Инициация физико-химических и биологических процессов самоочищения как способ подготовки углеводородных шламов к биоремедиации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат биологических наук Несмелов, Александр Александрович

• Несмелов, Александр Александрович
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Несмелов, Александр Александрович

СОДЕРЖАНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ПОЛОЖЕНИЯ НА ЗАЩИТУ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Шламы, содержащие углеводороды

1.2 Химический состав шламов, содержащих углеводороды

1.3 Физическая структура шламов, содержащих углеводороды

1.4 Замораживание и оттаивание шламов, содержащих углеводороды

1.5 Токсичность шламов, содержащих углеводороды

1.6 Оценка токсичности объектов, содержащих углеводороды

1.7 Микрофлора шламов, содержащих углеводороды

1.8 Биологические методы переработки шламов, содержащих углеводороды

1.9 Подготовка шламов к биологическому обезвреживанию

1.10 Фиторемедиация объектов, загрязнённых углеводородами

1.11 Факторы, определяющие эффективность биологического обезвреживания

углеводородного загрязнения

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Общая характеристика объектов исследования

2.2 Отбор и подготовка проб

2.3 Лабораторные эксперименты

2.3.1 Лабораторный эксперимент по оценке воздействия замораживания и оттаивания на скорость обезвоживания шламов при центрифугировании

2.3.2 Лабораторный эксперимент по оценке воздействия замораживания и оттаивания на обезвоживание шламов в условиях высушивания

2.3.3 Анализ минералогического состава шламов

2.4 Характеристика воздействия замораживания и оттаивания на микрофлору шлама

2.5 Характеристика воздействия замораживания и оттаивания шлама на токсические свойства, состав водной фазы шлама, генотоксические свойства водной фазы шлама и ДМСО-экстракта

2.6 Подготовка шлама к биологическому обезвреживанию в условиях полевого эксперимента

2.7 Оценка дыхательной активности микрофлоры обработанного шлама при варьировании форм и доз удобрений и источника полива

2.8 Скрининг растений-фитомелиорантов

2.9 Полевой эксперимент по оптимизации фиторемедиации

2.10 Методы анализа характеристик шлама

2.10.1 Биологические методы анализа

2.10.2 Методы анализа физической структуры

2.10.3 Методы анализа химического состава

2.11 Статистическая обработка данных

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Характеристика объектов исследования

3.2 Влияние замораживания и оттаивания на обезвоживание шламов

3.2.1 Влияние замораживания и оттаивания на обезвоживание шламов в условиях центрифугирования

3.2.2 Влияние замораживания и оттаивания на обезвоживание шламов в условиях высушивания

3.3 Характеристика минералогического состава шламов с точки зрения их физической структуры и процессов трансформации загрязнений

3.4 Выбор объекта для дальнейших исследований

3.5 Воздействие замораживания и оттаивания на микрофлору шлама

3.5.1 Воздействие замораживания и оттаивания на численность культивируемых микроорганизмов шлама

3.5.2 Воздействие замораживания и оттаивания на численность некультивируемых микроорганизмов шлама

3.5.3 Воздействие замораживания и оттаивания на дыхательную активность микрофлоры шлама

3.6 Воздействие замораживания и оттаивания на токсические и генотоксические свойства, состав водной фазы шлама

3.7 Полевой эксперимент по подготовке шлама ОАО "Казаньоргсинтез" к биологическому обезвреживанию

3.8 Подбор условий для активизации биологического обезвреживания шлама

3.8.1 Скрининг растений-фитомелиорантов

3.8.2 Дыхательная активность микрофлоры шлама при варьировании форм и доз удобрений и источника орошения

3.8.3 Изменение фитотоксичности обработанного шлама при внесении

наполнителей и удобрений в деляночном эксперименте

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

БГКП - бактерии группы кишечной палочки

ВС - водоудерживающая способность

ДМСО - диметилсульфоксид

МПА - мясо-пептонный агар

З/о - замораживание и оттаивание

КОЕ - колоние-образующая единица

НШ — нефтешлам, шлам, содержащий нефть, её компоненты или нефтепродукты.

ПАВ — поверхностно-активные вещества ПАУ - полиядерные ароматические углеводороды УВ - углеводороды УД - удобрения ФМ - фитомасса

ЕС50 - единица токсичности, кратность разведения образца, вызывающая 50% ингибирование тест-объекта.

Vbasai - «базальное» дыхание, показатель активности микрофлоры Vsir - субстрат-индуцированное дыхание, показатель активности микрофлоры QR - метаболический коэффициент, показатель активности микрофлоры БКРю - безопасная кратность разведения, кратность разведения токсиканта, вызывающая 10% ингибирования тест-объекта.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Инициация физико-химических и биологических процессов самоочищения как способ подготовки углеводородных шламов к биоремедиации»

ВВЕДЕНИЕ

В ходе первичной очистки сточных вод предприятий органического синтеза и нефтехимии образуются твёрдые отходы, загрязнённые углеводородами - шламы. Специфические свойства отходов данного типа обуславливают сложность их обезвреживания: существующие технологии переработки шламов характеризуются высокой стоимостью и нередко сопряжены с вторичным загрязнением окружающей среды.

Методы биоремедиации, с успехом применяемые для обезвреживания углеводород-загрязненных объектов [Dibble, Bartha, 1979], обладают спектром достоинств, из которых наиболее значимыми являются низкая экологическая опасность продуктов переработки и сравнительно низкая стоимость процесса. Однако, обезвреживание in situ шламов предприятий органического синтеза и нефтешламов с применением этих методов невозможно ввиду высокого уровня загрязнения отходов этого типа токсичными компонентами [Juvonen et al, 2000, Propst et al, 1999]. Дополнительными ограничениями в этом случае являются большая длительность биологической деградации значительного количества ксенобиотиков и неблагоприятные физико-химические свойства шламовых масс, обуславливающие отсутствие доступа кислорода в их толщу. Данные обстоятельства диктуют необходимость предварительной подготовки шламов к биологическому обезвреживанию.

В рамках наиболее известных технологий биоремедиации шламов -компостирования [Ouyang et al, 2005; Никитина с соавт., 2006] и ландфарминга [Prado-Jatar et al, 1993] в качестве приёма предварительной подготовки выступает смешивание масс отхода с большими количествами наполнителей (почвой, соломой, опилками, торфом и пр.). При этом, за счёт структурирования и разбавления снижается токсическое влияние компонентов отхода на биоту и усиливается аэрация его толщи, что ускоряет деградацию поллютантов [Rhykerd et al., 1999]. Однако такому способу подготовки шлама

присущи неотъемлемые недостатки, прежде всего - высокая стоимость, обусловленная затратами на наполнители и комплекс технологических операций.

В данной работе исследовали возможность проведения подготовки углеводородсодержащих шламов предприятия органического синтеза ОАО «Казаньоргсинтез» и нефтехимического предприятия ОАО «Нижнекамскнефтехим» к биологическому обезвреживанию за счёт комплексного воздействия абиотических и биотических факторов, лежащих основе естественных процессов их самоочищения, в том числе замораживания и оттаивания и аборигенной микрофлоры отходов. Наиболее перспективным методом дальнейшего биологического обезвреживания шламов, сочетающий сравнительно высокую эффективность с низкой стоимостью, является фиторемедиация, что обуславливает включение фитотоксичности в спектр показателей для оценки эффективности процесса подготовки шламов.

В связи с вышесказанным, целью данной работы стала разработка способа подготовки углеводородсодержащих шламов к биологическому обезвреживанию, основанного на направленном ускорении физико-химических и биологических процессов их самоочищения.

Решались следующие задачи:

1. Установить закономерности изменения физической структуры и химического состава щламов под воздействием замораживания и оттаивания и выявить основные компоненты в минералогическом составе твёрдой фазы шлама.

2. Определить токсические и генотоксические свойства водной фазы шлама до и после воздействия замораживания и оттаивания.

3. Охарактеризовать динамику изменений качественного и количественного состава и активности микрофлоры шламов под воздействием

замораживания и оттаивания.

4. Провести полевой эксперимент по подготовке шлама ОАО «Казаньоргсинтез» к биологическому обезвреживанию методом замораживания и оттаивания в масштабе промышленных испытаний.

5. Подобрать условия для ускорения биологического обезвреживания подготовленного шлама за счёт оптимизации доз азотных (нитрат аммония) и фосфорных (суперфорсфат) удобрений, скрининга растений-фитомелиорантов и внесения наполнителей.

ПОЛОЖЕНИЯ НА ЗАЩИТУ

1. Воздействие замораживания и оттаивания дестабилизирует физическую структуру углеводородного шлама ОАО «Казаньоргсинтез», ускоряет его обезвоживание в условиях высушивания до 26% в течение 10 сут, и не вызывает изменений токсических и генотоксических свойств водной фазы данного отхода, но вызывает снижение численности и активности микрофлоры.

2. С применением рентген-дифрактометрического анализа установлено, что в составе механических примесей шлама преобладают минералы, способные оказать значительное влияние на процессы трансформации органических компонентов шлама за счёт структурирующего действия ионов кальция.

3. В полевых условиях продемонстрировано, что воздействие комплекса процессов самоочищения шлама ОАО «Казаньоргсинтез», ускоренных в контролируемых условиях, позволяет достичь снижения уровня загрязнения и токсичности шлама до уровня, совместимого с ростом растений-фитомелиорантов и, тем самым, подготовить его к интенсивному биологическому обезвреживанию методом фиторемедиации.

4. Продемонстрирована возможность ускорения биологического обезвреживания шлама за счёт вовлечения микробно-растительных взаимодействий в процесс обезвреживания шлама при высеве овса Avena sativa L., внесении удобрений и агротехнической обработки.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 Шламы, содержащие углеводороды

Шламы — разнообразная группа отходов промышленности, представляющих собой осадки разнообразного происхождения. В данной работе объектом исследования являлись шламы, содержащие углеводороды (далее по тексту шламы). Наиболее распространённая группа подобных отходов - нефтешламы, осадки, загрязнённые нефтью или нефтепродуктами [Абросимов, 2002]. Основная масса нефтешламов (НШ) образуется при отстаивании сточных вод и при хранении нефти и нефтепродуктов в резервуарах [Абросимов, 2002]. Кроме того, шламы, содержащие углеводороды, образуются на предприятиях органического синтеза. Зачастую сырьём для синтезов служит природный газ, а не нефть, как например на одном из крупнейших в России предприятии органического синтеза ОАО "Казаньоргсинтез". В связи с этим, применение термина «нефтешлам» по отношению к шламам, образующимся на предприятиях органического синтеза, является некорректным. В рамках данной работы нефтешламы и шламы предприятий органического синтеза целесообразно обозначить общим термином «шламы, содержащие углеводороды». Рассматриваемые в данной работе отходы - шлам предприятия органического синтеза ОАО "Казаньоргсинтез" и нефтешлам нефтеперерабатывающего предприятия ОАО "Нижнекамскнефтехим" образуются в ходе первичной очистки сточных вод, содержащих углеводороды.

Основные компоненты шламов, образующихся при очистке сточных вод, содержащих углеводороды - собственно углеводороды, вода и механические примеси (минеральная часть - песок, глина и тому подобное) [Dibble, Bartha, 1979]. Соотношение данных компонентов, их состав и свойства шламов в целом значительно варьируют в зависимости от большого числа факторов, таких как источник происхождения конкретного шламов, тип

сырья и глубина его переработки, схема переработки, типа и состояния оборудования, применяемых регентов, длительности и условий хранения шламов. Как правило, шламы содержат углеводороды и воду в сравнимых количествах: содержание углеводородов, по разным оценкам, варьирует от 10 до 90% и более, воды - от 3 до 90% [Dibble, Bartha, 1979; Lazar et al, 1999; Zubaidy, Abouelnasr, 2010]. Содержание минеральной части варьирует от 2 до 46% [Dibble, Bartha, 1979]. В зависимости от происхождения нефтешламов, наблюдается некоторое смещение спектра их свойств в ту или иную область. Так, например, для нефтешламов, образующихся при очистке сточных вод, характерно повышенное содержание воды (не менее 50% [Абросимов, 2002]), в то время как нефтешламы, образующиеся в нефтяных резервуарах, в большинстве случаев представляют собой малообводнённые вязкие осадки с относительно высоким содержанием минеральных частиц и углеводородов. В зависимости от происхождения шламов, условий и длительности их хранения варьирует не только соотношение, но и химический состав их компонентов. В состав органических компонентов шламов могут войти как любые компоненты исходного сырья, так и любые прямые и побочные продукты технологических процессов. Состав органических компонентов шламов варьирует в зависимости от используемого сырья, типов и особенностей технологических процессов на предприятии, состояния оборудования и иных факторов.

Несмотря на одновременное содержание углеводородов и воды, углеводород-содержащие шламы не расслаиваются, а остаются стабильными. Это связано с тем, что компоненты шламов образуют стабильные дисперсные системы (эмульсии). Высокое содержание воды усложняет обработку и хранение этих отходов. Кроме того, высокая обводнённость шламов обуславливает консистенцию этих отходов в виде вязкой однородной массы, в которой отсутствуют поры. Это ограничивает доступ кислорода в объём отхода, и, наряду с токсичностью компонентов, ограничивает эффективность

биологического обезвреживания шламов.

1.2 Химический состав шламов, содержащих углеводороды

Специфической чертой углеводород-содержащих шламов, образующихся при первичной очистке сточных вод, является высокая доля углеводородов в составе их загрязнений. В состав органических компонентов шламов могут войти как любые компоненты исходного сырья, так и любые прямые и побочные продукты технологических процессов. Органические компоненты (прежде всего, компоненты нефти) на основании структурных и функциональных различий можно подразделить на четыре основные группы: насыщенные и ароматические углеводороды, а также N, S, О-содержащие компоненты: смолы и асфальтены. Углеводородное загрязнение, не связанное в своём происхождении с нефтью (например, загрязнение отходов органического синтеза), зачастую содержит компоненты, функционально аналогичные всем четырём перечисленным группам. Алифатические углеводороды в составе химических шламов представлены алканами, изоалканами и циклоалканами. В шламах нефтедобывающей промышленности их содержание может превышать 50% от общего количества нефтяных углеводородов [Mishra et al., 2001].Среди углеводородов ШЛ преобладают алканы, которые в отходах нефтедобычи могут составлять 90% от всех органических соединений [Giles et al., 2001]. Специфической чертой химических ШЛ является повышенное содержание ароматических углеводородов - до 30%, [Mishra et al., 2001], , среди которых значительно увеличивается доля разнообразных низкомолекулярных летучих ароматических компонентов, например, бензола, толуола, фенола, стирола [Якушева с соавт., 2002]. Кроме того, в данную группу входят полициклические ароматические углеводороды (содержание в шламах 0.14 -15 г/кг [Aprill et al., 1990, Juvonen et al., 2000]), некоторые из которых признаны опасными канцерогенами, например, бензо(а)пирен [Keith, Telliard,

1979].

Асфальтены и смолы представляют собой наиболее высокомолекулярные гетероорганические компоненты ШЛ: средний молекулярный вес асфальтенов составляет 1.6 - 5.0 KDa, смол - 0.55 - 1.5 KDa. Основу («каркас») их молекул составляют циклические группировки -ароматические, нафтеновые и гетероциклы (в среднем на молекулу: 4-5 циклов у смол и 6-8 у асфальтенов), а также УВ-цепи (чаще Ci-C4, изредка до C16-C20). Важной чертой молекул асфальтенов и смол является стохастичность их строения и состава. Для молекул асфальтенов характерна большая степень конденсации: 0.2 - 0.4 против 0.45 - 0.58 у смол; наблюдаются также некоторые различия в элементном составе их молекул. Основное различие между этими фракциями состоит в их отношении к растворителям: смолами считаются компоненты, растворимые и в хлороформе, и в низкомолекулярных алканах (до С8 - например, гексан), асфальтенами - растворимые только в хлороформе. Содержание этих фракций в различных шламах колеблется; асфальтены составляют 4-15 % от всех нефтяных углеводородов [Rocha et al, 1997; Габбасов с соавт., 2001]. Смолы и, особенно, асфальтены устойчивы к микробной деградации [Rocha et al., 1997].

1.3 Физическая структура шламов, содержащих углеводороды

Специфической чертой шламов, содержащих углеводороды, является сочетание высокого содержания воды и углеводородов. Это связано с тем, что компоненты шламов образуют стабильные дисперсные системы. Абсолютным большинством авторов данные системы рассматриваются как эмульсии [Абросимов, 2002, Chen, Не, 2003, Lazar et al., 1999, Jean et al, 2001], несмотря на характерное для шламов присутствие минеральных компонентов. В углеводородных шламах роль дисперсной среды может играть как вода (эмульсия типа «нефть в воде»), так и углеводородные компоненты (эмульсия типа «вода в нефти»); возможно сочетание в одном шламе двух типов

эмульсий (когда одновременно присутствует и углеводородная фаза, диспергированная в воде, и наоборот). Углеводородная фаза может играть роль дисперсной среды даже в случае её сравнительно низкого содержания [Lazar et al, 1999]. Данные эмульсии стабилизирует присутствие на границе раздела водной и углеводородной фаз поверхностно-активных компонентов, в роли которых могут выступать мелкодисперсные минеральные компоненты и поверхностно-активные вещества - в том числе, высокомолекулярные соединения нефти [Chen, Не, 2003; Абросимов, 2002].

При описании структуры шламов необходимо также отметить различные межмолекулярные взаимодействия их углеводородных компонентов. Так, в нефтях (и, соответственно, углеводородной фазе шламов) молекулы асфальтенов и, в меньшей степени, смол прочно ассоциированы вследствие организации различного рода взаимодействий [Поконова, 1980]. Наиболее сильное взаимодействие наблюдается между конденсированными ароматическими плоскими структурами [Белоусов с соавт, 1981], поэтому именно они составляют ядро ассоциатов. Эти двумерные слои, взаимодействуя поверхностью плоскостей, ассоциируются в кристаллоподобные образования, стопки [Поконова, 1980]. Основной объём этих стопок сложен, очевидно, наиболее конденсированными соединениями, представленными в шламах - асфальтенами. Высококонденсированные молекулы полиядерных ароматических углеводородов (ПАУ), имеющие плоскую конфигурацию и относительно крупные размеры, также склонны к тесной ассоциации с кристаллоподобными агрегатами молекул асфальтенов. Нафтены (циклоалканы) и ароматические углеводороды находятся в слоях, более близких к ядрам образующихся асоциатов, по сравнению с насыщенными углеводородами.

Высокое содержание гетероатомов в молекулах асфальтенов и смол равнозначно присутствию в их составе значительного количества полярных функциональных группировок. С одной стороны, их взаимодействие между

собой вносит свой вклад в ассоциирование макромолекул [Поконова, 1980]. С другой стороны, смолисто-асфальтены, характеризующиеся крупными размерами молекул, амфифильностью и склонностью к ассоциации (упорядочиванию), являются высокоэффективными ПАВ. Присутствие смолисто-асфальтеновой фракции играет решающую роль в стабилизации водонефтяных эмульсий [Поконова, 1980].

Таким образом, при обычных температурах ШЛ представляют собой дисперсные системы с частицами дисперсной фазы - мицеллами, ядро которых составляют молекулы асфальтенов. Входящие в состав последних полярные функциональные группы (карбонильные, карбоксильные, фенольные и гидроксильные) обращены большей частью внутрь мицеллы и взаимодействуют с заключённой во внутреннее пространство мицелл водой. УВ-цепи молекул асфальтенов обращены наружу [Поконова, 1980].

1.4 Замораживание и оттаивание шламов, содержащих углеводороды

Данный метод широко применяется для обработки нефтешламов, эмульсий и осадков иного происхождения (например, избыточного активного ила) с целью их обезвоживания и снижения их объёма [Chen, Не, 2003; Jean, 2001, Jean et al., 2001]. Суть метода заключается в последовательном воздействии замораживания и оттаивания, за счёт чего происходит частичное обезвоживание масс обрабатываемого шлама. Обезвоживание позволяет снизить объём отхода (за счёт удаления значительной части воды, составляющей до 90% нефтешлама) и упростить дальнейшую обработку шламов [Chen, Не, 2003]. Замораживание и оттаивание хорошо изучено и признано эффективным способом обезвоживания разнообразных осадков [Ormeci, Vesilind, 2001; Lai, 2004; Gao, 2011]. В отношении водо-нефтяных эмульсий эффективность данного способа изучена менее полно, но изучение ведётся и в настоящее время [Yang et al., 2009; Buyukkamaci, Kucukselek, 2007]. Установлено, что замораживание и оттаивание может вызывать

значительное обезвоживание нефтешламов [Chen, Не, 2003; Jean, 2001; Jean et al, 2001].

Эффекты замораживания и оттаивания шламов с точки зрения состояния микрофлоры и/или характеристики условий её жизнедеятельности (изменения химического состава и токсичности водной фазы за счёт перераспределения компонентов загрязнения, изменения физической структуры и иных факторов) практически не исследованы. Единичные публикации затрагивают лишь воздействие замораживания и оттаивания на численность условно-патогенных микроорганизмов или бактерий, являющихся индикаторами фекального загрязнения [Gao et al., 2006]. Показано снижение loglO численности Escherichia coli от 2.6 до 0.92 уже при температуре замораживания минус 5°С [Gao et al., 2006]. Кроме того, замораживание и оттаивание может вызывать гибель ооцист различных паразитов - показано снижение их количества от 0 для Ascaris до 8 и более для Cryptosporidium parvum [Sanin et al., 1994].

В различных работах по исследованию замораживания и оттаивания нефтешламов использованы объекты, значительно отличающиеся по своим характеристикам; значительно варьируют в разных работах и условия их обработки. Данные факторы оказывают значительное влияние не только на эффективность обработки, но может варьировать и механизм обезвоживания.

Так, для нефтешлама типа «нефть в воде» с содержанием УВ 22,9% по массе, воздействие замораживания и оттаивания ускорило обезвоживание при механическом воздействии в 15 раз, что свидетельствует о значительной дестабилизации шламовой эмульсии [Jean et ah, 2001]. Кроме того, при проведении микроскопических исследований было отмечено повышение плотности отдельных частиц и увеличение их размеров, что свидетельствует об агрегации и уплотнении частиц в процессе замерзания нефтешлама. В этом же исследовании показано, что в случае вязких осадков, образующихся в нефтяных резервуарах, практически полностью состоящих из растворимых в

н-гексане УВ, воздействие замораживания-оттаивания не способно изменить их влажность, скорость обезвоживания при механическом воздействии и структуру. Таким образом, данный метод может быть малоэффективен для обезвоживания нефтешламов с низким содержанием воды. Для столь тяжёлых осадков более предпочтителен путь экстракции компонентов, позволяющий извлекать из них полезные продукты, например, топливо.

Установлено также, что замораживание и оттаивание может способствовать частичному обезвоживанию и НШ типа «вода-в-нефти» [Chen, Не, 2003]. В данном исследовании, оценено воздействие на НШ температур замораживания от минус 13 до минус 55°С. Для НШ (эмульсии) с низким содержанием воды (38,7% по массе) эффективность обезвоживания сильно зависела от температуры: максимальная степень обезвоживания (70%) наблюдалась при температуре замораживания минус 40°С, тогда как при температурах минус 55 и минус 13°С наблюдалось лишь обезвоживание на уровне 10%. Для НШ с высоким (77%) содержанием воды эффективность обезвоживания практически не зависела от температуры замораживания, превышая во всём исследованном диапазоне температур уровень 80%. Таким образом, для НШ с высоким содержанием воды эффективное обезвоживание может быть достигнуто при температурах окружающей среды, наблюдаемых в условиях умеренного климата. Использование сезонных низких температур окружающей среды может позволить провести обработку НШ данным методом с минимальной стоимостью.

Аналогичные данные получены и другими авторами [Lin et al., 2007]. Продемонстрировано уменьшение эффективности обезвоживания методом замораживания и оттаивания при снижении содержания воды в НШ (с 96% обезвоживания при содержании воды 65% до 25% при содержании воды 30%).

Представляют интерес данные о уплотнении твёрдой фазы нефтешлама под воздействием замораживания и оттаивания [Jean et al., 2001].

Для почв известно, что механическое циклическое взаимное перемещение почвенных частиц, под воздействием замораживания и оттаивания (а также изменения объёма некоторых минералов под воздействием увлажнения и высыхания и давления корней растений) является главным механизмом образования структуры почв на уровне агрегатов [Шинкарёв с соавт., 2007]. Именно данный уровень структуры почв наиболее важен для её плодородия и организации оптимального водно-воздушного режима [Шеин, Гончаров, 2006]. Уплотнение твёрдой фазы шламов [Jean et al., 2001], сопряжённое с взаимным перемещением уплотнённых областей может способствовать улучшению структуры шламов, содержащих углеводороды, по аналогии с тем как это происходит в почвах [Шинкарёв с соавт., 2007].

Таким образом, воздействие замораживания и оттаивания на шламы вызывает разнообразные эффекты: дестабилизацию шламовой эмульсии, которая способствует разделению шламов на компоненты, их обезвоживанию и уплотнению твёрдой фазы, что может способствовать улучшению структуры шламов с точки зрения их биологического обезвреживания. Кроме того, в некоторых работах продемонстрировано снижение численности условно-патогенных микроорганизмов. Данные эффекты представляют значительный интерес с точки зрения подготовки шламов к биологическому обезвреживанию. Исходное состояние нефтешламов и шламов предприятий органического синтеза в виде вязкой однородной массы, в которой отсутствует поровое пространство [Chen, Не, 2003], ограничивает доступ воздуха в толщу отхода и, таким образом, эффективность его биологического обезвреживания. Ускорение обезвоживания шламов за счёт воздействия замораживания и оттаивания может способствовать их переходу в состояние твёрдого субстрата, которое кардинально улучшает условия в толще шлама с точки зрения деградации загрязнений. Однако, в мировой литературе данные об исследованиях замораживания и оттаивания и последующих процессах естественного самоочищения шламов как способа их подготовки к

биологическому обезвреживанию отсутствуют.

1.5 Токсичность шламов, содержащих углеводороды

Шламы, содержащие углеводороды обладают высоким токсическим потенциалом по отношению к широкому спектру тест-объектов. В основе оказываемого токсического эффекта лежит высокое содержание токсичных компонентов и специфические физико-химические свойства этих отходов.

Органические вещества содержатся в шламах в чрезвычайно высоких (до 60%) концентрациях [Francis, Stehmeyer, 1991]. Значительную их часть составляют углеводороды, обладающие высоким токсическим потенциалом по отношению к широкому спектру организмов [Juvonen et ah, 2000]. Острая токсичность углеводородов демонстрирует тенденцию к увеличению при уменьшении их молекулярной массы [Sikkema et al., 1995]. Среди характерных компонентов шламов к категории наиболее экологически опасных принадлежат полициклические ароматические углеводороды (ПАУ) [Keith, Telliard, 1979]. Вещества, принадлежащие к данному классу соединений, обладают мутагенным и канцерогенным потенциалом. Фракции смол и, особенно, асфальтенов признаны малотоксичными.

В целом, уровень загрязнения шламов чрезвычайно высок, и вклад прямого токсического эффекта компонентов отхода в его общий токсический потенциал можно расценивать как значительный.

С другой стороны, массы шламов, благодаря специфическим физико-химическим свойствам отхода, малопроницаемы для воздуха и воды. Шлам представляет собой вязкую стойкую эмульсию, в углеводородном матриксе которой мелко диспергирована вода [Elektrowicz et al, 2006].

Небольшие её капли заключены в стабильные оболочки из асфальтенов и прочих ПАВ, поэтому водная фаза шламов (вне которой развитие жизнедеятельности в массе отхода невозможно) изолирована от контактов с внешней средой. Микроорганизмы, даже находясь в водной фазе

шлама, оказываются в условиях отсутствия диффузии кислорода, воды и растворённых в ней веществ. В результате этого аэробная метаболическая активность микрофлоры оказывается невозможной; альтернативные кислороду конечные акцепторы электронов присутствуют в шламах в недостаточных количествах и так же, как и кислород, не могут диффундировать извне.

В таких условиях невозможна высокая деградационная активность микрофлоры, без которой невозможно биологическое обезвреживание ШЛ. Более того, в условиях масс шламов микроорганизмы вообще не проявляют активности, благодаря чему характеристики этих отходов за длительные (десятки лет) сроки хранения не претерпевают изменений. Растения также не способны ни прорастать, ни расти в отсутствие доступа воздуха. В результате этого становится затруднительным прямое определение значимости вклада в ингибирование жизнедеятельности микроорганизмов и растений прямой токсичности компонентов шлама и неблагоприятного воздушного и водного режимов. Но, поскольку доступ кислорода является необходимым условием жизнедеятельности микроорганизмов в объёме шлама, главным лимитирующим фактором биологического обезвреживания шламов является аэрация. Именно структурированность признана ключевым условием биоремедиации нефтезагрязнённых объектов [Glaser, Nicado 1988, Vasudavan, Rajaram 2001].

В подавляющем большинстве исследований в области биологического обезвреживания шламов структурирование масс отхода производится путём смешивания их с почвой (ландфарминг) и иными наполнителями (компостирование). При этом за счёт разбавления шламов происходит также снижение его токсичности. Альтернативным, значительно менее затратным способом структурирования шламов является воздействие циклов замораживания-оттаивания [Chen, Не 2003]. При этом поверхностно-активные вещества частично удаляются из границы раздела гидрофильной и

гидрофобной фаз, образуя мицеллы в гидрофобной или водной фазе; при этом, образование мицелл в водной фазе происходит в ходе объединения капель воды. В результате этого уменьшается стабильность во до-нефтяной эмульсии в целом и значительно облегчается отделение воды от массы шламов.

При отделении воды происходит увеличение вязкости отхода, в результате чего он становится способным к образованию стабильной структуры, порового пространства. При активизации микрофлоры в ходе организации структуры и появления аэрации наиболее быстро деградируют низкомолекулярные, обладающие меньшими вязкостью и склонностью к ассоциации компоненты шламов [Dibble, Bartha, 1979], что также способствует структурированию масс отхода.

1.6 Оценка токсичности объектов, содержащих углеводороды

Исследование экологической опасности загрязнений обязательно должно включать в себя не только оценку химического состава загрязнений, но и общую оценку токсичности [Juvonen et al., 2000]. Влияние загрязнения на живые организмы и его экологическая опасность не может быть достоверно оценено только на основе химического анализа его состава. Во-первых, состав загрязнений (особенно органических) зачастую весьма сложно установить ввиду присутствия чрезвычайно большого количества отдельных компонентов. Установление полного состава и концентрации всех его компонентов чрезвычайно сложно и нецелесообразно. Во вторых, суммарное воздействие комплекса загрязнений на живые организмы и экосистемы не представляет собой простой суммы отдельных взаимодействий, но включает в себя также синергические и антагонистические эффекты [Juvonen et al., 2000]. Кроме того, химический анализ подразумевает максимально полное определение концентрации анализируемых компонентов, без учёта их доступности для живых организмов.

В состав нефтяных отходов входят многие экологически опасные компоненты, обладающие токсическим, генотоксическим, мутагенным, а также канцерогенным потенциалом. Эти компоненты, поступая во внешнюю среду в концентрациях, превышающих предельно допустимые и обладая способностью при совместном присутствии усиливать действие друг друга, создают условия среды неадекватные для нормальной жизнедеятельности организма, приводящие к включению дополнительных механизмов адаптации и снижению неспецифической резистентности организма. Приоритетными техногенными загрязнителями являются: 3,4-бенз(а)пирен, инден, бензол, аммиак и диоксид азота, содержание которых в ряде случаев превышает норму более чем в 10 раз. Многие химические вещества, встречающиеся в природных объектах, обладают способностью взаимодействовать с ДНК и вызвать мутации. При этом одни химические вещества изначально являются мутагенами, непосредственно соединяющимися с ДНК, другие -промутагенами, которые для превращения в мутагены сначала претерпевают метаболическую активацию под действием ферментативных систем организма [Propst et al., 1999]. Эти соединения, как правило, передаются по трофическим цепям и накапливаются в опасных концентрациях в окружающей среде.

Для тестирования токсичности нефтезагрязненных объектов, таких как почва или осадки, нужно принимать во внимание взаимодействия между почвой и химическими компонентами, чтобы правильно предсказать их воздействие в окружающей среде. Например, адсорбция катионов на почвенных частицах приводит к значительно большей концентрации токсикантов. Почва может сорбировать и освобождать ионы в зависимости от типа присутствующих минеральных частиц, соотношения органического вещества, pH, окислительно-восстановительного потенциала, уровня влажности. Сорбция органических соединений и металлов в почве увеличивается по мере пребывания загрязнителя в почве. Поэтому

лабораторные эксперименты, в которых время экспозиции, как правило, невелико, могут давать завышенную оценку токсичности [Van Straalen, Van Gestel, 1993]. Это обуславливает необходимость оценки не только острой, но и хронической токсичности нефтесодержащих объектов.

Тесты на токсичность можно классифицировать в соответствии с временем экспозиции (острая или хроническая), по способу воздействия (смертность, ингибирование роста, размножения) или по эффективному ответу (летальный, сублетальный). Выбор метода для проверки токсического действия - наиболее важная стадия для получения достоверных данных. Наиболее адекватным является выбор батареи тестов, включающих организмы различных трофических уровней [Juvonen et ah, 2000].

Тесты на токсичность могут измерять как острое, так и хроническое воздействие. Острая токсичность охватывает только относительно короткий период жизненного цикла тестируемого организма. Например, тесты на рыбах, дафниях, крысах и птицах, длящиеся 24-48 ч, рассматривают как отражающие острую токсичность. Однако одноклеточные организмы с жизненным циклом короче, чем 24 ч могут использоваться для изучения хронической токсичности, если загрязнения препятствуют росту и размножению [Landis, Yu, 1995]. Острый ответ выражается как смертельная концентрация или эффективная концентрация (50% гибель тест-организмов при определенном времени экспозиции или изменение на 50% оцениваемого параметра).

Тесты, выявляющие острую токсичность, используют для анализа токсического потенциала компонентов нефтешлама. К примеру, одним из наиболее опасных компонентов нефтешлама являются вещества, относящиеся к классу ПАУ. Анализы острой токсичности ПАУ, проведенные на водных организмах Mysidopsis bahia, показали, что наибольший отрицательный эффект, обусловленный острым токсическим потенциалом, проявляют низкомолекулярные ПАУ (нафталин, ацетонафтилен) [Barron et al., 1999], чего

нельзя сказать о высокомолекулярных соединениях этого класса.

Тесты на хроническую токсичность используют для оценки долговременных эффектов, не приводящих к смерти. Примерами испытания хронической токсичности могут быть тесты, затрагивающие целый жизненный цикл организма или проявляющиеся на генетическом уровне. Широко известно отрицательное влияние сложных нефтяных поллютантов на иммунную систему млекопитающих [Propst et al, 1999]. При попадании в организм полиароматических соединений (компонентов нефтяного загрязнения) под действием ферментов образуются эпоксисоединения, которые реагируют с гуанином. Это препятствует синтезу ДНК, вызывает нарушения, приводящие к возникновению мутаций, что, несомненно, способствует развитию раковых заболеваний.

Одним из наиболее простых тестов на повреждение ДНК, является тест Эймса с микроорганизмом Salmonella. Испытание является коротким и длится всего 72 ч. Этот тест с успехом применяется для оценки генотоксичности нефтесодержащих отходов, загрязненной почвы, осадков сточных вод. Специфические свойства мутантных штаммов Salmonella typhimurium, заключающиеся в ауксотрофности по гистидину, используются для проверки мутагенности. На среде без гистидина колонии формируются только теми бактериями, которые вернулись к «дикой» форме и могут синтезировать гистидин. Выше указывалось на отсутствие у высокомолекулярных ПАУ острого токсического потенциала, однако, в тестах Эймса показана высокая генотоксичность ряда ПАУ с числом колец более трех. К числу таких полиядерных соединений из четырех и более колец принадлежат бензо(а)пирен и дибенз(а)антрацен, обладающие сильными мутагенными и канцерогенными свойствами. При тестировании же бициклического нафталина, трициклических флуорена, антрацена и фенантрена в классическом тесте Эймса на штаммах Salmonella typhimurium ТА 100, ТА98 и ТА97, как при метаболической активации, так в ее отсутствие, мутагенный

эффект не был выявлен. При изучении метаболизма полициклические аренов -флюорантена, 7,2-диметилбензантрацена и 1 - нитропирена грибами показано, что деструкция исходных соединений сопровождается уменьшением мутагенного действия этилацетатного экстракта на Salmonella typhimurium [Loehr, Webster, 1997]. Тесты измерения токсичности с использованием микроорганизмов являются быстрыми, простыми и недорогими и проводятся на небольшом количестве образцов. Наиболее краткосрочные испытания токсичности основываются на ингибировании действия ферментов бактерий, грибов, водорослей и простейших.

Наиболее часто применяемые микробные тесты могут быть подразделены на следующие категории: тесты с индивидуальными организмами, оценка микробной биомассы, оценка трансформации углерода и азота, ферментные тесты и тесты, определяющие изменения микробного разнообразия. Микробиологические тесты можно выполнить, используя чистую культуру хорошо известного отдельного вида или сообщество микроорганизмов. Воспроизводимость этого теста с единственным видом дает возможность его стандартизации и сопоставимости результатов. Испытания смешанной культуры с естественно встречающимися видами обеспечивают экологически более адекватную информацию относительно вредного действия соединений. Однако изменение в разнообразии популяций может снизить чувствительность теста, например, при измерении совокупной микробной активности. Негативные эффекты, проявляющиеся на некоторых видах, могут быть выгодны для других и могут скрывать токсический ответ. Данные, полученные на основе испытания токсичности, в основном выражаются как оценка эффективной концентрации [Juvonen et al., 2000].

К числу тестов, получивших в настоящее время наибольшее распространение, относится коммерческий тест Microtox. В данном тесте используются лиофильно высушенные клетки биолюминисцентной морской бактерии Vibrio fis chéri (Photobacterium phosphoreum). До последнего времени

тестирование почв и осадков проводилось на основе их водных экстрактов. Однако в последнее время была разработана модификация Microtox (SPT) в твердой фазе - тест, который позволяет частичкам образца вступать в непосредственный контакт с тест-организмами. Преимущество этого теста заключается в быстрой интегральной оценке общей токсичности органических и неорганических загрязнителей без использования водного экстракта образца.

Гетеротрофная бактерия - Pseudomonas putida является обычным обитателем почв и водоемов, и тест с использованием этого вида бактерий удовлетворяет формальным требованиям для оценки токсичности экстрактов загрязненных объектов. Принцип метода состоит в том, что P. putida культивируют в стандартизованных условиях с добавлением тестируемого экстракта в течение времени, соответствующего нескольким циклам клеточного деления. Влияние на рост бактерий, который измеряется фотоколометрически, позволяет судить о наличии или отсутствии токсического действия исследуемого экстракта по отношению к данному представителю гетеротрофных бактерий.

В соответствии со стандартизированной методикой ISO (International Organization for Standardization) 10712 (1995), P. putida культивируют в жидкой синтетической среде, затем культуру разбавляют, смешивая ее с исследуемым раствором (экстрактом). Инкубацию проводят в течение 16 ч при температуре 21°С, в конце опыта проводят фотоколориметрическое измерение плотности бактериальной суспензии. Влияние на рост бактериальной культуры оценивают в серии разведений тестируемого образца в сравнении с контролем. При наличии токсичности ее выражают в ЕС50 , ЕС20 и ЕС 10, в соответствии с процентом ингибирования роста при разведении исследуемого образца. Необходимо учитывать, что данный бактериальный тест не всегда выявляет общую токсичность образца из-за специфической устойчивости данного и многих других видов бактерий к нефтехимическому загрязнению.

Тесты с низшими ракообразными, относящимися к отряду ветвистоусых - дафниями и цериодафниями, являются наиболее широко используемыми во многих странах. Эти тесты рекомендованы для исследовательской оценки токсичности индивидуальных соединений, природных сред (воды, донных отложений, почвы). Причиной широкого использования ветвистоусых рачков является то, что они повсеместно распространены в водной среде, являются обязательным трофическим звеном многих пищевых цепей, имеют короткий жизненный цикл, относительно легко культивируются в лаборатории и чувствительны к широкому спектру токсичных соединений. Для определения токсичности в острых и хронических опытах используются Daphnia magna и Daphnia pulex. Виды, относящиеся к роду Ceriodaphnia, предпочтительно применяются для определения хронической токсичности. Тесты с использованием дафний и цериодафний во многих странах, в частности в России, стандартизированы.

Методика определения токсичности на Daphnia magna является одной из доступных и широко используемых процедур тестирования водорастворимых компонентов. Этот тест может быть использован для определения острого и хронического эффекта водного экстракта нефтезагрязненных осадков и почв. Стандартные методики определения токсичности с использованием дафний описаны в ISO (ISO 10706, ISO 6341). Они основаны на определении смертности и изменений в плодовитости дафний при воздействии токсических веществ.

Широко распространён анализ токсичности с использованием инфузории-туфельки Paramecium caudatum [Miyoshi et al., 2003]. Инфузории являются типичными обитателями почв, входят в состав активного ила, а также присутствуют в загрязненных поверхностных водах. Более того, простейшие, занимая промежуточный структурно-функциональный уровень между прокариотами и многоклеточными организмами, представляют собой удобный инструмент для исследований, поскольку сочетают в себе черты

сильно усложненной в процессе эволюции клетки и самостоятельного организма. Сравнительный анализ биотестов различных трофических уровней показывает, что инфузории занимают одно из первых мест по чувствительности и демонстрируют хорошую корреляцию с результатами, полученными на многоклеточных организмах.

P. caudatum - высокочувствительный тест-объект, реагирующий на низкие концентрации токсикантов. Реакцию на токсический стресс оценивают на клеточном уровне. Метод определения острой летальной токсичности по выживаемости инфузорий основан на установлении количества погибших или обездвиженных особей после экспозиции в условиях тестирования. Тестирование нефтезагрязненных осадков и почв заключается в анализе водного экстракта. Продемонстрировано влияние загрязнения на морфологию, поведение и время генерации P.caudatum [Rao et al., 2003].

Высшие растения составляют наиболее важный компонент мировой экосистемы из-за их уникальной способности преобразовывать энергию солнечного света в химическую энергию, при поглощении углекислого газа и выделении кислорода. Чувствительность различных видов растений к химикатам значительно варьирует. Растения, чувствительные к вредным веществам, могут быть использованы как биоиндикаторы, тогда как более стойкие растения полезны в биоремедиации. Фитотоксичность может определяться по прорастанию семян, росту корней и проростков. Тестирование на растениях должно включать, по крайней мере, один вид однодольных и один вид двудольных растений.

В настоящее время в качестве стандарта международной организацией стандартизации рекомендованы два метода определения фитотоксичности ISO 11269-1 (1993), ISO 11269-2 (1995). Первый основан на учете ингибирования роста корней растений в присутствие токсиканта. В качестве тест-культуры применяется ячмень (Hordeum vulgare L.). Во втором методе уровень фитотоксического действия оценивается по ингибированию всхожести и роста

высших растений. Рост растений учитывается по биомассе надземных побегов. Спектр тест-объектов, включенных в данный международный стандарт, более широкий - рожь (Secale cereale L.), рейграсс (Lolium perenne L.), рис (Oryza sativa L.) и другие.

В последнее время все больше распространение получает подход, предполагающий для определения токсичности использование системы тест-объектов или так называемой батареи тестов, включающей организмы различного эволюционного и трофического уровня. Предпочтение отдается организмам, обладающим высокой чувствительностью, простотой и быстротой получения результата, экологической значимостью [Juvonen et al., 2003]

Для характеристики состояния почв, а также других экосистем наибольшую важность представляет правильный выбор критерия, который адекватно отражал бы изменения микробного сообщества в результате климатических или антропогенных воздействий. Полная минерализация углеводородов осуществляется в почве в результате воздействия комплекса почвенных микроорганизмов. При выявлении самоочищающей способности нефтезагрязненных почв необходимо учитывать такой показатель, который в наибольшей мере характеризовал бы минерализационную активность почв и других экосистем. Этим показателем является интенсивность выделения С02 в качестве интегрального показателя активности микробиологических процессов. Дыхательная активность является одним из наиболее легко определяемых микробных параметров для оценки состояния почвенного образца.

Дыхательная активность отражает как степень деградации нефтяных углеводородов в процессе биоремедиации, так и влияние тяжелых металлов, токсических соединений, рН на активность почвенных микроорганизмов [Balba et al., 1998]. К тому же, дыхательная активность используется для

оценки экотоксичеекого состояния загрязненных почв. В последнее время многие авторы предлагают использовать для этих целей скорость базального дыхания (V basal) почв и субстрат-индуцированного дыхания - (V SIR -Substrate-indused respiration). Величина V basal показывает степень доступности имеющегося в образце органического вещества для почвенной биоты, а V SIR - окисление экзогенного субстрата, чаще всего глюкозы. Для характеристики состояния экосистемы также используют величину коэффициента микробного дыхания (QR), представляющего собой отношение скорости базального дыхания микроорганизмов к величине субстрат-индуцированного дыхания микробной биомассы.

Базальное дыхание является одной из важнейших биохимических характеристик почвы. Считается, что базальное дыхание, с одной стороны, отражает количество доступного углерода для поддержания

жизнедеятельности организмов, а с другой, является мерой скорости оборачиваемости углерода в почве .

Изменение влажности влияет на величину дыхательной активности микробного сообщества различных почв неодинаково. В большинстве случаев повышение влажности до определённого предела приводило к более интенсивной эмиссии С02 из почвы. Интервал оптимальной влажности для определения дыхательной активности составляет 55-65% от полной полевой влажности, причем как недостаток влаги, так и переувлажнение существенно снижают интенсивность дыхательной активности почвы.

В загрязненных нефтью почвах, в зависимости от состава нефти, её концентрации и свойств исходной почвы, интенсивность микробного дыхания может увеличиваться, что указывает на повышение численности микрофлоры, или же может снижаться, что означает интоксикацию микробного сообщества почвы. Ранее была выявлена корреляция между коэффициентом базального, субстрат-индуцированного дыхания и концентрацией ПАУ в загрязненных

участках в процессе биоремедиации. Подтверждена зависимость между концентрацией углеводородов и дыхательной активностью. Снижение дыхательной активности на поздних этапах биоремедиации свидетельствует об истощении легко доступных фракций органических соединений.

1.7 Микрофлора шламов, содержащих углеводороды

Несмотря на высокий уровень токсичности и загрязнения шламов, содержащих углеводороды, в них зачастую обнаруживается высокая численность жизнеспособных микроорганизмов [МкШпа аХ а\., 2003; Иаитоуа а1., 2009; 11гигаЬу et а1., 1998]. Основной источник происхождения микрофлоры шламов, образующихся в ходе первичной очистки сточных вод -система сбора сточных вод и их первичной очистки, которые непосредственно сопряжены с образованием шламов [Абросимов, 2002]. В массы шламов может также попадать избыточно активный ил из вторичных отстойников и микрофлора из установок для локальной очистки производственных сточных вод [МкШпа е! а1., 2003]. Характерным свойством микроорганизмов, населяющих углеводород-содержащие шламы, является способность к деградации широкого круга ксенобиотиков и устойчивость к различного рода стрессовым воздействиям [№кйша ег а1., 2003]. Продемонстрирован высокий биотехнологический потенциал микроорганизмов, выделенных из нефтешлама, за счёт способности к деградации широкого круга ксенобиотиков, азотфиксации и поддержания роста растений [№аитоуа е1 а1., 2009].

Микроорганизмы способны оказывать непосредственное воздействие на углеводородное загрязнение за счёт деструкции его компонентов. Углеводородокисляющие микроорганизмы повсеместно распространены в природе, однако активности микрофлоры, изначально населяющей загрязнённый объект, зачастую бывает недостаточно для его восстановления

[Van Hamme et al., 2003]. Внесение активных культур микроорганизмов в некоторых случаях позволяет достичь эффективной деградации углеводородов. Для почв с содержанием углеводородов (дизельного топлива) 2,8 и 3,3 г/кг внесение культуры активных микроорганизмов позволило достичь в обоих случаях наиболее быстрой деградации углеводородов, по сравнению с естественным самовосстановлением почв и внесением удобрений [Bento et al, 2005]. Использованные микроорганизмы были ранее выделены из почвы с 2,8 г/кг загрязнения нефтью, молекулярно-генетический анализ позволил установить видовой состав сообщества: Bacillus cereus, Bacillus sphaericus, Bacillus fosiformis, Bacillus pumilus, Acinetobacter junii и Pseudomonas sp.. Приспособление сообщества микроорганизмов к низкому уровню нефтяного загрязнения включает, помимо прочего, неоднократно отмеченное увеличение доли микроорганизмов, способных к деструкции углеводородов [Song, Bartha, 1990; Margesin et al., 2003; Nkwelang et al., 2008].

Вклад микроорганизмов в поддержание роста растений может быть прямым и опосредованным. При прямом воздействии бактерии влияют на удлинение корней и развитие проростков через выделение гормонов, способствующих росту растений, таких как гиббереллины и индолил-уксусная кислота. Опосредованные воздействия основаны на действии таких вторичных продуктов метаболизма, как антибиотики и цианиды, которые активизируют рост растений через угнетение патогенной микрофлоры [Kennedy, Islam, 2001]. Положительное воздействие PGPR на.растение возможно только при условии успешной колонизации бактериями ризосферы и филлосферы. Способность бактерий к колонизации ризосферы определяется большим числом генов, некоторые из которых идентифицированы [Воронин, Кочетков, 2000; Hugenholtz, Расе, 1996].

Стимуляция роста растений ризосферными микроорганизмами осуществляется при участии прямых механизмов (синтез фитогормонов,

фиксация молекулярного азота, повышение доступности для растений макро-и микроэлементов), а также опосредованных взаимодействий (защита растений от фитопатогенных микроорганизмов, иначе называемая «биоконтролем фитопатогенов»). Помимо этого, можно выделить специфическую функцию PGPR, связанную с повышением устойчивости растений к действию химических поллютантов. Бактерии могут участвовать в реализации как одного, так и нескольких механизмов.

1.8 Биологические методы переработки шламов, содержащих углеводороды

Совокупность методов биологического обезвреживания загрязнённых объектов обозначается термином «биоремедиация». В настоящее время биологическое обезвреживание загрязнённых объектов интенсивно изучается. Биоремедиация является эффективной, экономически доступной и достаточно универсальной альтернативой традиционным физико-химическим методам обработки [Xu, Lu 2003, Van Hamme, 2003]. Данный подход может быть разделён на два крупных направления: «in situ» (то есть «на месте») и «ex situ» (то есть с извлечением загрязнённого объекта).

Биоремедиацией in situ называется биологическое обезвреживание загрязнённого объекта без его предварительного извлечения. Биоремедиация в данном случае основана на возможностях аборигенной микрофлоры, которая адаптирована к условиям загрязненного объекта и способна утилизировать некоторые или все его компоненты [Van Hamme, 2003]. Степень микробной деградации загрязнений лимитируется рядом факторов: питательные вещества, акцепторы электронов, доступность кислорода, биогенные элементы, а также определяется токсикологическими и физическими свойствами загрязненного объекта. Существуют различные способы стимуляции биоремедиации in situ: биоаугментация (внесение активных

микроорганизмов), внесение органических и неорганических удобрений, добавление ПАВ и разрыхляющих агентов, фиторемедиация (культивирование растений) [Kirk et al., 1997]. Технологии ремедиации in situ гораздо экономичнее по сравнению с остальными подходами, связанными с извлечением загрязненного объекта, и целесообразны для обработки больших площадей с невысоким уровнем загрязнения [Siciliano, 1999].

Методы биоремедиации «ex situ» подразумевают извлечение загрязнённого объекта перед проведением его обезвреживания. Основные методы биоремедиации «ех situ»:

- компостирование - метод, основанный на смешивании загрязнённого объекта с органическими субстратами;

- landfarming и landspreading - методы, основанные на трансформации загрязнений почвенной микрофлорой (словосочетание «запахивание и рекультивация» является наиболее адекватным аналогом данных терминов в русскоязычной терминологии, сложившейся в данной области; транскрибированные термины «лэндфарминг» и «лендспрединг» фактически не применяются);

- обезвреживание в биореакторах - метод, в котором с помощью специальных устройств (биореакторов) создаются благоприятные условия для трансформации загрязнений за счёт контроля над тем или иным количеством параметров, определяющих условия деградации (концентрация питательных веществ, кислорода и других)..

Разделение биоремедиации на различные методы зачастую достаточно условно ввиду использования одних и тех же приёмов в различных методах и их повсеместной комбинации (например, при компостировании загрязнённый объект зачастую смешивают и с почвой, как в ходе рекультивации, в ходе запахивания и последующей рекультивации применяют фиторемедиацию и так далее). Кроме того, существуют универсальные способы стимуляции

трансформации загрязнений за счёт активности живых организмов, которые часто применяют во всех методах биоремедиации. Это внесение удобрений, организация доступа кислорода (за счёт перемешивания, искусственной подачи воздуха и иных приёмов), внесение поверхностно-активных веществ, наполнителей и активных микроорганизмов и другие.

1.9 Подготовка шламов к биологическому обезвреживанию

Данные мировой литературы свидетельствуют, что обезвреживание шламов предприятий органического синтеза и нефтешламов с применением биологических методов является выполнимой задачей, несмотря на чрезвычайно высокий высокий уровень загрязнения и токсичности отходов этого типа [Никитина с соавт., 2006; Ouyang et al., 2005; Prado-Jatar et al., 1993; Machín-Ramírez et al, 2008; Huang et al., 2005]. Дополнительными ограничениями в случае биологической ремедиации являются большая длительность биологической деградации значительного количества ксенобиотиков и неблагоприятные физико-химические свойства шламовых масс, обуславливающие отсутствие доступа кислорода в их толщу: в исходном состоянии типичные шламы представляют собой вязкую однородную массу, в объёме которой отсутствуют поры. Угнетение живых организмов ввиду неблагоприятных условий в толще шламов приводит к их низкой активности, в то время как для биологического обезвреживания загрязнения шлама необходима высокая активность процессов деструкции (соответствующая уровню загрязнения).

Данные обстоятельства диктуют необходимость предварительной подготовки шламов к биологическому обезвреживанию. И в абсолютном большинстве исследований по биологическому обезвреживанию шламов, содержащих углеводороды, проводится предварительная подготовка шламов, основанная на его разбавлении за счёт смешивания с водой (при

обезвреживании в биореакторах), почвой и иными наполнителями (в рамках компостирования, метода «landfarming»). Разбавление позволяет многократно снизить токсичность компонентов шламов, что способствует биологическому обезвреживанию данного отхода. Однако при этом увеличивается объём обрабатываемого шламов, что предъявляет повышенные требования к качеству его обезвреживания; неэффективное обезвреживание приведёт к образованию значительного объёма загрязнённого продукта. Кроме того, применение разбавления дополнительно увеличивает стоимость обезвреживания.

Альтернативная технология подготовки шламов к биологическому обезвреживанию может быть создана на основе процессов их самоочищения, ускоренных в контролируемых условиях обработки. При хранении шламов в накопителях верхний слой отхода постепенно трансформируется под действием замораживания и оттаивания, выветривания, активизирующейся микрофлоры [Якушева с соавт., 2002]. Однако, данные изменения затрагивают лишь верхний слой отхода и кроме того протекают замедленно ввиду недостатка соединений азота, высыхания шлама в летний период и его периодического переувлажнения или полного укрытия водой. Таким образом, активная микробная деградация загрязнения может происходить лишь в короткие периоды между осадками. Осуществление процесса в контролируемых условиях может значительно повысить эффективность процесса снижения уровня загрязнения и токсичности шламов за счёт неоднократно продемонстрированного значительного повышения микробной активности в условиях повышения аэрации при вспашке и размещении отхода тонким слоем, внесении удобрений и организации равномерного полива [Van Hamme, 2003; Dibble, Bartha, 1979].

1.10 Фиторемедиация объектов, загрязнённых углеводородами

Фиторемедиация - технология восстановления загрязнённых объектов окружающей среды, в рамках которой выращивание растений-фитомелиорантов на загрязнённом субстрате ускоряет его обезвреживание. В настоящее время данная технология широко распространена, что обусловлено её достоинствами [Huang et al., 2004]:

- экологичность, сохранение естественных качеств почвы;

- низкие затраты энергии;

- низкая стоимость при сравнительно высокой эффективности.

В рамках фиторемедиации объектов, загрязнённых органическими поллютантами, выделяют две основные стратегии воздействия на ксенобиотики: непосредственная фиторемедиация и фиторемедиация ex planta [Cunningham et aL, 1995; Salt et al., 1998]. Вторая стратегия основана на выделении растениями корневых эксудатов, которые поддерживают рост и метаболическую активность ризосферного сообщества [Anderson et al., 1994]. Некоторые органические компоненты корневых выделений (например, фенолы, органические кислоты, спирты, белки) могут выступать как источник углерода и азота для роста и длительного выживания микроорганизмов, способных к деградации ксенобиотиков. Численность ризосферной микрофлоры может на два-четыре порядка превышать таковую в окружающем объёме почвы и также демонстрировать большие метаболические возможности [Anderson et al., 1994; Walton et al., 1994]. Химический состав корневых выделений и их количество существено отличаются у различных растений, что оказывает влияние на процесс фиторемедиации [Salt et al., 1998]. Так, присутствие некоторых видов растений, корневые выделения которых обогащены фенолами, способствует поддержанию популяции бактерий, способных к деградации полихлорированных бифенилов [Fletcher and Hedge, 1995; Salt et al., 1998]. Данный эффект положительно сказывается

на их ризосферной микрофлоре в случае фиторемедиации ПХБ-загрязнённых объектов. Так, Fletcher и Hedge (1995) провели скрининг среди 17 различных видов растений на предмет их способности к выделению фенолов, которые могли бы стимулировать жизнедеятельность ПХБ-деградирующих бактерий и обнаружили, что шелковица (Morus rubra L.) обладает набором достоинств, которые делают её крайне привлекательным растением-фитомелиорантом. Ризосферные микроорганизмы могут также ускорять процессы ремедиации путём испарения органических компонентов, таких, как ПАУ или увеличения образования гуминовых веществ из молекул ксенобиотиков [Cunningham et al., 1996; Dec and Bollag, 1994].

При выращивании на загрязнённых субстратах растения могут также непосредственно воздействовать на ксенобиотики. В дополнение к секреции органических компонентов, которые подерживают рост и активность ризосферных микроорганизмов, растения могут также выделять в почву и воду пул ферментов, которые также могут участвовать в деградации оррганических контаминантов [Salt et al, 1998]. Встречающиеся в почве ферменты растительного происхождения представлены лакказами, дегалогеназами, нитроредуктазами, нитролазами и пероксидазами [Boyajian and Carreira, 1997; Schnoor et al., 1995]. Полевые эксперименты с выделяемыми растениями нитроредекутазами и лакказами продемонстрировали деградацию осадков, загрязнённых тринитротолуолом и триаминотолуолом, соответственно. Аналогичные даные были получены для нитрилаз и дегалогеназ, деградирующих 4-хлоробензонитрит и гексахлороэтан [Wenzel et al., 1999]. Деградация самих ферментов, выделенных в почву или осадки не полностью изучена, но определённые экспериментально периоды их 50%го снижения активности показывают, что они могут участвовать в деградации ксенобиотиков в течение нескольких суток после выделения растением [Schnoor et al., 1995]. Ферменты,

выделяемые растением в почву и участвующие в деградации молекул распространённых ксенобиотиков, могут быть использованы для разработки новых стратегий фиторемедиации [Salt et al., 1998].

Другим путём непосредственного воздействия растений на ксенобиотики является фитоэкстракция - извлечение загрязнителей из почвы в растительную биомассу. Данное явление крайне широко используется для удаления из почв металлов, но воздействие данного механизма на органические ксенобитики ограничено их доступностью в почве и самим механизмом поступления поллютантов в растения [Salt et al., 1998]. Поступление органических компонентов в биомассу растений происходит в основном с током почвенного раствора, как это продемонстрировано для пестицидов [Paterson et al, 1990; Topp et al., 1986].

Основными факторами, влияющими на фитоэкстракцию ксенобиотиков, являются физико-химические характеристики этих компонентов, например коэффициент октанол-вода и кислотность, а также их концентрация [Wenzel et al, 1999]. Органические поллютанты могут поступать в биомассу растений в том случае, если их молекулы гидрофильны или умеренно гидрофобны (значения коэффициента октанол-вода от 0.5 до 3 [Ryan et al., 1988; Wenzel et al., 1999]. В дополнение к факторам, которые изменяют доступность ксенобиотиков для фитоэкстракции, иногда проявляется несоответствие между поступлением ксенобиотиков в растительную биомассу и их накоплением, как это показано для нитро.бензола [MacFarlane et al, 1990] и атразина [Anderson and Walton, 1995; Burken and Schnoor, 1996]. Одной из возможных причин этого являются экспериментально показанные различия в уровне транспирации поллютантов растениями [Burken and Schnoor, 1996].

Таким образом, доступность органических ксенобиотиков в почвах может быть основным механизмом, ограничивающим их эффективность их

фиторемедиации [Cunningham et al., 1996; Schnoor et al., 1995; Sait et al., 1998]. Изменение состояния почв стало прорывом в разработке методов «индуцируемой» (в противовес естественной) фиторемедиации. Однако, возможности данного механизма испытаны в полевых условиях только для металлов. Тем не менее, было показано увеличение смачиваемости и бактериальной деградации органических ксенобиотиков при использовании синтетических (triton Х-100) и натуральных поверхностно-активных веществ [Bragg et al., 1994; Desai and Banat, 1997; Providenti et al., 1995; Van Dyke et al, 1993]. Было также продемонстрировано увеличение растворимости органических ксенобиотиков и металлов в присутствии циклодекстринов. Потенциальная способность сурфактантов и циклодекстринов увеличивать растворимость металлов и иных ксенобиотиков може быть использована при фиторемедиации почв со смешанным загрязнением.

Возможность использования растений для экстракции тех или иных органических ксенобиотиков определяется также судьбой метаболитов [Wenzel et al., 1999]. Распределение поллютантов между корнями и окружающим грунтом существенно варьирует в зависимости от их химического строения. После поступления в корневую систему ксенобиотики могут либо перемещаться в другие органы растения и впоследствии испаряться, частично или полностью деградировать [Goel et al., 1997; Schnoor et al, 1995] или трансформироваться в менее токсичные вещества и в такой .форме накапливаться в растении. Возможно накопление ксенобиотиков в нерастворимых клеточных структурах, например, лигнине, после их частичной трансформации в клетках растений [Sait et al., 1998]. Некоторые поллютанты могут быть полностью минерализованы растениями до воды и С02, но доля таких ксенобиотиков невелика. С этой точки зрения растения менее пригодны для проведения биологического обезвреживания загрязнённых объектов, по сравнению с микроорганизмами. Кроме того,

растительные метаболиты поллютантов, которые могут быть более токсичны, чем исходные вещества, могут оказывать негативное влияние на почву как среду для ремедиации.

Рядом авторов продемонстрирован фитотоксический эффект различных нефтяных углеводородов при загрязнении ими почвы, связанный как с изменением физических свойств почвы (доступность воды и питательных веществ), так и с физиологическими особенностями растений [Kirk et al, 2005]. Показано, что чувствительность к углеводородам у различных растений варьирует в широких пределах [Adam, Duncan, 2002]. В связи с этим, для процесса фиторемедиации нефтезагрязненного объекта необходимо подобрать растения, которые были бы способны к росту и длительной вегетации на нем.

Устойчивость растений к воздействию различных ксенобиотиков видоспецифична и может отличаться у представителей одного семейства. Различия в чувствительности к загрязнителю могут наблюдаться и между подвидами [Adam, Duncan, 2002]. В зависимости от подвида клевера, процент его прорастания в почве, загрязненной дизельным топливом в концентрации 50 г/кг колеблется в диапазоне 18-71% [Adam, Duncan, 2002]. Считается также, что толерантность к токсическим воздействиям отличается у представителей различных семейств. Так, представители семейства бобовых менее устойчивы, чем злаковые растения. Данный эффект проявляется не только в отношении острой токсичности. Так, одним из важных преимуществ бобовых растений с точки зрения их использования в качестве растений-фитомелиорантов - способность к образованию симбиотических связей с азотфиксирующими микроорганизмами. Недостаток соединений азота часто лимитирует процессы деградации ксенобиотиков (в том числе, углеводородов, Dibble, Bartha, 1979]. Поэтому поступление соединений азота за счёт его фиксации при использовании в качестве фитомелиорантов бобовых растений

Г РОССИЙСКАЯ

ГОСУДАРСТВЕННАЯ

I БИБЛИОТЕКА ;______________

могло бы способствовать обезвреживанию загрязнённых объектов. Однако, в условиях токсического воздействия ксенобиотиков способность бобовых к образованию клубеньков снижается, как это было продемонстрировано для почв, загрязнённых дизельным топливом [Adam, Duncan, 2003]. Преимущества использования тех или иных растений при фиторемедиации не ограничиваются их токсикорезистнтностью. Так, по мнению некоторых исследователей, злаковые растения имеют более высокий фиторемедиационный потенциал при сравнении с растениями из других семейств, благодаря более обширной и выраженной фиброзной корневой системе, которая имеет большую поверхность ризопланы для воздействия на микробные популяции [Aprill,Sims,1990; Banks et al.,1999].

Видоспецифичная устойчивость растений к воздействию различных ксенобиотиков обуславливает необходимость подбора растений-фитомелиорантов для каждого загрязнённого объекта. Степень деградации загрязнителя в процессе фиторемедиации, как правило, напрямую зависит от состояния растения - мелиоранта [Huang et al., 2005], поэтому применение при фиторемедиации наиболее устойчивых растений повышает эффективность процесса. При подборе растения - фитомелиоранта следует учитывать, кроме природы ксенобиотиков, климатические особенности региона и иные особенности загрязнённых экосистем. Дикорастущие растения, спонтанно заселяющие загрязнённые объекты, могут быть потенциально перспективными фитомелиорантами, поскольку они заведомо приспособлены к условиям восстанавливаемой экосистемы.

1.11 Факторы, определяющие эффективность биологического обезвреживания углеводородного загрязнения

Абсолютное большинство исследований биологической деградации УВ различными методами проводится при комнатной температуре окружающей

среды [Van Hamme; 2003]. Исключением являются процессы компостирования, в которых из-за интенсивной жизнедеятельности микроорганизмов происходит, как правило, разогрев обрабатываемой смеси (например, при исследовании деградации загрязнений в почве, содержащей застарелое загрязнение дизельным топливом, в смеси с опилками при постоянной аэрации происходил разогрев смеси до 30-40°С [Godoy-Faundez et al., 2008]. Отмечено повышение эффективности микробной деградации ПАУ при постепенном повышении температуры в ходе обработки почвы, загрязнённой каменным углем. Отмечено также, что для эффективной деградации нефтяных загрязнений необходима температура не менее 20° С [Van Hamme, 2003]. Однако контроль за температурой технически несложно осуществить лишь при обработке нефтесодержащих объектов методами компостирования и с использованием биореакторов. В иных случаях (например, при обработке нефтесодержащих объектов вне помещений, на открытом воздухе) биоремедиация проводится без контроля температуры. С одной стороны, это в какой-то мере снижает эффективность обработки (например, процесс может длиться более одного сезона), но значительно упрощает технологию и удешевляет обработку.

Оптимальный уровень содержания воды (влажности) в каждом конкретном случае обработки зависит от множества факторов, прежде всего -от структуры почвы и уровня загрязнений. Поддержание уровня влажности строго в районе оптимума не является необходимым, так как экспериментально показано, что при изменении влажности в достаточно широких пределах (30-90% от водоудерживающей способности почвы) уровень деградации загрязнений может оставаться близким к максимальному [Dibble, Bartha, 1979]. Кроме того, поддержание влажности в узких пределах -технически весьма сложная задача. В абсолютном большинстве исследований по обезвреживанию нефтезагрязнённых объектов методами фиторемедиации

и биоаугментации влажности придаётся второстепенное значение и её поддержание путём периодического внесения определённых количеств воды без контроля влажности [Liste, Prutz, 2006]. В различных работах, в которых в ходе процесса осуществлялся контроль влажности, рекомендуются уровни содержания воды 50%, 50-60%, 30-90% от водоудерживающей способности [Rhykerd et al., 1995]. Данные уровни могут быть откорректированы применительно к конкретному объекту обезвреживания по определению уровня влажности, оптимального для микробного дыхания и приемлемого для роста растений. Иные параметры среды, - например, давление, при проведении биологического обезвреживания не отслеживаются. Колебания атмосферного давления слабо отражаются на жизнедеятельности микроорганизмов и, соответственно, эффективности биоремедиации [Van Hamme, 2003].

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Общая характеристика объектов исследования

В данной работе в качестве основного объекта использовали твёрдый промышленный отход (шлам) предприятия ОАО «Казаньоргсинтез» (Россия, Республика Татарстан, г. Казань). Кроме того, в ряде начальных экспериментов был использован шлам ОАО «Нижнекамскнефтехим» (Россия, Республика Татарстан, г. Нижнекамск). Предприятие ОАО "Казаньоргсинтез" - одно из крупнейших в Европе предприятий органического синтеза. В качестве основного сырья на предприятии используется природный газ. Поэтому применение к шламу данного предприятия термина «нефтешлам» некорректно. Предприятие ОАО "Нижнекамскнефтехим" -нефтеперерабатывающее, и шлам данного предприятия является типичным нефтешламом, представителем наиболее изученной группы шламов, содержащих углеводороды. Выбор данных двух отходов в качестве объектов исследования обусловлен, сходством их свойств - прежде всего, высокого уровня углеводородного загрязнения и токсичности. Кроме того, рассматриваемые отходы образуются сходным путём, при очистке сточных вод, содержащих углеводороды. Данные шламы, равно как и другие шламы, образующиеся при первичной очистке стоков, представляют собой смесь компонентов, отделившихся от объёма стоков (то есть осевших, или всплывших) в ходе их отстаивания, смешанных с остатками воды. Данный путь образования предопределяет наличие в их составе трёх основных компонентов - воды, углеводородов и иных органических веществ, а также механических примесей, включающих в себя минеральные остатки, соли, продукты коррозии и тому подобное. Кроме того, в шламонакопители зачастую сбрасываются иные отходы, как-то избыточный активный ил,

смоляные остатки и прочее. Подобный путь образования предопределяет чрезвычайную сложность и неопределённость состава органических компонентов шламов.

Шлам ОАО "Нижнекамскнефтехим" характеризуется значительно более высоким, по сравнению с шламом ОАО "Казаньоргсинтез", уровнем загрязнения, и выбор двух данных отходов с разным уровнем загрязнения представляет интерес с точки зрения оценки широты выявляемых закономерностей - в том числе, широты их применимости в перспективе, то есть в рамках технологий переработки других шламов.

2.2 Отбор и подготовка проб

Поскольку при хранении в накопителях шлам приобретает неоднородную структуру - в частности, разделяется на горизонты, обладающие различными свойствами, особое внимание было уделено репрезентативности проб отходов. В лабораторных экспериментах использовали усредненный шлам; при отборе проб в равной степени захватывали все горизонты накопленных масс отхода с помощью специального пробоотборника, позволяющего извлечь керны ненарушенного строения с любого горизонта шлама глубиной до 1,4 м. Отбор проб проводили из 12 точек шламонакопителя №41 «А» ОАО "Казаньоргсинтез" (глубина отбора 0.3 - 1.2 м), и из 3 точек шламонакопителя №39 ОАО "Нижнекамскнефтехим" (глубина отбора 0.3 - 1.4 м). Отбор был проведён из горизонта шлама, визуально не подверженного влиянию выветривания. Оба шламонакопителя действовали на момент отбора проб (то есть в них регулярно сбрасывался образовавшийся на предприятии шлам). Отбор проб шлама соответствует требованиям ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб» и ГОСТ 17.4.4.02-84 «Охрана природы. Почвы. Методы отбора и подготовки проб для химического, бактериологического, гельминтологического анализа».

Пробы шламов в исходном состоянии характеризовали с точки зрения их влажности, токсических свойств. Параллельно часть проб высушивали в вытяжном шкафу, измельчали в фарфоровой ступке, отбирали вручную посторонние включения, проводили дополнительное измельчение в агатовой ступке. Подготовленные таким образом пробы характеризовали с точки зрения химического состава. Для экспериментов с определением микробиологических характеристик шлама были асептически отобраны дополнительные пробы шлама.

2.3 Лабораторные эксперименты

2.3.1 Лабораторный эксперимент по оценке воздействия замораживания и оттаивания на скорость обезвоживания шламов при центрифугировании

Для характеристики дестабилизации шламовой эмульсии под воздействием замораживания и оттаивания был предпринят эксперимент, в котором оценивалась скорость разделения шламов ОАО "Казаньоргсинтез" и ОАО "Нижнекамскнефтехим" на водную фазу и осадок при центрифугировании до и после воздействия замораживания и оттаивания. Данный метод оценки скорости разделения на водную фазу и осадок используется для характеристики стабильности водо-нефтяных эмульсий [Lin et al, 2007].

Усреднённые пробы шлама закладывались в центрифужные пробирки, масса проб (30-35 г в каждой пробирке) оценивалась по изменению массы пробирок. Поскольку под воздействием замораживания и оттаивания шлам начинает расслаиваться и необходимо избегать его перемешивания, замораживание и оттаивание проводили непосредственно в центрифужных стаканах при минус 14 °С в течение 12 часов. Оттаивание проводили при комнатной температуре 23-25 °С в течение 12 часов. Для предотвращения

изменения влажности и токсичности за счёт потерь воды и углеводородов стаканы герметично закрывали. Центрифугирование проводили при 350(^. Через заданные промежутки времени сливали отделившуюся воду, остатки воды отбирали автоматической пипеткой. Взвешиванием центрифужного стакана и сравнением полученных значений с исходной массой определяли массу отделившейся воды. Вместе с водой отделялись углеводороды в виде плёнки на поверхности воды. Однако суммарный их объём (на конец эксперимента) составил не более 1 % от первоначального объёма образцов, поэтому поправка к массе отделяемой воды за счёт массы углеводородной плёнки не учитывалась. Все варианты эксперимента проводили в четырёх повторностях, р=0.05 принимали за достоверный уровень значимости.

2.3.2 Лабораторный эксперимент по оценке воздействия замораживания и оттаивания на обезвоживание шламов в условиях высушивания

Часть усреднённых проб отходов отбирали в герметично закрытые пластиковые контейнеры, замораживали при температуре минус 14 °С в течение 12 часов и оттаивали при комнатной температуре (23-25°С) в течение 12 часов. После оттаивания пробы дополнительно перемешивали непосредственно перед закладкой опытных вариантов. Для размещения шлама по первому варианту с толщиной слоя отхода 1 см шлам помещали в предварительно подобранные стеклянные чашки Петри (донную часть) одного диаметра (±0.1 см). Во втором варианте с толщиной слоя отхода 20 см использовались пластиковые контейнеры внутренним диаметром 6 см высотой 20см без дна. Донную часть контейнеров закрывали фильтровальной бумагой и двумя слоями марли для обеспечения оттока воды. Для сбора воды контейнеры ставили в пустые стеклянные чашки Петри. В обоих вариантах опыта подготовленные контейнеры взвешивались непосредственно перед закладкой эксперимента.

Пробы шламов ОАО "Казаньоргсинтез" и ОАО "Нижнекамскнефтехим" (оставшуюся часть исходных проб, хранившуюся в холодильнике в герметично закрытом пластиковом контейнере, как исходный шлам, и шлам после замораживания и оттаивания) дополнительно усредняли, помещали в контейнеры и уплотняли до исчезновения пустот. Производили взвешивание контейнеров вместе со шламом и, вычитая массу контейнеров, высчитывали массу шлама. Затем контейнеры поместили в вытяжной шкаф и через заданные промежутки времени проводили взвешивание их вместе с содержимым и определение массы шлама. Все варианты эксперимента проводили в трёх повторностях.

2.3.3 Анализ минералогического состава шламов"

Для характеристики минералогического состава мелкоземистой (то есть совокупности механических элементов почвы размером менее 1 мм) части шламов производили рентгеновскую дифрактометрию порошковых препаратов шламов. Использовали шлам после предварительной обработки биологическими методами обезвреживания (фиторемедиации), так как минеральные фазы за сравнительно короткий (один год) период обработки не подвергаются изменениям, а значительно меньшее содержание органических веществ кардинально упрощает пробоподготовку образцов. Исследуемый материал измельчался в агатовой ступке до состояния пудры и помещался в стандартную, дисковую кювету из кварцевого стекла. Во время съёмки образец вращался в собственной плоскости со скоростью бОоб/мин. Спектры дифракции регистрировались в линейной шкале обратных межплоскостных расстояний с размерностью А"1 при шаговом режиме с шагом 0,05 А"1 (время в шаге 1 сек). Совокупность базальных рефлексов в интервале межплоскостных расстояний 65-3 А регистрировали на рентгеновском дифрактометре Б8

* Анализ выполнен на базе ЦНИИ Геологии Неруцных ресурсов, г. Казань

ADVANCE (Braker, USA). Использовано монохроматизированное Cu-излучение, режим шагового сканирования. Параметры измерения: напряжение на трубке 40 kV, сила тока - 30 тА. Интервал съёмки - 3-65°29.

Рентгеноструктурный анализ основан на взаимодействии рентгеновского излучения с кристаллической структурой исследуемого вещества. Последняя выражается в уникальном для каждого вещества упорядоченном, подчиняющемся строгим геометрическим закономерностям расположении элементов, входящих в состав кристаллической решётки. Расстояния между отдельными частицами близки к длинам волн используемого рентгеновского излучения, в силу чего кристаллическая структура твёрдого вещества является для рентгеновских лучей дифракционной решёткой. При взаимодействии с кристаллической структурой конкретного вещества способны дифрагировать только лучи, падающие на неё под несколькими определёнными углами. Набор этих углов зависит от геометрических параметров кристаллической структуры и для каждой является индивидуальным. Отслеживаемая в ходе анализа дифракция лучей на кристаллических решётках присутствующих в образце веществ позволяет идентифицировать эти минеральные вещества.

2.4 Характеристика воздействия замораживания и оттаивания на микрофлору шлама

Для замораживания и оттаивания часть усреднённого образца шлама асептически отбирали методом конверта в обработанный спиртом герметично закрываемый пластиковый контейнер. Замораживали шлам при минус 14 °С в течение 12 часов и оттаивали при комнатной температуре (23-25 °С) в течение 12 часов. В экспериментах использовали часть исходного образца, хранившуюся в холодильнике в герметично закрытом пластиковом контейнере, и шлам после замораживания и оттаивания.

Численность микроорганизмов различных физиолого-биохимических групп в шламе оценивали стандартным методом посева разведений объекта на спектр твёрдых сред. Использовались следующие стандартные среды [Теппер с соавт., 2003]:

а) мясо-пептонный агар (МПА) для выделения аэробных гетеротрофных микроорганизмов;

б) среда Эшби для выделения азотфиксирующих и олигонитрофильных микроорганизмов;

в) среда Эндо для выделения бактерий группы кишечной палочки (БГКП);

Кроме того, использовали высев на агаризованную среду с добавкой набора солей и гексадекана для выделения микроорганизмов, способных использовать данный углеводород в качестве единственного источника углерода и энергии. Выделенные таким образом микроорганизмы учитывали как деструкторы гексадекана.

Численность жизнеспособных некультивируемых микроорганизмов определяли путём подсчёта клеток в разведениях шлама, с использованием модифицированного метода Когуре [Marine microbiology, 2001]. В 1 мл разведения шлама в стерильном физиологическом растворе вносили в растворённом виде дрожжевой экстракт из расчёта его конечной концентрации 250 мкг/мл. Кроме того, вносили раствор смеси антибиотиков в следующих конечных концентрациях:

а) налидиксовая кислота - 20 мкг/мл

б) пипемидиновая кислота - 10 мкг/мл

в) цефалексин - 10 мкг/мл

г) ципрофлаксин - 0.5 мкг/мл

В ходе экспериментов был исследован спектр концентраций данных антибиотиков (пропорции, приведённые в методике, не изменялись), при

данных концентрациях наблюдалась максимальная доля клеток, демонстрировавших отклик.

После внесения антибиотиков и дрожжевого экстракта образцы инкубировали при 28°С в течение 6 часов, приготавливали фиксированные препараты, которые микроскопировали с иммерсией. Подсчитывали общее количество клеток и клеток, увеличившихся в размерах, в 20 полях зрения микроскопа, высчитывали среднее значение и стандартное отклонение.

Оценку изменения дыхательной активности микрофлоры шлама ОАО "Казаньоргсинтез" под воздействием замораживания и оттаивания проводили в соответствии с методикой, изложенной в разделе «Биологические методы анализа». Пробы шлама дополнительно усредняли перед проведением анализа. В замороженные пробы в начале их оттаивания вводили термопару и использовали пробы в работе через два часа после подъёма их температуры до комнатной (23°С), не дожидаясь окончания 12-часовой экспозиции.

2.5 Характеристика воздействия замораживания и оттаивания шлама на токсические свойства, состав водной фазы шлама, генотоксические свойства водной фазы шлама и ДМСО-экстракта.

Замораживание и оттаивание шлама проводили по методике, изложенной в разделе 2.4; дополнительно усреднённые пробы исходного шлама и шлама после замораживания и оттаивания центрифугировали при 3500g в течение 20 мин и отбирали отделившуюся водную фазу отхода.

Водную фазу оценивали с точки зрения токсичности по отношению к Paramecium caudatum и Ceriodaphnia affinis в соответствии со стандартными методиками [Juvonen el al., 2000].

Генотоксичность (мутагенное действие) определяли по отношению к штамму Salmonella typhimurium ТА 100 для водной фазы шламов и экстрактов шламов, приготовленных на основе диметилсульфоксида (ДМСО). Для

приготовления ДМ С О-э кстрактов смешивали ДМСО со шламом из соотношения ДМСО:шлам, равного 2:1 (по массе). В течение 10-минут перемешивали смесь в закрытой колбе на качалке при комнатной температуре (23-25°С), отбирали часть экстракта стеклянной пипеткой и центрифугировали экстракт в пластиковых пробирках при 8000g. Водную фазу шлама фильтровали через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Проводили предварительную оценку содержания гистидина по методу Ильинской с соавторами [Ильинская с соавт., 2001]. Токсичность образцов оценивали путём сравнения числа колоний тестерного микроорганизма Salmonella typhimurium ТА 100 в опыте и в контроле, содержащем эквивалентное количество растворителя - воды или ДМСО [Ильинская с соавт., 1995]. Собственно мутагенное действие оценивали в тесте Эймса по регистрации частоты реверсии ауксотрофного по гистидину штамма Salmonella typhimurium ТА 100 к прототрофности. Мутагенную активность учитывали по кратности превышения числа индуцированных ревертантов над спонтанным фоном мутирования [Marón, Ames, 1983].

Состав водной фазы шлама определяли методом газовой хроматографии с помощью газового хроматографа «Хром-5», со стальной колонкой длиной 0,5 м, диаметром 4мм, заполненной ПЭГ-20М. Детектор по теплопроводности, ток 50 мА.

2.6 Подготовка шлама к биологическому обезвреживанию в условиях полевого эксперимента

Основываясь на предварительных данных лабораторных экспериментов по воздействию замораживания и оттаивания на свойства шлама ОАО "Казаньоргсинтез", провели подготовку данного отхода за счёт комплексного воздействия замораживания и оттаивания, микрофлоры отхода и агротехнической обработки. В начале холодного сезона отход с помощью

погрузчика извлекли из действующего накопителя 41 Г очистных сооружений предприятия, и распределили слоем толщиной около 0.3 м на бетонированном дне свободного пшамонакопителя, оборудованного дренажной системой. Вода, содержавшаяся в шламовых массах и попадавшая на площадку с осадками, благодаря уклону основания (около 3°) стекала сквозь гравийный фильтр и через дренажную систему перекачивалась в общую систему очистки сточных вод.

Последовательность основных технологических этапов обработки представлена ниже.

9 ноября - Выемка шлама (5 мЗ) из накопителя 41Г и перемещение в свободный накопитель 42Г, распределение слоем 25-30 см.

8 мая - Вспахивание мотокультиватором, анализ оптимальной дозировки азота по респираторной активности микрофлоры

11 мая - Внесение нитрата аммония, повторное вспахивание, полив.

22 мая - Анализ оптимальной дозировки азота по респираторной активности микрофлоры

25 мая - Внесение нитрата аммония, полив.

По мере снижения влажности шлама осуществляли ежедневный полив небольшими дозами воды, поддерживая влажность отхода. Периодически осуществляли отбор проб из 5 точек, равномерно распределённых по поверхности шлама. Отбор проводили цилиндрическим пробоотборником на всю глубину слоя шлама. Отбор проб на оценку физической структуры проводили отдельно, вырезая керн шлама цилиндрической формы и постепенно надвигая на него стеклянный стакан, для уменьшения повреждения структуры шлама.

2.7 Оценка дыхательной активности микрофлоры обработанного шлама при варьировании форм и доз удобрений и источника полива

В опыте использовали подготовленный к биологическому обезвреживанию шлам. Дыхательную активность микрофлоры отхода оценивали на фоне варьирования источника орошения (водопроводная вода; очищенная вода из вторичных отстойников; иловая жидкость), форм и доз удобрений. Опыт проводили со шламом, влажность которого в ходе предварительной обработки снизили до 20 и 10%. К пробам отхода (по 50 г, сухой вес) добавили в контрольных вариантах (без удобрений) по 15 мл увлажняющей жидкости из различных источников. В опытных вариантах к пробам отхода (по 50 г, сухой вес) также добавляли по 15 мл увлажняющих жидкостей, в которых предварительно растворяли различные дозы удобрений - сульфата аммония (МН4)2804 (бг/кг), аммиачной селитры МЩЧОз (0.9, 3.5, 7.4 г/кг) аммофоски (И\Т4)2НР04 (2.5г/кг), мочевины СО(:Ш2)2 (2.6 г/кг), и совместно аммиачную селитру и суперфосфат (3.5 г/кг и 1гР/кг, соответственно). В вариантах с обезвоженным шламом к 50 г проб добавили по 35 мл увлажняющих жидкостей и растворенные в них удобрения. Таким образом, конечная влажность во всех вариантах опыта (как с влажным обработанным шламом, так и с воздушно-сухим) составила около 40%. После 24 ч инкубации подготовленных проб при комнатной температуре (22-23°С) определяли дыхательную активность микрофлоры газохроматографическим методом [8сЫппег ег а1., 1995].

2.8 Скрининг растений-фитомелиорантов

Подбор растений, устойчивых к токсическому действию обработанного шлама, проводили в лабораторных условиях. Для использования в качестве

растений-фитомелиорантов были испытаны горох (Pisiim sativum), люцерна {Medicago sativa), клевер (Trifolium pratense), козлятник (Onobrychis viciafolia), ячмень (Hordeum vulgare), овёс {Avena sativa), овсяница {Festuca pratensis) и тимофеевка {Phleum pratense). Подготовленный шлам после усреднения закладывали (по 20-25 кг) в пластиковые контейнеры (34x64x20 см) с дренируемым дном. Семена растений высевали в количестве 20г/м2. Устойчивость растений к токсическому действию шлама определяли по прорастанию семян, накоплению биомассы корней и побегов в течение 2-х недель согласно ISO 11269 (1993). Результаты выражали в процентах ингибирования относительно контрольных вариантов - тех же параметров состояния растений при их росте в незагрязнённой почве (дерновый подзол).

2.9 Полевой эксперимент по оптимизации фиторемедиации

В полевом эксперименте были подобраны условия для оптимизации фиторемедиации путём внесения удобрений и наполнителей. Для эксперимента использовали специально подготовленные делянки, размещенные на бетонированном основании шламонакопителя (рисунки 1, 2). Для проведении эксперимента каркас установили на дополнительный дренажный слой (гравий слоем толщиной 10 см, укрытый металлической сеткой с диаметром ячей 1мм). Испытания с использованием делянок включали следующие варианты (таблица 1): 1-6 - оценка фиторемедиации при варьировании различных наполнителей и их концентраций; варианты 6-8 -оценка влияния формы и дозы удобрений на фоне внесения наполнителей; контрольный вариант (9) - фиторемедиация обработанного шлама без дополнительной стимуляции (контроль).

Наполнители вносили в сухом виде, фитомассу измельчали до длины стеблей 5-7 см. Удобрения - аммиачную селитру и суперфосфат - вносили в гранулированном виде. Доза вносимых удобрений (lrN/кт + 0.6 г Р/кг)

составила примерно половину от оптимальной (3.5 гЫЩЧОз/кГ'+• 1 гР/'кг), найденной при оценке дыхательной активности микрофлоры.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Несмелов, Александр Александрович

выводы

1. Выявлена дестабилизация масс шлама ОАО «Казаньоргсинтез» под воздействием замораживания-оттаивания, проявляющаяся в ускорении его обезвоживания при естественном высушивании на 26 % за 10 суток; выявлено преобладание кальцита и распространённых породообразующих силикатов в минеральной фазе шламов.

2. Процедура замораживания и оттаивания не изменяет токсикологические свойства водной фазы шлама ОАО "Нижнекамскнефтехим" и незначительно увеличивает таковую в случае шлама ОАО "Казаньоргсинтез" по отношению к Ceriodaphnia affinis; по отношению к Paramecium caudatum изменения токсикологических свойств водной фазы шлама не зафиксированы. Генотоксический эффект водной фазы шлама в тесте Эймса отсутствовал как до, так и после процедуры замораживания и оттаивания; органическая фаза проявляла слабую генотоксичность.

3. Замораживание и оттаивание шлама ОАО "Казаньоргсинтез" вызывает достоверное снижение численности аэробных гетеротрофных (снижение log 10 с 6.2±1.1 до 4.5±0.4) микроорганизмов, численность деструкторов гексадекана достоверно не изменяется, оставаясь на высоком уровне (4.3±0.6).

4. Полевой эксперимент подтвердил закономерности изменения физико-химических характеристик шлама ОАО «Казаньоргсинтез»: шлам перешёл из состояния вязкой однородной массы в состояние рыхлого твёрдого субстрата с поровым пространством до 76% от объёма, его плотность снизилась с 1.6 г/см3 до 1.0 г/см3; уровень загрязнения углеводородами с 96.1±15.0 до 83.7±7 г/кг; фитотоксичности - на 1-2 порядка (с ЕС50 на уровне 18-29 % до 29-47 % ингибирования).

5. Предложены методы ускорения биологического обезвреживания шлама ОАО «Казаньоргсинтез», включающие внесение нитрата аммония (1г NH4NO3 кг) и суперфосфата (0,5 г/кг), полив очищенными сточными водами, применение в качестве растения-мелиоранта овса (Avena sativa L.), рост которого благодаря вышеуказанным мероприятиям улучшается на 170% по показателю общей биомассы, что обеспечивает интенсификацию микробно-растительных взаимодействий в процессе обезвреживания шлама.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые разработан способ подготовки углеводородных шламов к биологическому обезвреживанию за счёт процессов самоочищения шламов, ускоренных направленным воздействием замораживания и оттаивания и агротехнической обработки. В качестве ключевого фактора воздействия на свойства нефтешлама предлагается воздействие замораживания и оттаивания за счёт естественных для умеренного климата низких температур зимнего сезона. Впервые широко охарактеризовано воздействие замораживания и оттаивания на углеводородсодержащий шлам с точки зрения условий обитания в нём живых организмов и его биологического обезвреживания (влияние на физическую структуру, химический состав, токсикологические и генотоксикологические характеристики, микрофлору). Полученные результаты позволяют охарактеризовать воздействие замораживания и оттаивания как эффективный приём, способствующий разностороннему улучшению характеристик шлама с точки зрения его последующего биологического обезвреживания.

Экспериментально показано, что воздействие замораживания и оттаивания дестабилизирует физическую структуру шламов предприятий ОАО "Казаньоргсинтез" и ОАО "Нижнекамскнефтехим", ускоряя их обезвоживание в модельных условиях (отделения водной фазы при центрифугировании). В отношении шлама ОАО "Казаньоргсинтез" воздействие замораживания и оттаивания вызывает ускорение обезвоживания и в условиях естественного высушивания (до 26% в течение 10 суток). Воздействие замораживания сопряжено также с повышением токсичности водной фазы шлама ОАО "Казаньоргсинтез" по отношению к СегШарИта <фпй (с 5 до 10%, безопасная кратность разведения выросла (БКР10) на 40% (с 50 до 70 крат) ), токсический эффект водной фазы шлама ОАО "Нижнекамскнефтехим" в данном тесте не изменился и безопасная кратность разведения (БКРю) составила 200 раз.

Токсический эффект водных фаз шламов ОАО "Казаньоргсинтез" и ОАО "Нижнекамскнефтехим" в отношении Paramecium caudatum не изменялся, составляя соответственно 2 и 6%. Водные фазы обоих шламов не оказали генотоксического эффекта на Salmonella typhimurium ТА 100 в тесте Эймса, ни до воздействия замораживания и оттаивания, ни после. При этом, замораживание и оттаивание по данным газовой хроматографии не вызывает изменения химического состава водной фазы. Замораживание и оттаивание шлама ОАО "Казаньоргсинтез" вызывает достоверное снижение численности культивируемых микроорганизмов - в том числе, численности аэробных гетеротрофных (снижение log 10 с 6,2±1,1 до 4,5±0,4) микроорганизмов, численность углеводородокисляющих микроорганизмов достоверно не изменяется, оставаясь на высоком уровне (log 10 после замораживания и оттаивания 4,3±0,6). Снижается также численность некультивируемых жизнеспособных микроорганизмов и дыхательная активность микрофлоры.

Состав минеральной части шлама может быть определен только на качественном уровне. Выявлено, что в составе механических примесей шлама ОАО "Нижнекамскнефтехим" преобладает кальцит, в составе шлама ОАО "Казаньоргсинтез" — кварц. В целом, в составе механических примесей шламов преобладают кальцит и распространённые породообразующие силикаты, представлены и вторичные глинистые минералы. Примечательно, что никаких выраженных нехарактерных для почв сигналов, которые можно было бы отнести, к минеральным фазам, используемым в качестве катализаторов, в дифракционных спектрах не обнаруживается. Минералы, способные к циклическим изменениям объёма при изменении влажности, в составе шламов присутствуют лишь в небольшом количестве; видимо, вклад циклов усадки-набухания в образование структуры шлама невелик. Присутствие в составе шламов значительных количеств кальций-содержащих минералов оказывает значительное влияние на процессы трансформации органического вещества за счёт насыщения раствора основаниями, структурирующего действия ионов Са2+ на систему органических и минеральных компонентов (за счёт образования мостиковых связей).

В условиях полевого эксперимента в масштабе промышленных испытаний нами продемонстрировано, что разработанный способ позволяет успешно преобразовать физическую структуру шлама ОАО "Казаньоргсинтез» из исходного состояния вязкой однородной массы без порового пространства, с плотностью 1.6 г/см3 в состояние рыхлого почвоподобного субстрата с плотностью 1,0 г/см3, с высокоразвитым поровым пространством, составляющим 76±1% от объёма отхода. При этом уровень загрязнения шлама уменьшился с 96.1±15.0 до 83.7±7 г/кг. Уровень фитотоксичности снизился ориентировочно на 1-2 порядка: исходная токсичность характеризовалась концентрацией шлама в смеси с почвой, вызывающей 50% ингибирования тест-объекта (ЕС50), на уровне 20±7%, тогда как обработанный шлам ингибировал развитие растений в различных тестах на 29 - 47%. Таким образом, нами достигнуты характеристики обработанного шлама, сопоставимые с таковыми в лабораторном эксперименте. Чрезвычайно важно, что достигнутое снижение уровня загрязнения и токсичности позволяет проводить интенсивное биологическое обезвреживание отхода, например, методом фиторемедиации, без его разбавления.

Тем самым показано, что использование замораживания и оттаивания и инициация физико-химических и микробиологических процессов самоочищения позволяет провести успешную подготовку шламов к биологическому обезвреживанию, несмотря на то, что непосредственные эффекты замораживания и оттаивания на микрофлору были отрицательными. Отдалённый эффект замораживания и оттаивания заключается в ускорении обезвоживания масс шлама и уплотнении его твёрдой фазы. Тем самым, ускоряется переход масс шлама в состояние рыхлого твёрдого субстрата.

Данный переход, в свою очередь, кардинальным образом улучшает условия для биологической деградации загрязнений в толще отхода, по сравнению с исходным состоянием шлама в виде вязкой однородной эмульсии, в которой отсутствуют поры. Данный эффект компенсирует снижение численности и активности микроорганизмов непосредственно после процедуры замораживания и оттаивания.

Установлено, что при проведении фиторемедиации подготовленного шлама в качестве растения-фитомелиоранта целесообразно использовать овес, который на 10-60% более устойчив к токсическому воздействию отхода, по сравнению с другими испытанными растениями. При варьировании форм и доз удобрений наибольшую стимуляцию дыхательной активности микрофлоры шлама вызвало совместное внесение аммонийной селитры (3 г азота/кг) и суперфосфата (1 г/кг) на фоне полива очищеными сточными водами, эмиссия С02 при этом повысилась пятикратно.

Учитывая необходимость стимуляции обоих компонентов в системе очистки шлама, а именно-микрофлоры и растения фитомелиоранта, мы усреднили оптимальные значения вносимых удобрений до 1 г/кг для аммонийной селитры и 0,6 г/кг для суперфосфата. Кроме того, целесообразно внесение опилок в количестве 20% по объёму. При данной обработке в условиях лабораторного опыта достигнута стимуляция развития растения-фитомелиоранта (овёс Avena sativa L.) до 80%.

Таким образом, нами разработан новый способ очистки нефтешлама позволяющий преобразовать физическую структуру отхода, частично снизить уровень его токсичности и загрязнения до уровня, позволяющего культивировать растения-фитомелиоранты и таким образом осуществить в дальнейшем его интенсивное биологическое обезвреживание методом фиторемедиации. Данный способ успешно прошёл патентование (патент Российской Федерации № 2421289). Данный способ основан на естественных процессах самоочищения отхода, ускоренных за счёт минимальной обработки: распределения на технологической площадке при отрицательных температурах окружающей среды, внесения удобрений, рыхления и полива. По сравнению с аналогичными технологиями биологического обезвреживания, данный способ характеризуется максимальной технологической простотой и, таким образом, минимальной стоимостью.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Несмелов, Александр Александрович, 2011 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абросимов, A.A. Экология переработки углеводородных систем [Текст]: Учебник / A.A. Абросимов, под ред. М. Ю. Долматова, Э. Г. Теляшева. - М.: Химия, 2002. - 608 с. - ISBN 5-7245-1198-315.

2. Аринушкина, Е. В. Руководство по химическому анализу почв [Текст] /Е. В. Аринушкина. - М.: изд-во МГУ, 1970. - 487 с.

3. Белоусов, В. П. Тепловые свойства растворов неэлектролитов [Текст] / В. П. Белоусов, А. Г. Морачевский, М. Ю. Панов. - JI. : Химия, 1981. - 264 с.

4. Воронин, А. М. Биологические препараты на основе псевдомонад [Текст] / A.M. Воронин, В.В. Кочетков // Arpo XXI. - 2000. - № 3. - С. 3-5.

5. Воронин, А.Д. Основы физики почв [Текст] / А.Д. Воронин. - М. : Изд-во МГУ, 1986. - 243 с.

6. Габбасов, И. М. Рекультивация серой лесной почвы, загрязненной нефтяным шламом [Текст] / И. М. Габбасов, Р. Р. Сулейманов, Ф. X. Хазиев, Т. Ф. Бойко, Н. Ф. Галимзянова, В. Ф. Фердман, Г. М. Ханисламова // Экологическая и промышленная безопасность. - 2001. - № 7. - С. 81-84.

7. Звягинцев, Д.Г. Биология почв: учебник [Текст] / Д.Г. Звягинцев, И.П. Бабьева, Г.М. Зенова. - Зе изд., испр. и доп. - М.: Изд-во МГУ, 2005. - 445 с. ISBN 5-211-04983-7.

8. Ильинская О.Н., Определение генотоксичности веществ в краткосрочных тест-системах. Методическое руководство [Текст] / О.Н. Ильинская, О.Б. Иванченко, Н.С. Карамова // Казань: Изд-во КГУ, 1995. - 22 с.

9. Ильинская, О.Н. Определение свободного гистидина методом тонкослойной хроматографии [Текст] / О.Н. Ильинская, И.М. Скипина, Н.С. Карамова, О.Б. Иванченко, М.А. Шмидт, З.Ф. Круглова // Клиническая лабораторная диагностика. - 2001. - № 6. - С. 12-14.

10. Касьянова, E.B. Эколого-микробиологический мониторинг почв в окрестностях химического комбината [Текст] / Е.В. Касьянова, Н.Д. Ананьева, Е.В. Благодатская, Д.Б. Орлинский// Почвоведение. - 1995,-№5.-С. 626-633.

11. Киреева, H.A. Биологическая активность нефтезагрязненных почв [Текст] / H.A. Киреева, В.В. Водопьянов, A.M. Мифтахова. - М.: Изд-во «Гилем», 2001. - 377 с.

12. Лурье, Ю.Ю. Аналитическая химия промышленных сточных вод [Текст] / Ю. Ю. Лурье. - М.: Изд-во Химия, 1984. - 447 с.

13. Никитина, Е.В. Биоремедиация отходов нефтехимического производства с использованием компостирования [Текст] / Е.В. Никитина, О.И. Якушева, А. В. Гарусов, Р.П. Наумова // Биотехнология. - 2006. - № 1. - С. 53-61.

14. Поконова, Ю. В. Химия высокомолекулярных соединений нефти [Текст] / B.C. Поконова. - Л.: Изд-во ЛГУ, 1989. - 171 с. -ISBN 5-03-001103-Х.

15. Теппер Е.З. Практикум по микробиологии [Текст] / Е.З. Теппер, В.К. Шильникова, Г.И. Переверзева // Практикум по микробиологии. - М.: Дрофа, 2004. - 256 с. - ISBN: 5-7107-7437-5.

16. Шеин, Е.В. Агрофизика [Текст] / Е.В. Шеин, В.М. Гончаров. - Ростов-на-Дону.: Феникс, 2006. - 400 с. - ISBN 5-222-07741-1.

17. Шинкарёв, A.A. Органические компоненты глино-металло- органического комплекса почв лесостепи (теоретические и экспериментальные аспекты изучения) [Текст] / A.A. Шинкарёв, К.Г. Гиниятуллин, Л.В. .Мельников, Г.А. Кринари, С.Г. Гневашев // Казань: Изд-во КГУ. - 2007. - 249 с. - ISBN 5-98180381-9.

18. Якушева О.И. Биотехнологическая очистка сточных вод нефтехимического комплекса [Текст] / О.И. Якушева, Р.П. Наумова // Проблемы био- и медэкологии Республики Татарстан - Казань: Экоцентр, 1998. -Вып. 1.-С. 168-188.

19. Якушева, О.И. Особенности химического состава нефтешлама - отхода нефтехимического производствиаца [Текст] / О.И. Якушева, В.Н. Никонорова, Г.В. Кияненко, О.В. Качалина, P.A. Алиулова, В.В. Абузярова, Е.В. Никитина, Р.П. Наумова // Материалы VI Междунар. конф. «Нефтехимия-2002», 22-26 октября 2002, г. Нижнекамск. - 2002. - С. 271-276.

20. Adam, G. Effect of diesel fuel on growth of selected plant species [Text] G. Adam, H.J. Duncan // Science and Technology. - 2000. - P. 353-357.

21. Anderson, T.A. Comparative fate of 14C- trichloroethylene in the root zone of plants from a former solvent disposal site [Text] / T.A. Anderson, B.T. Walton // Environmental Toxicology and Chemistry. - 1995. - V. 14. - P. 2041-2047.

22. Anderson, T. A. Enhanced degradation of a mixture of three herbicides in the rhizosphere of a herbicide-tolerant plant [Text] / T.A. Anderson, E.L. Kruger, J.R. Coats // Chemosphere. - 1994. -V. 28. - P. 1551-1557.

23. Aprill, W. Evaluation of the use of prairie grasses forstimulating polycyclic aromatic hydrocarbon treatment in soil [Text] / W. Aprill, R.C. Sims // Chemosphere. -1990.-V. 20.-P. 253-265.

24. Aprill, W. Assessing detoxification and degradation of wood preserving and petroleum wastes in contaminated soil [Text] / W. Aprill, R.C. Sims, J.L. Sims, J.E. Matthews // Waste Managament Research. - 1990. - V. 8. - P. 45-65.

25. Atagana, H.I. Optimization of soil physical and chemical conditions for the bioremediation of creosote-contaminated soil [Text] / H.I. Atagana, R.J. Haynes, EM. Wallis // Biodegradation. - 2003. - V. 14. - P. 297-307.

26. Atlas, R.M. Microbial ecology: fundamentals and applications [Text] / R.M. Atlas, R. Bartha. - 4th ed. - San Francisco: Cummings Science Publishing, 1997. -343 p.

27. Balba, M.T. Bioremediation of oil-contaminated soil: microbiological methods for feasibility assessment and field evaluation [Text] / M.T. Balba, N. Al-Awadhi, R.

Al-Daher // Journal of Microbiological Methods. - 1998. - V. 32. - P. 155-164.

28. Banks M.K. Rhizosphere Microbial Characterization in Petroleum-Contaminated Soil [Text] / M.K Banks, H. Mallede, K. Rathbone // Soil and Sediment Contamination. -2003. -V. 3. - P. 371-385.

29. Barron, M.G. An aromatic hydrocarbons the primary detemiinant of petroleum toxicity to aquatic organisms [Text] / M.G. Barron, T. Podrabsky, S. Ogle, R.W. Ricker // Aquatic Toxicology. - 1999. - V. 46. - P. 253-268.

30. Beaudin, N. Identification of the key factors affecting composting of a weathered hydrocarbon-contaminated soil [Text] / N. Beaudin, R.F. Caron, R. Legros, J. Ramsay, B. Ramsay// Biodegradation. - 1999. -V. 10. - P. 127-133.

31. Boyajian, G.E. Phytoremediation: A clean transition from laboratory to marketplace? [Text] / G.E. Boyajian, L.H. Carreira // Nature Biotechnology. - 1997. -V. 15.-P. 127-128.

32. Bragg, J.R. Effectiveness of bioremediation for the Exxon Valdez oil spill [Text] / J.R. Bragg, R.C. Prince, E.J. Harner, R.M. Atlas // Nature. - 1994. - V. 368. - P. 413—418.

33. Burken J.G. Phytoremediation: plant uptake of atrazine and role of root exudates [Text] / J.G. Burken, J.L. Schnoor // Journal of Environmental Engineering. -1996.-V. 122.-P. 958-963.

34. Buyukkamaci, N. Improvement of dewatering capacity of a petrochemical sludge [Text] / N. Buyukkamaci, E. .Kucukselek // Journal of Hazardous Materials. -2007. - V. 144 (1-2). - P. 323-327.

35. Chen, G. Separation of water and oil from water-in-oil emulsion by freeze/thaw method [Text] / G. Chen, G. He. // Separation and Purification Technology. - 2003. -V. 31,1.1.-P. 83-89.

36. Cunningham, S.D. Phytoremediation of contaminated soil [Text] / S.D. Cunningham, W.R. Berti, J.W. Huang // Trends Biotechnology. - 1995. - V. 13. - P.

393-397.

37. Cunningham, S.D. Phytoremediation of soils contaminated with organic pollutants [Text] / S.D. Cunningham, T.A. Anderson, A.P. Schwab, F.C. Hsu // Advances in Agronomy. - 1996. - V. 56. - P. 55-114.

38. Desai, J. D. Microbial production of surfactants and their commercial potential [Text] / J.D. Desai, I.M. Banat // Microbiology and Molecular Biology Reviews. -1997.-V. 61.-P. 47-64.

39. Dibble, J.T. Effect of environmental parameters on the biodégradation of oil sludge [Text] / J.T. Dibble, R. Bartha // Applied and environmental microbiology. -1979. - V. 37,1.4. - P. 729-739.

40. Elektrowicz, N. Effect of electrical potential on the electro-demulsification of oily sludge [Text] / N. Elektrowicz, S. Habibi, R. Shifrina, // Journal of Colloid and Interface Science. - 2006. - V. 295. - P. 235-241.

41. Fletcher, J. S. Release of phenols by perrennial plant roots and their potential importance in bioremediation [Text] / J.S. Fletcher, R.S. Hedge // Chemosphere. -1995.-V. 31. -P. 3000-3016.

42. Francis, M. Biotreatment of waste oil and sludges [Text] / M. Francis, L. Stehmeyer // Applied and Environmental Microbiology. -1991. - V. 94. - P. 55-74.

43. Gao, W. Freezing as a combined wastewater sludge pretreatment and conditioning method [Text] / W. Gao // Desalination. - 2011. - V. 268 (1-3). - P. 170173.

44. Giles, W. R. Characterization and bioremediation of a weathered oil sludge [Text] / W. R. Giles, K. D. Kriel, J. R. Stewart // Environmental Geosciences. - 2001. -V. 8,-№2.-P. 110-122.

45. Glaser, A.N. Microbial Biotechnology: Fundamentals of Applied Microbiology [Text] / A.N. Glaser, H. Nikaido. - New York: Freeman W.H. and Comp., 1988. - 554 p.;-ISBN 0521842107

46. Godoy-Faundez, A. Bioremediation of contaminated mixtures of desert mining soil and sawdust with fuel oil by aerated in-vessel composting in the Atacama Region (Chile) [Text] / A. Godoy-Faundez, B. Antizar-Ladislao, L. Reyes-Bozo, A. Camano, C. Sâez-Navarrete // Journal of Hazardous Materials. - 2008. - V. 151, I. 2-3. - R 649-657.

47. Goel, A. Plant cell biodégradation of a xenobiotic nitrate ester, nitroglycerin [Text] / A. Goel, G. Kumar, G. F. Payne, S. K. Dube // Nature Biotechnology. -1997. -V. 15.-P. 174-177.

48. Hollender, J. Assessing the microbial activity of soil samples, its nutrient limitation and toxic effect of contaminants using a simple respiration test [Text] / J. Hollender, K. Althoff, M. Mundt, W. Dott // Chemosphere. - 2003. - V. 53. - N. 3. -P. 269-275.

49. Huang X.-D. A multi-process phytoremediation system for decontamination of persistent total petroleum hydrocarbons (TPHs) from soils [Text] / X.-D. Huang Y. El-Alawi, J. Gurska, B. Glick, B. Greenberg // Microchemical Journal. - 2005. - V. 81. -P. 139-147.

50. Huang, X. Responses of three grass species to creosote during phitoremediation [Text] / X. Huang, Y. El-Alawi, D. M. Penrose, B. R. Glick, B. M. Greenberg // Environmental Pollution. - 2004. - V. 130. - P. 453-463.

51. Hugenholtz, P. Identifying microbial diversity in the natural environment: a molecular phylogenetic approach [Text] / P. Hugenholtz, N.R. Pace // Trends in Biotechnology. - 1996. - V. 14. - P. 190-197.

52. Insam, H. Relationship of soil microbial biomass and activity with fertilization practice and crop yield of three ultisoils [Text] H. Insam, C.C. Mitchel // Soil Biology and Biochemistry. - 1991. - V. 23. - P. 459-464.

53. ISO 10706:2000. Water quality - Determination of long term toxicity of substances to Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) [Text], - Geneva:

International Standard Organization, 2000. - 7 p.

54. ISO 11269 - 1. Soil quality - determination of the effects of pollutants on soil flora: Part 1. Method for measurement of inhibition of root growth [Text], - Geneva: International Standard Organization, 1993. - 9p.

55. ISO 10712:1995. Water quality - Pseudomonas putida growth inhibition test (Pseudomonas cell multiplication inhibition test) [Text], - Geneva: International Standard Organisation, 1995. - 9 p.

56. ISO 6341:1996. Water quality - Determination of the inhibition of the mobility of Daphnia magna Straus (Cladocera, Crustacea) - Acute toxicity test. [Text]. -Geneva: International Standard Organisation, 1996. - 9 p.

57. ISO 11269-2:1995 Soil Quality - Determination of the effects of pollutants on soil flora - Effects of chemicals on the emergence and growth of higher plants. [Text], - Geneva: International Standard Organisation, 1995. - 9 p.

58. Jean, D.J. Direct sludge freezing using dry ice [Text] / D.J. Jean // Advances in Environmental Research. - 2001. - V. 5. - N. 2. - P. 145-150.

59. Jean, D.J. Freeze/Thaw Treatment of Oily Sludge From Petroleum Refinery Plant [Text] / D.J. Jean, C.P. Chu, D. Lee // Separation Science and Technology . -2001. -V. 36. -N. 12.-P. 2733-2746.

60. Juvonen, R. A battery of toxicity tests as indicators of decontamination in composting oily waste [Text] / R. Juvonen, E. Martikainen, E. Schultz, A. Joutti, J. Ahtianen, M.A. Lehtokari // Ecotoxical Environmental Safety. - 2000. - V.47. - P. 156166.

61. Keith, L. H. Priority pollutants [Text] / L. H. Keith, W. A. Telliard // Environmental Science and Technology . - 1979. -V. 13. - P. 416-423.

62. Kennedy, I.R. The current and potential contribution of asymbiotic nitrogen fixation to nitrogen requirements on farms: a review [Text] / I.R. Kennedy, N. Islam // Australian Journal of Experimental Agriculture. - 2001. - V. 41. - P. 447-457.

63. Kirk, J.L. The effects of perennial ryegrass and alfalfa on microbial abundance and diversity in petroleum contaminated soil [Text] / J.L. Kirk, J.N. Klironomos, H. Lee, J.T. Trevors // Environmantal Pollution. - 2005. - V. 133. - P. 455-465.

64. Lai, C. Salinity effect on freeze/thaw conditioning of activated sludge with and without chemical addition [Text] / C. Lai // Separation and Purification Technol., -2004.-V. 34,1.1-3.-P. 155-164.

65. Lazar, I. Microbial degradation of waste hydrocarbons of oily sludge fron some Romanian Oil Fields [Text] / I. Lazar, S. Dobrota, A. Voicu, M. Stefanescu, L. Sandulescu, I.G. Petrisor // Journal of Petroleum Science and Engineering. - 1999. -V. 22.-P. 151-160.

66. Lin, C. Freeze/thaw induced demulsification of water-in-oil emulsions with loosely packed droplets [Text] / C. Lin, G. He, X. Li, L. Peng, C. Dong, S. Gu, G. Xiao // Separation and Purification Technology . - 2007. - V. 56,1. 2. - P. 175-183.

67. Liste, H.-H. Plant performance, dioxygenase-expressing rhizosphere bacteria, and biodegradation of weathered hydrocarbons in contaminated soil [Text] / H.-H. Liste, I. Prutz // Chemosphere. - 2006. - V. 62,1. 9. - P. 1411-1420.

68. Loehr, R.C. Changes in Toxicity and Mobility Resulting from Bioremediation Processes [Text] / R. C. Loehr, L. Webster// Bioremediation Journal. - 1997. -V. 1,1. 2.-P. 149-163.

69. MacFarlane, J. C. Efect, uptake and distribution of nitrobenzene in several terrestrial plants [Text] / J. C. MacFarlane, T. Peeger, J. Fletcher // Environmental Toxicology and Chemistry. - 1990. - V. 9. - P. 513-520.

70. Machín-Ramírez, C. Slurry-phase biodegradation of weathered oily sludge waste [Text] / C. Machín-Ramírez, I.Okoh, D. Morales, K.Mayolo-Deloisa, R.Quintero, M.R. Trejo-Hemández // Chemosphere. - 2008. - V. 70, I. 4. - P. 737744.

71. Margesin, R. Monitoring of bioremediation by soil biological activities [Text] /

116

R, Margesin, A. Zimmerbauer, F. Shinner // Chemosphere. - 2000. - V. 40. - R 339346

72. Marine Microbiology. Volume 30. Methods in Microbiology [Text] / ed. J.Paul. - 1th edition. - New Jork: Academic Press, 2001. - V. 30. - 666 p. - ISBN-10: 0125215304.

73. Maron, D.M. Revised method for Salmonella mutagenecity test [Text] / D.M. Maron, B.N. Ames // Mutation Research. - 1983. - V. 113. - P. 175-215.

74. Methods of Soil Analysis. Part 1. Physical and Mineralogical Methods [Text] / ed. Klute A., - 2nd edition. - Madison, Wisconsin: American Society of Agronomy and Soil Science Society of America, 1986. - 1216 p. - ISBN: 0891188118.

75. Mishra, S. Evaluation of inoculum addition to stimulate in situ bioremediation of oily-sludge-contaminated soil [Text] / S. Mishra, J. Jyot, R.C. Kuhad, B. Lai //Applied and Environmental Microbiology. - 2001. - V. 4. - P. 1675-1681.

76. Miyoshi, N. Use of Paramecium species in bioassays for environmental risk management: determination of IC50 values for water pollutants [Text] / N. Miyoshi, T. Kawano, M. Tanaka, T. Kadono, T. Kosaka, M. Kunimoto, T. Takahashi, H. Hosoya // Journal of Health Science. - 2003. - V. 49. - P. 429-435.

77. Mrayyan, B. Biodegradation of total organic carbons (TOC) in Jordanian petroleum sludge [Text] / B. Mrayyan, M. N. Battikhi // Journal of Hazardous Materials. - 2005. -V. 120. - P. 127-134.

78. Namova, R.P. Diazotrophs originated from petrochemical sludge as a potential resource for waste remediation [Text] / R.P. Namova, T.V. Grigoreva, A.A. Rizvanov, V.Y. Gorshkov, N.V. Kudijashova, A.V. Laikov // World Applied Science Journal. -2009.-V. 6.-N. 2.-P. 154-157.

79. Nikitina, E.V. Distribution and Physiological State of Microorganisms in Petrochemical Oily Sludge [Text] / E.V. Nikitina, O.I. Yakusheva, S.A. Zaripov, R.A. Galiev, A.V. Garusov, R.P. Naumova // Microbiology. - 2003. - V. 72, N. 5. - P. 621117

80. Ormeci, B. Effect of dissolved organic material and cations on freeze-thaw conditioning of activated and alum sludges [Text] / B. Ormeci, P. Vesilind // Water research. - 2001. - V. 35,1. 18. - P. 4299-4306.

81. Ouyang, W. Comparison of bio-augmentation and composting for remediation of oily sludge: a field-scale study in china [Text] / W. Ouyang, H. Liu, V. Murygina, Y. Yu, Z. Xiu, S. Kalyuzhnyi // Process Biochemistiy. - 2005. - V. 40. - P. 3763-3768.

82. Paterson, S. Uptake of organic chemicals by plants : a review of processes, correlations and models [Text] / S. Paterson, D. Mackay, D. Tam, W.Y. Shiu, // Chemosphere. - 1990. - V. 21. - P. 297-331.

83. Pineda-Flores, G. A microbial consortium isolated from a crude oil sample that uses asphaltenes as a carbon and energy source [Text] / G. Pineda-Flores, G. Boll-Argbello, C. Lira-Galeana, A.M. Mesta-Howard // Biodegradation. - 2004. - V. 15. -P. 145-151.

84. Prado-Jatar, M. Oil sludge landfarming biodegradation experiment conducted at a tropical site in eastern Venezuela [Text] / M. Prado-Jatar, M. Correa, J. Rodriguez-Grau, M. Carneiro // Waste Management Research. - 1993. - V. 11. - P. 97-106.

85. Propst, T.L. In situ (mesocosm) assessment of immunotoxicity risks to small mammals inhabiting petrochemical waste sites [Text] / T.L. Propst, R.L. Lochmiller, C.W. Quails, K. McBee // Chemosphere. - 1999. -V. 38, N. 5. - P. 1049-1067.

86. Providenti, M. A. Efect of addition of rhamnolipid biosurfactants or rhamnolipid-producing Pseudomonas aeruginosa on phenanthrene mineralization in soil slurries [Text] / M. A. Providenti, C. A. Flemming, H. Lee, J. T. Trevore // FEMS Microbiology Ecology. - 1995. - V. 17. - P. 15-26.

87. Rao, J.V. Toxic effects of acephate on Paramecium caudatum with special emphasis on morphology, behavior, and generation time [Text] / J.V. Rao, K. Srikanth, S.K. Arepalli, V.G. Gunda // Pesticide Biochemistry and Physiology. - 2006. - V. 86,

I. 3.- P. 131-137.

88. Rhykerd, R. L. Impact of bulking agents, forced aeration, and tillage on remediation of oil-contaminated soil [Text] / R. L. Rhykerd, B. Crews, K. J. Mclnnes, R. W. Weaver // Bioresource Technology. - 1999. - V. 67. - P. 279-285.

89. Rocha, C. Enhanced oily sludge biodégradation by a tension-active agent isolated from Pseudomonas aeruginosa USB-CS1 [Text] / C. Rocha, C. Infante //Applied Microbiology and Biotechnology. - 1997. - V. 47. - P. 615-619.

90. Ryan, J. A. Plant uptake of non-ionic chemicals from soils [Text] / J. A. Ryan, J. M. Bell, J. M. Davidson, O'Connor // Chemosphere. - 1988. -V. 17. - P. 2299-2323.

91. Salt, D. E. Phytoremediation [Text] / D. E. Salt, R. D. Smith, I. Raskin // Annual Reviews of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. - 1998. - V. 49. - P. 643668.

92. Schnoor, J. L. Phytoremediation of organic and nutrient contaminants [Text] / J. L. Schnoor, L. A. Licht, S. C. McCutcheon, N. L. Wolfe, L. H. Carreira // Environmental Science and Technology. - 1995. - V. 29. - P. 318-323.

93. Schinner, F. Methods in soil biology [Text] / F. Schinner, E. Kandeles, R. Öhlinger, R. Margesin // Berlin: Springer-Verlag, 1995. - 426 p. - ISBN 3-540-590552.

94. Sikkema, J. Mechanisms of Membrane Toxicity of Hydrocarbons [Text] / J. Sikkema, J. A. M. De Bont, B. Poolman // Microbiology Reviews. - 1995. - V. 59, N.2.-P. 201-222.

95. Tikhonovich, I.A. Genetic potential of plants for improving the beneficial microbe interactions [Text]/ I.A. Tikhonovich, A.P. Kozhemiakov, N.A. Provorov, L.V. Kravchenko // NATO ASI Series. Vol. G39, Biological fixation of nitrogen for ecology and sustainable agriculture, ed. A. Legockhi, H. Bothe, A. Pühler.- Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 1997.-P. 191-194.

96. Topp, E. Factors afecting the uptake of 14C-labeled organic chemicals by plants

from soil [Text] / E. Topp, I. Scheunert, A. Attar, E Korte // Ecotoxicology and Environmental Safety. - 1986. -V. 11. -P. 219-228.

97. Siciliano S.D., Changes in Microbial Community Composition and Function During a Polyaromatic Hydrocarbon Phytoremediation Field Trial [Text] / Siciliano S.D., Germida J.J., Banks K., Greer C.W. // Applied and Environmental Microbiology. - 2003. - V. 69, N. 1. - P. 483-489.

98. Song H.-G. Effect of jet fuel spills on the microbial community of soil [Text] / H.-G. Song, R. Bartha // Applied and Environmental Microbiology. - 1990. - V. 56, N. 3.-P. 646-651.

99. Ururahy, A.F.P. Effect of aeration on biodegradation of petroleum waste [Text] / A.F.P. Ururahy; M.D.M. Marins, R.L. Vital, I. Therezinha Gabardo, Nei Pereira Jr. // Reviews of Microbiology. - 1998. -V. 29, N. 4. - P. 254-258.

100. Van Dyke, M. I. Evaluation of microbial surfactants for recovery of hydrophobic pollutants from soil [Text] / M. I. Van Dyke, S. L. Gulley, H. Lee, J. T. Trevors // Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology. - 1993. - V. 11. - P. 163-170.

101. Van Hamme, J.D. Recent Advances in Petroleum Microbiology [Text] / J.D. VanHamme, A. Singh, O.P. Ward // Microbiology and Molecular Biology Reviews. -2003. - V. 67,1. 4 - P. 503-549.

102. Van Straalen, N.M. Soil invertebrates and microorganisms [Text]: Monograph / N.M. van Straalen, C.A.M. van Gestel //. In: P. Calow, (ed.), Handbook of Ecotoxicology, Blackwell Science Ltd., Oxford, UK, 1993. - P. 251-277. - ISBN: 9780632049332.

103. Vasudavan, N. Bioremediation of oil sludge-contaminated soil [Text] / N. Vasudavan, P. Rajaram // Environmental International. - 2001. - V. 26. - P. 409-411.

104. Walton, B. T. Rhizosphere microbial community as a plant defense against toxic substances in soils [Text] / B. T. Walton, A. M. Hoylman, M. M. Perez, T. A.

Anderson, T. R. Johnson // Bioremediation through Rhizosphere Technology. - 1994. -V. 563.-P. 82-92.

105. Wenzel, W. W. Phytoremediation : a plant-microbe-based remediation system [Text] / W. W. Wenzel, D. C. Adriano, D. Salt, R. Smith // Bioremediation of Contaminated Soils. - 1999, - V. 37. - P. 167-177.

106. Xu, Y. Bioremediation of crude oil-contaminated soil: comparison of different biostimulation and bioaugmentation treatments [Text] / Y. Xu, M. Lu // Journal of Hazardous Materials. -2010. -V. 183,1. 1-3. - P. 395-401.

107. Yang, Z. Electroosmotic flow in sludge floes [Text] / Z. Yang, X.F. Peng, D.J. Lee // International Journal of Heat and Mass Transfer. - 2009. - V. 52. - P. 29922999.

108. Zubaidy, E.H. Fuel recovery from waste oily sludge using solvent extraction [Text] E.H. Zubaidy, D.M. Abouelnasr II Process Safety and Environ. Protect. - 2010. -V. 88,1. 5.-P. 318-326.