Структурно-функциональные особенности взаимодействия интегразы ВИЧ-1 и клеточного белка Ku70 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Анисенко, Андрей Николаевич

• Анисенко, Андрей Николаевич
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Анисенко, Андрей Николаевич

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Роль факторов репарации повреждений ДНК в жизненном цикле ВИЧ-1

2.1. Общая характеристика ВИЧ-1

2.2. Жизненный цикл ВИЧ-1

2.1.1. Ранние этапы жизненного цикла ВИЧ-1

2.1.2. Поздние этапы жизненного цикла ВИЧ-1

2.2. Интеграция ВИЧ-1 как источник повреждений ДНК

2.3. Клеточные системы ответа на повреждения ДНК

2.3.1. Репарация двуцепочечных разрывов ДНК

2.3.2. Репарация одноцепочечных повреждений ДНК

2.4. Постинтеграционная репарация ВИЧ-1

2.4.1. Роль пути негомологичного объединения концов и его компонентов в интеграции ВИЧ-1

2.4.2. Роль других факторов клеточного ответа на повреждения ДНК в репликации ВИЧ-1

2.4.3. Путь эксцизионной репарации оснований и репликация ВИЧ-1

2.5. Заключение

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Буферы

3.2. Олигонуклеотиды и плазмиды

3.3. Получение и очистка рекомбинантных белков

3.4. Метод соосаждения белков

3.5. Ко-иммунопреципитация

3.6. Вестерн-блот анализ

3.7. Определение активности ИН

3.8. Связывание ДНК с белками

3.9. Культивирование клеток и сборка псевдовирусных частиц

3.10. Оценка стабильности белков

3.11. Количественный ПЦР

3.12. Докинг и молекулярная динамика

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ

4.1. Определение структурных элементов, участвующих в образовании комплекса

интегразы ВИЧ-1 и клеточного белка ^70

2

4.1.1. Рекомбинантные белки Ku70 и интеграза ВИЧ-1 образуют комплекс in vitro

4.1.2. Вирусная ДНК и клеточный партнер ИН ВИЧ-1 - LEDGF, не препятствуют

взаимодействию ИН ВИЧ-1 с клеточным белком Ku70

4.1.3. Роль N-концевого домена Ku70 во взаимодействии с интегразой

4.1.4. Ku70 не взаимодействует с интегразой пенообразующего вируса человека

4.1.5. Каталитический домен интегразы ВИЧ-1 участвует во взаимодействии с Ku70

4.1.6. Центральный ß-баррельный домен Ku70 содержит второй сайт взаимодействия с интегразой

4.1.7. Аминокислотные остатки интегразы E212 и L213 важны для образования комплекса с Ku70

4.1.8. Конъюгат 11-звенного олигонуклеотида с эозином предотвращает образование комплекса ИН/Ки70

4.1.9. Компьютерное моделирование структуры комплекса интегразы ВИЧ-1 с ингибитором 11-ОМ-Е

4.1.10. Аминокислотные остатки интегразы E212 и L213 важны для ее взаимодействия с Ku70 в клетках HEK293T

4.2. Функциональная роль взаимодействия интегразы ВИЧ-1 и клеточного белка Ku70

4.2.1. Замена аминокислот E212 и L213 в составе интегразы ВИЧ-1 не влияет на интеграцию вектора на основе ВИЧ-1

4.2.2. Интеграза ВИЧ-1 и ее мутантный вариант ИН_Е212А_Ь213 A имеют одинаковую стабильность в клетках HEK293T

4.2.3. Взаимодействие интегразы ВИЧ-1 и клеточного белка Ku70 обеспечивает постинтеграционную репарацию ДНК

4.2.4. Компоненты DNA-PK: Ku70, Ku80 и DNA-PKcs, - вовлечены в процесс постинтеграционной репарации

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

A-MuLV - Abelson murine leukemia virus, вирус мышиной лейкемии Абельсона;

AP-сайт - апуриновый сайт;

ASV - avian sarcoma virus, вирус саркомы птиц;

ATM - аtaxia telangiectasia mutated protein, белок, мутированный при атаксии телеангиэктазии;

ATR - ataxia-telangiectasia and Rad3-related protein, атаксии телеангиэктазии Rad3-связанный белок;

ATRIP - ATR-interacting protein, белок, взаимодействующий с ATR; CHK2 - ^eckpoint kinase 2, чекпоинт киназа 2;

DNA-PK - DNA-dependent protein kinase; ДНК-зависимая протеинкиназа;

DNA-PKcs - DNA-dependent protein kinase catalytic subunit, каталитическая субъединица ДНК-зависимой протеинкиназы;

FEN1 - Flap endonuclease 1, флэп-эндонуклеаза 1;

GST - glutathione S-transferase, глутатион^-трансфераза;

HR - homologous recombination, гомологичная рекомбинация;

LEDGF - lens epithelium-derived growth factor, фактор роста эпителия хрусталика;

MEF - mouse embryonic fibroblast, фибробласты мышиных эмбрионов;

MMLV - Moloney Murine Leukemia Virus, вирус мышиной лейкемии Молони;

NHEJ - non-homologous end joining, негомологичное объединение концов;

PARP - poly-(ADP-ribose) polymerase, поли-(АДФ-рибоза) полимераза;

PCNA - proliferating cell nuclear antigen, ядерный антиген пролиферирующих клеток;

PI3K - phosphoinositide 3-kinase, фосфоинозитид 3-киназа;

RFC - replication factor C, репликативный фактор С; RPA - replication protein A, репликативный белок А; shPHK - малая шпилечная РНК; siPHK - малая интерферирующая ДНК;

TOPBP1 - DNA Topoisomerase II Binding Protein 1, ДНК-топоизомераза II связывающий белок;

АДФ - аденозиндифосфат;

ВИЧ-1 - вирус иммунодефицита человека первого типа; ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; ЖЦ - жизненный цикл; ИН - интеграза;

МИ - множественность инфекции; ОТ - обратная транскриптаза; ПВЧ - пенообразующий вирус человека; ПИК - прединтеграционный комплекс; ПЦР - полимеразная цепная реакция; РНК - рибонуклеиновая кислота; УФ - ультрафиолет;

ЭРН - эксцизионная репарация нуклеотидов; ЭРО - эксцизионная репарация оснований.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурно-функциональные особенности взаимодействия интегразы ВИЧ-1 и клеточного белка Ku70»

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Современные методы борьбы с вирусом иммунодефицита человека первого типа (ВИЧ-1) основаны на предупреждении передачи вируса и на медикаментозном лечении ВИЧ-инфекции. В терапии ВИЧ в последние 20-30 лет проделана колоссальная работа, позволившая создать десятки уникальных препаратов и их комбинаций, применяемых в современной медицинской практике. Все эти препараты делятся на 4 категории в зависимости от мишени, на которую они действуют: ингибиторы вирусной обратной транскриптазы, протеазы, интегразы и ингибиторы слияния и проникновения вируса в клетку.

Применение указанных препаратов, а также их комбинаций позволило существенно улучшить качество жизни ВИЧ-инфицированных пациентов и перевести это заболевания из разряда смертельно опасных в хронические. К сожалению, особенности жизненного цикла ВИЧ приводят к появлению в организме пациентов, получающих терапию, вирусных частиц, устойчивых к действию конкретных антиретровирусных агентов. Дело в том, что все анти-ВИЧ препараты действуют на вирусные белки, а при репликации вируса в организме из-за низкой точности работы обратной транскриптазы в этих белках возникают мутации, часть из которых вызывает резистентность к действию препаратов. Таким образом, актуальным является поиск новых мишеней для создания препаратов с минимальным риском развития резистентности.

Такими мишенями потенциально могут быть комплексы вирусных белков с клеточными белками, участвующими в репликации вируса. Установлено, например, что для правильной работы вирусного фермента интегразы, осуществляющей встраивание ДНК-копии вирусного генома в геном клетки, требуется его ассоциация с различными клеточными белками-помощниками. Один из наиболее изученных белков-помощников - фактор роста эпителия хрусталика (lens epithelium-derived growth factor, LEDGF). Он стабилизирует функционально активное тетрамерное состояние интегразы, а

также направляет интеграцию в активно транскрибируемые участки генома. Подавление экспрессии LEDGF существенно понижает эффективность репликации вируса, что иллюстрирует функциональную значимость клеточных белков-помощников в жизненном цикле вируса. Созданы соединения, препятствующие взаимодействию интегразы ВИЧ-1 и белка LEDGF, которые в культуре инфицированных клеток подавляют репликацию вируса.

Важно отметить, что к соединениям, действующим не на вирусные ферменты, а препятствующим формированию их комплексов с клеточными белками, практически не развивается резистентность, поскольку поверхность взаимодействия двух белков чрезвычайно консервативна и любая мутация в этом регионе негативно сказывается на стабильности комплекса.

Несколько лет назад был обнаружен еще один клеточный белок, подавление экспрессии которого в культуре клеток приводит к снижению эффективности репликации вируса, - Ku70. Было высказано предположение, что Ku70 взаимодействует с вирусной интегразой и защищает ее от протеасомальной деградации. Однако ни точный механизм участия Ku70 в репликации ВИЧ-1, ни структура комплекса интегразы с Ku70 не были установлены. Соответственно, для того чтобы понять, может ли комплекс интегразы ВИЧ-1 с клеточным белком Ku70 рассматриваться как еще одна перспективная мишень для создания ингибиторов репликации вируса с минимальным риском развития резистентности, необходимо было охарактеризовать структуру этого комплекса и оценить важность его формирования для успешной репродукции ВИЧ-1.

Цели и задачи работы. Целью данной работы являлось изучение структурных основ взаимодействия интегразы ВИЧ-1 и клеточного белка Ku70, а также установление функционального значения этого взаимодействия. В ходе работы было необходимо решить следующие задачи: 1) показать, что рекомбинантные белки: интеграза ВИЧ-1 и белок человека Ku70, - образуют комплекс in vitro;

7

2) определить структурные элементы в составе интегразы ВИЧ-1 и Ku70, участвующие в образовании их комплекса;

3) исследовать возможность ингибирования процесса связывания интегразы ВИЧ-1 с Ku70;

4) изучить эффект Ku70 на стабильность интегразы в культуре клеток человека HEK293T;

5) исследовать влияние взаимодействия интегразы с Ku70 на репликацию ВИЧ-1 и выяснить механизм этого влияния.

Научная новизна и практическая значимость. В данной работе впервые показано, что интеграза ВИЧ-1 (ИН) и клеточный белок Ku70 формируют устойчивый комплекс in vitro. Определены структурные детерминанты как ИН, так и Ku70, отвечающие за формирование комплекса между этими белками. Показано, что замена двух аминокислот в составе ИН, E212 и L213, нарушает ее связывание с Ku70 как in vitro, так и в культуре клеток НЕК 293Т. Обнаружено соединение, препятствующее взаимодействию ИН ВИЧ-1 с Ku70, - конъюгат эозина с 2'-О-метил-олигонуклеотидом GGUUUUUGUGU, охарактеризован механизм ингибирования. В сотрудничестве с лабораторией А.В. Головина методом молекулярного моделирования комплекса ИН ВИЧ-1 с этим конъюгатом на суперкомпьютере «Ломоносов» показано, что ингибирование связывания ИН с Ku70 обусловлено экранированием аминокислот E212 и L213 олигонуклеотидом.

Детально исследовано влияние Ku70 на стабильность ИН и ее варианта с заменами E212A/L213A в культуре клеток НЕК 293Т, и установлено, что уровень ИН прямо пропорционально зависит от уровня Ku70, причем этот эффект одинаков для фермента дикого типа и его мутантной формы, неспособной взаимодействовать с Ku70. Таким образом, впервые показано, что стабилизация ИН в присутствии Ku70 не обусловлена образованием их комплекса.

Разработан метод, позволяющий количественно определять степень

8

репарации геномной ДНК после интеграции в нее вирусной ДНК. С использованием этого метода впервые достоверно показано, что Ku70 в составе ДНК-зависимой протеинкиназы DNA-PK участвует в постинтеграционной репарации ДНК. Впервые установлено, что взаимодействие ИН ВИЧ-1 с клеточным белком Ku70 критически важно для постинтеграционной репарации ДНК.

Полученные результаты способствуют пониманию механизмов постинтеграционной репарации ДНК, а также могут быть использованы для создания принципиально новых препаратов, подавляющих репликацию ВИЧ-1 на уровне постинтеграционной репарации ДНК и не приводящих к развитию резистентности вируса. Положения, выносимые на защиту:

1. Рекомбинантные белки: интеграза ВИЧ-1 и белок человека Ku70 -образуют прочный комплекс in vitro;

2. Со стороны интегразы в связывании Ku70 принимают участие аминокислотные остатки а6-спирали, а именно, E212 и L213. Со стороны Ku70 ключевую роль в образовании комплекса с интегразой играют аминокислотные остатки N-концевого домена с 1 по 250;

3. Конъюгат 11-звенного 2'-О-метил-олигонуклеотида (5'-GGUUUUUGUGU-3') с эозином препятствует взаимодействию интегразы ВИЧ-1 и клеточного белка Ku70, экранируя аминокислотные остатки интегразы E212 и L213 в составе а6-спирали;

4. Белок Ku70 действительно защищает интегразу от протеасомальной деградации, но этот эффект не обусловлен образованием комплекса между этими белками;

5. Взаимодействие интегразы ВИЧ-1 и клеточного белка Ku70 важно для завершения процесса интеграции вирусной ДНК, а именно, для постинтеграционной репарации ДНК.

Вклад автора. Личный вклад заключался в анализе литературных данных,

планировании и постановке экспериментов, обработке полученных результатов и их интерпретации, подготовке публикаций. Молекулярное моделирование комплекса интегразы ВИЧ-1 с олигонуклеотидным ингибитором 11 -ОМ-Е было выполнено в сотрудничестве с лабораторией А.В. Головина (Факультет биоинженерии и биоинформатики, МГУ, Россия). Степень достоверности результатов. Результаты были получены на современном научном оборудовании, изготовленном ведущими мировыми производителями. В работе использовали классические, хорошо зарекомендовавшие себя методы, а также новые экспериментальные подходы, получившие хорошие отзывы на конференциях и при рецензировании статей. Все эксперименты были поставлены несколько раз и хорошо воспроизводимы, результаты статистически обработаны в соответствии с существующими критериями.

Апробация работы и научные публикации. По материалам работы опубликовано 6 статей в отечественных и зарубежных рецензируемых журналах. Результаты работы были доложены на следующих конференциях: международная научная конференция по биоорганической химии «XII чтения памяти академика Юрия Анатольевича Овчинникова» 2017 г., V Съезд Биохимиков России 2016 г., Frontiers of Retrovirology Conference 2016 г., 38-ой, 39-ый, 40-ой и 42-ой Конгресс FEBS 2013, 2014, 2015 и 2017 гг, соответственно, 11th Annual Meeting of the Oligonucleotide Therapeutics Society 2015 г., 29th Annual Symposium of the Protein Society 2015 г.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Роль факторов репарации повреждений

ДНК в жизненном цикле ВИЧ-1

2.1. Общая характеристика ВИЧ-1

ВИЧ-1 относится к семейству Retroviridae, роду Lentivirus. Вирион

имеет вид сферических частиц размером от 100 до 200 нм в диаметре. Генетический материал ВИЧ-1 представлен двумя идентичными молекулами одноцепочечной (+)РНК, каждая из которых имеет размер порядка 10 000 оснований [Sukosd et al., 2015]. Вирусная РНК находится в ассоциации с нуклеокапсидным белком p7, обратной транскриптазой (ОТ) и интегразой (ИН) [Muriaux, Darlix, 2010]. Последние два вирусные фермента осуществляют ключевые стадии жизненного цикла ВИЧ-1: обратную транскрипцию, т.е. синтез ДНК копии вирусной геномной РНК, и интеграцию этой ДНК копии в геном клетки. Эти рибонуклеопротеиновые комплексы защищены капсидом, состоящим из примерно 1500 - 3000 копий капсидного белка p24 и имеющим форму усеченного конуса [Summers et al., 1992]. Капсид окружен сферической матриксной оболочкой, состоящей из матриксного белка p17, снаружи от которой расположена оболочка вируса. Эта наружная оболочка представляет собой фрагмент билипидного слоя клеточной мембраны, захваченный вирусом во время его отпочковывания от инфицированной клетки, с трансмембранными гликопротеиновыми комплексами Env вирусного происхождения [Muriaux, Darlix, 2010]. Каждый комплекс образован тремя субъединицами трансмембранного гликопротеина gp41 и тремя субъединицами поверхностного гликопротеина gp120 (Рис. 1, А) [Turner, Summers, 1999]. На рисунке 1, Б представлена схематическая структура генома ВИЧ-1. В нем закодировано, по крайней мере, 15 вирусных белков, находящихся в перекрывающихся рамках считывания. Ген pol кодирует три вирусных фермента: обратную транскриптазу, интегразу и протеазу. В гене gag закодирована информация о четырех структурных белках: p24 (белок капсида), p6 и p7 (нуклеокапсидные белки), p17

(матриксный белок). Третий большой ген env кодирует белок gp160, разрезаемый клеточными протеазами на структурные белки gp41 и gp120. Другие более мелкие гены кодируют белки Tat, Rev и Vpr, участвующие в регуляции вирусной транскрипции и экспорту из ядра молекул вирусной РНК, а также Vif, Nef, Vpu, способствующие вирусной репликации и подавляющие защитные клеточные механизмы [Sükösd et al., 2015].

Рисунок 1. Схематичное представление структуры ВИЧ-1 и его генома. А - Структура вириона ВИЧ-1 ^ескЬеск й а1., 2013]; Б - структура генома ВИЧ-1 [БеШ й а1., 2017]. Обратная транскриптаза (ОТ), интеграза (ИН).

2.2. Жизненный цикл ВИЧ-1

Жизненный цикл ВИЧ-1 (ЖЦ) представляет совокупность последовательных событий, начинающихся со связывания вируса с CD4 рецептором на поверхности клетки и заканчивающихся отпочковыванием новых вирусных частиц. События в жизненном цикле вируса можно формально разделить на ранние и поздние этапы. Ранние этапы ЖЦ направлены на формирование провирусной ДНК, т.е. ДНК копии вирусного генома, встроенной в геном инфицированной клетки. На поздних этапах происходит биосинтез компонентов вириона и сборка новых вирусных частиц [Sutton et al., 2015] (Рис. 2).

Рисунок 2. Жизненный цикл ВИЧ-1. Этапы 1-5 - ранние этапы жизненного цикла ВИЧ-1, этапы 6-11 - поздние этапы жизненного цикла ВИЧ-1 [Kirchhoff, 2013].

2.1.1. Ранние этапы жизненного цикла ВИЧ-1

Проникновение вируса. Первый этап ЖЦ вируса представляет собой его связывание с поверхностью клетки. Этот процесс начинается, когда гликопротеин gp120, расположенный на поверхности вириона, связывается с CD4 рецептором на поверхности инфицируемой клетки, что приводит к конформационным изменениям обоих белков. CD4 рецептор присутствует на поверхности таких клеток, как CD4+ T-лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки, микроглия. В ходе конформационных изменений в комплексе gp120/CD4 в составе gp120 открывается эпитоп, позволяющий ему связываться с хемокиновыми рецепторами CCR5 или CXCR4 на поверхности клетки. Мутации в этих молекулах, также как и соединения, связывающиеся с ними, препятствуют эффективному проникновению вируса в клетки. В ходе связывания корецептора происходят конформационные изменения в трансмембранной части гликопротеинового комплекса gp41/gp120, что обеспечивает слияние вирусной оболочки и клеточной мембраны [Sullivan et al., 1998].

Обратная транскрипция. Сразу после слияния вируса с клеткой вирусный геном попадает в цитоплазму клетки, где начинается процесс обратной транскрипции. Вирион-ассоциированная обратная транскриптаза ВИЧ-1 (ОТ) синтезирует двуцепочечную ДНК на матрице вирусной РНК. В качестве затравки для синтеза первой цепи ДНК используется лизиновая тРНК, 3'-конец которой комплементарен последовательности на 5'-конце вирусной РНК (PBS, Рис. 3, А) [Kleiman, 2002]. Обладая РНК-зависимой ДНК-полимеразной активностью, ОТ синтезирует первую цепь вирусной ДНК (Рис. 3). ОТ обладает РНКазной активностью, поэтому сразу за синтезом первой цепи ДНК следует деградация РНК-матрицы, находящейся в дуплексе с вновь синтезированной цепью ДНК. Лишь небольшой фрагмент исходной РНК, получивший название полипуриновый тракт, остается нетронутым и выступает в качестве затравки для синтеза второй цепи

вирусной ДНК (Рис. 3, Г). Вторая цепь ДНК синтезируется также вирусной ОТ за счет ДНК-зависимой ДНК-полимеразной активности фермента [Hu, Hughes, 2012]. При синтезе ДНК происходят два «перескока» синтезируемых фрагментов ДНК (Рис. 1, В и Е), в результате чего на концах ДНК копии вирусного генома оказываются два одинаковых участка - длинные концевые повторы (long terminal repeats, LTR), содержащие последовательности U3, R и U5. С онцами вновь синтезированной ДНК связываются вирусные и клеточные белки, формируя прединтеграционный комплекс (ПИК), который транспортируется в ядро [Engelman, 2009].

R U5 | pbs_gag_pol_env_ppt| U3

В

«-I

R U5 | pbs gag pol env ppt| из R

«-

| Pbs gag pol env ppt| из R

TT * I

I Pbs gag pol env ppt| из R U5

т ' 1

| Pbs gag pol env JDptj из R U5

U3 R U5 I pbs gag pol env ppt, U3 R U5 -1±-1-1-г A

)K из R U5 ,pbs gag pol env ppt. U3 R U5

LTR LTR

■ г A

CSH

PERSPECTIVES

Рисунок 3. Стадии процесса обратной транскрипции ВИЧ-1. А - фрагмент тРНК, выступающей в качестве праймера, связывается с комплементарным участком в РНК-геноме ВИЧ-1; Б - ОТ синтезирует фрагмент «-»-цепи ДНК ВИЧ-1 (синяя), разрушая участок РНК, находящийся в РНК/ДНК дуплексе; В-Г - вновь синтезированный фрагмент ДНК содержит в своем составе R-последовательность, комплементарную 3'-концу вирусной РНК. Происходит скачок ДНК-фрагмента на 3'-конец РНК, что позволяет продолжить синтез первой цепи ДНК. Одновременно с синтезом ДНК разрушается вся РНК ВИЧ-1 за исключением одного фрагмента (ppt, полипуриновый тракт); Д - ppt фрагмент РНК выступает в качестве затравки для синтеза второй цепи ДНК; Е-Ж -участок второй цепи «перепрыгивает» на 3' -конец первой цепи ДНК, продолжается синтез полноразмерной ДНК копии вирусного генома [Hu, Hughes, 2012].

Распаковка вирусного генома и ядерный транспорт. Ранние работы по изучению жизненного цикла ВИЧ предполагали, что капсидная оболочка удаляется сразу после проникновения вируса [Grewe et al., 1990; Karageorgos et al., 1993; Bukrinsky, 2004; Arhel, 2010]. Согласно последним данным [Campbell, Hope, 2015; Jacques et al., 2016], вирусный капсид остается в неизменном виде на протяжении нескольких часов после проникновения вируса в клетку. Подобная стабильность капсидной оболочки играет ключевую роль в защите РНК-генома ВИЧ-1 от цитоплазматических эндонуклеаз и сенсоров чужеродных нуклеиновых кислот [Campbell, Hope, 2015; Jacques et al., 2016]. Более того, некоторые исследователи предполагают, что процесс обратной транскрипции и образования ПИК сопряжен с распаковкой капсида и происходит в непосредственной близости к ядерной поре [Arhel, 2010]. ПИК транспортируется в ядро путем активного транспорта, поскольку он слишком велик для пассивного транспорта. Первоначально предполагалось, что важную роль в активном транспорте выполняет ряд белков ПИК, такие как интеграза, матриксный белок p17, а также Vpr [Jayappa et al., 2012]. Однако сейчас появляется все больше данных, согласно которым ключевую роль в этом процессе выполняет белок капсида p24 [Jayappa et al., 2012].

Интеграция. Синтезированная в ходе обратной транскрипции ДНК копия вирусного генома связана с рядом вирусных и клеточных белков-помощников, вместе образующих ПИК. В составе ПИК идентифицированы как вирусные (ОТ, интеграза (ИН), Vpr, нуклеокапсидный белок p7, матриксный белок p17), так и клеточные белки (LEDGF, BAF, Ku70, Ini-1, HMG-I/Y) [Lin, Engelman, 2003; Miller et al., 1997; Liano et al., 2007; Raghavendra et al., 2010; Li et al., 2001]. Основной компонент ПИК - ИН, вирусный фермент, встраивающий копию вирусной ДНК в геном инфицированной клетки. Без интеграции, протекающей в ядре инфицированной клетки, невозможна эффективная продукция новых

вирусных частиц. В результате этого процесса формируется провирус -стабильно интегрированный вирусный геном.

ИН ВИЧ-1 относится к семейству DD(E/D) ДНК-транспозаз, обеспечивающих встраивание ДНК в геном за счет реакции переэтерификации без образования ковалентного интермедиата ДНК с ферментом. Однако, в отличие от классических транспозаз, для активности ИН ВИЧ-1 необходимо наличие свободных концов вирусной ДНК [Polard, Chandler, 1995; Engelman, Cherepanov, 2014].

Процесс интеграции начинается еще в цитоплазме. Здесь ИН, связанная с последовательностями на концах вирусной ДНК, катализирует реакцию 3'-процессинга, в результате которой отщепляются динуклеотиды GT c обоих З'-концов вирусной ДНК. После проникновения ПИК в ядро ИН связывает клеточную ДНК. ИН ВИЧ-1 не проявляет сиквенс-специфичности при связывании ДНК in vitro [Агапкина et al., 2005]. Тем не менее, анализ распределения сайтов интеграции в клеточной ДНК демонстрирует, что интеграция происходит преимущественно в активно-транскрибируемые локусы генома [Brady et al., 2010]. Этому способствует один из наиболее изученных клеточных партнеров ИН - транскрипционный коактиватор LEDGF, входящий в состав ПИК. Снижение внутриклеточного уровня LEDGF, также как и нарушение взаимодействия между ИН и LEDGF с помощью низкомолекулярных соединений существенно снижают инфекционность вируса [Hare, Cherepanov, 2009].

Будучи связанной с клеточной и вирусной ДНК, ИН катализирует реакцию переноса цепи, в результате которой вирусная ДНК встраивается в геном инфицированной клетки. Процесс интеграции завершается клеточными системами репарации, которые устраняют бреши по краям провирусной ДНК, возникающие в ходе интеграции [Ю. Агапкина et al., 2005].

2.1.2. Поздние этапы жизненного цикла ВИЧ-1

После образования провируса начинаются поздние этапы ЖЦ ВИЧ-1. Во-первых, запускается активная транскрипция вирусных мРНК и новых геномных РНК вируса. Во-вторых, начинается синтез новых вирусных белков, необходимых для сборки новых вирусных частиц, а также участвующих в регуляции транскрипции с провируса (например, Tat, активирующий транскрипцию с LTR промотора ВИЧ-1). Поздние этапы репликативного цикла ВИЧ-1 завершаются сборкой и отпочковыванием новых вирусных частиц [Sutton et al., 2013].

2.2. Интеграция ВИЧ-1 как источник повреждений ДНК

Интеграция является неотъемлемой частью жизненного цикла ВИЧ-1, поскольку активная транскрипция возможна только с интегрированной провирусной ДНК. Как отмечалось выше, в этом процессе принимает участие большое количество как вирусных, так и клеточных белков, входящих в состав ПИК. Однако ключевая роль отводится интегразе ВИЧ-1. Как отмечено выше, ее каталитический центр представлен триадой аминокислот D,D(35)E, который характерен для всех ретровирусных интеграз и транспозаз [Esposito, Craigie, 1999]. Связывание концов вирусной ДНК в каталитическом центре фермента позволяет ИН осуществить первую из двух каталитических реакций - реакцию 3'-концевого процессинга, - в ходе которой отщепляется динуклеотид GT и конец вирусной ДНК приобретает структуру, необходимую для последующего этапа интеграции (Рис. 4). Реакция осуществляется в цитоплазме клетки и проходит по механизму нуклеофильной атаки молекулой воды фосфодиэфирной связи между вторым и третьим нуклеотидом [Ю. Агапкина et al., 2005].

5' ©оооооооооооэ©3' 3. о©оооооооооо®©5.

Вирусная кДНК

З'-процессинг

5'©®оооооооооо0^ о оооооооооо@о5.

3 1) Транспорт в ядро

Цитоплазма

ядР° ,, 1) Перенос цепи

5©<юооооооооо°^— О оооооооооо®©5.

-^3

г

5'оооооооооооооо3'

з-ОООООООООООООО..

Клеточная ДНК

5Ъооо ^Чэооооооооооооооооооо3' 3,оооооооооооооооооос^ ооооо5,

Репарация ДНК

ООООООООООСХЭООООООООООООООООО

ооооооооооооооооооооооооооооо

Интегрированная провирусная ДНК

Рисунок 4. Схема интеграции и постинтеграционной репарации повреждений ДНК, возникающих в ходе интеграции генома ВИЧ-1 [Княжанская е! а1., 2016].

Затем ПИК транспортируется в ядро, где при участии клеточных белков-помощников ИН связывается с клеточной ДНК и катализирует реакцию переноса цепи. В ходе нее свободные 3'-гидроксильные группы вирусной ДНК атакуют межнуклеотидные фосфаты обеих цепей клеточной ДНК. Геометрия ПИК такова, что встраивание обоих концов вирусной ДНК идет в комплементарные цепи клеточной ДНК на расстоянии 5 пар

19

нуклеотидов друг от друга (Рис. 4). Вследствие интеграции в обе цепи клеточной ДНК вносятся разрывы, фланкирующие интегрированную вирусную ДНК [Агапкина et а1., 2005].

Ретровирусная интеграция приводит к появлению множественных повреждений ДНК. Во-первых, как повреждение может быть воспринято нарушение структуры хроматина, вызванное встраиванием безгистоновой вирусной ДНК (около 10 000 п.о.) (Рис. 5). Во-вторых, к прямым повреждениям ДНК, происходящим в ходе интеграции, можно отнести одноцепочечные 5-ти нуклеотидные бреши в составе клеточной ДНК, фланкирующие вновь интегрированную ДНК, а также неспаренные динуклеотиды СА на 5'-концах вирусной ДНК (Рис. 4, 5). Прохождение репликативной вилки через интегрированную, но нерепарированную ДНК в ходе Б-фазы клеточного цикла может приводить к преобразованию этих одноцепочечных разрывов ДНК в двуцепочечные, что является серьезной угрозой для стабильности генома (Рис. 5) [Бка1ка, Katz, 2005].

А

Рисунок 5. Интеграция ВИЧ-1 - источник множественных повреждений ДНК. А - в

ходе интеграции ДНК копии генома ВИЧ-1 образуются серьезные аномалии в структуре хроматина: фрагмент вирусной ДНК не связан с гистоновыми белками; Б - по краям от провируса содержатся 5-нуклеотидные одноцепочечные фрагменты клеточной ДНК, а на 5'-концах вирусной ДНК расположены неспаренные динуклеотиды; В - в результате прохождения репликативной вилки через сайт интеграции могут образовываться двуцепочечные разрывы ДНК [Бка1ка, Katz, 2005].

Таким образом, ретровирусная интеграция является источником существенных повреждений клеточной ДНК, которые требуют незамедлительного восстановления для эффективной репликации вируса. В противном случае, клетки с такими повреждениями могут быть элиминированы путем апоптоза, что негативно скажется на вирусной инфекции.

2.3. Клеточные системы ответа на повреждения ДНК

Ежедневно в каждой клетке нашего организма возникают повреждения ДНК; их число варьирует от десятков до тысяч событий в день [Jackson, Bartek, 2010]. Подобные повреждения могут возникать в геноме как в результате эндогенных клеточных процессов, так и под действием экзогенных факторов. К внутриклеточным процессам, приводящим к повреждениям, относятся: продукция активных форм кислорода, репликация ДНК, в ходе которой ДНК-полимераза допускает ошибки, неправильная работа ферментов, таких как топоизомеразы I и II, приводящая к разрывам цепей ДНК [Caldecott, 2007]. К внешним повреждающим агентам относятся УФ и ионизирующее излучение, вирусные агенты, химические мутагены [Ghosal, Chen, 2013].

Быстрое и точное устранение любых повреждений ДНК важно для

поддержания стабильности генома, в противном случае они могут привести к

образованию мутаций, в том числе нарушающих функционирование

отдельных клеток или даже организма [Jackson, Bartek, 2010]. Для борьбы с

повреждениями ДНК клетка использует широкий спектр механизмов их

обнаружения и восстановления. Это высокоорганизованная и четко

регулируемая белковая сеть, которая быстро активируется в ответ на

повреждения ДНК. Такие сигнальные пути включают следующие

обязательные компоненты: сенсоры повреждений, преобразователи сигнала,

ряд переносчиков и финальные акцепторы сигнала. Активация таких путей

21

ведет к аресту клеточного цикла (КЦ) и привлечению белков, участвующих в репарации повреждений ДНК [Ryan et al., 2015].

Рисунок 6. ATM, ATR и DNA-PK сигнальные пути. ATM путь: MRN комплекс (MRE11, RAD50, NBS1) связывается с двуцепочечным разрывом ДНК, привлекает ATM-протеинкиназу к месту повреждения. Активированная ATM фосфорилирует ряд эффекторов, например, CHK2 и p53 и репарационных факторов. ATR путь: ATR связывается в сайтах одноцепочечных разрывов ДНК, связанных с репликативным белком А (RPA), при участии белка-помощника ATRIP. К месту повреждения также привлекается белок TOPBP1, который активирует ATR. Активированная форма ATR фосфорилирует ряд эффекторов. DNA-PK путь: гетеродимер Ku70/Ku80 узнает двуцепочечный разрыв ДНК, после чего с концами поврежденной ДНК связывается каталитическая субъединица DNA-PKcs. Автофосфорилирование DNA-PKcs ведет к активации DNA-PK и привлечению ряда факторов, принимающих участие в негомологичном объединении концов (NHEJ). [Ryan et al., 2015].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Анисенко, Андрей Николаевич, 2018 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Amsel, A.D., Rathaus, M., Kronman, N., Cohen, H.Y. (2008). Regulation of the proapoptotic factor Bax by Ku70-dependent deubiquitylation. Proc. Natl. Acad. Sci. 105, 5117-5122.

2. Anisenko, A., Agapkina, J., Zatsepin, T., Yanvarev, D., Gottikh, M. (2012). A new fluorometric assay for the study of DNA-binding and 3'-processing activities of retroviral integrases and its use for screening of HIV-1 integrase inhibitors. Biochimie 94, 2382-2390.

3. Anisenko, A.N., Knyazhanskaya, E.S., Zalevsky, A.O., Agapkina, J.Y., Sizov, A.I., Zatsepin, T.S., Gottikh, M.B. (2017). Characterization of HIV-1 integrase interaction with human Ku70 protein and initial implications for drug targeting. Sci. Rep. 7, 5649.

4. Anisenko, A.N., Knyazhanskaya, E.S., Zatsepin, T.S., Gottikh, M.B. (2017) Human Ku70 protein binds hairpin RNA and double stranded DNA through two different sites. Biochimie 132, 85-93.

5. Appelqvist, H., Johansson, A.C., Linderoth, E., Johansson, U., Antonsson, B., Steinfeld, R., Kâgedal, K., Ollinger, K. (2012). Lysosome-mediated apoptosis is associated with cathepsin D-specific processing of bid at Phe24, Trp48, and Phe183. Ann. Clin. Lab. Sci. 42, 231-242.

6. Arhel, N. (2010). Revisiting HIV-1 uncoating. Retrovirology 7, 96.

7. Ariumi, Y., Turelli, P., Masutani, M., Trono, D. (2005). DNA damage sensors ATM, ATR, DNA-PKcs, and PARP-1 are dispensable for human immunodeficiency virus type 1 integration. J. Virol. 79, 2973-2978.

8. Awasthi, P., Foiani, M., Kumar, A. (2016). ATM and ATR signaling at a glance. J. Cell Sci. 129, 1285.

9. Baekelandt, V., Claeys, A., Cherepanov, P., De Clercq, E., De Strooper, B., Nuttin, B., Debyser, Z. (2000). DNA-Dependent protein kinase is not required for efficient lentivirus integration. J. Virol. 74, 11278-11285.

10. Bennett, G.R., Peters, R., Wang, X.H., Hanne, J., Sobol, R.W., Bundschuh, R., Fishel, R., Yoder, K.E. (2014). Repair of oxidative DNA base damage in the host genome influences the HIV integration site sequence preference. PLoS One 9, e103164.

11. Brady, T., Agosto, L.M., Malani, N., Berry, C.C., O'Doherty, U., Bushman, F. (2009). HIV integration site distributions in resting and activated CD4+ T cells infected in culture. AIDS 23, 1461-1471.

12. Brin, E., Yi, J., Skalka, A.M., Leis, J. (2000). Modeling the late steps in HIV-1 retroviral integrase-catalyzed DNA integration. J. Biol. Chem. 275, 3928739295.

13. Bueno, M.T., Reyes, D., Valdes, L., Saheba, A., Urias, E., Mendoza, C., Fregoso, O.I., Llano, M. (2013). Poly(ADP-ribose) polymerase 1 promotes transcriptional repression of integrated retroviruses. J. Virol. 87, 2496-2507.

14. Bukrinsky, M. (2004) A hard way to the nucleus. Mol. Med. 10, 1-5.

15. Bushman, F., Lewinski, M., Ciuffi, A., Barr, S., Leipzig, J., Hannenhalli, S., Hoffmann, C. (2005). Genome-wide analysis of retroviral DNA integration. Nat. Rev. Microbiol. 3, 848-858.

16. Caldecott, K.W. (2007). Mammalian single-strand break repair: mechanisms and links with chromatin. DNA Repair 6, 443-453.

17. Campbell, E.M., Hope, T.J. (2015). HIV-1 capsid: the multifaceted key player in HIV-1 infection. Nat. Rev. Microbiol. 13, 471-483.

18. Cannan, W.J., Pederson, D.S. (2016). Mechanisms and Consequences of Double-Strand DNA Break Formation in Chromatin. J. Cell Physiol. 231, 314.

19. Ciccia, A., Elledge, S.J. (2010). The DNA damage response: making it safe to play with knives. Mol. Cell. 40, 179-204.

20. Coffin, J.M., Rosenberg, N. (1999). Retroviruses. Closing the joint. Nature 399, 413-416.

21. Daniel, R., Greger, J.G., Katz, R.A., Taganov, K.D., Wu, X., Kappes, J.C., Skalka, A.M. (2004). Evidence that stable retroviral transduction and cell survival following DNA integration depend on components of the nonhomologous end joining repair pathway. J. Virol. 78, 8573-8581.

22. Daniel, R., Kao, G., Taganov, K., Greger, J.G., Favorova, O., Merkel, G., Yen, T.J., Katz, R.A., Skalka, A.M. (2003). Evidence that the retroviral DNA integration process triggers an ATR-dependent DNA damage response. Proc. Natl. Acad. Sci. 100, 4778-4783.

23. Daniel, R., Katz, R.A., Merkel, G., Hittle, J.C., Yen, T.J., Skalka, A.M. (2001). Wortmannin potentiates integrase-mediated killing of lymphocytes and reduces the efficiency of stable transduction by retroviruses. Mol. Cell Biol. 21, 1164-1172.

24. Daniel, R., Katz, R.A., Skalka, A.M. (1999). A role for DNA-PK in retroviral DNA integration. Science 284, 644-647.

25. Dehart, J.L., Andersen, J.L., Zimmerman, E.S., Ardon, O., An, D.S., Blackett, J., Kim, B., Planelles, V. (2005). The ataxia telangiectasia-mutated and Rad3-related protein is dispensable for retroviral integration. J. Virol. 79, 13891396.

26. Durocher, D., Jackson, S.P. (2001). DNA-PK, ATM and ATR as sensors of DNA damage: variations on a theme? Curr. Opin. Cell. Biol. 13, 225-231.

27. Durocher, D., Jackson, S.P. (2001). DNA-PK, ATM and ATR as sensors of DNA damage: variations on a theme? Curr. Opin. Cell Biol. 13, 225-231.

28. Engelman, A. (2009). Isolation and analysis of HIV-1 preintegration complexes. Methods Mol. Biol. 485, 135-149.

29. Engelman, A., Cherepanov, P. (2014). Retroviral Integrase Structure and DNA Recombination Mechanism. Microbiol. Spectr. 2, 1-22.

30. Espeseth, A.S., Fishel, R., Hazuda, D., Huang, Q., Xu, M., Yoder, K., Zhou, H. (2011). siRNA screening of a targeted library of DNA repair factors in HIV infection reveals a role for base excision repair in HIV integration. PLoS One 6, e17612.

31. Esposito, D., Craigie, R. (1999). HIV integrase structure and function. Adv. Virus Res. 52, 319-333.

32. Felli, C., Vincentini, O., Silano, M., Masotti, A. (2017). HIV-1 Nef Signaling in Intestinal Mucosa Epithelium Suggests the Existence of an Active Inter-kingdom Crosstalk Mediated by Exosomes. Front. Microbiol. 8, 1022.

33. Fernandez, G., Zeichner, S.L. (2010). Cell line-dependent variability in HIV activation employing DNMT inhibitors. Virol. J. 7, 266.

34. Gagné, J.P., Rouleau, M., Poirier, G.G. (2012). Structural biology. PARP-1 activation - bringing the pieces together. Science 336, 678-679.

35. Gäken, J.A., Tavassoli, M., Gan, S.U., Vallian, S., Giddings, I., Darling, D.C., Galea-Lauri, J., Thomas, M.G., Abedi, H., Schreiber, V., Ménissier-de Murcia, J., Collins, M.K., Shall, S., Farzaneh, F. (1996). Efficient retroviral infection of mammalian cells is blocked by inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase activity. J. Virol. 70, 3992-4000.

36. Ghosal, G., Chen, J. (2013). DNA damage tolerance: a double-edged sword guarding the genome. Transl. Cancer Res. 2, 107-129.

37. Goetze, R.W., Kim, D.H., Schinazi, R.F., Kim, B. (2017). A CRISPR/Cas9 approach reveals that the polymerase activity of DNA polymerase ß is dispensable for HIV-1 infection in dividing and nondividing cells. J. Biol. Chem. 292, 14016-14025.

38. Grewe, C., Beck, A., Gelderblom, H.R. (1990). HIV: early virus-cell interactions. J. Acquir. Immune Defic. Syndr. 3, 965-974.

39. Gu, Z., Wang, H., Nekrutenko, A., Li, W.H. (2000). Densities, length proportions, and other distributional features of repetitive sequences in the human genome estimated from 430 megabases of genomic sequence. Gene 259, 81-88.

40. Ha, H.C., Juluri, K., Zhou, Y., Leung, S., Hermankova, M., Snyder, S.H. (2001). Poly(ADP-ribose) polymerase-1 is required for efficient HIV-1 integration. Proc. Natl. Acad. Sci. 98, 3364-3368.

100

41. Hanakahi, L.A. (2007). 2-Step purification of the Ku DNA repair protein expressed in Escherichia coli. Protein Expr. Purif. 52, 139-145.

42. Hare, S., Cherepanov, P. (2009). The Interaction Between Lentiviral Integrase and LEDGF: Structural and Functional Insights. Viruses 1, 780-801.

43. Hu, W.S., Hughes, S.H. (2012). HIV-1 reverse transcription. Cold Spring Harb. Perspect. Med. 2, pii: a006882.

44. Hultquist, J.F., Schumann, K., Woo, J.M., Manganaro, L., McGregor, M.J., Doudna, J., Simon, V., Krogan, N.J., Marson, A. (2016). A Cas9 Ribonucleoprotein Platform for Functional Genetic Studies of HIV-Host Interactions in Primary Human T Cells. Cell Rep. 17, 1438-1452.

45. Jackson, S.P., Bartek, J. (2009). The DNA-damage response in human biology and disease. Nature 461, 1071-1078.

46. Jacques, D.A., McEwan, W.A., Hilditch, L., Price, A.J., Towers, G.J., James, L.C. (2016). HIV-1 uses dynamic capsid pores to import nucleotides and fuel encapsidated DNA synthesis. Nature 536, 349-353.

47. Jayappa, K.D., Ao, Z., Yao, X. (2012). The HIV-1 passage from cytoplasm to nucleus: the process involving a complex exchange between the components of HIV-1 and cellular machinery to access nucleus and successful integration. Int. J. Biochem. Mol. Biol. 3, 70-85.

48. Jeanson, L., Subra, F., Vaganay, S., Hervy, M., Marangoni, E., Bourhis, J., Mouscadet, J.F. (2002). Effect of Ku80 depletion on the preintegrative steps of HIV-1 replication in human cells. Virology 300, 100-108.

49. Kameoka, M., Nukuzuma, S., Itaya, A., Tanaka, Y., Ota, K., Ikuta, K., Yoshihara, K. (2004). RNA interference directed against Poly(ADP-Ribose) polymerase 1 efficiently suppresses human immunodeficiency virus type 1 replication in human cells. J. Virol. 78, 8931-8934.

50. Kameoka, M., Nukuzuma, S., Itaya, A., Tanaka, Y., Ota, K., Inada, Y., Ikuta, K., Yoshihara, K. (2005). Poly(ADP-ribose)polymerase-1 is required for integration of the human immunodeficiency virus type 1 genome near centromeric alphoid DNA in human and murine cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 334, 412-417.

51. Karageorgos, L., Li, P., Burrell, C. (1993). Characterization of HIV replication complexes early after cell-to-cell infection. AIDS Res. Hum. Retroviruses 9, 817-823.

52. Khow, O., Suntrarachun, S. (2012). Strategies for production of active eukaryotic proteins in bacterial expression system. Asian Pac. J. Trop. Biomed. 2, 159-162.

53. Kimple, M.E., Brill, A.L., Pasker, R.L. (2013). Overview of affinity tags for protein purification. Curr. Protoc. Protein Sci. 73, Unit 9.9.

101

54. Kirchhoff, F. (2013). HIV Life Cycle: Overview. Encyclopedia of AIDS. Springer Science, New York.

55. Kleiman, L. (2002). tRNA(Lys3): the primer tRNA for reverse transcription in HIV-1. IUBMB Life 53, 107-114.

56. Knyazhanskaya, E.S., Smolov, M.A., Kondrashina, O.V., Gottikh, M.B. (2009). Relative Comparison of Catalytic Characteristics of Human Foamy Virus and HIV-1 Integrases. Acta Naturae 1, 78-80.

57. Ko, H.L., Ren, E.C. (2012). Functional Aspects of PARP1 in DNA Repair and Transcription. Biomolecules 2, 524-548.

58. Krishnan, L., Li, X., Naraharisetty, H.L., Hare, S., Cherepanov, P., Engelman, A. (2010). Structure-based modeling of the functional HIV-1 intasome and its inhibition. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 15910-15915.

59. Krokan, H.E., Bj0ras, M. (2013). Base excision repair. Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 5, a012583.

60. Kunkel, T.A., Erie, D.A. (2015). Eukaryotic Mismatch Repair in Relation to DNA Replication. Annu. Rev. Genet. 49, 291-313.

61. Lans, H., Marteijn, J.A., Vermeulen, W. (2012). ATP-dependent chromatin remodeling in the DNA-damage response. Epigenetics Chromatin 5, 4.

62. Leh, H., Brodin, P., Bischerour, J., Deprez, E., Tauc, P., Brochon, J.C., LeCam, E., Coulaud, D., Auclair, C., Mouscadet, J.F. (2000). Determinants of Mg2+-dependent activities of recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase. Biochemistry 39, 9285-9294.

63. Li, L., Olvera, J.M., Yoder, K.E., Mitchell, R.S., Butler, S.L., Lieber, M., Martin, S.L., Bushman, F.D. (2001). Role of the non-homologous DNA end joining pathway in the early steps of retroviral infection. EMBO J. 20, 32723281.

64. Lin, C.W., Engelman, A. (2003). The barrier-to-autointegration factor is a component of functional human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes. J. Virol. 77, 5030-5036.

65. Llano, M., Vanegas, M., Fregoso, O., Saenz, D., Chung, S., Peretz, M., Poeschla, E.M. (2004). LEDGF/p75 determines cellular trafficking of diverse lentiviral but not murine oncoretroviral integrase proteins and is a component of functional lentiviral preintegration complexes. J. Virol. 78, 9524-9537.

66. Manganaro, L., Lusic, M., Gutierrez, M.I., Cereseto, A., Del Sal, G., Giacca, M. (2010). Concerted action of cellular JNK and Pin1 restricts HIV-1 genome integration to activated CD4+ T lymphocytes. Nat. Med. 16, 329-333.

67. Mazurov, D., Ilinskaya, A., Heidecker, G., Lloyd, P., Derse, D. (2010). Quantitative comparison of HTLV-1 and HIV-1 cell-to-cell infection with new replication dependent vectors. PLoS Pathog. 6, e1000788.

102

68. Miller, M.D., Farnet, C.M., Bushman, F.D. (1997). Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes: studies of organization and composition. J. Virol. 71, 5382-5390.

69. Miller, M.D., Wang, B., Bushman, F.D. (1995). Human immunodeficiency virus type 1 preintegration complexes containing discontinuous plus strands are competent to integrate in vitro. J. Virol. 69, 3938-3944.

70. Muriaux, D., Darlix, J.L. (2010). Properties and functions of the nucleocapsid protein in virus assembly. RNA Biol. 7, 744-753.

71. Polard, P., Chandler, M. (1995). Bacterial transposases and retroviral integrases. Mol. Microbiol. 15,13-23.

72. Prikazchikova, T.A., Volkov, E.M., Zubin, E.M., Romanova, E.A., Gottikh, M.B. (2007) Inhibition of HIV-1 Integrase by Modified Oligonucleotides: Optimization of the Inhibitor Structure. Molecular Biology 41, 118-125.

73. Raghavendra, N.K., Shkriabai, N., Graham, R.L., Hess, S., Kvaratskhelia, M., Wu, L. (2010). Identification of host proteins associated with HIV-1 preintegration complexes isolated from infected CD4+ cells. Retrovirology 7, 66.

74. Rathaus, M., Lerrer, B., Cohen, H.Y. (2009). DeubiKuitylation: a novel DUB enzymatic activity for the DNA repair protein, Ku70. Cell Cycle 8, 18431852.

75. Roelofs, K.G., Wang, J., Sintim, H.O., Lee, V.T. (2011). Differential radial capillary action of ligand assay for high-throughput detection of protein-metabolite interactions. Proc. Natl. Acad. Sci. 108, 15528-15533.

76. Rom, S., Reichenbach, N.L., Dykstra, H., Persidsky, Y. (2015). The dual action of poly(ADP-ribose) polymerase -1 (PARP-1) inhibition in HIV-1 infection: HIV-1 LTR inhibition and diminution in Rho GTPase activity. Front. Microbiol. 6, 878.

77. Ryan, E.L., Hollingworth, R., Grand, R.J. (2016). Activation of the DNA Damage Response by RNA Viruses. Biomolecules 6, 2.

78. Sakurai, Y., Komatsu, K., Agematsu, K., Matsuoka, M. (2009). DNA double strand break repair enzymes function at multiple steps in retroviral infection. Retrovirology 6, 114.

79. Shinagawa, H., Iwasaki, H. (1996). Processing the holliday junction in homologous recombination. Trends Biochem. Sci. 21, 107-111.

80. Siva, A.C., Bushman, F. (2002). Poly(ADP-ribose) polymerase 1 is not strictly required for infection of murine cells by retroviruses. J. Virol. 76, 11904-11910.

81. Skalka, A.M., Katz, R.A. (2005). Retroviral DNA integration and the DNA damage response. Cell Death Differ. Suppl 1, 971-978.

103

82. Smith, J.A., Wang, F.X., Zhang, H., Wu, K.J., Williams, K.J., Daniel, R. (2008). Evidence that the Nijmegen breakage syndrome protein, an early sensor of double-strand DNA breaks (DSB), is involved in HIV-1 postintegration repair by recruiting the ataxia telangiectasia-mutated kinase in a process similar to, but distinct from, cellular DSB repair. Virol. J. 5, 11.

83. Steckbeck, J.D., Kuhlmann, A.S., Montelaro, R.C. (2013). C-terminal tail of human immunodeficiency virus gp41: functionally rich and structurally enigmatic. J. Gen. Virol. 94, 1-19.

84. Studamire, B., Goff, S.P. (2008). Host proteins interacting with the Moloney murine leukemia virus integrase: multiple transcriptional regulators and chromatin binding factors. Retrovirology 5, 48.

85. Sükösd, Z., Andersen, E.S., Seemann, S.E., Jensen, M.K., Hansen, M., Gorodkin, J., Kjems, J. (2015). Full-length RNA structure prediction of the HIV-1 genome reveals a conserved core domain. Nucleic Acids Res. 43, 10168-10179.

86. Sullivan, N., Sun, Y., Sattentau, Q., Thali, M., Wu, D., Denisova, G., Gershoni, J., Robinson, J., Moore, J., Sodroski, J. (1998). CD4-Induced conformational changes in the human immunodeficiency virus type 1 gp120 glycoprotein: consequences for virus entry and neutralization. J. Virol. 72, 4694-4703.

87. Summers, M.F., Henderson, L.E., Chance, M.R., Bess, J.W., South, T.L., Blake, P.R., Sagi, I., Perez-Alvarado, G., Sowder, R.C., Hare, D.R. (1992). Nucleocapsid zinc fingers detected in retroviruses: EXAFS studies of intact viruses and the solution-state structure of the nucleocapsid protein from HIV-1. Protein Sci. 1, 563-74.

88. Sutton, J., Dotson, D., Dong, X. (2013). Molecular Events in Late Stages of HIV-1 Replication. JSM Microbiol. 1, pii:1004.

89. Turner, B.G., Summers, M.F. (1999). Structural biology of HIV. J. Mol. Biol. 285, 1-32.

90. Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C.J., Li, P. (2001). Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. J. Virol. 75, 11253-11260.

91. Vandekerckhove, L., Christ, F., Van Maele, B., De Rijck, J., Gijsbers, R., Van den Haute, C., Witvrouw, M., Debyser, Z. (2006). Transient and stable knockdown of the integrase cofactor LEDGF/p75 reveals its role in the replication cycle of human immunodeficiency virus. J. Virol. 80, 1886-1896.

92. Vandergeeten, C., Fromentin, R., Merlini, E., Lawani, M.B., DaFonseca, S., Bakeman, W., McNulty, A., Ramgopal, M., Michael, N., Kim, J.H.,

104

Ananworanich, J., Chomont, N. (2014). Cross-clade ultrasensitive PCR-based assays to measure HIV persistence in large-cohort studies. J. Virol. 88, 12385-12396.

93. Walker, J.R., Corpina, R.A., Goldberg, J. (2001). Structure of the Ku heterodimer bound to DNA and its implications for double-strand break repair. Nature 412, 607-614.

94. Waninger, S., Kuhen, K., Hu, X., Chatterton, J.E., Wong-Staal, F., Tang, H.

(2004). Identification of cellular cofactors for human immunodeficiency virus replication via a ribozyme-based genomics approach. J. Virol. 78, 1282912837.

95. Yan, S., Sorrell, M., Berman, Z. (2014). Functional interplay between ATM/ATR-mediated DNA damage response and DNA repair pathways in oxidative stress. Cell Mol. Life Sci. 71, 3951-3967.

96. Yang, J., Yu, Y., Hamrick, H.E., Duerksen-Hughes, P.J. (2003). ATM, ATR and DNA-PK: initiators of the cellular genotoxic stress responses. Carcinogenesis 24, 1571-1580.

97. Yoder, K.E., Bushman, F.D. (2000). Repair of gaps in retroviral DNA integration intermediates. J. Virol. 74, 11191-11200.

98. Yoder, K.E., Espeseth, A., Wang, X.H., Fang, Q., Russo, M.T., Lloyd, R.S., Hazuda, D., Sobol, R.W., Fishel, R. (2011). The base excision repair pathway is required for efficient lentivirus integration. PLoS One 6, e17862.

99. Zheng, Y., Ao, Z., Wang, B., Jayappa, K.D., Yao, X. (2011). Host protein Ku70 binds and protects HIV-1 integrase from proteasomal degradation and is required for HIV replication. J. Biol. Chem. 286, 17722-17735.

100. Агапкина, Ю.Ю., Приказчикова, Т.А., Смолов, М.А., Готтих, М.Б.

(2005). Структура и функции интегразы ВИЧ-1. Успехи биологической химии 45, 87-122.

101. Княжанская, Е.С., Шадрина, О.А., Анисенко, А.Н., Готтих, М.Б. (2016). Роль ДНК-зависимой протеинкиназы в репликации ВИЧ-1. Молекулярная биология 50, 639-654.