IL-4d2 - альтернативная форма IL-4: изучение структуры и разработка тест-системы тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.36, кандидат биологических наук Башкатова, Юлия Николаевна

• Башкатова, Юлия Николаевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Башкатова, Юлия Николаевна

Введение.

Глава 1. Биологические свойства и методы анализа цитокинов.

1.1. Введение.

1.2. Классификация цитокинов.

1.3. Биологическая активность цитокинов.

1 АРецепторы цитокинов.

1.5.Методы определения цитокинов.

1.5.1. Определение по биологическим эффектам.

1.5.2. Определение внутриклеточного содержания.

1.5.3. Количественное определение цитокинов с использованием антител

1.6.Интерлейкин-4 (1Ь-4).

1.6.1. Открытие.

1.6.2. Структура 11,-4.

1.6.3.Физиология 1Ь-4.

1.6.4.Возможность регуляции активности 1Ь-4 в терапевтических целях.

1.7. Альтернативный сплайсинг.

1.7.1. Типы альтернативного сплайсинга.

1.7.2. Биологическая роль альтернативного сплайсинга.

1.7.3. Экспрессия и физиология 1Ь-452.

1.7.4. Рекомбинантный 1Ь-452.

1.7.5. Структура 1Ь-452.

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Лабораторные животные.

2.2. Основные реагенты и расходные материалы.

2.3. Молекулярное моделирование.

2.4. Пептидный синтез.

2.5. Отщепление пептида от смолы.

2.5.1. Состав реакционной смеси для снятия пептида со смолы в зависимости от аминокислотного состава пептида.

2.6. Очистка пептидов.

2.7. Синтез стартовых Бтос-аминокислот.

2.8. Конъюгирование пептидов и рекомбинантных белков с гемоцианином виноградной улитки (КЬН).

2.9. Получение поликлональных антител к г1Ь-4 человека.

2.10. Забор крови и получение сывороток.

2.11. Получение моноклональных антител к 1Ь-4 и 1Ь-452 и антипептидных моноклональных антител

2.12. Определение класса иммуноглобулинов в супернатантах.

2.13. Наработка асцитных жидкостей мышей - носителей гибридом, продуцирующих моноклональные антитела.

2.14. Очистка антител.

2.15. Биотинилирование очищенных моноклональных антител.

2.16. Наработка поликлональных антител к пептидам, конъюгатам пептидов с КЬН и рекомбинантным белкам.

2.17. Иммуноферментный анализ (ИФА).

2.18. Дот-блот с использованием в качестве конъюгата стрептавидин-меченной щелочной фосфатазы (8ААР).

2.19. Дот-блот с использованием в качестве конъюгата стрептавидин-меченной полимерной пероксидазы (8АРР).

2.20. Иммуноферменттный анализ в формате сэндвич-ИФА.

2.21. Получение тимоцитов и эксперименты по стимуляции синтеза цитокинов IL-4 и IL-452 in vitro

2.22. Статистическая обработка результатов.

Глава 3. Результаты исследований.

3.1. Теоретический анализ трехмерой и антигенной структуры IL-482.

3.2.Получение моноклональных антител (МКА) к IL-4 и IL-452 и их анализ

3.3. Определение изотипов МКА.

3.4. Иммунохимический анализ района сплайсинга цитокина IL-452.

3.5. Анализ IL-4 и IL-452 с помощью моноклональных антител в формате дот-блота.

3.6. Конструирование сэндвич-ИФА тест-системы.

3.7. Анализ супернатантов от стимулированных тимоцитов на наличие IL-4 и IL-452.

Глава 4. Обсуждение результатов.

Глава 5.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «IL-4d2 - альтернативная форма IL-4: изучение структуры и разработка тест-системы»

Эпидемиологические исследования свидетельствуют о том, что распространенность бронхиальной астмы в разных странах составляет около 10-15%, а аллергического ринита — более 20%. Каждое десятилетие происходит почти двукратное увеличение количества людей, страдающих аллергическими заболеваниями, причем детальные причины этого феномена еще неясны [67]. Поэтому, от состояния научных разработок в области фундаментальных исследований зависит как эффективность, так и появление новых направлений в диагностике, профилактике и лечении аллергии [25,49,50, 51,52, 53, 88, 89].

Способность Т-клеток (СЭ4+) распознавать аллергены и отвечать выбросом определенных цитокинов является ключевым фактором в регуляции синтеза 1§Е, активации тучных клеток, базофилов и эозинофилов, и генерации воспаления. На ряде моделей показано, что цитокины обычно продуцируются двумя различными субпопуляциями Т-хелперов - Тх1 и Тх2, предшественниками которых являются клетки ТхО. Эти клетки, в свою очередь, активируются Т-эпитопами аллергенных белков, которые нарезаются в антиген-экспрессирующих клетках и экспрессируются в виде комплексов с молекулами главного комплекса гистосовместимости второго класса (МНС-П). У атопических больных Т-клеточный репертуар, как в периферической крови, так и в местах контакта аллергена представлен субпопуляцией с Тх2-фенотипом, который генерирует цитокины Тх2-типа: 1Ь-4,1Ь-5,11-10 и 1Ь-13. Эти цитокины модулируют функцию В-лимфоцитов, моноцитов, дендритных клеток и фибробластов, стимулируют переключение продукции антител В-клетками с ^в-изотипа на 1§Е-изотип. С другой стороны, клетки Тх1-типа, задействованные в иммунной защите от чужеродных антигенов, секретируют цитокины с «антиаллергенными» свойствами: 1Ь-2, 1Ь-12, ШЧ-у. У лиц с аллергией число этих клеток и их активнось значительно снижается [67,90]. Таким образом, продукция

Е-антител, в основном, зависит от соотношения цитокинов 1Ь-4 и у-интерферона, а угнетение секреции 1Ь-4 является, по-видимому, эффективным подходом к аллерготерапии.

1Ь-4 представляет собой белок с молекулярной массой 15 кДа, продуцируемый активированными Т-лимфоцитами, тучными клетками и базофилами. Он обладает широким функциональным спектром, поэтому не удивительно, что изменение его активности во многом определяет исход ряда патологических состояний, например при лейшманиозе, проказе, шистосомозе, аллергических заболеваниях и астме. Недавно был описан новый механизм регуляции активности 1Ь-4 с участием альтернативной формы этого белка — 1Ь-452. Альтернативная форма белка 1Ь-452 образуется в результате естественного альтернативного сплайсинга гена ГЬ-4, при котором происходит элиминация второго экзона, кодирующего аминокислотные остатки 22-37, при этом экзоны 1,3,4 гена ТЬ-4 образуют одну открытую рамку считывания. В тимоцитах и клетках бронхиального экссудата уровень экспрессии мРНК 1Ь-452 выше по сравнению с мРНК 1Ь-4, что свидетельствует о тканевой специфичности 1Ь-482. Установлено, что 1Ь-452 (рекомбинантный) подавляет пролиферацию Т- лимфоцитов, а также конкурирует с полноразмерной формой белка за общие рецепторы на иммунокомпетентных клетках. Из имеющихся в литературе данных следует, что 1Ь-4б2 экспрессируется в основном в тимусе и дыхательных путях, ингибируя функции полноразмерной формы 1Ь-4 [14, 120, 126]. Предполагают, что 1Ь-482 является регулятором синтеза приводящим к снижению его уровня в плазме/сыворотке и на поверхности клеток-мишеней - тучных клеток и базофилов. Это, в свою очередь, может сопровождаться изменением соотношения Тх2/Тх1 в пользу Тх1 клеток, снижением чувствительности клеток-мишеней к специфическому аллергену и угнетением реакций ранней и поздней фазы аллергического ответа с подавлением выброса соответствующих медиаторов, гистамина и лейкотриенов.

В связи с этими воззрениями мониторинг, 1Ь-452 представляет большое теоретическое и практическое значение. Анализ динамики его концентрации в крови позволит прослеживать процессы реконвалесценции при атопической бронхиальной астме и аллергических ринитах, наиболее распространенных в мире сезонных заболеваниях. Количественное определение обеих форм цитокина в клинических образцах может обеспечить новый подход в прогнозировании результатов в процессе терапии больных атопической астмой и поллинозами.

Цель работы: анализ пространственной и антигенной структур цитокинов 1Ь-4 и 1Ь-452, поиск дискриминирущих моноклональных антител для обоих цитокинов, разработка системы для количественного определения 1Ь-452 в биологических образцах.

Задачи:

1. Изучить трехмерную структуру цитокинов 1Ь-4 и 1Ь-452.

2. Провести анализ и предсказание наиболее вероятных В-доминантных эпитопов белков 1Ь-4 и 1Ь-452.

3. Синтезировать набор пептидов, имитирующих В-доминантные эпитопы обоих изучаемых белков.

4. Получить моноклональные и поликлональные антитела, специфичные к 1Ь-4 и 1Ь-452.

5. Изучить варианты дизайна тест-системы для количественного определения 1Ь-452.

Научная новизна работы:

Проведен анализ антигенной и трехмерной структур цитокинов человека - 1Ь-4 и его альтернативного сплайсинг-варианта 1Ь-452. Используя наработанные моноклональные и поликлональные антитела и синтетические пептидные фрагменты этих цитокинов, локализованы доминантные В-эпитопы. Впервые получено моноклональное антитело, специфичное для 1Ь-452. Полученная информация использована для разработки системы для количественного определения 1Ь-452 в биологических образцах. Доступность количественного анализа открывает возможность изучения механизмов регуляции экспрессии и активности цитокинов группы 1Ь-4, взаимосвязи между экспрессией мРНК и соответствующей белковой формой.

Практическая значимость:

Ввиду того, что 1Ь-452, является антагонистом полноразмерного 1Ь-4, анализ динамики концентрации обоих цитокинов в крови позволит прослеживать процессы реконвалесценции при аллергических заболеваниях, атопической бронхиальной астме и ринитах, наиболее распространенных в мире сезонных заболеваниях. Количественное определение обеих форм цитокина в клинических образцах может обеспечить новый подход в прогнозировании результатов при терапии аллергических заболеваний.

Разработанная тест-система для количественного определения концентрации 1Ь-452 в биологических образцах может быть использована в мониторинге заболеваний, связанных с повышенной секрецией 1Ь-4.

Сконструированная тест-система является хорошей моделью для создания систем определения сплайсинг-форм других белков.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Башкатова, Юлия Николаевна, 2009 год

1. Дзантиев Б.Б., Осипов А.ГТ. «Классификация и характеристика методов иммуиоферментного анализа». «Итоги науки и техники». 1987; 3:56116.

2. Егоров A.M., А.П.Осипов и др. Теория и практика иммуиоферментного анализа, М., Высш.шк.; 1991.

3. Ешану B.C. Цитокины и их биологические эффекты при некоторых болезнях печени. Клинические перспективы гастроэнтерологии, гепатологии. 2004; 5: 11-17.

4. Кетлинский С.А. Роль Т-хелперов типов 1и 2 в регуляции клеточного и гуморального иммунитета. Иммунология, 2002; 23(2):77 79.

5. Кетлинский С.А., Симбирцев A.C. Цитокины. Издательство Фолиант, монография; 2008.

6. Ковальчук JI. В., Ганковская Л. В. Иммунология. 1995; 1: 4-7.

7. Крысов C.B., Д.Х. Курамшин, С.А. Силков, C.B. Сенников, В.А. Козлов. Клинич. лаб. диагностика. Использование электрохемилюминесцентного метода для количественного определения цитокинов в различных средах . 2000; 12: 39-43.

8. Птицын JI. Р., С. В. Смирнов, И. Б. Альтман, H. Н. Самсонова, А. В. Ходякова, Р. Н. Василенко. Продукция рекомбинантного hIL-482 -природной изоформы интерлейкина-4 человека, в клетках Escherichia coli. Биоорг. химия .1999; 25 (8):623-629.

9. Щепкин И. А., Гердынцева Н. В., Васильев Н. В. Иммунология. 1994; 1:4-7.

10. Ярилин А.А. Система цитокинов и принципы ее функционирования в норме и при патологии. Иммунология, 1997; 5:7-14.

11. Alms WJ, Atamas SP, Yurovsky W, White В Generation of a variant of human interleukin-4 by alternative splicing. Mol Immunol. 1996; 33(4-5):361-70.

12. Arai K., Lee F., Miyajima A., Miyatake S., Yokata T. Cytokines: coordinators of immune and inflammatory responses. Annu Rev Biochem. 1990; 59:783.

13. Atamas S. P., Choi J., Yurovsky V.V., White B. An alternative splice variant of human IL-4, IL-4 delta 2, inhibits IL-4-stimulated T cell proliferation. J. Immunol. 1996; 156(2) :43 5-441

14. Atamas SP, White B.Interleukin 4 in systemic sclerosis: not just an increase.Clin Diagn Lab Immunol. 1999 ; 6(5):658-9. Review.

15. Atamas, S P; Yurovsky, V V; Wigley, F M; Wise, R; Bleecker, E; White, B. Complete and alternatively spliced mRNA for interleukin-4 in pulmonary lymphocytes: systemic sclerosis alveolitis versus asthma. Arthritis Rheum. 1997;40:S54

16. Aulitzky WE, Schuler M, Peschel C, Huber C. Interleukins. Clinical pharmacology and therapeutic use. Drugs. 1994 ;48(5):667-77

17. Baarsch MJ et al Detection of tumor necrosis factor alpha from porcine alveolar macrophages using an L929 fibroblast bioassay. Journal of Immunological Methods. 1991; 140: 15-22.

18. Babakhin A.A., Nolte H., DuBuske L.M. Effect of misoprostol on the secretion of histamine from basophils of whole blood. Ann Allergy Asthma Immunol. 2000;84(3):361-5.

19. Beckmann M. P., Cosman, D., Fanslow, W., Maliszewski, C. R., and Lyman, S. D. The interleukin-4 receptor: structure, function, and signal transduction. Chem. Immunol. 1992; 51:107-134

20. Bienvenu A et al Cytokine assays in human sera and tissues. Toxicology, 1998; 129(1): 55-61.

21. Borish LC, Nelson HS, Corren J, et al. Phase I/II study of recombinant interleukin-4 receptor (IL-4R) in adult patients with moderate asthma. Am J Respir Crit Care Med., 2000; 161:A504.

22. Borish LC, Nelson HS, Lanz MJ, et al. Interleukin-4 receptor in moderate atopic asthma. Am J Respir Crit Care Med., 1999;160:1816-1823.

23. Butcher C, Steinkasserer A, Tejura S, Lennard AC.Comparison of two promoters controlling expression of secreted or intracellular IL-1 receptor antagonist. J Immunol. 1994 ;153(2):701-711.

24. Carr C, Aykent S, Kimack NM, Levine AD. Disulfide assignments in recombinant mouse and human interleukin 4. Biochemistry. 1991 ; 30(6):1515-1523.

25. Carson, R. T., and D. A. Vignali. Simultaneous quantitation of 15 cytokines using a multiplexed flow cytometric assay. J. Immunol. Methods, 1999; 227:41-52.

26. Cheng L, Gearing DP, White LS, Compton DL, Schooley K, Donovan PJ Role of leukemia inhibitory factor and its receptor in mouse primordial germ cell growth. Development. 1994; 120(11):3145-3153.

27. Chomarat, P; Banchereau, J. An update on interleukin-4 and its receptor. Eur Cytokine Netw. 1997; 8:333-344.

28. Clarke D et al Interaction of interleukin 7 (IL-7) with glycosaminoglycans and its biological relevance. Cytokine 1995; 7(4): 325-330.

29. Conlon PJ A rapid biologic assay for the detection of interleukin 1. J Immunol. 1983;131(3):1280-1282.

30. De Vries, J. E., Gauchat, J. F., Aversa, G. G., Punnonen, J., Gascan, H., and Yssel, H. Regulation of IgE synthesis by cytokines. Curr. Opin. Immunol., 1991; 3: 851-858.

31. Dheda K, Chang JS, Breen RA, Haddock JA, Lipman MC, Kim LU, Huggett JF, Johnson MA, Rook GA, Zumla A.Expression of a novel cytokine, IL-4delta2, in HIV and HIV-tuberculosis co-infection.AIDS. 2005;19(15):1601-1606.

32. DuBuske L.M. Appropriate and inappropriate use of immunotherapy. Ann Allergy Asthma Immunol. 2001;87(1 Suppl l):56-67.

33. DuBuske L.M. Mediator antagonists in the treatment of allergic disease. Allergy Asthma Proc. 2001;22(5):261-275. Review

34. DuBuske L.M. The link between allergy and asthma. Allergy Asthma Proc. 1999;20(6):341-345

35. DuBuske L.M. Second-generation antihistamines: the risk of ventricular arrhythmias. Clin Ther. 1999;21(2):281-295.

36. DuBuske L.M. The role of P-glycoprotein and organic anion-transporting polypeptides in drug interactions. Drug Saf. 2005; 28(9):789-801. Review.

37. Eisenberg S.P., Evans R. J., Arend W.P., Verberder E., Brewer M.T., Hannum C.H., Thompson R.C. Primary structure and functional expression from complementary DNA of a human interleukin-1 receptor antagonist. Nature, 1990; 343(6256):341-346.

38. Eperon I.C., Ireland D.C., Smith R.A., Mayeda A., Krainer A.R. Pathways for selection in eucariotic pre-messenger RNA Cell, 1993; 65:797-804.

39. Eric T. Wang, Rickard Sandberg, Shujun Luo, Irina Khrebtukova, Lu Zhang, Christine Mayr, Stephen F. Kingsmore, Gary P. Schroth & Christopher B. Burge. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes Nature , 2008 ; 456: 470-476.

40. Finbloom DS, Larner AC Regulation of the Jak/STAT signalling pathway.Cell Signal. 1995;7(8):739-745

41. Finkelman FD, Madden KB, Morris SC, et al. Anti-cytokine antibodies as carrier proteins. J Immunol 1993; 151:1235-1244.

42. Fox RA, Rajaraman K A link between helper and suppressor factors and the lymphokines migration inhibition factor and migration stimulation factor.Cell Immunol. 1981;59(2):448-454.

43. Fulton, R. J., R. L. McDade, P. L. Smith, L. J. Kienker, and J. R. Kettman, Jr. Advanced multiplexed analysis with the FlowMetrix system. Clin. Chem., 1997; 43:1749-1756.

44. Galli G., Guise J.W., McDevitt M.A., Nevins J.R. Relative position and strength of poly(A) sites as well as transcription termination are critical tomembrane versus secreted m-chain expression during B-cell development Genes Dev., 1987; 1:471-481.

45. Ge H., Manley J.L. A protein factor, ASF, controls cell-specific alternative splicing of SV40 early pre-mRNA in vitro Cell, 1990; 62:25-34.

46. Gery I., Gerson R., Waksman B.Potentiation of the T-lymphocyte response to mitogens. I. The responding cell. J. Exptl Med. 1972; 136: 128-142.

47. Geysen H. M., Meloen R. H., Barteling S. J. Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984; 81: 3998-4002.

48. Glare EM, Divjak M, Rolland JM, Walters EH.Asthmatic airway biopsy specimens are more likely to express the IL-4 alternative splice variant IL-4delta2.J Allergy Clin Immunol. 1999;104(5):978-982.

49. Gushchin I.S. Allergy, Asthma and Clinical Immunology. 1998; 9:5-9

50. Hage T., Sebald W., Reinemer P. Crystal structure of the interleukin-4/receptor alpha chain complex reveals a mosaic binding interface.Cell, 1999; 97:271-281.

51. Hammerling Ulf, Anne-Charlotte Henningsson and Lars Sjodin . Development and validation of a bioassay for Interleukin-2 Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 1992; 10(8):547-553.

52. Heldin, C. H. Dimerization of cell surface receptors in signal transduction. Cell, 1995; 80: 213-223.

53. Helle M, Boeije L, Aarden LA. Functional discrimination between interleukin 6 and interleukin 1 .Eur J Immunol. 1988; 18(10): 1535-1540.

54. Henderson WR, Chi EY, Maliszewski CR. Soluble IL-4 receptor inhibits airway inflammation following allergen challenge in a mouse model of asthma. J Immunol, 2000;164:1086-1095.

55. Henkel, G., and Brown, M. A. PU. 1 and GATA: components of a mast cell-specific interleukin 4 intronic enhancer. Proc. Natl. Acad. Sei. USA .1994; 91: 7737-7741 .

56. Hitoshi Nishimura, Junji Washizu, Nobuhisa Nakamura, Atsushi Enomoto and Yasunobu Yoshikai. Translational Efficiency Is Up-Regulated by Alternative Exon in Murine IL-15 mRNA The Journal of Immunology, 1998, 160: 936-942.

57. Houston D. (ed.). Diagnostic laboratory immunology. Immunol. All. Clin. North Am. Philadelphia, W. B. Saunders, 1994: 199—481.

58. Howard M., Farrar J., Hilfiker M., Johnson B., Takatsu K., Hamaoka T., Paul W. E. Identification of a T cell-derived b cell growth factor distinct from interleukin 2. J. Exp. Med., 1982; 155(3):914-923.

59. Hu-Li, J; Shevach, EM; Mizuguchi, J; Ohara, J; Mosmann, T; Paul, WE. B cell stimulatory factor 1 (interleukin 4) is a potent costimulant for normal resting T lymphocytes. J Exp Med. 1987 ;165(1):157-172.

60. Keegan, AD; Nelms, K; Wang, LM; Pierce, JH; Paul, WE. Interleukin 4 receptor: signaling mechanisms. Immunol Today. 1994;15(9):423-432.

61. Kestler DP, Agarwal S, Cobb J, Goldstein KM, Hall RE.Detection and analysis of an alternatively spliced isoform of interleukin-6 mRNA in peripheral blood mononuclear cells.Blood. 1995;86(12):4559-4567.

62. Kitamura T et al. Establishment and characterization of a unique human cell line that proliferates dependently on GM-CSF, IL3, or erythropoietin. Journal of Cellular Physiology, 1989; 140: 323-334.

63. Klein SC, Golverdingen JG, Bouwens AG, Tilanus MG, de Weger RA An alternatively spliced interleukin 4 form in lymphoid cells. Immunogenetics. 1995;41(1):57.

64. Klein SC, Golverdingen JG, van Wichen DF, Bouwens AG, Stuij I, Tilanus MG, Bast EJ, de Weger RA.Expression of two interleukin 4 mRNA isoforms in B lymphoid cells.Cell Immunol. 1996;167(2):259-268.

65. Kondo, M., Takeshita, T., Ishii, N., Nakamura, ML, Watanabe, S., Arai, K., and Sugamura, K. Sharing of the interleukin-2 (IL-2) receptor gamma chain between receptors for IL-2 and IL-4. Science ,1993; 262: 1874-1877.

66. Konishi K et al A simple and sensitive bioassay for the detection of human interleukin-18/interferon-gamma-inducing factor using human myelomonocytic KG-1 cells. Journal of Immunological Methods, 1997; 209(2): 187-191.

67. Kotnik V, Fleischmann WR Jr A simple and rapid method to determine hematopoietic growth factor activity.J Immunol Methods. 1990;129(1):23-30.

68. Kowal K., Nolte H., Skov P.S., DuBuske L.M. Effect of allergen-specific immunotherapy on recombinant human interleukin 3-mediated amplification of allergen-induced basophil histamine release. Allergy Asthma Proc. 2005;26(6):456-462.

69. Kowal K., Pampuch A., Kowal-Bielecka O., DuBuske L.M., Bodzenta-Lukaszyk A. Platelet activation in allergic asthma patients during allergen challenge with Dermatophagoides pteronyssinus. Clin Exp Allergy. 2006; 36(4):426-32.

70. Kowalski ML, Jutel M. Mechanisms of specific immunotherapy of allergic diseases.Allergy. 1998;53(5):485-492. Review.

71. Kruse, N., Shen, B. J., Arnold, S., Tony, H. P., Muller, T., and Sebald, W. Conversion of human interleukin-4 into a high affinity antagonist by a single amino acid replacement. EMBO J. 1993; 12: 5121-5129.

72. Langford C.J., Galwitz D. Evidence for intron-contained sequence required for the splicing of yeast RNA polimeraze II transcripts. Cell, 1983; 33:519527.

73. Lee, H. J., Matsuda, I., Nailo, Y., Yokota, T., Arai, N., and Arai, K. Signals and nuclear factors that regulate the expression of interleukin-4 and interleukin-4 genes in helper T cells J. Allergy Clin. Immunol. 1994; 94: 594-604.

74. Li-Weber, M., Kraft, H., and Krammer, P. H. A novel enhancer element in the human IL-4 promoter is suppressed by a position-independent silencer. J. Immunol., 1993; 151: 1371-1382.

75. McCurdy D.K., Zaldivar F., Sandborg C., Imfeld K. and Berman M. Interleukin-4 (IL-4) and IL-4 antagonist, IL-4d2, expression in synovial fluid from patients with juvenile rheumatoid artrits (JRA). Arthritis Rheum 1998; 41:100.

76. Morgan D.A., Ruscetti F.W., Gallo R.C. Selective in vitro growth of T lymphocytes from normal human bone marrows. Science. 1976; 193(4257): 1007-1008.

77. Mosmann T.R., Coffman R.L. Thl and Th2 Cells: Different Patterns of Lymphokine Secretion Lead to Different Functional Properties Ann. Rev. Immunol., 1989; 7,:145-173.

78. Miiller, T., Dieckmann, T., Sebald, W. & Oschkinat, H. Aspects of receptor binding and signalling of interleukin-4 investigated by site-directed mutagenesis and NMR spectroscopy. J. Mol. Biol., 1994; 237:423-436.

79. Muller, T., Oehlenschlager, F., Buehner, M.: Human interleukin-4 and variant R88Q: phasing X-ray diffraction data by molecular replacement using X-ray and nuclear magnetic resonance models. J Mol Biol ., 1995; 247:360.

80. Murata, T; Obiri, N I; Puri, R K. Structure of and signal transduction through interleukin-4 and interleukin-13 receptors (review). Int J Mol Med. 1998; 1:551-557.

81. Nelms K, Keegan AD, Zamorano J, Ryan JJ, Paul WE. The IL-4 receptor: signaling mechanisms and biologic functions. Annu Rev Immunol 1999;17:701-738.

82. Noelle R, Krammer PH, Ohara J, Uhr JW, Vitetta ES. Increased expression of la antigens on resting B cells: an additional role for B-cell growth factor. Proc Natl Acad Sci USA. 1984;81(19):6149-53.

83. Pan Q, Shai O, Lee LJ, Frey BJ, Blencowe BJDeep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 2008;40(12): 1413-1415.

84. Paul N., Ruddle N. Lymphotoxin. Annual Rev. Immunol. 1988; 6: 407-438.

85. Paul W. Blood. Interleukin-4: a prototypic immunoregulatory lymphokine. 1991; 77:1859-1865.

86. Paul W.E., Seder R.A. Lymphocyte responses and cytokines Cell, 1994; 76:241-251.

87. Peitsch M. C. ProMod and Swiss-Model: Internet-based tools for automated comparative protein modelling. Biochem. Soc. Trans., 1996; 24: 274-279.

88. Powers, R., Garrett, D. S., March, C. J., Frieden, E. A., Gronenborn, A. M. & Clore, G. M. Three-dimensional solution structure of human interleukin-4 by multidimensional heteronuclear magnetic resonance spectroscopy. Science, 1992; 256:1673-1677.

89. Prinz M; Hanisch U K; Kettenmann H; Kirchhoff F Alternative splicing of mouse IL-15 is due to the use of an internal splice site in exon 5. Brain research. Molecular brain research 1998; 63(1): 155-62.

90. Prussin, C., and D. D. Metcalfe. Detection of intracytoplasmic cytokine using flow cytometry and directly conjugated anti-cytokine antibodies. J. Immunol. Methods, 1995; 188:117-128.

91. Randall LA et al A novel sensitive bioassay for transforming growth factor beta. Journal of Immunological Methods, 1993; 164: 61-67.

92. Rapolle D., Mark D., Banda M.J. Werb Z. Wound Macrophages Express TGF-a and Other Growth Factors in Vivo: Analysis by mRNA Phenotyping .Science, 1988;241:708-712.

93. Redfield C., Smith L.J., Boyd J., Lawrence G.M.P., Edwards R.G., Smith R.A.G., Dobson C.M. Secondary structure and topology of human interleukin 4 in solution.Biochemistry, 1991; 30:11029-11035.

94. Seah G. T., Gao P. S., Hopkin J. M., and G. A. W. Rook. Interleukin-4 and its alternatively spliced variant (IL-482) in patients with atopic asthma Am. J. Respir. Grit. Care Med., 2001; 164:1016-1018.

95. Seah GT, Scott GM, Rook GA.Type 2 cytokine gene activation and its relationship to extent of disease in patients with tuberculosis.J Infect Dis. 2000;181(l):385-389.

96. Sennikov,S.V. Krysov, T.V. Injelevskaya, A.N. Silkov, L.V. Grishina,V.A. Kozlov Quantitative analysis of human immunoregulatory cytokines by electrochemiluminescence method. J. Immunol. Methods. 2003; 275(1-2): 81-88.

97. Smith, L. J., Redfield, C., Boyd, J., Lawrence, G. M., Edwards, R. G., Smith, R. A. & Dobson, C. M. Human interleukin 4. The solution structure of a four-helix bundle protein. J. Mol. Biol. 1992; 224: 899-904.

98. Snapper, CM; Finkelman, FD; Paul, WE. Differential regulation of IgGl and IgE synthesis by interleukin 4. J Exp Med. 1988;167(1):183-196.

99. Sorg, R. V., J. Enczmann, U. R. Sorg, E. M. Schneider, and P. Wernet Identification of an alternatively spliced transcript of human interleukin-4 lacking the sequence encoded by exon 2. Exp. Hematol. 1993, 21:560—563;

100. Sutton B. J. and Gould H. The human IgE network. J. Nature, 1993; 366:421-428.

101. Todd, M. D., Grusby, M. J., Lederer, J., A. Lacy, E., Lichtman, A. H., and Glimcher, L. H. Transcription of the interleukin 4 gene is regulated by multiple promoter elements . J. Exp. Med., 1993; 177: 1663-1674.

102. Tsytsikov V. N., Yurovsky V.V., Atamas S.P., Alms W.J., White B. Identification and characterization of two alternative splice variants of human interleukin-2. J. Biol. Chem. 1996; 271(38): 23055-23060.

103. Ulfendahl P.J., Kreivi J.-P., Akusjarvi G. Role of the branch site/3' splice site region in adenovirus-2 E1A pre-mRNA alternative splicing: evidence for 5' and 3' splice site cooperation Nucleic Acids Res., 1989; 17:925-938.

104. Van Ommen R., Meulenberg P. P., Breedland E. G., Coffman R. L. and Savelkoul H.F.J. Eur. J. Allergy Clin. Immunol., 1992; 47(12):sl68.

105. Van Regenmortel M. H. V. In: Synthetic peptides as antigens. Eds: Van Regenmortel M. H. V. & Mueller S. 1999.

106. Walter MR, Cook WJ, Zhao BG, Cameron RP Jr, Ealick SE, Walter RL Jr, Reichert P, Nagabhushan TL, Trotta PP, Bugg CE Crystal structure of recombinant human interleukin-4. J Biol Chem. 1992;267(28):20371-20376.

107. Wang S.M., Lei H.Y., Huang M.C., Su L.Y., Lin H.C., Yu C.K., Wang J. L., Liu C.-C. Modulation of cytokine production by intravenous immunoglobulin in patients with enterovirus 71-associated brainstem encephalitis. J. Clin. Virol., 2006; 37 (1): 47-52.

108. Wang, Y., Shen, B. J., and Sebald, W. A mixed-charge pair in human interleukin 4 dominates high-affinity interaction with the receptor alpha chain. Proc. Natl Acad. Sci. USA, 1997; 94(5): 1657-1662.

109. Wieringa B., Hofer E., Weissmann C. A minimal intron length but no specific internal sequence is required for splicing the large rabbit b-globin intron. Cell, 1994; 37:915-25

110. Wlodaver A., Pavlovsky A., Gustchina A.Crystal structure of human recombinant interleukin-4 at 2.25-A resolution. FEBS Lett. 1992; 309:59-64.

111. Wu HP, Wu CL, Yu CC, Liu YC, Chuang DY.Efficiency of interleukin-4 expression in patients with tuberculosis and nontubercular pneumonia.Hum Immunol. 2007;68(10):832-838.

112. Young S.G. , Smith R.D. , Hogle D.M. , Curtiss L.K. , Witztum J.L. Two new monoclonal antibody-based enzyme-linked assays of apoprotein B. Clin. Chem., 1986 ; 32:1484-1490.

113. Ziff E.B. Transcription and RNA processing by the DNA tumor viruses, Nature ,1980; 187: 491-499.