Характеристика новых мутантных форм пенициллинацилазы из Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 02.00.15, кандидат химических наук Шаповалова, Ирина Владимировна

• Шаповалова, Ирина Владимировна
• кандидат химических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат химических наук Шаповалова, Ирина Владимировна

Список сокращений

Введение

1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8 1.1. Антибиотики, как эффективные антиинфекционные препараты

1.1.1.0 механизме действия ß-лактамных антибиотиков 11 1.1.2 Полусинтетические антибиотики

1.2 Пенициллинацилаза из E.coli

1.2.1 Структура пенициллинацилаз из Е. coli

1.2.2 Каталитический механизм

1.2.3 Субстратная специфичность пенициллинацилаз

1.2.4 Строение участка связывания ацильной части субстрата (pl)

1.2.4.1 Ингибирование пенициллинацилаз производными фенилуксусной кислоты

1.2.5 Участок связывания нуклеофила

1.2.5.1 Изучение участка связывания боковой группы субстрата (р2)

1.2.5.2 Изучение участка связывания карбоксильной группы субстрата (рЗ)

1.2.6 О pH-зависимости каталитической активности

1.2.7 Кинетическая схема реакций ацильного переноса, катализируемых пенициллинацилазой из Е. coli

1.3 Изучение структурно-функциональных взаимосвязей в пенициллинацилазе 34 1.3.1 Об опыте использования сайт-направленного мутагенеза с целью улучшения пенициллинацилазы для синтеза ß-лактамных антибиотиков

1.3.2Использование новейших технологий для изучения ПА из E.coli

1.4 Исследование субстратной специфичности и изучение кинетики мутантных ферментов

1.4.1 Мутагенез, основанный на анализе аминокислотной последовательности

1.4.2 Случайный мутагенез

2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1 Материалы

2.2 Методы

2.2.1 Сайт-направленный мутагенез пенициллинацилазы из E.coli

2.2.2 Экспрессия и очистка мутантных ферментов

2.2.3 Определение концентрации активных центров нативной пенициллинацилазы

2.2.4 Определение концентрации активных центров мутантных пенициллинацилаз

2.2.5 Определение кинетических параметров ферментативного гидролиза цветных субстратов

2.2.6 Синтез М-фенилацетил-(11)-фенилглицил-(8)-цистеина

2.2.7 Предколоночная модификация аминогрупп о-фталевым альдегидом

2.2.8 ВЭЖХ-анализ 61 2.2.90пределение константы Км в реакции гидролиза

М-фенилацетильных производных аминокислот

2.2.10 Определение ккат гидролиза М-фенилацетильных производных аминокислот под действием пенициллинацилаз

2.2.11 Определение концентрации свободных аминогрупп

2.2.12 Изучение стабильности пенициллинацилазы

2.2.13 Хроматографический анализ реакционной смеси при синтезе антибиотиков

2.2.14 Ферментативный синтез ампициллина, катализируемый нативной и мутантными пенициллинацилазами в гомогенной водной системе

2.2.15 Ферментативный синтез цефалексина, катализируемый мутантной пенициллинацилазой аА^145Ьеи

2.2.16 Определение кинетических параметров реакции ферментативного синтеза ампициллина и цефалексина

2.2.17 Определение реакционной способности 6-АРА как нуклеофила в реакции синтеза ампициллина

2.2.18 Определение реакционной способности 7-АБСА как нуклеофила в реакции синтеза цефалексина

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Введение

3.1 Изучение пенициллинацилаз с точечной мутацией по остатку рРЪе

3.1.1 Профиль субстратной специфичности и каталитической эффективности действия мутантных ферментов

3.1.2 Изучение способности мутантных ферментов катализировать ацильный перенос на ядра р-лактамных антибиотиков в водной среде

3.1.3 Изучение стабильности мутантных ферментов в щелочной и кислой среде

3.1.4 Стереоселективность действия мутантных ферментов при гидролизе >1-фенилацетильных производных аминокислот

3.1.4.1 Новый реагент М-фенилацетил-(К)-фенилглицил-(5)-цистеин для предколоночной модификации с о-фталевым альдегидом при определении отдельных энантиомеров

3.1.4.2 Стереоселективность действия фермента

3.2 Изучение пенициллинацилаз с точечной мутацией по остатку рРЬе

3.3 Синтез Р-лактамных антибиотиков методом ацильного переноса в водной среде, катализируемого пенициллинацилазами

3.4 Исследование каталитических свойств ферментов с точечной мутацией по остаткам аРЬе 146 и аА

§

3.4.1 Изучение стабильности мутантных ферментов

3.4.2 Способность мутантных ферментов катализировать ацильный перенос

3.4.3 Характеристика мутантного фермента аА^145Ьеи как катализатора синтеза антибиотиков в водной среде

3.4.4 Изучение субстратной специфичности и каталитической активности мутантных ферментов

3.4.5 Изучение стереоселективности мутантного фермента аА^145Ьеи

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика новых мутантных форм пенициллинацилазы из Escherichia coli»

Актуальность проблемы фармацевтической Пенициллинацилаза из Е. соИ широко используется в Появление структурных данных, а также промышленности. разностороннее исследование каталитических свойств пенициллинацилаз из различных источников позволило задуматься о получении пенициллинацилаз с измененными свойствами. Совместный анализ ранее накопленных данных о взаимосвязи строения субстратов и эффективности их каталитического превращения, а также структуры пативной пенициллинацилазы, аналогов фермент-субстратного комплекса и комплексов с ингибиторами нозволяет очертить круг тех аминокислотных остатков, которые могут определять специфичность и хиральную дискриминацию субстратов в активном центре, а также участвовать предоставляет в механизме действия фермента. Сайт-направленный мутагенез действия и форм тонкой возможность выявления роли этих остатков в механизме понимания природы субстратной ненициллинацилазы, энантиоселективности ненициллинацилазы химической катализаторы, специфичности мутантных и ее действия. В то же время получение представляет большой поскольку нативный интерес таким фермент. для путем Таким медицинской могут быть промышленности, превосходяш;ие получены и образом, получение характеристика мутантных форм пенициллинацилазы имеет как фундаментальное, так и практическое значение. Целью настоящей работы Целью настоящего исследования явилось: сайтструктурных направленный мутагенез остатков, которые на основании имеющихся данных могут играть важную роль в механизме действия фермента и онределять его специфичность специфичности (pPhe71, pPhe57, aArgl45 и aPhel46); изучение субстратной полученных мутантных пенициллинацилаз, характеристика стереоселективности их действия в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производпых аминокислот, выявление методом быстрого скрининга перспективных мутантов для использования в синтезе антибиотиков, детальное кинетическое исследование реакций переноса ацилыюй группы на добавленный нуклеофил, катализируемых наиболее активными мутантами, их использование в препаративном синтезе ампициллина и цефалексина. Научная новизна и практическая значимость работы. В результате проведенных исследований мутантных субстратная были впервые охарактеризованы каталитические свойства более 30 форм пенициллинацилазы из Е. соИ: их специфичность и эпантиоселективность каталитическая действия, активность, способность катализировать ацильный перенос на ядра пенициллинов и цефалоспоринов. Показано, что ряд мутантных ферментов по остатку pPhe71 обладают измененным субстратным профилем и более высокой специфичностью по отпошению к остатку D-фенилглицина, причем каталитическую активность фермента к субстрату удается повысить более чем в 10 раз. Введением мутаций в положение pPhe71 (в зависимости от природы вводимого остатка) можно повысить или понизить стереоселективность гидролиза N-фенилацетильных производных фермента в реакциях Охарактеризована аминокислот. возможность иснользования мутантных ферментов в качестве катализаторов синтеза важных Р-лактамных антибиотиков ампициллина и цефалексина; показано, что замена остатка pPhe57, являющегося важным составным фрагментом узкого гидрофобного кармана для связывания ацильной части субстрата, приводит к снижению эффективности связывания субстрата на несколько порядков. В то же время замена остатков aArgl45 и aPhel46 может улучшить эффективность ацильного переноса на ядра ненициллииов и цефалоспоринов. Методом мутантные ферменты быстрого скрининга выбраны aArgl45 и aPhel46 наиболее и нерснективные детальное по остаткам проведено исследование их каталитических свойств с целью выявления оптимальпых условий синтеза антибиотиков. Определены количественные параметры, определяющие эффективность переноса ацильной группы на добавленый нуклеофил нри иснользовании данных мутантов ненициллинацилазы в качестве катализатора. Три мутантные формы фермента по остатку aArgl45, показавшие наиболее эффективные свойства при синтезе ампициллина и цефалексина по сравнению с нативной пенициллинацилазой, использованы в качестве катализаторов нренаративного процесса. Показано, что нри использовании этих мутантных форм можно нолучить более высокий выход целевого продукта с меньшими нецелевыми нотерями донора ацильной части при синтезе ампициллина. Детально охарактеризована также субстратная и стереоспецифичность действия одного из «улучшенных» мутантных ферментов этой грунпы aArgl45Leu в реакциях гидролиза. Предложен новый оптически активный тиоловый реагент Nфенилацетил-(Я)-фенилглицил-(8)-цистеин для хирального анализа аминокислот и определения энантиоселективности действия пенициллинацилазы и ее мутантов.

Заключение диссертации по теме «Катализ», Шаповалова, Ирина Владимировна

выводы

1) Введение мутаций в положения рРЬе57, рРЬе71, аАг§145 и аРЬе146 позволяет получить каталитически активные мутанты пенициллинацилазы, причем некоторые из них превосходят по своим свойствам нативный фермент.

2) Введением мутаций по остатку рРЬе71 можно изменить субстратную специфичность пецициллинацилазы и увеличить каталитическую активность: замены рРЬе71Ьеи и рРЬе71Ьуз приводят к увеличению каталитической эффективности действия мутантных ферментов более чем на два порядка, причем эффект улучшения каталитических свойств сильно зависит от структуры превращаемого субстрата.

3) Замена фенилаланина на другие аминокислотные остатки в положении рРЬе71 изменяет энантиоселективность фермента, причем в зависимости от природы вводимого остатка и структуры субстрата энантиоселективность может быть как увеличена, так и уменьшена.

4) Замена остатка рРЬе57 приводит к потере эффективности действия фермента; не обнаружено улучшения ни одного из исследованных свойств фермента при мутагенезе этого остатка.

5) При замене остатка аРЬе146 можно получить мутантные ферменты, способные более эффективно катализировать перенос ацильной группы на ядра Р-лактамных антибиотиков, однако практически все мутантные ферменты в этом ряду обладают низкой каталитической активностью.

6) Эффективным путем улучшения синтетических свойств фермента является замена остатка <хАг£145: наиболее эффективными мутантами являются аА^1458ег, аА^145Ьеи и аА^14501у, при их использовании в качестве катализаторов синтеза ампициллина удается получить более высокие выходы целевого антибиотика (увеличение выхода до 16 %) и снизить нецелевые потери донора ацильной части на 29-56%.

7) Предложен новый оптически активный тиоловый реагент Ы-фенилацетил-(К)-фенилглицил-(8)-цистеин, применение которого позволяет улучшить эффективность хирального анализа аминосоединений и изучать ряд ранее недоступных для количественного исследования реакций энантиоселективного превращения.

Выражаю благодарность: Проф. Д.Б. Янссену и его сотрудникам Э. де Врису, В.Б.Л. Алкеме и С.А.В. Джагеру за совместную работу по получению мутантных пенициллинацилаз (факультет биохимии Гронингенского Института биомолекулярных наук и биотехнологии, Гронингенский Университет, Нидерланды),

Д.Т. Гуранде за консультации при работе по разработке нового оптически активного тиолового реагента К-фенилацетил-(Я)-фенилглицил-(8)-цистеина,

М.И. Юшко за консультации по моделированию и оптимизации ферментативного синтеза ампициллина и цефалексина,

Своим подным и близким за моральную поддержку.

3.5 ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенной работы было исследовано влияние замены остатков, которые на основании имевшихся структурных данных могли играть важную роль в механизме действия фермента и определять его специфичность (pPhe71, pPhe57, aArgl45 и aPhel46). При исследовании субстратной специфичности мутантных ферментов по остаткам pPhe71 и pPhe57 было обнаружено, что замена pPhe71 на другие остатки, содержащие различные функциональные группы в своей боковой цепи, существенно меняет субстратный профиль фермента. Для мутантных ферментов pphe71Leu и pPhe71Lys наблюдали существенное (до 150 раз) улучшение субстратной специфичности к отдельным субстратам.

Установлено, что остаток pPhe57, находящийся на дне гидрофобного кармана, является оптимальным для фермента, и введение остатков, содержащих в своей боковой цепи как более объемные, так и небольшие гидрофобные радикалы, приводит к снижению каталитической активности и специфичности фермента.

При исследовании влияния замены остатка pPhe71 на стереоспецифичность действия фермента в реакциях гидролиза N-фенилацетильных производных аминокислот было установлено, что, в зависимости от природы аминокислотного остатка в этом положении, стереоселективность может как увеличиться, так и уменьшиться. Наиболее сильный эффект обнаружен в реакции гидролиза N-фенилацетильного производного фенилглицина, когда энантиоселективность в зависимости от введенной мутации менялась в диапазоне от 300 до 12000, в то время как нативная пенициллииацилаза по отношению к этому субстрату имела энантиоселективность равную 1960; для мутантных ферментов pPhe71Lys и pPhe71Glu стереоселективность увеличивалась в 6 и 3 раза, соответственно, по сравнению с нативным ферментом.

При исследовании синтетических свойств мутантных ферментов по остатку pPhe71 установили, что при замене этого остатка эффективность фермента катализировать ацильный перенос на внешние нуклеофилы снижается.

При изучении замены остатков aPhel46 и aArgl45 обнаружена возможность увеличения синтетического потенциала пенициллинацилазы. С помощью метода быстрого скрининга бьш определен ряд наиболее перспективных мутантов для последующего детального исследования. Установлено, что хотя в результате мутации остатка aPhel46 и удается увеличить эффективность переноса на внешний нуклеофил, однако такие мутанты представляют скорее только научный интерес, поскольку обладают значительно более низкой каталитической активностью, чем нативный фермент. В то же время замена остатка аАг§145 является значительно более перспективной для увеличения синтетического потенциала пенициллинацилазы. После первоначального скрининга мутантных ферментов по остатку аА^145 были отобраны 3 кандидата (аА^ 145 Бег, аА^145Ьеи и аАг§14501у) для детального исследования их эффективности в реакции синтеза ампициллина. Было показано, что при использовании всех трех мутантных ферментов удается получить более высокие выходы целевого антибиотика (увеличение выхода до 16 %), и можно снизить нецелевые потери донора ацильной части на 29-56%. Для мутантного фермента аА^145Ьеи определены значения ключевых кинетических параметров, с использованием которых проводено моделирование и оптимизация ферментативного синтеза ампициллина и цефалексина. Полученные при моделировании рекомендации подтверждены экспериментально и проведены, с более высокими, чем у нативного фермента, выходами, синтезы ампициллина и цефалексина. Таким образом показано, что с помощью сайт-направленного мутагенеза можно получить мутантные формы пенициллинацилазы, обладающие улучшенными каталитическими свойствами по сравнению с нативным ферментом и пригодные для решения конкретных практических задач. Более эффективные мутантные ферменты аАгд145Бег, аАг£145Ьеи и аА^145С1у, могут быть использованы в качестве катализаторов препаративного синтеза Р-лактамных антибиотиков.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Шаповалова, Ирина Владимировна, 2007 год

1. С.М.Навашин, И.П.Фомина, Полусинтетические пенициллины, М. Медицина, 1974 г., с.10.

2. Н.С.Егоров, Основы учения об антибиотиках, М. Высшая школа, 1969.

3. Betina V. The Chemistry and Biology of Antibiotics, Elsevier Scientific, Amsterdam, 1983.

4. Nicholas R.A., Hamilton H., Cohen M.S. in Principles of Pharmacology (Munton P.L. ed), Chapmann&Hall, New York, 1995, pp. 1351-1371.

5. Швядас B.K. Ферментативный синтез и модификация Р-лактамных антибиотиков и пептидов. Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология, ВИНИТИ, 1988,7,148с.6. веб-сайт Нобелевского комитета http://nobelprize.org/

6. Segel Н., Microbiologe, Canbride University Press, Cambridge, 1986.

7. Bruggink A., Synthesis of b-lactam antibiotics. Chemistry, Biocatalysis & Process Integration, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, 2001.

8. Bruggink A., Roos E.R., Vroom de E., Penicillin acylase in the industrial production of b-lactam antibiotics, Org.Proc.Res.&Develop., 1998,2,128-133.

9. Svedas V.K., Margolin A.L., Berezin I.V. Enzymatic modification of P-Iactam antibiotics: problems and perspectives. Enzyme Engineering. Future Directions, Plenum Press, 1980,257-293,5.

10. Svedas V.K., Margolin A.L., Berezin I.V. Enzymatic synthesis of P-lactam antibiotics: a thermodynamic background. Enzyme.Microb.Technol. 1980,2,138-144.

11. Svedas V.K., Margolin A.L., Borisov I.L., Berezin I.V. Kinetics of the enzymatic synthesis ofbenzylpenicillin. Enzyme.Microb.Technol. 1980,2,313-317.

12. Guranda D.T., Khimiuk A.I., Van Langen L.M., Van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas V.K. An "Easy-on, easy-off' protecting group for the enzymatic resolution of (±)-l-phenylethylamine in an aqueous medium. Tetrahedron: Asymmetry. 2004,15,2901-2906

13. Юшко М.И., Буханов A.JI., Швядас B.K. "Изучение связывания нуклеофила в активном центре пенициллинацилазы. Кинетический анализ", Биохимия, 2003,68 №3.403-408.

14. Youshko M.I., Chilov G.G., Shcherbakova T.A., Svedas V.K. "Quantitative characterization of the nucleophile reactivity in penicillin acylase-catalyzed acyl transfer reactions" Biochim. Biophys. Acta: Proteins & Proteomics, 2002, 1599 (1-2), 134-140.

15. Youshko M.I., Van Langen L.M., De Vroom E., Van Rantwijk F., Sheldon R.A., Svedas V.K. "Penicillin Acylase-Catalyzed Ampicillin Synthesis Employing a pH Gradient: a New Approach to Optimization", Biotechnol. Bioeng., 2002, 78(5), 589-593.

16. Huber F.M., Chauvette R.R., Jackobson B.G., In Chemistry and Biology of b-lactam Antibiotics (Flynn E.H. ed.), Academic Press, New York, 1972.

17. Barbero J.I., Buesa J.M., Gonzalez de Buitrago G., Mendez E., Pez-Aranda A., Garcia J.L., Complete nucleotide sequence of the penicillin acylase gene from Kluyvera citrophila. 1986, Gene, 49,69-80.

18. Ohashi H., Katsuta Y., Hashizume T., Abe S.N., Kajiura H., Hattori H., Kamei T., Yano M., Molecular cloning of penicillin G acylase gene from Arthrobacter viscosus. Appl.Environ. Microbiol., 1988,54,2603-2607.

19. Gang D.M., Shaikh K., Regulation of penicillin acylase in Esherichia coli by cyclic AMP. Biochim.Biophys.Acta, 1976,425,110-114.

20. Valle F., Gosset G., Tenorio B., Oliver G., Bolivar F., Characterization of the regulatory region of the Esherichia coli penicillin acylase structural gene. Gene, 1986,50,119-122.

21. Merino E., Balbas P., Recillas F., Becerril B., Valle F., Bolivar F., Carbon regulation and the role in nature of the Esherichia coli penicillin acylase (pac) gene. Mol. Microbiol., 1992,6,2175-2182.

22. Roa A., Garcia J.L., New insights into the regulation of the pac gene from Esherichia coli W ATCC 11105, FEMS Microbiol. Lett., 1999,177,7-14.

23. Prieto M.A., Perez-Aranda A., Garcia J.L., Characterization of an Esherichia coli aromatic hydrolase with a broad substrate range, J. Bacterid., 1993,175,2162-2167.

24. Prieto M.A., Diaz E., Garcia J.L., Molecular characterization of 4-hydroxyphenylacetate catabolic path-way of Esherichia coli W: engineering a mobile aromatic degradative cluster. J. Bacterid., 1996, 178,111-120.

25. Cole M, Deacylation of acylamino compounds other than penicillins by the cell- bound penicillin acylase of Esherichia coli, Biochem. J., 1969,115,741-745.

26. Cole M, Hydrolysis of penicillins and related compounds by the cell-bound penicillin acylase of Esherichia coli, Biochem. J., 1969,115,733-739.

27. Schumacher G., Sizmann D., Haug H., Buckel P., Bock A., Penicillin acylase from Esherichia coli: unique gene-protein relation. Nucleic Acids Res., 1986,14,5713-5727.

28. Duggleby H.J., Tolley S.P., Hill C.P., Dobson E.J., Dobson G., Moody P.C., Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic center. Nature, 1995,373,262-268.

29. Sizmann D., Keilmann C., Bock A., Primary structure requirements for the maturation in vivo of penicillin acylase from Esherichia coli ATCC 11105. Eur. J. Biochem, 1990,192, 143-151.

30. Choi K.S., Kim J.A., Kang H.S., Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Esherichia coli ATCC 11105. J. Bacterid., 1992, 174,6270-6276.

31. Kasche V., Lummer K., Nurk A., Piotraschke E., Rieks A., Stoeva S., Voelter W., Intramolecular auto-proteolysis initiates the maturation of penicillin amidase from Esherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1999,1433,76-86.

32. Zoya Ignatova, Frank Wischnewski, Holger Notbohm, Volker Kasche, Pro-sequence and Ca2+-binding: Implications for Folding and Maturation of Ntn-hydrolase Penicillin Amidase from E. coli, Mol Biol., 2005,348(4), 999-1014.

33. Duggleby H.J., Tolley S.P., Hill C.P., Dodson, E.J., Dodson, G., and Moody, P.C.E., Penicillin acylase has a single-amino-acid catalytic centre, Nature, 1995,373,264-268.

34. McVey, C.E., Walsh, M.A., Dodson, G.G., Wilson, K.S., Brannigan J.A., Crystal structures of penicillin acylase enzyme-substrate complexes: structural insights into the catalytic mechanism, J. Mol. Biol., 2001,313,139-150.

35. Shamolina, Т., Svedas, V.K., Reactivation of heterodimer and individual subunits of penicillin acylase from E. coli after inactivation in urea, Biochemistry (Mosc), 2000, 65, 672-676.

36. Brannigan J.A., Dobson G., Duggleby H.J., Moody P.C., Smith J.L., Tomchick D.R., Murzin A.G., A protein catalytic framework with an N-terminal nucleophile is capable of self-activation. Nature, 1995,378,416-419.

37. Oininen C., Rouvinen J., Structural comparison of Ntn-hydrolases. Protein Sci., 2000, 9, 2329-2337.

38. Done S.H., Brannigan J.A., Moody P.C.E., Hubbard R.E., Ligand-induced conformational change in penicillin acylase, J. Mol. Biol., 1998,284,463-475.

39. Morillas, M., Goble, M. L., Virden, R., The kinetics of acylation and deacylation of penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105: evidence for lowered pKa values of groups near the catalytic centre, Biochem. J., 1999,338,235-239.

40. Чилов Г.Г., Сидорова A.B., Швядас B.K. Исследование механизма каталитического действия N-концевых гидролаз методами квантово-химического моделирования. Биохимия, 2007, т. 72 (5), с. 615-321.

41. Polgar L. Mechanism of Protease Action, CRC, Cambridge, 1989.

42. Dobson G., Wlodawer A., Catalytic triads and their relatives. Trends Biochem. Sci., 1998,23,347-352.

43. Kim M.G., Lee S.B., Penicillin acylase-catalysed synthesis of b-lactam antibiotics in water-methanol mixtures: effect of cosolvent content and chemical nature of the substrate on reaction rates and yields. J. Mol. Cat. B: Enzymatic, 1996,1,201-211.

44. McDonough M.A., Klei H.E., Kelly J.A. Crystal structure of penicillin G acylase from the Brol mutant strain of Providencia rettgeri. Protein Sci., 1999, 8,1971-1981.

45. McVey C.E., Walsh M.A., Dobson G.G.,K.,S.W., Brannigan J.A. Crystal structures of penicillin acylase enzyme-substrate complexes: Structural insights into the catalytic mechanism. J. Mol. Biol., 2001,313,139-150.

46. M. Cole Properties of the penicillin deacylase enzyme of Escherichia coli, Nature., 1964. 203,519-520.

47. M. Cole Deacylation of acylamino compounds other than penicillins by the cell-bound penicillin acylase of Escherichia coli, Biochem. J., 1969,115,741-745.

48. Н.С. Бондарева, М.М. Левитов, М.С. Рабинович Изучение субстратной специфичности пенициллинацилазы из E.coli, Биохимия, 1969, 34,478-783.

49. М. Van der Mey. Е. De Vroom Substrate specificity of immobilized penicillin-G acylase, Bioorg. Med. Chem. Lett. 1994,4, 345-348.

50. M. Robak, A. Szewczuk Penicillin amidase from Proteus rettgeri, Acta Biochimica. Polonica. 1981,28 275-284.

51. D. Chiang, R.E. Bennet Purification and properties of penicillin amidase from Bacillus megaterium. J. Bacteriol. 1967,93,302-308.

52. Svedas V.K., Savchenko M.V., Beltser A.I., Guranda D.F. Enantio-selective penicillin acylase-catalyzed reactions. Factors governing substrate and stereospecificity of the enzyme. Ann. N. Y. Acad. Sei., 1996,799,659-669.

53. Alkema W.B.L., Floris R., Janssen D.B. The use of chromogenic reference substrates for the kinetic analysis of penicillin acylases. Anal. Biochem., 1999,275,47-53.

54. Margolin A.L., Svedas V.K., Berezin I.V. Substrate specificity of penicillin amidase from Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta, 1980,616,283-289.

55. Д. Т. Гуранда Субстратная специфичность и стереоспецифичность пенициллинацилаз из Escherichia coli и Alcaligenes faecalis, диссертация на соискание кандидата хим. наук, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2000.

56. A.S. Soloshonok, A.G. Kirilenko, N.A. Fokina, I.P. Shishkina, S.V. Galushko, V.P. Kukhar, V.K. Svedas, E.V. Kozlova Biokatalytic resolution of ß-fluoroalkyl-ß-amino acids, Tetrahedron: Asymmetry, 1994,5,1119-1126

57. A. Plaskie, E. Roets, H. Vanderhaeghe Substrate specificity of penicillin acylase of E.coli. J. Antibiotics. 1978,31,783-788.

58. И.А. Ямсков, M.B. Буданов, B.A. Даванков, П.С. Ныс, Е.М. Савицкая Энантиоселективный гидролиз №фенилацетил-0,Ь-С-фенилглицина пенициллинамидогидролазой из E.coli и ее иммобилизированными препаратами. Биоорг. химия. 1979,5,604-610.

59. W.B. Alkema, A.K. Prins, Е. de Vries, D.B. Janssen Role of alphaArgl45 and betaArg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli, Biochem J. 2002, 365,303.

60. Svedas V., Guranda D., Van Langen L., Van Rantwijk F. and Sheldon R. Kinetic study of penicillin acylase from Alcaligenes faecalis. FEBS Lett., 1997,417,414-418.

61. D.T. Guranda, L. M. van Langen, F. van Rantwijk, R. A. Sheldon, V. K. Svedas Highly efficient and enantioselective enzymatic acylation of amines in aqueous medium, Tetrahedron: Asymmetry, 2001,12,1645-1650.

62. Чилов Г.Г., Нетрадиционные пути получения ядер р -лактамных антибиотиков ферментативной трансформацией пенициллинов и цефалоспоринов, Диссертация на соискание звания кандидата химических наук, Москва, 2003.

63. Юшко М.И. Кинетические закономерности ферментативного синтеза ампициллина, катализируемого пенициллинацилазой, в комогенных, гетерогенных и твердофазных системах, диссертация на соискание кандидата хим. наук, Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2000.

64. Fernandez-Lafuente R., Rosell C.M., Guisan J.M. Dynamic reaction design of enzymic biotransformations in organic media: equilibrium-controlled synthesis of antibiotics by penicillin G acylase. Biotechnol. Appl. Biochem., 1996,24,139-143.

65. Lummer K., Rieks A., Galunsky В., Kasche V. pH dependence of penicillin amidase enentioselectivity for charged substrates. Biochim Biophys. Acta, 1999, 1433, 327-334.

66. Boccu E., Carenza M., Lora S., Palma G., Veronese F.M. Radiation-induced polymerization for the immobilization of penicillin acylase. Appl. Biochem. Biotechnol., 1987,15,1-10.

67. Alvaro G., Fernandez-Lafuente R., Blanco R.M., Guisan J.M. Immobilization-stabilization of penicillin G acylase from Escherichia coli. Appl. Biochem. Biotechnol., 1990,26,181-195.

68. Prabhune A., SivaRaman H. Immobilization of penicillin acylase in porous beads of polyacrylamide gel. Appl. Biochem. Biotechnol., 1991,30,265-272.

69. Bryjak J., Noworyta A. Immobilization of penicillin acylase on copolymer of butyl acrylate and ethylene glycol dimethacrylate. J. Chem. Technol. Biotechnol., 1993, 57, 7985.

70. Fonseca L.P., Cardoso J.P., Cabral. J.M. Immobilization studies of an industrial penicillin acylase preparation on a silica carrier. J. Chem. Technol. Biotechnol., 1993,58,27-37.

71. Kasche V. Mechanism and yields in enzyme catalysed equlibrium and kinetically controlled synthesis of b-lactam antibiotics, peptides and other condensation products. Enzyme Microb. Technol., 1986, 8,4-16.

72. Forney L.J., Wong D.C. Alteration of the catalytic efficiency of penicillin amidase from Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 1989, 55,2556-2560.

73. Forney L.J., Wong D.C., Ferber D.M. Selection of amidases with novel substrate specificities from penicillin amidase of Escherichia coli. Appl. Environ. Microbiol., 1989, 55,2550-2555.

74. Choi K.S., Kuo B.Y., Kang H.S. Effects of site-directed mutations on processing and activities of penicillin G acylase from Escherichia coli ATCC 11105. J. Bacterid., 1992, 174,6270-6276.

75. Alkema, W.B.L., Prins, A.K., Vries, E. Janssen, D.B. Role of alphaArgl45 and betaArg263 in the active site of penicillin acylase of Escherichia coli, Biochem. J., 2002, 365,303-309.

76. W.B.L. Alkema Kinetic and strucrural studies of penicillin acylase from Escherichia coli. Rijksuniniversiteit Groningen, 2002,142 p.

77. Alkema W. B. L., Dijkhuis A.-J., Vries E., Janssen D.B. The role of hydrophobic active-site residues in substrate specificity and acyl transfer activity of penicillin acylase. Eur J Biochem. 2002,269(8), 2093-100.

78. Gabor E.M., Janssen D.B., Increasing the synthetic performance of penicillin acylase PAS2 by structure-inspired semi-random mutagenesis, Protein Eng Des Sei., 2004,17 (7), 571-579.

79. Menard R., Plouffe C., Laflamme P., Vernet T., Tessier D.C., Thomas D.Y., Storer A.C. Modification of the electrostatic enviroment is tolerated in the oxyanion hole of the cysteine protease papain. Biochemistry, 1995,34,464-471.

80. Warshel A. Electrostatic origin of the catalytic power of the enzymes and the role of preorganized active sites. J. Biol. Chem., 1998,273, 27035-27038.

81. Jackson S.E., Fersht A.R. Contribution of long-renge electrostatic interactions of the stabilization of the catalyric transition state of the serine protease subtilisin BPN\ Biochemistry, 1993,32,13909-13916.

82. Morillas M., Goble M.L., Virden R. The kinetics of acylation and dezcylation of penicillin acylase from Escherichia coli ATCC 11105: evidence for lowered pKa values of groups near the catalytic centre. Biochem. J., 1999,338,235-239.

83. Roa A., Garcia J.L., Salto F., Cortes E. Changing the substrate specificity of penicillin G acylase from Kluyvera citrophila through selective pressure. Biochem. J., 1994,303, 869-875.

84. Martin J., Prieto I., Barbero J.L., Perez-Gil J., Mancheno J.M., Arche R. Thermodynamic profiles of penicillin G hydrolysis catalysed by wild-type and Metl68Ala mutant penicillin acylases from Kluyvera citrophila, Biochem. J., 1990,280,659-662.

85. Prieto I., Rodrigues M.C., Marguez G.„ Perez-Aranda A., Barbero J.L. Changing glicine 21 for glutamic acid in the b-subunit of penicillin G acylase from Kluyvera citrophila prevents protein maturation. Appl. Microbiol. Biotechnol., 1992,36,659-662.

86. Morillas, M., McVey, C.E., Brannigan, J.A., Launder A.G., Forney L.J., Virden, R. Mutations of penicillin acylase residue B71 extend substrate specificity by decreasing steric constraints for substrate binding, Biochem. J., 2003,371,143-150.

87. Brannigan, J. A., Dodson, G. G., Done, S. H., Hewitt, L., McVey, C. E., Wilson, K. S. Strucrural Studies of Penicillin Acylase, Appl. Biochem.Biotechnol., 2000, 88,313-319.

88. Abrahmsen L., Tom J., Burnier J., Butcher K.A., Kossakoff A., Wells J.A. Engineering subtilisin and its substrates for efficient ligation of peptide bonds in aqueous solution. Biochemistry, 1991,30,4151-4159

89. Elliott R.J., Bennet A.J., Braun C.A., MacLeod A.M., Borgford T.J. Active-site variants of Streptomyces griseus protease B with peptide-ligation activity. Chem. Biol., 2000,7,163-171.

90. You L., Usher J.J., White B.J., Novotny J. Internetional patent WO/98/20120,1998.

91. Hedstrom L., Szilagyi L., Rutter W.J. Converting trypsin to chymotrypsin: the role of surface loops, Science, 1992,255,1249-1253.

92. Bender M.L. The mechanism of a-chymotrypsin catalyzed hydrolysis. J. Am. Chem. Soc., 1962,84,3682-3690.

93. Gololobov M.Y., Borisov I.L., Svedas V.K. Acyl group transfer by proteases froming an acylenzyme intermediate: kinetic model analysis (including hydrolysis of acylenzyme nucleophile complex). J. Theor. Biol., 1989,140,193-204.

94. Malthouse J.P., Primrose W.U., Mackenzie N.E., Scott A.I. 13C-NMR study of the ionizations within a trypsin-chloromethyl ketone inhibitor complex. Biochemistry, 1985, 24,3478-3487.

95. O'Connell T.P., Day R.M., Torchilin E.V., Bachovchin W.W., Malthouse J.G. A 13C-NMR study of the role of Asn-155 in stabilizing the oxyanion of a subtilisin tetrahedral adduct. Biochem. J., 1997,326,861-866.

96. O'Connell T.P., Malthouse J.G. Determination of the iionization state of the active-site histidine in a subtilisin-(chloromethane inhibitor) derivative by 13C-NMR. Biochem. J., 1996,317,35-40.

97. Robillard G., Shulman R.G. High resolution nuclear magnetic resonance studies of the active site of chymotrypsin. I. The hydrogen bonded protons of the "charge relay" system. J. Mol. Biol., 1974,86,519-540.

98. Bachovchin W.W. Confirmation of the assignment of the low-field proton resonance of serine proteases by using specifically nitrogen-15 labeled enzyme. Proc. Nat. Acad. Sci., 1985, 82,7948-7951.

99. Halkides C.J., Wu Y.Q., Murray C.J. A low-barrier hydrogen bond in subtilisin: 1H-and 15N-NMR studies with peptidyl trifluoromethyl ketones. Biochemistry, 1996,35, 15941-15948.

100. Cassidy C.S., Lin J., Frey P.A. A new concept for the mechanism of action of chymotrypsin: the role of the low-barrier hydrogen bond. Biochemistry, 1997,36,45764584.

101. Cassidy C.S., Lin J., Frey P.A. The deuterium isotope effect on the NMR signal of the low-barrier hydrogen bond in a transition-state analog complex of chymotrypsin. Biochem. Biophys. Res. Commun., 2000,273, 789-792.

102. Stein R.L., Elrod J.P., Schowen R.L. Correlative variations in enzyme-derived and substrate-derived structures of catalytic transition states. Implications for the catalytic strategy of acyl transfer enzymes. J. Am. Chem. Soc., 1983,105,2446-2452.

103. Stein R.L., Strimpler A.M., Hori H., Powers J.C. Catalysis by human leukocyte elastase: proton inventory as a mechanistic probe. Biochemistry, 1987,26,1305-1314.

104. Polgar L., Szeltner Z., Boros I. Substrate-dependent mechanisms in the catalysis of human immunodeficiency virus protease. Biochemistry, 1994, 33,9351-9357.

105. Никитин В.А. «Катализ пенициллинацилазой в кислой и щелочной средах», дипломная работа, кафедра химической энзимологии,химический факультет, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2003.

106. Ayala Y.M., Di Cera Е. A simple method for determinatio of individual rate constants for substrate hydrolysis by serine proteases. Protein Sci, 2000,9,1589-1593.

107. Ninkovic M., Riester D., Wirsching F., Dietrich R., Schwienhorst A. Fluorogenic assay for penicillin G acylase activity. Anal. Biochem., 2001,292,228-233.

108. Knuttel Т., Hartmann Т., Meyer H., Scheper T. On-line monitoring of a quasi-enentiomeric reaction with two coumarin substrates via 2D-fluorescence spectroscopy. Enzyme and Microb. Technol., 2001,29,150-159.

109. Sakamoto H., Ichikawa Y., Yamano Т., Takagi T. Circular dichroic studies on the interaction between reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-adrenodoxin reductase and adrenodoxin. J. Biochem. (Tokyo), 1981,90,1445-1452.

110. Arvidson D.N., Bruce C., Gunsalus R.P. Interaction of the Escherichia coli trp aporeperssor with its ligandd, L-tryptophan. J. Biol. Chem., 1986,261,2238-243.

111. Kim Y., Yoon K., Knang Y., Turley S., Hoi W.G. The 2.0 A crystal structure of cephalosporin acyalse. Structure Fold. Des., 2000, 8,1059-1069.

112. Martin J., Slade A., Aitken A., Arche R., Virden R. Chemical modification of serine at the active site of penicillin acylase from Kluyvera citrophila. Biochem. J., 1991,280, 659-662.

113. Yan B.X., Sun Y.Q. Glycine residues provide flexibility for enzyme active sites. J. Biol. Chem., 1997,272,3190-3194

114. MacArthur M.W., Thornton J.M. Influence of proline residues on protein conformation. J. Mol. Biol., 1991,218,397-412.

115. Kim Y., Yoon K., Khang Y., Turley S., Hoi W.G. The 2.0 A crystal structure of cephalosporin acylase. Structure Fold. Des., 2000, 8,1059-1068.

116. Suresh C.G., Pundle A.V., SivaRaman H., Rao K.N., Brannigan J.A., McVey C.E., Verma C.S., Dauter Z., Dobson E.J., Dobson G.G. Penicillin V acylase crystal structure reveals new Nth-hydrolase family members. Nat. Struc. Biol., 1999,6,414-416.

117. Carter P., Wells J. A. Dissecting the catalytic triad of a serine protease. Nature, 1988, 332,564-568.

118. Corey D.R., Craik C.H. An anvestigation into the minimum requirements for peptide hydrolysis by mutation of the catalytic triad of trypsin. J. Am. Chem. Soc., 1992,114, 1784-1790.

119. Oinonen C., Rouvinen J. Structural comprasin of Ntn-hydrolases. Protein Sci., 2000,9, 2329-2337.

120. Chanouni P., Steenhuis J.J., Fan-ens D.L., Kobilka B.K Agonist-induced conformational changes in the G-protein-coupling domain of the b-2 adrenergic receptor. Proc. Nat. Acad. Sci., 2001,98,5997-6002.

121. Boyd A.E., Marnett A.B., Wong L., Taylor P. Probing the active center gorge of acetylcholinesterase by fluorophores linked to substituted cysteines. J. Biol. Chem., 2000, 275,22401-22408.

122. Davis B.G., Shang X., DeSantis G., Bott R.R., Jones J.B. The controlled introduction of multiple negative charge at single amino acids sites in subtilisin Bacillus lentus. Bioorg. Med. Chem., 1999,7,2293-2301.

123. Stemmer W.P. Rapid evolution of a protein in vitro by DNA shuffling. Nature, 1994, 370,389-391.

124. Crameri A., Raillard S.A., Bermudes E., Stemmer W.P. DNA shuffling of a family of genes from diverse species accelerates directed evolution. Nature, 1998,391,288-291.

125. М.И. Юшко, Т.А. Шамолина, Д.Ф. Гуранда, А.В. Синев, В.К. Швядас «Высокоспецифичные субстраты для спектрофотометрического определения активности пенициллинацилазы», Биохимия, 1998, 63 (9), с. 1295-1300.

126. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение. М.: Мир, 2002,589 с.

127. Sambrook, J., Fritsch, E.F. and Maniatis, T. Molecular cloning, a laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989.

128. Aswad D.W., Determination of D- and L-aspartate in amino acid mixtures by highperformance liquid chromatography after derivatization with a chiral adduct of o-phthaldialdehyde, Anal. Biochem. 1984. V. 137 P. 405-409

129. Buck R.H., Krummen K., Resolution of amino acid enantiomers by high-performance liquid chromatography using automated pre-column derivatisation with a chiral reagent, J. Chromatogr. 1984. V. 315. P. 279-285.

130. Svedas V.K., Galaev I.J., Borisov I.L., Berezin I.V. The interaction of amino acids with o-phthaldialdehyde: A kinetic study and spectrophotometric assay of the reaction product, Anal. Biochem. 1980. V. 101. P. 188-195.

131. Florance J., Galdes A., Konteatis Z., Kosarych Z., Langer K., High-performance liquid chromatographic separation of peptide and amino acid stereoisomers, J. Chromatogr. 1987. V. 414. P. 313-322.

132. Duchateau A.L.L., Knuts H., Boesten J.M.M., Guns J. J., Enantioseparation of amino compounds by derivatization with o-phthalaldehyde and D-3-mercapto-2-methylpropionic acid, J. Chromatogr. 1992. V. 623. P. 237-245.

133. Jegorov A., Trnka Т., Stuchlik J., High-performance liquid chromatographic detection of enantiomeric amino alcohols after derivatization with o-phthaldialdehyde and various thiosugars, J. Chromatogr. 1991. V. 558. P. 311-317.

134. Desai D.M., Gal J., Enantiospecific drug analysis via the ortho-phthalaldehyde/homochiral thiol derivatization method, J. Chromatogr. 1993. V. 629. P. 215-228.

135. Bruckner Н., Wuttner R., Godel Н., Automated enantioseparation of amino acids by derivatization with o-phthaldialdehyde and N-acylated cysteines, J. Chromatogr. 1989. V. 476. P. 73-82.

136. Duchateau A.L.L., Boesten J.M.M., Coussens B.B. High-Performance liquid chromatographic separation and molecular modelling of diastereomeric isoindole derivatives of amino compounds, Chirality, 1995, V.7, P. 547-555.

137. Jacobs W.A., Leburg M.W., Madaj E.J. Stability of o-phthalaldehyde-derived isoindoles, Anal. Biochem. 1986. V. 156. P. 334-340.

138. Lindner W., Indirect Separation of Enantiomers by Liquid Chromatography, Eds. M. Zief, L.J. Crane. Chromatographic Chiral Separations. Chromatographic Science Series. V. 40, New York: Marcel Dekker. 1988. P. 116.