Иммуноферментный анализ аминогликозидных антибиотиков тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Гордон, Кира Валериановна

• Гордон, Кира Валериановна
• кандидат биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гордон, Кира Валериановна

Список сокращений Введение ■

1. Обзор литературы

1.1. Аминогликозидные антибиотики. Свойства и применение

1.2.Методы определения лекарственных препаратов 1.2.1. Твердофазный иммуноферментный анализ

2. Материалы и методы

2.1.Материалы

2.2.Методы

2.2.1. Функциональный анализ белков и. конъюгатов

2.2.2. Получение антисьшоротбк'^;•'

2.2.3. Иммуноферментный анализ

2.2.4. Получение и анализ липосом

2.2.5. Липосомальный иммуноферментньй анализ

2.2.6. Синтез конъюгатов пероксидазы с антибиотиками

3. Результаты исследований и их обсуждение

3.1. Получение иммуногенов и изучение их свойств

3.1.1.Синтез конъюгатов белков с неомицином и канамицином глутаральдегидньм методом

3.1.2. Синтез конъюгатов белков с неомицином, канамицином и гентамицином карбодиимидным методом

3.1.3. Синтез конъюгатов глицидалированньк белков с гентамицином

3.1.4. Синтез конъюгатов модифицированного п-бензохиноном овальбумина с гентамицином

3.1.5. Синтез конъюгатов синтетических полимеров с неомицином

3.2. Изучение иммуногенности конъюгатов амино-гликозидных антибиотиков с природными и синтетическими полимерами

3.3. Изучение свойств кроличьих сывороток против аминогликозидных антибиотиков

3.3.1. Изучение динамики иммунного ответа и аффинности антител

3.3.2. Изучение специфичности антисывороток

3.4. Изучение различных систем иммуноферментного анализа аминогликозидных антибиотиков '

3.4.1. Липосомальный иммуноферментный анализ неомицина

3.4.2. Прямой конкурентный ИФА аминогликозидных антибиотиков

3.4.2.1. Прямой конкурентный ИФА гентамицина

3.4.2.2. Прямой конкурентный ИФА неомицина 3.4.4. Непрямой конкурентный ИФА аминогликозидных антибиотиков

3.4.4.1. Непрямой конкурентный ИФА гентамицина

3.4.4.2. Непрямой конкурентный ИФА неомицина, канамицина и мономицина

3.4.4.3. ИФА гентамицина при региональной антибиотикотерапии

3.4.4.4. Экологически мониторинг неомицина и мономицина

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммуноферментный анализ аминогликозидных антибиотиков»

Актуальность проблемы.

Аминогликозидные антибиотики являются препаратами широко используемыми в медицине для лечения тяжелых инфекций, вызванных преимущественно грамотрицательными микроорганизмами. За годы применения аминогликозидов таких как стрептомицин, гентамицин, канамицин, неомицин, тобрамицин и амикацин, было выяснено, что они отличаются не только высокой лечебной эффективностью, но и оказывает неблагоприятное побочное действие. Наиболее серьезными токсическими эффектами, вызываемыми аминогликозидными антибиотиками, являются ототоксичность и нефротоксичность, что сильно ограничивает использование этих ценных препаратов. Бактерицидная активность аминогликозидов и их токсическое действия на слух и функции почек зависят от достигнутых концентраций в крови. К сожалению, различия между эффективной (терапевтической) и токсической концентрациями аминогликозидов минимальны. Поэтому для достижения лечебного эффекта без проявления побочного действия необходима оперативная информация о концентрациях антибиотика в крови и других биологических жидкостях.

Фиксированные дозы и режимы применения антибиотиков не во всех случаях отвечают отмеченным требованиям эффективности и безопасности поскольку метаболизм, распределение и выведение лекарств сильно варьируют в зависимости от возраста, пола, особенностей заболевания и даже от взаимодействия с другими препаратами, использованными параллельно с антибиотиками для лечения больного.

В связи с сильными вариациями фармакокинетических параметров у различных больных применение аминогликозидных антибиотиков рекомендуется в индивидуальных дозах. Выяснение особенностей фармакодинамики антибиотика принято осуществлять с помощью мониторинга лекарства. Для определения концентраций антибиотика в крови в различные сроки после введения могут быть использованы биологические (микробиологические) и физико-химические методы. Микробиологические методы не отличаются высокой чувствительностью, полуколичественны, недостаточно специфичны, длительны и трудоемки. Физико-химические, включающие сепарационную стадию, требуют пробоподготовки и дериватизации для введения в определяемый антибиотик детектируемой метки.

Иммунохимические методы определения аминогликозидов отличаются необходимой чувствительностью и высокой специфичностью, устойчивостью к интерферирующим факторам биологических жидкостей, быстры и высокопроизводительны при соответствующем аппаратурном оформлении. Известные в настоящее время иммунохимические методы определения различных лекарственных препаратов в том числе аминогликозидов базируются на применении меченых аналита (определяемый антибиотик) или специфических антител. Биотехнологическая промышленность США, Великобритании и Франции производят соответствующие наборы реагентов для . радиоиммунного, иммунофлуоресцентного и иммуноферментного анализа различных лекарственных препаратов, в том числе антибиотиков.

Твердофазный иммуноферментный анализ является одним из перспективных направлений иммунохимического определения биологически активных веществ, сочетающим уникальную специфичность иммунологического распознавания и очень высокую чувствительность детекции энзимной метки, в качестве которой могут применяться наиболее активные ферменты.

Сравнительная простота осуществления различных стадий твердофазного иммуноферментного анализа, возможность регистрации результатов без применения сложных дорогостоящих приборов, высокая стабильность реагентов, включающих ферментную метку, послужили обоснованием для широкого внедрения этого варианта анализа в медицину, биотехнологию, работы по охране окружающей среды и научные исследования.

Внедрения методов иммуноферментного анализа аминогликозидных антибиотиков тормозится в значительной степени, особенно в России, слабой научной проработкой вопросов синтеза и получения . необходимых реагентов, недостаточным обоснованием определенных вариантов ИФА этих антибиотиков (особенно это относится к гетерогенным системам), не проведены экспериментальные исследования пригодности систем твердофазного ИФА для анализа биологических образцов и определения антибиотиков в окружающей среде.

Целью настоящего исследования является разработка способов получения иммуногенов на основе аминогликозидных антибиотиков, разработка способов и исследование свойств иммунореагентов для получения высокочувствительных и высокоспецифичных иммуноферментных тест-систем, исследование параметров наиболее перспективного варианта анализа, исследование возможности использования разработанных систем ИФА для научных исследований, клинического и экологического мониторинга.

-81. Обзор литературы

1.1. Ам^огликозидные аншибисупики. Свойства и применение.

Аминогликозидные антибиотики- группа препаратов, продуцируемьк микроорганизмами, относящимися к родам Streptomyces, Micromonospora и Bacillus. Отличительной особенностью строения этих антибиотиков является наличие в молекуле циклического аминоспирта (стрептидин или 2-дезоксистрептамин),. с которым связаны несколько остатков Сахаров и аминосахаров.

Стрептомицин было выделен в 1944 г. из культуральной жидкости Streptomyces griseus. Этот антибиотик отличается высокой активностью в отношении различных патогенных микроорганизмов, включая Mycobacterium tuberculosis. В 1957 г был выделен второй аминогликозидный антибиотик канамицин, который быстро нашел широкое применение в клинике ввиду высокой активности в отношении грамотрицательных бактерий

Структура некоторых аминогликозидных антибиотиков, применяемых в-России, представлена на стр.2.

Антибиотики, содержащие 2-дезоксистрептамин, разделяют на 2 группы, в зависимости от замещения гидроксильных групп аминоспирта (С-4 и С-5 или С-4 и С-б) . Наиболее известным представителем первой группы производных дезоксистрептамина является неомицин, продуцируемый штаммом Streptomyces fradiae. Спектр биологической активности неомицина в основном повторяет спектр стрептомицина. В настоящее время применение этих антибиотиков в медицине ограничено в связи с их побочным действием. В частности стрептомицин вызывает нарушения вестибулярного аппарата и обладает -10довольно сильньм аллергизирующим действием. Кроме того, в последние года приобрели широкое распространение резистентные мутанты. Неомицин ввиду ототоксичности и нефротоксичности либо не применяют в медицине, либо в исключительных случаях используют в композициях только для местного применения. В зарубежных странах применение неомицина в ветеринарии и пищевой промышленности для предотвращения микробиологической порчи продуктов питания запрещено законодательством. В сельском хозяйстве применяют и другие аминогликозиды. В частности для лечения аскаридоза животных применяют гигромицин В и дестомицин. Для лечения болезней растений применяют касугамицин и дестомицин. Эти антибиотики не производятся в России.

Представители второй группы антибиотиков, содержащие 2-дезоксистрептамин(канамицин, гентамицин, сизомицин и тобрамицин), были выделены позднее' стрептомицина и отличаются более высокой активностью и меньшим побочным действием. Канамицин, продуцируемый штаммом Streptomyces kanamyceticus, нашел применения для лечения туберкулеза и инфекций, вызванных грамотрицательными бактериями

Разработка биосинтеза культуры Micromonospora purpurea и химической очистки целевого продукта обеспечивало создание так называемого гентамицинового комплекса, представляющего собой смесь компонентов CI, С1а и С2, отличающихся степенью метилирования С-б сахарного остатка, присоединенного к сахароспирту в -4 положении. Гентамицин в минимальных концентрациях активен в отношении золотистого стафилококка и многих грамотрицательных бактерий. Этот антибиотик широко применяют в клинике для лечения инфекций, вызванных чувствительными к нему микроорганизмами.

За рубежом применяют в клинике антибиотики тобрамицин и сизомицин. Строение тобрамицина сильно напоминает структуру канамицина. Антимикробный спектр тобрамицина почти повторяет спектр гентамицина за исключением того, что тобрамицин более активен в отношении Pseudomonas.

Молекула сизомицина имеет строение очень близкое строению гентамицина и, .как следствие, биологические свойства аналогичны последнему антибиотику.

В результате ацилирования атома азота при С-1 канамицина было получено биологически активное соединение, названное амикацином. Этот аминогликозидный антибиотик отличается довольно широким спектром и высокой активностью в лечении инфекций, вызванных бактериями, резистентными к другим антибиотикам, в том числе группы аминогликозидов.

С помощью химической модификации сизомицина был получен антибиотик нетилмицин (l-N-этил-сизомицин), отличающийся высокой активностью и слабыми токсическими свойствами.

Широкое практическое применение аминогликозидных антибиотиков в медицине и биотехнологии вызвало появление устойчивых вариантов патогенных микроорганизмов. По мере продолжительности применения аминогликозидов проблема резистентности к ним приобретает все большую остроту. Резистентность к этим антибиотикам затрагивает многие роды патогенных микроорганизмов. Так у представителях родов Providencia и Serratia развилась хромосомная резистентность. Широкий спектр резистентности псевдомонад обусловлен сочетанием плазмидной резистентности и изменениями в проницаемости клеток для аминогликозидов. Полагают, что одинаковые формы резистентности наблюдаются как в Европе, так и в США и вызваны не применением определенного антибиотика этой группы, а скорее вообще использованием всей группы аминогликозидных антибиотиков [1-3].

Резистентность к стрептомицину может быть с одной стороны сопряжена с нарушением проницаемости микробной клетки к антибиотику, а с другой изменением 30 3 рибосом бактерий.

Известен также механизм обусловленный переносимым И-фактором инактивации стрептомицина под влиянием ферментов бактерий, катализирующих аденилирование и фосфорилирование молекулы антибиотика. Энтерококки и стафилококки вырабатывают энзим АТФ-зависимую киназу. Этот фермент катализирует фосфорилирование и других аминогликозидов: канамицина, амикацина, неомицина, что приводит к утрате ими биологической активности. С помощью масс-спектрального анализа продуктов ферментативной реакции было выяснено, что у аминогликозидов, содержащих 4,5-ди-замещенный аминосахароспирт (амикаиин, канамицин) присоединяется только одна фосфатная группа, тогда как у антибиотиков, содержащих 4,5-замещенный аминоциклитол (неомицин, рибостамицин и др.) присоединяется 2 фосфатных групп в положениях 3' и 5' .

У амикацина и канамицина фосфорилируется гидроксильная группа в положении 3' .

На основании изучения биохимических свойств АТФ-зависимой киназы сформулированы предложения по создания ингибиторов фермента для борьбы с устойчивостью патогенных микроорганизмов к аминогликозидам [4-6].

Резистентность к гентамицину и канамицину также определяется изменением проницаемости для антибиотика. Энзиматическая инактивация аминогликозидов осуществляется ацетилкоэнзим А-зависимьми ферментами, ацетилирующими аминогруппы аминогликозида, а также ферментами, использующими АТФ для аденилирования определенных гидроксильных групп антибиотиков или АТФ-зависимыми энзимами, катализирукздими фосфорилирование определенных ОН-групп.

Как известно, аминогликозиды наиболее активны в отношении грамотрицательных бактерий. Механизм действия аминогликозидных антибиотиков связан с подавлением синтеза белка у чувствительных патогенных микроорганизмов. Стрептомицин и другие аминогликозиды связываются с малыми (30 S) субчастицами рибосом, изменяя последние таким образом, что нарушается правильное присоединение амино-ацил-т-РНК. Сайты связывания стрептомицина и других аминогликозидов не идентичны. Бактерицидное действие этих антибиотиков является результатом необратимого связывания с рибосомами и, соответственно, их необратимой инактивации.

В настоящее время в медицине наиболее часто применяют гентамицин и тобрамицин. С целью повысить устойчивость аминогликозидов к инактивации были разработан нетилмицин и амикацин. Последний антибиотик является продуктом химической модификации канамицина. Амикацин отличается довольно широком спектром действия, включая микроорганизмы, резистентные к гентамицину и. тобрамицину. Нетилмицин является производным сизомицина. Его структура схожа со строением гентамицина. С1а.

Аминогликозидные антибиотики являются основными препаратами лечения опасных системных инфекций. Аминогликозиды используют также в сочетании с другими антибиотиками. Например, известно сочетание стрептомицина и пенициллина G для лечения эндокардитов, вызванных энтерококками. Стрептомицин и тетрациклин используют в лечении бруцеллеза, а в сочетании с синтетическими препаратами для лечения туберкулеза [7-9].

Несмотря на некоторые различия в спектре биологической активности, аминогликозидные антибиотики в силу близости строения характеризуется схожими фармакокинетическими свойствами и токсичностью.

Наиболее серьезные проявления побочного действия аминогликозидов связаны с нефротоксичностью и ототоксичностью.

Измерения концентрации антибиотиков в крови и на основе -этих определений выбор наиболее рациональных дозировок и схем применения антибиотиков позволяет повысить лечебную эффективность и существенно ослабить токсическое действие препаратов.

Наиболее серьезные и опасные побочные эффекты аминогликозидов связаны с' ототоксичностью и нефротоксичностью. Нарушения слуха и вестибулярного аппарата наблюдаются у 0,5 - 3 % лиц,получавших эти антибиотики. Нарушения слуха могут быть билатеральными, или затрагивать только одно ухо. Ухудшение слуха может проявиться в различные сроки после начала применения антибиотика или даже после отмены аминогликозида. Интенсивность побочного действия на слух, вероятно, зависит от строения аминогликозидного антибиотика. Экспериментальное исследование [10] позволило составить ряд "напряженности" ототоксических свойств аминогликозидных антибиотиков: гентамицин = сизомицин = тобрамицин > амикацин > нетилмицин.

Токсическое действие аминогликозидов на почки обычно проявляется уже на 5 сутки после начала антибиотикотерапии. Нефротоксичность проявляется увеличением содержанием креатинина и азота мочевины в > крови и сопровождается ухудшением концентрирующей способности почек. Кроме того, довольно часто наблюдаются протеинурия, аминоацидурия, глюкозурия и нарушения электролитного баланса. Фильтрационная функция сильно ухудшается в последукщие сроки продолжения лечения аминогликозидными антибиотиками, . но восстанавливается обычно после отмены препарата [11-13]. Возможность проявления нефротоксичности в результате применения гентамицина, тобрамицина и амикацина приблизительно одинакова. Нетилмицин является, по-видимому, наиболее безопасным в этом отношении аминогликозидньм антибиотиком [7].

Многие больные, получавцме аминоглюкозиды экскретируют лизосомальные ферментны, такие как Ы-ацетил-глюкозидаза, Р~ галактозидазы, аминопептидазы и щелочные фосфатазы. Повышенный уровень р-микроглобулина'в моче наблюдается уже через несколько дней после начала применения аминогликозидов.

Точные механизмы нефротоксического действия аминогликозидов не вполне ясны, однако известно что антибиотики даже после однократного приема накапливаются в ренальном кортексе, где удерживается несколько дней [7,14]. Полагают что продолжительность курса лечения и количество накопившегося в почках антибиотика определяют выраженность нефротоксичности [15,16]. Вероятно эти наблюдения не относятся ко всем антибиотикам данной группы. Так, например, неомицин сравнительно слабо накапливается в кортексе, но обладает более ,чем другие аминогликозиды, сильным нефротоксическим действием.

Аминоглйкозидные антибиотики могут на биохимическом уровне оказывать некоторые действия, которые, по крайней мере частично, могут быть ответственными за нефро- и ото-токсичность. Известно, что аминогликозиды взаимодействуют с липопротеинами лизосом, вызывая конформационные изменил последних. Эти антибиотики способны также подавлять активность Ыа-К АТФазы.

Вероятность нефротоксичности возрастает у больных, имеющих в анамнезе болезни почек. Предшествующая терапии аминогликозидами также усиливает риск развития поражений почек при последующих курсах применения этих препаратов [7]. Значительно реже побочное действие аминогликозидных антибиотиков проявляется в виде нейромышечной блокады [17], что объясняется взаимодействием аминогликозидов с кальцием и подавлением выделения ацетилхолина пресинаптическими мембранами. Эта реакция наблюдается после . быстрого введения антибиотика и на фоне применения нейромышечных блокаторов и гипокальцемии. Следует отметить, что отмеченные вьше побочные реакции наблюдается в результате увеличения рекомендованных стандартных дозировок антибиотиков.

Среди других неблагоприятных реакций на лечение аминогликозидами можно упомянуть аллергические реакции, которые иногда проявляются даже анафилактическим шоком. Тератогенное и мутагенное действие этих антибиотиков также представляют потенциальное опасность. Показано, что в эксперименте стрептомицин и канамицин в высоких дозах вызывали нарушения слуха у плода.

Аминогликозидные антибиотики относятся к препаратам, отличающихся узким химиотерапевтическим индексом. Границы концентраций обеспечивающих лечебное действие фактически перекрывают пределы концентраций антибиотиков при которых возможно проявление неблагоприятных побочных эффектов.

Аминогликозиды плохо всасываются из желудочно-кишечного тракта, поэтому для лечения тяжелых системных инфекций препараты вводят внутривенно или внутримышечно. Однако при этих способах введения терапевтическая концентрации в крови могут сильно отличаться в зависимости от особенностей фармакокинетики препарата в индивидуальном организме. Некоторые фармакокинетические параметры этих антибиотиков у здоровых лиц представлены в таблице. Значительные отклонения от указанных значений носят индивидуальный характер. Например, существенные изменения в объеме распределения, что часто наблюдается у пациентов сердечно- сосудистными заболеваниями, сильно влияют на скорость элиминации антибиотика.

На распределение и выведение антибиотика влияют различные факторы, например изменения в метаболизме и экскреции, обусловленные возрастом, полом, характером основного и

• сопровождающего заболевания, влияние взаимодействия с другими применяемыми лекарственными препаратами [18].

Таблица

Основные фармакокинетические показатели аминогликозидных антибиотиков [7,9,15].

Параметр А В

Терапевтическая концентрации пиковые) 6- -10 20-25 мкг/мл потенциальные токсические концентрации (пиковые) 12- -15 30-38,5 мкг/мл

Клиренс 1,33±0,61 мл/мин/кг

Константа скорости элиминации 1, 4±0,4 6 час"1

Период полувыведения 0,5-15 час

Объем распределения 0,05-0,15 литр/кг

Связывание с белками 0-30 %

Выведение с мочой 85-95 %

Примечание: А - данные относящиеся к гентамицину, тобрамицину, нетилмицину, сизомицину. В - то же для амикацина, стрептомицина и канамицина

Фармакокинетика аминогликозидных антибиотиков после внутривенного введения обычно хорошо соответствует одно-частевой модели. Для вычисления важных фармакокинетических параметров достаточно определить концентрацию препарата в крови минимально в два срока - непосредственно после завершения инфузии препарата для определения объем распределения и через интервал соответствующий 1,5-2 периоду полувыведения препарата, известного из литературы для здоровых лиц с целью вычисления константы скорости элиминации антибиотика у данного пациента.

Эту константу вычисляют по кривой зависимости концентрации антибиотика в крови от времени. Период полувыведения и константа элиминации связаны еледукщим уравнением: ti/2=0, 693х1/Кэл. Объем распределения препарата может быть вычислен из следующего уравнения:

V --^х-—

М ^max ~ l^mm Х е J где: Ko-скорость введения, мг/ч t -продолжительность введения, ч С мах-пиковая концентрация, мкг/мл

С min-концентрация существующая в крови перед введением антибиотика, мкг/мл

Кщ -константа скорости элиминации, ч-1

Интервал между введениями антибиотика (Т) может быть определен по следующему уравнению:

1С. Г = -—-xln-^ + f vi m» х.ж где: Кдл -константа скорости элиминации, ч-1

С мах ж-желаемая максимальная (пиковая) концентрация, мкг/мл С mm ж -желаемая минимальная концентрация, мкг/мл t-продолжительность инфузии, ч

Нарушения функций почек приводят к сильному изменению фармакокинетических свойств этих антибиотиков. Для безопасного и эффективного применения аминогликозидов у таких больных особенно важно проводить определение концентраций антибиотика в крови. На основании результатов анализа можно определить индивидуальную дозу антибиотика и уточнить временные интервалы введения повторных доз препарата, обеспечивающие высокую эффективность препарата и безопасность для пациента. В повышении эффективности антибиотикотерапии заинтересованы и лечебные учреждения, стремящиеся к сокращению времени пребывания больных в стационаре [19]. .

Следует отметить, что токсическое действие аминогликозидов может проявляться не только у больных в клинике, но и персонала антибиотических производств, контактирующего с антибиотиком, содержащимся в воздушной среде или технологических жидкостях. Вот почему необходимо разработать универсальный метод определения аминогликозидного антибиотика в крови для лекарственного мониторинга и в окружающей среде производства для экологического мониторинга.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Гордон, Кира Валериановна

-1074. Заключение

В результате проделанной работы по синтезу конъюгатов белок-аминогликозидньм антибиотик был опробован ряд описанных в литературе методов. Выявленные недостатки одних (классического карбодиимидного и с использованием п-бензохинона) не позволили с их применением получить конъюгаты требуемой степени гаптенизации, другие же (двухстадийный глутаральдегидный) после проведенной нами доработки могут быть рекомендованы для синтеза иммунореагентов. Также были предложены оригинальные методы синтеза высокогаптенизированных иммуногенных конъюгатов: карбодиимидньй с предварительным сукцинилированием белка, который можно рекомендовать для модификации белка аминосодержащими гаптенами, в которых отсутствуют другие реакционноспособные в отношении карбодиимида функционалы, и метод, включающий стадии глицидилирования и перйодатного окисления, пригодный для всех аминосодержащих гаптенов. При этом окисленный и модифицированный белок может длительное время храниться в растворенном или лиофилизированном виде.

Результаты, полученные при изучении иммуногенности конъюгатов на мышах различных линий, указывают на возможность получения моноклональных антител против аминогликозидов, что важно в случае массового производства иммунохимических тест-систем. При использовании же для комплектации наборов поликлональных антисывороток показана необходимость мониторинга титра антител и их аффинитета у индивидуальных доноров для производства качественных антисывороток. Также представляет интерес, что иммуногенность конъюгатов не снижается при предельной степени гаптенизации, как это было отмечено Ландштейнером [140].

-108

Синтез конъюгата фосфолипазы С с неомицином, характеризующегося значительньм сохранением ' каталитической активности и ее модуляцией с широком диапазоне специфической антисывороткой, открывает перспективы разработки высокочувствительного липосомального иммунохимического анализа аминогликозидов при условии использования существующих резервов повышения чувствительности, в том числе синтеза конъюгата на основе высокоочищенного фермента с удельной активностью 2000 Ед/мг белка (Sigma). При дальнейшей разработке данной тематики необходимо, однако, показать эффект модуляции активности для всего ряда аминогликозидов.

Твердофазный прямой конкурентный ИФА аминогликозидов, как показано в представленной работе, уже на данной стадии разработки обладает чувствительностью, необходимой для практического использования. При этом сложности с получением стандартного конъюгата с маркерным ферментов в значительной степени компенсируются выделением необходимых фракций на стадии хроматографической очистки продуктов синтеза. Однако, снижение выхода целевого конъюгата делает предпочтительным использование более экономичного и стандартного непрямого конкурентного варианта ИФА. Также следует отметить, что повсеместное использование олигосахаридных остатков пероксидазы для введения гаптенов хотя и на первый взгляд привлекательно вследствие технической простоты, стереохимически неоправдано и требует введения между гаптеном и ферментом спейсера, обеспечивающего пространственную доступность гаптена [141]. Вероятно, в этом направлении необходимо проведение дополнительных исследований других сайтов модификации фермента. В частности привлекательным представляется введение гаптена по остаткам аргинина, грисутствующим в полипептидной цепи ПХ в достаточном. количестве (21 остаток) [142,143]. При этом также появляется возможность

-109снижения изоэлектрической точки фермента, что должно дополнительно уменьшать неспецифическое связывание конъадгата.

Наиболее полно в представленной работе изложены исследования по созданию непрямого конкурентного ИФА. Образцы ИФТС апробированы для применения в доклинических медицинских исследованиях, анализа клинических образцов и экологического мониторинга. На основе полученных результатов в настоящее время разработаны лабораторные регламенты на производство ИФТС исследованной серии аминогликозидов. Для дальнейшего совершенствования этого варианта ИФА можно предложить использование Fab фрагментов иммуноглобулиновой фракции или мон'оклональных антител, что должно повысить крутизну градуировочной зависимости за счет уменьшения двухцентрового связывания и неспецифической сорбции [144], синтез конъюгата Fab-ttX [145]- для сокращения стадий анализа и использование в качестве детектируемой реакции реакцию продолженной хемадЖзуинесценции, что может повысить чувствительность анализа еще на 2 порядка.

-1105 . ВЫЮДЫ

1. Разработаны способы модификации белков-носителей (БСА и овальбумина) аминогликозидньми антибиотиками - гентамицином, неомицином, мономицином и канамицином. Получены конъюгаты, содержащие от 3 до 25 остатков антибиотика на молекулу белка.

2. Проведен скрининг конъюгатов аминогликозидных антибиотиков для выявления соединений, способных вызывать сильный специфический гуморальный иммунный ответ. Специфические антисыворотки высокого титра получены в результате иммунизации конъюгатами, содержащими от 18 до 25 остатков антибиотика на молекулу белка.

3. Изучена динамика биосинтеза антител против аминогликозидных антибиотиков и ,их аффинитета. Показано, что в ходе иммунизации происходит увеличение популяции высокоаффинных антител с Ксв. 109-Ю10.

4. Разработан способ связывания неомицина с фосфолипазой С, обеспечивающий высокую каталитическую активность модифицированного фермента, которая в широком диапазоне модулировалась специфическими к антибиотику антителами. Разработана липосомальная система иммуноферментного анализа антибиотика с чувствительностью 10 мкг/мл.

5. Получены конъюгаты гентамицина с пероксидазой хрена. Показано, чФо конъюгаты, в которых антибиотик присоединен к ферменту через полшерный спейсер, отличаются высоким сродством к антителам (Ксв.= 109) и могут быть использованы в прямом конкурентном ИФА с чувствительностью 0,10 мкг/мл.

6. Получены высокомолекулярные конъюгаты на основе сополимеризованной с неомицином пероксидазы. Разработан прямой конкурентной ИФА неомицина с чувствительностью 0,05 мкг/мл.

7. На основе полученных иммунореагентов разработаны иммуноферментные тест-системы для непрямого . конкурентного

-111айализа аминогликозидных антибиотиков с чувствительностью 20 -5б нг/мл. Показана возможность использования иммуно-ферментных тебт-систем апробированы для проведения терапевтического мониторингу и анализа проб воздуха промышленной зоны антибиотических производств.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гордон, Кира Валериановна, 1998 год

1. Thompson P.R'.-, Hughes D.W., Wright G.D. Regiospecificity of aminoglycoside phosphotransferase from Enterococci and Staphylococci (APH(3' )-3a).// Biochemistry. 1996. - v.35. - №26. - 8686-8695.

2. McKay G.A.,Wright G.D. Catalytic mechanism of enterococcal kanamycin kinase (APH (3' ) -3a) .'viscosity, thio, and solvent isotope effects support a Theorell-Chance mechanism.// Biochemistry. -.1996. v.35. - №26. - p.8680-8685.

3. Buchanan T.M., Faber L.C., Feldman R.A. Brucellosis in United

4. States, 1960-1972. An Abbattoir-associated disease.// Medicine. 1974. - v.53. - p.403-407.

5. Навашин C.M., Фомина И.П. Рациональная антибиотико-терапия.1982. М.: Медицина. - 495с.

6. Brummett R.E., Drug-induced ototoxicity.// Drugs. 1980. -v.19. - p.412- 428.

7. Silverblatt F.J. Antibiotic nephrotoxicity.// Urol.Clin.N.Amer. 1975. - v.2. - p.557-567.

8. Humes D.H., Weinberg J.M., Knauss T.C. Clinical and pathophysiologic aspects of aminoglycoside nephrotoxicity.// Amer. J.Kid.Dis. 1982. - v.l. - p.5-29.

9. Leitman P.S. Aminoglycoside inhibition of renal sodium-potassium ATPase.A possible model for nephrotoxicity.// • Antimicrob. Ag.Chemother. 1978. v.18. - p.328.

10. Edwards C.Q., Smith C.R., Baughman.K.L.,et al. Concentrations of gentamicin and amikacin in human kidneys.//Antimicrob. Chemother. 1976. - v.9. - p.925-927.

11. Ланчини Д., Паренти Ф.//В кн. Антибиотики. 1985. - М.: Медицина. - 270с.

12. Guay D.R.P. Netilmicin.//Drug Int.Clin.Pharm. 1983. v.17. - p.83-91.

13. L'Hommedieau C.S., Nicolas D., Armes D.A., et al. Potentiation of magnesium sulfate-induced neuromuscular-114weakness by gentamicin, tobramicin, andamikacin.//J.Pediatr. 1983. - v.102. - №4. - p.629-631.

14. Boothe D.M. Therapeutic drug monitoring article.-Internet, 1997, http: / /www. cvm. tamu. edu/vcpl/tdmarticle. htm.

15. Kimelblatt B.J. Cost-benefit analysis of an aminoglycoside monitoring service.//Am.J.Hosp.Pham. 1986. - v.43. - №5.- p.1205-1209.

16. Tayeb O.S. Comparisonof the fluorescence polarization immunoassay and the microbiological assay methods for the determination of gentamicin concentration in human serum.// Ther.Drug.Monit.- 1986. v.8. - №2. - p.232-235.

17. Jehl F., Gallion C., Monteil Y. High-performance liquid chromatography of antibiotics.//J.Chromatogr.(Biomed. Appl.)- 1990. v.531. - p.509-548.

18. Riley C.M., Ault J.M. Chromatographic methods for the bioanalysis of antiviral agents.//J.Chromatogr.(Biomed. Appl.) 1990. - v.531. - p.295-368.

19. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б., Гаврилова Е.М.//Теория и практика иммуноферментного анализа.- М.: ,Высш.шк. 1991. - с.288.

20. Kitagawa Т. Enzyme Immunoassay. // Igaku-Shoin, Tokyo. 1981- p.136-145.

21. Wisdom G.B. Enzyme-immunoassay.//Clin.Chem. 1976. - v.22.- p.1234-1255.

22. Butler V.P., The immunological assays of drugs.// . Pharmacol.Rev. 1978. v.29. - p.103-184.

23. Lowrence J.L. Comparison of particle-enhanced turbidimetric inhibition immunoassay and fluorescence polarization immunoassay using monoclonal antibodies to theophylline.// Ther.Drug.Monit.- 1986. v.8. - №2. - p.228-231.

24. Nishikawa Т., Saito M. Competitive nephelometric immunoassay of carbamazepine and its epoxide metabolite in patient blood plasma.// J.Pharmacobio-Dynamics. 1981. - v.4. - №1.p.77-83.

25. Nishikawa Т., Kubo H., Saito M. Competitive nephelometric immunoassay method for antiepileptic drugs in patient blood.//J. Immunol.Meth. 1979. - v.29. - №1. - p.85-89.

26. Li P.K., Lee J.T., Schreiber R.M. Rapid quantification of pentobarbital in serum by fluorescence polarization immunoassay.//Clin.Chem. 1984. - v.30. - №2. - p.307-308.

27. Кашкин А.П. Им^^оферментный анализ биологически активных веществ.// М.: ЦБНТИ Минмедпром. 1985. - 43с.

28. Кашкин А.П., Немцова Н.Н., Аак О.В. Иммуноферментный анализ лекарственных веществ.//В сб.научн.трудов института им.Пастера "Твердофазный иммуноферментный анализ" -Л. -1988. т.64. - с.59-80.

29. Pesker В.A., Pesker В.М. Advances in hapten immunoassays.// Eur.Drug.Metab.Pharmacokinet.- 1977. v.4. - p.163-170.

30. Митрохина Т.Г., Осипов А.П., Гаврилова Е.М., Сорокина Н.В., Егоров A.M. Гомогенный иммунокофакторный метод определения инсулина.//Прикл.биохим.микробиол. т.19. - №1. - с.143-151.

31. Avrameas S. Recent developments in immunoenzymatic methods.// Fresenius J.Anal.Chem. 1984. - v.317. - №6. -p.647-648.

32. Oellerich M. Enzyme-immunoassay: areview.//J.Clin.Chem.Clin. Biochem. 1984. - v.22. - №12. -p. 895-904.

33. Li T.M., Benovic J.L., Buckler R.T. Homogeneous substrate :■ labeled fluorescent immunoassay for theophylline inserum.//Clin. Chem. 1981. - v.27. - №1. - p.22-26.

34. Wong R.C., Burd J.C., Carrico R.J., Buckler R.T., Thoma J., Boguslaski R.C. Substrate-labeled fluorescent immunoassay for phenytoin in human serum.//Clin.Chem. 1979. - v.25. -№5. - p.686-691.

35. Dandliker W.B., de Saussure V.A. Review article: Fluorescence polarization immunoassay.//Immunochemistry. -1970. v.7-. - p.799-828.

36. Kitagawa T., Fujitake H., Aikawa T. Enzyme immunoassay of" viomycin. New cross-linking reagent for enzyme labelling and a preparation method for antiserum to viomycin./J.Biochem. (Tokyo). 1978.-v.83.- p.1493-1501.

37. Kitagawa T., Kanamaru T., Wakamatsu H., Kato H., Yano S., Asanuma Y. A new method for preparation of an antiserum to penicillin and its application for novel enzyme immunoassayof penicillin.// J.Biochem.(Tokyo) 1978. - v.84. - №2.-p.491-494.

38. Kawasaki T., Munechika H., Kitagawa T. Enzyme immunoassay of blasticidin S. .//Abstr.Papers 100th Annual

39. Meeting.Pharm.Soc. Japan. Tokyo. - 1980. - 5V 1-3S.

40. Mattiasson B„, Svensson K., Borrebaeck C., Jonsson S.f Kronvall G. Non-eguilibrium enzyme immunoassay of• gentamicin.//Clin.Chem. 1978. - v.24. - p.1770-1773.

41. Kabakoff D.S., Leung D., Singh P. An EMIT® assay for gentamicin.//CIin.Chem. 1978. - v.24. -p.105.5.

42. Hodgkinson A.J. Single-reagent polarization fluoroimmunoassay for theophylline inserum.//Ther.Drug.Monit.- 1986. v.8. - №2. - p.236-240.

43. Kampa I.S., Jarnabek J., Hundertmark J.M. A comparison of the EMIT assay with two iodinated radioimmunoassays' for diphenylhydantoin.//Clin.Biochem. 1978. - v.11. - №4. -p.167-168.

44. Kitagawa T, Fujitake T., Taniyama R., Aikawa T. Enzyme-coupled immunoassay of viomycin.//J.Antibiot. 1976.v.29. №12. - p.1343-1345.

45. Eriksen P.B., Andersen 0. Homogeneous enzyme immunoassay of serum digoxin with use of biochromatic analyzer.//Clin.Chem. 1979. -"v.25. - №1. - p.169-171.

46. Kj0ller H.M. A study of enzyme multiplied immunoassay technique (EMIT) for determination of serum digoxin by means of LKB-8600 reaction rateanalyzer.//Scand.J.Clin.Lab.Invest. 1977. - v.37. -Suppl.№147. - p.96.

47. Lacher D.A., Valdes E. Savary J. Enzyme immunoassay of carbamazepine with a centrifugal analyzer.//Clin.Chem. -1979. v.25. - №2. - p.295-298.

48. Lesne M., Kadima L.Assay of digitoxin in plasma by an enzyme-immunoassay technique.//Clin.Chim.Acta. 1978. -v.84. - №2. - p.45-47.

49. Wenk M.R., Hemmann V., StainerT.F. A rapid enzyme immunoassay for netilmicin inserum.//J.Clin.Chem.Clin.Biochem. 1981. - v.19. - №8. -p. 872-873.

50. Braun S.C., Tausch A., Vogt W., Jacob K.,Knedel M. Evaluation of a new valproic acid enzyme immunoassay and-118comparisorr with a capillary gas-chromatographic. method.//Clin.Chem. 1981. - v.27. - №1. - p.169-172.

51. Pesce M.A., Bodourian S.H. Enzyme immunoassay and enzyme inhibition assay of methotrexate with the use of the centrifugal analyzer.//Clin.Chem. 1981. - v.27. - №3. -p.380-384.

52. Buckman K., Claiborn K., deGuzman M., Walberg C.B., Haywood L.J. Lidocain efficacy and toxicity assessed by a new rapid method.// Clin.Pharm.Ther. 1980. - v.28. - №2. - p.177-181.

53. Budd R.D. Methadone EMIT structure versus reactivity.//Clin.'Toxicol. - 1981. - v.18. - №7. - p.783-792.

54. Jailkhani B.L., Jaffery N.F. Comparison of colorimetric & EMIT methods for estimation of phenytoin.//Indian J.Med.Res.- 1984. -'v.79. p.679-683.•

55. Koup J.R., Brodsky B. Comparison of homogeneous enzyme immunoassay and high-pressure liquid chromatography for the determination of theophylline concentration in serum.// Amer.Rev.Resper.Di.s. 1982. - v.117. - №6. - p. 1135-1138.

56. Jolley M.E., Stroupe S.D., Wang C.J., Panas H.N., Keegan C.L., Schmidt R»LV/ Schwenzer K.S. Fluorescence polarization immunoassay I. Monitoring aminogllycoside antibiotics in serum and plasma././Clin.Chem. . 1981. - v.27. - №7.p. 1190-1197.

57. Fujiwara K., Saita T., Takenawa N., Matsumoto N.f Kitagawa T. Enzyme-linked immunosorbent assay for the quantification of actinomycin D using (3-D-galactosidase as a label.//Cancer Res. 1988. - v.48. - p.4843-4847.

58. Brown S.A., Newkirk D.R., Hunter R.P., Smith G.C,, Sugimoto K. Extraction methods for quantitation of gentamicin residues from tissues using fluorescence polarization immunoassay.// J.Assoc.Anal.Chem. 1990. - v.73. - №3. - p.479-483.

59. Haga M., Sugavara S., Itagaki H. Drug sensor: liposome immunosensor for theophylline.// Anal.Biochem. 1981. -v. 118. - №2. - p.286-293.

60. Haga M., Itagaki H., Sugavara S., Okano T. Liposome immunosensor for theophylline.//Biochem.Biophys.Res.Commun. 1980.- v.95. - p.187-195.

61. Freytag J.W., Litchfield W.J. Liposome mediated immunoassays for small haptens (digoxin) independent of,compliment.//J.Immunol. Methods. 1984. - v.70. - №2. -p.133-140.

62. Engvall E., Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) . Quantitative assay of immunoglobulin G.//Immunochemistry. 1971. - v;i8 - p.871-874.

63. O'Beirn A.J., Cooper H.R. Heterogeneous enzyme immqnoassay.// J.Histochem.Cytochem. 1979. - v.27. -p.1148-1162.

64. Вербов B.H. Принципы твердофазного иммуноферментного анализа. .//В сб.научн.трудов института им.Пастера-120- .

65. Твердофазный иммуноферментный анализ" -JI. -1988. -т.64. с.3-27.

66. Suyden D.D. Latest development in the enzyme-linked immunosorbent assay.//Avian Dis. 1986. - v.30. - №1. -p.19-23.

67. Иммуноферментньй анализ. Под ред. Нго Т.Т., Ленхоффа Г. -М.: Мир. 1988. - 444с.

68. Weemen В.К. ELISA: highlights of the present state of the art.//J.Virol.Meth. 1985. - v.10. -№4. -p.371-378.

69. Fraytag J.W., Dickinsong J.C., Tseng S.Y. A highly sensitive affinity-column-mediated immunometric assay, as exemplified by digoxin.//Clin.Chem. 1984. - ,v.30. - №3. - p.417-420.

70. Fraytag J.W.Lau H.P., Wadsley J.J. Affinity-column-mediated immunoenzymometric assays: influence of affinity-column ligand and valency of antibody-enzymeconjugates.//Clin.Chem. 1984. - v.30. - №9. - p.1494-1498.

71. Chandler H.M., Cox J.C., Healey K. An investigation of the use of urease-antibody conjugates in. enzyme immunoassay.// J.Immunol. Meth. 1982. - v.53. - №2. - p.187-194.

72. Johnsson R.B.Jr., Libby R.M., Nakamura R.M. Comparison of glucose oxidase and peroxidase labelled antigen in enzyme immunoassay.//J.Immunoassay. 1980. - v.l. - №1.- p.27-37.

73. Blake C., Could B.J.: Use of enzymes in immunoassay techniques: a review.//Analyst. 1984. - v.109. - №5. -p.533-547.

74. Imagawa M., Hashida S., Ohta Y., Ishikawa E. Evaluation of the p-D-galactosidase from Escherichia coli and horseradish peroxidase as labels by sandwich enzymeimmunoassay.//Ann.Clin.Biochem. 1984. - v.21. - p.310-317.

75. Pradelles P., Maclouf J. Development of sensitive semi-automatized enzyme immunoassay of leukotriene-using-121acetylcholinesterase-leukotriene conjugate as a tracer.// Prostaglandines. 1984. - v.28. - №5. - p.661.

76. Shrivastav T.G., Kumari G.L., Rao P.N. Enzyme immunoassay of Cortisol in human plasma using penicillinase as a label.//

77. Clin.Chim.Acta. 1988. - v.174. - p.83-92.

78. Rodighiero V. Therapeutic drug monitoring of cyclosporin, practical application and limitations.//Clin.Pharmacokinet. 1989. - v.16. - №1. - p.27-37.

79. Полевая О.Ю., Ковалев И.В., Ровакидзе Т.Н. Количественное определение фармакологических веществ в организме иммуноферментными методами.//Хим.-фарм.журнал. 1980. -т. 14. ->11. - р.31-40.

80. Uchihara К., Kori Y., Kitagawa Т. Enzyme immunoassay of cephalexin.//Abstr.Papers 100th Annual

81. Meeting.Pharm.Soc.Japan. Tokyo. - 1980. - 5V 1-2S.

82. Standefer J.C., Saunders G.C. Enzyme immunoassay for gentamicin.//Clin.Chem. 1978. -v.24. - p.1903-1907. ;

83. Erlanger В.F. Principles and methods for the preparation of drug-protein conjugates for immunologicalstudies.//Pharmacol.Rev.- 1973. v.25. - p.271-280.

84. Hamburger R.N. Chloramphenicol-specific antibody.//Science -1966. v.152. - p.203-205.

85. Pesker В .A., Pesker B.M., Levine L. Specificities of antibodies to.normetanephrine.//Eur.J.Biochem. — 1972. — v.26. 191-195.

86. Isetta A.M., Minghetti A., Radojkovic J., Vasile C., Celada F. Affinity and specificity of penicillin-antibody interaction dermined by an enzyme (E. coli ß-galactosidase) immunoassay.// Bur.J.Immunol. 1976. - v.6. - p.737-742.

87. Miura Т., Kouno H., Kitagawa T. Detection of residual penicillin in milk by sensitive enzyme immunoassay.// J.Pharmacobio-Dynamics. -1981. -v.4. №9. - p.706-710.

88. Mokry J. Versatility of immunohistochemical reactions:comprehensive survey of detection systems.//Acta Medica. — 1996. v.39. - №4. - p.129-140.

89. Scouten W.H. A survey of enzyme coupling techniques.// Me'ch.Enzymol. 1987. - v. 135. - pt.B. - p.30-65.

90. Рукосуев B.C. К методике получения растворимого комплекса . пероксидаза-антипероксидаза (ПАП).//В сб.научн.трудов

91. Центрального ин-та усовершенствования врачей. 1980. -т.234ю - с.75-82. .

92. Ш. Cqrdell jJ.L,> ; Falini В., Erb&r W-Jii Inttiunoenzyrtiaticlabelling of monoclonal antibodies'using1 immune complexes of-123alkaline phosphatase (APAAPcomplexes) .//:J.Histochem.Cytochem. 1984. - v.32. - №2. -p. 219-229.

93. Hsu S.—M., Raine L., Fanger H. Use of avidin-biotin-peroxidase complex (ABC) in immunoperoxidase techniques.// J.Histochem. Cytochem. 1981. - v.29. - №4. - p.577-580.

94. Guesdon J.-L., Ternynck T. The use of avidin-biotin interaction in immunoenzymatic techniques.//J. Histochem.• Cytochem. 1979. - v.27. - №8. - p.1131-1139.

95. Butler J,E. The use of new biotin binding protein -streptavidin in immunochemical techniques.//Mol. Immunol. -1986. -'v.23. - №9. - p.971-982.

96. Madri J.A., Keneth W., Barwick M.D. Use of avidin-biotin complex in ELISA system.//Lab.Invest. -.1983. -v.48. №1.- p.98-105.

97. Kendall C., Ionescu-Matiu I., Dreesman G.R. Utilization of the biotin/avidin system to amplify the sensitivity of the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).//J.Immunol.Meth.- 1983. v.56. - №3. - p.329-339.

98. Shaap A.P. Chemiluminescent substrates for alkalinephosphatase and p-galactosidaseA application to ultrasensitive enzyme-linked immunoassays and DNA-probes.//J.Bioluminescence and Chemiluminescence. -1988. .-v.2. №4. - p.165.

99. Bronstein I. Novel chemiluminescent enzyme substrates and their application in immunoassays.//J.Bioluminescence and Chemiluminescence. -1988. v.2. - №4. - p.186.

100. Vlasenko S.B., Yegorov A.M. Acceleration mechanism of luminol peroxidase oxidation reaction in presence of enhancing substrates.// J.Bioluminescence and Chemiluminescence. -1988. v.2. - №4. - p.272-.

101. Beale E.G., Deeb E.A., Handley R., Akhavan-Tafti H., .Shaap A.P. A rapid and simple chemiluminescent assay for bacterial (3-galactosidase.//BioTechniques. 1992. - v.12. - №3.p.320.

102. Ottolenghi A. Estimation and subcellular distribution of the lecithinase activity in rat intestinal mucose. //J.Lipid.Res. 1964. - v.5. - №4. - p.532-537.

103. Chen P.S., .Toribara T.Y., Warner H. Microdetermination of phosphorus.//Anal.Chem. 1956. - v.11. - p.1756-1759.

104. Кленин В.И., Щеголов С.Ю., Лаврущиц В.И. Характеристические функции светорассеяния дисперсных'' систем. — Саратов: Изд-во Сарат.ун-та, 1977. - 97с.

105. Tijssen P., Kurstak.E. Highly efficient and simple methods for the preparation of peroxidase and active peroxidase-antibody conjugate for enzyme immunoassays.//Anal.Biochem. -1984. v.136. - p.451-457.

106. А.с. № 1607573 СССР, МКИ G 01 N 33/53, Способ получения конъюгатов аминогликозидов с белком. Н.Н.Немцова, А.П.Кащкин, К.В.Шифрина, Э.А.Арене. заявл.3.02.88,№ 4417088.

107. Hardy , P.M., Nicholls A.C., Rydon H.N. The nature of the cross-linking of proteins by glutaraldehyde with the amino-groups of 6-aminohexanoic acid and of a-N-acetyl-lysine.// J. Chem. Soc. Perkin 1 1976. - v.9. - p.958-962.

108. Tijssen P. Practice and theory of enzyme immunoassay.//Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology./Burdon R.M., Knippenberg P.H. (Eds.). -N.Y.-Oxford. ESP. -1985. - v.15. -p.548.

109. Citro G., Verdina A., Galati R., Floridi A. Quantitation of adriamicin content by a sensitive immunochemical assay.//Anticancer Res. 1988.- v.8.- p.549-552.

110. The peptides. Analysis, synthesis, biology./ Gross E. (Ed.). N.Y.-L. - Acad.Press. - 1979. - v.l. -458 p.

111. Lewis J. Radioimmunoassay of antibiotic: gentamicin.//Nature New Biol. 1972. - v.239. - p.214-216.122. 'Gilles M.A. Stability of water-soluble carbodiimides in aqueous solution.//Anal.Biochem. <1990. - v.184. - №2. -p.244-248.

112. Habeeb A.F.S.A. Quantitation of conformational changes on chemical modification of proteins. Use of succinylated proteins as a model.//Arch.Biochem.Biophis.1967. v.121. - №3. - p.652-664.

113. Коршак В. В., Штильман М.И. Полимеры в процессах иммобилизации и модификации природных: соединений. М: Наука - 1984. -261с.

114. Li Conan K.N. ELISA-based determination of immunological binding constants.//Mol.Immunol. 1985.- v.22.- №3.- p.321-327.

115. Kemp H.A., Morgan R.A. Studies on the detrimental effects of bivalent binding in a microtitration plate ELISA and possible remedies.//J. Immunol. Methods 1986. - v. 94.p. 65-72.

116. Bachas L.G., Meyerhoff M.E. Theoretical models for predicting the effect of bridging group recognition and conjugate substitution on hapten enzyme immunoassay dose-response curves.//Anal. Biochem. 1986.- v.156.- p.223-238.

117. Nieto A., Gaya A., Jansa M., Moreno C., Vives J. Direct measurement of antibody affinity distribution by hapten-inhibition enzime immunoassay.//Mol. Immunol. 1984.v.21.-№6.- p.537-543.

118. Pullen C.P. Antibody avidity determination by ELISA using thiocyanate elution.//J.Immunol.Methods 1986. - v.86. -№1. - p.83-87.

119. Liu D., Zhou F., Huang L. Characterization of plasma-stabilized liposomes composed of dioleoyl-phospatidyletanolamine and oleic acid.// Biochem. Biophys. Res. Commuri. 1989. - v.162. - №1. - p.326-333.

120. Urano S., Yano K., Matsuo M. Membrane-stabilizing effect of vitamin E: effect of a-tocopherol and its model compounds on-127fluidity of lecithin liposomes.//Biochem.Biophys.Res.Commun. 1988. - v.150. - №1. - p.469-475.

121. Stoyanovsky D.A., Kagan V.E., Packer L. Iron binding to alpha-tocopherol-containing phospholipid liposomes.// Biochem. Biophys. Res.Commun. 1989. - v. 160. - №2. -p.834-838.

122. Aranda F.J., Coutinho A., B|rberan-Santos M.N., Prieto M.J.E., Gomez-Fernandez J.C.//Biochim.Biophys .Acta 1989. -v.985. - p.26-32.

123. Окунь B.M. Анализ сравнительной способности пероксидазы разных партий к перйодатному окислению и конъюгированию с биотинсвязывающим белком.//Деп.ВИНИТИ 12.07.91. № 2 995-В91.

124. Окунь. В.М., Аак О.В. Сопоставление систем детекции биотиновой метки на основе биотинсвязываюцего белка актинавидина.// В межвуз.сб.научн.трудов "Новое в практике лабораторных исследований инфекционных заболеваний". Н.Новгород: 1991. - с.12-16.

125. Claasen Е., Van Rooijen N. A trinitrophenyl (TNP) poly-L-lysine - horseradish peroxidase conjugate for the determination of anti-TNP antibodies in vivo.//J.Histochem.Cytochem. - 1985.- v.33.- №8.- p.840-844.

126. Предельно допустимые концентрации вредных веществ в воздухе рабочей зоны./Под ред. Измерова Н.Ф.- М.: 1991. - 586с.1^0. Landsteiner К. Specificity of serological reactions.-Cambridge (USA) .: Harvard University Press.- 1946.- 415p.

127. DuerKsen-Hughes P.J., Williamson M.M., Wilkinson K.D.//Affinity chromatography using protein immobilized via arginine residues: purification of ubiquitin carboxyl-terminal hydrolases.//Biochemistry. 1989. - v.28. - №21. -p.8530-8536. ■