Индукторы синтеза шаперонов из класса пирролилазинов в качестве нейропротекторов для купирования нейродегенеративных процессов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Дутышева Елизавета Александровна

• Дутышева Елизавета Александровна
• кандидат наук
• 2025

Оглавление диссертации кандидат наук Дутышева Елизавета Александровна

Список сокращений

Введение

Актуальность исследования

Цели и задачи исследования

Научная новизна исследования

Научная и практическая значимость работы

Положения, выносимые на защиту

Апробация работы

Список публикаций по теме исследования

Финансовая поддержка диссертации

Объем и структура диссертации

Личный вклад автора

1. Обзор литературы

1.1 Общая характеристика ЧМТ

1.2 Патофизиология черепно-мозговой травмы

1.2.1 Эксайтотоксичность

1.2.2 Окислительный стресс

1.2.3 Дисфункция митохондрий

1.2.4 Нейровоспаление

1.2.5 Агрегация белков

1.3 Современные подходы к диагностике и лечению ЧМТ

1.4 Этиология, эпидемиология и симптоматическая картина болезни Альцгеймера

1.4.1 Амилоид-опосредованный патогенез БА

1.4.2 Тау-опосредованный патогенез БА

1.4.3 Связь Р-амилоида, тау и ГАФД в патогенезе БА

1.4.4. Современная терапия болезни Альцгеймера и разработки в этой области

1.5 Цитопротекторное действие ЩР70 при черепно-мозговой травме и болезни Альцгеймера

1.5.1 Структура ШР70

1.5.2 Шаперонный цикл ШР70

1.5.3 Регуляция активности ЩР70

1.5.4 Функции ШР70

1.5.5 Защитная функция ЩР70

1.5.6 Защитная роль ЩР70 при нейродегенерации

1.5.7 Использование ШР70 в терапии нейродегенерации

2. Материалы и методы

2.1 Животная модель ЧМТ

2.2 Тест «сужающаяся дорожка»

2.3 «Водный лабиринт Морриса»

2.4 "Открытое поле"

2.5 Клеточные линии

2.6 Репортерная система

2.7 Иммуногистохимия

2.8 Измерение активности каспазы-3

2.9 Определение активности Р-газактозидазы

2.10 Определение активности дегидрогеназ по Мосману

2.11 Система мониторинга состояния клеток xCELLigence

2.12 Проточная цитометрия

2.13 Выделение РНК и ПЦР в реальном времени

2.14 ПААГ-SDS электрофорез

2.15 Вестерн-блот анализ

2.16 Иммунопреципитация

2.17 DARTS (Drug affinity responsive target stability)

2.18 Обращенно-фазовая жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией

2.19 In silico анализ

2.20 Статистика

3. Результаты

3.1 Выявленное с помощью скрининга пирролил-подобных соединений PQ-29 способно вызывать накопление шаперонов в клетках

3.2 Отработка модели вторичных повреждений после ЧМТ

3.3 PQ-29 снижает гибель клеток С6, обусловленную действием СМЖ после ЧМТ

3.4 PQ-29 оказывает терапевтическое воздействие в in vivo модели ЧМТ

3.5 Применение PQ-29 блокирует запуск вторичных повреждений, обуславливающих гибель нейронов после ЧМТ крыс

3.6 PQ-29 оказывает нейропротекторное действие по отношению к нейрональным клеткам на in vitro модели БА

3.6.1 Скрининг и оценка эффективности накопления шаперонов в клетке соединений из группы производных пирролилазина выявил новые индукторы синтеза шаперонов

3.6.2 Применение соединений из группы производных пирролилазина снижает гибель MSC-NEU и уменьшает активность Р-галактозидазы на in vitro модели БА

3.7 Оптимизированные новые индукторы синтеза шаперонов повышают уровень белков теплового шока в стареющих клетках

3.8 Соединения из группы пирролил-производных индуцируют синтез шаперонов за счет снижения активности ингибиторной киназы HSF1 казеин киназы

Обсуждение

Выводы

Список литературы

Благодарности

Список сокращений

АФК - активные формы кислорода

БА - болезнь Альцгеймера

ГАФД - глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа

ГЭБ - гематоэнцефалический барьер

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СККБ - система контроля качества белков

СМЖ - спинномозговая жидкость

СМЖЧМТ - спинномозговая жидкость после черепно-мозговой травмы

ЧМТ - черепно-мозговая травма

УПС - убиквитин-протеасомная система

17-DMAG - 17-диметиламиноэтиламино-17-деметоксигелданамицина

ADME - absorption, distribution, metabolism and excretion, всасывание,

распределение, матаболизм и выведение

APP - amyloid precursor protein, предшественник Р-амилоида

BSA - bovine serum albumin, бычий сывороточный альбумин

CK2 - казеин киназа

DMSO - диметилсульфоксид

HSE - heat shock element, промоторная область генов белков теплового шока HSPs - heat shock proteins, белки теплового шока HSF-1 - heat shock factor 1. Транскрипционный фактор генов белков теплового шока

HSP70 - белок теплового шока 70 HSP90 - белок теплового шока

MAP2 - microtubule-associated protein 2, маркерный белок нейрональных клеток

MSC-DP - мезенхимальные стволовые клетки пульпы зуба человека MSCWJ-2 - мезенхимальные стволовые клетки пупочного канатика человека

MSC-NEU - дифференцированные в нейрональном направлении мезенхимальные стволовые клетки

PASS - Prediction of the Biological Activity Spectra of Organic Compounds, сервис компьютерного предсказания вероятности взаимодействия малых молекул с белками PBS - фосфатно-солевой буфер

PQ-29 - (3-(5-фенил-1И-пиррол-2-ил)хиноксалин-2(1И)-он TPSA - topological polar surface area, физико-химические параметры фармакологического средства

Введение

Актуальность исследования

В связи с развитием уровня медицины в настоящее время всё больше внимания сосредоточено на нейродегенеративных патологиях, таких как болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера (БА), боковой амиотрофический склероз, а также на состояниях, приводящих к развитию нейродегенерации таких как черепно-мозговая травма (ЧМТ). Согласно исследованиям всемирной организации здравоохранения, к 2040 году нейродегенеративные заболевания станут второй по распространенности причиной гибели в мире [136]. Нейродегенерация характеризуется прогрессирующей дисфункцией и атрофией нервных клеток различного генеза, приводящей к угнетению когнитивных функций и снижению качества жизни. Наиболее распространённой причиной деменции является БА, которая диагностирована примерно у 50 миллионов пациентов в настоящее время [136]. При БА основной причиной потери нейронов считается токсическое воздействие внеклеточных высокоорганизованных комплексов белка Р-амилоида -бляшек, а также нейрофибриллярных тяжей тау-белка, образующихся внутри клеток. Накопление патогенных белков происходит в результате снижения эффективности внутриклеточных систем утилизации белков, а также в результате дисфункции дренажных систем мозга [107]. В отличие от БА, проявление которой характерно в основном в пожилом возрасте, лидирующей причиной нейродегенерации среди трудоспособного населения является черепно-мозговая травма. Ежегодно около 70 миллионов человек в мире получают ЧМТ [244]. ЧМТ - комплексное понятие, объединяющее механические повреждения тканей головного мозга и черепа и вызываемые ими кратковременные или длительные последствия в виде когнитивной и двигательной дисфункции [37, 71]. Прогнозы у пациентов с этими

патологиями довольно удручающие, даже несмотря на современный уровень развития медицины. Помощь при болезни Альцгеймера на данное время ограничивается лишь симптоматическим лечением, основу которого составляют нейролептики, приём которых зачастую вызывает ещё большее угнетение когнитивных функций. По статистике у 60% пациентов после ЧМТ наблюдаются когнитивные и двигательные нарушения, несмотря на своевременно оказанную медицинскую помощь [166, 168]. При ЧМТ повреждения и гибель нервной ткани могут быть отложенными и спровоцированными не механическими повреждениями, а молекулярными процессами, сопровождающими первичные повреждения тканей и клеток и их дисфункцию [103]. Одной из молекул, принимающих участие в этих процессах, является белок глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназа (ГАФД). Показано, что в ответ на различные виды стресса, например, окислительный стресс, молекула ГАФД претерпевает ряд модификационных и конформационных изменений, склоняющих белок к образованию токсичных агрегатов [170]. В нашей лаборатории было доказано, что наличие агрегатов ГАФД в спинномозговой жидкости (СМЖ) крыс после ЧМТ обуславливает токсичность СМЖ по отношению к нервным клеткам. Помимо этого, блокирование агрегатов ГАФД в межклеточном пространстве приводит к уменьшению потери нейронов гиппокампа и снижению двигательной дисфункции крыс [127].

Одним из наиболее эффективных инструментов клетки в борьбе с белками с неправильной конформацией или с их агрегатами является шаперонный аппарат. В число центральных белков шаперонной системы входят HSP70 (Heat shock protein 70), HSP90 (Heat shock protein 90) и HSP40 (Heat shock protein 40). Эти белки принимают активное участие в системе контроля качества белка, куда входит сопровождение белка на пути фолдинга, распознавание аберрантной конформации белков и направление их на деградацию. Помимо этого, HSP70 и HSP40 участвуют в дезагрегации белковых агрегатов [30]. Суммируя перечисленные функции шаперонов, не

удивительно, что научное сообщество видит перспективы их использования в терапевтических целях. Терапевтический эффект использования индукторов синтеза шаперонов был показан для полиглутаминовых заболеваний, обусловленных агрегированием мутантных белков с увеличенным количеством полиглутаминовых повторов в аминокислотной последовательности, таких как спиноцеребеллярная атаксия, болезнь Хантингтона, спинально-бульбарная амиотрофия [87]. Положительное действие HSP70 было продемонстрировано на моделях болезни Паркинсона и для амиотрофического латерального склероза [41, 196], также обусловленных образованием патогенных белковых агрегатов. Применение индукторов синтеза HSP70 и HSP40 показало положительный эффект и на моделях болезни Альцгеймера и ЧМТ [81], однако все используемые в этих случаях соединения осуществляют индукцию синтеза шаперонов за счёт ингибирования HSP90 или HSP70, что, вероятно, может снижать эффективность работы шаперонного аппарата и, соответственно, самой терапии, либо вызывают протеотоксический стресс. От коллег из Уральского федерального университета наша лаборатория получила в распоряжение группу соединений (производные пирролилазина) потенциально способных индуцировать синтез шаперонов через активацию транскрипционного фактора HSF1 (Heat shock factor 1), регулирующего экспрессию генов белков теплового шока. В данной работе планировалось проверить терапевтический потенциал этого класса веществ на моделях БА и ЧМТ.

Цели и задачи исследования

Цель: Поиск соединений из класса производных пирролилазина, способных вызывать накопление шаперонов в нервных клетках и их апробация в качестве терапевтических агентов после ЧМТ и при БА

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести скрининг соединений из группы производных пирролилазина и оценить их способность вызывать накопление шаперонов в клетках мозга;

2. Оценить нейропротекторное действие ряда соединений из группы производных пирролилазина на моделях ЧМТ in vitro и in vivo;

3. Апробировать соединения из группы производных пирролилазина на in vitro модели болезни Альцгеймера;

4. Оценить терапевтический потенциал соединений из группы пирролилазинов на трансгенных мышах линии 5XFAD, моделирующей болезнь Альцгеймера;

5. Изучить механизм индукции синтеза шаперонов производными пирролилазина в нейрональных клетках.

Научная новизна исследования

В ходе скрининга группы соединений было обнаружено несколько новых индукторов синтеза шаперонов, способных увеличивать количество HSP70 и HSP90 в клетках. Полулетальная концентрация этих соединений составляла более 400 мкМ на дифференцированных в нейрональном направлении клетках, что предполагает их безопасность при терапевтическом применении. Помимо этого, обнаруженные соединения оказывали терапевтический эффект на in vitro и in vivo моделях черепно-мозговой травмы и болезни Альцгеймера. Более того, нами был открыт ранее не показанный в литературе механизм индукции шаперонов обнаруженными соединениями

Научная и практическая значимость работы

Ряд соединений из группы производных пирролилазина оказались способны блокировать развитие первичных и вторичных повреждений после ЧМТ, а также снижали интенсивность нейродегенеративных процессов при БА. Особенно важно, что в процессе оптимизации по фармакокинетическим

параметрам было подобрано соединение, отвечающее всем характеристикам фармакологического средства, а также способное демонстрировать терапевтический потенциал в условиях физиологического старения. Помимо этого, нами был показан механизм индукции шаперонов новыми соединениями. В отличие от большинства существующих индукторов синтеза шаперонов, изученные соединения из группы производных пирролилазина способствуют накоплению этих белков, не вызывая протеотоксический стресс и не ингибируя ЖР90 и ЖР70, что, по нашему мнению, позволит увеличить эффективность терапии по сравнению с известными на данный момент индукторами синтеза шаперонов. Результаты данного исследования являются фундаментом для разработки новых лекарственных средств, направленных на борьбу с нейродегенеративными состояниями.

Положения, выносимые на защиту

1. Соединения Р0-29, 1А-47, ЕА-3, 10-378 и 1А-50 из группы производных пирролилазина способны повышать уровень шаперонов в клетках нейронального фенотипа;

2. Исследуемые соединения защищают нейроны от гибели и блокируют развитие когнитивной дисфункции у крыс при болезни Альцгеймера, а также уменьшают интенсивность вторичных повреждений после ЧМТ и способствуют реабилитации после травмы;

3. Один из возможных механизмов индукции синтеза шаперонов заключается в ингибировании изученными соединениями из группы производных пирролилазина киназной активности СК2 в отношении транскрипционного фактора HSF1.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Индукторы синтеза шаперонов из класса пирролилазинов в качестве нейропротекторов для купирования нейродегенеративных процессов»

Апробация работы

Результаты, полученные в ходе исследования, были заслушаны на

следующих выступлениях:

1. На Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2021», Москва, 17 апреля 2021 г.

2. На III объединенном научном форуме, Сочи, 6 октября 2022 г.

3. На Международной научной студенческой конференции, Новосибирск, 18 апреля 2024 г.

4. На всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Учение академика И.П. Павлова в современной системе нейронаук», Санкт-Петербург, 18 сентября 2024 года

Список публикаций по теме исследования

По теме диссертации опубликовано 11 работ, из них 7 - статьи, 4 -тезисы.

Статьи:

1. Лазарев В.Ф., Дутышева Е.А., Тресцова М.А., Микеладзе М.А., Утепова И.А., Чупахин О.Н., Гужова И.В., Маргулис Б.А. Испытание нового индуктора белков теплового шока в клеточной модели реакции на черепно-мозговую травму // Цитология. 2019. № 9 (61). C. 713-718.

2. Dutysheva E.A., Mikeladze M.A.; Trestsova M.A.; Aksenov N.D.; Utepova I.A.; Mikhaylova E.R.; Suezov R.V.; Charushin V.N.; Chupakhin O.N.; Guzhova I.V.; Margulis B.A.; Lazarev V.F. Pyrrolylquinoxaline-2-One Derivative as a Potent Therapeutic Factor for Brain Trauma Rehabilitation // Pharmaceutics. 2020. № 5 (12). C. 414.

3. Dutysheva E.A., Utepova I.A., Trestsova M.A., Anisimov A.S., Charushin V.N., Chupakhin O.N., Margulis B.A., Guzhova I.V., Lazarev V.F. Synthesis and approbation of new neuroprotective chemicals of pyrrolyl- and indolylazine classes in a cell model of Alzheimer's disease // European Journal of Medicinal Chemistry. 2021. (222). C. 113577.

4. Dutysheva E.A., Utepova I. A., Trestsova M. A., Anisimov A. S., Charushin V. N., Chupakhin O. N., Margulis B. A., Guzhova I. V., Lazarev V. F. Dataset of NMR-spectra pyrrolyl- and indolylazines and evidence of their ability to induce heat shock genes expression in human neurons // Data in brief. 2021. (39).

5. Lazarev V.F., Dutysheva E.A., Mikhaylova E.R., Trestsova M.A., Utepova I.A., Chupakhin O.N., Margulis B.A., Guzhova I.V. Indolylazine Derivative Induces Chaperone Expression in Aged Neural Cells and Prevents the Progression of Alzheimer's Disease // Molecules. 2022. № 24 (27). C. 8950.

6. Dutysheva E.A., Mikhaylova E.R., Trestsova M.A., Andreev A.I., Apushkin D.Y., Utepova I.A., Serebrennikova P.O., Akhremenko E.A., Aksenov N.D., Bon' E.I., Zimatkin S.M., Chupakhin O.N., Margulis B.A., Guzhova I.V., Lazarev V.F. Combination of a Chaperone Synthesis Inducer and an Inhibitor of GAPDH Aggregation for Rehabilitation after Traumatic Brain Injury: A Pilot Study // Pharmaceutics. 2022. № 1 (15).

7. Lazarev V.F., Dutysheva E.A., Kanunikov I.E., Guzhova I.V., Margulis B.A. Protein Interactome of Amyloid-P as a Therapeutic Target // Pharmaceuticals 2023, Vol. 16, Page 312. 2023. № 2 (16). C. 312.

Тезисы:

1. Дутышева Е.А. Активация синтеза цитопротекторного белка-регулятора протеостаза - эффективный подход для лечения болезни Альцгеймера. Материалы Международного молодёжного научного форума «Ломоносов-2021» [Электронный ресурс] - М.:МАКС Пресс, 2021.

2. Дутышева Е.А., Тресцова М.А., Аксёнов Н.Д., Утепова И.А., Чарушин В.Н., Чупахин О.Н., Гужова И.В., Маргулис Б.А., Лазарев В.Ф. Применение нового активатора многофункционального цитопротекторного белка HSP70 в качестве подхода для лечения болезни Альцгеймера. В книге: III объединённый научный форум. VII съезд физиологов СНГ. VII съезд биохимиков России. X российский симпозиум «Белки и пептиды». Научные труды. Союз физиологических обществ стран СНГ. Российское общество

биохимиков и молекулярных биологов. Acta Naturae. Спецвыпуск, т. 2, 2021. С. 231.

3. Дутышева Е.А. Производное пирролилазина способно индуцировать синтез шаперонов в условиях клеточного старения in vitro и препятствовать развитию болезни Альцгеймера на модели in vivo. Биология. Медицина. Психология: Материалы 62-й Междунар. науч. студ. конф. 17-23 апреля 2024 г./Новосибирск: ИПЦ НГУ, 2024. С. 93.

4. Дутышева Е.А. Применение производных индолилазина, способных повышать уровень шаперонов в стареющих нейронах, для блокирования прогрессии болезни Альцгеймера. Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием "Учение академика И. П. Павлова в современной системе нейронаук", посвященная 175-летию со дня рождения академика И. П. Павлова и 120-летию со дня вручения академику И. П. Павлову Нобелевской премии: сборник тезисов докладов / под науч. ред. Абдурасуловой И.Н. - Санкт-Петербург: ИЭМ, 2024. С. 246 - 247.

Финансовая поддержка диссертации

Исследование было выполнено при финансовой поддержке грантов Российского научного фонда № 23-74-10117 и № 18-74-10087, программы министерства образования и науки «Фундаментальные исследования нейродегенеративных заболеваний с позиции трансляционной медицины»

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит следующие разделы: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы», «Благодарности», и изложена на 127 страницах и проиллюстрирована 18 рисунками и 4 таблицами.

Личный вклад автора

Все основные результаты исследования были получены лично автором. Постановка задач и планирование экспериментов исследования осуществлялись под руководством научного руководителя Лазарева В.Ф.

Все эксперименты, связанные с клеточными культурами и определением их жизнеспособности, проводил автор. Определение активности каспазы-3 проводилось совместно с Лазаревым В.Ф. Получение данных проточной цитофлуориметрии проводилось при участии Аксёнова Н.Д. Данные анализа библиотеки соединений с помощью репортерной системы были получены совместно с Михайловой Е.Р.

Автор лично участвовал в экспериментальной части работы, связанной с животными. Поведенческие тесты проводились совместно с Михайловой Е.Р., Микеладзе М.А, Рыкуновой Е. и Сахаровым А.А.

Данные, связанные с компьютерным предсказанием взаимодействий соединений с белковыми молекулами, а также предсказание сайта связывания низкомолекулярных соединений с CK2 были получены автором лично. Совместно с Анисимовым А.С. были получены данные фармакокинетических свойств соединений.

Обращенно-фазовая жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией проводилась совместно с коллегами из Уральского федерального университета.

1. Обзор литературы

1.1 Общая характеристика ЧМТ

Черепно-мозговая травма - это нарушение нормальной структуры и функционирования мозга посредством ударов, сотрясения или проникающих ранений [62]. Последствия ЧМТ включают в себя головокружение, головные боли, амнезию и тошноту, которые пациент может испытывать дни или недели после травмы, однако после тяжелых ЧМТ могут наблюдаться более длительные поведенческие, двигательные и когнитивные нарушения [73]. ЧМТ является одной из самых частых причин недееспособности среди трудоспособного населения, с частотой 400 случаев на 100 тыс. человек, причем треть случаев ЧМТ оказывается с летальным исходом [200, 223]. Ежегодно в мире около 2,5 миллионов человек погибает вследствие ЧМТ, и половина смертей из этого числа происходит в первые два часа после травмы. Согласно данным Министерства здравоохранения, в России около 50 тысяч человек живут с инвалидностью после ЧМТ. Известно, что в момент физического воздействия наносится только часть неврологических повреждений, именуемых первичными повреждениями. Наносимый нервным тканям ущерб продолжает прогрессировать через минуты, часы и дни после травмирования, и такие процессы принято называть вторичными повреждениями [71].

1.2 Патофизиология черепно-мозговой травмы

ЧМТ часто классифицируют по степени тяжести согласно шкале Глазго (лёгкая, средняя и тяжёлая), по анатомическим особенностям травмы, по сообщению с внешней средой (открытые, закрытые) [201]. Легкую ЧМТ также часто называют сотрясением мозга. В этом случае пациент находится в

сознании, к испытываемым симптомам относится потеря ориентации, головные боли, проблемы с фокусировкой внимания. Средняя тяжесть ЧМТ характеризуется летаргическим состоянием, открытием глаз при воздействии стимула, что сопровождается отеком мозга и кровотечением. При тяжёлой форме ЧМТ пациент находится в коме, глаза не отвечают на стимулы [148]. Однако не существует такой однозначной классификации относительно механизмов, относящихся к первичным и вторичным повреждениям, так как ЧМТ гетерогенна по своей природе. При ЧМТ источником первичного повреждения нормального клеточного функционирования в тканях мозга становится воздействие прямых, ротационных и режущих сил [23]. К основным первичным повреждениям, сопровождающим ЧМТ, можно отнести механическое разрушение тканей и некротическую гибель клеток, разрушение гематоэнцефалического барьера (ГЭБ), разрыв аксонов, изменение притока крови к мозгу и отёк [227].

Ротационные воздействия приводят к разрыву аксонов белого вещества мозга, что вызывает локальный отёк и, как следствие, замедление передачи сигнала [23]. В более тяжелых случаях травма может вызывать внутреннее кровоизлияние в эпидуральные, субдуральные, субарахноидальные и интравентрикулярные пространства, опосредующие изменения в церебральной перфузии и внутричерепном давлении. Биохимические, клеточные и физиологические процессы, сопровождающие первичные повреждения, зачастую развиваются во вторичные повреждения, к которым можно отнести эксайтотоксичность, митохондриальную дисфункцию, окислительный стресс, переокисление липидов, нейровоспаление и токсичные экзогенные белковые агрегаты [181]. В результате действия вторичных повреждений погибают клетки нервной ткани, которые не были подвержены механическому травматическому воздействию (Рис.1).

1.2.1 Эксайтотоксичность

Вопрос о том, что запускает изначальный выброс нейромедиаторов после травмы, остаётся спорным. Согласно одной теории, интенсивный выброс глутамата, вызываемый ЧМТ, происходит из-за нарушения целостности ГЭБ [25]. Однако есть авторы, которые полагают, что эксайтотоксичность появляется в результате механического разрушения клеток в момент травмы, а также как следствие дисфункции нервных тканей из-за метаболического сбоя и гипоксии, вызванных разрывом сосудов и капилляров [125]. Глутамат, наряду с различными его метаболитами, связывается с глутаматными рецепторами NMDA (The N-methyl-D-aspartate) и AMPA (Glutamatergic a-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid), отвечающими за транспорт ионов Na2+, K+ и Ca2+ через мембрану, и активирует их [145, 218]. Есть данные о том, что NMDAR характерна механочувствительность, заключающаяся в изменении активности субъединиц в ответ на механический стимул [214]. Избыточный выход глутамата в межклеточное пространство при ЧМТ запускает оверэкспрессию его рецепторов и нарушает ионный гомеостаз за счёт увеличенного притока №2+и Ca2+ в клетку [157]. Продолжительная активация клеткой мембранных насосов в попытке восстановить ионный гомеостаз ведет к быстрому потреблению глюкозы, истощению энергетических запасов, нарушениям в дыхательной цепи и ацидозу. Изменение осмотического давления приводит к набуханию клеток, а увеличение количества ионов натрия деполяризует нейрональную мембрану, в результате чего развивается цитотоксический отёк мозга [227]. Известно, что в развитии отёка мозга не последнюю роль играет белок аквапорин 4 (AQP4). ЧМТ стимулирует транслокацию в ядро различных транскрипционных факторов, связывающихся с промотором AQP4, и способствует индукции его синтеза [109].

Избыточное количество ионов Са2+ запускает множество сигнальных каскадов за счет активации таких молекул как Са2+/кальмодулин-зависимая протеин киназа 2, протеин киназа С, митоген-активируемые протеин киназы и белковые фосфатазы [65, 238]. Нарушение баланса Са2+ становится

переломным моментом, запускающим каскад вторичных повреждений при ЧМТ, приводящих к отложенной гибели нервной ткани.

1.2.2 Окислительный стресс

Активные формы кислорода (АФК) - крайне реактивные молекулы, обуславливающие патологию вторичных повреждений после ЧМТ посредством механизмов окислительного стресса [197]. Одним из таких механизмов является активация Са2+-зависимых NO-синтетаз и фосфолипаз, опосредующих продукцию реактивных форм азота и кислорода [250]. В результате нормального метаболизма выделяется О2-, который превращается в пероксид водорода. Н202, в свою очередь, служит источником гидроксильного радикала, который является одним из самых реакционноспособных химических групп. При соединении гидроксильного радикала с нитрит-ионом образуется ещё более агрессивный окислитель - пероксинитрит. Реактивные формы кислорода и азота вызывают обширные повреждения из-за своей способности индуцировать патологические окислительные изменения в липидах, белках, ДНК, мембранных структурах и митохондриях [149].

1.2.3 Дисфункция митохондрий

Нарушение функций митохондрий является определяющим событием среди вторичных повреждений после ЧМТ, которое становится причиной физиологического и метаболического сбоя в работе нервных тканей, приводящего к клеточной гибели. Переокисление липидов клеточной мембраны митохондрии в результате действия активных форм кислорода ведёт к её дезинтеграции и увеличению проницаемости [38]. Избыточное количество цитоплазматического кальция может активировать кальций-активируемые проницаемые временные поры (РТР) митохондрий, что приводит к деполяризации мембраны митохондрии, продукции АФК,

коллапсу дыхательной цепи, окислительного фосфорилирования и метаболической функции митохондрий в целом. АФК могут провоцировать разрыв мембран митохондрий и выход цитохрома С, запускающего сборку апоптосом, в цитоплазматическое пространство. В этот комплекс, кроме самого цитохрома С, входят белки Apaf-1 (Apoptosis Protease Activating Factor-1) и каспаза-9. Этот комплекс реализует митохондриальный сигнальный путь апоптоза через активацию цистеиновой протеазы каспазы-3. Доказано, что после ЧМТ наблюдается ингибирование активации цитопротекторного сигнального каскада протеинкиназы В, обеспечивающего выживание клеток путём ингибирования апоптоза [61].

1.2.4 Нейровоспаление

Немедленным ответом мозга на кровоизлияние является активация микроглии, сопровождающаяся инфильтрацией лейкоцитов из периферии через разрушенный гематоэнцефалический барьер или трансэпителиальную миграцию и диапедез [91, 131]. Воспалительный ответ после ЧМТ зависит от выброса провоспалительных цитокинов, таких как фактор некроза опухоли (tumor necrosis factor - TNF), интерлейкин-1 и интерлейкин-6, а также от усиленной экспрессии молекул клеточной адгезии, например, ICAM-1 (InterCellular Adhesion Molecule 1) [84]. Оценка СМЖ и тканей мозга пациентов после ЧМТ, а также модельных грызунов продемонстрировала наличие полиядерных лейкоцитов и таких цитокинов, как интерлейкин-1р, интерлейкин-6 и TNFa через 1 день после травмы. Помимо этого, поврежденный эндотелий паренхимы в течение первого дня после травмы активно синтезирует адгезины, такие как ICAM-1 и VCAM-1, рекрутирующие лейкоциты из периферии в сайт повреждения. [249]. Привлеченные лейкоциты могут стимулировать дальнейшее нарушение целостности ГЭБ за счёт генерации АФК, активации протеолитических ферментов и секреции цитокинов и хемокинов. [29, 247]. В зависимости от соотношения про- и

противовоспалительных сигналов иммунный ответ может как поспособствовать восстановлению после травмы, так и вызвать дальнейшее повреждение нервной ткани [105].

1.2.5 Агрегация белков

В условиях окислительного стресса и метаболического коллапса после ЧМТ очень высок риск появления аберрантных белков, склонных к агрегированию, обуславливающих отложенное во времени развитие симптоматики, схожей с наиболее распространенными нейродегенеративными заболеваниями [251].

Накопление амилоидного белка-предшественника (APP - amyloid precursor protein) и р-амилоида в острой фазе после ЧМТ подтверждается на экспериментальных моделях и исследованиями клинических случаев и может быть объяснено нарушением внутриклеточного транспорта, вызванного снижением количества моторных белков, например, кинезина-1 [101, 150]. В последующий период после травмы, который может длиться до нескольких десятков лет, происходит аккумуляция амилоидного пептида в амилоидные бляшки. Исследования тканей мозга пациентов с тяжёлой формой ЧМТ продемонстрировали, что в 30% случаев наблюдается наличие Р-амилоидных бляшек [106].

Было показано, что у пациентов со средней и тяжелой формой ЧМТ, в СМЖ и аксонах обнаруживается агрегированный а-синуклеин, который считается основной причиной дегенерации дофаминергических нейронов при болезни Паркинсона. Даже через 60 дней после травмы в области повреждения, согласно исследованию, наблюдается значительное увеличение уровня а-синуклеина, коррелирующее с потерей дофаминергических нейронов и увеличением MHCII-положительных клеток микроглии, негативно влияющей на популяцию нейронов [198].

Рисунок 1. Патофизиологические механизмы первичных и вторичных повреждений после ЧМТ [174].

Ещё одним белком, аберрантная конформация и агрегация которого тесно связана с прогрессией нейродегенеративных патологий, является гликолитический белок глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (ГАФД). Активная форма фермента представляет собой тетрамер, состоящий из 4 идентичных субъединиц, каждая из которых содержит активный центр с СуБ149 [215]. При стрессовом воздействие, например, окислительном стрессе, происходит диссоциация фермента на мономеры и димеры. В этом состоянии субъединицы склонны олигомеризоваться и агрегировать. При этом центральную роль в этом процессе играют цистеины активных центров, между которыми образуются дисульфидные связи, что сопровождается изменением конформации молекулы. Такая конформация белка приводит к образованию амилоидоподобных фибрилл за счёт формирования дисульфидных связей, в чём активное участие принимает Cys149 [170].

В нашей лаборатории было показано, что экзогенная ГАФД способна проникать в клетки нейробластомы человека SH-SY5Y, образовывать внутриклеточные агрегаты и инициировать апоптоз. Также наши исследования продемонстрировали, что СМЖ крыс после ЧМТ содержит агрегаты ГАФД и токсична для нейрональных клеток. При этом удаление экзогенных агрегатов ГАФД значительно снизило СМЖ-опосредованную гибель нейронов, а интракраниальное введение антител против ГАФД крысам после ЧМТ и оральное применение производного гидрокортизона, блокирующего экзогенную ГАФД, предупредило развитие ЧМТ-опосредованного двигательного дефицита [127].

Для демонстрации комплексности вторичных повреждений и сложности взаимосвязей молекулярных взаимодействий внутри них, можно рассмотреть последствия такого первичного повреждения, как разрыв аксонов. Из-за нарушения целостности мембраны нейронов происходит утечка К+, опосредованная этим деполяризация мембраны вызывает неконтролируемый приток Са2+. Ишемия тоже приводит к деполяризации мембраны нейронов, только путём недостатка АТФ и отключения АТФ-зависимых ионных насосов [71]. Увеличение цитоплазматической концентрации Са2+, особенно в условиях невозможности вывести его из клетки или заключить в депо, становится переломной точкой вторичных повреждений, когда запускается вышеописанное Са2+-зависимое нарушение функционирования клетки. Всё это приводит не только к выделению глутамата, активирующему приток Са2+ в соседние нейроны, но и к гибели, как апоптотической, так и АТФ-независимой некротической, опосредующей воспалительный ответ, который, в свою очередь, в условиях избыточных воспалительных сигналов, может также оказывать травмирующее воздействие на нервную ткань, ещё больше усугубляя повреждение. Вышеперечисленные стрессорные воздействия в сумме инициируют протеотоксический стресс и образование токсичных белковых агрегатов, а также их выход в межклеточное пространство и

распространение нейродегенерации в отдаленные от очага механического воздействия после ЧМТ области мозга.

1.3 Современные подходы к диагностике и лечению ЧМТ

Шкала комы Глазго - наиболее распространённая шкала оценки тяжести ЧМТ, с помощью которой оценивают уровень нарушения сознания по шкале от 3 до 15. При оценке учитывается речевая и двигательная реакция, а также реакция открытия глаз в ответ на различные стимулы. Было установлено, что оценка 13 и выше характеризует лёгкую ЧМТ, от 9 до 12 соответствует средней травме, 8 баллов и ниже присваиваются пациенту с тяжёлой степенью ЧМТ [61]. На основе результатов оценки выбирают тактику оказания медицинской помощи, следующей за неотложной в виде восстановления дыхания и циркуляции. В качестве дальнейших мер необходимо проводить полное неврологическое обследование и компьютерную томографию головы, необходимую для обнаружения внутричерепных патологий, требующих хирургического вмешательства, например, нарушения целостности черепа, субдуральной гематомы, внутрижелудочкового кровоизлияния. Важно также постоянно контролировать внутричерепное давление и оксигенацию мозга [194]. Специальная техника магнитно-резонансной томографии, называемая диффузионная спектральная томография, может выявлять повреждение белого вещества, то есть разрыв аксонов.

Последующее медицинское вмешательство сосредотачивается на устранении различных клинических последствий ЧМТ. Например, посттравматическая гидроцефалия решается путём установки вентрикулоперитонеального шунта; для предотвращения эпилептических припадков назначают антиэпилептические препараты сразу же после поступления пациента. Также после травмы зачастую проявляются нейропсихиатрические расстройства, такие как депрессия, паранойя, психозы, агрессия, с которыми борятся с помощью селективных ингибиторов обратного

захвата серотонина, антипсихотиков, антидепрессантов, антиаритмических препаратов и бета-блокаторов [244].

Несмотря на профессиональную медицинскую помощь, после госпитализации почти в 50% случаев у пациентов с ЧМТ наблюдается ухудшение состояния [188]. Причина может заключаться в том, что в современной практике терапия после ЧМТ фокусируется в основном на первичных повреждениях. На данный момент ведется разработка многих препаратов, принцип действия которых основан на блокировании механизмов вторичных повреждений после ЧМТ. Одни из первых исследований были направлены на блокирование токсического распространения глутамата. Шонами и коллеги показали, что дексанабинол способен снижать NMDAR-опосредованную эксайтотоксичность, уменьшать отёк мозга и участвовать в восстановлении ГЭБ, и в настоящее время соединение прошло III фазу клинических испытаний (КСТ00129857) [210].

Активно изучается использование блокаторов кальциевых каналов для ингибирования чрезмерного притока кальция в цитозоль, который опосредует эксайтотоксичность при ЧМТ. Было обнаружено, что нимодипин, являющийся антагонистом потенциал-зависимых каналов L-типа, оказывает терапевтический эффект на крыс с дисфункцией памяти, однако в клинических испытаниях было обнаружено гипотензивное свойство соединения [167].

Посттравматические повреждения мозга, связанные с действием окислительного стресса, могут быть уменьшены за счёт антиоксидантов, обезвреживающих свободные радикалы. Исследования показали, что циклоспорин А, успешно прошедший II фазу клинических испытаний, может останавливать переокисление липидов, а также блокировать РТР на моделях фокальной и диффузной ЧМТ, за счёт чего значительно тормозится развитие нейропаталогии. [113, 152]. Различные группы ученых также разрабатывают подходы к терапии ЧМТ, основанные на регулировании иммунного ответа и блокировании путей апоптоза, например, за счёт снижения уровня ^-6, !Ь-1р

и Т№а и увеличения количества Вс1-Х [253]. Многие из терапевтических средств, основанных на блокировании механизмов вторичных повреждений после ЧМТ, находятся на разных стадиях клинический испытаний, тем не менее поиск терапии только набирает обороты. Сложный гетерогенный патогенез ЧМТ накладывает дополнительные требования к препарату, предназначенному для лечения последствий травмы, а именно: необходимо, чтобы препарат мог блокировать максимальное большое количество механизмов вторичных повреждений, оставаясь при этом безопасным для организма.

1.4 Этиология, эпидемиология и симптоматическая картина болезни

Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера - комплексное, прогрессирующее и необратимое нейродегенеративное заболевание, являющееся главной причиной деменции в пожилом возрасте. К факторам риска БА относится как генетический фактор, так и влияние окружающей среды, однако главным фактором риска является возраст, так как это заболевание диагностируется по большей части у людей старше 60 лет [6]. БА является одним из самых распространенных нейродегенеративных заболеваний - в настоящий момент считается, что этим недугом страдает более чем 40 миллионов человек в мире, по официальным расчётам международной федерации ассоциаций по борьбе с болезнью Альцгеймера во всех странах мира эта цифра увеличится до 100 миллионов человек к 2050 году [5]. Прогнозы для пациентов с БА неутешительны: продолжительность жизни после постановки диагноза составляет в среднем 6 лет [205].

Клинические симптомы БА включают прогрессирующее ухудшение памяти и проблемы в выполнении бытовых задач. На ранних стадиях у пациентов наблюдается изменения в поведении и речи, проблемы с кратковременной памятью. Помимо этого, около 25% процентов больных с

ранней формой БА испытывают симптомы депрессии и частые изменения в настроении. При позднем течении заболевания у больных наблюдается серьезная потеря памяти наряду с галлюцинациями, дезориентацией и отсутствием самостоятельности, встречаются случаи гибели вследствие респираторного синдрома, инфекции или истощения [205].

Болезнь Альцгеймера может быть классифицирована на два типа: спорадическая и аутосомно-доминантная (семейная). Спорадическая форма характерна для людей в возрастной группе 65+ и часто носит название болезни Альцгеймера с поздним началом. Согласно современным данным генетические факторы не играют первостепенную роль в её развитии [185]. Аутосомно-доминантная форма БА или болезнь Альцгеймера с ранним началом возникает в возрасте от 30-ти до 65-ти лет и обусловлена наличием редких мутаций в генах АРР, пресенилина-1 (PSEN1) и пресенилина-2 (Р8БК2) [205]. Большинство случаев БА носят спорадический характер, и их развитие провоцируют по большей части факторы окружающей среды, однако имеет место и влияние генетических факторов, например 4 аллели гена АРОЕ, кодирующего алипопротеин Е4 (АроЕ4), и эпигенетических факторов [132].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Дутышева Елизавета Александровна, 2025 год

источник номер ое

получения разведение

ГАФД Мышь ab8245 Abcam, Великобритания 1:1000

HSP70 Мышь Гибридома 2B11 Мюнхенский технический университет, Германия 1:2

HSP90 Мышь MA1-10372 Thermo Fisher, США 1:1000

CK2 Кролик 2656 Cell Signaling, США 1:1000

а-тубулин Крыса ma1-80017 Thermo Fisher, США 1:1000

HSF-1 Кролик 4356 Cell Signaling, США 1:1000

Таблица 2. Антитела, использованные при Вестерн-блот анализе.

2.16 Иммунопреципитация

Чтобы подтвердить взаимодействие между молекулами HSF1 и CK2 в клетках, был применен метод иммунопреципитации. После инкубации мезенхимальных стволовых клеток человека, дифференцированных в нейрональном направлении, c соединениями, их поместили в буфер, состоящий из 150 мМ NaCl, 1% NP-40, 50 мМ Tris-HCl pH 8.0, и подвергли обработке ультразвуком. Далее была определена концентрация белков в растворе по методу Брэдфорда [19], и по 600 мкг из каждой пробы смешивали с антителами к фосфосубстрату СК2 (CellSignaling, США) в концентрации 5 мкг/мл и инкубировали 2 часа на 4°С, после чего добавляли 20 мкл Protein A сефарозы (Cytiva, США). Далее происходила промывка PBS, и сефарозу добавляли к буферу, содержащему 50 мМ Tris-HCl pH 6.8, 2% SDS, 10% глицерол, 0,1% бромфеноловый синий, нагревали в течение 10 минут на 100°С и подвергали процедуре ПААГ электрофореза и Вестерн блоттинга. Далее по стандартной процедуре проводили гибридизацию с антителами к HSF1 (Таб. 2) с последующей гибридизацией со вторичными антителами с пероксидазной меткой и визуализацией с помощью метода усиленной хемилюминесценции.

2.17 DARTS (Drug affinity responsive target stability)

Для доказательства межмолекулярного взаимодействия СК2 с соединениями из группы производных пирролилазина был применён метод DARTS (Drug affinity responsive target stability). Он заключается в том, что при связывании белка с низкомолекулярным соединением белковая молекула стабилизируется и становится более устойчивой к протеолизу [138]. 5 мкг очищенной рекомбинантной СК2 инкубировали в 20 мкл буфера (50 мМ Tris HCl, pH 8.0, 50 мМ NaCl, и 10 мМ CaCl2) в течение 2 часов инкубировали с соединениями при 4°С, после чего раствор добавляли к трипсин-агарозе на 20 минут при комнатной температуре. После центрифугирования, фракция

агарозы подвергалась Вестерн-блот анализу с гибридизацией с антителами к HSF1 (Таб. 2)

2.18 Обращенно-фазовая жидкостная хроматография в сочетании с масс-

спектрометрией

Способность соединений проникать через гематоэнцефалический барьер была изучена с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией (ВЭЖХ-МС). Зафиксированные 4% параформальдегидом образцы мозга и гиппокампа крыс, изъятые после внутрибрюшинных инъекций соединений, растворяли в 400 мкл ацетонитрила, вортексировали и центрифугировали 10 минут на 10 тыс. об/мин. Затем супернатант подвергали хромато-масс-спектрометрической характеристике режиме ВЭЖХ-МС, что включало определение их индексов удерживания и регистрацию масс-спектров с ионизацией электрораспылением при детектировании положительно заряженных ионов.

2.19 In silico анализ

Предсказание фармакокинетических свойств соединений проводилось с помощью сервиса SwissADME (www. swissadme.ch), разработанного швейцарским Институтом биоинформатики, и включало предсказание растворимости, кишечной адсорбции и проницаемости через ГЭБ [42]. Набор инструментов SwissADME включает набор моделей, позволяющих определить возможность изучаемых малых молекул обладать фармакокинетическим потенциалом. Близость соединений к лекарствам по их физико-химическим качествам определялась на основании параметров Липински, включающих молекулярный вес, количество акцепторов и доноров водородных связей и коэффициент распределения октанол/вода. Сервис PASS (www.way2drug.com/passtargets) был использован для предсказания мишеней соединений, комплекс с которыми обладает потенциалом биологической

активности [190]. Для этого структурные формулы загружали в PASS, результаты предсказаний ранжировались по параметру Confidence, который отражает соотношение возможности и невозможности соединения взаимодействовать с белком. Для того чтобы определить наиболее вероятный сайт взаимодействия соединений с CK2, был использован веб-сервис молекулярного докинга SwissDock (www. swissdock.ch), разработанный швейцарским Институтом биоинформатики [80]. MOL2 файлы, содержащие информацию о 3D структурах молекул соединений, были загружены в сервис, после чего происходило вычисление сайтов взаимодействия соединения с кристаллическими структурами белков и константы диссоциации этого комплекса со всеми сайтами взаимодействий.

2.20 Статистика

Значения сравнивали с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни, используя программное обеспечения MicroSoft Excell, Statgraphics и GraphPad Prism. Статистическую значимость определяли при p < 0,05.

3. Результаты

3.1 Выявленное с помощью скрининга пирролил-подобных соединений РО-29 способно вызывать накопление шаперонов в клетках

В поисках нового индуктора синтеза шаперонов наша лаборатория обратилась к коллегам из Уральского федерального университета, которые предоставили коллекцию новых соединений. Из коллекции были отобраны те, чьи молекулы имели сходство с пирролил-подобным фармакофорным центром, демонстрирующим высокую биологическую активность и представленным в ряде фармакологических средств (противоопухолевый препарат Вариолин Б [213], ноотропный препарат Мериолин 2 [52], блокатор альфа-адренорецепторов Ницерголин [246], ингибитор

сериновых/треониновых фосфатаз Драгмицидин Е [236]. Для скрининга коллекции была использована репортерная система, основанная на клетках глиомы крысы С6, несущих ген люциферазы под контролем промотора генов белков теплового шока. Уровень люминесценции позволяет судить об эффекте соединения на транскрипцию генов белков теплового шока (Рис. 7А). Согласно результатам скрининга, среди всех соединений 3-(5-фенил-1Н-пиррол-2-ил)хиноксалин-2(1Н)-он (PQ-29), чья формула обозначена на рис.7В, способен наиболее эффективно активировать экспрессию гена люциферазы (Рис. 7Б). Для дополнительного подтверждения способности PQ-29 активировать HSF1 клетки глиомы крысы С6 через час после нанесения PQ-29 были лизированы и подвергнуты ПААГ-электрофорезу в неденатурирующих условиях с последующим Вестерн-блот анализом. С помощью гибридизации с антителами против HSF1 было установлено, что соединение запускает тримеризацию транскрипционного фактора (Рис. 7Г), что свидетельствует о его активации.

Чтобы проверить, вызывает ли соединение в действительности увеличение экспрессии генов шаперонов и накопление самих белков на

примере ШР70, после инкубации с PQ-29 была проведена ПЦР в реальном времени и ПААГ-электрофорез белков из лизатов клеток, культивировавшихся в присутствии PQ-29. Согласно полученным данным, количество мРНК И8р70 значительно увеличивалось через час после внесения РР-29, хотя и не достигло значения теплового шока (Рис. 7Д). Количество же белка в клетке через 24 часа возрастало в 5 раз по сравнению с контролем (Рис. 7Е). Подбор концентраций, использованных в описанных выше экспериментах, а также использованных в будущем, осуществлялся на основе анализа полулетальной концентрации соединения (Рис. 7Ж), полученной на основании данных о выживаемости клеток под воздействием PQ-29 при титровании от 0,01 до 200 мкМ с помощью метода оценки активности дегидрогеназ по Мосману.

Рисунок 7. Поиск и апробация нового индуктора синтеза шаперонов. А. Схема скрининга на основе репортерной системы, использующей в качестве мишени ген люциферазы, сшитый с HSE. Б. Результаты скрининга, демонстрирующие уровень люминесценции, соответствующий интенсивности активации HSE. Стрелкой отмечен PQ-29. В. Структурная формула PQ-29. Г. Анализ тримеризации HSF1 на С6. Д. Результаты Вестерн-блот анализа. Количественный уровень HSP70 увеличивается под воздействием PQ-29: тепловой шок представлен в качестве контроля индукции HSP70; окраска антителами к HSP70 2В11. В качестве контроля нагрузки используется ГАФД. Е. Данные ПЦР в реальном времени и нормализации интенсивности зон HSP70 по уровню ГАФД в С6. Ж. Данные полулетальной концентрации PQ-29, установленной методом оценки активности дегидрогеназ по Мосману. *p<0.05.

Таким образом, в результате скрининга группы соединений было отобрано лидерное соединение PQ-29, которое эффективно увеличивало уровень HSP70 в клетках глиомы крысы и имело низкую токсичность и, соответственно, удовлетворяло базовым требованиям к соединению для дальнейшей апробации в контексте реабилитации после ЧМТ.

3.2 Отработка модели вторичных повреждений после ЧМТ

Чтобы оценить нейропротекторное действие нового индуктора синтеза шаперонов при терапии вторичных повреждений после ЧМТ, необходимо было наладить клеточную и животную модель соответствующего патологического состояния. С целью моделирования вторичных повреждений in vitro мы производили забор СМЖ у крыс через большое затылочное отверстие спустя 1, 3 и 9 дней после травмы и инкубировали клетки глиомы крысы С6 с СМЖ и ДМЕМ/Р12 в соотношении 1:1 в системе xCelligence, позволяющей оценивать пролиферацию клеточной культуры на основании импеданса при прохождении электрического тока через культуральную среду

(клеточный индекс) (Рис. 8А). В результате СМЖ, собранная спустя день после травмы, по своему влиянию на пролиферацию С6 не отличалась от СМЖ крыс без ЧМТ, что подтверждает отложенный характер этого нейродегенеративного состояния. В свою очередь, клеточный индекс значительно падал при инкубации С6 с СМЖ, полученной через 3 дня после травмы (СМЖЧМТ), что свидетельствовало о том, что СМЖ, собранная через 3 дня после ЧМТ, обладает наибольшей токсичностью. Далее С6 инкубировали с СМЖЧМТ в течение 12, 24 и 48 часов, а после при помощи МТТ-теста оценивалась жизнеспособность клеточной популяции (Рис. 8Б). В результате оказалось, что активность дегидрогеназ уменьшалась с увеличением времени инкубации и достигла минимального значения 44 ± 1.3% через 48 часов, что говорит о значительном снижении метаболической активности клеток глиобластомы под действием СМЖЧМТ.

Чтобы определить, с чем связана токсичность СМЖчмт, мы провели анализ клеточной популяции с помощью окрашивания Апдехт V и Р1. В связи с тем, что фосфатидилсерин, с которым связывается Апдехт V - ранний маркер апоптоза, временные точки инкубации с СМЖ решено было перенести на 6, 12, 24 часа. Оказалось, что СМЖЧМТ вызывала апоптоз нейрональных клеток крысы, в то время как процент некротической гибели оставался сравнимым с контрольным (Рис. 8Г). Наибольшая разница в апоптотической гибели между клетками под воздействием СМЖчмт и СМЖ контрольных животных наблюдалась через 12 часов, где процент смерти возрос более, чем в два раза (Рис. 8В). Небольшой процент апоптотической гибели может быть объяснён тем, что высвобождение факторов, опосредующих вторичные повреждение в СМЖ, происходит не единомоментно, поэтому она не вызывает острой токсичности.

А 3.0

Рисунок 8. Отработка in vitro модели вторичного повреждения после ЧМТ. А. Данные оценки клеточного индекса С6 под действием СМЖЧМТ, собранных через 1,3 и 7 дней после травмы. График с СМЖк отражает клеточный индекс С6, инкубируемых с СМЖ животных без травмы. Б. Жизнеспособность клеток С6 после инкубации с СМЖ по результатам анализа активности дегидрогеназ по Мосману. В. Доля апоптотических клеток в популяции С6 после культивирования в присутствии СМЖ согласно результатам окраски Annexin V. Г. Результаты окрашивания Annexin V и PI клеток С6 после взаимодействия с СМЖ. Нижний левый сектор показывает долю PI-/Annexin V- клеток, верхний левый - PI+/Annexin V-, нижний правый -PI-/Annexin V+, верхний правый -PI+/Annexin V+. *p<0.05.

Для дальнейших экспериментов по моделированию вторичных повреждений после ЧМТ in vitro мы использовали СМЖ, собранную через 3 дня после травмы. Эффективность данной модели заключалась в провоцировании клеточной гибели, которая была подтверждена с помощью нескольких методов, а механизм вызываемой гибели определялся как апоптоз. Такая модель обеспечивала условия для проверки нейропротекторного действия нового индуктора синтеза шаперонов.

3.3 PQ-29 снижает гибель клеток С6, обусловленную действием СМЖ

после ЧМТ

На следующем этапе работы мы проверили, может ли PQ-29 защитить культуру клеток С6 от СМЖЧМТ-опосредованной токсичности. Для выполнения этой задачи мы определили диапазон концентраций соединения от 0,2 до 1 мкМ, основываясь на данных о полулетальной концентрации PQ-29, составляющей 10,2 мкМ (Рис. 7Ж). Далее клетки С6 инкубировали с СМЖчмт согласно отработанной ранее методике, после чего проводили оценку жизнеспособности клеток с помощью определения активности дегидрогеназ по Мосману, системы мониторинга состояния клеток xCelligence, а также окраской Annexin V. Результаты определения активности дегидрогеназ по Мосману показали увеличение выживаемости клеток С6 на 22,7% в случае инкубации с СМЖ травмированных животных совместно с максимальной концентрацией PQ-29 по сравнению с клетками, инкубированными только с СМЖЧМТ (Рис. 9 А). Сходные результаты были получены и при использовании системы мониторинга состояния клеток xCelligence. После 45 часов культивирования с СМЖ после ЧМТ и PQ-29 показатели пролиферативной способности С6 были в 1,5 раза выше, чем в отсутствие пирролилхиноксалина и сравнялись с показателями клеток, которые культивировали с СМЖ животных, не получивших травму (Рис 9Б). То, что снижение СМЖ-

опосредованной гибели при применении PQ-29 происходило за счёт ингибирования апоптоза, показывают данные окрашивания Аддехт V (Рис 9Г и Д). При добавлении пирролилхиноксалина доля апоптотических клеток в популяции снижалась более, чем в два раза с 14.58 ± 0.54% до 7.03 ± 0.72% (Рис. 9Г). Дополнительно мы оценили ферментативную активность каспазы-3 в клетках С6 в ответ на СМЖчмт и обнаружили, что спустя 6 часов инкубации активность фермента возрастала более чем в 2 раза. PQ-29 оказался способен снижать уровень активации протеолитического фермента до значений в клетках, культивируемых с СМЖ крыс без травмы (Рис. 9В), что дополнительно подтвердило механизм цитопротекторного действия PQ-29.

Канграл ь

iS.l&fc. Q.62K

Щ □ J5 %

1«* iif СМЖ^+0.2 мкМ PQ-29

°0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Time, h

8 50% 1 1 azs

Äs-/'-

ъ.

□б 57*. ' f 'Ь ъ. 80 58*. Р a.asn

Контроль OMSO СМЖ,

в

0,2 0,5 1

10* 1<f 10*

Hf I* Ii

»81% 1 (¡Э1Ь

ВВ60 J.76

смж^+о.бмкм pq-29

m" * \* I* »

7 83% 1.71%

/

Щ

ш 12.87%

if

СМЖ +1 HHMpQ-29

IF 10* 1<T iff

Аппент V AlexaFlour-647

у J? CMW-

G.2 0.5 1 жМ PQ-29

Рисунок 9. PQ-29 снижает апоптоз и увеличивает жизнеспособность С6 при культивировании с СМЖчмт. А. Результаты оценки жизнеспособности С6, культивируемых в присутствии СМЖЧМТ и PQ-29, полученные с помощью анализа активности дегидрогеназ по Мосману. DMSO представлен в качестве контроля токсичности PQ-29. Б. Данные клеточного индекса С6 при добавлении PQ-29 к СМЖЧМТ. В. Результаты оценки активности каспазы-3. Г. Доля апоптотических клеток в популяции С6 при культивации с СМЖЧМТ и PQ-29. Д. Результаты окрашивания Annexin V и PI клеток С6 после взаимодействия с СМЖ с добавлением PQ-29. Нижний левый сектор показывает долю PI-/Annexin V- клеток, верхний левый - PI+/Annexin V-, нижний правый -PI-/Annexin V+, верхний правый - PI+/Annexin V+. *p<0.05.

Таким образом, было показано, что PQ-29 способен защищать клетки глиомы крысы от гибели, вызываемой действием СМЖ-опосредованных вторичных повреждений после ЧМТ.

3.4 PQ-29 оказывает терапевтическое воздействие в in vivo модели ЧМТ

Дальнейшим шагом в работе стала проверка эффективности нейропротектерного действия нового индуктора синтеза шаперонов в терапии ЧМТ. С помощью Вестерн-блот анализа мы подтвердили накопление HSP70 в мозге крыс через 1 день после внутрибрюшинной инъекции PQ-29 (Рис. 10 А). Максимальный уровень шаперона наблюдался на 3-й день, а повышенный уровень сохранялся в течение 5 дней после введения соединения. После травмы животные были разделены на две группы: в одной группе крысы получали внутрибрюшинные инъекции PQ-29 (1 мг/кг) (n = 9), животные из другой группы терапии не получали (n = 10). В качестве токсикологического контроля PQ-29 некоторым крысам без ЧМТ также вводили инъекции PQ-29 (n = 9), также была группа крыс без ЧМТ, не получавшая терапии (n = 10). Спустя месяц после ЧМТ крысы были подвергнуты тесту «сужающаяся дорожка» для анализа двигательной функции задних и передних лап, а также «водному лабиринту Морриса» для анализа функции пространственной памяти, после чего был произведён забор спинномозговых жидкостей экспериментальных животных.

Согласно результатам теста «сужающаяся дорожка» животные, получившие терапию в виде PQ-29 после ЧМТ, совершали на 43% меньше ошибок, чем травмированные (Рис. 10Б). Из этого можно сделать вывод о снижении степени выраженности двигательного дефицита, обусловленного ЧМТ, после применения индукции синтеза HSP70 с помощью PQ-29. Данные «водного лабиринта Морриса» также демонстрировали терапевтический эффект PQ-29. Крысы с ЧМТ, получившие инъекции PQ-29 проводили на 25% больше времени в секторе, в котором ранее размещалась платформа, по

сравнению с животными без терапии (Рис. 10В). Что свидетельствует о способности РО-29 препятсвовать развитию нарушений памяти после травмы

а :

^ Кол-во дней после ^ инъекции РО-29

HSP70-+ ГДФД—►

И

OI О* £2-

Т

> • «

~г

7*

~г

- •

V

Т

Контроль PQ 29 растворитель PQ

чмт

ш

в

2 5-1

а

I'1

Sí 2.0г а

9? 1.54

11 1 II

Ш х 0 5-

i

iso-

100-

У У

* *

Ч- А«"

т

Контроль

PQ 29 Растворитель ЧМТ

Г"

»Q-29

Рисунок 10. PQ-29 оказывает терапевтическое действие на животной модели ЧМТ. А. Определение методом Вестерн-блот анализа количества HSP70 в мозге крыс 1, 3 и 5 дней после инъекции PQ-29. ГАФД используется в качестве контроля нагрузки. Б. Результаты оценки двигательной активности крыс с ЧМТ после терапии с применением PQ-29 (1 мг/кг) с помощью теста "сужающаяся дорожка". В. Результаты оценки функции памяти крыс с ЧМТ после терапии PQ-29 методом «водного лабиринта Морриса». Г. Результаты иммуногистологического исследования области CA1 гиппокампа крыс с ЧМТ после терапии PQ-29. Было использовано окрашивание по технике Tunnel, а также применялся краситель DAPI. На двух крайних столбцах представлены объединенные изображения с разным увеличением. Д. Количество клеток в изучаемой области, окрашенных DAPI, нормализованных на значение этого показателя в СА1 гиппокампа контрольной крысы. *p<0.05, *p<0.01.

Помимо этого, нами было проведено гистологическое исследование поля СА1 гиппокампа с целью оценки гибели нейронов. Область СА1 гиппокампа была выбрана, так как расположение нейронов в ней достаточно компактное, и сами нейроны образуют медиальные стенки боковых желудочков, а значит оказываются особенно близки к воздействию токсических факторов, находящихся в СМЖ после ЧМТ. Окрашивание гистологических срезов мозга с помощью метода Tunnel, позволяющего детектировать двунитевые разрывы ДНК, показало, что после ЧМТ большая часть пирамидальных нейронов гиппокампа оказалась положительно окрашенной, что может свидетельствовать о происходящих в них процессах клеточной гибели (Рис. 10Г). С другой стороны, значительно меньшее количество нейронов было окрашено в пирамидальном слое гиппокампа крыс, получивших после травмы инъекции PQ-29. Как результат, применение PQ-29 снизило атрофию нейронов в СА1 области после ЧМТ почти в два раза (Рис.

10Д)

Такими образом, мы доказали, что PQ-29 блокировало развитие

первичных повреждений после ЧМТ и появление в следствие них двигательного и когнитивного дефицита.

3.5 Применение PQ-29 блокирует запуск вторичных повреждений, обуславливающих гибель нейронов после ЧМТ крыс

Следующим этапом работы была проверка возможности защиты нейрональных клеток от вторичных повреждений после ЧМТ с помощью PQ-29. О влиянии СМЖ животных, получивших терапию в виде индуктора HSP70 PQ-29, на нервные клетки судили по результатам оценки жизнеспособности клеток С6 после культивирования с СМЖ. Оценку производили с помощью проточной цитометрии С6, окрашенных Annexin V с меткой Alexa Fluor 647, определения активности дегидрогеназ по Мосману и системы мониторинга состояния клеток xCelligence. По результатам определения активности

дегидрогеназ по Мосману, токсичность ликворов крыс, получавших терапию в виде PQ-29, оказалась ниже на 28% по сравнению с СМЖ группы травмированных животных без терапии (Рис. 11А). Клеточный индекс С6 спустя 20 часов культивации с СМЖ крыс после терапии PQ-29 согласно данным системы мониторинга состояния клеток xCelligence возрос на 20% по сравнению с клетками С6, культивированными с СМЖ животных с ЧМТ, не получивших терапии (Рис. 11Б). Данные оценки клеточной гибели путём окрашивания Annexin V показали уменьшение апоптотической гибели: по сравнению с С6, которые инкубировались с СМЖ травмированных животных, не получавших терапию, процентное содержание апоптотических клеток под воздействием ликворов после терапии PQ-29 снизилось с 11,86% до 3% (Рис. 11Г и Д). Помимо этого, также была проанализирована активность каспазы-3 после инкубации С6 с СМЖ крыс после терапии. Оказалось, что СМЖ крыс, которым после ЧМТ вводили PQ-29 вызывала почти в три раза меньшую активацию каспазы-3 по сравнению с СМЖ крыс, не получивших лечения (Рис. 11В).

А,

|100-

ц

ш

,1 30-

т

Контроль

гп

ь ±

PQ-29

СМЖК

СМЖщ

~ i = —

1.2

Z г

I К о.в

6 3 10 12 14 16 18

Time, h

Контроль

смжк

смж^ *

- FQ-29

£ К *-

О U

И ,

: = гн

п

U Ъ

О М

Г +

¡4 -

> 7ВД% „ 1 W / 1 6316

■ дНв

4Т.431» ^ 2.61%

Iß* 1Ü1 Iii1 IIf 1D

ja 2В*К. j 1 44% ■ . / j -T

4 96%

10" itf ir

Контроль

- PQ-2S

сижк

ii 5

И = =

I i

10-

5-

СМЖ» _*

I-

aUD

Контроль

PQ-29

2' + ■

Ы

о ■

смж.

смж^

«.01S Iii 9%

ш 6 24%

lip lif lf Iii'

13 93% W j 1.27%

74 17%™^ 10 59%

1D1 llf 1 rf IIt ID7

17 B71t / o.se%

"63 11% 2.42%

1С1 l(f 1D* 1 [p ■--------

Лппехш Y Aleialloui-ö+T

Рисунок 11. Терапия с использованием PQ-29 уменьшает токсичность СМЖ крыс после ЧМТ. В качестве контроля представлены клетки, инкубируемые с СМЖ животных, не получавших травму. А. Жизнеспособность клеток С6, оцениваемая с помощью анализа активности дегидрогеназ по Мосману, после инкубации в течение 24 часов с 50% раствором в DMEM/F12 СМЖ крыс после терапии ЧМТ. Б. Клеточный индекс С6, культивируемых с СМЖ крыс после терапии ЧМТ. В. Активность каспазы-3 в клетках, подвергнувшихся 6-ти часовому воздействию СМЖ крыс после терапии ЧМТ. Г. Доля апоптотических клеток в популяции С6 через 6 часов культивирования с СМЖ животных после терапии ЧМТ, полученная методом окрашивания Annexin V

и PI и проточной цитометрии. Д. Распределение популяций окрашенных Annexin V и PI клеток С6. Нижний левый сектор показывает долю PI-/Annexin V- клеток, верхний левый - PI+/Annexin V-, нижний правый - PI-/Annexin V+, верхний правый - PI+/Annexin V+. *p<0.05.

Исходя из полученных данных, можно сделать вывод, что терапия с помощью PQ-29 не только способствовала защите нейронов от вторичных повреждений, опосредуемых через СМЖ, но и останавливала запуск механизмов самих вторичных повреждений, что подтверждает факт уменьшения токсичности СМЖ после терапии по отношению к нервным клеткам.

3.6 PQ-29 оказывает нейропротекторное действие по отношению к нейрональным клеткам на in vitro модели БА

3.6.1 Скрининг и оценка эффективности накопления шаперонов в клетке соединений из группы производных пирролилазина выявил новые индукторы синтеза шаперонов

Следующим этапом работы стала оптимизация потенциальных терапевтических соединений, объединяемых структурным родством с PQ-29. Наши коллеги из Уральского федерального университета синтезировали группу соединений - производных пирролилазина. 18 соединений, включая PQ-29 были протестированы на ранее уже использованной репортерной тест-системе на основе гена люциферазы, сшитого с промоторной областью HSE (Рис. 12А). В результате было обнаружено, что помимо PQ-29, среди сходных по структуре соединений ещё 10 демонстрировали повышенный уровень люминесценции. Наибольшую способность индуцировать синтез шаперонов показали PQ-29, IQ-378, IP-3 и IA-47. Формулы соединений представлены на рис. 12Б.

Далее, чтобы проверить эффективность индукции синтеза шаперонов новыми соединениями, были использованы мезенхимальные стволовые клетки из пульпы зуба человека, полученные из банка клеточных культур Института цитологии и дифференцированные в сторону нейронального фенотипа (MSC-NEU). Контроль дифференцировки осуществлялся с помощью оценки уровня мРНК маркерных белков МАР2 и Р-тубулина методом ПЦР в реальном времени (Рис. 12В). 100% клеток приобретали постмитотический нейрональный фенотип, о чём свидетельствовала гибридизация антител к ядерному нейрональному антигену NeuN (моноклональные антитела из кролика, аЬ177487, разведение 1:200, АЬеаш, США) с цитологическим препаратом MSC-NEU (Рис. 12Г). MSC-NEU инкубировались с соединениями в течение 24 часов, после чего при помощи Вестерн-блот анализа было проанализировано накопление ШР70 и ШР90 в клетках (Рис. 12Д). В результате количество ШР70 и ШР90 увеличивалось под действием 1 мкМ PQ-29 в 1,6 и 1,85 раз, соответственно, под действием 1 мкМ 1А-47 - в 2,2 и 2,1 раз, соответственно. Похожие показатели были получены для 1Р-3 (ШР70 - в 2,7 раз; ШР90 - в 1,6 раз) и ^-378 (ШР70 - в 1,9 раз; ШР90 - без изменений). В результате, новые соединения оказались даже более эффективны в накоплении шаперонов, чем PQ-29, хотя в репортерной системе лучше всего показал себя именно (3-(5-фенил-1Н-пиррол-2-ил)хиноксалин-2(1Н)-он.

А

Сиимещенне

в

г 25~|

а. 5

£ 20-

щ

0

£ 15-

я 3

1 ю-I

I

■

I ш!

мэс-ОР МЭС-МЕи

р-3-тубулим

д

I ра-гэ.мкм 1Р-З.МИМ

тш ° 0 2 0 5 1 0 2 0 5 1

Нвр9а| --— —■ - |

§

£ 1Д-47.МЧМ Ю-378.миМ ° 01 0 5 1 Р.г 0.5 1

£ И>-

1050=494 406 мкМ

гй 70-

,001 0,01 0,1 1 10 100 1000 10000

Концентрация, мкМ

1_С50>1000 мкМ

0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 1 Концентрация, мкМ

1 •

■ 1Р-3 • •

; 1.050=315.620 мкМ

1

0.001 0.01 0.1 1 10 100 1000 10000 0.001 0,01 0.1 1 10 100 1000 10000 Концентрация, мкМ Концентрациях шгкМ

Рисунок 12. Соединения из группы производных пирролилазина - эффективные и безопасные индукторы синтеза шаперонов. А. Результаты скрининга 18 соединений с помощью репортерной системы на основе НЕК^ис. Б. Структурные формулы 4 соединений, показавших наибольшую эффективность индукции. Красным выделены фрагменты пиррола. В. Данные оценки уровня мРНКметодом ПЦР в реальном времени нейрональных маркеров в-тубулина и МАР-2 в MSC-DP через 5 дней процедуры дифференцировки. Г. Данные иммуноцитохимического анализа MSC-NEU после гибридизации с антителами против ЫеиЫ. Окрашивание с помощью DAPI использовалось в качестве контроля общего количества клеток. Д. Результаты оценки количества НБ.Р70 и НБ.Р90 в MSC-NEU через 24 часа воздействия новых соединений. в-Тубулин представлен в качестве контроля белковой нагрузки. Е. Показатели полулетальных концентраций соединений,

установленные с помощью анализа активности гидрогеназ по Мосману. *p<0.05.

Следующим этапом была проверка безопасности соединений. Предыдущие исследования индукторов синтеза шаперонов базировались на малигнизованных культурах, однако на нынешнем этапе мы использовали дифференцированные MSC, поэтому ожидалось, что полулетальные концентрации будут ниже, чем на С6 для PQ-29. Однако через 24 часа инкубации MSC-NEU с соединениями в диапазоне концентраций от 0,01 до 1000 мкМ показатель LC50 для PQ-29 соответствовал 494,4 мкМ, для IQ-378 -278,8 мкМ, для IP-3 - 317,6 мкМ, а показатель полулетальной концентрации для IA-47 оказался за пределами 1000 мкМ (Рис. 12Е). Таким образом, для дальнейших экспериментов было решено сохранить диапазон от 0,2 до 1 мкМ, использованный в части работы, посвященной ЧМТ.

3.6.2 Применение соединений из группы производных пирролилазина снижает гибель MSC-NEU и уменьшает активность р-

галактозидазы на in vitro модели БА

Для проверки эффективности действия новых соединений мы использовали in vitro модель болезни Альцгеймера, основанную на культивировании MSC-NEU с Р-амилоидным пептидом 1-42. После 48 часов инкубации с пептидом в концентрации 20 мкМ клеточный индекс, измеряемый с помощью системы xCelligence, снижался на 22% по сравнению с контролем, в то время как добавление соединений из группы пирролил-производных увеличивало это значение в среднем на 10% для каждого соединения (Рис. 13А). При помощи окрашивания Annexin V было продемонстрировано, что через 24 часа культивирования Р-амилоид вызывал увеличение популяции Annexin-положительных клеток, до 20% от всей пробы, а применение новых индукторов синтеза шаперонов приводило к снижению

этого показателя до значения контрольных клеток (PQ-29 - 3,39%, 1А-47 -3,95%, 1Р-3 - 4,25%, 10-378 - 5,24%) (Рис. 13Б).

Мы проанализировали активность каспазы-3 в ответ на добавление Р-амилоида и обнаружили увеличение более, чем в 3 раза активности фермента в MSC-NEU, культивируемых в присутствии 20 мкМ пептида. При этом добавление соединений уменьшало показатель активации каспазы-3. В результате, при применении 1 мкМ PQ-29 активность каспазы-3 на увеличивалась в 2,12 раза, 1А-47 - в 2,24 раза, ^-378 - 2,51 раза и 1Р-3 - в 2,04 раза (Рис. 13В).

Так как болезнь Альцгеймера тесно связана с процессом клеточного старения, в заключение этой части работы мы оценили активность Р-галактозидазы - фермента, активно работающего в стареющих клетках, в МБС-ЫЕи под воздействием Р-амилоида и новых индукторов синтеза шаперонов. Для этого мы использовали окрашивание хромогенным субстратом Р-галактозидазы Х^а1 и обнаружили, что культивация MSC-NEU в присутствии Р-амилоида в течение 4 дней приводит к увеличению активности Р-галактозидазы более, чем в два раза, в то время как все 4 соединения оказались способны снижать этот показатель до значения, характерного для клеток, не подвергавшихся действию амилоидного пептида (Рис. 13Г).

: % 0.80 = Ц 0.75

РС!-29

121 131

Время, ч

121 131

Время, ч

+ + + АР1-42, 20 мкМ 0.2 0.5 1 ПА, мкМ

* * * * бппп

^ # ^ « /

+ + + + А&1-42,20 мкМ 0 1 О 0.2 0.5 1 ПА.МК.Ч

О 1 0 0.2 0.5 1

+ Ар 1-42, 20 >]кЫ О 1 0 0.2 0.5 1 ПА, мкМ

Рисунок 13. Индукторы синтеза шаперонов из группы пирролилазинов защищают нейрональные клетки от токсичного воздействия и клеточного старения, вызываемого воздействием в-амилоида. А. Данные клеточного индекса MSC-NEU через 50 часов культивирования в присутствии 20 мкМв-амилоида и новых индукторов синтеза шаперонов в концентрации от 0,2 до 1 мкМ. Б. Доля апоптотических клеток в популяции MSC-NEU после 6 часов инкубирования с 20 мкМ в-амилоида и 1 мкМ соединений из группы производных пирролилазинов, определенная с помощью окрашивания Аппехт V. В. Результаты оценки активности каспазы-3 через 6 часов культивирования с в-амилоидом и индукторами синтеза шаперонов. Г. Результаты оценки активности галактозидазы в MSC-NEU через 4 дня

культивирования с 20 мкМ fí-амилоида и индукторами синтеза шаперонов в концентрации от 0,2 до 1 мкМ. *p<0.05, **p<0.01.

Таким образом, новые индукторы синтеза шаперонов из группы производных пирролилазина продемонстрировали нейропротекторное действие в присутствии Р-амилоида по отношению к нейрональным клеткам человека. При этом соединения имели низкую токсичность и демонстрировали эффективность в терапии ЧМТ и БА.

3.7 Оптимизированные новые индукторы синтеза шаперонов повышают уровень белков теплового шока в стареющих клетках

Многие изучаемые терапевтические агенты против БА, показывающие хорошие результаты на in vitro моделях, оказываются бессильны в опытах in vivo. Зачастую это происходит из-за того, что обнаруживаются неблагоприятные побочные эффекты, или по причине неучтенности физиологических аспектов заболевания в клеточных моделях. В случае болезни Альцгеймера пораженные нейроны зачастую находятся в состоянии клеточного старения. Так, у пациентов с БА обнаруживают астроциты, нейроны, микроглию и эндотелиальные клетки, демонстрирующие признаки клеточного старения, в том числе высокий уровень экспрессии маркеров клеточного старения р21, р53 и р16 [12, 231, 259]. В условиях замедления метаболизма высока вероятность того, что интенсивность синтеза некоторых белков также может быть значительно снижена. С помощью Вестерн-блот анализа мы показали, что у мышей линии 5XFAD, несущих 5 мутаций в генах, предопределяющих развитие БА, с возрастом содержание шаперонов в мозге уменьшается [129]. Поэтому следующим этапом работы стала проверка эффективности ранее выявленных индукторов синтеза шаперонов на стареющих клетках. В качестве стареющих клеток были использованы предоставленные центром клеточных культур Института цитологии мезенхимальные стволовые клетки из пупочного канатика человека MSCWJ-

2, ранее демонстрировавшие стремительное замедление роста после 10 пассажа и высокую активность Р-галактозидазы [119]. Нами была проведена дифференцировка MSCWJ-2 в сторону нейронального фенотипа на 7 и 15 пассаже, что было доказано с помощью ПЦР в реальном времени мРНК, соответствующих маркерным белкам МАР2 и Р-тубулину (Рис. 14А). Также было показано с помощью набора для определения активности Р-галактозидазы, что активность фермента в MSCWJ-2-NEU на 15 пассаже почти в два раза превышала значение этого показателя на 7 пассаже (Рис. 14Б). Проверка 4 соединений, однако, не выявила статистически значимого увеличения уровня шаперонов на 15 пассаже (данные не показаны).

Рисунок 14. Модель нейрональных клеток, демонстрирующих фенотип клеточного старения. А. Результаты оценки уровня экспрессии уровня мРНК белков нейроналъной дифференцировки через 5 дней после культивирования с нейробазалъной средой. MSCWJ-2 отражают уровень изучаемых мРНК в клетках, культивируемых c ДМЕМ/F12. Б. Данные активности fî-галактозидазы, полученные с помощью окрашивания X-Gal в MSCWJ-2-NEU на 7-м и 15-м пассажах. **p<0.01.

Эти результаты привели нас к вопросу о соответствии наших соединений комплексу фармакокинетических параметров лекарственного средства ADME (absorption, distribution, metabolism and excretion), включающим всасывание, распределение, метаболизм, выведение и некоторые другие параметры. (Таб. 3). По этим показателям было произведено

сравнение in silico всех 18-ти соединений, входящих в группу пирролил-производных, согласно которым одно из соединений IA-50 выделяется среди остальных соединений по параметру TPSA (topological polar surface area). Этот параметр отражает способность малых молекул проникать через клеточную мембрану, чем ниже этот показатель, тем лучше способность проникновения, и IA-50 показало наименьшее значение TPSA среди всей группы соединений. Учитывая измененный липидный состав мембраны стареющих клеток, приводящий к худшему проникновению молекул через мембраны, мы предположили, что IA-50, имея значительно большую проникающую способность, может оказаться более эффективным индуктором синтеза шаперонов в стареющих клетках.

Рекомендуемое значение PQ-29 IA-47 IP-3 IQ-378 1А-50

Количество ординарных связей 1-11 2 1 1 1 1

LogS <-4 -4,1 -6,53 -4,2 -4,6 -4,78

LogP <4,15 3,24 3,34 3,33 3,72 3,78

TPSA 25-138 61,54 39,9 41,57 41,57 28,15

Количество акцепторов Н <10 2 1 2 2 1

Количество допоров Н+ <5 2 2 ] 1 1

Молекулярный вес <500 287,322 452,3 308,556 324,17 296,35

Проницаемость через ГЭБ Да Да Да Да Да

Кишечная абсорбция Да Да Да Да Да

Таблица 3. Данные компьютерного предсказания параметров всасывания, распределения, метаболизма и выведения (ADME) соединений из группы производных пирролилазина. LogS отражает растворимость в воде, LogP -константа липофильности, TPSA отражает способность малых молекул проникать через мембраны.

Для проверки эффективности ^-50 на стареющих клетках дифференцированные MSCWJ-2 на 7 и 15 пассаже инкубировали с 1 мкМ ]Л-50. Структурная формула и результаты оценки полулетальной концентрации соединения показаны на рис. 15A и Б. Согласно результатам Вестерн-блот анализа 1А-50 способен вызывать накопление шаперонов в молодых клетках, однако разница между уровнем шаперонов в контроле и при воздействии соединения на стареющих клетках оказалась небольшой. Мы наблюдали

увеличение уровня ШР70 на 22%, но не наблюдали статистически значимого увеличения ЖР90 (Рис. 15Г и Д). Идентичная картина появлялась при оценке уровня мРНК генов шаперонов, где через 6 часов воздействия уровень экспрессии ШР70 возрастал в 1,2 раза, а уровень ШР90 не менялся (Рис. 15В).

Рисунок 15.1А-50 демонстрирует небольшое увеличение уровня шаперонов на стареющих клетках. А. Структурная формула 1А-50. Б. Данные полулетальной концентрации 1А-50, полученные с помощью анализа активности дегидрогеназ по Мосману. В. Результаты оценки уровня мРНК ИБР70 и НБ.Р90, нормализованного по ГАФД, в MSCWJ-NEU через 6 часов инкубации с 1 мкМ 1А-50. Г. Данные Вестерн-блот анализа, демонстрирующие уровень накопления НБР70 и НБР90 через 24 часа культивирования MSCWJ-Nи с 1 мкМ 1А-50. ТШ - тепловой шок. Д. Интенсивность зон НБР70 и НБР90, нормализованная на в-тубулин. *р<0.05.

Несмотря на скромные результаты IA-50 в контексте повышения уровня шаперонов в стареющих клетках, мы решили проверить эффективность использования нового лидерного соединения в терапии БА. В качестве дополнения к данному опыту было принято решение апробировать ещё одно соединение из группы производных пирролилазина - IP-3, которое обладает наиболее отличным значением TPSA от IA-50 среди производных пирролилазина, которые ранее не были испытаны на животных моделях. Для этого мы использовали трансгенную модель БА - мышей линии 5XFAD, у которых, согласно литературным данным, в возрасте 6 месяцев наблюдаются признаки БА, такие как накопление амилоидных бляшек в мозге, потеря нейронов мозга и когнитивная дисфункция (Oakley et al. 2006; Flanigan et al. 2014; Jawhar et al. 2012). По достижению 6 месяцев мышей 5XFAD и wt (wild type) разделили на 6 групп: мыши дикого типа без лечения (n = 10), 5XFAD без лечения (n = 10), мыши дикого типа, получающие лечение в виде IA50 (n = 10) и IP-3 (n = 8) и 5XFAD, получающие лечение в виде IA-50 (n = 10) и IP-3 (n = 8). Соединение вводили животным внутримышечно в концентрации 10 мг/кг 1 раз в неделю в течение полугода.

Когда животные достигли 15 месяцев, мы провели «водный тест Морриса», направленный на оценку функции памяти. Время поиска платформы у 5XFAD, не получавших лечения, оказалось в 2,5 раза больше, чем у здоровых животных. При этом, 5XFAD, получавшие инъекции IA-50, находили платформу в два раза быстрее, чем 5XFAD без лечения, а траектория первых была значительно короче, хоть и уступала траектории здоровых животных. Статистически значимой разницы не было выявлено между показателями скорости нахождения платформы у мышей с моделью БА, которым проводили лечение с помощью IP-3 и у интактных 5XFAD, однако можно наблюдать положительную тенденцию (Рис. 16А и Б).

После «водного теста Морриса» мыши были перфузированы, после чего был изъят мозг для процедуры иммуногистохимии. С помощью гибридизации с антителами к NeuN, который является нейрональным ядерным маркером,

было исследовано поле СА1 гиппокампа (Рис. 16В). Было обнаружено, что у мышей 5XFAD количество нейронов в области СА1 гиппокампа было на 57% меньше, чем у здоровых мышей. При этом потеря нейронов у 5XFAD, которые получали лечение в виде IA-50, была значительно менее выраженной и составляла всего 22% по сравнению со здоровыми особями. Для больных мышей, которым проводили терапию IP-3, потеря нейронов этой области гиппокампа составляла 39% (Рис. 16Г).

Рис. 16. Соединения из группы производных пирролилазина оказывают терапевтический эффект на in vivo модели БА. А. Траектории поиска платформы здоровыми мышами и мышами 5XFAD после терапии IA50 и IP-3 согласно результатам "водного теста Морриса". Траектория обозначена зелёной линией, платформа - красным кругом. Б. Время поиска платформы здоровыми мышами и мышами 5XFAD после терапии IA50 и IP-3 согласно результатам "водного теста Морриса". В. Результаты иммуногистохимии CA1 области гиппокампа мышей 5XFAD после терапии IA50 и IP-3. В данном случае была проведена гибридизация с антителами к NeuN. Г. Количество

окрашенных NeuN клеток на участке CA1 гиппокампа мышей, участвовавших в эксперименте, нормализованное на контроль. *p<0.05, **p<0.01, *p<0.005.

Таким образом новое лидерное соединение, выбранное на основе анализа фармакохимических параметров, показало эффективность на животной модели БА, уменьшив потерю нейронов гиппокампа и снизив когнитивный дефицит при сравнительно небольшом увеличении уровня шаперонов в стареющих клетках. Однако остается возможность дальнейшей оптимизации соединений с целью достижения большей эффективности увеличения шаперонов в стареющих клетках и соответствующего терапевтического эффекта, так как, например, IP-3, чьё значение TPSA также находится в диапазоне рекомендуемых значений, показало значительно меньший терапевтический потенциал на in vivo модели БА. Возможно, нам стоит обратить внимание на параметр липофильности (LogP) для дальнейшей оптимизации соединений, так как соответствие этому показателю также может влиять на способность соединений проникать через мембраны с меньшей текучестью, наблюдаемые при старении клеток. Также рекомендуемым значениям именно этого параметра меньше всего соответствуют исследуемые соединения из группы производных пирролилазина (Таб. 3).

Перспективой этого исследования может являться запуск одного или нескольких индукторов синтеза шаперонов из группы производных пирролилазина в фармакологическое применение. Для предсказания возможных побочных эффектов препарата необходимо детально знать механизмы молекулярных взаимодействий, опосредующих действие препарата. Поэтому далее мы решили исследовать механизм индукции синтеза шаперонов обнаруженными нами соединениями.

3.8 Соединения из группы пирролил-производных индуцируют синтез шаперонов за счет снижения активности ингибиторной киназы HSF1

казеин киназы 2

На момент исследования про механизм активации синтеза шаперонов обнаруженными нами соединениями нам известно только то, что есть прямая взаимосвязь между воздействием PQ-29 и тримеризацией HSF1. Предполагается, что механизм действия исследуемых соединений заключается в регулировке активности киназ или фосфатаз, координирующих активность транскрипционного фактора. Для того, чтобы обнаружить искомый белок мы прибегли к in silico анализу взаимодействий PQ-29 со всеми известными белками, чьи кристаллические структуры получены. С помощью сервиса PASS (Prediction of the Biological Activity Spectra of Organic Compounds) было предсказано взаимодействие соединения с несколькими белками, потенциально имеющими возможность регулировать функцию HSF1, среди которых одной из самых вероятных мишеней взаимодействия является казеин киназа 2 (CK2), которая, согласно литературным данным, фосфорилирует HSF1 по 303 остатку серина, что приводит к инактивации транскрипционного фактора (Таб. 4). Далее для проведения молекулярного докинга мы воспользовались сервисом SwissDoc. На основе результатов компьютерного моделирования мы выяснили, что наиболее энергетически выгодное взаимодействие PQ-29 c CK2 происходит в АТФ-связывающем кармане каталитической а субъединицы фермента, причём AG такого взаимодействия, согласно компьютерным расчетам, составляет почти -8 ккал/моль (Рис.17А, Б, В). IA-50, IP-3, IQ-378 и IA-47 продемонстрировали схожие результаты, поэтому эти данные in silico исследований позволили сформулировать гипотезу, согласно которой исследуемые пирролил-содержащие соединения блокируют активный сайт каталитической субъединицы CK2, за счёт чего снижается ее способность фосфорилировать HSF1, что способствует тримеризации транскрипционного фактора и инициации экспрессии генов белков теплового шока.

Мишень Место в регуляции Н5П Confidence

Casein kinase 2 (СК2) Ингибиторное фосфорилирование Н5Р1 по 5303/307 0,4

MAP kinase-activated protein kinase 2 (MAPKAPK2) Ингибиторное фосфорилироеание Н5Р1 по 5121 0,041

Serine/threonine-protein phosphatase (PP5} Часть комплекса с Н5Р90, удерживающего НЯГ 1 в неактивном состоянии 0,0351

CaM kinase 2 Фосфор ил ирова ние Н5Р1 по 5230, что приводит к транса ктивации 0,38

Se ri n e/th reon i n e-prote in kinase 11 Опосредованное через ДМРК ингибиторное фосфорилирование 5121 0.4791

Таблица 4. Результаты in silico анализа мишеней PQ-29 с помощью сервиса PASS. Параметр "Confidence" отражает вероятность несущего биологическую активность взаимодействия малой молекулы с белком.

Рисунок 17. Соединения из группы пирролилпроизводных взаимодействуют с АТФ-связывающим карманом СК2а. А. Величины константы диссоциации соединений с СК2а, полученные т silico с помощью сервиса SwissDoc. Б. Результаты молекулярного докинга с участием соединений и СК2а. В. Схема, демонстрирующая наиболее энергетически выгодное положение соединений

из группы производных пирролилазина на молекуле СК2а, предсказанное с помощью SwissDoc.

Для того чтобы проверить данную гипотезу, мы оценивали активность CK2 в MSC-NEU после инкубации с PQ-29 c помощью Вестерн-блота и окрашивания антителами к мотиву pS/pTD/EXD/E, который является фосфорилированным субстратом CK2 (Рис. 18А). В этом случае интенсивность зон белков-мишеней СК2, как ожидалось, становилась ниже, что указывало на значительное снижение киназной активности CK2 после 3 часов инкубации с PQ-29 по сравнению с интактными клетками.

Рисунок 18. Взаимодействие соединений из группы пирролил-производных с СК2 ингибирует фосфорилирование HSF1 казеин киназой 2. А. Количество белков, профосфорилированных СК2 уменьшается в MSC-DP через 3 часа инкубации с 1 мкМ PQ-29. а-тубулин присутствует в качестве контроля нагрузки. Б. Данные иммунопреципитации за антитела к фосфосубстрату

СК2 и последующего Вестерн-блот анализа лизатов MSC-DP после инкубации с 1 мкМ PQ-29. Крайняя правая проба - проба без добавления белкового лизата. ИГ - иммуноглобулины. В. Данные иммунопреципитации за антитела к фосфосубстрату СК2 и последующего Вестерн-блот анализа лизатов MSC-DP после инкубации с 1 мкМ PQ-29 Г. Результаты оценки прямого взаимодействия производных пирролилазина с СК2, проводимой с помощью метода DARTS. В пробе "ДМСО" проводился трипсинолиз, но вместо соединений добавлялось пропорциональное количество растворителя.

Далее мы оценили количество HSF1, фосфорилированного CK2, в присутствии PQ-29. Для этого клетки MSC-NEU инкубировали с 1 мкМ PQ-29 в течение разного промежутка времени, после чего иммунопреципитировали белки из клеточного лизата с антителами к фосфосубстрату СК2, проводили Вестерн-блот анализ с гибридизацией с антителами против HSF1 (Рис. 18Б и В). Оказалось, что уже через 30 минут после добавления PQ-29 количество фосфорилированного СК2 транскрипционного фактора становилось следовым, и этот эффект сохранялся и на последней временной точке, составляющей 4 часа. Эти данные доказывают, что PQ-29 препятствует СК2-опосредованному фосфорилированию HSF1.

Чтобы подтвердить прямое взаимодействие соединений с СК2 был использован метод DARTS, в котором скорость (интенсивность) протеолиза белка зависит о того, связана ли молекула с определенным соединением, что обеспечивает её стабильность. Очищенную рекомбинантную СК2а инкубировали с 1 мкМ PQ-29 и IA50, после чего подвергали трипсинолизу. Данные Вестерн-блот анализа с гибридизацией с антителами против СК2 подтверждают прямое взаимодействие СК2 с соединениями, так с повышением концентрации, протеолитический распад молекулы белка-субстрата снижался (Рис. 18Г).

Таким образом, был обнаружен механизм индукции синтеза шаперонов рядом соединений из группы производных пирролилхиноксалина. Было показано, что регуляция экспрессии генов шаперонов происходит за счёт

блокирования каталитической активности казеин киназы 2 и исходящего из этого изменения статуса фосфорилирования транскрипционного фактора ИЗБ!.

Обсуждение

Модуляторы активности и уровня шаперонов уже давно изучаются в контексте применения в терапии нейродегенеративных заболеваний. Однако многие широко известные индукторы синтеза шаперонов демонстрируют такой эффект за счёт инициирования протеостатического стресса. Например, целастрол, позиционирующийся как индуктор ЖР70, вызывает окисление тиольных групп и повреждение белков, благодаря чему и запускает ответ систем стресса, таких как белков теплового шока и системы антиоксидантов, сопровождающийся повышением экспрессии генов участвующих белков [228]. За счет этого значительная часть индукторов синтеза шаперонов демонстрирует высокую токсичность. Индукторы из группы пирролил-производных, в свою очередь, имеют очень высокие значения полулетальной концентрации в диапазоне от 278 до >1000 мкМ [51].

Другая часть исследований направлена на повышение уровня шаперонов посредством ингибирования ШР90, благодаря чему из комплекса с ним высвобождается HSF1. Закономерно встает вопрос, не будет ли блокирование одного из участников системы контроля качества белка в клетке снижать эффективность терапии нейродегенеративных заболеваний, связанных с нарушением конформации белков. По данному вопросу мнения исследователей разделяются. Есть работы, доказывающие, что ЖР90 препятствует деградации аберрантных белков, в частности тау, за счёт стабилизации его молекулы [240]. Однако, хорошо известно, что ШР90 способен связываться с фибриллами тау и трансформировать их в менее патологичную форму. Такой же эффект оказывает ЖР90 на агрегаты а-синуклеина. DaturpaШ и коллеги показали, что при инкубировании клеток глиобластомы человека SH-SY5Y с а-синуклеином добавление ЖР90 приводит к увеличению выживаемости клеток на 50% по сравнению с клетками без добавления шаперона [44]. Было показано, что увеличение уровня ШР90 под действием джуджубозида А способствует устранению

амилоидных отложений и снижению когнитивного дефицита у трансгенных мышей [258]. Сложившееся мнение о том, что HSP90 может участвовать в развитии патогенеза нейродегенеративных заболеваний, может проистекать из результатов in vitro тестов в отсутствие других элементов шаперонного аппарата, таких как ко-шаперонов. Исследования, в которых происходит активация HSF1, демонстрируют обнадеживающие результаты. Так, на клеточной и мышиной моделях болезни Хантингтона, где экспрессируется конститутивно активная форма HSF1, показано снижение количества образованных агрегатов мутантного хантингтина [68]. При этом важно, что в случае сверхэкспрессии HSP70, HSP40 и других шаперонов по-отдельности, эффективность «терапии» оказывалась почти в два раза ниже.

В данной работе было показано, что новые соединения и группы производных пирролилазина увеличивают уровень как мРНК, так и белка HSP90 за счёт активации HSF1, при этом достигается терапевтический эффект при таких внутренне разнородных нейродегенеративных состояниях, как вторичные повреждения после ЧМТ и болезнь Альцгеймера. Одна из схожих работ Gomez-Pastor и коллег демонстрирует, что активация HSF1 вызывает накопление шаперонов, в том числе и HSP90 и приводит к уменьшению гибели на клеточной модели болезни Хантингтона [77]. В этой работе авторы предполагают, что активация HSF1 происходит за счёт взаимодействия с белковым комплексом TRiC/CCT. TRiC/CCT участвует в фолдинге белков цитоскелета, таких как актин и тубулин, поэтому ингибрование этого белкового комплекса, по предположению авторов, может запускать дополнительный синтез шаперонов.

Механизм действия индукторов, изучаемых в данной работе, как минимум частично основан на ингибировании киназы, фосфорилирующей HSF1 - СК2. Лишь незначительное количество работ посвящено изучению взаимодействия CK2 и HSF1 в контексте нейродегенеративных заболеваний. В исследовании Gomez-Pastor и коллег на модели PC-12, несущих ген мутантного хантингтина, показано увеличение количества CK2a,

коррелирующее с увеличением фосфорилированного по 303 остатку серина HSF1 и его деградацией, а также накоплением агрегатов мутантного хантингтина [77]. При этом нокаут гена CSNK2A приводит к восстановлению уровня HSF1 в клетках и утилизации мутантного хантингтина. В нынешней работе было продемонстрировано прямое взаимодействие соединений из группы пирролил-производных с СК2а. Также было показано, что применение соединений-индукторов шаперонов сопровождается уменьшением количества фосфорилированного казеин киназой 2 HSF1. Эти данные позволяют сделать вывод о том, что новые индукторы синтеза шаперонов действуют за счёт блокирования ингибиторного фосфорилирования HSF1.

Новые индукторы синтеза шаперонов из группы производных пирролилазина показали высокий потенциал терапевтического средства, сочетая эффективность индукции шаперонов и низкую токсичность с проходимостью через ГЭБ. Соединения, имеющие близкую по строению структуру, уже зарекомендовали себя в качестве терапевтических средств различной направленности, такие как а-адреноблокатор ницергалин [246], ноотропный препарат мериолин 2 [52], ингибитор циклин-зависимой киназы вариолин Б [213].

Таким образом, мы обнаружили ряд соединений из группы производных пирролилазина, которые обладают высоким терапевтическим потенциалом в контексте терапии нейродегенеративных заболеваний и на фоне своих конкурентов выгодно выделяются за счёт безопасности и соответствия фармакокинетическим параметрам, необходимым для лекарственных соединений. Также мы впервые показали механизм индукции синтеза шаперонов низкомолекулярным соединением через модуляцию активности CK2.

106 Выводы

1. В результате скрининга пирролил-подобных соединений были выявлены некоторые представители этой группы (PQ-29, IA-47, IQ-378, IP-3 и IA-50), способные вызывать накопление шаперонов в нейрональных клетках;

2. Терапия с помощью PQ-29 уменьшает гибель клеток глиомы крысы С6, вызванную действием СМЖ травмированных крыс, а также снижает токсичность самой СМЖ после ЧМТ;

3. Исследуемые ранее соединения из группы производных пирролилазина защищают MSC-NEU от гибели за счёт блокирования каспаза-зависимого апоптоза на in vitro модели БА;

4. В системе in vivo на модели БА IA-50 и IP-3 препятствуют потере нейронов гиппокампа и блокируют развитие дефицита памяти у мышей линии 5XFAD;

5. Ряд соединений из группы производных пирролилазина индуцируют синтез шаперонов за счет блокирования активного центра ингибиторной киназы CK2.

Список литературы

1. Akwa Y. [h gp.]. Synaptic activity protects against AD and FTD-like pathology via autophagic-lysosomal degradation // Molecular psychiatry. 2018. № 6 (23). C. 1530-1540.

2. Alberti S. [h gp.]. Ubiquitylation of BAG-1 Suggests a Novel Regulatory Mechanism during the Sorting of Chaperone Substrates to the Proteasome // Journal of Biological Chemistry. 2002. № 48 (277). C. 45920-45927.

3. Aleardi A.M. [h gp.]. Gradual alteration of mitochondrial structure and function by beta-amyloids: importance of membrane viscosity changes, energy deprivation, reactive oxygen species production, and cytochrome c release // Journal of bioenergetics and biomembranes. 2005. № 4 (37). C. 207-225.

4. Andrade Nunes M., Araujo Viel T., Sousa Buck H. Microdose lithium treatment stabilized cognitive impairment in patients with Alzheimer's disease // Current Alzheimer research. 2013. № 1 (10). C. 104-107.

5. Athar T., Balushi K. Al, Khan S.A. Recent advances on drug development and emerging therapeutic agents for Alzheimer's disease // Molecular Biology Reports. 2021. № 7 (48). C. 5629.

6. Atri A. The Alzheimer's Disease Clinical Spectrum: Diagnosis and Management // Medical Clinics of North America. 2019. № 2 (103). C. 263-293.

7. Avila J. [h gp.]. Tau Structures // Frontiers in aging neuroscience. 2016. № NOV (8).

8. Bandyopadhyay U. [h gp.]. The Chaperone-Mediated Autophagy Receptor Organizes in Dynamic Protein Complexes at the Lysosomal Membrane // Molecular and Cellular Biology. 2008. № 18 (28). C. 5747-5763.

9. Bateman G.A. [h gp.]. Quantitative measurement of cerebral haemodynamics in early vascular dementia and Alzheimer's disease // Journal of clinical neuroscience : official journal of the Neurosurgical Society of Australasia. 2006. № 5 (13). C. 563-568.

10. Beere H.M. [h gp.]. Heat-shock protein 70 inhibits apoptosis by preventing recruitment of procaspase-9 to the Apaf-1 apoptosome // Nature Cell Biology. 2000. № 8 (2). C. 469-475.

11. Bergen M. Von [h gp.]. Assembly of tau protein into Alzheimer paired helical filaments depends on a local sequence motif ((306)VQIVYK(311)) forming beta structure // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2000. № 10 (97). C. 5129-5134.

12. Bhat R. [h gp.]. Astrocyte senescence as a component of Alzheimer's disease // PloS one. 2012. № 9 (7).

13. Bianco C. Lo [h gp.]. Hsp104 antagonizes a-synuclein aggregation and reduces dopaminergic degeneration in a rat model of Parkinson disease // Journal of Clinical Investigation. 2008. № 9 (118). C. 3087-3097.

14. Biggs W.H. [h gp.]. Protein kinase B/Akt-mediated phosphorylation promotes nuclear exclusion of the winged helix transcription factor FKHR1 // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1999. № 13 (96). C. 7421-7426.

15. Blanco-Silvente L. [h gp.]. Discontinuation, Efficacy, and Safety of Cholinesterase Inhibitors for Alzheimer's Disease: a Meta-Analysis and MetaRegression of 43 Randomized Clinical Trials Enrolling 16 106 Patients // The international journal of neuropsychopharmacology. 2017. № 7 (20). C. 519-528.

16. Blanco-Silvente L. [h gp.]. Predictors of discontinuation, efficacy, and safety of memantine treatment for Alzheimer's disease: meta-analysis and metaregression of 18 randomized clinical trials involving 5004 patients // BMC geriatrics. 2018. № 1 (18).

17. Bloom G.S. Amyloid-P and tau: the trigger and bullet in Alzheimer disease pathogenesis // JAMA neurology. 2014. № 4 (71). C. 505-508.

18. Bode D.C. [h gp.]. Amyloid-P oligomers have a profound detergent-like effect on lipid membrane bilayers, imaged by atomic force and electron microscopy // The Journal of biological chemistry. 2019. № 19 (294). C. 7566-7572.

19. Bradford M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding // Analytical biochemistry. 1976. № 1-2 (72). C. 248-254.

20. Brunden K.R., Trojanowski J.Q., Lee V.M.Y. Advances in tau-focused drug discovery for Alzheimer's disease and related tauopathies // Nature reviews. Drug discovery. 2009. № 10 (8). C. 783-793.

21. Candé C. [h gp.]. Apoptosis-inducing factor (AIF): caspase-independent after all // Cell Death & Differentiation. 2004. № 6 (11). C. 591-595.

22. Canevari L., Abramov A.Y., Duchen M.R. Toxicity of amyloid beta peptide: tales of calcium, mitochondria, and oxidative stress // Neurochemical research. 2004. № 3 (29). C. 637-650.

23. Capizzi A., Woo J., Verduzco-Gutierrez M. Traumatic Brain Injury: An Overview of Epidemiology, Pathophysiology, and Medical Management // Medical Clinics of North America. 2020. T. 104. № 2. 213-238 c.

24. Cardone M.H. [h gp.]. Regulation of cell death protease caspase-9 by phosphorylation. // Science (New York, N.Y.). 1998. № 5392 (282). C. 1318-21.

25. Chamoun R. [h gp.]. Role of extracellular glutamate measured by cerebral microdialysis in severe traumatic brain injury: Clinical article // Journal of Neurosurgery. 2010. № 3 (113). C. 564-570.

26. Chen G.F. [h gp.]. Amyloid beta: structure, biology and structure-based

therapeutic development // Acta Pharmacologica Sinica 2017 38:9. 2017. № 9 (38). C. 1205-1235.

27. Chen Y. [h gp.]. Hsp90 chaperone inhibitor 17-AAG attenuates Ap-induced synaptic toxicity and memory impairment // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2014. № 7 (34). C. 2464-2470.

28. Chiang H.L. [h gp.]. A role for a 70-kilodalton heat shock protein in lysosomal degradation of intracellular proteins. // Science (New York, N.Y.). 1989. № 4928 (246). C. 382-5.

29. Chodobski A., Zink B.J., Szmydynger-Chodobska J. Blood-brain barrier pathophysiology in traumatic brain injury // Translational stroke research. 2011. № 4 (2). C. 492-516.

30. Ciechanover A., Kwon Y.T. Protein Quality Control by Molecular Chaperones in Neurodegeneration // Frontiers in Neuroscience. 2017. (11).

31. Clavaguera F. [h gp.]. Transmission and spreading of tauopathy in transgenic mouse brain // Nature cell biology. 2009. № 7 (11). C. 909-913.

32. Cleren C. [h gp.]. Celastrol protects against MPTP- and 3-nitropropionic acid-induced neurotoxicity // Journal of Neurochemistry. 2005. № 4 (94). C. 995-1004.

33. Cohen R.M. [h gp.]. A transgenic Alzheimer rat with plaques, tau pathology, behavioral impairment, oligomeric ap, and frank neuronal loss // The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 2013. № 15 (33). C. 6245-6256.

34. Cohen T.J. [h gp.]. The acetylation of tau inhibits its function and promotes pathological tau aggregation // Nature communications. 2011. № 1 (2).

35. Connell J.W. [h gp.]. Quantitative analysis of tau isoform transcripts in sporadic tauopathies // Brain research. Molecular brain research. 2005. № 1-2 (137). C. 104-109.

36. Cook C. [h gp.]. Acetylation of the KXGS motifs in tau is a critical determinant in modulation of tau aggregation and clearance // Human molecular genetics. 2014. № 1 (23). C. 104-116.

37. Cremer O.L. [h gp.]. Prognosis Following Severe Head Injury: Development and Validation of a Model for Prediction of Death, Disability, and Functional Recovery // The Journal of Trauma: Injury, Infection, and Critical Care. 2006. № 6 (61). C. 1484-1491.

38. Cristofori L. [h gp.]. Early onset of lipid peroxidation after human traumatic brain injury: a fatal limitation for the free radical scavenger pharmacological therapy? // Journal of investigative medicine : the official publication of the American Federation for Clinical Research. 2001. № 5 (49). C. 450-8.

39. Cuervo A.M. [h gp.]. Impaired Degradation of Mutant -Synuclein by Chaperone-Mediated Autophagy // Science. 2004. № 5688 (305). C. 1292-1295.

40. Cuervo A.M., Dice J.F. A receptor for the selective uptake and degradation of proteins by lysosomes. // Science (New York, N.Y.). 1996. № 5274 (273). C. 5013.

41. Cummings C.J. [h gp.]. Over-expression of inducible HSP70 chaperone suppresses neuropathology and improves motor function in SCA1 mice. // Human molecular genetics. 2001. № 14 (10). C. 1511-8.

42. Daina A., Michielin O., Zoete V. SwissADME: a free web tool to evaluate pharmacokinetics, drug-likeness and medicinal chemistry friendliness of small molecules // Scientific reports. 2017. (7).

43. Datta S.R. [h gp.]. Akt phosphorylation of BAD couples survival signals to the cell-intrinsic death machinery. // Cell. 1997. № 2 (91). C. 231-41.

44. Daturpalli S. [h gp.]. Hsp90 inhibits a-synuclein aggregation by interacting with soluble oligomers // Journal of molecular biology. 2013. № 22 (425). C. 4614-4628.

45. Day G.S. [h gp.]. Aducanumab Use in Symptomatic Alzheimer Disease Evidence in Focus: A Report of the AAN Guidelines Subcommittee // Neurology. 2022. № 15 (98). C. 619-631.

46. Dedmon M.M. [h gp.]. Heat shock protein 70 inhibits alpha-synuclein fibril formation via preferential binding to prefibrillar species. // The Journal of biological chemistry. 2005. № 15 (280). C. 14733-40.

47. Denault J.B. [h gp.]. Small molecules not direct activators of caspases // Nature Chemical Biology 2007 3:9. 2007. № 9 (3). C. 519-519.

48. Dhillon S. Aducanumab: First Approval // Drugs. 2021. № 12 (81). C. 14371443.

49. Dixit R. [h gp.]. Differential regulation of dynein and kinesin motor proteins by tau // Science (New York, N.Y.). 2008. № 5866 (319). C. 1086-1089.

50. Du C. [h gp.]. Smac, a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition. // Cell. 2000. № 1 (102). C. 33-42.

51. Dutysheva E.A. [h gp.]. Synthesis and approbation of new neuroprotective chemicals of pyrrolyl- and indolylazine classes in a cell model of Alzheimer's disease // European Journal of Medicinal Chemistry. 2021. (222). C. 113577.

52. Echalier A. [h gp.]. Meriolins (3-(pyrimidin-4-yl)-7-azaindoles): Synthesis, kinase inhibitory activity, cellular effects, and structure of a CDK2/Cyclin A/meriolin complex // Journal of Medicinal Chemistry. 2008. № 4 (51). C. 737751.

53. Echeverria V. [h gp.]. Altered mitogen-activated protein kinase signaling, tau hyperphosphorylation and mild spatial learning dysfunction in transgenic rats expressing the beta-amyloid peptide intracellularly in hippocampal and cortical

neurons // Neuroscience. 2004. № 3 (129). C. 583-592.

54. Eckert A. [h gp.]. March separate, strike together--role of phosphorylated TAU in mitochondrial dysfunction in Alzheimer's disease // Biochimica et biophysica acta. 2014. № 8 (1842). C. 1258-1266.

55. Egan M.F. [h gp.]. Randomized Trial of Verubecestat for Mild-to-Moderate Alzheimer's Disease // The New England journal of medicine. 2018. № 18 (378). C. 1691-1703.

56. Ellis R.J., Minton A.P. Protein aggregation in crowded environments // Biological Chemistry. 2006. № 5 (387). C. 485-97.

57. Engelhardt B. [h gp.]. Vascular, glial, and lymphatic immune gateways of the central nervous system // Acta neuropathologica. 2016. № 3 (132). C. 317-338.

58. Eroglu B. [h gp.]. Therapeutic inducers of the HSP70/HSP110 protect mice against traumatic brain injury. // Journal of neurochemistry. 2014. № 5 (130). C. 626-41.

59. Etchells S.A. [h gp.]. The Cotranslational Contacts between Ribosome-bound Nascent Polypeptides and the Subunits of the Hetero-oligomeric Chaperonin TRiC Probed by Photocross-linking // Journal of Biological Chemistry. 2005. № 30 (280). C. 28118-28126.

60. Evans C.G., Wisén S., Gestwicki J.E. Heat Shock Proteins 70 and 90 Inhibit Early Stages of Amyloid P-(1-42) Aggregation in Vitro // Journal of Biological Chemistry. 2006. № 44 (281). C. 33182-33191.

61. Farook J.M. [h gp.]. GADD34 induces cell death through inactivation of Akt following traumatic brain injury // Cell Death & Disease. 2013. № 8 (4). C. e754-e754.

62. Faul M., Coronado V. Epidemiology of traumatic brain injury // Handbook of clinical neurology. 2015. (127). C. 3-13.

63. Ferbitz L. [h gp.]. Trigger factor in complex with the ribosome forms a molecular cradle for nascent proteins // Nature. 2004. № 7008 (431). C. 590-596.

64. Fernández-Vizarra P. [h gp.]. Intra- and extracellular Abeta and PHF in clinically evaluated cases of Alzheimer's disease // Histology and histopathology. 2004. № 3 (19). C. 823-844.

65. Folkerts M.M. [h gp.]. Phosphorylation of Calcium Calmodulin—Dependent Protein Kinase II following Lateral Fluid Percussion Brain Injury in Rats // https://home.liebertpub.com/neu. 2007. № 4 (24). C. 638-650.

66. Forester B.P. [h gp.]. Age-related changes in brain energetics and phospholipid metabolism // NMR in biomedicine. 2010. № 3 (23). C. 242-250.

67. Frydman J., Hohfeld J. Chaperones get in touch: the Hip-Hop connection. // Trends in biochemical sciences. 1997. № 3 (22). C. 87-92.

68. Fujimoto M. [h gp.]. Active HSF1 significantly suppresses polyglutamine

aggregate formation in cellular and mouse models // The Journal of biological chemistry. 2005. № 41 (280). C. 34908-34916.

69. Gabai V.L. [h gp.]. Hsp70 prevents activation of stress kinases. A novel pathway of cellular thermotolerance. // The Journal of biological chemistry. 1997. № 29 (272). C. 18033-7.

70. Gabai V.L. [h gp.]. Hsp72 and stress kinase c-jun N-terminal kinase regulate the bid-dependent pathway in tumor necrosis factor-induced apoptosis. // Molecular and cellular biology. 2002. № 10 (22). C. 3415-24.

71. Gaetz M. The neurophysiology of brain injury. // Clinical neurophysiology : official journal of the International Federation of Clinical Neurophysiology. 2004. № 1 (115). C. 4-18.

72. Gao X. [h gp.]. Human Hsp70 Disaggregase Reverses Parkinson's-Linked a-Synuclein Amyloid Fibrils // Molecular Cell. 2015. № 5 (59). C. 781-793.

73. Gils A. Van [h gp.]. Management of mild traumatic brain injury // Practical Neurology. 2020. № 3 (20). C. 213-221.

74. Ginsberg S.D. [h gp.]. Shift in the ratio of three-repeat tau and four-repeat tau mRNAs in individual cholinergic basal forebrain neurons in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease // Journal of neurochemistry. 2006. № 5 (96). C. 1401-1408.

75. Goedert M. [h gp.]. Cloning and sequencing of the cDNA encoding an isoform of microtubule-associated protein tau containing four tandem repeats: differential expression of tau protein mRNAs in human brain // The EMBO journal. 1989. № 2 (8). C. 393-399.

76. Goedert M., Jakes R. Expression of separate isoforms of human tau protein: correlation with the tau pattern in brain and effects on tubulin polymerization // The EMBO journal. 1990. № 13 (9). C. 4225-4230.