Иммунные протеасомы в развитии иммунной системы и в условиях эффективного и неэффективного иммунного ответа у крыс тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.05, кандидат биологических наук Карпова, Ярослава Дмитриевна

• Карпова, Ярослава Дмитриевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Карпова, Ярослава Дмитриевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Структура протеасомы и ее функционирование

1.119Б субчастица

1.2 20Б субчастица

1.3 Убиквитинирование белка-субстрата

1.4 Биогенез 208 протеасом

2 Иммунные протеасомы и их функции

2.1 Иммунные протеасомы, строение и сборка

2.2 Участие иммунных протеасом в образовании антигенного эпитопа

2.3 Участие иммунных протеасом в запуске сигнала на уничтожение дефектных клеток

2.4 Участие иммунных протеасом в образовании антигенных эпитопов из ВЮРэ

2.5 Участие иммунных протеасом в активации наивных СИ8 Т-лимфоцитов

2.6 Участие тимопротеасом в положительной селекции тимоцитов

2.7 Участие иммунных протеасом в отрицательной селекции тимоцитов

2.8 Неиммунные функции иммунных протеасом

3 Лимфоидные органы иммунной системы и нелимфоидные органы

3.1 Взаимоотношения между центральными и периферическими органами иммунной системы и нелимфоидными органами

3.2 Строение селезенки

3.3 Строение печени

3.4 Особенности иммунитета печени

3.4.1 АПК клетки печени и специфический иммунный ответ

3.4.2 Неспецифический иммунный ответ в печени

3.5 Возможная роль протеасом в развитии портальной толерантности

2

5 Иммунные протеасомы и злокачественные опухоли

5.1 Иммунные протеасомы в развитии раковых опухолей

5.2 Особенности роста и регрессии опухоли Walker 256, трансплантированной крысам линии Brattleboro

6 Заключение

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1 Животные и схемы экспериментов

1.1 Схема работы по исследованию иммунных протеасом в раннем развитии

1.2 Схема работы по исследованию иммунных протеасом в развитии донор-специфической иммунологической портальной толерантности

1.3 Схема работы по исследованию иммунных протеасом при росте и регрессии злокачественной опухоли Walker 256у крыс линий WAG и Brattleboro

2 Получение осветленных гомогенатов органов

3 Определение активностей протеасом

4 Вестерн-блоттинг

5 Приготовление криостатных срезов органов и последующее иммунофлуоресцентное окрашивание

6 Выделение мононуклеарных клеток печени

7 Проточная цитометрия

8 Статистический анализ

РЕЗУЛЬТАТЫ

1 Протеасомы в раннем развитии селезенки и печени крысы

1.1 Изменение уровня иммунных протеасом, 1 ЯБ-активатора протеасом и тотального пула протеасом в раннем развитии печени и селезенки крысы

1.2 Химотрипсин- и каспазаподобная активности протеасом в раннем развитии печени и селезенки крыс

1.3 Распределение иммунных протеасом по клеткам селезенки и печени

1.3.1 Иммуногистохимическое исследование клеток на срезах селезенки

з

1.3.2 Иммуногистохимическое исследование клеток на срезах печени

1.3.3. Иммуноцитохимическое исследование мононуклеарных клеток

печени

1.4 Изменение количества иммунных протеасом в печени плода при индукции воспаления у матери инъекцией LPS

2 Иммунные протеасомы при индукции донорспецифической толерантности

2.1 Уровень половых гормонов у различных групп животных

2.2 Гистологическая картина трансплантатов на 30 сутки

2.3 Содержание протеасом в селезенке, печени и аллотрансплантате яичника

2.4 Активность протеасом в селезенке, печени и аллотрансплантате яичника

2.5 Иммуногистохимическое исследование аллотрансплантата яичника

3 Протеасомы в опухоли Walker 256 у крыс линий WAG и Brattleboro

3.1 Протеасомы в опухоли Walker 256у крыс линии Brattleboro

3.2 Протеасомы в опухоли Walker 256у крыс линии WAG

3.3 Экспрессия молекул МНС класса I в опухоли Walker 256у крыс линии

Brattleboro и WAG

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Иммунные протеасомы в раннем онтогенезе иммунной системы

1.1 Иммунные протеасомы в развивающейся селезенке

1.1.1 Изменение количества иммунных протеасом в развивающейся селезенке

1.1.2 Активность протеасом в развивающейся селезенке

1.1.3 Иммунные протеасмоы в клетках формирующейся селезенки

1.1.4 Особенности формирования морфофункциональных зон селезенки

1.2 Иммунные протеасомы в развивающейся печени

1.2.2 Количество иммунных протеасом в развивающейся печени

1.2.2 Активность протеасом в развивающейся печени

1.1.3 Иммунные протеасмоы в клетках формирующейся печени

1.3 Заключение: возможные особенности работы иммунной системы в раннем развити, связанные с функционированием иммунных

протеасом

1.4. Иммунные протеасомы при индукции воспаления в эмбрионалном

развитии

2 Иммунные протеасомы при эффективном и неэффективном иммунном ответе

2.1 Иммунные протеасомы в развитии донорспецифической

толерантности

2.1.1. Иммунные протеасомы в селезенке, печени и трансплантатах при

развитии ДСТ

2.1.2 Активность протеасом в исследуемых органах при развитии ДСТ

2.2 Иммунные протеасомы при росте и регрессии опухоли

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АВП - Аргинин-вазопрессин

АПК - Антигенпредставляющие клетки

АТФ - Аденозинтрифосфат

ДНК - Дезоксирибонуклеиновая кислота

ДСТ - Донорспецифическая толерантность

мРНК - матричная Рибонуклеиновая кислота

ПААГ - Полиакриламидный гель

ЭДТА- Этилендиаминтетрауксусная кислота

сАМР - cyclic Adenosin monophosphate

CD - Cluster of differentiation

DRiPs - Defective ribosomal products

ECL - Enhanced chemiluminescence

FITC - Fluorescein isothiocyanate

Foxp3 - Forkhead box P3

cGMP - cyclic Guanosine monophosphate

GTP - Guanosine triphosphate

HSC - Hepatic stellate cells

IgG - Immunoglobulin type G

IFN - Interferon

IkK - IkB kinase

IL - Interleukin

INK - c-Jun N-terminal kinases КС - Kupffer cells

KIRs - Killer immunoglobulin-like receptors LMP - Low molecular mass polypeptide LPS - Lipopolysaccharide LSEC - Liver sinusoidal endothelial cells МАРК - Mitogen-activated protein kinase MHC - Major histocompatibility complex

MICA - MHC class I polypeptide-related sequence A

NF-kB - Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells

NK - Natural killer cells

NKG2 - Natural killer G2 receptors

NKT - Natural killer T-cells

NKp46 - Natural killer p46 receptors

PALS - Periarteriolar lymphoid sheath

PBS - Phosphate buffered saline

PD-1 - Programmed Death

PD-1L - Programmed Death lligand

PE - Phycoerythrin

PGE2 - Prostaglandin E2

15d-PGJ2 - 15-Deoxy-Delta-l2,14-prostaglandin J2

POMP - Proteasome maturation protein

RDPs - Rapidly degraded polepetides

RT1A - Rano class 1 histocompatibility antigen A

SDPs - Slowly degraded polepetides

SDS - Sodium dodecyl sulfate

SE-1 - Sinusoidal endothelial cells

TAP - Transporter associated with antigen presentation

TCR - T-cells receptor

TGF-ß - Transforming growth factor ß

TLR - Toll-like receptors

Treg - T regulatory cells

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Иммунные протеасомы в развитии иммунной системы и в условиях эффективного и неэффективного иммунного ответа у крыс»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. Изучение молекулярных механизмов становления иммунной системы в онтогенезе и развития иммунных реакций и иммунологической толерантности является актуальной проблемой современной биологии. Решение данной проблемы поможет понять, в какой период онтогенеза начинает функционировать иммунитет, чем определяется развитие иммунных реакций или иммунологической толерантности в ответ на появление того или иного антигена, и выявить причины различных нарушений в работе иммунной системы. В связи с этим наиболее перспективным представляется исследование иммунных протеасом, играющих ключевую роль в образовании антигенных эпитопов из чужеродных белков в клетках лимфоидных и нелимфоидных органов. Совместно с молекулами главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) класса I антигенные эпитопы выносятся на поверхность клеток для представления Т-лимфоцитам СБ8+-фенотипа. В антигенпредставляющих клетках вторичных лимфоидных органов этот процесс важен для активации наивных СБ8+-лимфоцитов, а в клетках любого иного органа, за исключением головного мозга, - для предъявления их цитотоксическим Т-лимфоцитам. В рамках данной проблемы наиболее актуально исследование иммунных протеасом селезенки, вторичного лимфоидного органа, ответственного за развитие иммунных реакций, и печени - органа с особым иммунным статусом. Печень является местом развития иммунологической толерантности к пищевым и другим попадающим в нее антигенам, в эмбриональный период печень выполняет функции первичного лимфоидного органа. Вместе с тем, в случае инфицирования клеток печени вирусами гепатитов зараженные гепатоциты служат мишенями Т-клеточного иммунного ответа, эффективность которого определяется уровнем иммунных протеасом. Не меньший интерес представляет изучение экспрессии иммунных протеасом в клетках злокачественных опухолей при их развитии и

8

регрессии и в клетках трансплантатов при индукции иммунологической толерантности или в ее отсутствие. Выявление особенностей функционирования иммунных протеасом в различных иммунологических ситуациях может прояснить роль отдельных форм иммунных протеасом.

Цель работы - исследовать особенности экспрессии иммунных протеасом в развитии иммунной системы в раннем онтогенезе и в различных иммунологических ситуациях: при росте и регрессии злокачественной опухоли и трансплантации ткани яичника.

Задачи:

1. Изучить динамику экспрессии и распределения иммунных протеасом в селезенке и печени крысы в раннем онтогенезе в сравнении с изменениями химотрипсин- и каспазаподобной активностей и экспрессии тотального пула протеасом.

2. Исследовать относительный уровень иммунных протеасом в печени плодов крысы после индукции воспаления у матери введением липополисахарида.

3. Выявить особенности экспрессии иммунных протеасом в карциносаркоме Walker 256 при ее росте у крыс линии WAG и при ее регрессии у крыс линии Brattleboro.

4. Исследовать относительное содержание иммунных протеасом в трансплантате ткани яичника и в печени реципиента в условиях индукции донорспецифической портальной толерантности и в ее отсутствие.

Научная новизна. Впервые изучена динамика экспрессии иммунных протеасом в селезенке и печени крысы в эмбриональном и раннем постнатальном развитии и выявлена связь этой динамики с клеточными процессами, происходящими в этих органах. Обнаружены особенности миграции В- и Т-лимфоцитов из красной пульпы в белую пульпу в развивающейся селезенке и показано, что миграция Т-лимфоцитов завершается к концу третьей постнатальной недели - именно в тот период, когда возрастает экспрессия иммунных протеасом в гепатоцитах. Таким

9

образом, выявлены причины неэффективности иммунитета в первые недели после рождения.

Впервые исследованы особенности функционирования иммунных протеасом в процессе регрессии опухоли (на модели карциносаркомы Walker 256, трансплантированной крысам линии Brattleboro). Показано повышение экспрессии иммунных протеасом в клетках опухоли в период, предшествующий началу ее регрессии, что может объяснить причину распознавания опухоли иммунной системой.

Впервые описана разница функций различных форм иммунных протеасом при трансплантации: иммунные протеасомы, содержащие субъединицу LMP7, важны для развития иммунных реакций и отторжения трансплантата, в то время как иммунные протеасомы, содержащие субъединицу LMP2, играют роль в развитии иммунологической толерантности и приживлении трансплантата.

Научная и практическая значимость работы. Полученные результаты важны как для понимания молекулярных механизмов становления и регуляции иммунной системы, так и для практического применения в медицине - для разработки инновационных подходов к противоопухолевой терапии и создания препаратов, регулирующих на молекулярном уровне процесс приживления трансплантатов. Результаты и выводы диссертации могут быть взяты за основу для разработки новых курсов лекций по биологии развития, физиологии и иммунологии.

Личное участие автора. Все разделы диссертации выполнены непосредственно автором или при его активном участии в лаборатории биохимии Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Апробация работы. Работа прошла апробацию на VI симпозиуме «Химия протеолитических ферментов» (Москва, 23-25 апреля 2007 г.), Международной научной конференции «Протеолиз, механизмы его регуляции и роль в физиологии и патологии клетки» (Минск, Беларусь, 25-26 октября 2007 г.), Конференции «Современные проблемы биологии развития»

ю

(Москва, 14-16 ноября 2007 г.), Пятой конференции по экспериментальной и трансляционной онкологии (Краньска Гора, Словения, 26-30 марта 2008 г.), XV школе «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 19-24 октября 2008 г.), Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2007 г., 2010 г., 2011 г.), Первом международном конгрессе по исследованию рака (Антапия, Турция, 21-24 мая 2009 г.), IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 23-27 июня 2009 г.), Конференции ЕМВО (Барселона, Испания, 4-7 сентября 2010 г.), Пятом Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 8-10 октября 2010 г.), V Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Петрозаводск, 8-12 августа 2011 г.), 36-м конгрессе БЕВ8 «Биохимия для медицины завтра» (Турин, Италия, 25-30 июня, 2011 г.).

Публикации по теме диссертации. По теме диссертации опубликованы 4 статьи в журналах перечня ВАК, 3 статьи в иностранных рецензируемых журналах, 12 тезисов докладов на Российских конференциях, 5 тезисов докладов на зарубежных конференциях.

Работа поддержана Российским фондом фундаментальных исследований (гранты № 06-04-48229-а и № 09-04-00077-а) и Министерством образования и науки Российской Федерации (госконтракт № 02.512.12.2047).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Структура протеасомы и ее функционирование

Для нормальной жизнедеятельности и функционирования клетки необходимо громадное количество правильно работающих белков. Белок, который имеет неправильную структуру из-за мутации или ошибки в синтезе, или тот, который уже отработал и больше не нужен клетке, необходимо вовремя уничтожить. В противном случае это может закончиться летально как для клетки, так и для всего организма. Функцию разрушения таких внутриклеточных белков выполняют специализированные мультисубъединичные белковые комплексы - протеасомы (Coux et al., 1996). Протеасомы обладают несколькими протеазными активностями и в клетках эукариот представлены множественными субтипами.

26S протеасома состоит из трех частей: 20S внутренней (коровой) части и двух 19S субчастиц, расположенных с двух сторон от коровой части (рис. 1А). 19S субчастица связывает, подготавливает к гидролизу и «проталкивает» белок-субстрат в 20 S субчастицу, в которой и происходит его деградация. Протеасома не способна сама распознать белок, который нужно гидролизовать. Для этого он метится специальной системой ферментов цепочкой из не менее четырех белков-убиквитинов. Рассмотрим подробнее строение 26S протеасомы.

1.119S субчастица.

19S субчастица состоит из 17 субъединиц, гетерогенных по молекулярной массе, аминокислотной последовательности и структуре (Voges et al., 1999). В состав этой субчастицы входят два комплекса: base и lid (основной комплекс и крышка), выполняющие различные функции. Base-комплекс состоит из девяти субъединиц (Rptl-Rpt6, Rpnl, Rpn2, RpnlO), шесть из которых (Rptl-Rpt6) обладают АТФ-гидролизующей активностью и образуют кольцо, которое присоединяется к 20S протеолитической части.

А

20S-субчастица

субчастица

19S-

ß кольца

а кольцо

а кольцо

РисЛ. Модель 26S (А) и 20S (Б) nporeaco« (по Столярову С. Д.. Институт биологии развития им. Н К. Кольцова РАН).

Lid-комплекс располагается над base и состоит из восьми негидролизующих АТФ субъединиц (Rpn3, Rpn5-Rpn9, Rpnl 1 и Rpnl2) (рис. 2) (Sharon et al., 2006). Base- и lid-комплексы связаны друг с другом посредством Rpn 10, которую относят к base-комплексу. Связывание протеасомы с субстратом осуществляет lid-комплекс. Механизм этого процесса еще до конца не ясен. Было обнаружено, что субъединицы Rpn 10, Rpn5 и Rpn6 способны связывать полиубиквитиновую цепь, которой метится большинство белков-субстратов ( Verma et al., 2004; Richly et al., 2005). После того, как произошло связывание белкового субстрата с протеасомой, и перед тем, как произойдет его гидролиз в центральной камере, необходимо деубиквитинировать и «развернуть» третичную структуру этого белка (Forster, Hill, 2003). Эту функцию также выполняет 19S субчастица.

Rpr 1t

я r~ Л Субъедгапщя

v

6 \ J'"

Rpn 8 jRPn 9 Ьазе-коыпяексп

Рис.2. Схема Lid-комплекса 19S субчастицы (Sharon, et al., 2006).

Процесс деубиквитинирования является плохо изученным для эукариотических клеток. Вероятнее всего, он тесно связан с дальнейшим продвижением уже развернутой полипептидной цепочки через АТФазное гексамерное кольцо, образованное субъединицами base-комплекса, во внутренние камеры коровой части. Кроме того, было показано, что 19S субчастица, а в особенности base-комплекс обладают шаперон-подобной активностью (Braun et al., 1999), видимо, работая «в обратном» шаперонам направлении. Разворачивание белка - энергозависимый процесс, требующий большого количества АТФ. Отсоединение убиквитина от белка происходит при участии субъединицы Rpnll lid-комплекса, содержащей активный Zn2+ зависимый металлопротеиназный центр. Он катализирует процесс гидролиза изопептидной связи между молекулой убиквитина и белком-субстратом (Yao, Cohen, 2002).

1.2. 2 OS субчастица.

20S субчастица (или 20S протеасома) представляет собой полый цилиндр длиной 15-17 нм и диаметром 11-12 нм и состоит из четырех расположенных друг над другом колец (рис. 1Б). Внутри цилиндра располагается канал, который расширяется и образует три камеры: две небольшие по краям и одну центральную (рис. 3). Именно в центральной камере и происходит протеолиз. Каждое кольцо коровой части состоит из

семи белковых субъединиц (молекулярной массой 20-35 кДа), причем периферические кольца сформированы разными субъединицами a-типа, а два центральных - разными субъединицами ß -типа. Коровая часть протеасомы млекопитающих состоит из семи различных субъединиц а типа (а 1 -7) и семи субъединиц ß типа (ß 1 -7). В целом, строение протеасом млекопитающих можно описать следующей формулой:а1 -7/ßl-7/ßl-7/al-7 (Groll et al., 2005). Каждая субъединица а типа и каждая субъединицы ß типа состоит из flByxß слоев, зажатых с двух сторон четырьмя* -спиралями, с помощью которых и осуществляется взаимодействие субъединиц между собой (как в одном кольце, так и между кольцами). Основное структурное различней и ß субъединиц заключается в различных N-концевых участках. На N-конце а субъединиц есть еще одна -спираль, которая в собранной протеасоме заполняет щель между дв^кя -слоями. N-концевые аминокислоты*, субъединиц формируют ворота-решетку, которая препятствует свободному прохождению белков череза -кольцо (рис. 3). In vitro ворота открываются в присутствии небольшого количества SDS, длинных жирных кислот, гидрофобных белков и др. (Coux et al., 1996) In vivo для прохождения внутрь протеасомы необходима 19S субчастица. Ворота открываются в процессе АТФ-зависимого присоединения 19S части k20S коровой части. В результате этого происходит пространственное замещение N конца субъединицваЗ на субъединицу Rpt2 base-комплекса. Поскольку N-конец субъединицыхЗ взаимодействует со всеми N-концами остальных а субъединица кольца, то изменение положения одного конца ведет за собой изменение положения всех остальных (Groll et al., 2000; Kohler et al., 2001). В результате этой модификации ворота открываются, и развернутые деубиквитинированные полипептиды могут пройти внутрь протеасомы и гидролизоваться (Hutschenreiter et al., 2004).

Три субъединицы протеасом эукариот - ßl, ß2 и ß5 содержат на своем N-конце остаток треонина, который располагается между ß-слоями и

Преддверие

Центральная

протеолитическая

камера

Преддверие

а субъединица

О

Рис.3. (А) Схема 20S субчастнтцы. Синими кружочками отмечены активные центры; (Б) Схема аир субъединиц 20S субчастицы. Черными стрелками указаны N-концы. зелеными - С-концы (Dahlmann, 2005),

выдается во внутреннюю полость центральной камеры. Этот треониновый остаток формирует активный центр, поскольку является нуклеофилом и акцептором протонов. Субъединицы различаются субстрат-связывающими карманами, которые содержат сайты для взаимодействия с полипептидной цепочки длиной 7—9 аминокислот. Протеолитическую активность этих субъединиц можно описать как химотрипсинподобную (£>), трипсин-подобную (ß2) и каспаза подобную (ßl) (Dahlmann, 2005; Groll et al., 2005), гидролиз происходит после гидрофобных, основных и кислых аминокислот, соответственно.

1.3. Убиквитинирование белка-субстрата.

Для того, чтобы протеасома распознала белок, направленный деградировать, он метится цепочкой из убиквитинов специальной системой ферментов убиквитинирования, включающей три типа ферментов - El, Е2, ЕЗ (Hershko et al., 1983). Убиквитин присоединяется в АТФ-зависимой реакции к ферменту-активатору El, который в свою очередь передает его одному из нескольких десятков

Рис.4. Схема убиквитинирвания.

ферментов семейства Е2 (их называют конъюгирующими). Затем в каскад реакций вступает третий участник — представитель семейства ЕЗ или убиквитинлигаз, которых обнаружено больше сотни. Комбинация Е2 и ЕЗ ферментов системы убиквитинирования обеспечивает строго специфичное распознавание субстрата. Убиквитинлигаза ЕЗ связывается с белком-субстратом и комплексом фермент Е2-убиквитин и инициирует передачу убиквитина на убиквитин-связывающий домен белка (Pickart, 2001) (рис. 4). Присоединение убиквитина к белку-субстрату или другому убиквитину происходит изопептидной связью, которая образуется между С-концом связываемого убиквитина и аминогруппой (как правило лизина) белка или другого убиквитина. В зависимости от количества убиквитинов, от того, к какому именно лизину произошло присоединение, дальнейшая судьба белка-субстрата различна, в частности, для направления белка на деградацию в протеасоме, необходимо не менее 4-х убиквитинов^ связанных через 48 лизин (Kirnet al., 2007).

1.4. Биогенез 20S протеасом.

Биогенез протеасом в эукариотических клетках - сложный и многоступенчатый процесс, локализованный главным образом в эндоплазматическом ретикулуме. Пятф субъединиц синтезируются в виде пробелков, на N-конце которых, за треонином, располагается достаточно длинная последовательность аминокислот (Heinemeyer et ah, 1997), Для сборки протеасомы необходимо присутствие специального белка POMP, также называемого протоассомблином или UMP1 у человека и мышей; а также некоторых шаперонов (Fricke et al., 2007). «Полулротеасома» состоит из одногш и одного ß-кольца, причем ß-кольцо состоит из еще непроцессированных с N-конца ß субъединиц и РОМРа. Индуцированная встраиванием последней субъединицы ß7 димеризация двух половинок протеасом происходит вокруг белка РОМРа, который взаимодействует с субъединицей ß5, после чего происходит автокатализ этой субъединицей всех остальных ß субъединиц. Этот процесс приводит к образованию зрелой протеасомы, первым субстратом которой и становится белок POMP (Witt et al., 2000; Fricke et al., 2007).

2. Иммунные протеасомы и их функции,

2.1. Иммунные протеасомы. Строение и сборка.

По набору протеолитически активных субъединиц протеасомы млекопитающих можно разделить на две основные группы - конститутивные и иммунные. Иммунные протеасомы выполняют дополнительные функции, связанные с эффективной работой иммунной системы. При действии на клетки y-IFN (или a-TNF), происходит встраивание во вновь синтезируемые протеасомы не конститутивных субъединиц, а иммунных (Driscoll et al., 1993; Groettrup et al., 2001). Иммунные протеасомы содержат каталитические субъединицы LMP7 ( ß5i), LMP2 ( ßli) и MECL1 (LMP 10) ( ß2i) вместо каталитических субъединиц X (ß5), Y (ßl ) и Z (ß2) (рис. 5),

КАТАЛИТИЧЕСКИЕ СУБЪЕДИНИЦЫ ПРОТЕАСОМ

X Y Z

□

Центры хыыотрипин ■

ГЮЛО<>1й.В1

□ ижлш-подсиЧаи"!

□ трипшн-подобныЛ

К ОН с TUTS "П IB ИЫЕ СУБЪЕДШШЦЫ

195 Э

20S

□

LMP7

LMP2

MECL1 (LMP10)

иммунные

СУБЪЕДШШЦЫ

Конститутивная протеасома

Субтипы иммунных протеасом

ПУЛ ПРОТЕАСОМ

Рис.5. Множественные формы протеасом.

Известно, что субъединицы LMP2 и MECLÎ встраиваются совместно, но независимо от LMP7. Включение субъединицы LMP7 во вновь образующуюся протеасому, хотя и облегчается наличием LMP2 и MECL1, но может осуществляться и в их отсутствие (Groettrup et al., 1997; Griffin et al, 1998). Таким образом, формируются три субтипа иммунных протеасом: субтип, содержащий все y-IFN-индуцируемые каталитические субъединицы, субтип, содержащий субъединицы LMP2 и MECL1; и субтип, обладающий только LMP7. Если рассматривать пул протеасом в тканях млекопитающих в целом, то можно сказать, что он образован четырьмя субтипами -конститутивными и тремя формами иммунных протеасом (Dahlmann et al., 2000; Dahlmann, 2005).

2.2. Участие иммунных протеасом в образовании антигенного эпитопа.

Иммунные протеасомы - более узкоспецифичные ферменты, чем конститутивные. Хотя при гидролизе иммунными протеасомами практически не изменяются размеры получаемых олигопептидов (и конститутивные, и иммунные протеасомы могут образовывать олигопептиды длиной до 30 амнокислот, но существенно изменяется их качественный набор, а именно: при гидролизе иммунными протеасомами в несколько раз возрастает выход потенциальных антигенных эпитопов. Активные центры иммунных протеасом гидролизуют белок преимущественно после основных или гидрофобных аминокислот (Driscoll et al., 1994; Aki et al., 1994;), в результате чего образуются олигопептиды длиной 8—11 аминокислотных остатков с «правильным» С-концом, содержащим остатки гидрофобных аминокислот или аргинина, необходимых для образования комплекса с МНС (major histocompatibility complex) класса L При гидролизе иммунными

Рис.6. Презентация антигенного эпитопа. I. Убиквитинирование своего мутантного или чужеродного белка и связываемие его с протеасомой:

2. Протеолиз белка протеасомой с образованием антигенных эпитопов;

3. Перемещение антигенных, эпитопов в эндоплазматическую сеть с помощью белков TAPI и ТАР2 и образование стабильного комплекса с молекулами МНС класса I (до этого димер молекулы МНС класса I был стабилизирован калнексином); 4, 5. Транспортировка комплекса МНС класса I на поверхность клетки для связывания с Т-клеточным рецептором.

протеасомами либо сразу образуются антигенные эпитопы нужной длины, либо их удлиненные с N-конца предшественники (Cascio et al., 2001; Goldberg et al., 2002). Во втором случае эти олигопептиды в цитоплазме или эндоплазматическом ретикулуме укорачивают до нужной длины с помощью аминопептидаз (Serwold et al., 2001; Kloetzel, Ossendorp, 2004).

2.3. Участие иммунных протеасом в запуске сигнала на уничтожение дефектных клеток

Впервые то, что протеасомы участвуют в МНС класса I опосредованной презентации антигенных эпитопов, было показано в опытах с применением ингибиторов протеасом (Bogyo et al., 1997; Adams et al., 1998; Rock, Goldberg, 1999). Когда на клетки действовали ингибиторами протеасом, в них продолжался синтез белков МНС, однако комплекс не собирался из-за отсутствия антигенных эпитопов. С другой стороны, было известно, что гены, кодирующие субъединицы иммунных протеасом LMP2 и LMP7 находятся в локусе МНС класса II (Glynne et al., 1991; Ortiz-Navarrete et al., 1991). И при встраивании продуктов этих генов в протеасому происходит изменение ее протеолитической активности и увеличивается продукция антигенных эпитопов.

Антигенные олигопептиды соединяются в цитоплазме с белками-транспортёрами (TAPI и ТАР2, Transporter Associated with Antigen Presentation) и переносятся в эндоплазматическую сеть, где при необходимости укорачиваются под действием аминопептидаз до нужной длины и связываются с молекулами МНС класса I (Rock, Goldberg, 1999). Молекулы МНС класса I представляют собой белковый димер, образованный anß цепями. Домены а цепи формируют замкнутую с обоих концов щель Бьёркмана, которая по длине соответствует 8—9 аминокислотным остаткам. В случае незначительного превышения этой длины антигенный олигопептид "выпячивается" из щели, образуя арку, поскольку место для него ограничено и оба его конца фиксированы. Комплекс молекул МНС класса I и антигенного олигопептида выносится на поверхность клетки в составе

трансмембранного пузырька и является своеобразным "флажком, сигналящем о бедствии" (рис. 6). Меченная таким флажком клетка не излечивается, а распознаётся и уничтожается Т-киллерами иммунной системы (Roitt, Delves, 2007).

2.4. Участие иммунных протеасом в образовании антигенных эпитопов из DRiPs.

Белки, деградирующие с помощью протеасом можно разделить на два пула: медленно деградирующие белки (SDPs; slowly degraded polepetides) и быстро деградирующие белки белки (RDPs; rapidly degraded polepetides). Время полужизини таких белков различается в несколько порядков и составляет примерно 10 минут для RDPs и больше 1000 минут для SDPs. По результатам некоторых исследований оказалось, что примерно 70% всех белковых субстратов, идущих на деградацию в протеасомы являются быстро деградирующими полипептидами, и лишь остальные 30% приходятся на медленно деградирующие (Yewdell et al., 2003). Одной из форм быстро деградирующих белков являются так называемые DRiPs (defective ribosomal products). Это полипептиды, которые оказались «неправильными» в результате различных ошибок синтеза - ошибок в процессе транскрипции, трансляции, сворачивании и процессинге. Для оперативной деградации таких неправильных белков протеасома образует комплекс с работающей рибосомой для детекции синтезирующихся продуктов. Если среди них будет обнаружен DRiPs, он будет незамедлительно гидролизован (Yewdell, 2002; Strehl et al., 2005). Такая система имеет несколько преимуществ. Во-первых, происходит защита клетки от повреждений, которые могут быть вызваны функционированием поврежденных белков. Во-вторых, большое количество антигенных эпитопов получаются именно в результате гидролиза DRiPs (Strehl et al., 2005; Qian et al., 2006), что значительно ускоряет процесс представления антигена и, соответственно, иммунный ответ может развиться гораздо раньше.

2.5. Участие иммунных протеасом в активации наивных CD8+ Т-лимфоцитов.

Участие иммунных протеасом в запуске сигнала на уничтожение дефектных клеток не является единственной функцией в обеспечении иммунной защиты организма. Известно, что удельное содержание иммунных протеасом в селезёнке, тимусе и, скорее всего, в других органах иммунной системы значительно выше, чем во всех остальных органах, а в головном мозгу их крайне мало (Dahlmann et al., 2000; Nöda et al., 2000). С чем это может быть связано?

На иммунные протеасомы ложится дополнительная нагрузка в антигенпредставляющих клетках (АПК) иммунной системы, к числу которых относятся B-лимфоциты, макрофаги, дендритные клетки (Roitt, Delves, 2007). Антигены, попадающие во вторичные лимфоидные органы с током крови и лимфы, поглощаются АПК путём эндоцитоза, поступают в цитоплазму из эндоцитозных пузырьков и с помощью иммунных протеасом превращаются в антигенные эпитопы, которые выносятся на поверхность клетки в комплексе с молекулами МНС класса I (Rock, Goldberg, 1999; Kloetzel, Ossendorp, 2004). В результате связывания представленного комплекса с Т-клеточным рецептором и взаимодействии корецепторов происходит активация наивного CD8+ Т-лимфоцита. Он пролиферируют и образует клоны дифференцирующихся Т-киллеров, специфичных в отношении конкретных антигенных эпитопов. Таким образом, обе рассмотренные функции иммунных протеасом указывают на их непосредственное участие в Т-клеточном иммунном ответе.

2.6 Участие тимопротеасом в положительной селекции тимоцитов

Кортикальные эпителиальные клетки тимуса, осуществляющие положительную селекцию CD8+ Т-лимфоцитов, содержат еще одну форму протеасом - тимопротеасому. Она содержит в себе особую субъединицу ß5t вместо конститутивной ß5 или иммунной ß5i и отличается химотрипсинподобной активностью. При гидролизе в клетках собственных

23

белков тимопротеасомами образуются уникальный набор антигенных эпитопов, необходимых для положительной селекции CD8+ Т-лимфоцитов (Murata et al., 2007, 2008) Эти эпитопы имеют особенность непрочно связываться с молекулами МНС класса I и образовывать «дышащую» структуру на поверхности клетки. В этом случае происходит «проверка» Т-лимфоцитов на способность распознавать свои молекулы МНС класса 1, но не свои антигенные эпитопы, то есть осуществляется не отрицательная, а положительная селекция CD8+ Т-лимфоцитов.

2.7 Участие иммунных протеасом в отрицательной селекции тимоцитов

При взаимодействии эпителиальных клеток тимуса и T-CD8+-лимфоцитов происходит их отрицательная селекция - лимфоциты, экспрессирующие Т-клеточный рецептор против собственных антигенов, вступают в апоптоз. Для образования необходимых антигенов для такой отбраковки лимфоцитов и необходимы иммунные протеасомы (Melnikova et al., 2010).

2.8 Неиммунные функции иммунных протеасом

В течение последних лет было обнаружено, что иммунные протеасомы участвуют не только в иммунном ответе, но и в других процессах: дифференцировке хрусталика (Singh et al., 2002; Hussong et al., 2010), контролировании пролиферативной активности Т-лимфоцитов. Так, показано, что Т-лимфоциты мышей, нокаутных по субъединицам иммунных протеасом LMP7 и MECL1, гиперпролиферируют in vitro в ответ на различные поликлональные митогены (Caudill et al., 2006). Кроме этого, иммунные протеасомы выполняют антиоксидативную функцию, связанную с сигнальным путем NO/cGMP/cAMP в эндотелиальных клетках (Kotamraju et al., 2006). Последнее время все большее значение в гашении окислительного стресса придают именно роли иммунных протеасом. Так, функционирование иммунных протеасом защищает клетку от дефектных белков, неправильно синтезирующихся под действием ylFN, активирующего образование

24

активных форм кислорода (Seifert et al., 2010). Не исключено, что вскоре будут описаны и другие функции иммунных протеасом, не связанные с иммунными реакциями.

Итак, все вышеизложенное свидетельствует о том, что исследование функций иммунных протеасом в различных органах перспективно не только для понимания молекулярных механизмов иммунных реакций, но и для выяснения особенностей становления иммунитета в раннем онтогенезе и поиска причин неэффективности иммунной системы при ряде заболеваний, в том числе онкологических. Вместе с тем, до сих пор в литературе нет данных, кроме данных нашей лаборатории, о функционировании иммунных протеасом в лимфоидных и нелимфоидных органах в эмбриональном и раннем постнатальном развитии млекопитающих, также нет детального описания изменений в пуле протеасом при росте и регрессии злокачественных опухолей. В следующих главах обзора литературы рассматриваются особенности строения и развития органов, интересных для нас в связи с исследованием протеасом при становлении иммунитета, и приводятся имеющихся в литературе единичные сведения об иммунных протеасомах в злокачественных опухолях.

3 Лимфоидные органы иммунной системы и нелимфоидные органы 3.1 Взаимоотношения между центральными и периферическими органами иммунной системы и нелимфоидными органами

Органы иммунной системы (или лимфоидные органы) разделяют на центральные (первичные) и периферические (вторичные). В первичных лимфоидных органах происходит дифференцировка лимфоцитов. К ним относят тимус, в котором созревают Т-лимфоциты, и красный костный мозг, в котором созревают В-лимфоциты. Кроме этих двух органов в качестве центрального органа иммунной системы в эмбриональном развитии выступает печень. В процессе развития лимфоциты мигрируют из центральных органов иммунной системы в периферические. К ним относятся: лимфатические узлы, селезенка, миндалины, групповые

25

лимфатические фолликулы (пейеровы бляшки), аппендикс. Периферический отдел иммунной системы осуществляет контакт лимфоцитов с антигеном, в результате чего происходит активация наивных лимфоцитов, пришедших из центральных органов. В принципе работы периферической иммунной системы лежит регионапьность: каждый лимфоидный орган контролирует определенную часть тела, от которой к нему поступает лимфа (в случае лимфатических узлов), кровь (в случае селезенки) или регуляция осуществляется при непосредственном контакте с барьерами, которые ограничивают внутреннюю среду организма (в случае лимфоидной ткани, ассоциированной с кожей и слизистыми оболочками) (Roitt, Delves, 2007).

3.2 Строение селезенки

Селезенка - периферический орган иммунной системы. Снаружи она покрыта соединительно-тканной капсулой, от которой внутрь органа отходят поддерживающие перегородки - трабекулы. Характерной чертой строения селезенки является наличие двух гистологически хорошо различимых

Рис.7. Схема строения селезенки. А - артерия, В - вена.

участков - красной и белой пульпы (рис. 7). Белая пульпа (мальпигиевы тельца) представляют собой скопление лимфоцитов, мигрирующих сюда из центральных органов иммунной системы (костного мозга и тимуса). В-лимфоциты селезенки располагаются в пограничной (маргинальной) зоне, которая отделяет белую пульпу от красной. Кроме этого, В-лимфоциты входят в состав первичных и вторичных фолликулов. Т-лимфоциты локализуются вокруг артериол, образуя периартериальные муфты или PALS-структуры (Periarteriolar Lymphoid Sheath). В красной пульпе локализуется большое количество эритроцитов, а также макрофагов, мегакариоцитов, гранулоцитов, перемещающихся сюда из белой пульпы лимфоцитов. Четких границ между этими двумя пульпами нет, и между ними происходит частичный клеточный обмен (Roitt, Delves, 2007).

В эмбриональном развитии селезенка закладывается в виде скопления лимфоидной ткани в стенке желудка, и ее клеточная дифференцировка проходит достаточно быстро. Т- и B-лимфоциты проявляются в селезенке рано, еще в эмбриональном развитии, но они перемешаны и пока не объединены в специфические функциональные зоны, способные обеспечить иммунную защиту организма. При этом в первые постнатальные дни растет количество зон концентрически расположенных клеток стромы в периартериальном пространстве белой пульпы, куда постепенно мигрируют Т-лимфоциты (van Rees et al., 1990). Эта картина отражает процесс формирования в селезенке PALS-структур, которые становятся у крысы функционально зрелыми к 18-м суткам постнатального развития (Шарова и др., 2006).

3.3 Строение печени

Печень - один из важнейших и уникальных органов, выполняющий большое количество функций: общеметаболическую, секреторную (экзо- и эндокринную), барьерную (защитную и обезвреживающую). В эмбриональном развитии на печень ложится дополнительная нагрузка в качестве кроветворного органа. Идентифицировать печень крысы можно уже

27

на 10-й день эмбрионального развития, однако функция гемопоэза начинается в ней к 15-му дню (Rees van et al., 1990). В печени происходят все стадии дифференцировки клеток крови, присущие костному мозгу во взрослом состоянии: миелопоэз, лимфопоэз, эритропоэз и тромбоцитопоэз. Остановимся подробнее на процессе лимфопоэза. В печени проходят все стадии дифференцировки B-лимфоцитов, от некоммитированных стволовых клеток, до наивных B-лимфоцитов. Также в печени происходит дифференцировка Т-предшественников до про-Т-лимфоцитов, которые затем мигрируют в тимус для дальнейшей дифференцировки. Заселение тимуса предшественниками Т-лимфоцитов происходит двумя волнами миграции, которая осуществляется на стадии про-Т-лимфоцитов, еще не имеющих TCR, а, соответственно, и маркерного белка CD3 на поверхности. Из предшественников лимфоцитов первой волны миграции дифференцируются у5 Т-лимфоциты с ограниченным набором вариабельных цепей TCR. После дифференцировки такие лимфоциты выходят из тимуса попадают в эпидермис кожи, слизистые оболочки, репродуктивный аппарат самок и в

Рис.8. Микроанатомия печеночного синусоида. ЬБЕС - клетка эндотелия синусоида; КС - клетка Купфера; ЗК - звездчатая клетка; Г - гепатоцит.

дальнейшем поддерживаются в них местно. После этого в тимусе формируются уб Т-лимфоциты, похожие на у8 Т-лимфоциты взрослого организма. Эти клетки мигрируют на периферию уже после рождения, в раннем постнатальном развитии. Вторая волна миграции предшественников происходит перед рождением, и из нее в тимусе дифференцируют^ Т лимфоциты, после созревания выходят из него и заселяют периферические органы иммунной системы: селезенку, лимфатические узлы, групповые лимфатические фолликулы (пейеровы бляшки) (Ярилин, 1999).

В раннем постнатальном развитии печень перестает быть первичным лимфоидным органом, передавая свои «полномочия» костному мозгу. Однако и во взрослом состоянии иммунный статус печени специфичен и имеет ряд уникальных особенностей.

3.4 Особенности иммунитета печени

В печени, в отличие от большинства других органов, неспецифический иммунитет преобладает над адаптивным, а в ответ на индукцию антигеном предпочтительнее развивается не защитная иммунная реакция, а иммунологическая толерантность. Это подтверждают следующие факты: (1) в печени приобретается толерантность к пищевым антигенам (Yang et al., 1998); (2) аллогенные трансплантаты печени не отторгаются, преодолевая барьер МНС класса I (Calne et al., 1969); (3) при введении через портальную вену в печень донорских клеток значительно увеличивается приживаемость тканевых аллографтов (Gorczynski, 1992); (4) при введении через портальную вену в печень растворимых антигенов развивается иммунологическая толерантность(Smith et al., 2000). Такое явление иммунологической гипореактивности печени при попадании антигена через портальную вену получило название «портальной толерантности».

Состояние портальной толерантности связывают с особенностями

локальной регуляции иммунного ответа в печени, хотя детально ее механизм

еще не изучен. Очевидно, что бимодальная функция печени, т.е.

обезвреживание антигенов и патогенных микроорганизмов с одной стороны,

29

и избежание активного иммунного ответа на эти антигены с другой стороны, требует искусного баланса между иммунитетом и толерантностью. Уникальность выполняемых печенью функций определяется особенностями ее строения и кровоснабжения, особым клеточным составом печени и функционированием самих клеток, а также спецификой межклеточных взаимоотношений, связанных с анатомическими особенностями микроциркуляции крови в печени.

Одной из важнейших функций печени в организме, наряду с участием в обмене веществ, является функция детоксикации. Печень имеет ряд уникальных особенностей, которые позволяют осуществлять ей эту функцию. Прежде всего, это система кровотока через воротную вену (vena portae), которая собирает кровь от органов брюшной полости: желудка, кишечника, селезенки, поджелудочной железы. Такая кровь насыщена антигенами пищи и продуктами жизнедеятельности кишечной микрофлоры, в частности липополисахаридами, которые создают особое микроокружение для функционирования клеток.

Функциональной микроциркуляторной единицей печени является синусоид (рис. 8). Стенку синусоида выстилает один ряд эндотелиальных клеток (liver sinusoidal endothelial cells, LSEC), которые образуют отверстия (фенестрации) приблизительно 100 нм в диаметре и не имеют базальной мембраны. В пространстве синусоида находятся макрофаги печени, называемые клетками Купфера (KupfFer cells, КС), а между гепатоцитами и эндотелием синусоидов существует перисинусоидное пространство (пространство Диссе), в котором находятся звездчатые клетки (hepatic stellate cells, HSC). Узкий диаметр синусоидов и низкая скорость тока облегчает контакт между кровью и клетками печени. Приходящие в печень с кровотоком антигены и лейкоциты прежде всего взаимодействуют с КС и LSEC, составляющими основную популяцию клеток синусоидов. Предполагается, что специфика функционирования и особенности процесса

презентации антигена этими клетками и лежат в основе явления портальной толерантности.

3.4.1 АПК клетки печени и специфический иммунный ответ

LSEC имеют фенотип и свойства, присущие классическим антиген-представляющим клеткам (Knolle et al., 1999; Crispe et al., 2006; Watanabe et al., 2008). Они способны захватывать антиген и представлять его через МНС класса II CD4+ Т-лимфоцитам (Knolle et al., 1999), а также через МНС класса ICD8+ Т-лимфоцитам (Tokita et al., 2006). В эксперименте было показано, что патоген-ассоциированные молекулярные комплексы вызывают полное функциональное созревание LSEC с последующим превращением их в профессиональные АПК, несущие на своей поверхности не только молекулы МНС классов I и II, но и все необходимые для активации Т-лимфоцитов корецепторы. Удобная локализация LSEC дает им возможность постоянно контактировать с циркулирующими лимфоцитами и влиять на их активность. Представление антигена LSEC наивным CD4+ Т-лимфоцитам направляет их дифференцировку не в противовоспалительные эффекторные клетки, а в сторону развития иммуносупрессорного регуляторного фенотипа CD4+CD25+Foxp3+ Т-лимфоцитов (Treg cells), которые поддерживают развитие иммунологической толерантности. Презентация же захваченных антигенов через МНС класса I CD8+ Т-лимфоцитам, называемая кросс-презентацией (Tokita et al., 2006), вызывает ингибирование развития наивных CD8+ Т-лимфоцитов в эффекторные цитотоксические лимфоциты, обеспечивая, таким образом, иммунологическую клеточную толерантность к пищевым антигенам.

КС составляют примерно 30% от всех клеток печеночного синусоида (Parker, Picut, 2005). Одной из важнейших функций КС является очищение циркулирующей крови от различных эндотоксинов. Они отлично поглощают вирусы, бактерии, грибы, раковые клетки, липосомы и др. микрочастицы. КС играют важную роль в обеспечении толерантности организма как к тканевым аллографтам, так и к растворимым антигенам. Была показана сниженная

si

способность КС активировать Т-лимфоциты in vitro в сравнении с макрофагами и дендритными клетками костного мозга и селезенки (Watanabe et al., 2008). Кроме того, Т-лимфоциты, активированные КС, продуцируют значительно меньшее количество IL-2. В опытах на культуре КС показали, что это может зависеть от нескольких факторов. Для эффективной активации лимфоцитов необходимо два сигнала: от МНС класса I, связанного с антигеном (первый сигнал), и от корецепторов CD40 и В7-1, В7-2 (второй сигнал). Причиной сниженной способности КС активировать лимфоциты является редуцированное проведение первого сигнала и неэффективное представление антигена. Кроме того, макрофаги выделяют PGE2 и 15d-PGJ2, которые оказывают сильное ингибирующее влияние на активируемые лимфоциты. Эти клетки в норме экспрессируют лиганд иммуноингибиторного рецептора PD-1 (Watanabe et al., 2008). Взаимодействие между PD-1L лигандом КС и PD-1 рецептором активированного Т-лимфоцита приводит к угнетению пролиферации последнего (Erhardt et al., 2007). Также было показано, что КС играют основную роль в аккумуляции активированных CD8+ Т-лимфоцитов в печени, модифицируя, таким образом, общий иммунный ответ организма (Crispe et al., 2006).

Под постоянным воздействием липополисахаридов КС и LSEC продуцируют иммуносупрессорные цитокины IL-10 и TGF-0, в ответ на паракринное или аутокринное выделение TGF-{3, гепатоциты также продуцируют IL-10. Под действием этих иммуноспрессорных цитокинов происходит направление дифференцировки наивных CD4+ Т-лимфоцитов в Treg, которые играют важную роль в поддержании иммунологической толерантности, ингибируя пролиферацию наивных CD4+ Т-лимфоцитов in vitro и иммунный ответ in vivo. Отличительной особенностью регуляторных клеток является экспрессия транскрипционного фактора Foxp3. При его нокауте у мышей развиваются системные аутоиммунные реакции в результате гипер-пролиферации CD4+ Т-клеток, продуцирующих высокий

32

уровень эффекторных воспалительных цитокинов (Brunkow et al., 2001). Кроме этого, уменьшение количества Tregs или потеря их функций наблюдается при развитии многих аутоиммунных заболеваниях человека (Alvarado-Sanchez et al., 2006; Korn et al., 2007). Tregs оказывают ингибиторный эффект не только на CD4+ лимфоциты, но также и на другие типы клеток: CD8+ Т, В, дендритные и натуральные киллеры. Секреция таких ингибиторных цитокинов как IL-10, IL-35 и TGF-P, прямой клеточный контакт используются регуляторными клетками для эффективной супрессии иммунного ответа.

3.4.2 Неспецифический иммунный ответ в печени

Особый статус адаптивного иммунитета печени определяет тот факт, что защитные реакции в ней связаны, в первую очередь, с неспецифическим, врожденным иммунитетом, которые играет первостепенную роль. В обеспечении такого иммунного ответа участвуют многие клеточные субтипы: макрофаги, нейтрофилы, NK, NKT клетки и даже гепатоциты. Запуск иммунного ответа происходит при распознавании «чужого» или «своего измененного» антигена. Для такого определения на поверхности клеток имеются паттерн-распознающие рецепторы (PRRs, pattren-recognition receptors), включающие рецепторы для бактериальных карбогидратов и Tol-подобные рецепоторы (TLR) (Medzhitov et al., 1997; Poltorak et al., 1998; Takeda et al., 2003). Они распознают различные компоненты микрооргнанизмов и белки-маркеры повреждения собственных клеток. Одной из многочисленных клеточных популяций печени, принимающих активное участие в обеспечении врожденного иммунного ответа являются NK клетки. Они способны уничтожать инфицированные и раковые клетки. Однако, в отличие от лимфоцитов, они не имеют антиген-специфичных рецепторов. NK клетки распознают патологические изменения в гликопротеиновом профиле клетки, то есть реагируют на «измененное свое». На поверхности NK клеток располагаются специфические рецепторы: NKG2 (Zafirova et al., 2011), распознающий белок MICA (количество этого белка

зз

увеличивается в раковых и инфицированных клетках), NKp46, распознающий вирусные геммаглютинины и CD 16 - Fe рецептор к IgG (Mandelboim, Porgador, 2001; Marras et al., 2011). Активация этих рецепторов незамедлительно ведет к уничтожению дефектной клетки. Кроме того, на своей поверхности NK клетки имеют белки-рецепторы KIRs (killer immunoglobulin-like receptors). KIRs взаимодействуют с молекулами МНС класса I и могут определять даже незначительные изменения в их экспрессии, которое происходит в случае инфицирования клетки или при ее раковом перерождении (Campbell, Purdy, 2011). Цитокины alFN, IL-2, IL-12 и IL-15 также способствуют активации NK клеток. В печени также присутствует другой особый тип NK клеток, выполняющий схожие функции. Особенность клеток этого типа заключается в экспрессии как Т-клеточного рецептора, так и NK1.1+ маркера NK клеток. Однако вариабельность Т-клеточных рецепторов значительно снижена, поскольку возможен лишь один вариант a -цепи и несколько вариантовр цепи. В то время как классические ap Т -клеточные рецепторы распознают белковые антигены в комплексе с молекулами МНС, TCR NKT клеток распознает гликолипиды в комплексе с поверхностными молекулами CD1. Активация и запуск цитотоксической реакции NKT клетками превосходит таковое Т-лимфоцитами по скорости, поскольку не требуется длительного процессинга белкового антигена и его дальнейшего встраивания в МНС комплекс. Такой иммунный ответ позволяет значительно быстрее уничтожать опухолевые и инфицированные клетки (Parker, Picut, 2005).

Таким образом, особенности иммунитета печени: преобладание врожденного иммунитета над адаптивным, в первую очередь, и развития специфической иммуннологической толерантности на антиген, связаны с уникальностью ее клеточного «оркестра», где каждый тип иммуннокомпетентных клеток играет свою роль на определенном этапе.

3.5 Возможная роль протеасом в развитии портальной толерантности

Протеасомы участвуют в регуляции многих внутриклеточных процессов. Много исследовательских работ посвящено роли протеасом в организации иммунного ответа, но практически отсутствуют работы об участии протеасом в развитии специфической толерантности. Иммунные протеасомы необходимы для образования антигенных эпитопов, участвуют в презентации антигена АПК, в активации Т лимфоцитов и отрицательной селекции в тимусе (Melnikova et al., 2010). Кроме этого, протеасомы необходимы для образования активного транскрипционного фактора NF-kB (Orian et al., 1995; Rousset et al., 1996), который играет ключевую роль в регуляции иммунного ответа, как врожденного иммунитета, так и приобретенного. Увеличение уровня активности протеасом сопровождает развитие таких аутоиммунных заболеваний, как системная красная волчанка и ревматоидный артрит. Все эти данные свидетельствуют о том, что различия в функционировании пула протеасом могут лежать в основе становления толерантности и появления невосприимчивости к специфическим антигенам.

Так, было показано, что при действии на незрелые дендритные клетки ингибитором протеасом происходит блокада их созревания, ингибирование экспрессии МНС класса II, CD86 и CD40, IL-12, но не IL-10. Такие дендритные клетки теряют свою способность стимулировать дифференцировку наивных CD4+ Т-лимфоцитов в эффекторные клетки, наоборот, индуцируют их развитие в Tregs (Cong et al., 2005).

Blanco с соавторами показали, что бортезомиб вызывает индукцию апоптоза активированных Т-лимфоцитов, ингибирует продукцию цитокинов Т-хелперами, при этом не оказывает влияния на покоящиеся и регуляторные Т-клетки. Так, при длительном воздействии бортезомибом на популяцию CD4+ Т-лимфоцитов она обогащалась регуляторными Т-лимфоцитами при очень низком уровне эффекторных Т-хелперов (Blanco et al., 2006, 2009). Причем при активации этих двух клеточных субтипов происходит

35

увеличение уровня экспрессии иммунных протеасом (Birzele et al., 2011), в то время как увеличение уровня экспрессии конститутивных протеасом было отмечено только в регуляторных клетках.

В целом, работы по изучению функционирования протеасом в развитии иммунологической толерантности немногочисленны и очень разрозненны. Ясный ответ на вопрос, какие именно изменения субъединичного состава протеасом, их активности в разных клеточных субтипах определяют развитие иммунного ответа или же толерантности, до сих пор не получен.

4. Липополисахарид - индуктор воспалительного процесса

Липополисахарид (LPS) представляет собой макромолекулу, состоящую из полисахарида, ковалентно соединённого с липидом. Он является основным компонентом клеточной стенки грамотрицательных бактерий, эндотоксином, вызывающим в организме млекопитающих сильную иммунологическую реакцию с секрецией провоспалительных цитокинов (Stewart et al., 2006). LPS связывается с рецепторным комплексом CD14/TLR4/MD2, что приводит к активации сигнальных молекул, таких как тирозинкиназа, IkK, Rho GTPase, МАРК, р38 и JNK (Takeda et al., 2003). В свою очередь это приводит к активации транскрипционных факторов, таких как NF-kB и АР-1, и выделению провоспалительных цитокинов (Beinke et al., 2004; Zafirova et al., 2011). Ключевым регулятором индуцируемого LPS воспаления являются протеасомы. При воздействии на макрофаги небольшой дозой лактоцистина, ингибитора протеасом, на 90% снижается уровень экспрессии гена синтетазы оксида азота и многих провоспалительных цитокинов (Qureshi et al., 2003; Shen et al., 2006; Reis et al., 2011). Более того, воспалительная реакция требует увеличения уровня иммунных протеасом со всеми тремя иммунными субъединицами в макрофагах при действии на них LPS, которое также ведет к изменению в активности протеасом (Reis et al., 2011). В данной работе мы использовали модель индукции воспаления введением LPS для выявления возможности развития аналогичных реакций на уровне иммунных протеасом в раннем развитии печени, когда иммунитет

полноценно не функционирует. Данные по этому вопросу отсутствуют в литературе.

5 Иммунные протеасомы и злокачественные опухоли

5.1 Иммунные протеасомы в развитии раковых опухолей

Ежедневно в клетках млекопитающих и человека появляется множество мутаций, которые могут вызвать злокачественную трансформацию. Этого не происходит, во-первых, из-за процесса репарации ДНК (Шарова, 2005), во-вторых, из-за иммунного надзора за клетками и устранения тех из них, которые экспрессируют мутантные гены. Концепция иммунного надзора была предложена австралийским ученым Ф. Бернетом (Burnet, 1969). Согласно его концепции, главную роль в распознавании и уничтожении клеток, несущих чужеродную генетическую информация, играет Т-клеточное звено иммунной системы. В течение последних нескольких лет достигнут значительный прогресс в понимании механизмов, лежащих в основе указанных процессов. Эти механизмы связаны с функциями иммунных протеасом, описанными выше. Тем не менее, некоторые мутантные клетки дают начало опухолям. С одной стороны, злокачественная трансформация может иметь место в случае нарушений в иммунной системе. С другой стороны, опухоли могут возникать из дефектных клеток, избегающих иммунного надзора. Возникает вопрос, сопровождает ли эти процессы изменение в уровне иммунных протеасом? Нахождение ответа на этот вопрос может помочь решению другой проблемы - восстановлению эффективности иммунитета против злокачественных клеток.

Опубликованные за последнее десятилетие данные, касающиеся этого вопроса, посвящены, в основном, исследованию уровня мРНК иммунных протеасом в клеточных линиях опухолей грызунов и человека (Johnsen et al., 1998; Delp et al., 2000; Seliger et al., 2000; Matsui et al., 2002; Miyagi et al., 2003). В ряде клеточных линий опухолей различного происхождения выявлен более низкий уровень мРНК иммунных протеасом по сравнению с уровнем мРНКр -актина. В то же время, обнаружено несоответствие между

37

уровнем мРНК и белка иммунной субъединицы LMP2 в клеточной линии почечной карциномы мыши (Seliger et al., 2000). Более того, показано, что высокое содержание мРНК субъединиц LMP7 и LMP2 иммунных протеасом не всегда коррелирует с высоким содержанием самих субъединиц, что свидетельствует о наличии специфических механизмов регуляции трансляции, контролирующих синтез субъединиц протеасом (Frentzel et al., 1993). Поэтому сравнение уровней иммунных протеасом в опухолевых и контрольных клетках представляется более корректным. Пониженное содержание иммунных протеасом выявлено в меланоме (Meidenbauer et al., 2004), астроцитоме (Mehling et al., 2007), раке молочной железы (Gobbi et al., 2004) человека иммуногистохимическим методом. Показано снижение содержания субъединицы LMP2 в опухолевых клетках при развитии маточной лейомиосаркомы, кроме того, у мышей, нокаутных по этой субъединице, спонтанно образует такая опухоль (Hayashi et al., 2010, 2011). Также был продемонстрирован противоопухолевый эффект как in vitro, так и in vivo на множественную миелому человека специфического ингибитора иммунной субъединицы LMP7 протеасом Carfilzomib (Jain et al., 2011).

Таким образом, имеющиеся в литературе данные о функционировании множественных форм протеасом в опухолевых клетках, единичны и разрозненны. Детальное исследование этого вопроса проводится в нашей лаборатории. Так, описаны особенности пула протеасом асцитной карциномы Krebs II, привитой мышам Balb/c (Астахова, Шарова, 2006), гепатоклеточной карциномы, возникшей у мышей CBA/Lac х BL/6 Fl под действием дипина (Астахова и др., 2010), папиллярной карциномы щитовидной железы человека (Sharova et al., 2011). Важно отметить, что экспрессия иммунных протеасом изменялась в клетках всех этих опухолей, но не одинаковым образом. В асцитной карциноме Krebs П уровень иммунных протеасом был на порядок ниже по сравнению с контролем, что указывает на избегание иммунной системы клетками этой опухоли с помощью исключения иммунных протеасом. В гепатоклеточной карциноме

38

мышей и папиллярной карциноме щитовидной железы человека содержание иммунных протеасом, напротив, возрастало. При этом наблюдался дефицит молекул МНС класса I в клетках карциномы щитовидной железы. Полученный результат указывает на то, что хотя повышенная экспрессия иммунных протеасом и направлена на развитие иммунного ответа по отношению к опухоли, но дефицит другого важного компонента, молекул МНС класса I, в клетках опухоли не позволяет иммунной системе найти свою мишень. Следует отметить, что во всех трех исследованных опухолях возрастала экспрессия 19S регулятора протеасом - факт, важный для рассмотрения этого компонента в качестве мишени для разработки новых противоопухолевых лекарств. В целом, проведенная нами работа указывает на то, что каждая конкретная опухоль имеет свои особенности, касающиеся изменений в пуле протеасом. Для того, чтобы выяснить дополнительные нюансы функционирования протеасом в опухолях и понять, каким образом можно использовать результаты этой работы для практического применения в медицине, необходимо провести исследования протеасом и в обратном процессе - при регрессии злокачественной опухоли

5.2 Особенности роста и регрессии опухоли Walker 256, трансплантированной крысам линии Brattleboro

В настоящей работе была выбрана модель карциносаркомы Walker 256, развивающейся у физиологически нормальных крыс линии Wag и приводящей их к гибели, но регрессирующей у крыс линии Brattleboro, дефективных по экспрессии аргинин-вазопрессина (АВП). Эта уникальная модель интересна тем, что возможно исследовать множественные формы иммунных протеасом и пул протеасом в целом не только в развитии злокачественной опухоли, способной уходить из-под иммунного надзора, но и в процессе регрессии опухоли при восстановлении эффективности иммунитета.

Как показано в работе Хегая с коллегами, рост карциносаркомы Walker 256 у крыс линии Brattleboro наблюдается в течение первых15-17 дней после

39

прививки, после чего происходит регрессия опухоли и ее исчезновение к 30-му дню (Хегай и др., 2006). Тот факт, что повторное введение клеток Walker 256 крысам линии Brattleboro приводит не к росту опухоли, а к ее полному отторжению, навело нас на мысль, что в организме этих животных вырабатывается адаптивный Т-клеточный иммунитет против опухоли. Опухоль Walker 256, клеточная линия карциносаркомы молочных желез крыс, является гормонально чувствительной (Nakagawa et al., 2005). Дефицит АВП является, по-видимому, важным условием для регрессии опухоли у крыс линии Brattleboro. АВП - нейрогипофизарный нанопептид с антидиуретической активностью, участвует в контролировании объема крови и осмомолярности плазмы. Кроме того, АВП вовлечен в морфогенез центральной нервной системы и контролирует различные нейроэндокринные и иммунные процессы (Chowdrey et al., 1994; Iqbal, Jacobson, 1995; Jessop et al., 1995; Shibasaki et al., 1998). Делеция одного гуанина в кодирующем регионе ведет к сдвигу рамки считывания и инактивации гена, кодирующего АВП, а это, в свою очередь, к неспособности правильно синтезировать нейрогормон у крыс линии Brattleboro (Schmale, Richter, 1984). Нарушение синтеза АВП в гипоталамусе и его отсутствие в крови становится причиной морфологических и функциональных изменений в нейроэндокринной и иммунной системе (Захарова и др., 2001; Хегай и др., 2003; Афанасьева и др., 2008), часто с развитием несахарного диабета (Хегай, 2003). Однако, продемонстрированный антиопухолевый эффект не связан с отсутствием АВП напрямую. Напротив, систематическое введение АВП крысам линии Brattleboro нормализует водно-солевой баланс, но не оказывает никакого эффекта на увеличенную активность NK клеток и низкий уровень кортикостерона в крови (Yirmiya et al., 1989). Таким образом, непонятно, какие именно процессы дают возможность крысам линии Brattleboro распознавать и уничтожать злокачественные клетки. Возможно, это связано именно с функционированием иммунных протеасом.

Заключение диссертации по теме «Биология развития, эмбриология», Карпова, Ярослава Дмитриевна

выводы

1. В печени и селезенке крысы в развитии увеличивается доля иммунных протеасом, включающих субъединицы LMP7 и LMP2, при постоянном общем количестве протеасом.

2. В селезенке увеличение содержания иммунных протеасом обусловлено миграцией обогащенных ими В- и Т-лимфоцитов, постепенно заполняющих белую пульпу селезенки. В печени этот процесс осуществляется за счет изменения ее клеточного состава и увеличения экспрессии иммунных протеасом в гепатоцитах.

3. Возрастание доли иммунных протеасом в общем пуле сопровождается нелинейными изменениями химотрипсин- и каспазаподобной активностей. Спад активностей в обоих органах на 10-12-й дни постнатального развития отражает процесс деградации старого пула и наработку новых протеасом.

4. Увеличение уровня иммунных протеасом в печени крысы при воспалении возможно уже в эмбриональном развитии в ответ на введение в организм матери липополисахарида.

5. Обнаружена связь между судьбой опухоли и содержанием в ней иммунных протеасом. Так, у физиологически нормальных крыс линии WAG карциносаркома Walker 256 развивается при постоянном содержании в ней иммунных протеасом. У крыс линии Brattleboro, дефектных по синтезу аргинин-вазопрессина, значительно повышается уровень иммунных протеасом в клетках карциносаркомы Walker 256 в период, предшествующий ее регрессии.

6. При индукции донорспецифической портальной толерантности происходит приживление трансплантата и обогащение его клеток иммунными протеасомами с субъединицей LMP2. Иммунный ответ против трансплантата, напротив, сопряжен с его обогащением иммунными протеасомами с субъединицей LMP7. Подобная зависимость обнаружена и для клеток печени.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В данной работе впервые исследованы протеасомные механизмы развития иммунной системы и регуляции иммунного ответа и иммунологической толерантности у крыс. Показано, что становление иммунной системы в онтогенезе обусловлено повышением экспрессии иммунных протеасом, содержащих субъединицы LMP7 и LMP2. Причем развитие полноценной иммунной реакции в ответ на инфицирование печени теоретически возможно только на третьей неделе постнатального развития. Именно к этому сроку в гепатоцитах печени возрастает экспрессия иммунных протеасом, необходимых для образования антигенных эпитопов, а в селезенке заканчивается формирование белой пульпы, появляется способность «посылать» Т-лимфоциты для защиты. Однако, при индукции воспаления введением липополисахарида увеличение количества иммунных протеасом в печени возможно уже в эмбриональном развитии, что говорит о гибкости и пластичности этой молекулярной системы.

Иммунный ответ против опухолевых клеток обусловлен повышением экспрессии иммунных протеасом, содержащих все типы иммунных субъединиц. Вместе с тем, выявлены разные функции отдельных форм иммунных протеасом при аллотрансплантации ткани яичника. В то время как иммунные протеасомы с субъединицей LMP7 связаны с развитием иммунных реакций против трансплантата, иммунные протеасомы с

106 субъединицей ЬМР2, напротив, обеспечивают процессы приживления трансплантата (таблица 3). Таким образом, соотношение разных форм иммунных протеасом является ключевым звеном тонкой настройки иммунной системы на развитите Т-клеточного иммунного ответа или иммунологической толерантности. Полученные результаты открывают перспективы для разработки новых подходов к трансплантологии и противоопухолевой терапии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Карпова, Ярослава Дмитриевна, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Абрамова Е.Б., Астахова Т.М., Ерохов П.А. и др. Множественность

форм протеасомы и некоторые подходы к их разделению // Известия РАН. Сер. Биол. 2004. Т. 2. С. 150-156.

2. Астахова Т.М., Делоне Г.В., Люпина Ю.В. и др. Изменение пула протеасом в процессе злокачественной трансформации клеток печени мыши // Acta Naturae. 2010. Т. 2. № 1. С. 109-114.

3. Астахова Т.М., Шарова Н.П. Исключение иммунных протеасом из асцитной карциномы Krebs-II мыши // Известия РАН. Сер. Биол. 2006. Т. 3. С. 275-283.

4. Афанасьева М.А., Мельникова В.И., Воронова С.Н. и др. Пролиферативный ответ лимфоцитов тимуса и селезенки, активированных конканавапином А, в онтогенезе крыс Brattleboro с генетическим дефектом синтеза вазопрессина // Доклады Академии Наук. 2008. Т. 420. С. 153-154.

5. Захарова Л.А., Карягина А.Ю., Попова H.A. и др. Гуморальный иммунный ответ в онтогенезе крыс Браттлеборо с наследственным дефектом синтеза вазопрессина // Доклады Академии Наук. 2001. Т. 376. № 2. С. 70-71.

6. Кабак Я.М. Практикум по эндокринологии. М.: Сов. наука, 1968.

7. Лимфоциты: Методы / Под ред. Дж. Клауса // М.: Мир, 1990. С. 395

8. Хегай И.И. Фенотипическое проявление мутантного гена diabetes insipidus у крыс и критерии генотипирования по фенотипу // Генетика. 2003. Т. 39. С. 70-74.

9. Хегай И.И., Гуляева, М.А. Г., Попова H.A. и др. Особенности системы иммунитета в онтогенезе у крыс с дефектом синтеза вазопрессина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2003. Т. 136. С. 448450.

10. Хегай И.И., Попова H.A., Захарова Л.А. Особенности роста опухоли Walker 256 у крыс с наследственным дефектом синтеза вазопрессина // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006. Т. 141. № 9. С. 316-318.

11. Шарова Н.П. Как клетка восстанавливает поврежденную ДНК? // Биохимия. 2005. Т. 70. С. 341-359.

12. Шарова Н.П., Астахова Т.М., Бондарева JI.A. и др. Особенности формирования пулов протеасом в селезенке и печени крысы в постнатальном развитии // Биохимия. 2006. Т. 71. № 9. С. 1278-1286.

13. Ярилин А. А. Основы иммунологии. М.: Медицина. 1999. 607р.

14. Adams J., Behnke М., Chen S. et al. Potent and selective inhibitors of the proteasome: dipeptidyl boronic acids // Bioorg Med Chem Lett. 1998. T. 8. № 4. C. 333-338.

15. Aki M., Shimbara N., Takashina M. et al. Interferon-gamma induces different subunit organizations and functional diversity of proteasomes // J Biochem. 1994. T. 115. №2. C. 257-269.

16. Alvarado-Sanchez В., Hernandez-Castro В., Portales-Perez D. et al. Regulatory T cells in patients with systemic lupus erythematosus // J Autoimmun. 2006. T. 27. №2. C. 110-118.

17. Beinke S., Robinson M.J., Hugunin M. et al. Lipopolysaccharide activation of the TPL-2/MEK/extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase cascade is regulated by IkappaB kinase-induced proteolysis ofNF-kappaBl pl05. // Molecular and cellular biology. 2004. T. 24. № 21. C. 9658-9667.

18. Birzele F., Fauti Т., Stahl H. et al. Next-generation insights into regulatory T cells: expression profiling and FoxP3 occupancy in Human // Nucleic Acids Res. 2011.

19. Blanco В., Pérez-Simón J.A., Sánchez-Abarca L.I. et al. Treatment with bortezomib of human CD4+ T cells preserves natural regulatory T cells and allows the emergence of a distinct suppressor T-cell population. // Haematologica. 2009. T. 94. №7. C. 975-983.

20. Blanco В., Pérez-Simón J.A., Sánchez-Abarca L.I. et al. Bortezomib induces selective depletion of alloreactive T lymphocytes and decreases the production of Thl cytokines. // Blood. 2006. T. 107. № 9. C. 3575-3583.

21. Block T.M., Mehta A.S., Blumberg B.S. et al. Does rapid oligomerization of hepatitis B envelope proteins play a role in resistance to proteasome degradation and enhance chronicity? // DNA Cell Biol. 2006. T. 25. № 3. C. 165-170.

22. Bogyo M., McMaster J.S., Gaczynska M. et al. Covalent modification of the active site threonine of proteasomal beta subunits and the Escherichia coli homolog HslV by a new class of inhibitors // Proc Natl Acad Sei USA. 1997. T. 94. № 13. C. 6629-6634.

23. Braun B.C., Glickman M., Kraft R. et al. The base of the proteasome regulatory particle exhibits chaperone-like activity // Nat Cell Biol. 1999. T. 1. № 4. C. 221-226.

24. Brooks P., Fuertes G., Murray R.Z. et al. Subcellular localization of proteasomes and their regulatory complexes in mammalian cells // Biochem J. 2000. T. 346 Pt l.C. 155-161.

25. Brunkow M.E., Jeffery E.W., Hjerrild K.A. et al. Disruption of a new forkhead/winged-helix protein, scurfin, results in the fatal lymphoproliferative disorder of the scurfy mouse // Nat Genet. 2001. T. 27. № 1. C. 68-73.

26. Burnet F.M. Cellular immunology. Cambridge University Press, 1969.

27. Calne R.Y., Sells R.A., Pena J.R. et al. Induction of immunological tolerance by porcine liver allografts //Nature. 1969. T. 223. № 5205. C. 472-476.

28. Campana D., Janossy G., Coustan-Smith E. et al. The expression of T cell receptor-associated proteins during T cell ontogeny in man // J Immunol. 1989. T. 142. № l.C. 57-66.

29. Campbell K.S., Purdy A.K. Structure/function of human killer cell immunoglobulin-like receptors: lessons from polymorphisms, evolution, crystal structures and mutations // Immunology. 2011. T. 132. № 3. C. 315-325.

30. Cascio P., Hilton C., Kisselev A.F. et al. 26S proteasomes and immunoproteasomes produce mainly N-extended versions of an antigenic peptide // EMBO J. 2001. T. 20. № 10. C. 2357-2366.

31. Caudill C.M., Jayarapu K., Elenich L. et al. T cells lacking immunoproteasome subunits MECL-1 and LMP7 hyperproliferate in response to polyclonal mitogens // J Immunol. 2006. T. 176. № 7. C. 4075-4082.

32. Chowdrey H.S., Lightman S.L., Harbuz M.S. et al. Contents of corticotropin-releasing hormone and arginine vasopressin immunoreactivity in the spleen and thymus during a chronic inflammatory stress // J Neuroimmunol. 1994. T. 53. № l.C. 17-21.

33. Cong Y., Konrad A., Iqbal N. et al. Generation of antigen-specific, Foxp3-expressing CD4+ regulatory T cells by inhibition of APC proteosome function // J Immunol. 2005. T. 174. № 5. C. 2787-2795.

34. Coux O., Tanaka K., Goldberg A.L. Structure and functions of the 20S and 26S proteasomes // Annu Rev Biochem. 1996. T. 65. C. 801-847.

35. Crispe I.N., Giannandrea M., Klein I. et al. Cellular and molecular mechanisms of liver tolerance // Immunol Rev. 2006. T. 213. C. 101-118.

36. Dahlmann B. Proteasomes // Essays Biochem. 2005. T. 41. C. 31-48.

37. Dahlmann B., Ruppert T., Kuehn L. et al. Different proteasome subtypes in a single tissue exhibit different enzymatic properties // J Mol Biol. 2000. T. 303. № 5. C. 643-653.

38. Delp K., Momburg F., Hilmes C. et al. Functional deficiencies of components of the MHC class I antigen pathway in human tumors of epithelial origin. // Bone marrow transplantation. 2000. T. 25 Suppl 2. C. S88-95.

39. Dijkstra C.D., Dopp E.A. Ontogenetic development of T- and B-lymphocytes and non-lymphoid cells in the white pulp of the rat spleen // Cell Tissue Res. 1983. T. 229. № 2. C. 351-363.

40. Douagi I., Colucci F., Santo J.P. Di et al. Identification of the earliest prethymic bipotent T/NK progenitor in murine fetal liver. // Blood. 2002. T. 99. № 2. C. 463-471.

41. Driscoll J., Brown M.G., Finley D. et al. MHC-linked LMP gene products specifically alter peptidase activities of the proteasome // Nature. 1993. T. 365. № 6443. C. 262-264.

42. Dullmann J., Feldhaus S., Damme E.J. Van et al. Lectin histochemistry of the spleen: a new lectin visualizes the stromal architecture of white pulp and the sinuses of red pulp // J Histochem Cytochem. 2000. T. 48. № 7. C. 923-931.

43. Dunon D., Courtois D., Vainio O. et al. Ontogeny of the immune system: gamma/delta and alpha/beta T cells migrate from thymus to the periphery in alternating waves // J Exp Med. 1997. T. 186. № 7. C. 977-988.

44. Erbach G.T., Semple J.P., Osathanondh R. et al. Phenotypic characteristics of lymphoid populations of middle gestation human fetal liver, spleen and thymus // J Reprod Immunol. 1993. T. 25. № 1. C. 81-88.

45. Erhardt A., Biburger M., Papadopoulos T. et al. IL-10, regulatory T cells, and Kupffer cells mediate tolerance in concanavalin A-induced liver injury in mice. // Hepatology (Baltimore, Md.). 2007. T. 45. № 2. C. 475-85.

46. Forster A., Hill C.P. Proteasome degradation: enter the substrate // Trends Cell Biol. 2003. T. 13. № 11. C. 550-553.

47. Frentzel S., Kuhn-Hartmann I., Gernold M. et al. The major-histocompatibility-complex-encoded beta-type proteasome subunits LMP2 and LMP7. Evidence that LMP2 and LMP7 are synthesized as proproteins and that cellular levels of both mRNA and LMP-containing 20 S proteasomes are differentially regulated. // European journal of biochemistry / FEBS. 1993. T. 216. № l.C. 119-126.

48. Fricke B., Heink S., Steffen J. et al. The proteasome maturation protein POMP facilitates major steps of 20S proteasome formation at the endoplasmic reticulum // EMBO Rep. 2007. T. 8. № 12. C. 1170-1175.

49. Fu Y.X., Chaplin D.D. Development and maturation of secondary lymphoid tissues //Annu Rev Immunol. 1999. T. 17. C. 399-433.

50. Glynne R., Powis S.H., Beck S. et al. A proteasome-related gene between the two ABC transporter loci in the class II region of the human MHC // Nature. 1991. T. 353. № 6342. C. 357-360.

51. Gobbi G., Mirandola P., Micheloni C. et al. Expression of HLA class I antigen and proteasome subunits LMP-2 and LMP-10 in primary vs. metastatic

113

breast carcinoma lesions. // International journal of oncology. 2004. T. 25. № 6. C. 1625-1629.

52. Goldberg A.L., Cascio P., Saric T. et al. The importance of the proteasome and subsequent proteolytic steps in the generation of antigenic peptides // Mol Immunol. 2002. T. 39. № 3-4. C. 147-164.

53. Gorczynski R.M. Immunosuppression induced by hepatic portal venous immunization spares reactivity in IL-4 producing T lymphocytes // Immunology letters. 1992. T. 33. № 1. C. 67-77.

54. Griffin T.A., Nandi D., Cruz M. et al. Immunoproteasome assembly: cooperative incorporation of interferon gamma (IFN-gamma)-inducible subunits // J Exp Med. 1998. T. 187. № 1. C. 97-104.

55. Groettrup M., Khan S., Schwarz K. et al. Interferon-gamma inducible exchanges of 20S proteasome active site subunits: why? // Biochimie. 2001. T. 83. № 3-4. C. 367-372.

56. Groettrup M., Standera S., Stohwasser R. et al. The subunits MECL-1 and LMP2 are mutually required for incorporation into the 20S proteasome // Proc Natl Acad Sci USA. 1997. T. 94. № 17. C. 8970-8975.

57. Groll M., Bajorek M., Kohler A. et al. A gated channel into the proteasome core particle // Nat Struct Biol. 2000. T. 7. № 11. C. 1062-1067.

58. Groll M., Bochtler M., Brandstetter H. et al. Molecular machines for protein degradation // Chembiochem. 2005. T. 6. № 2. C. 222-256.

59. Haider R.C., Kawamura T., Bannai M. et al. Intensive generation of NK1.1- extrathymic T cells in the liver by injection of bone marrow cells isolated from mice with a mutation of polymorphic major histocompatibility complex antigens // Immunology. 2001. T. 102. № 4. C. 450-459.

60. Hayashi T., Horiuchi A., Sano K. et al. Mice-lacking LMP2, immunoproteasome subunit, as an animal model of spontaneous uterine leiomyosarcoma. // Protein & cell. 2010. T. 1. № 8. C. 711-717.

61. Hayashi T., Horiuchi A., Sano K. et al. Molecular Approach to Uterine Leiomyosarcoma: LMP2-Deficient Mice as an Animal Model of Spontaneous Uterine Leiomyosarcoma. // Sarcoma. 2011. T. 56. C. 476-498.

62. Heinemeyer T., Klingenhoff A., Hansen W. et al. A sensitive method for the detection of murine C-type retroviruses // J Virol Methods. 1997. T. 63. № 1-2. C. 155-165.

63. Hershko A., Heller H., Elias S. et al. Components of ubiquitin-protein ligase system. Resolution, affinity purification, and role in protein breakdown // J Biol Chem. 1983. T. 258. № 13. C. 8206-8214.

64. Hussong S.A., Kapphahn R.J., Phillips S.L. et al. Immunoproteasome deficiency alters retinal proteasome's response to stress // J Neurochem. 2010. T. 113. № 6. C. 1481-1490.

65. Hutschenreiter S., Tinazli A., Model K. et al. Two-substrate association with the 20S proteasome at single-molecule level // EMBO J. 2004. T. 23. № 13. C. 2488-2497.

66. Iqbal J., Jacobson C.D. Ontogeny of arginine vasopressin-like immunoreactivity in the Brazilian opossum brain // Brain Res Dev Brain Res. 1995. T. 89. № l.C. 11-32.

66. Jain S., Diefenbach C., Zain J. et al. Emerging role of carfilzomib in treatment of relapsed and refractory lymphoid neoplasms and multiple myeloma. // Core evidence. 2011. T. 6. C. 43-57.

67. Jessop D.S., Murphy D., Larsen P.J. Thymic vasopressin (AVP) transgene expression in rats: a model for the study of thymic AVP hyper-expression in T cell differentiation // J Neuroimmunol. 1995. T. 62. № 1. C. 85-90.

68. Johnsen A., France J., Sy M.S. et al. Down-regulation of the transporter for antigen presentation, proteasome subunits, and class I major histocompatibility complex in tumor cell lines. // Cancer research. 1998. T. 58. № 16. C. 3660-3667.

69. Khan S., Broek M. van den, Schwarz K. et al. Immunoproteasomes largely replace constitutive proteasomes during mi antiviral and antibacterial immune response in the liver // J Immunol. 2001. T. 167. № 12. C. 6859-6868.

70. Kim H.T., Kim K.P., Lledias F. et al. Certain pairs of ubiquitin-conjugating enzymes (E2s) and ubiquitin-protein ligases (E3s) synthesize nondegradable forked ubiquitin chains containing all possible isopeptide linkages // J Biol Chem. 2007. T. 282. № 24. C. 17375-17386.

71. Kloetzel P.M., Ossendorp F. Proteasome and peptidase function in MHC-class-I-mediated antigen presentation // Curr Opin Immunol. 2004. T. 16. № 1. C. 76-81.

72. Knolle P.A., Germann T., Treichel U. et al. Endotoxin down-regulates T cell activation by antigen-presenting liver sinusoidal endothelial cells. // Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950). 1999. T. 162. №3. C. 1401-1407.

73. Kohler A., Cascio P., Leggett D.S. et al. The axial channel of the proteasome core particle is gated by the Rpt2 ATPase and controls both substrate entry and product release // Mol Cell. 2001. T. 7. № 6. C. 1143-1152.

74. Korn T., Reddy J., Gao W. et al. Myelin-specific regulatory T cells accumulate in the CNS but fail to control autoimmune inflammation // Nat Med. 2007. T. 13. №4. C. 423-431.

75. Kotamraju S., Matalon S., Matsunaga T. et al. Upregulation of immunoproteasomes by nitric oxide: potential antioxidative mechanism in endothelial cells. // Free radical biology & medicine. 2006. T. 40. № 6. C. 10341044.

76. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. et al. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J Biol Chem. 1951. T. 193. № 1. C. 265-275.

77. Mandelboim O., Porgador A. NKp46 // The international journal of biochemistry & cell biology. 2001. T. 33. № 12. C. 1147-1150.

78. Marras F., Bozzano F., Maria A. De. Involvement of activating NK cell receptors and their modulation in pathogen immunity // Journal of biomedicine & biotechnology. 2011. T. 35 . C. 152-430.

79. Matsui M., Machida S., Itani-Yohda T. et al. Downregulation of the proteasome subunits, transporter, and antigen presentation in hepatocellular

carcinoma, and their restoration by interferon-gamma // Journal of gastroenterology and hepatology. 2002. T. 17. № 8. C. 897-907.

80. Medzhitov R., Preston-Hurlburt P., Janeway C.A. A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity // Nature. 1997. T. 388. № 6640. C. 394-397.

81. Mehling M., Simon P., Mittelbronn M. et al. WHO grade associated downregulation of MHC class I antigen-processing machinery components in human astrocytomas: does it reflect a potential immune escape mechanism? // Acta neuropathologica. 2007. T. 114. № 2. C. 111-119.

82. Meidenbauer N., Zippelius A., Pittet M.J. et al. High frequency of functionally active Melan-a-specific T cells in a patient with progressive immunoproteasome-deficient melanoma // Cancer research. 2004. T. 64. № 17. C. 6319-6326.

83. Melnikova V.I., Sharova N.P., Maslova E.V. et al. Ontogenesis of rat immune system: Proteasome expression in different cell populations of the developing thymus // Cellular immunology. 2010. T. 266. № 1. C. 83-89.

84. Miyagi T., Tatsumi T., Takehara T. et al. Impaired expression of proteasome subunits and human leukocyte antigens class I in human colon cancer cells. // Journal of gastroenterology and hepatology. 2003. T. 18. № 1. C. 32-40.

85. Murata S., Sasaki K., Kishimoto T. et al. Regulation of CD8+ T cell development by thymus-specific proteasomes // Science. 2007. T. 316. № 5829. C. 1349-1353.

86. Murata S., Takahama Y., Tanaka K. Thymoproteasome: probable role in generating positively selecting peptides // Current opinion in immunology. 2008. T. 20. №2. C. 192-196.

87. Nakagawa H., Yoshioka K., Miyahara E. et al. Intrathecal administration of Y-27632, a specific rho-associated kinase inhibitor, for rat neoplastic meningitis. // Molecular cancer research : MCR. 2005. T. 3. № 8. C. 425-433.

88. Noda C., Tanahashi N., Shimbara N. et al. Tissue distribution of constitutive proteasomes, immunoproteasomes, and PA28 in rats // Biochem Biophys Res Commun. 2000. T. 277. № 2. C. 348-354.

89. Ohteki T., Abo T., Seki S. et al. Predominant appearance of gamma/delta T lymphocytes in the liver of mice after birth // Eur J Immunol. 1991. T. 21. № 7. C. 1733-1740.

90. Orian A., Whiteside S., Israel A. et al. Ubiquitin-mediated processing of NF-kappa B transcriptional activator precursor pi 05. Reconstitution of a cell-free system and identification of the ubiquitin-carrier protein, E2, and a novel ubiquitin-protein ligase, E3, involved in conjugation // J Biol Chem. 1995. T. 270. №37. C. 21707-21714.

91. Ortiz-Navarrete V., Seelig A., Gernold M. et al. Subunit of the "20S" proteasome (multicatalytic proteinase) encoded by the major histocompatibility complex //Nature. 1991. T. 353. № 6345. C. 662-664.

92. Parker G.A., Picut C.A. Liver immunobiology // Toxicol Pathol. 2005. T. 33. № l.C. 52-62.

93. Pickart C.M. Mechanisms underlying ubiquitination // Annu Rev Biochem. 2001. T. 70. C. 503-533.

94. Poltorak A., He X., Smirnova I. et al. Defective LPS signaling in C3H/HeJ and C57BL/10ScCr mice: mutations in Tlr4 gene // Science (New York, N.Y.). 1998. T. 282. № 5396. C. 2085-2088.

95. Qian S.B., Reits E., Neefjes J. et al. Tight linkage between translation and MHC class I peptide ligand generation implies specialized antigen processing for defective ribosomal products // J Immunol. 2006. T. 177. № 1. C. 227-233.

96. Qureshi N., Perera P.-Y., Shen J. et al. The proteasome as a lipopolysaccharide-binding protein in macrophages: differential effects of proteasome inhibition on lipopolysaccharide-induced signaling events. // Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 2003. T. 171. №3. C. 1515-1525.

97. Rees E.P. van, Dijkstra C.D., Sminia T. Ontogeny of the rat immune system: an immunohistochemical approach // Dev Comp Immunol. 1990. T. 14. № l.C. 9-18.

98. Reis J., Guan X.Q., Kisselev A.F. et al. LPS-induced formation of immunoproteasomes: TNF-a and nitric oxide production are regulated by altered composition of proteasome-active sites // Cell biochemistry and biophysics. 2011. T. 60. № 1-2. C. 77-88.

99. Richly H., Rape M., Braun S. et al. A series of ubiquitin binding factors connects CDC48/p97 to substrate multiubiquitylation and proteasomal targeting // Cell. 2005. T. 120. № 1. C. 73-84.

100. Robek M.D., Garcia M.L., Boyd B.S. et al. Role of immunoproteasome catalytic subunits in the immune response to hepatitis B virus // J Virol. 2007. T. 81. №2. C. 483-491.

110. Rock K.L., Goldberg A.L. Degradation of cell proteins and the generation of MHC class I-presented peptides // Annu Rev Immunol. 1999. T. 17. C. 739-779.

111. Roitt I.M., Delves P.J. Roitt's essential immunology. UK: Blackwell Science, 2007.

112. Rousset R., Desbois C., Bantignies F. et al. Effects on NF-kappa Bl/pl05 processing of the interaction between the HTLV-1 transactivator Tax and the proteasome. // Nature. 1996. T. 381. № 6580. C. 328-331.

113. Schmale H., Richter D. Single base deletion in the vasopressin gene is the cause of diabetes insipidus in Brattleboro rats // Nature. 1984. T. 308. № 5961. C. 705-709.

114. Seifert U., Bialy L.P., Ebstein F. et al. Immunoproteasomes preserve protein homeostasis upon interferon-induce oxidative stress // Cell. 2010. T. 142. № 4. C. 613-624.

115. Seliger B., Wollscheid U., Momburg F. et al. Coordinate downregulation of multiple MHC class I antigen processing genes in chemical-induced murine tumor cell lines of distinct origin. // Tissue antigens. 2000. T. 56. № 4. C. 327-336.

119

116. Serwold T., Gaw S., Shastri N. ER aminopeptidases generate a unique pool of peptides for MHC class I molecules // Nat Immunol. 2001. T. 2. № 7. C. 644-651.

117. Sharon M., Taverner T., Ambroggio X.I. et al. Structural organization of the 19S proteasome lid: insights from MS of intact complexes // PLoS Biol. 2006. T. 4. № 8. C. e267.

118. Sharova N.P., Astakhova T.M., Karpova Y.D. et al. Changes in proteasome pool in human papillary thyroid carcinoma development // Central European Journal of Biology. 2011. T. 6. № 4. C. 486-496.

119. Shen J., Reis J., Morrison D.C. et al. Key inflammatory signaling pathways are regulated by the proteasome. // Shock (Augusta, Ga.). 2006. T. 25. № 5. C. 472-484.

120. Shibasaki T., Hotta M., Sugihara H. et al. Brain vasopressin is involved in stress-induced suppression of immune function in the rat // Brain Res. 1998. T. 808. № l.C. 84-92.

121. Singal D.P., Ye M., Qiu X. Molecular basis for lack of expression of HLA class I antigens in human small-cell lung carcinoma cell lines // International journal of cancer. Journal international du cancer. 1996. T. 68. № 5. C. 629-636.

122. Singh S., Awasthi N., Egwuagu C.E. et al. Immunoproteasome expression in a nonimmune tissue, the ocular lens. // Archives of biochemistry and biophysics. 2002. T. 405. № 2. C. 147-153.

123. Smith R.M., Chen Y., McKenna G.J. et al. Prolongation of heterotopic heart allograft survival by portal venous injection of alloantigen: the role of hepatic nonparenchymal cells. // Journal of investigative surgerjthe official journal of the Academy of Surgical Research. 2000. T. 13. № 5. C. 241-246.

124. Stewart I., Schluter P.J., Shaw G.R. Cyanobacterial lipopolysaccharides and human health - a review // Environmental health a global access science source. 2006. T. 5. C. 7.

125. Strehl B., Seifert U., Kruger E. et al. Interferon-gamma, the functional plasticity of the ubiquitin-proteasome system, and MHC class I antigen processing // Immunol Rev. 2005. T. 207. C. 19-30.

126. Takeda K., Kaisho T., Akira S. Toll-like receptors // Annual review of immunology. 2003. T. 21. C. 335-376.

127. Tanaka K., Ichihara A. Half-life of proteasomes (multiprotease complexes) in rat liver // Biochem Biophys Res Commun. 1989. T. 159. № 3. C. 1309-1315.

128. Tokita D., Shishida M., Ohdan H. et al. Liver sinusoidal endothelial cells that endocytose allogeneic cells suppress T cells with indirect allospecificity. // Journal of immunology (Baltimore, Md.: 1950). 2006. T. 177. № 6. C. 3615-3624.

129. Veerman A.J. The postnatal development of the white pulp in the rat spleen and the onset of immunocompetence against a thymus-independent and a thymus-dependent antigen // Z Immunitatsforsch Exp Klin Immunol. 1975. T. 150. № l.C. 45-59.

130. Verma R., Oania R., Graumann J. et al. Multiubiquitin chain receptors define a layer of substrate selectivity in the ubiquitin-proteasome system // Cell. 2004. T. 118. № l.C. 99-110.

131. Voges D., Zwickl P., Baumeister W. The 26S proteasome: a molecular machine designed for controlled proteolysis // Annu Rev Biochem. 1999. T. 68. C. 1015-1068.

132. Vrionis F.D., Wu J.K., Qi P. et al. Tumor cells expressing the herpes simplex virus-thymidine kinase gene in the treatment of Walker 256 meningeal neoplasia in rats // J Neurosurg. 1996. T. 84. № 2. C. 250-257.

133. Watanabe T., Kudo M., Chiba T. et al. Molecular mechanisms of portal vein tolerance. // Hepatology research: the official journal of the Japan Society of Hepatology. 2008. T. 38. № 5. C. 441-449.

134. Witt E., Zantopf D., Schmidt M. et al. Characterisation of the newly identified human Umpl homologue POMP and analysis of LMP7(beta 5i) incorporation into 20 S proteasomes // J Mol Biol. 2000. T. 301. № 1. C. 1-9.

135. Yang M., Omura S., Bonifacino J.S. et al. Novel aspects of degradation of T cell receptor subunits from the endoplasmic reticulum (ER) in T cells: importance of oligosaccharide processing, ubiquitination, and proteasome-dependent removal from ER membranes // J Exp Med. 1998. T. 187. № 6. C. 835846.

136. Yao T., Cohen R.E. A cryptic protease couples deubiquitination and degradation by the proteasome // Nature. 2002. T. 419. № 6905. C. 403-407.

137. Yewdell J. To DRiP or not to DRiP: generating peptide ligands for MHC class I molecules from biosynthesized proteins // Mol Immunol. 2002. T. 39. № 34. C. 139-146.

138. Yewdell J.W., Reits E., Neefjes J. Making sense of mass destruction: quantitating MHC class I antigen presentation // Nat Rev Immunol. 2003. T. 3. № 12. C. 952-961.

139. Yirmiya R., Shavit Y., Ben-Eliyahu S. et al. Natural killer cell activity in vasopressin-deficient rats (Brattleboro strain) // Brain Res. 1989. T. 479. № 1. C. 16-22.

140. Zafirova B., Wensveen F.M., Gulin M. et al. Regulation of immune cell function and differentiation by the NKG2D receptor. // Cellular and molecular life sciences : CMLS. 2011. T. 68. №21. C. 3519-3529.