Интеграза ВИЧ-1: ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.10, кандидат химических наук Приказчикова, Татьяна Александровна

• Приказчикова, Татьяна Александровна
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Приказчикова, Татьяна Александровна

Список принятых сокращений.

Введение.

1. Ингибиторы интегразы вируса иммунодефицита человека и механизм их действия /обзор литературы/.

1.1. Интеграза ВИЧ-1: строение и функции.

1.2. Ингибиторы интегразы ВИЧ-1.

1.2.1. Низкомолекулярные ингибиторы.

1.2.1.1. Производные дикетокислот.

1.2.1.2. Производные нафтиридина.

1.2.1.3. Стирилхинолиновые ингибиторы.

1.2.1.4. L-цикориевая кислота и ее производные.

1.2.1.5. Производные гидроксикумарина.

1.2.2. Пептиды и антитела.

1.2.3. Олигонуклеотиды.

2. Интеграза ВИЧ-i: ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами результаты и обсуждение/.

2.1. Оптимизация структуры олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1.

2.1.1. Оптимизация структуры ненуклеотидной части олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1.

2.1.1.1. Дизайн и синтез конъюгатов.

2.1.1.2. Влияние структуры ненуклеотидной части конъюгата на его ингибирующую активность.

2.1.1.3. Влияние положения ненуклеотидной части в структуре конъюгата на его ингибирующую активность.

2.1.2. Оптимизация структуры нуклеотидной части ингибитора интегразы ВИЧ-1.

2.1.2.1. Влияние длины олигонуклеотида на ингибирующую активность конъюгата.

2.1.2.2. Влияние модификаций углеводо-фосфатного остова олигонуклеотида на ингибирующую активность его конъюгатов.

2.1.3. Влияние олигонуклеотидных конъюгатов на активность некоторых ДНК-связывающих ферментов.

2.1.4. Проверка ингибирующей активности конъюгатов 2'-0-метил-олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой.

2.2. Механизм действия олигонуклеотидных конъюгатов.

Определение участка связывания ингибитора.

2.2.1. Действие олигонуклеотидных конъюгатов на устойчивость комплекса интегразы ВИЧ-1 с ДНК.

2.2.2. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ-1 и определение участка связывания.

2.2.2.1. Дизайн и синтез олигонуклеотидных ингибиторов, содержащих 2,3 -дигидроксипропил ьную группировку при 2'-0-атоме уридина.

2.2.2.2. Оптимизация условий ковалентного присоединения ингибитора к интегразе.

2.2.2.3. Получение препаративного количества ковалентно связанного комплекса ингибитора T2-F1 с интегразой, его триптический гидролиз и подготовка продуктов гидролиза к масс-спектрометрическому анализу.

2.2.2.4. Масс-спектрометрический анализ продуктов триптического гидролиза ковалентно связанного комплекса ингибитора с интегразой.

2.3. Доставка олигонуклеотидного ингибитора интегразы ВИЧ-1 в клетки.

2.3.1. Оптимизация условий формирования комплексов олигонуклеотидного ингибитора с носителями.

2.3.2. Проникновение олигонуклеотидного ингибитора в клетки.

2.3.2.1. Трансфекция клеток комплексами олигонуклеотидного ингибитора с пептидными носителями.

2.3.2.2. Трансфекция клеток комплексом олигонуклеотидного ингибитора с pDMAEMA.

Тестирование противовирусной активности олигонуклеотидных ингибиторов на ВИЧ-инфицированных клетках.

3. Экспериментальная часть.

3.1. Реактивы иматериалы

3.1.1. Реактивы.

3.1.2. Ферменты.

3.1.3. Олигонуклеотиды.

3.1.4. Буферные растворы.

3.2. Методы.

3.2.1. Синтез конъюгатов олигонуклеотида с флуоресцеином, эозином и тетраметилродамином.

3.2.2. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность интегразы ВИЧ-1.

3.2.3. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность фрагмента Кленова.

3.2.4. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность эндонуклеазы рестрикции Msp 9RI.

3.2.5. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность мутантов интегразы ВИЧ-1.

3.2.6. Изучение влияния олигонуклеотидных конъюгатов на каталитическую активность интегразы ПВЧ.

3.2.7. Изучение действия олигонуклеотидных конъюгатов на устойчивость комплекса интегразы ВИЧ-1 с ДНК.

3.2.8. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе ВИЧ-1 и определение участка связывания.

3.2.9. Изучение проникновения олигонуклеотидного конъюгата в клетки.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Интеграза ВИЧ-1: ингибирование каталитической активности модифицированными олигонуклеотидами»

Вирус иммунодефицита человека (ВИЧ) поражает иммунную систему и вызывает одно из опаснейших заболеваний - синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). По оценкам всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), на начало 2006 года число людей, зараженных ВИЧ, во всем мире составляло 38,6 миллиона человек (рис.1) [1]. Число людей, заразившихся ВИЧ в 2005 году, составило 4,1 миллиона человек, и 2,8 миллиона человек умерли от СПИДа. В Российской Федерации с момента начала эпидемии и до начала 2006 года официально было зарегистрировано около 350 000 случаев ВИЧ-инфекции. Однако фактическое число людей, живущих в России с ВИЧ-инфекцией намного выше. По различным оценкам, их количество на начало 2006 года составляет от 560000 до 1,6 миллиона человек.

15.04-34,0% □ 1.0%-<5.0% □ 0,1%-<Я.5Ч

5,0%-<15,0Ч □ 0,5%-<1,0% □ <0,1%

Рис. 1. Глобальная картина ВИЧ-инфекции по данным ВОЗ (на начало 2006 года) [1].

До начала применения первых коммерчески доступных лекарственных препаратов против СПИДа продолжительность жизни больных составляла не более одного года. Используемая в настоящее время комплексная терапия HAART (highly active antiretroviral therapy) позволяет продлить время жизни больных СПИДом до 8 лет [2]. Данный вид терапии включает лекарственные препараты, направленные на подавление трех стадий репликативного цикла ВИЧ: обратной транскрипции, протеолитического созревания и слияния вирусной частицы с клеткой. Необходимость использования комплексной терапии обусловлена быстрой эволюцией ВИЧ, которая приводит к появлению устойчивых к препаратам форм вируса. Несмотря на то, что

HAART-терапия рассматривается как наиболее действенная и доступная на сегодняшний день, ее применение приводит к желаемому снижению уровня инфекции только у 50-90% наблюдаемых больных. Она так же не позволяет полностью остановить репликацию ВИЧ. Кроме того, часто возникают проблемы с доступностью препаратов, применяемых в HAART-терапии, их токсичностью и восприимчивостью организмом инфицированного человека. По этим причинам в настоящее время продолжается активный поиск как новых ингибиторов указанных выше стадий репликативного цикла ВИЧ, так и соединений, нарушающих другие стадии цикла вируса и способных дополнить существующую противовирусную терапию.

Большое внимание уделяется разработке ингибиторов стадии интеграции. В ходе собственного воспроизводства вирус использует ресурсы клетки, для чего ему необходимо встроить (интегрировать) ДНК-копию своего генома в геном зараженной клетки. Этот процесс осуществляет вирусный фермент интеграза. Показано, что вирус, содержащий дефектную интегразу, не способную осуществлять интеграцию вирусной ДНК, не размножается в культуре клеток [3]. Это говорит о ключевой роли стадии интеграции в репликативном цикле ВИЧ. Кроме того, остановка репликации вируса при нарушении функций интегразы свидетельствует также о том, что клетка не содержит каких-либо собственных ферментов, способных катализировать интеграцию. В связи с этим, ингибиторы, специфично подавляющие каталитическую активность интегразы, не должны влиять на другие клеточные процессы и, как следствие, должны быть менее токсичны для клетки и всего организма в целом по сравнению с ингибиторами других стадий репликативного цикла ВИЧ. Но, несмотря на всю привлекательность интегразы в качестве мишени для противовирусных препаратов, на сегодняшний день нет ни одного соединения - ингибитора интегразы, которое бы успешно прошло все клинические испытания и было бы предложено как лекарственное средство против СПИДа. Большинство известных на сегодняшний день ингибиторов интегразы, в том числе и ингибиторы, находящиеся на стадии клинических испытаний, взаимодействуют с ионом магния, связанным в активном центре фермента. Однако уже показано, что применение этих ингибиторов приводит к быстрому появлению устойчивых к их действию форм фермента, содержащих мутации в активном центре. Кроме того, такие ингибиторы способны влиять на активность клеточных ферментов, относящихся к тому же семейству, что и интеграза, и использующих при катализе ионы магния, например, V(D)J RAG рекомбиназы, которые необходимы для нормального синтеза антител в организме. В этой связи крайне актуальным является поиск новых соединений, способных подавлять каталитическую активность интегразы, и в том числе ингибиторов с новым механизмом действия.

Целью настоящей работы стала разработка эффективных, специфичных и нецитотоксичных ингибиторов интегразы ВИЧ-1 на основе модифицированных олигонуклеотидов. В ходе работы был осуществлен синтез серии конъюгатов коротких одноцепочечных олигонуклеотидов с гидрофобными соединениями различной структуры и исследовано их действие на активность интегразы ВИЧ-1. Показано, что наиболее эффективными ингибиторами являются конъюгаты 11-звенных олигонуклеотидов с эозином и олеиновой кислотой. Эти соединения подавляют обе стадии интеграции: З'-процессинг и перенос цепи. Кроме того, было исследовано влияние длины олигонуклеотида и структуры его углеводо-фосфатного остова на ингибирующую активность конъюгатов. По результатам исследований, для ингибирования интегразы ВИЧ-1 in vivo предложены конъюгаты 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином или олеиновой кислотой.

Для того чтобы понять механизм действия предложенных нами ингибиторов, мы изучили их действие на комплекс интегразы с ДНК-субстратом - U5 фрагментом ДНК ВИЧ. Установлено, что действие ингибиторов на основе модифицированных олигонуклеотидов направленно на разрушение комплекса интегразы с вирусной ДНК. Ковалентное присоединение олигонуклеотидного ингибитора к интегразе с последующим масс-спектрометрическим анализом продуктов триптического гидролиза ковалентно связанного комплекса позволило идентифицировать участок фермента, с которым взаимодействует ингибитор. Показано, что он локализован в С-концевом домене интегразы. Высокая активность олигонуклеотидных конъюгатов как ингибиторов интегразы ВИЧ-1 свидетельствует о важности данного участка в функционировании фермента. Полученная информация может быть использована для дизайна новых ингибиторов интегразы ВИЧ-1.

Для тестирования противовирусной активности предлагаемых нами ингибиторов на ВИЧ-инфицированных клетках мы подобрали носители, обеспечивающие эффективную доставку олигонуклеотидных конъюгатов в ядра клеток. В сотрудничестве с университетом г. Левен (Бельгия) показано, что конъюгаты 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой ингибируют репликацию ВИЧ-1 в инфицированных клетках.

Работа включает обзор литературы, посвященный основным классам ингибиторов интегразы ВИЧ-1 и механизмам их действия.

Заключение диссертации по теме «Биоорганическая химия», Приказчикова, Татьяна Александровна

выводы

1. Синтезирована серия конъюгатов олигодезоксинуклеотида GGTTTTTGTGT с различными гидрофобными молекулами, исследована их способность ингибировать каталитическую активность интегразы ВИЧ-1 и показано, что наиболее эффективными ингибиторами являются конъюгаты с эозином и олеиновой кислотой. Исследовано влияние длины олигонуклеотида и структуры его углеводо-фосфатного остова на ингибирующую активность. Установлено, что конъюгаты 11-звенного 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином и олеиновой кислотой специфично подавляют активность в реакциях З'-процессинга и переноса цепи.

2. Показано, что конъюгаты подавляют активность интегразы, разрушая ее комплекс с субстратной ДНК.

3. Установлено, что конъюгаты взаимодействуют с С-концевым доменом интегразы в районе Lys236. Предложена гипотеза, согласно которой взаимодействие ингибитора с ферментом в данном участке приводит к нарушению гидрофобных контактов, формирующих p-баррельную структуру С-концевого домена, что в результате вызывает нарушение его ДНК-связывающей функции.

4. Изучено проникновение олигонуклеотидного ингибитора в клетки в присутствии носителей различной природы и подобраны оптимальные условия трансфекции. Обнаружено, что конъюгат 2'-0-метилированного олигонуклеотида с эозином 11-ОМ-Е в комплексе с пептидным носителем (Пептид 1) эффективно ингибирует репликацию ВИЧ-1 в инфицированных клетках.