. P. 1398-1406.

36. Ebel J., Feger M., Kissel U., Mithofer A., Waldmuller Т., Bhagwat A.A., Cosio E.G. Elicitor-binding proteins and signal transduction in the activation of aphytoalexin defense response // Can. J. Bot. 1995. V. 73. P. 506-510.

37. Emri M., Balkay L., Krasznai Z., Tron L., Marian T. Wide applicability of a flow cytometric assay to measure absolute membrane potentials on the millivolt scale // Eur. Biophys. J. 1998. V. 28. P. 78-83.

38. Fan L.-M., Wang Y.-F., Wu W.-H. Outward К channels in Brassica chinensis pollen protoplasts are regulated by external and internal pH // Protoplasma. 2003. V. 220. P. 143-152.

39. Fan L.-M., Wang Y.-F., Wang H., Wu W.-H. In vitro Arabidopsis pollen germination and characterization of the inward potassium currents in Arabidopsis pollen grain protoplasts // J. Exp. Bot. 2001. V. 52. P.1603-1614.

40. Faundez V., Hartzell H.C. Intracellular chloride channels: determinants of function in the endosomal pathway. 2004. 8 p. Mode of access: www.stke.org/cgi/content/full/sigtrans;2004/233/re8.

41. Feijo J.A., Malho R., Obermeyer G. Ion dynamics and its possible role during in vitro pollen germination and tube growth // Protoplasma. 1995. V. 187. P. 155-167.

42. Feijo J.A., Sainhas J., Hackett G.R., Kunkel J.G., Hepler P.K. Growing pollen tubes possess a constitutive alkaline band in the clear zone and a growth-dependent acidic tip // J. Cell Biol. 1999. V. 144. P. 483-496.

43. Ferguson C., Teeri T.T., Siika-aho M., Read S.M., Bacic A. Location of cellulose and callose in pollen tubes and grains of Nicotiana tabacum II Planta. 1998. V. 206. P. 452-460.

44. Franklin-Tong V.E. Signaling and the modulation of pollen tube growth // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 727-738.

45. Gamaley I.A., Kirpichnikova K.M., Klyubin I.V. Superoxide release is involved in membrane potential changes in mouse peritoneal macrophages // Free Rad. Biol. Med. 1998. V. 24. P. 168-174.

46. Ge L.L., Tian H.Q., Russell S.D. Calcium function and distribution during fertilization in Angiosperms // Am. J. Bot. 2007. V. 94.P. 1046-1060.

47. Gehwolf R., Griessner M., Pertl H., Obermeyer G. First patch, then catch: measuring the activity and the mRNA transcripts of a proton pump in individual Lilium pollen protoplasts //FEBS Letters. 2002. V. 512. P. 152-156.

48. Geitmann A. The rheological properties of the pollen tube cell wall // Fertilization in higher plants. Eds. Cresti M., Cai G., Moscatelli A. Berlin: Springer-Verlag. 1999. P. 283-297.

49. Geitmann A., Emons A.M.C. The cytoskeleton in plant and fungal cell tip growth // J. Microscop. 2000. V. 198. P. 218-245.

50. Geitmann A., Parre E. The local cytomechanical properties of growing pollen tubes correspond to the axial distribution of structural cellular elements. Sex. Plant Repr. V. 17. P. 9-16.

51. Geitmann A., Wojciechowicz K., Cresti M. Inhibition of intracellular pectin transport in pollen tubes by monensin, brefeldin A and cytochalasin D // Bot. Acta. 1996. V. 109. P. 373-381.

52. Godbole A., Varghese J., Sarin A., Mathew M.K. VDAC is a conserved element of death pathways in plant and animal systems // Biochim. Biophys. Acta. 2003. V. 1642. P. 87-96.

53. Halliwell В., Whiteman M. Measuring reactive species and oxidative damage in vivo and in cell culture: how should you do it and what do the results mean? // Br. J. Pharmacol. 2004. V. 142. P. 231-255.

54. Han D., Antunes F., Canali R., Rettori D., Cadenas E. Voltage-dependent anion channels control the release of the superoxide anion from mitochondria to cytosol II J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 5557-5563.

55. Hasegawa Y., Nakamura S., Kakizoe S., Sato M., Nakamura N. Immonocytochemical and chemical analyses of Golgi vesicles isolated from the germinated pollen of Camellia japonica II J. Plant Res. 1998. V.lll. P. 421— 429.

56. Haugland R.P. Handbook of fluorescent probes and research chemicals / 9th edn. Or: Molecular Probes, Inc. 2002. 966 p.

57. Hepler P.K., Lovy-Wheeler A., McKenna S., Kunkel J.G. Ions and pollen tube growth // The pollen tube. Ed. Malho R. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag. 2006. 47-69.

58. Hepler P.K., Vidali L., Cheung A.Y. Polarized cell growth in higher plants // Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 2001. V. 17. P. 159-187.

59. Herrero M., Dickinson H.G. Pollen tube development in Petunia hybrida following compatible and incompatible intraspecific matings I I J.Cell Sci. 1981. V. 47. P. 365-383.

60. Heslop-Harrison J. Pollen germination and pollen-tube growth // Int. Rev. Cytol. 1987. V. 107. P. 1-78.

61. Heslop-Harrison J.S., Reger B.J. Chloride and potassium ions and turgidity in the grass stigma // J. Plant Physiol. 1986. V. 124. P. 55-60.

62. Holdaway-Clarke T.L., Hepler P.K. Control of pollen tube growth: role of ion gradients and fluxes // New Phytologist. 2003. V. 159. P. 539-563.

63. Hussey P.J., Ketelaar Т., Deeks M.J. Control of the actin cytoskeleton in plant cell growth // Annu. Rev. Plant Biol. 2006. V. 57. P. 109-125.

64. Iwano M., Shiba H., Miwa Т., Che F.-S., Takayama S., Nagai Т.,2+

65. Miyawaki A., Isogai A. Ca dynamics in a pollen grain and papilla cell during pollination of Arabidopsis II Plant Physiol. 2004. V. 136. P. 3562-3571.

66. Jauh G.Y., Lord E.M. Localization of pectins and arabinogalactan-proteins in lily (Lilium longiflorum L.) pollen tube and style, and their possible roles in pollination // Planta. 1996 V. 199. P. 251-261.

67. Jentsch T.J., Stein V., Weinreich F., Zdebik A. Molecular structure and physiological function of chloride channels // Physiol. Rev. 2002. V. 82. P. 503568.

68. Johannes E., Croft A., Sanders D. Control of СГ efflux in Chara coralline by cytosolic pH, free Ca2+, and phosphorylation indicates a role ofplasma membrane anion channels in cytosolic pH regulation I I Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 173-181.

69. Johnson I. Fluorescent probes for living cells // Histochem. J. 1998. V. 30. P. 123-140.

70. Krasznai Z., Marian Т., Balkay L., Emri M., Tron L. Flow cytometric determination of absolute membrane potential of cells // J. Photochem Photobiol B. 1995. V. 28. P. 93-99.

71. Kroh M., Knuiman B. Exocytosis in non-plasmolyzed and plasmolyzed tobacco pollen tubes. A freeze-fracture study // Planta. 1985. V. 166. P.287-299.

72. Kropf D.L. Establishment and expression of cellular polarity in fucoid zygotes // Microbiol. Rev. 1992. V. 56. P. 316-339.

73. Kropf D.L. Electrophysiological properties of Achlya hyphae: ionic currents studied by intracellular potential recording // J. Cell Biology. 1986. V. 102. P. 1209-1216.

74. Kusano Т., Tateda C., Berberich Т., Takahashi Y. Voltage-dependent anion channels: their roles in plant defense and cell death // Plant Cell Rep. 2009. V. 28. P. 1301-1308.

75. Laus M.N., Soccio M., Trono D, Cattivelli L., Pastore D. Plant inner membrane anion channel (PIMAC) function in plant mitochondria // Plant Cell Physiol. 2008. V. 49. P. 1039-1055.

76. Li Y.-Q., Faleri C., Geitmann A., Zhang H.-Q., Cresti M. Immunogold localization of arabinogalactan proteins unesterified and esterified pectins in pollen grains and pollen tubes of Nicotiana tabacum L. // Protoplasma. 1995. V. 189. P. 26-36.

77. Loew L.M. 1996. Potentiometric dyes: Imaging electrical activity of cell membranes // Pure & Appl. Chem. 1996. V. 68. P. 1405-1409.

78. Logan D.C., Leaver C.J. Mitochondria-targeted GFP highlights the heterogeneity of mitochondrial shape, size and movement within living plant cells // J. Exp. Bot. 2000. V. 51. P. 865-871.

79. Lush W.M., Grieser F., Wolters-Arts M. Directional guidance of Nicotiana alata pollen tubes in vitro and on the stigma // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 733-741.

80. Ma J.F. Role of organic acids in detoxification of aluminum in higher plants // Plant Cell Physiol. 2000. V. 41. P. 383-390.

81. Malho R., Read N.D., Trewavas A.J., Pais M.S. Calcium channel activity during pollen tube growth // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 1173-1184.

82. Mascarenhas J.P. Molecular mechanisms of pollen tube growth and differentiation//Plant Cell. V. 5. P. 1303-1314.

83. Messerli M.A., Danuser G., Robinson K.R. Pulsatile influxes of H^, K+ and Ca2+ lag growth pulses of Lilium longiflorum pollen tubes // J. Cell Sci. 1999. V. 112. P. 1497-1509.

84. Messerli M.A., Smith P.J.S., Lewis R.C., Robinson K.R. Chloride fluxes in lily pollen tubes: a critical reevaluation // Plant J. 2004. V. 40. P. 799-812.

85. Michard E., Alves F., Feijo J. A. The role of ion fluxes in polarized cell growth and morphogenesis: the pollen tube as an experimental paradigm // Int. J. Dev. Biol. 2009. V. 52. P. 2296- 2296.

86. Mileykovskaya E., Dowhan W., Birke R.L., Zheng D., Lutterodt L., Haines Т.Н. Cardiolipin binds nonyl acridine orange by aggregating the dye at exposed hydrophobic domains on bilayer surfaces // FEBS Letters. 2001. V. 507. P. 187-190.

87. Montana V., Farkas D.L., Loew L.M. Dual wavelength ratiometric fluorescence measurements of membrane potential // Biochemistry. 1989. V. 28. P. 4536-4539.

88. Monteiro D., Coelho P.C., Rodrigues C., Camacho L., Quader H., Malho R. Modulation of endocytosis in pollen tube growth by phosphoinositides and phospholipids //Protoplasma. 2005. V. 226. P. 31-38.

89. Nitsch J.P. Deux espaces photoperiodiques de jours courts: Plumbago indica L. et P. zeyelanica L // Bull. Soc. Bot. France. 1965. V. 112. P. 517-522.

90. Nuccitelli R. Ionic currents in morphogenesis // Experientia. 1988. V. 44. P. 657-666.

91. O'Rourke B. Mitochondrial Ion Channels // Annu. Rev. Physiol. 2007. V. 69. P. 19-49.

92. O'Rourke B. Pathophysiological and protective roles of mitochondrial ion channels //J. Physiol. 2000. V. 529. P. 23-36.

93. Obermeyer G., Blatt M.R. Electrical properties of intact pollen grains of Lilium longiflorum: characteristics of the non-germinating pollen grain // J. Exp. Bot. 1995. V. 46. P. 803-813.

94. Obermeyer G., Liitzelschwab M., Heumann H.-G., Weisenseel M.H. Immunolocalization of H^-ATPases in the plasma membrane of pollen grains and pollen tubes of Lilium longiflorum II Protoplasma. 1992. V. 171. P. 55-63.

95. Palanivelu R., Preuss D. Pollen tube targeting and axon guidance: parallels in tip growth mechanisms // Tr. Cell Biol. 2000. V. 10. P. 517-524.

96. Parre E., Geitmann A. Pectin and the role of the physical properties of the cell wall in pollen tube growth of Solarium chacoense //Planta. 2005. V. 220. P. 582-592.

97. Parton R.M., Fischer-Parton S., Watahiki M.K., Trewavas A J. Dynamics of the apical vesicle accumulation and the rate of growth are related in individual pollen tubes // J. Cell Sci. 2001. V. 114. P. 2685-2695.

98. Pierson E.S., Miller D.D., Callaham D.A., van Aken J., Hackett G., Hepler P.K. Tip-localized calcium entry fluctuates during pollen tube growth // Dev Biol. 1996. V. 174. P. 160-173.

99. Pina C., Pinto F., Feijo J.A., Becker J.D. Gene family analysis of the Arabidopsis pollen transcriptome reveals biological implications for cell growth, division control, and gene expression regulation // Plant Physiol. V.138. P.744-756.

100. Plasek J., Sigler K. Slow fluorescent indicators of membrane potential: a survey of different approaches to probe response analysis // J. Photochem. Photobiol. B: Biology. 1996. V. 33. P. 101-124.

101. Pucihar G., Kotnik Т., Valic В., Miklavcic D. Numerical determination of transmembrane voltage induced on irregularly shaped cells II Ann. Biomed. Engineering. 2006. V. 34. P. 642-652

102. Rehman S., Rha E.S., Ashraf M., Lee K.J., Yun S.J., Kwak Y.G.,.Yoo N.H., Kim J.-K. Does barley {Hordeum vulgare L.) pollen swell in fractions of a second? //Plant Science. 2004. V.167. P. 137-142.

103. Rhoads D.M., Umbach A.L., Subbaiah C.C., Siedow J.N. Mitochondrial reactive oxygen species. Contribution to oxidative stress and interorganellar signaling // Plant Physiol. 2006. V. 141. P. 357-366.

104. Roberts S.K. Plasma membrane anion channels in higher plants and their putative functions in roots // New Phytologist. 2006. V. 169. P. 647-666.

105. Robinson K.R., Messerli M.A. Left/right, up/down: the role of endogenous electrical fields as directional signals in development, repair and invasion // BioEssays. 2003. V. 25. P. 759-766.

106. Rodriguez-Rosales M.P., Roldan M., Belver A., Donaire J.P. Correlation between in vitro germination capacity and proton extrusion in olive pollen // Plant Physiol. Biochem. 1989. V. 27. P. 723-728.

107. Romagnoli S., Cai G., Faleri C., Yokota E., Shimmen Т., Cresti M. Microtubule- and actin filament-dependent motors are distributed on pollen tube mitochondria and contribute differently to their movement // Plant Cell Physiol. 2007. V. 48. P. 345-361.

108. Roy S.J., Holdaway-Clarke T.L., Hackett G.R., Kunkel J.G., Lord E.M., Hepler P.K. Uncoupling secretion and tip growth in lily pollen tubes: evidence for the role of calcium in exocytosis // Plant J. 1999. V. 19. P. 379-386.

109. Samaj J. Methods and molecular tools for studying endocytosis in plants an overview // Plant Endocytosis. Eds. Samaj J., Baluska F., Menzel D. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag. 2005. P. 1-17.

110. Schiott M., Romanowsky S.M., Baekgaard L., Jakobsen M.K., Palmgren M.G., Harper J.F. A plant plasma membrane Ca pump is required for normal pollen tube growth and fertilization // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2004. V. 101. P. 9502-9507.

111. Schroeder J.I., Schmidt C., Sheaffer J. Identification of high-affinity slow anion channel blockers and evidence for stomatal regulation by slow acidification//J. Biol. Chem. 1993. V. 258. P. 14834-14838.

112. Shabala S. Ion-specific mechanisms of osmoregulation in bean mesophyll cells // J. of Exp. Bot. 2000. V. 51. P. 1243-1253.

113. Shang Z., Ma L., Zhang H., He R., Wang X., Cui S., Sun D. Ca2+ influx into lily pollen grains through a hyperpolarization-activated Ca2+-permeable channel which can be regulated by extracellular CaM // Plant and Cell Physiol. 2005. V. 46. P. 598-608.

114. Stanley R.G. Pollen chemistry and tube growth // Pollen: development and physiology. Ed. Heslop-Harrison J. L.: Butterworths, 1971. P. 131-155.

115. Sundelacruz S., Levin M., Kaplan D.L. Membrane potential controls adipogenic and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells // PLoS ONE. 2008. V. 3. e3737.

116. Sze H., Frietsch S., Li X., Bock K.W., Harper J.F. Genomic and Molecular Analyses of Transporters in the Male Gametophyte // The Pollen Tube. Ed. Malho R. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag. 2006. P. 71-93.

117. Sze H., Xuhang L., Palmgren M.G. Energization of plant membranes by Ft-pumping ATPases: regulation and biosynthesis // Plant Cell. 1999. V. 11. P. 677-689.

118. Taiz L. Zeiger E. Plant Physiology / 3rd. Edn. Sunderland: Sinauer Ass. 2002. 690 p.

119. Tanaka I., Kitazume C., Ito M. 1987. Isolation and culture of lily pollen protoplasts // Plant Science. 1987. V. 50. P. 205-211.

120. Tao W.-J., Liang S.-P., Lu Y.-T. The roles of calmodulin polar distribution during pollen hydration and germination // Can. J. Bot. 2004. V. 82. P. 774-780.

121. Taylor L.P., Hepler P.K. Pollen germination and tube growth // Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol./ Biol. 1997. V. 48. P. 461-491.

122. Thomine S., Lelievre F., Boufflet M., Guern J., Barbier-Brygoo H. Anion-Channel blockers interfere with auxin responses in dark-grown Arabidopsis hypocotyls // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 533-542.

123. Vanden Hoek T.L., Becker L.B., Shao Z., Li C. Schumacker P.T. Reactive oxygen species released from mitochondria during brief hypoxia induce preconditioning in cardiomyocytes. // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 18092-18098.

124. Vander Heiden M.G., Chandel N.S., Li X.X., Schumacker P.T., Colombini M., Thompson C.B. Outer mitochondrial membrane permeability can regulate coupled respiration and cell survival // Proc. Natl. Acad. Sci. 2000. V. 97. P. 4666-4671.

125. Verkman A.S., Sellers M.C., Chao A.C., Leung Т., Ketcham R. Synthesis and characterization of improved chloride-sensitive fluorescent indicators for biological applications // Anal Biochem. 1989. V. 178. P. 355-361.

126. Wang Y.F., Fan L.M., Zhang W.Z., Zhang W., Wu W.H. Ca2+-permeable channels in the plasma membrane of Arabidopsis pollen are regulated by actin microfilaments // Plant Physiol. 2004. V. 136. P. 3892-3904.

127. Ward J.M., Pei Z.-M., Schroeder J. Roles of ion channels in initiation of signal transduction in higher plants // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 833-844.

128. Weisenseel M.H., Jaffe L.F. The major growth current through lily pollen tubes enters as K+ and leaves as ИСII Planta. 1976. V. 133. P. 1-7.

129. Weisenseel M.H., Nuccitelli R., Jaffe L.F. Large electrical currents traverse growing pollen tubes // J. Cell Biol. 1975. V. 9. P. 556-567.

130. Weisenseel M.H., Wenisch H.H. The membrane potential of growing lily pollen // Z. Pflanzephysiol. 1980. V. 99. P. 313-323.

131. Wolters-Arts M., Lush W.M., Mariani C. Lipids are required for directional pollen-tube growth //Nature. 1998. V. 392. P. 818-821.

132. Xie X.S., Stone D.K., Racker E. Determinants of clathrin-coated vesicle acidification//J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 14834-14838.

133. Yamashita K., Yamamoto Y., Matsumoto H. Characterization of an anion transporter in the plasma membrane of barley roots // Plant Cell Physiol. 1996. V. 37. P. 949-956.

134. Yokota E., Muto S., Shimmen T. Inhibitory regulation of higher-plant myosin by Ca2+ ions // Plant Physiol. 1999. V. 119. P. 231-239.

135. Yoon G.M., Dowd P.E., Gilroy S., McCubbin A.G. Calcium-dependent protein kinase isoforms in Petunia have distinct functions in pollen tube growth, including regulating polarity // Plant Cell. 2006. V. 18. P. 867-878.

136. Zarsky V., Potocky M., Baluska F., Cvrckova F. LipidMetabolism, Compartmentalization and Signalling in the Regulation of Pollen Tube Growth // The Pollen Tube. Ed. Malho. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag. 2006. P. 117138.

137. Zhang J., Davidson R.M., Wei M., Loew L.M. 1998. Membrane electric properties by combined patch clamp and fluorescence ratio imaging in single neurons // Biophys. J. 1998. V. 74. P. 48-53.

138. Zhang J., Liub J., Chena Z., Lin J. In vitro germination and growth of lily pollen tubes is affected by calcium inhibitor with reference to calcium distribution // Flora. 2007. V. 202. P. 581-588.

139. Zhao J., Mollet J.-C., Lord E.M. Lily (Lilium longiflorum L.) pollen protoplast adhesion is increased in the presence of the peptide SCA // Sex. Plant Reprod. 2004. V. 16. P. 227-233.

140. Zonia L., Cordeiro S., Tupy J., Feijo J.A. Oscillatory chloride efflux at the pollen tube apex has a role in growth and cell volume regulation and is targeted by inositol-3,4,5,6-tetrakisphosphate // Plant Cell. 2002. V. 14. P. 22332249.

141. Zonia L., Munnik T. Osmotically induced cell swelling versus cell shrinking elicits specific changes in phospholipid signals in tobacco pollen tubes //Plant Physiol. 2004. V. 134. P. 813-823.

142. Zoratti M., De Marchi U., Gulbins E., Szabo I. Novel channels of the inner mitochondrial membrane // Biochim. Biophys. Acta. 2009. V. 1787. P. 351-363.