Интеграза ВИЧ-1: влияние структуры ДНК-субстрата на активность в реакции 3-концевого процессинга тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Агапкина, Юлия Юрьевна

• Агапкина, Юлия Юрьевна
• кандидат химических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат химических наук Агапкина, Юлия Юрьевна

Список принятых сокращений.

Введение.

I. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧобзор литературы).

1.1. СТРОЕНИЕ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.

1.1.1. Строение каталитического домена.

1.1.2. Строение N-концевого домена.

1.1.3. Строение С-концевого домена.

1.1.4. Строение мутантных белков, содержащих два домена интегразы.

1.1.5. Мультимерная организация интегразы.

1.2. ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.

1.2.1. Реакции, катализируемые интегразой.

1.2.2. Связывание ДНК интегразой.

1.2.3. Домены интегразы, отвечающие за связывание ДНК.

1.2.4. Участие аминокислотных остатков интегразы во взаимодействии с ДНК.

1.2.5. Взаимодействие интегразы с вирусной ДНК.

1.2.5.1. Влияние нуклеотидной последовательности ДНК-субстрата на каталитическую активность интегразы.

1.2.5.2. Моделирование предпочтительной нуклеотидной последовательности ДНК-субстрата.

1.2.6. Взаимодействие интегразы с клеточной ДНК.

I.3. МОДЕЛИРОВАНИЕ СТРУКТУРЫ ПОЛНОРАЗМЕРНОГО ФЕРМЕНТА И ЕГО КОМПЛЕКСА С ДНК.

II. ИНТЕГРАЗА ВИЧ-1: ВЛИЯНИЕ СТРУКТУРЫ ДНК-СУБСТРАТА НА АКТИВНОСТЬ В РЕАКЦИИ З'-КОНЦЕВОГО ПРОЦЕССИНГА

Результаты и обсуждение).

II.1. ДИЗАЙН МОДИФИЦИРОВАННЫХ АНАЛОГОВ Ш-СУБСТРАТА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.

II.2. ТЕРМИЧЕСКАЯ УСТОЙЧИВОСТЬ МОДИФИЦИРОВАННЫХ

АНАЛОГОВ Ш-СУБСТРАТА ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1.

113. ОСОБЕННОСТИ ВЫДЕЛЕНИЯ ИСПОЛЬЗУЕМОЙ В РАБОТЕ

ИНТЕГРАЗЫ.

11.4. СВЯЗЫВАНИЕ ИНТЕГРАЗЫ С РАЗЛИЧНЫМИ

ДНК-ДУ ПЛЕКС АМИ.

11.4.1. Изучение связывания интегразы с ДНК методом торможения в геле.

11.4.2. Изучение связывания интегразы с ДНК методом поляризации флюоресценции.

11.4.3. Изучение связывания интегразы с ДНК методом фотоаффинной модификации.

11.5. ВЛИЯНИЕ МОДИФИКАЦИЙ и5-СУБСТРАТА

НА СПЕЦИФИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ИНТЕГРАЗЫ.

II.5.1. Модификации нуклеозидов в 3-ем положении и5-субстрата.

9 IL5.2. Модификации нуклеозидов в 5-ом и 6-ом положениях Ш-субстрата.

11.5.3. Модификации нуклеозидов в 7-ом и 8-ом положениях Ш-субстрата.

11.5.4. Модификации нуклеозидов в 9-ом положении Ш-субстрата.

11.5.5. Модификации нуклеозидов в 12-ом положении Ш-субстрата.

II.6. ВЛИЯНИЕ ДЕСТАБИЛИЗАЦИИ ДНК В РАЙОНЕ РАСЩЕПЛЯЕМОЙ СВЯЗИ НА АКТИВНОСТЬ ИНТЕГРАЗЫ.

11.6.1. Изучение взаимодействия интегразы с аналогом Ш-субстрата с ковалентно связанными цепями.

11.6.1.1. Синтез субстрата интегразы

А с ковалентно связанными цепями.

11.6.1.2. Реакция 3 '-концевого процессинга субстрата с ковалентно связанными цепями.

11.6.2. Процессинг субстратов, в которых консервативный динуклеотид

СА расположен во внутренней части дуплекса.

11.7. ИЗУЧЕНИЕ КОНТАКТОВ АДЕНИНА

В ТРЕТЬЕМ ПОЛОЖЕНИИ ПРОЦЕССИРУЕМОЙ ЦЕПИ и5-СУБСТРАТА С ИНТЕГРАЗОЙ.

11.8. МОДЕЛЬ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 С ДНК-СУБСТРАТОМ.

III. Экспериментальная часть.

III. 1. Реактивы и материалы.

III.2. Методы.

Ш.2.1. Изучение связывания интегразы ВИЧс ДНК-дуплексами.

Ш.2.2. Изучение влияния модификаций Ш-субстрата на специфическую активность интегразы ВИЧ-1.

Ш.2.3. Синтез дуплексов с ковалентно связанными цепями.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Интеграза ВИЧ-1: влияние структуры ДНК-субстрата на активность в реакции 3-концевого процессинга»

Вирус иммунодефицита человека 1-го типа (ВИЧ-1), относящийся к классу ретровирусов, поражает иммунную систему организма человека и вызывает синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) [1]. Для лечения этого опасного заболевания в настоящее время применяется комплексная терапия, основанная на использовании ингибиторов двух ферментов ВИЧ-1: обратной транскриптазы и протеазы [2]. Однако эта терапия не приводит к полной остановке репликации вируса, а позволяет лишь подавлять ее до низкого уровня, продлевая жизнь ВИЧ-инфицированным пациентам [3, 4]. В связи с этим внимание ученых сосредоточено на поиске новых мишеней и новых ингибиторов репликации вируса. Одной из самых привлекательных и актуальных мишеней на сегодняшний день является третий вирусный фермент - интеграза (ИН). Она катализирует одну из ранних стадий репликативного цикла ВИЧ - встраивание вирусной ДНК в клеточную [5]. Понятно, что подавление этого ключевого для развития вируса процесса должно необратимо привести к полной остановке репликации ВИЧ. Важно, что ИН не участвует в процессах, необходимых для жизнедеятельности самой клетки, поэтому её ингибирование является одним из наиболее перспективных приемов селективного подавления репликации на раннем этапе развития вирусной инфекции.

Однако создание эффективных ингибиторов ИН во многом тормозится из-за того, что ИН является наименее изученным ферментом ВИЧ-1. Известно, что она узнает определенные последовательности на концах вирусной ДНК, связывается с ними и катализирует реакцию отщепления двух нуклеотидов с 3'-концов каждой цепи. Это - первая стадия интеграции, она называется 3'-концевой процессинг [6]. Далее ИН осуществляет перенос цепи - встраивание укороченной вирусной ДНК в клеточную ДНК. Однако детальный механизм, по которому ИН взаимодействует с вирусной и с клеточной ДНК, не известен. До настоящего времени не известна полная структура ни всего фермента, ни его комплекса с ДНК-субстратом, поскольку не удается закристаллизовать полноразмерный каталитически активный белок и сделать его рентгеноструктурный анализ или ЯМР. Понятно, что выяснение механизма узнавания вирусной ДНК интегразой и дальнейшей ее интеграции в клеточную ДНК позволит более системно и рационально подойти к созданию ингибиторов этого фермента.

В настоящее время для изучения взаимодействий ИН с ДНК in vitro используется рекомбинантный фермент и модифицированные аналоги вирусной ДНК. Необходимо отметить, что ИН активна только в присутствии кофактора - иона двухвалентного металла. Природным кофактором является Mg2+, in vitro чаще используется ион Мп2+, поскольку в его присутствии активность ИН выше. Однако в последнее время установлено, что субстратная специфичность ИН и ее ингибирование различными соединениями зависят от природы используемого кофактора. Так ряд ингибиторов ИН, активных in vitro в присутствии Мп2+, не ингибируют этот фермент в присутствии ионов Mg2+ и, следовательно, оказываются неактивными в экспериментах на клеточных культурах [7, 8].

В связи с этим в настоящей работе взаимодействие ИН с ДНК изучалось в присутствии обоих кофакторов: и Мп2+, и Mg2+. Целью нашей работы было изучить влияние структуры вирусной ДНК на специфичность ее взаимодействия с ИН ВИЧ-1 и выявить те структурные элементы, которые определяют эту специфичность. Для этого использовались ДНК-дуплексы, последовательность которых соответствовала последовательности сайта узнавания ИН в Ш-участке длинного концевого повтора ДНК ВИЧ-1. Природные нуклеозиды в определенных положениях дуплекса заменяли на ненуклеозидные вставки (остатки 1,3-пропандиола) или 2'-аминонуклеозиды и изучали связывание модифицированных дуплексов с ИН и их 3'-концевой процессинг. Оказалось, что введение модификаций в структуру субстрата ИН не влияет на его связывание ферментом, но оказывает очень сильное воздействие на скорость 3'-концевого процессинга.

На основании полученных результатов предложена модель взаимодействия ИН с вирусной ДНК. В соответствии с этой моделью, основной вклад вносят контакты ИН с углеводофосфатным остовом первых девяти нуклеотидов ДНК-субстрата, а специфичность взаимодействия, в первую очередь, определяется наличием в структуре ДНК последовательности 5'-СА -3' в 3-ем и 4-ом положениях от 3'-конца процессируемой цепи, причем со стороны аденина из этой последовательности с ИН взаимодействуют Ы7-атом и экзоциклическая аминогруппа. Также предполагается, что с положениями 3-6 в составе субстрата взаимодействует каталитический домен ИН, а во взаимодействии с нуклеотидами в 7-9 положениях субстрата участвует С-концевой домен фермента. Впервые обнаружено, что в положениях субстрата с 5-ого по 8-ое ИН взаимодействует с непроцессируемой цепью субстрата в большей мере, чем с процессируемой. Помимо этого установлено, что модификации субстрата с положениях с 3-его по 6-ое оказывают значительно более сильное влияние на активность ИН в присутствии ионов Mg2+, чем Мп2+.

Введение 2'-аминонуклеозидов в терминальные положения U5-субстрата позволило нам получить аналог вирусной ДНК с ковалентно связанными на конце цепями. С использованием такого дуплекса показано, что «расплетание» цепей вирусной ДНК не является необходимым условием З'-процессинга. В то же время, для эффективного З'-процессинга ДНК-субстрата необходима дестабилизация пары А/Т рядом с расщепляемой связью.

Работа включает обзор литературы, посвященный строению и функциям интегразы ВИЧ-1.

I. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ ИНТЕГРАЗЫ ВИЧ-1 /обзор литературы/

Вирус иммунодефицита человека принадлежит к классу ретровирусов, и его репликативный цикл включает в себя стадию встраивания провирусной ДНК в ДНК зараженной клетки. Этот процесс осуществляется вирусным ферментом -интегразой (ИН). Известны два типа вируса иммунодефицита человека (ВИЧ): ВИЧ-1 и ВИЧ-2, которые незначительно отличаются друг от друга строением генома [9, 10]. Интегразы обоих типов вируса очень близки по структуре и функциям, а поскольку ВИЧ-1 является более патогенным и широко распространенным типом вируса, в дальнейшем мы будем рассматривать вопросы, касающиеся ИН именно ВИЧ-1.

ИН ВИЧ-1 относят к семейству полинуклеотидилтрансфераз, в которое входят такие ферменты как транспозазы и ретровирусные ИН, а также РНКаза Н и резолваза Ruv С [11, 12]. Ферменты данного семейства катализируют процессы, приводящие к перемещению ДНК или ее фрагментов внутри генома, либо между геномами. Следует отметить, что данные процессы осуществляются без привлечения дополнительных источников энергии и, в конечном итоге, без изменения числа фосфодиэфирных связей. Кроме того, для ретровирусных интеграз характерно формирование очень устойчивых комплексов с ДНК-субстратом. Однако катализируемые ими реакции протекают без образования ковалентной связи между белком и ДНК [13].

ИН ВИЧ-1 осуществляет перенос молекулы ДНК вируса в геном зараженной клетки (рис. 1). Известно, что ИН узнает определенные последовательности на концах вирусной ДНК, связывается с ними и катализирует реакцию отщепления двух нуклеотидов с 3'-концов каждой цепи. Это - первая стадия интеграции, она называется 3'-концевой процессинг. Далее ИН осуществляет перенос цепи -встраивание укороченной вирусной ДНК в клеточную ДНК (рис.1) [6]. Для осуществления 3'-концевого процессинга и переноса цепи ИН необходим кофактор; л I in vivo роль кофактора играют ионы Mg , in vitro реакции могут проходить также в присутствии ионов Мп [14]. Помимо описанных выше двух реакций, in vitro ИН способна катализировать еще одну, называемую дезинтеграцией [15]. По существу она является обратной реакции интеграции.

4 дкп Вирусная ДНК ACTGGAA>——--'

I GTACCTT \ J / из N

ДКП / 3' \

TAGCAGT |

ATCGTCA /

U5

ИНТЕГРАЗА

ИНТЕГРАЗА

З'-концевой процессинг 5'

ACTGGAA АССТТ дкп Вирусная ДНК из дкп / N jTAGCA |

-Jatcgtca J У перенос цепи

У* * 5'

Вирусная ДНК

Клеточная ДНК репарация ДНК

Рис. 1. Интеграция ДНК ВИЧ-1 в геном клетки.

Для осуществления стадии переноса цепи ИН необходимо связать сразу две молекулы ДНК: вирусную и клеточную. Соответственно, встраиваемую вирусную ДНК называют субстратом ИН, а клеточную ДНК - мишенью. Взаимодействие ИН с ДНК-субстратом носит строго си квенс-спе пифический характер, в то время как мишень связывается ферментом неспецифически. Все ретровирусные ИН высоко консервативны и обладают гомологией между собой, а также с множеством транспозаз [13]. Рассмотрим строение ИН ВИЧ-1.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Агапкина, Юлия Юрьевна

выводы

1. Синтезирована серия ДНК-дуплексов - аналогов 115-участка ДНК вируса иммунодефицита человека, содержащих в различных положениях одной и/или двух цепей 2'-аминонуклеозиды или остатки 1,3-пропандиола, и изучено их взаимодействие с вирусной интегразой. Установлено, что использованные модификации не влияют на связывание ДНК-субстрата интегразой, но значительно влияют на скорость его З'-концевого процессинга.

2. Показано, что специфичность взаимодействия интегразы с ДНК-субстратом существенно выше в присутствии ионов магния, чем марганца.

3. Предложена модель взаимодействия интегразы с ДНК-субстратом, согласно которой:

• интеграза взаимодействует, по крайней мере, с первыми девятью нуклеотидами ДНК, причем основной вклад в это взаимодействие вносят ее контакты с углеводофосфатным остовом;

• специфичность взаимодействия определяется последовательностью нуклеозидов в 3-6 положениях от 3'-конца процессируемой цепи, и в первую очередь динуклеотидом СА;

• во взаимодействии с интегразой участвуют N7-aTOM и экзоциклическая аминогруппа консервативного аденина из последовательности СА;

• с положениями 3-6 взаимодействует каталитический домен интегразы, а во взаимодействии с нуклеотидами в 7-9 положениях субстрата участвует С-концевой домен.

4. Установлено, что для З'-концевого процессинга вирусной ДНК необходима дестабилизация пары А/Т рядом с расщепляемой межнуклеотидной связью и не требуется полного разрушения комплементарных пар на конце ДНК.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Агапкина, Юлия Юрьевна, 2004 год

1. Kaufmann G. R., Cooper D. A. (2000) Antiretroviral therapy of HIV-1 infection: established treatment strategies and new therapeutic options. Current Opinion in Microbiology 3, 508-514;

2. Geist A., BouHamdan M., Nunnari G., Pomerantz R.J., Kulkosky J. (1999) HIV-1 DNA integration: advancing anti-HIV-1 gene therapy approaches by blocking and modulating the process. Gene Ther. Mol. Biol. 4,133-141;

3. Brown P. O. (1990) Integration of retroviral DNA. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 157,19-48;

4. Neamati N, Lin Z, Karki RG, Orr A, Cowansage K, Strumberg D, Pais GC, Voigt JH, Nicklaus MC, Winslow HE, Zhao H, Turpin JA, Yi J, Skalka AM, Burke TR Jr, Pommier Y. (2002) J. Med. Chem. 45, 5661-5670;

5. Marchand С, Johnson AA, Karki RG, Pais GC, Zhang X, Cowansage K, Patel ТА, Nicklaus MC, Burke TR Jr, Pommier Y. (2003) Mol. Pharmacol. 64, 600609;

6. Clavel F., Guyader M., Guetard D., Salle M., Montagnier L., Alizon M. (1986) Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2. Nature 324 (6098), 691-695;

7. Essex M. (1999) Human immunodeficiency viruses in the developing world. Adv. Virus Res. 53, 71-88;

8. Dyda F., Hickman В., Jenkins T.M., Engelman A., Craigie R., Davies D.R. (1994) Crystal structure of the catalytic domain of HIV-1 integrase: similarity to other polynucleotidyl transferases. Science 266 (5193), 1981-1986;

9. Ariyoshi M., Vassylyev D. G., Iwasaki H., Nakamura H., Shinagawa H., Morikawa K. (1994): Atomic structure of the RuvC resolvase: a holliday junction-specific endonuclease from E. coli. Cell 78 (6), 1063-1072;

10. Rice P.A., Baker T.A. (2001) Comparative architecture of transposase and integrase complexes. Nat. Struct. Biol. 8 (5), 302-307;

11. Haren L., Ton-Hoang В., Chandler M. (1999): Integrating DNA: Transposases and Retroviral Integrases. Annu. Rev. Microbiol. 53,245-281;

12. Chow S.A, Vincent K.A., Ellison V., Brown P.O. (1992): Reversal of integration and DNA splicing mediated by integrase of human immunodeficiency virus. Science 255, 723-726;

13. Kulkosky J., Skalka A.M. (1994): Molecular mechanism of retroviral DNA integration. Pharmacol. Ther. 61, 185-203;

14. Vink C., Groeneger A.A., Plasterk R. (1993) Identification of the catalytic and DNA-binding region of the human immunodeficiency virus type 1 integrase protein. Nucleic. Acids Res. 21 (6), 1419-1425;

15. Bushman F.D., Engelman A., Palmer I., Wingfield P., Craigie R. (1993) Domains of the integrase protein of the human immunodeficiency virus type 1 responsible for polynucleptidyl transfer and zinc binding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (8), 3428-3432;

16. Lee S. P, Xiao J., Knutson J. R., Lewis M. S., Han M.K. (1997): Zn2+ promotes the self-association of human immunodeficiency virus type-1 integrase in vitro. Biochemistry 36 (1), 173-180;

17. Engelman A., Craigie R. (1992) Identification of conserved amino acid residues critical for human immunodeficiency virus type 1 integrase function in vitro. J. Virol. 66 (11), 6361-6369;

18. Polard P., Chandler M. (1995) Bacterial transposases and retroviral integrase. Mol. Microbiol. 15 (1), 13-23;

19. Leavitt A.D., Shiue L., Varmus H.E. (1993) Site-directed mutagenesis of HIV-1 integrase demonstrates effects on integrase functions in vitro. J. Biol. Chem. 268 (3), 2113-2119;

20. Yang W., Steitz T.A. (1995) Recombining the structure of HIV-1 integrase, RuvC and RNase H. Structure 3, 131-134;

21. Goldgur Y., Dyda F., Hickman A.B., Jenkins T.M., Craigie R., Davies D.R. (1998) Three new structures of the core domain of HIV-1 integrase: an active site that binds magnesium. Proc. Natl. Acad. Sci USA. 95 (16), 9150-9154;

22. Lovell S., Goryshin I. Y., Reznikoff W.R., Rayment I. (2002) Two-metal active site binding of a Tn5 transposase synaptic complex. Nature Struct. Biol. 9 (4), 278-281;

23. Mizuuchi K. (1997) Polynucleotidyl transfer reaction in site-specific DNA recombination. Genes Cells 2, 1-12;

24. Andrake M.D., Skalka A.M. (1996) Retroviral integrase, putting the pieces together. J. Biol. Chem. 271, 19633-19636;

25. Rice P., Craigie R., Davies D.R. (1996) Retroviral intergases and their cousins. Curr. Opin. Struct. Biol. 6, 76-83;

26. Mizuuchi K. (1992) Polynucleotidyl transfer reaction in transpositional DNA recombination. J. Biol. Chem. 267,21273-21276;

27. Mizuuchi K., (1992) Transpositional recombination: mechanistic insights from studies of mu and other elements. Annu. Rev. Biochem. 61,1011-1051;

28. Vincent K.A., Ellison V., Chow S.A., Brown P.O. (1993) Characterization of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Integrase expressed in Escherichia coli and analysis of variants with amino terminal mutations. J. Virol. 67 (1), 425437;

29. Zheng R., Jenkins T.M., Craigie R. (1996) Zinc folds the N-terminal of HIV-1 integrase, promotes multimerization, and enhances catalytic activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 93 (24), 13659-13664;

30. Woerner A.M., Marcus-Sekura C.J. (1993) Characterization of a DNA binding domain in the C-terminus of HIV-1 integrase by deletion mutagenesis. Nuc. Acids Res. 21 (15), 3507-3511;

31. Katzman M., Sudol M. (1998). Mapping Viral DNA specificity to the central region of integrase by using functional human immunodeficiency virus type 1/ Visna virus chimeric proteins. J. Virol. 72 (3), 1774-1753;

32. Cai M., Zheng R., Caffrey M., Graigie R., Clore G.M., M.Granenborn A.M. (1997) Solution structure of the N-terminal zinc binding domain of HIV-1 integrase. Nature Struct. Biol. 4 (7), 567-577;

33. Puras Lutzke R.A., Vink C., Plasterk R. (1994) Characterization of the minimal DNA-binding domain of the HIV integrase protein. Nuc. Acids Res. 22 (20), 4125-4131;

34. Lodi P.J., Ernst J.A., Kuszewski J., Hickman А.В., Engelman A., Craigie R. Clore G.M., Gronenborn A.M. (1995) Solution structure of the DNA-binding domain of HIV-1 integrase. Biochemistry. 34 (31), 9826-9833;

35. Chen J.C.-H., Krucinski J., Miercke L.J.W., Finer-Moore J.S., Tang A.H., Leavitt A.D., Stroud R.M. (2000) Crystal structure of the HIV-1 integrase catalytic and C-terminal domains: a model for viral DNA binding. Biochemistry. 97 (15), 8233-8238;

36. Wang J.-Y., Ling H., Yang W., Graigie R. (2001) Structure of a two-domain fragment of HIV-1 integrase: implications for domain organization in the intact protein. EMBO J. 20 (24), 7333-7343;

37. Esposito D., Craigie R. (1999) HIV integrase structure and function. Adv. Virus Res. V 52. P. 319-333;

38. Cherepanov P., Maertens G., Proost P., Devreese В., Van Beeumen J., Engelborgh Y., De Clercq E., Debyser Z. (2003) HIV-1 integrase forms stable tetramers and associates with LEDGF/p75 protein in human cells. J. Biol. Chem. 278 (1), 372-381;

39. Deprez E., Tauc P., Leh H., Mouscadet J.-F., Auclair C., Brochon J.-C. (2000) Oligomeric state of the HIV-1 integrase as measured by time-resolved fluorescence anisotropy. Biochemistry. 39 (31), 9275-9284;

40. Brown P.O., Bowerman В., Varmus H.E., Bishop J.M. (1987) Correct integration of retroviral DNA in vitro. Cell. 49 (3), 347-356;

41. Bukrinsky M.I., Sharova N., Dempsey M.P., Stanwick T.L., Bukrinskaya A.G., Haggerty S., Stevenson M. (1992) Active nuclear import of human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 89(14), 6580-6584;

42. Miller M.D., Farnet C.M., Bushman F.D. (1997) Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J. Virol. 71 (7), 5382-5390;

43. Farnet C.M., Bushman F.D. (1997) HIV-1 cDNA integration: requirement of HMG I(Y) protein for function of preintegration complexes in vitro. Cell. 88 (4), 483-492;

44. Bushman F.D. (1999) Host proteins in retroviral cDNA integration. Adv. Virus Res. 52, 301-317;

45. Carteau S., Hoffmann C., Bushman F. (1998) Chromosome structure and human immunodeficiency virus type 1 cDNA integration: centromeric alphoid repeats are a disfavored target. J. Virol. 72 (5), 4005-4014;

46. Appa R.S., Shin C.G., Lee P., Chow S.A. (2001) Role of the nonspecific DNA-binding region and alpha helices within the core domain of retroviral integrase in selecting target DNA sites for integration. J. Biol. Chem. 276 (49), 45848-45855;

47. Goulaouic H., Chow S.A. (1996) Directed integration of viral DNA mediated by fusion proteins consisting of human immunodeficiency virus type 1 integrase and Escherichia coli LexA protein. J. Virology. 70 (1), 37-46;

48. Bushman F.D, Miller M.D. (1997) Tethering human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes to target DNA promotes integration at nearby sites. J. Virology. 71 (1), 458-464;

49. Coffin J. M., Hughes S. H., Varmus H. E. (1998) Retroviruses. Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Lab. Press. 161-203;

50. Brin E., Yi J., Skalka A., Leis J. (2000) Modeling the late steps in HIV-1 retroviral integrase-catalyzed DNA integration. J. Biol. Chem. 275 (50), 3928739295;

51. Bushman F. D., Craigie R. (1992) Integration of human immunodeficiency virus DNA: adduct interference analysis of required DNA sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 3458-3462;

52. Bushman F. D., Craigie R. (1991) Activities of human immunodeficiency virus (HIV) integration protein in vitro: specific cleavage and integration of HIV DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88,1339-1343;

53. Vink C., van Gent D.C., Elgersma Y., Plasterk R.H. (1991) Human immunodeficiency virus integrase protein requires a subterminal position of its viral DNA recognition sequence for efficient cleavage. J. Virol. 65, 4636-4644;

54. Katzman M., Mack J.P.G., Skalka A.M., Leis J. (1991) A covalent complex between retroviral integrase and nicked substrate DNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 4695-4699;

55. Engelman A., Mizuuchi K., Craigie R. (1991) HIV-1 DNA integration: mechanism of viral DNA cleavage and DNA strand transfer. Cell, 67, 1211-1221;

56. Katzman M., Sudol M. (1996) Nonspecific alcoholysis, a novel endonuclease activity of human immunodeficiency virus type 1 and other retroviral intergases. J. Virol. 70, 2598-2604;

57. Tramontano E., Colla P.L., Cheng Y.C. (1998) Biochemical characterization of HIV-1 integrase 3'-processing activity and its inhibition by phosphorothioate oligonucleotides. Biochemistry 37, 7237-7243;

58. Gerton J.L., Herschlag D., Brown P.O. (1999) Stereospecifity of reactions catalyzed by HIV-1 integrase. J. Biol. Chem. 274, 33480-33487;

59. Mumm S. R., Grandgenett D. P. (1991) Defining nucleic acid-binding properties of avian retrovirus integrase by deletion analysis. J. Virol. 65, 1160-1167;

60. Khan E„ Mack J. P. G„ Katz R. A., Kulkosky J., Skalka A. M. (1991) Retroviral integrase domains: DNA binding and the recognition of LTR sequences. Nucleic Acids Res. 19, 851-860;

61. Yoshinaga Т., Kimura-Ohtani Y., Fujiwara T. (1994) Detection and characterization of a functional complex of human immunodeficiency virus type 1 integrase and its DNA substrate by UV cross-linking. J. Virol., 68, 5690-5697;

62. Hazuda D. J., Wolfe A. L., Hastings J. C., Robbins H. L., Graham P. L., LaFemina R. L., Emini E. A. (1994) Viral long terminal repeat substrate binding characteristic of the human immunodeficiency virus type 1 integrase. J. Biol. Chem. 269, 3999-4004;

63. Vink C., Lutzke R. A., Plasterck R. H. (1994) Formation of a stable complex between the human immunodeficiency virus integrase protein and viral DNA. Nucleic Acids Res. 22,4103-4110;

64. Woerner A. M., Klutch M., Levin J. G., Marcus-Sekura C. J. (1992) Localization of DNA binding activity of HIV-1 integrase to the C-terminal half of the protein. AIDS Res. Hum. Retroviruses 8,297-304;

65. Vora A. C., Grandgenett D. P. (1995) Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration. J. Virol. 69, 7483-7488;

66. Mazumder A., Neamati N., Pilon A.A., Sunder S., Pommier Y. (1996) Chemical trapping of ternary complexes of HIV-1 integrase, Me and DNA substrates. J. Biol. Chem. 271, 27330-27338;

67. Ellison V., Brown P.O. (1994) A stable complex between integrase and viral DNA ends mediates human immunodeficiency virus integration in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 7316-7320;

68. Hazuda D. J., Felock P. J., Hastings J. C., Pramanik В., Wolfe A. L. (1997) Differential divalent cation requirements uncouple the assembly and catalytic reactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase. J. Virol. 71, 70057011;

69. Bugreev D.V., Baranova S., Zakharova O.D., Parissi V., Desjobert C., Sottofattori E., Balbi A., Litvak S., Tarrago-Litvak L., Nevinsky G.A. (2003) Biochemistry 42 (30), 9235-9247;

70. Heuer T.S., Brown P.O. (1997) Mapping features of HIV-1 integrase near selected sites on viral and target DNA molecules in an active enzyme-DNA complex by photo-cross-linking. Biochemistry. 36 (35), 10655-10665;

71. LaFemina R.L., Callahan P.L., Cordingley M.G. (1991) Substrate specifity of recombinant human immunodeficiency virus integrase protein. J. Virol. 65, 56245630;

72. Engelman A., Hickman А. В., Craigie R. (1994) The core and carboxyl-terminal domains of the integrase protein of human immunodeficiency virus type 1 each contribute to nonspecific DNA binding. J. Virol. 68, 5911-5917;

73. Gerton J. L., Brown P. O. (1997) The core domain of HIV-1 integrase recognizes key features of its DNA substrates. J. Biol. Chem. 272, 25809-25815;

74. Shibagaki Y., Holmes M. L., Appa R. S., Chow S. A. (1997) Characterization of feline immunodeficiency virus integrase and analysis of functional domains. Virology 230, 1-10;

75. Katzman M., Sudol M. (1995) Mapping domains of retroviral integrase responsible for viral DNA specificity and target site selection by analysis of chimeras between human immunodeficiency virus type 1 and visna virus integrases. J. Virol. 69, 5687-5696;

76. Jenkins T.M., Esposito D., Engelman A., Craigie R. (1997) Critical contacts between HIV-1 integrase and viral DNA identified by structure-based analysis and photo-crosslinking. EMBO J. 16, 6849-6859;

77. Esposito D., Craigie R. (1998) Sequense specifity of viral end DNA binding by HIV-1 integrase reveals critical regions for protein DNA interactions. EMBO J. 17, 5832-5843;

78. Gao K., Butler S.L., Bushman F. (2001) Human immunodeficiency virus type-1 integrase: arrangement of protein domains in active cDNA complexes. EMBO J. 20, 3565-3576;

79. Withka J.M., Wilde J.A., Bolton P.H., Mazumder A., Gerlt J.A. (1991) Characterization of conformational features of DNA heteroduplexes containing aldehydic abasic sites. Biochemistry 30, 9931-9940;

80. Sherman P.A., Dickson M.L., Fyfe J.A. (1992) Human immunodeficiency virus type 1 integrase protein: DNA sequence requirements for cleaving and joining reaction. J. Virol., 66, 3593-3601;

81. Katzman M., Katz R. A., Skalka A. M., Leis J. (1989) The avian retroviral integration protein cleaves the terminal sequences of linear viral DNA at the in vivo sites of integration. J. Virol. 63, 5319-5327;

82. Mazumder A., Pommier Y. (1995) Processing of deoxyuridine mismatches and abasic sites by human immunodeficiency virus type-1 integrase. Nucl. Acids. Res. 23,2865-2871;

83. Scottoline B.P., Chow S., Ellison V., Brown P.O. (1997) Disruption of the terminal base pairs of retroviral DNA during integration. Genes & Development 11,371-382;

84. Whitcomb J. M., Hughes S. H. (1991) The sequence of human immunodeficiency virus type 2 circle junction suggests that integration protein cleaves the ends of linear DNA asymmetrically. J. Virol. 65, 3906-3910;

85. Randolph C. A., Champoux J. J. (1993) The majority of simian immunodeficiency virus/Mne circle junctions result from ligation of unintegrated viral DNA ends that are aberrant for integration. Virology 194, 851-854;

86. Sherman P., Fyfe J. A. (1990) Human immunodeficiency virus integration protein expressed in Escherichia coli possesses selective DNA cleaving activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 5119-5123;

87. Katzman M., Sudol M. (1996) Influence of subterminal viral DNA nucleotides on differential susceptibility to cleavage by human immunodeficiency virus type 1 and visna virus integrases. J. Virol. 70, 9069-9073;

88. Mazumder A., Gupta M., Pommier Y. (1994) Methylphosphonodiester substitution near the conserved CA dinucleotide in the HIV LTR alters both extent of 3'-processing and choice of nucleophile by HIV-1 integrase. Nucleic Acids Res. 22, 4441-4448;

89. Balakrishnan M., Jonsson C.B. (1997) Functional identification of nucleotides conferring substrate specifity to retroviral integrase reactions. J. Virol. 71, 10251035;

90. Wang Т., Balakrishnan M., Jonsson C.B. (1999) Major and minor groove contacts in retroviral integrase LTR interactions. Biochemistry 38, 3624-3632;

91. Zhou H., Rainey G.J., Wong S.-K., Coffin J.M. (2001) Substrate sequence selection by retroviral integrase. J. Virol. 75,1359-1370;

92. Shih C.-C., Stoye J. S., Coffin J. M. (1988) Highly preferred targets for retrovirus integration. Cell. 53, 531-537;

93. Withers-Ward E. S., fCitamura Y., Barnes J. P., Coffins J. M. (1994) Distribution of targets for avian retrovirus DNA integration in vivo. Genes Dev. 8, 1473-1487;

94. Farnet С. M., Wang В., Lipford J. R., Bushman F. D. (1996) Differential inhibition of HIV-1 preintegration complexes and purified integrase protein by small molecules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 9742-9747;

95. Miller M. D„ Bor Y.-C., Bushman F. (1995) Target DNA capture by HIV-1 integration complexes. Curr. Biol. 5, 1047-1055;

96. Kitamura Y., Lee Y. M. H., Coffin J. M. (1992) Nonrandom integration of retroviral DNA in vitro: Effect of CpG methylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89,5532-5536;

97. Pryciak P. M., Varmus H. E. (1992) Nucleosomes, DNA-binding proteins, and DNA sequences modulate retroviral integration target site selection. Cell 69, 769780;

98. Bor Y.-C., Miller M. D., Bushman F. D., Orgel L. E. (1996) Target-sequence preferences of HIV-1 integration complexes in vitro. Virology 222,283-288;

99. Fitzgerald M. L., Grandgenett D. P. (1994) Retroviral integration: In vitro host site selection by avian integrase. J. Virol. 68,4314-4321;

100. Hong Т., Murphy E., Groarke J., Drlica K. (1993) Human immunodeficiency virus type 1 DNA integration: Fine structure target analysis using synthetic oligonucleotides. J. Virol. 67, 1127-1131;

101. Muller H.-P., Varmus H. E. (1994) DNA bending creates favored sites for retroviral integration: An explanation for preferred insertion sites in nucleosomes. EMBO J. 13,4704-4714;

102. Pruss D., Reeves R., Bushman F. D., Wolffe A. P. (1994) The influence of DNA and nucleosome structure on integration events directed by HIV integrase. J. Biol. Chem. 269,25031-25041;

103. Bushman F. D. (1994) Tethering human immunodeficiency virus 1 integrase to a DNA site directs integration to nearby sequences. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9233-9237;

104. Craigie R. (1992) Hotspots and warm spots: integration specifity of retroelements. Trends Genet. 8, 187-190, Review;

105. Katz R.A., Gravuer К., Skalka A.M. (1998) A preferred target DNA structure for retroviral integrase in vitro. J. Biol. Chem. 273, 24190-24195;

106. Pribil P.A, Haniford D.B. (2003) Target DNA bending is an important specificity determinant in target site selection in TnlO transposition. J Mol Biol. 330(2), 247259;

107. Kalpana G.V., Marmon S., Wang W„ Crabtree G.R., Goff S.P. (1994) Binding and stimulation of HIV-1 integrase by a human homolog of yeast transcription factor SNF5. Science 266, 2002-2006;

108. Podtelezhnikov A.A., Gao K., Bushman F.D., McCammon J.A. (2003) Modeling HIV-1 integrase complexes based on their hidrodynamik properties. Biopolymers 68(1), 110-120;

109. De Luca L., Pedretti A., Vistoli G., Barreca M. L., Villa L., Monforte P., Chimirri A. (2003) Analysis of the full-length integrase-DNA complex by a modified approach for DNA docking. Biochem. and Biophys. Res. Commun. 310, 10831088;

110. Heuer T. S., Brown P. O. (1998) Photo-cross-linking studies suggest a model for the architecture of an active human immunodeficiency virus type 1 integrase-DNA complex. Biochemistry 37, 6667-6678;

111. Gerton J.L., Ohgi S., Olsen M., DeRisi J., Brown P.O. (1998) Effects of mutations in residues near the active site of human immunodeficiency virus type 1 integrase on specific enzyme-substrate interactions. J Virol. 72(6), 5046-55;

112. Adesokan A. A., Roberts V. A., Lee K. W., Lins R. D„ Briggs J. M. (2004) Prediction of HIV-1 integrase/viral DNA interactions in the catalytic domain by fast molecular docking. J. Med. Chem. 47 (4), 821-828;

113. Engelman A., Craigie R. (1995) Efficient magnesium-dependent human immunodeficiency virus type 1 integrase activity. J. Virol. 69, 5908-5911;

114. Gelfand, C.A., Plum, G.E., Grollman, A.P., Johnson, F., Breslauer K.J. (1998) Thermodynamic consequences of an abasic lesion in duplex DNA are strongly dependent on base sequence. Biochemistry. 37, 7321-7327;

115. Zubin EM, Romanova EA, Volkov EM, Tashlitsky VN, Korshunova GA, Shabarova ZA, Oretskaya TS. (1999) Oligonucleotide-peptide conjugates as potential antisense agents. FEBS Lett. 456(1), 59-62;

116. Кузнецова Л.Г., Волков E.M., Романова E.A., Ташлицкий В.Н., Орецкая Т.С., Шабарова З.А. (1991) Биоорган, химия. 17 (9), 1289-1291;

117. Pemberton I.K., Buckle M., Buc H. (1996) The metal ion-induced cooperative binding of HIV-1 integrase to DNA exhibits a marked preference for Mn(II) rather than Mg(II). J Biol Chem. 271(3),1498-506;

118. Deprez E., Barbe S., Kolaski M., Leh H., Zouhiri F., Auclair C., Brochon J.C., Le Bret M., Mouscadet J.F. (2004) Mechanism of HIV-1 integrase inhibition by styrylquinoline derivatives in vitro. Mol. Pharmacol.65(l), 85-98;

119. Bayley H. (1983) Photogenerated reagents in biochemistry and molecular biology. Eds. Work Т., Burdon R. Amsterdam, New York, Oxford: Elsevier 12, 187;

120. Dickerson, R.E. (1998) DNA bending: the prevalence of kinkiness and the virtues of normality. Nucleic Acids Res. 26, 1906-1926;

121. Packer, M.J., Dauncey, M.P., Hunter, C.A. (2000) Sequence-dependent DNA structure: dinucleotide conformational maps. J. Mol. Biol. 295, 71-83;

122. Bertrand, H., Ha-Duong, Т., Fermandjian, S., Hartmann, B. (1998) Flexibility of the B-DNA backbone: effects of local and neighbouring sequences on pyrimidine-purine steps. Nucleic Acids Res. 26,1261-1267;

123. Dickerson, R.E., Chiu, Т.К. (1997) Helix bending as a factor in protein/DNA recognition. Biopolymers. 44,361-403;

124. Jones, S., van Heyningen, P., Berman, H.M., Thornton, J.M. (1999) Protein-DNA interactions: A structural analysis. J. Mol. Biol. 287, 877-896;

125. Lee I., Harshey R. M. (2003) Patterns of sequence conservation at termini of long terminal repeat (LTR) retrotransposons and DNA transposons in the human genome: lessons from phage Mu Nucleic Acids Res. 31(15), 4531 -4540;

126. Antsypovich S.I., Oretskaya T.S., Romanova E.A., Volkov E.M., Tashlitsky V.N., Vasser M., Shabarova Z.A. (1996) Synthesis and properties of cross-linked DNA duplexes. FEBS Lett. 15, 224-226 ;

127. Krzyzosiak W.L., Biernat J., Ciesiolka J., Gornicki P., Wiewiorowski M. (1979) Chemical modification of N6-(N-threonylcarbonyl)adenosine. Part II. Condensation of the carboxyl group with amines. Nucl. Acids Res. 7, 1663-1674;

128. Verheyden J.P., Wagner D., Moffatt J.G. (1971) Synthesis of some pyrimidine 2'-amino-2'-deoxynucleosides. J. Org. Chem. 36, 250-254;

129. Корана Г. Новые направления в химии биологически важных эфиров фосфорной кислоты. М., Изд-во "Мир", 1964, 146-149.