Идентификация и свойства бета-лактамаз полирезистентных штаммов грамотрицательных бактерий тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.31, кандидат биологических наук Сазыкин, Алексей Юрьевич

• Сазыкин, Алексей Юрьевич
• кандидат биологических наук
• 1985

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сазыкин, Алексей Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА I. ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ, БИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ И.

ПРОИСХОЖДЕНИЕ .^-ЛАКТАМАЗ.

ГЛАВА 2. ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА /-ЛАКТАМАЗ ГРАМПО

ЛОЖИТЕЛЬНЫХ И ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ.

2.1. Субстратные спектры ^-лактамаз и новые £ -лактамные антибиотики.

2.2. Ингибиторы и индукторы ^-лактамаз.

ГЛАВА 3. АНАЛИТИЧЕСКИЕ И ПРЕПАРАТИВНЫЕ МЕТОДЫ

ИЗУЧЕНИЯ. /-ЛАКТАМАЗ.

3.1. Микробиологические методы определения ^з-лактамаз.

3.2. Методы регистрации ^-лактамазной активности.

3.3. Аналитическое изоэлектрическое фокусирование . .^-лактамаз.

3.4. Методы выделения и очистки ^А-лактамаз.

ГЛАВА 4. СИСТЕМЫ КЛАССИФИКАЦИИ И ПРИМЕНЕНИЕ

-ЛАКТАМАЗ.

4.1. Основные принципы классификации

-лактамаз.

4.2. Использование ^-лактамаз при скрининге з-лактамных структур и характеристике новых полусинтетических 3 -лактамных соединений.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

I. Бактериальные штаммы - источнике .Я-лактамаз.

2. Антибиотики и основные реактивы.

3. Методы очистки и изучения З-лактамаз.

РЕЗУЛЬТАТЫ

ГЛАВА I. РАЗРАБОТКА МЕТОДОВ ОПРВДЕЯЕНШ АКТИВНОСТИ

И ХАРАКТЕРИСТИКИ СВОЙСТВ Я -ЛАКТАМАЗ.

1.1. Определение л-лактамаз.ной активности модифицированным микроиодометрическим методом.

1.2. Модифицированный потенциометрический метод определения активности, ^б-лактамаз.

1.3. Метод препаративного изоэлектрического фокусирования ^-лактамаз.

ГЛАВА 2. ИЗУЧЕНИЕ СВОЙСТВ И КЛАССИФИКАЦИЯ:

-ЛАКТАМАЗ ИЗ ПОЗШРЕЗИСТЕНТНЫХ ШТАММОВ . ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ.

2.1. Характеристика ферментов цефалоспориназного типа действия.

2.2. Свойства пенициллиназ различных классов.

ГЛАВА 3. ДИФФЕРЕНЦИАЦИЯ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ^-ЛАКТАМАЗ

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭВМ.

3.1. Вывод расчетной формулы.

3.2. Применение программы вьас для анализа спектров ^-лактамазной активности и подтверждение данных ЭВМ методами препаративного разделения ферментов.

ГЛАВА 4. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА /-ЛАКТАМАЗЫ ПЕНИЦИЛЛИНАЗНО-ГО ТИПА, ОБРАЗУЕМОЙ citrobacter

PREUNDII

ГЛАВА 5. ВЫДЕЛЕНИЕ, ОЧИСТКА И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА jÖ-ЛАКТАМАШ ЦЕФАЛОСПОРИНАЗ-НОГО ТИПА ИЗ КЛЕТОК enterobacter aerogeues 6803.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. вывода.

ШСОМЕНДАЦИИ ПО ПРАКТИЧЕСКОМУ ПРИМЕНЕНИЮ

РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация и свойства бета-лактамаз полирезистентных штаммов грамотрицательных бактерий»

Актуальность проблемы

Бактериальная резистентность к широко применяемым в клинике /-лактамным антибиотикам - пенициллинам и цефалоспоринам обусловлена в большинстве случаев их ферментативной инактивацией. Ферменты, инактивирующие /-лактамные антибиотики путем расщепления £-лактамного кольца, получили название ^-лактамаз.

-Лактамазы составляют обширную группу ферментов, различающихся по субстратной специфичности и другим свойствам. Наиболее многочисленную и сравнительно мало изученную группу ^-лак-тамаз составляют -лактамазы грамотрицательных .бактерий. Кроме того, внедрение в клинику.новых поколений пенициллинов. и цефа-лоспоринов приводит.к распространению в микробных популяциях-лактамаз с измененными субстратными спектрами, а также к появлению штаммов бактерий, содержащих в клетке две различных по субстратной .специфичности ^б-лактамазы. Разностороннее.изучение каталитических и физико-химических свойств ^з-лактамаз грамотрицательных бактерий является весьма актуальным, поскольку, эффективность антибиотикотерапии во многом зависит.от создания новых /-лактамных структур, не являющихся субстратами наиболее распространенных . £-лактамаз. Препараты £-лактамаз необходимы при оценке, .получаемых путем скрининга или химической, трансформации ^-лактамных антибиотиков, а также при оценке ингибиторов ^-лактамаз, которые могут быть использованы в комбинациях с ^-лактамными антибиотиками. . Характеристика . /-лактамаз бактерий, выделяемых в клинике, необходима при изучении эпидемиологии антибиотикорезистент-ности. .

Цель и основные задачи работы

Цель работы заключалась в идентификации, изучении свойств и классификации ^-лактамаз, ввделенных из клинических полирезистентных штаммов грамотрицательных бактерий, принадлежащих к семейству Enterobacteriaceae И роду Pseudomonas, Для ЭТОГО предстояло решить следующие основные задачи: - модифицировать микроиодометрический и потенциометричес-кий методы определения активности ^3-лактамаз с целью их использования для работы как с пенициллинами, так и с цефалоспоринами;

- разработать быстрый метод дифференциации ^ß-лактамаз у штаммов, содержащих по две jß-лактамазы с разным субстратным спектром;

- определить субстратную , специфичность и провести классификацию >-лактнмаз, присутствующих у. полирезистентных жаммов, выявить среди них частоту встречаемости бактерий, содержащих в клетке одновременно две различные js-лактамазы;

- выделить, очистить до гомогенного состояния и исследовать физико-химические свойства /-лактамаз пенициллиназного и цефа-лоспориназного типов; .

- изучить особенности взаимодействия очищенных препаратов J3—лактамаз. -с ингибиторами - аналогами субстратов.

Научная новизна работы. Получены данные о субстратной.специфичности и распределении по классификационным группам ./-лактамаз полирезистентных штаммов грамотрицательных бактерий, выделенных в ряде клиник.

Разработаны схемы выделения высокоочищенных ферментных препаратов ß-лактамаз. .

Предложена модификация микроиодоме.трического метода определения активности yö-лактамаз, позволяющая использовать этот метод при сравнительных исследованиях ферментов, а также в случае испытания как субстратов не только пенициллинов, но и цефалоспо-ринов.

Внесены модификации в потенциометрический метод определения ,^-лактамазной активности, уменьшающие зависимость получаемых результатов от непостоянства емкости буферных растворов при изменениях рН.

Впервые разработан основанный на применении ЭВМ метод, позволяющий быстро устанавливать одновременное наличие в клетках одного штамма двух ^-лактамаз. Метод может быть использован для -характеристики штаммов при массовых исследованиях и изучении эпидемиологии ^-лактамаз и не требует предварительного разделения ферментных., б елков

Модифицирован, применительно к ^й-лактамазам, метод изсн-электрического фокусирования, позволяющий выделять, ^з-лактама-зы в препаративных количествах. Модификации приводят к более полному извлечению ^В-лактамаз из геля, ж предотвращают возможную инактивацию ферментных белков цри крайних (низких или высоких) значениях рН во время их миграции в геле.

При изучении кинетики гидролиза различных субстратов гомогенными препаратами ^-лактамаз впервые для регистрации ферментативной активности был использован метод кругового дихроизма, позволивший выявить особенности действия этих ферментов на некоторые субстраты, не выявляемые обычными методами, а также оцре-делить дот оС- и -спиральных участков в полипептидной цепи.

Практическая ценность работы. Изученные бактериальные штаммы с установленным классом ./З-лактамаз были рекомендованы к использованию в лабораторной практике во ВНИИА: I) при сравнительной характеристике новых клинических штаммов, 2) при поиске и оценке природных ^Л-лактамных структур с антибиотическими свойствами и/или свойствами ингибиторов ./-лактамаз.

Гомогенный препарат фермента цефалоспориназного типа был применен в практике работы ВНИИА при изучении фармакокинетики антибиотиков в случае комбинированной антибиотикотерапии. Фермент использован для инактивации цефалоспоринов (и выявлении при этом активности применяемых совместно с цефалоспоринами аминогликози-дов).

Модифицированные микрон одометрический и потенциомегрический методы определения /-лактамазной активности и метод быстрого обнаружения двух ^З-лактамаз у штамма с помощью ЭВМ могут быть использованы в лабораторной практике цри характеристике полирезистентных клинических штаммов бактерий, а также при поисковой работе и оценке новых ^-лактамных структур.

Методы препаративного выделения ^-лактамаз, в частности с помощью улыврафильтрации и изофокусирования могут быть использованы в работах по получению этих ферментов.

Заключение диссертации по теме «Химиотерапия и антибиотики», Сазыкин, Алексей Юрьевич

- 122 -ВЫВОДЫ

1. Из 56 полирезистентных клинических штаммов грамотрица-тельных бактерий выделены и охарактеризованы препараты ß -лак-тамаз. Изученные /-лактамазы отнесены к пяти классам по клас-. сификации Richmond. Около 30$ из них составляли ферменты цефало-спориназного типа (I класс), 70$ - пенициллиназы (П-У.классы). Видовой специфичности ß -лактамаз не было обнаружено.

2. Разработаны модифицированные микроиодометрический и по-тенциометрический методы определения ß -лактамаз. Методы.при-, годны для работы с различными ß -лактамазами при использовании . в качестве субстратов как пенициллинов, так и цефалоспоринов.Разработан модифицированный метод изоэлектрического фокусирования -лактамаз для аналитических и препаративных целей.

3. Разработан метод анализа спектра ß -лактамазной активности с использованием ЭВМ, позволяющий выявлять одновременное присутствие у штамма двух ß -лактамаз с описанием субстратного спектра каждого фермента. Обнаружены сочетания /-лактамаз (ТЕМ и PSE-2 - Ш класс, ТЕМ и I класс, ТЕМ и П класс, ТЕМ и У класс)

У штаммов, относящихся к Ps.aeruginosa, Ent.aerogenes,И Kl.pneumoniae. Данные ЭВМ подтверждены биохимическими методами.

4. Пенициллиназа группы ТЕМ, кодируемая плазмидой из Citr. freundii^n ß> -лактамаза цефалоспориназного типа из Ent.aerogenes 6803 с ранее не описанным субстратным спектром были получены в гомогенном состоянии. Определены их кинетические параметры и чувствительность к.реагентам на функциональные группы и ß -лактам-ным ингибиторам. Установлено соотношение о( - и ß -спиральных структур в молекулах.

5. Применение для изучения /-лактамаз метода кругового дихроизма позволило выявить не обнаруживаемый другими методами медленный гидролиз некоторых ингибиторов /-лактамной структуры. Впервые были определены Км и Ккат при гидролизе р -лактамазой ТМ метициллина. Показан гидролиз ^-лактамазой из Еп-иаегс^епев 6803 ее.ингибитора цефазолина, но не второго ингибитора - цефу-роксима.

6. Штаммы-продуценты охарактеризованных р -лактамаз, препараты ферментов, а также модифицированные методы определения активности р -лактамаз использованы при скрининге новых р -лак-тамных структур.

РЖОМЕНДАЦИИ ПО. ПРАКТИЧЕСКОМУ ПРИМЕНЕНИЮ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ

Модифицированные микроиодометрический и потенциометрический методы определения активности -лактамаз, а также бактериальные штаммы с идентифицированными и отнесенными к разным классам -лактамазами могут быть использованы при скрининге и оценке свойств новых природных и полусинтетических р -лактамных структур.

Метод дифференциации -лактамаз при помощи ЭВМ может применяться для характеристики бактериальных штаммов при изучении эпидемиологии антибиотикорезистентности.

Указанные методы впервые апробированы в Лаборатории экспериментальной химиотерапии ВНИИА.

- 125

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сазыкин, Алексей Юрьевич, 1985 год

1. Аверьянова Е.В., Богачева Т.И., Роканская Т.И., Селезнева A.A. Экспресс-метод определения активности ингибитора в -лактама-зы. Антибиотики, 1984, 29, И 4, 245-248.

2. Бибикова М.В., Иваницкая Л.П., Никишина В.Г., Кузнецова С.М. Характеристика субстратной специфичности сырцов эндогенныхв-лактамаз грамотрицательных бактерий. Антибиотики, 1983 , 28, J* 3, 566-573.

3. Иваницкая Л.П. Направленный поиск природных беталактамных антибиотиков. Антибиотики, 1982, 28, të 2, 117-136.

4. Макарова P.A. К вопросу об образовании пенициллиназы грамотри-цательныш бактериями. Антибиотики, 1968, 13, Ji 5, 391-395.

5. Навашин С.М., Петрова М.А., Чавдарова В.Б. Комбинированное действие полу синтетических пенициллинов (ампициллина и оксацил-лина) на клинические штаммы грамполокительных и грамотрица-телышх микроорганизмов. Антибиотики, 1969, 14, të II, 1006-I0II.

6. Навашин С.М., Фомина И.П. Природа антибиотикоустойчивости иее механизмы. В кн. "Рациональная антибиотикотерапияй. Москва, "Медицина", 1982, стр. 28.

7. Павлович Н.В., Шиманюк Н.Я., Мшнанышн Б.Н. Выделение и очистка пенициллиназы из клеток возбудителя туляремии. Антибиотики, 1983, 28, Л 10, 743-747.

8. Резван С.П., Чайковская С.М. Связь устойчивости E.coli к пенициллинам с образованием пенициллиназы этими культурами. Антибиотики, 1974, 19, Я 2, 139-141.

9. Резван С.П., Чайковская С.М. Уровень "внутренней" устойчивости культур E.coli к бензилпеницидлину. Антибиотики, 1975, 20, ifi 3, 262-266.

10. Фомина И.П., Лобусева А.Н., Навашин С.М. Ингибиторы ß-лак-тамаз и их возможная роль в лекарственной терапии. Антибиотики, 1984, 29, Jfi 2, 142-148.

11. Чайковская С.М., Венкина Т.Г. Модифицированный и о доме тричес-кий метод определения активности пеницидлиназы. Антибиотики, 1962, 7, А 5, 453-456.

12. Baty D., Bernadac A*, Berthois Y», Lazdunski C. Synthesis and export of TEM-1 ß-lactamase in Escherichia coliTPEBS Lett., 1981, 127, N, 1, p. 161-165.

13. Breunig K.D», Mackedonski V., Hollenberg C.P. Transcription of the bacterial ß-lactamase gene in Saccharomyces cerevisiae.

14. Dubois J., Pechere J.-C., Letarte R. Factors affecting the increase of R plasmids during hospitalization. Current Microbiology, 1981, 5, N 4, p. 219-222.

15. Duetz C., Frere J.M., Ghuysen J.M., Van Beeumen J., Delcambe L., Dierickx L. Purification and properties of the exocellular ß-lactamase of Actinomadura strain R39» Biochim. Biophys. Acta, 1982, 700, N 1, p. 24-32.

16. Greenwood D., Eley A. In vitro evaluation of sulbactam, a pe~ nicillanic acid sulphone with ß-lactamase inhibitory properties. J. Antimicrobial Chemotherapy, 1982, 10, N 2, p. 117-123«

17. Hamilton-Miller J.M.T. ß-Lactamases and their clinical significance. J. Antimicrobial Chemotherapy, 1982, 9, N 2, Supplement B, p. 11-19*

18. Heimdall A., Konow L. von, Kord C«E. Beta-lactamase-producing Bacteroides species in the oral cavity in relation to penicillin therapy. J. Antimicrobial Chemotherapy, 1981, 8, N3» P» 225-229»

19. Holt J., Simpson I.N., Harper P.B. Quantitative methods for assessing stability of ß-lactam antibiotics to cell-free ß-lac-tamase extracts. Soc. Appl. Bacteriol. Tech. Ser. 1983, 18 (Antibiot Assess. Antimicrob. Act. Resist.), p. 127-133»

20. Neu H.C. Mechanism of bacterial resistance to antimicrobial agents with particular reference to cefotaxime and other ß~ lactam compounds. Reviews of Infectious Diseases, 1982, 4, Supplement, S288-S299«

21. Ogawara H. Biochemical properties of ß-lactamases from strep-tomycetes. Zentralbl. Bakteriol., Mikrobiol., Hyg., Abt.1, Suppl. 1981, 11, (Actinomycetes), p. 291-295«

22. Ogawara H., Horikawa S. Purification of ß-lactamase from Streptomyces cellulosae by affinity chromatography on blue sepharose. J. Antibiotics, 1979, 32, N 12, p.1328-1335*

23. Reviews of Infections Diseases, 1982, 4, Supplement1,S522-S526.

24. Scudamore R.A., Beveridge T.J., Goldner M. Outer membrane penetration barriers as components of intrinsic resistance to beta-lactam and other antibiotics in Escherichia coli K-12. Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1979, 15, N 2, p.182-189.

25. Smith W.P., Tai P.-C., Davis B-D. Bacillus licheniformis penicillinase: cleavages and attachment of lipid during cotrans-lational secretion. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1981, 78, N 6, p. 3501-3505.

26. Smith J«T., Wyatt J.M. Relation of R factor and chromosomal B-lactamase with the periplasmic space. J. Bacteriology, 1974, 117, N 3, P« 931-939.