Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Головина, Галина Игоревна

• Головина, Галина Игоревна
• кандидат биологических наук
• 1991

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Головина, Галина Игоревна

Список сокращений, .принятых в диссертации.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Биология аденовирусов.

1.1. Физико-химические свойства вирионов.

1.2. Классификация аденовирусов человека.

1.3. Особенности репликации и сборки.аденовирусов . . 18 . 1.4. Рекомбинации аденовирусов.

2. Молекулярная эпидемиология аденовирусных инфекций,.

2.1. Методы молекулярной эпидемиологии.

2.2. Рестрикционный анализ в плане изучения геном-. . ной гетерогенности аденовирусов

2.3. Молекулярная эпидемиология аденовирусных инфекции,.обусловленных.аденовирусами.серо-. . типа 3.

2.4. Молекулярная эпидемиология аденовирусных инфекций, обусловленных.аденовирусами. с еро типа 7.

3. Эволюция геномов аденовирусов

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Геномный полиморфизм и эволюционная изменчивость природных популяций аденовирусов серотипов 3 и 7 в процессе их эпидемической циркуляции в СССР»

Актуальность проблемы. Аденовирусы се-ротипов 3 и 7 относятся к группе эпидемически актуальных вирусов. По данным Всесоюзного Центра по гриппу и ОРЗ, в период с 1976 по 1988 гг. они составляли соответственно 25$ и 11% от 2005 аденовирусных изолятов, выделенных на территории Советского Союза. Аденовирусы серотипов 3 и 7 часто этиологически связаны с развитием эпидемических вспышек ОРЗ, особенно среди детей младшего возраста. Они играют ведущую роль в генезе ОРЗ, пневмонии, конъюнктивитов, энтеритов, фарингоконъюнкти-вальной лихорадки и нередко в генезе осложнении - менингитов и энцефалитов.

Вместе с тем до настоящего времени основным методом идентификации и сравнительного изучения аденовирусных изолятов являлся вирусологический анализ, включающий в себя нейтрализующие тесты и реакции торможения ге«агглютинации. В последние годы стало быстро развиваться новое направление исследований, основанное на принципах молекулярной эпидемиологии, внедрение которого в практику этиологического надзора за острыми респираторными вирусными инфекциями в ряде стран мира дало возможность существенно унифицировать и повысить качество идентификации вирусных антигенов и нуклеиновых кислот. В частности, применение методов молекулярной гибридизации ДНК, рестрикци-онного анализа ДНК и моноклональных антител в сочетании с высокочувствительными иммунохимическими методами позволяет выявлять и изучать уровни природной изменчивости аденовирусов (генетический дрейф). Однако наиболее доступным, чувствительным и высокоинформативным является метод рестрикционного анализа ДНК с помощью крупнощепящих ферментов рестрикции, используемый для определения вариабельности геномоЕ аденовирусов /164/.

Актуальность генетического типирования вирусов с помощью рестрикционного анализа определяется возможностью выявления . ряда закономерностей циркуляции аденовирусов одного серотипа, но с разными генотипическими характеристиками, а также возможностью выяснения характера эволюции геномов аденовирусов и, наконец, установлением коррелятивной связи между генотипами штаммов и уровнями.их вирулентности, другими биологическими свойствами вирусов.

Вопросы, касающиеся изучения основных направлений молекулярной эпидемиологии аденовирусных инфекций, обусловленных АдЗ и Ад7, и глобальное распространение генотипов указанных, вирусов достаточно подробно освещены в литературе /10,14,95, 97/. Тем не менее, до сих пор остаются нерешенными проблемы, связанные с причинами и характером эволюции геномов аденовирусов в плане изменения их вирулентности и эпидемической активности. В связи с этим продолжают оставаться актуальными исследования, посвященные изучению характера циркуляции генотипов в течение продолжительного периода Бремени в сравнительно ограниченном регионе земного шара, как, например, исследования эволюции геномов Ад7 в странах Западной Европы /169/ и в Китае /95/. Следует отметить, что в Советском Союзе подобного рода исследования ранее не проводились, и.нет сведений об эпидемически актуальных генотипах аденовирусов серотипов 3 и 7, циркулировавших на территории СССР.

С другой стороны, в настоящее время в процессе рестрикци-онного анализа ДНК аденовирусных изолятов общепринятым является использование крупнощепящих рестриктаз, узнающих 6 пар оснований. Уровни гомологии мезду сравниваемыми генотипами в данном случае определяются с высокой точностью по проценту эмигрирующих рестрикционных фрагментов. Однако при этом сравнительному анализу подвергается относительно небольшая часть генома, и определяющим условием является выбор подходящего набора ферментов рестрикции,, дающих наибольший спектр геномных вариантов. В случае исследования эволюции геномов бо-. лее адекватными будут выеоды, основанные на сравнении нуклео-тидных последовательностей геномных вариантов. Но метод сек-венирования ДНК остается очень трудоемким для анализа большого числа аденовирусных изолятов. Поэтому-актуальной является разработка более дешевого, быстрого и доступного метода, позволяющего проанализировать незначительные геномные изменения у большого числа штаммов и практически независящего от выбора ферментов.рестрикции. Таким методом может быть анализ ДНК аденовирусных изолятов с помощью мелкощепящих эндонуклеаз рестрикции, узнающих 4 пары оснований. К достоинствам разрабатываемого метода следует отнести: во-первых, использование очень небольшого числа ферментов рестрикции (вплоть до одного) вместо 10-12 ферментов при применении.метода с крупнощепящими рестршстазами; во-вторых, .исследованию подвергается большая часть генома в.результате.сравнения наборов мелких фрагментов рестрикции.ДНК; в-третьих, существенно повышается точность анализа эволюционных взаимосвязей, геномных вариантов.

В рамках данной проблемы наряду с интенсивными исследованиями геномной гетерогенности аденовирусов на молекулярном уровне малоизученными являются вопросы, касающиеся установления корреляций между генотипическими и фенотипическими характе-риогикаш штаммов. Б основном уделяется внимание лишь определению взаимосвязи между генотипом вирусов и клинической картиной заболевания, индуцированного ими, а также взаимосвязи между генотипами вирусов и их антигенными характеристиками /10,14,82,172/. Однако в том и другом случаях не было выявлено четко выраженного соответствия.

Вместе с тем актуальными являются исследования репродукционных свойств штаммов аденовирусов с разными генотипами, поскольку указанные свойства должны играть.значительную роль в процессе циркуляции вирусов. К.сожалению, в доступной нам литературе не были обнаружены исследования в этой области.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение геномной гетерогенности популяции аденовирусов серотипов 3 и 7, циркулировавших на территории Советского Союза, при использовании как стандартного метода ресгрикционного анализа с помощью крупнощепящих рестрик-таз, так и нестандартного метода рестрикционного анализа с помощью мелкощепящих рестриктаз; а также изучение эволюционных, взаимосвязей.геномных вариантов АдЗ и Дд7 разных лет выделения.

В соответствии с поставленной целью.были определены.следующие задачи.

I. Разработать наиболее результативные способы очистки аденовирусных вирионов от конгаминирующих ДНК-содержащих вирусов (аденоассоциированных вирусов) и неполных частиц, накапливающихся в процессе репродукции вирусов в клетках тканевых культур

Нер-2 и Hela, а также разработать оптимизированные методы.выделения ДДК аденовирусов.

2. Разработать метод анализа ДНК аденовирусов с помощью мелкощепящих рестриктаз.

3. Изучить геномную гетерогенность популяции аденовирусов, серотипа 3, циркулировавших на территории СССР в период с 1976 по 1988 гг., при использовании крупнощепящих и мелкощепящих рестриктаз.

4. Изучить, геномную гетерогенность популяции аденовирусов серотипа 7, циркулировавших в Советском Союзе в период 19761988 гг., при использовании крупнощеиящих и мелкощепящих рестриктаз.

5. Провести анализ эволюции генотипов аденовирусов серо-, типов 3 и 7, циркулировавших на территории Советского Союза.

6. Исследовать ряд биологических свойств штаммов аденовирусов серотипов 3 и 7 с разными генотипами.

7. Оценить биологическую совместимость аденовирусов серотипов 3 и 7 с разными генотипами при их сокультивировании в клетках тканевых культур.

H.а учная новизна работы.

I. Разработан новый методический прием для изучения геномной, изменчивости аденовирусов с помощью мелкощепящих рестриктаз, позволяющий более адекватно устанавливать эволюционные связи геномных вариантов циркулирующих вирусов.

2. Впервые генотипированы штаммы аденовирусов серотипов 3 и 7, циркулировавшие на территории Советского Союза. Установлены эпидемически актуальные генотипы аденовирусов серотипов 3 и 7 для территории страны в целом.

3. Впервые проанализирована эволюционная взаимосвязь геномных вариантов циркулировавших штаммов аденовирусов серотипов 3 и 7, выявленных с помощью мелкощепящей рестриктазы Cfr 131. Установлено, что для эволюции геномов АдЗ региональная локализация, свойственна в большей степени, чем для эволюции геномов Ад7.

4. Впервые показана возможность существования определенной взаимосвязи ряда биологических свойств штаммов, аденовирусов таких, как температурная зависимость репродукционной активности и интерферирующие свойства в отношении вируса везикулярного стоматита, - и генотипов тестированных штаммов.

5. Впервые проведено исследование внутритиповой и межтиповой интерференции на тканевых культурах штаммов аденовирусов серотипов 3 и 7 с разными генотипами.

Практическое значение работы.

Внедрение в систему этиологического мониторинга за аденовирусной инфекцией е. масштабах страны методов генетического типирования аденовирусов.

В совместных исследованиях с д.б.н. проф.Н.С.Дяченко (институт микробиологии и вирусологии им.Д.К.Заболотного АН УССР) показана возможность использования штаммов АдЗ и Ад7 с новыми генотипами в качестве модельных вирусов для поиска ингибиторов вирусной репродукции.

Депонирование в Государственную коллекцию.вирусов пяти оригинальных, авторских штаммов аденовирусов с изученной геноти-пической характеристикой и рекомендованных в качестве диагностических: Ад7/Воронеж/1708/80/p -N ГКВ 2216, Ад7Дерсон/ 3022/86 /Г1 -NTKB 2213, Ад7Дерсон/3024/86 /П -N ГКВ 2214, Ад7Дерсон/3160/86/П -N ГКВ 2215, Ад7/Алма-Ата/3234/87/П -«ГКВ 2217.

- 12

В качестве диагностикума для РСК (реакции связывания комплемента) рекомендован и внедрен в практику.ВНИИ гриппа Минздрава СССР штамм Ад7Дерсон/3160/86/ , что позволило существенно увеличить (на 30$). чувствительность реакции при выявлении аденовирусной инфекции у детей.

Основные положения, выносимые назащиту.

1. В природной популяции аденовирусов серотипа 3 при использовании крупнощепящих рестриктаз обнаружено.4 генотипа: АдЗа4, АдЗаЭ, АдЗаЮ и АдЗаП. Эпидемически актуальными генотипами аденовирусов серотипа 3 для Советского Союза являлись АдЗа4 и АдЗаЭ.

2. В природной популяции аденовирусов серотипа 7 при использовании крупнощепящих рестриктаз идентифицировано 4 генотипа: Ад7р, Ад7а, Ад7а(1-5) и Ад7£1 .На территории Советского Союза в период с 1976 по 1979 гг. эпидемически актуальным являлся Ад7а-генотип, тогда как в период 1986-1988 гг. эпидемически . актуальным стал Ад7П -генотип. 3. Использование мелкощепящих ферментов рестрикции, узна- ' ющих 4 пары оснований, - новый методический подход в изучении геномной.изменчивости .аденовирусов.

4. Использование мелкощепящих рестриктаз позволяет выявлять различия в структуре популяций циркулировавших штаммов аденовирусов серотипов 3 и 7 по генотипической характеристике в разные годы наблюдения: в противоположность исключительной гетерогенности популяции аденовирусов серотипа 3 и способности возбудителей к активной коциркуляции на протяжении определенного периода наблюдения, для популяции аденовирусов серотипа 7 свойственны значительная гомогенность штаммов, циркулировавших на территории страны в отдельные .годы, а также последовательная смена генотипов во времени.

5. Применение мелкощепящих рестриктаз в изучении геномной гетерогенности аденовирусов позволяет более адекватно устанавливать эволюционные связи геномных вариантов; для эволюции геномов АдЗ характерна региональная локализация в значительно большей степени, чем для эволюции геномов Ад7.

6. Штаммам аденовирусов серотипов 3 и 7 с разными генотипами свойственна различная степень внутритиповой.и межтиповой интерферирующей активности на тканевых культурах.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены: на научной конференции молодых ученых и специалистов (Ленинград, 1988), на Всесоюзной.конференции "Молекулярная биология ДНК-содержащих вирусов, имеющих практическое значение для сельского хозяйства и медицины" (Киев, 1990).

Метод генотипирования аденовирусов Енедрен в практику работы ВЦГ при.ВНИИ гриппа Минздрава СССР (акт внедрения от 16.05.1989 г.).

По теме диссертации опубликовано 2 статьи.

Объем, и структура диссертации. Материалы.диссертации изложены на 218 страницах машинописного текста, иллюстрированы . 21 рисунками и 23 таблицами. Работа состоит из введения, трех глав обзора литературы, четырех глав собственных исследований, заключения, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего работы 7 отечественных и 183 иностранных авторов.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Головина, Галина Игоревна

- 193 -9. В Ы В О Д Ы I. В итоге многолетних наблюдений впервые в.СССР проведено изучение генотипического состава природной популяции аденовирусов серотипа 3, циркулировавших на территории страны. Методом рестрикционного анализа с использованием крупнощепящих рестриктаз BamHi , Bgin и Hindin выявлено четыре ге-нотипических варианта аденовирусов серотипа 3: АдЗа4, АдЗа9, АдЗаЮ и АдЗаП. Впервые только в СССР, обнаружены новые генотипы АдЗаЮ и АдЗа11. Определены доминирующие геномные варианты аденовирусов серотипа 3 - ДдЗа4 и ДдЗа9, циркулировавшие на территории страны.

2. На основе генетического типирования аденовирусов серотипа 7 с помощью крупнощепящих ферментов рестрикции, обнаружено в СССР в период с 1976 по 1988 гг. наличие в природной по-, пуляции четырех генотипов аденовирусов серотипа 7: Ад7р, Ад7а, Ад7а(1-5) и Ад7г1. Впервые выявлен новый генотип АдТГI. Установлен факт смены доминирующих геномных вариантов, аденовирусов серотипа 7 в зависимости от периода наблюдения, поскольку в .1976-1979 гг. преобладающим был генотип Ад7а, а в

I986-1988 гг. - Дд7П -генотип.

3. Разработан метод более глубокого исследования аденовирусного генома на основе, использования мелкощепящей эндонук-леазы рестрикции CfrI3I, узнающей 4 пары оснований. Анализи-зируемые наборы ресгрикционных фрагментов ДНК изолятов АдЗ. и Ад7 содержали при таком разрезании по 74-81 и 70-79 фрагментов соответственно.

4. На основе анализа ДНК циркулировавших штаммов аденовирусов серотипов 3 и 7 при использовании мелкощепящей рест-риктазы сгг 131 обнаружена значительно большая гетерогенность геномов ДдЗ по. сравнению с Ад 7: выявлено в природной популяции 19. геномных вариантов аденовирусов серотипа 3 и 9 геномных вариантов аденовирусов серотипа 7.

Построены схематические карты эволюционных взаимосвязей геномных вариантов АдЗ и Ад7, циркулировавших на территории страны.

5. Проанализирован характер вариабельности различных участков ДНК исследованных штаммов АдЗ и Ад7. Установлено, что основная генетическая гетерогенность изолятов АдЗ сконцентрирована в области размеров фрагментов ДНК от 228 до 361 п.н., . полученных в результате обработки ДНК рестрикгазой С:Гг 131, тогда как в случае изолятов Ад7 основная генетическая гете- . рогенность охватывала области от 530 до 1288 п.н, и от 245 до 315 п.н,

6. Показаны различия в структуре популяции циркулировавших в СССР штаммов аденовирусов серотипов 3 и 7 по. генотипи-ческой характеристике в разные годы наблюдения. Для аденовирусов серотипа,3 характерна исключительная гетерогенность популяции и способность возбудителей к активной коциркуляции на протяжении определенного периода наблюдения. Для аденовирусов серотипа 7 в отдельные годы была свойственна значительная гомогенность штаммов, циркулировавших на территории страны, а также последовательная смена генотипов во времени,

7. Сформулирована гипотеза об активных рекомбинационных процессах, являющихся основным условием эволюции геномов аденовирусов. На примерах аденовирусов серотипов 3 и 7 показана возможность использования мелкощепящих рестриктаз для углубленного изучения этого явления,

8, Проведено исследование биологической совместимости некоторых генотипов АдЗ и Ад7 при.их.сокультивиров.ании в клеточных культурах. Показана возможность дифференцировать генотипы по результатам их влияния на репродукцию близкородственных вирусов при внутритиповой и межтиповой интерференции.

Заключение

Проведено сопоставление биологических свойств изолятов АдЗ и Ад7 с их ген о типическими профилями. Анализ соотношения клинических форм заболеваний, вызванных изученными изолятами АдЗ и Ад7, и генотипов этих изолятов позволяет предварительно предположить, что наиболее вирулентными являются вирусы с генотипами АдЗа4 и Ад7а-П. Исследование других биологических характеристик аденовирусных изолятов в их взаимосвязи с генотипом обнаружило ряд отличительных особенностей. В случае аденовирусов серотипа 7 наблюдалась определенная корреляция между генотипами изолятое и их антигенными свойствами, поскольку штаммы с генотипом Ад7а были антигенноподобны эталонному штамму, имевшему также генотип Ад7а, тогда как вирусы с генотипами Ад7р и Ад7а(1-5) являлись антигенноотличными вариантами. Что касается субпопуляции вирусов с Ад7Д-гено-типом, то она имела преимущественно антигенноотличные свойства. Напротив, для аденовирусов серотипа 3 подобной связи выявлено не было.

Анализ активностей репродукции вирусов при оптимальной и супраопгимальной температурах инкубации выявил возможность существования определенной взаимосвязи генотипических характеристик и температурной зависимости репродукционной активности штаммов. Так, в случае аденовирусов,серотипа 7 при повышении температуры инкубации наблюдалась следующая ситуация: для изолятов с генотипом Ад7а(1-5) было.характерно в основном увеличение репродукционной активности, для штаммов с генотипом Ад7*1 - наблюдалась тенденция к подавлению активности репродукции, а для большинства штаммов с генотипами Ад7а и Ад7р был свойственен практически одинаковый уровень активности репродукции при оптимальной и супраоптимальной температурах инкубации. Напротив, в связи со значительной геномной гетерогенностью ДдЗ подобного рода сопоставления провести было трудно. Тем не менее, для несколько более генетически гомогенной субпопуляции вирусов с генотипом АдЗа9 была характерна преимущественная активация репродукции при повышении температуры инкубации.

В итоге проведенной работы было установлено, что интерферирующие свойства аденовирусов., серотипа 7 в отношении ВВС на тканевых культурах позволяют в меньшей степени дифференцировать штамшвую специфичность в зависимости от генотипа. Оказалось, что штаммы с генотипами Ад7р и Ад7а(1-5) обладали способностью сильно интерферировать о БьО; субпоцуляцяк вирусов с генотипом Ад7^1 в отличие от Ад7а-генотипа бшш преимущественно присущи высокоинтерфериругощие свойства, тогда как субпопуляция вирусов с генотипом Ад7а может быть скорее отнесена к группе умеренноинтерферирующих вариантов.

Проведено исследование биологической совместимости некоторых генотипов АдЗ и Ад7 при их сокультивировании в клеточных тканевых культурах. Показана возможность дифференцировать генотипы по результатам их влияния на репродукцию близкородственных вирусов. Анализ характера взаимодействия между вирусами,' имеющими геяогишАдЗр, Ад7р:,'; Ад7П л Ад7а(1-5) предполагает

- 169 существование повышенной интерферирующей активности между виру> сами одного серотипа по сравнению с вирусами разных сероти-пов.

- 170

8." ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Еопросы молекулярной эпидемиологии аденовирусных инфекций, обусловленных АдЗ и Ад7, и глобальное распространение генотипов.указанных вирусов широко, представлены в литературе /10,14,26,28,95,97,120/. В исследованиях, выполненных а-<И4 . и G.Wadell, ,Th.Adrian и R.Wigand, О'Donneil at al., A.Bailey И S.Richraond, М.Arena и V.Dilworth , генотипированы изоляты, выделенные среди населения разных стран мира при эпидемической, спорадической или локальной заболеваемости. Доказана значительная.генетическая вариабельность аденовирусов серотипов 3 и 7. Среди штаммов аденовирусов, изолированных на протяжении 30-летнего периода наблюдений, идентифицировано и описано 31 геномный вариант АдЗ /14,97/ и 24 геномных вариантов Ад7 /10,28,84,95/, рассмотрены их эволюционные взаимосвязи /10,97/. Тем не менее, в процессе исследования глобального распространения генотипов недостаточно точно отражаются реальные эволюционные взаимосвязи геномных вариантов. Напротив, при изучении штаммов, представляющих изоляты, выделенные в сравнительно ограниченном регионе (Европа, Китай), эеолюция генотипов АдЗ и Ад7 прослеживалась более отчетливо /95,169/. С другой стороны,, ряд авторов /14/ отмечает, что несмотря на высокую точность сравнительного анализа геномов при использовании ресгриктаз, узнающих 6 пар оснований, наиболее корректное сравнение геномных вариантов должно проводиться на основе анализа нуклеотидных последовательностей ДНК. Мы полагаем, что в качестве более дешевого, быстрого и доступного метода, чем секвенирование нуклеотидных последовательностей аденовирусных изолятов, может быть также предложено использование мелкощепящих рестриктаз.

В настоящем исследовании мы впервые провели анализ геномов аденовирусов серотипа 3 и 7, циркулировавших на территории Советского Союза в течение 12-летнего периода наблюдений. В итоге работы наш были рассмотрены эволюционные связи выявленных генотипов АдЗ и Ад7 с помощью стандартного метода ге-нотипирования с использованием крупнощепяншх рестриктаз, а также на основе использования усовершенствованного нами метода с применением для анализа мелкощепящих рестриктаз. В результате изучения генотипических характеристик изолятов аденовирусов нами сделан ряд заключений, касающихся особенностей их циркуляции в СССР.

Среди штаммов АдЗ, присланных в адрес Всесоюзного Центра по гриппу и ОРЗ в период с 1976 по 1988 гг., методом рест-рикционного анализа с использованием ферментов, узнающих 6 . пар оснований, нами было идентифицировано, 4 генотипа: АдЗа4, АдЗа9, АдЗаЮ и АдЗаП. Доминирующим генотипом оказался АдЗа4, который стал эпидемически значимым с 1976 г. и выделялся до 1988 г, в Советском Союзе и Чехословакии. Вирусы с. указанным генотипом были впервые выделены во время вспшки ОРЗ в районе Beijing (Китай) в 1983 г. на фоне многолетней циркуляции в данном регионе вирусов с генотипом АдЗа2 /97/. Другим наиболее распространенным в СССР, генотипом являлся АдЗаЭ. Указанный геномный вариант был аналогичен генотипу DIO, выделенному во время локальной вспышки фарингоконъюнктивитов в США в 1977 г. и описанному в работе Th.Adrian/14/. Следует отметить, что в США в период с 1964 по 1985 гг. превалярова

- 172 ли вирусы с генотипом бЗ, соответствующим АдЗа-генотипу по классификации о.иайеН /97/. Генотип АдЗа9 был также подобен геномному варианту АдЗа по классификации о'БоппеИ /120/, который был обнаружен в Англии в 1981 г? во время вспышки ОРЗ и конъюнктивитов."

Спорадически выделяемые генотипы АдЗаЮ и АдЗаН выявлены в настоящем исследовании впервые. На основании данных о гомологии идентифицированных нами генотипов было построено эволюционное древо, предполагающее в случае аденовирусов серотипа 3, циркулировавших на территории Советского Союза, что исходным генотипом, дивергировавшем в три независимых геномных варианта, являлся генотип АдЗа4.

В ходе работы были установлены эпидемически актуальные генотипы АдЗ для отдельных регионов нашей страны, поскольку в Европейской части СССР преобладали адновирусы с генотипом АдЗа4, а в Восточных районах страны - вирусы с генотипом АдЗа^.

Исследование геномов аденовирусов с использованием фермента рестрикции сГг131» узнающего 4 пары оснований, позволило нам более детально изучить вариабельность генотипов и существенно уточнить их эволюционную взаимосвязь. Сайт узнавания рестрикгазы сГг131 имеет в основном ГЦ-состав (Г'ГНЦЦ), что предполагало подвергнуть сравнительному анализу ГЦ-богатую часть ДНК, входящую, как правило, в смысловые участки генома.

Анализ ДНК с помощью рестрикгазы с?г121 выявил большую генетическую гетерогенность АдЗ. Из двух преобладающих генотипов АдЗ, выделенных в Советском Союзе, АдЗа4 имел значительно большее число генетических вариантов, чем АдЗа9, т.к^ среди 12 проанализированных изолятов ДдЗа4 было обнаружено II субтипов, а среди 6 изолятов АдЗа9 - 4 субтипа. В то же время европейский вариант АдЗа9 оказался более генетически вариабельным, чем азиатский (Хабаровский) вариант, обладавший чрезвычайно высокой генетической стабильностью. Характерно, что в Европейской части СССР субгипы генотипа АдЗа9 имели гораздо большую гомологию с некоторыми субтипами АдЗа4 (98$), чем с АдЗа9 (92$). Данный факт предполагает непосредственную эволюционную взаимосвязь генотипов. АдЗа4 и АдЗа9. Вместе с тем сравнительный анализ отличающихся фрагментов, выявленных в процессе сопоставления ресгрикционных профилей ДНК штаммов АдЗ для рестриктазы Cfr I3X, установил, что все европейские варианты генотипа АдЗа9 имели зону вариабельных фрагментов С (от 270 до 365 п.н.), подобную одному из вариантов генотипа АдЗа4. По результатамчнаших исследований следовало, что такого рода соответствие было связано как с периодом изоляции возбудителя, так и с местом его выделения. Сказанное подтверждает существование определенных генетических взаимодействий генотипов АдЗа4 и АдЗа9^

В ходе наших исследований была обнаружена локальная эволюция геномов АдЗ в пределах ограниченного региона, поскольку родство субгипов АдЗ, выделенных в одном городе (районе)1,' было^ как правило, более высоким, чем между вариантами АдЗ; изолированными в разных городах нашей страны.

Использование мелкощепящей рестриктазы Cfr 131 в плане изучения гетерогенности геномов позволило нам значительно углубить анализ исследований в области эволюции генотипов АдЗ. Исследование распределения геномных субтипов АдЗ установило;1что аденовирусы серотипа 3, циркулировавшие на территории СССР; могут быть сгруппированы по гомологии ДНК в 3 кластера. Согласно нашим данным, за наблюдаемый период времени в популяции аденовирусов серотипа 3, распространенных в Европейской части страны, произошла смена геномных кластеров с кластера I -европейского (1978-1980 гг.1) на кластер Ш - азиатский (19811988 гг.')-. Все известные по данным литературы генотипы АдЗ также были разбиты по голомогии ДНК на три кластера. Кластер I содержал генотипы АдЗр, АдЗр1, АдЗр2 и АдЗъ; кластер 2 -включал в себя только один генотип - АдЗе; и, наконец, кластер 3 охватывал генотипы АдЗа, АдЗа1 - АдЗа8,.АдЗс; АдЗа и АдЗ-7 /97/; В данном исследовании на основе сопоставления уровней гомологии между генотипами АдЗ и сроков их первоначального выделения было построено эволюционное древо, которое позволило выявить закономерность смены генотипов АдЗ. Однако, если глобальная смена генотипов заключалась в постепенном вытеснении из циркуляции АдЗр-подобных генотипов генотипами, подобными АдЗа, то локальная смена геномных вариантов на территории Советского Союза характеризовалась эволюционной сменой кластеров субтипов в пределах близкородственных генотипов АдЗа4 и АдЗа9;!

В результате анализа ДНК крупнощепящими рестриктазами нами была установлена способность АдЗ с различными генотипами к совместной циркуляции. Это наблюдение было подтверждено и исследовано более детально при использовании мелкощепящей рестриктазы сггхз1;- в итоге проведенной работы нам удалось выявить характерную особенность циркуляции аденовирусов серотипа 3, которая проявлялась в исключительной геномной гетерогенности субтипов АдЗ среди изолятов, представлявших различные регионы страны и выделенных в достаточно короткий промежуток времени - в течение одного года.

Следует также подчеркнуть, что в годы активной коцир-куляции АдЗ с разными генотипами (1979-1981 гг.) мы наблюдали повышение интенсивности циркуляции аденовирусов серотипа 3 на территории нашей страны. Аналогичные ситуации были описаны во время вспышек ОРЗ аденовирусной этиологии в Англии (1981 и 1983-1984 гг.) /28,120/, в Китае (1983-1984 гг.) /97/, в Японии (1979-1980 гг.) /97/. С другой стороны, необходимо отметить, что наблюдаемый нами факт смены геномных кластеров аденовирусов серотипа 3 на Европейской части территории Советского Союза (1980-1981 гг.) происходил в период повышенной активности циркуляции АдЗ и активной коциркуляции нескольких геномных вариантов аденовирусов серотипа 3.'

Анализ результатов детального исследования генетической нестабильности и характера распространения различных субтипов АдЗ позволяет предположить наличие активных обменных генетических процессов среди циркулирующих штаммов. С точки зрения спонтанного мутагенеза, геномы ДНК-содержащих вирусов относительно стабильны. Благодаря наличию корректирующей активности; которая присуща ферментам, реплицирующим ДНК, скорости накопления спонтанных мутаций в ДНК-геномах низки: они со-8 И сгавляЕэт 10" -10" на каждый включенный нуклеотид.' Поэтому эволюция геномов происходит скорее всего не столько за счет статистических мутационных процессов, а благодаря геномным перестройкам. Это положение мы можем подтвердить фактом выявления различий геномов локального характера у близкород- . ственных штаммов.

Так, например, среди штаммов АдЗ существуют отличия е зоне вариабельных фрагментов Д (230 п.н., 255 п.н.). Объяснение изменений размеров фрагментов в результате спонтанных мутационных процессов,на наш взгляд', неприемлемо, т.к. воздействию подвергается вполне определенный участок ДНК у рассматриваемых аденовирусов. Строго говоря,: подтверждением существования сайт-специфических рекомбинаций является обнаружение изменения размеров фиксированных фрагментов, гомология которых установлена гибридизационным анализом. Однако весь сравнительный анализ генотипов аденовирусов строится на выявлении эмигрирующих фрагментов, т.е. фрагментов, имеэдих одинаковый размер, предполагая их гомологию';- Поэтому анализ рестрикционных профилей близкородственных штаммов и выявление изменения размеров фиксированных фрагментов, гомологию которых мы предполагаем априорно, позволяет утверждать наличие сайт-специфических изменений, яеляодихся отражением рекомбинационных перестроек ДНК.

Анализ геномов с помощью ферментов рестрикции, узнающих 6 пар оснований, позволяет дифференцировать рестрикционные фрагменты ДНК, отличающиеся на 50-100 п.н; Однако возникновение таких больших изменений возможно не только благодаря рекомбинационным процессам, но и в результате изменений сайтов рестрикции за счет мутаций. Следует подчеркнуть, что подобные изменения фрагментов, описанные, например, в работе /95/, выявлены у изолятов, выделенных в разных странах и через довольно большой промежуток времени. В нашем же исследовании проводился анализ близкородственных штаммов, представлявтих изоляты, полученные в ряде регионов одной страны. Использование модифицированного нами метода с привлечением ферментов рестрикции, узнающих 4 пары оснований, позволило обнаружить незначительные изменения фиксированных фрагментов. Такого рода изменения могут происходить, по-видимому, не за счет возникновения или исчезновения определенных сайтов рестрикции для использованного фермента, а скорее всего в результате других,сайт-специфических процессов.

Наличие рекомбинаций у аденовирусов было описано ранее в ряде работ./30,38,101/ (см.гл.1.4). Среди природных штаммов аденовирусов.обнаружены рекомбинанты между вирусами.разных серотипов, принадлежащих подгруппам В и.Д,.например, АдЗ-7 /18,9% ДдЗ-16 /19,71/, Ад15-9 /9/ и т.д.,выявлению которых способствует.появление у подобных рекомбинантов гегерологичных антигенных характеристик. Рекомбинации между геномами вирусов в пределах одного серотипа.интенсивно изучаются исключительно в лабораторных условиях, т.к. в этом случае используются мугантные штаммы (в основном, tэ-мyтaнты), например, у.аденовирусов, серотипов 2 /80,85/, 5 /62,99/, 12 /94,138/. Возможные рекомбинации между геномами аденовирусов и клетки »хозяина обнаруживаются: .как в природных условиях, в случае Ад2 /114/, так и в процессе лабораторного эксперимента, напри- . мер, у аденовирусов серотипа 3 /93/. - при использовании гиб-ридизашонного. анализа ДНК аденовирусов и хромосомной ДНК . клетки-хозяина. Природные рекомбинации внутри популяции вирусов, одного серотипа обнаружить достаточно трудно из-за отсутствия дополнительных фенотипических маркеров.

Существует теория, согласно которой важным эволюционирующим фактором в изменчивости вирусных геномов являются дефектные интерферирующие (ДМ) - частицы. Дефектные геномы.представляют собой субгеномные. . деледионные мутанты вирусов, из которых они образовались. Образование дефектных геномов служит одним из .механизмов регуляции избыточного количества вируса. ДИ-частицы лучше всего накапливаются при высокой множественности заражения вируса, с их помощью ослабляется легальное действие вируса на клетки, происходит взаимодействие с генетическим материалом выживающих клеток и организмов.

Bot 3tein и SuBskind /32/ предложили общую модульную теорию эволюции вирусов, согласно которой эволюция действует пер< вичмо не на уровне ингакгных вирусов, а на уровне индивидуальных функциональных единиц (модулей). Каждый модуль кодирует полезную функцию или обеспечивает протекание определенного процесса, например, инкапсидацию вируса, раннюю или позднюю регуляцию, репликацию и т.д. В природе каждый интакт-ный вирус является продуктом не одной линии эволюции, а благоприятной комбинации генных модулей, которые успешно занимают индивидуальную нишу в природе. Принимая во внимание эту теорию, считается, что дефектные геномы-это не просто временные побочные продукты репликации вируса, но скорее субгеномные модули, которые могут оказывать.разнообразное и важное биологическое и эволюционное воздействие. .

Таким образом, допустимо предположить, что.обнаруженные нами эволюционные изменения геномов аденовирусов серотипа 3 могут являться следствием подобного рода рекомбинационных процессов, протекающих в природных популяциях аденовирусов.

Другим основным разделом нашего исследования было изучение геномной изменчивости аденовирусов серотипа 7 и определение.ряда особенностей их циркуляции в СССР. Среди изолятов Ад7, выделенных в Советском Союзе в период с 1976 по 1988 гг, при использовании набора крупнощепящих рестриктаз BamHi . ,

Bgin и .Hindin яами было идентифицировано 4 генотипа: Ад7р, Ад7а, Ад7а(1-5) и Ад7*" I. В природной популяции обнаружены как доминирующие генотипы: Ад7а (1976-1979 гг.) и Ад7П (1986-1988 гг.)г так и.генотипы, имеющие локальное или эпизодическое распространение - Ад7р и Ад7а(1-5). Обнаружен-, ный нами Ад^-генотип родственен Ад7г.-генотипу, выделенному пока только в Австралии, но имеет существенные отличия.от него, заключающиеся в полном несоответствии ресгрикционных профилей генотипов M7f и Ад7Г1 душ рестриктазы Bgin # К сожалению, в нашей коллекции вирусов не оказалось референс-штам-мов с генотипами Ад7г и АдТь. Поэтому мы не можем говорить с полной ответственностью относительно установления уровней гомологии генотипа Ад7П с Ад7Г или Ад7.ь. Однако на основании данных, устанавливающих аналогичность наборов ресгрикционных фрагментов Ад7^1 и Ад7£ -генотипов для таких дискриминационных в.отношении генотипов Ад7 реотрикгаз, как BamHi -и Hindin, мы предполагаем определенное родство между генотипами Ад7^1 и Ад7Г .

В ходе работы нам удалось установить, что в.1976 г. на фоне повышенной активности циркуляции, аденовирусов серотипа 7 на территории нашей страны наблюдалась коциркуляция Ад7 с близкородственными генотипами Ад7а и Ад7а(1-5).

Анализ данных литературы.показывает, что для аденовирусов серотипа 7 также возможна коциркуляция нескольких генотипов во время эпидемических вспышек ОРЗ аденовирусной природы. Так, например, в Китае в период с 1958 по 1959 гг» коцирку-лировали вирусы с генотипами Ад7а1, Ад7а4,. Ад7Ь и.Ад7е /95/, а в Англии в период с I983.no 1985 гг. коциркулировало несколько вариантов Ад7ь-генотипа /28/. . .

В результате проведенных нами исследований было обнаружено, что за наблюдаемый период времени произошла последовательная смена генотипов аденовирусов серотипа 7 с Ад7а.на Ад7г1 при спорадическом появлении в циркуляции Ад7р-генотипа. В ряде работ /95,165,169/, посвященных глобальному распространению генотипов Ад7, отмечается, что в странах Европы, Азии, Австралии, и Америки были зарегистрированы факты последовательной смены генотипов аденовирусов серотипа 7. Так, в Европе и Австралии аденовирусы с Ад7а-генотипом выделялись преимущественно в период смены генотипа Ад7с на Ад7:Ь, из которых последний приобрел эпидемическую актуальность с середины 70-х годов /165/. В США на фоне доминирующей циркуляции, начиная с 1962 г., вирусов с Ад7.Ь-генотипом в популяции появлялись аденовирусы с генотипами Ад7р, Ад7а, Ад7с /10,95,165/,' тогда как Ад7,<1, Ад7е и Afl7f -генотипы выявлены не были. В Китае Ад7Ь-генотип также был доминирующим на протяжении многих лет наблюдения (I958-I98I гг.), а затем, как предполагенотипы гают авторы /95Д он эволюционировал (I98I-I984 гг;) и Ад7а,1 (с . 1984 г.)* Таким образом, во многих регионах земного шара так или иначе появлялись и в основном продолжительно циркулировали вирусы с Ад7Ь .-генотипом.

Что касается взаимосвязи различных генотипов Ад7, то,по результатам сравнительного анализа; выделенный в Австралии

Ад7г-генотип имел наибольший уровень гомологии с генотипом Ад7ъ (92$ ПКРФ-6) /95/, и,- следовательно,1 Ад7^-генотип можно было отнести к пъ"-подгрудпе доминирующих генотипов Ад7. Следует особо подчеркнуть, что на территории Советского Союза нами не было обнаружено ни одного штамма, имеющего Ад7Ь-ге-нотип, тогда как был выявлен доминирующий генотип Дц7^1, родственный Дц7г-генотипу, и условно отнесенный нами также к "ь"-подгруппе доминирующих генотипов. Подводя итог вышесказанному, мы предполагаем, что в нашей стране наблюдается самостоятельный, независимый путь эволюции генома аденовирусов серотипа 7, приводящий к возникновению генотипа, относящегося к подгруппе Характерно, что выявляется определенная особенность в э.волюции геномов Дц7, которая заключается в том, что эволюция аденовирусов серотипа 7 направлена в сторону возникновения ">"-подобных вариантов.

Проведенный нами анализ субгидов. Ад7, выявленных с помощью рестриктазы cfrI3I, обнаружил гораздо меньшую генетическую гетерогенность изолятов Дц7 по сравнению с аденовирусами серотипа 3. Установлено, что аденовирусы с Дц7р-генотипом пред-сгавляют.собой чрезвычайно гомогенную субпопуляцию.

Напротив, среди 19 обследованных штаммов, представляющих . три родственных генотипа (Ад7а, Дц7а(1-5) и Ад7.г I) было обнаружено 8 субтипов. Причем разные генотипы обладали разной степенью геномной гетерогенности. Значительно вариабельным оказался Ад7а-генотип, в пределах которого нам удалось дифференцировать 4 субтипа, три из которых (Ад7а-П, Ад7а-Ш и Ад7а-1У) были свойственны вирусам, циркулировавшим в Советском Союзе. Сопоставление степени вариабельности генотипов с их эпидемической актуальностью (на примерах Ад'&и Ад7р-генотипов) дает нам.возможность придти к заключению, что вариабельные генотипы в отличие от более стабильных имеют, по-видимому, больше преимуществ в активизации эпидемического процесса. На основании данных о гомологии выявленных с помощью круп-нощепящих рестриктаз генотипов нами было построено эволюционное древо, предполагавшее непосредственную эволюционную связь Дц7а(1-5) и АдТеI -генотипов, тогда как эволюционные взаимосвязи генотипов Ад7а и Ад7:ГI с одной стороны и Дд7а и Ад7а(1-5) - с другой стороны, были относительно слабыми. Исследование ДЩ с использованием фермента, узнающего 4 пары . оснований, существенно изменило наши представления об эволюционных связях изученных генотипов. В результате анализа зон вариабельных фрагментов и уровнейгомологии между геномными вариантами, выявленными о помощью рестриктазы с£т 131, обнаружено, что субтипы Дд7 £Е-генотипа более родственны Ад7а-Ш-субтипу, чем обоим субтипам.генотипа Ад?а(1-5) (Дц7а(1-5)-1 и Дд7а(1-5)-П). Следовательно, генотипы Ад7а(1-5) и. Ад7?1 могут являться независимыми продуктами двух путей эволюции генотипа Ад7а. В то же время рассмотрение эволюции генотипа Ад7а(1-5) предполагает два возможных варианта: I) независимое возникновение разных субтипов Ад7а(1-5)-генотипа от различных вариантов Ад7а, или 2) последовательные рекомбинации. генотипа Ад7а(1-5) о различными вариантами генотипа Дд7а.- Тот и.другой вариант позволяют объяснить наблюдаемое нами возникновение гомологичных зон вариабельных фрагментов Д у субтипов генотипов Дд7а(Х-5) я Ад7а^ связанное либо с временем; либо с местом выделения изолятов. Мы полагаем, что для аденовирусов.серотипа 7 характерно наличие обменных генетических процессов, которые по.сравнению с аденовирусами серотипа 3 менее интенсивны, поскольку в популяции вирусов Ад7 генетическая гетерогенность выражена слабее. Сказанное находит подтверждение в работах ряда зарубежных исследователей, которые установили значительную гетерогенность.изолятов АдЗ по сравнению с. изолятами Ад7 /10,14-,28,95,97/.

Следует отметить, что в отличие от способности АдЗ к активной коциркуляции на протяжении относительно короткого промежутка ,времени (в течение одного года), популяция вирусов Ад7. характеризовалась в указанный период времени значительной гомогенностью генотипов. Вместе с тем обнаружена способность аденовирусов серотипа 7, обладавших определенным геномным вариантом (субтипом), распространяться на. большой территории страны, что не наблюдалось у аденовирусов серотипа 3. В результате этого для эволюции генотипов Ад7 не характерна региональная локализация в такой степени, как в случае эволюции генотипов АдЗ. Одним из недостатков метода идентификации геномов аденовирусов с помощью крупнощепящих рестриктаз является существенная зависимость спектра выявляемой вариабельности генотипов от набора используемых ферментов. Так, например, геномные варианты Ад7ь-генотипа были обнаружены только с.помощью рестриктаз вен , руихх и SstII /26,28/, которые не,использовались в работах а.шайеН /95,165/. Другим недостатком метода является тот факт, что сравнительному анализу подвергается лишь незначительная часть генома /14/.

К достоинствам метода изучения геномной гетерогенности аденовирусов с помощью мелкощепящей ресгрикгазы сГг 131 относятся, во-первых, использование ограниченного набора рест-риктаз в процессе анализа генотипов (одна - вместо 10-12 рестриктаз при применении крупнощепящих ферментов) и, во-вторых, более глубокий анализ геномов, позволяющий установить возможную эволюционную.связь геномных вариантов, относящихся как к разным генотипам, так и в пределах одного генотипа. й.^айеН на основании анализа данных в плане изучения циркуляции генотипов,. принадлежащих разным кластерам АдЗ и Ад7, на протяжении трех десятилетий наблюдений отметил чрезвычайную стабильность некоторых генотипов, в частности гено-. типов АдЗа2, ДдЗрХ и Дд7.ь /97/. Это наблюдение побудило автора высказать предположение о том, что геномные кластеры эволюционировали задолго до начала геногипирования аденовирусов, тогда как ситуация с выявляемостью генотипов скорее характеризует частоту обнаружения постоянно персистирующих вариантов,, а. не. появление вариантов с новыми генетическими изменениями/97,164/.

Результаты наших исследований показали значительно большую генетическую гетерогенность АдЗ по сравнению с Дц7. Кроме того, мы рассмотрели.эволюционные связи геномных вариантов в популяциях аденовирусов серотипов 3 и 7, а также существование возможной независимой, эволюции генотипов Ад7, циркулировавших на территории СССР. Все вышесказанное позволяет нам сделать вывод о том, что эволюция геномов аденовирусов серотипов 3 и 7 происходит непрерывно, и мы полагаем, что важным источником эволюции являются рекомбинационные процессы,' происходящие в пределах вирусных популяций.

В настоящее время широко проводятся исследования аденовирусов в плане изучения их молекулярной биологии. Однако сведения о корреляции между, изменчивостью геномов аденовирусов и их биологическими свойствами в литературе представлены явно недостаточно. В основном рассматриваются взаимосвязи между гено-типическими профилями изолятов и характером клинического проявления инфекций, обусловленных этими изолятами, а также исследуются антигенные характеристики штаммов с. разными генотипами. Вместе с тем участки генома, кодирующие.антигенную информацию, составляют незначительную его часть. В связи с этим в большинстве случаев исследователям не удается выявить коррелятивную связь.между генотипическими и серологическими профилями изолятов /82,172/, .

Во многих работах /10,14,26,28/ проводилось сопоставление выявленных генотипов с особенностями клинической, картины заболеваний, обусловленных данными геномными вариантами, но убедительных доказательств связи генотипа с характером протекания заболевания.обнаружено не было. Вместе с тем в исследовании Th.Adrian /14/ отмечалось, что в развитии пневмоний и ■ фарингоконъюнктивальной лихорадки ведущая роль принадлежит АдЗ с генотипом вз (АдЗа - по классификации G.v/adeii а не

АдЗс генотипом 151 (АдЗр). Аналогичные. данные были получены и . в работе g.wadell /164/. В то же время аденовирусы с генотипом D10 были этиологически связаны преимущественно с развитием фарингоконъюнктивальной лихорадки, и в меньшей степени пневмонии и ОРЗ /14/.

В итоге наших исследований также наметилась слабая дифференциация генотипов АдЗ и Ад7 по характеру проявления вызванных ими заболеваний. Характерно;' что наиболее тяжелые.формы, заболеваний были обусловлены аденовирусами серотипа 3, имевшими генотип АдЗа4, а не АдЗаЭ или АдЗаЮ. Среди аденовирусов серотипа 7 также были выявлены определенные отличия для разных субтипов генотипа Ад7а. Наиболее. вирулентными оказались вирусы, обладавшие Ад7а-П-субтипом. Однако в связи с небольшим количеством обследованных штаммов это заключение нельзя, считать окончательным. Следует особо подчеркнуть, что невозможность установления, однозначной корреляции, вероятно, в.какой-то мере может быть связана с выявленной в ходе наших исследований существенной.гетерогенностью, генотипов.

Сопоставление серологических и генотилических профилей обследованных изолятов установило определенные различия в антигенных характеристиках Ад7-генотипов, тогда как дифференциа-. ции генотипов аденовирусов серотипа 3 по этому признаку.обнаружено не было. В случае аденовирусов серотипа 7 нами были получены результаты, хорошо согласующиеся с данными литературы: все изоляты, имевшие Ад7а-генотип, были антигеннопо-г добны эталонному штамму. (Ад7а-генотипа), в то время как изоляты с другими генотипами (Ад7а(1-5) и Ад7р) являлись преимущественно антигенноотличными от эталона вариантами, за исключением штаммов с генотипом Ад7Г1, относительно которых.однозначного ответа об их антигенных характеристиках получено не было. В пользу наших результатов свидетельствуют данные Rowe et ai. /131/, обнаруживших среди изолятов в процессе перекрестной реакции нейтрализации в тканевых культурах антиген-ноотличный вариант Ад7, обозначенный Ад7а (штамм 1058). Впоследствии данный штамм был генотипирован в работе Gnaden

172/ и описан как Ад7а-генотип, отличный от генотипа Ад7р (штамм Gomen ). Следовательно, в ходе нашей работы также были выявлены антигенные отличия между вирусами с Ад7а и Ад7р-генотипами.

В итоге анализа экспериментальных, данных, на наш взгляд, наиболее дискриминационными биологическими свойствами в отношении генотипов оказались характеристики, связанные с репродукцией аденовирусов в клетках, в частности температурная зависимость репродукционной активности вирусов. Подобного рода исследований, касающихся изучения репродукционных свойств изолятов, имеющих разные генотипы, в доступной нам литературе обнаружено не было. Однако анализ глобального распространения геномных вариантов АдЗ и Ад7 побудил TfcuAdrian /14/ высказать, предположение, согласно которому различное поведение вирусных штаммоЕ во время циркуляции может.заключаться в существовании определенных отличий в процессе их репродукции. Необходимо отметить, что.нами была обнаружена некоторая дифференциация генотипов по ts-зависимости репродукционной активности вирусов, которая заключалась.в тенденции преимущественного проявления тех или иных *3-свойств штаммами с разными генотипами и в ряде случаев.была сопоставима со степенью их. геномной гетерогенности. Наиболее генетически гетерогенной субпопуляции вирусов с генотипом АдЗа4 не были свойственны какие-либо характерные ts. -свойства. В.то же время менее гетерогенной субпопуляции вирусов с геногит пом АдЗаЭ оказалось возможным сопоставить преимущественную активацию репродукции в культуре клеток в условиях супраоп-тимальной температуры инкубации. Вместе с тем репродукционнал активность изолятов с АдЗаЮ-генотипом практически не зависела от изменения температуры инкубации.

Что касается аденовирусов, серотипа 7, то ts -зависимость репродукционной активности была выражена у них несколько более отчетливо в силу значительной гомогенности субпопуляций разных генотипов указанных вирусов. Так, если репродукционная активность изолятов с генотипом Ад7а(1-5) в основном увеличивалась при повышении температуры инкубации, то репродукционная активность штаммов с генотипом Дд7£Е в большинстве . случаев подавлялась в разной степени в условиях супраоптималь-ной температуры инкубации. С другой стороны, активность pènpo-дукции изолятов с генотипом Ад7а практически не зависела от изменения температуры инкубации.

Необходимо особо подчеркнуть, что в ходе исследований нами не было обнаружено корреляций между признаками t s -зависимостей репродукционных активностей сравниваемых штаммов и уровнями гомологии их ДНК. Штаммы с высоким уровнем гомологии геномов, но принадлежащие разным генотипам, могли иметь значительно отличающиеся t в-показатели, тогда как штаммам одного генотипа, хотя и с низким.уровнем гомологии ДНК, могли соответствовать подобные характеристики "t ^зависимости репродукционной активности.

Интерферирующую активность.аденовирусов мы оценивали как в.гетерологичных, так и в гомологичных системах.-Ранее были показаны значительные отличия в способности интерферировать с вирусом везикулярного стоматита (ВВС) у аденовирусов, принадлежащих к разным серотипам с одной стороны, и, с другой стороны, принадлежащих к вариантам дикого типа или холодо

- 189 адаптированным внутри одного серотипа /5/. Исследование нами интерферирующей активности аденовирусов серотипа 7 в отношении ВВС обнаружило способность к сильной интерференции среда штаммов, имеющих генотипы Ад7р и Ад7а(1-5), и среди большинства штаммов с генотипом Ад? тогда как в субпопуляции вирусов с генотипом Ад7а преимущественно присутствовали слабоиятерферирующие вирусы. .

В целом необходимо отметить, что рассматриваемое нами сопоставление биологических свойств изолятов с их генотипами мы оцениваем как тенденции возможного проявления тех или.иных свойств штаммами.с различными генотипами. Неоднозначность подобного рода корреляций , на наш звзгляд, может заключаться, во-первых,' в обнаруженной наш значительной геномной гетерогенности генотипов, и, во-вторых;* в недостаточной.стандарти-" зации опытов при изучении биологических свойств изолятов.

В основе исследований межтиповых взаимоинтерферирующих . отношений аденовирусов.ранее использовались определенные, фе-нотшшческие или физико-химические свойства. Интерференцию Ад2 и Ад12 /103/ наблюдали при их сокультивировании в КВ-клетках. Дифференциацию вирусного потомства при подобного рода сокультивировании осуществляли, во-первых, по различию антигенных характеристик Ад2 и Ад12, и, во-вторых, методом молекулярной гибридизации на основе оценки различий штаммов по уровню гомологии ДНК.

С другой стороны, интерферирующее действие штаммов■дикого типа и холодоадаптированных вариантов Ад2 и Ад4 в отношении аденовирусов серотипа 12 изучали по. способности указанных. . влрусов изменять репродукционную активность Ад12 в культуре клеток почки морской свинки (ШС), предварительно инфицированных интерферирующими агентами, по сравнению с размножением Ад12 в интактной культуре клеток БМС /7/. В данном исследовании интерференцию в отношении Ад12 наблюдали лишь в случае использования холодоадаптированных вариантов Ад2 и.Ад4, поскольку в.такой постановке эксперимента использовалось существенное свойство интерферирующих агентов - их размножение на культуре клеток ШЛО при температуре инкубации 37°С происходило без развития видимых цитопатических изменений.клеток»

Исследование внутритшювых взаимодействий, виру сов, .имеющих различные генотипические характеристики. сгалкивается.со значительными трудностями, касающимися отсутствия определенных фенотипических маркеров генотипов таких, как, например, пермиссивные и непермиссивные условия размножения вирусов /7/ или их антигенные свойства /ЮЗ/. Использование в подобного рода экспериментах.собственно генотипических различий штаммов предполагает необходимость предварительного разделения сокультивированной смеси вирусов методом бляшкообразова-ния и последующего анализа клонов с целью установления генотипа каждого клона, что делает эксперимент чрезвычайно трудоемким.

Нами было проведено исследование биологической совместимости некоторых генотипов АдЗ и Ад7 при их сокультивировании в культуре.клеток почки эмбриона человека. В основу использованного метода было положено изучение характера изменения.активности репродукции в клетках культуры, ткани смеси аденовирусов по сравнению с активностью репродукции отдельных вирусов, входящих в смесь.

На основе проведенного анализа родства идентифицированных генотипов АдЗ и Ад7 по проценту эмигрирующих рестрикционных фрагментов, учитывая степень разброса в уровнях гомологии между генотипами и тог факг, что АдЗр-генотип был изолирован не в Советском. Союзе, исследование возможной интерференции про-, водили между АдЗр, Ад7р, Ад7а, Ад7а(1-5) и Ад7*" 1-генотипами, В итоге работы нами было показано, что штаммы аденовирусов ое-ротипов 3 и 7, отличающиеся по генотипическому профилю, обладали различной интерферирующей активностью по отношению друг к другу. Установлено, что наиболее выраженная интерферирующая активность наблюдалась между генотипами Ад7р.и.Ад7г1, а также между. АдЗр.и Ад7р, АдЗр и Ад7г1. Напротив, слабая интерферирующая активность была зарегистрирована.между, геноти-. пами АдЗр и Ад7а и.АдЗр и Ад7а реф. и, наконец, между Ад7а(1-5) и Ад7г1-генотипами,- Показано, что разным генотипам была свойственна существенно отличающаяся интенсивность интерференции в отношении вирусов с АдЗр-генотипом. Наибольшую.отрицательную интерферирующую активность проявляли вирусы с Ад7р-гено-типом, тогда.как между вирусами .с.генотипами Ад7а(1-5) и АдЗр наблюдалось, синэргетическое взаимодействие. .

Полученные данные также предполагают,.что вирусы с различными генотипами, принадлежащие к одному серотипу, обладали повышенной интерферирующей активностью по отношению друг к другу, чем к вирусам друг.ого серотипа.

По-видимому* в процессе интерференции участвуют не только интактные. вирусы, но и дефектные интерферирующие частицы ?-ДИ-частицы. Мы полагаем, что воздействие ДИ-частиц на вирусы в пределах одного серотипа должно быть сильнее, чем на. вирусы другого серотипа. Таким образом, мы считаем, что обнаруженное нами явление биологической совместимости аденовирусов является отражением фенотипических отличий внутриклеточных популяций вирусов, имеющих разные генотипы.

Вероятно, это наблюдение.отражает разную конкурентную способность генотипов-Иу возможно, разную их стабильность в природных условиях. Можно предположить, что если в популяции одновременно циркулируют вирусы, способные ингибировать размножение друг друга, т.е, с сильной отрицательной интерференцией между ними, то будет наблюдаться более благоприятная, эпидемическая ситуация, чем в случае циркуляции вирусов со слабой интерферирующей активностью. Поскольку, в первом случае вирусы будут подавлять распространение друг друга, тогда как во втором случае слабое взаимное влияние даст им возможность коциркулировать, что, по нашим данным, коррелирует с увеличением активности циркуляции вирусов в ходе эпидемического процесса.

В заключение следует сказать, что .полученные в нашей, работе данные позволяют наметить перспективы дальнейших исследований в области этиологии аденовирусных инфекций, а также в . области естественной популяционной изменчивости аденовирусов: в плане более глубокого изучения природы зон наиболее вариабельных фрагментов АдЗ и Ад7 с одной стороны и в плане углубленного исследования биологических свойств, штаммов с различными генотипическими.характеристиками - с другой стороны. Выявленные вирулентные штаммы с определенной характеристикой. их геномов могут быть использованы в качестве модельных вирусов, для поиска ингибиторов, вирусной репродукции с целью разработки эффективных средств профилактики и химиотерапии аденовирусных инфекций.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Головина, Галина Игоревна, 1991 год

1. Галманн Р., Стабель С., Дойринг Р., Дерфлер В. Рекомбинации ме;еду аденовирусной и клеточной ДНК //Вопросы вирусологии.- 1984. ~ ¡Ь 4. С. 399-410.

2. Дяченко Н.С. Аденовирусы. Киев: Наук, думка, 1974. - 157 с.

3. Ыаниатис Т., Фрич 3., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - С. 439.

4. Селиванов А.А., Лысов В.В., Руденко Л.Г. и др. Изучение биологии внутритиповых вариантов аденовирусов 1,2,3,4 и 7-го серотипов //Вестн. АМН СССР. 1970. - Л 8. - С. 46-51.

5. Селиванов А.А., Лысов В.В., Юрлова Т.И., Аксенов О.А. Сравнение двух методов титрования аденовирусов //Вопр. вирусологии 1971. - В 5. -С. 600-603.

6. Юрлова Т.Й., Лысов В.В., Ковалева Т.П. и др. Интерферирующая активность холодолюбивых штаммов аденовирусов типов 2 и • 4 с аденовирусом типа 12 //Вопр. вирусологии. 1972. - $ I.- С. 72-75.

7. Adam Е., Erdei G., Nass I. et al. Hew approaches to the study of antigenic structure of adenovirus hexon using mono- , clonal antibodies //Ann.Immunol.Hung. 1984. - V.24* - Р» 122-134.

8. Adrian Т., Bastain В., Benoist W. et al. Characterization of adenovirus I5/H9 intermediate strains //intervirology.1985» Vol.23. ~ P. 15-22.

9. Adrian Т., Becker M., Hierholzer X.C., V/igand R. Molecular epidemiology and restriction site napping of adenovirus 7 genome types //Arch.Virol. 1989. Vol.106. - P. 72-84.

10. Adrian Т., Best В., Miiller S.I., Knocke K.W. Genome type analysis of adenoviruses, isolated 1981 in Hannover, FRG //Zbl.Bakteriol., Hikrobiol. und Hyg. X984. - Vol. A258, S? 4. - P. 498.

11. Adrian Т., Best В., Wigand. R. A proposal for naming adenovirus genome types, exemplified by adenivirus type 6 //J. Gen .Virol. 1985. - Vol.66. - P. 2685-2691.

12. Adrian Т., Best В., Wigand R. Serologically atypical adenovirus strains of subgenues D are different in their genome from the respective prototypes //Med.Microbiol.Immunol. — 1987. Vol.176, И! 4. - P. 217-224.

13. Adrian Т., Best В., Hierholzer J.CWigand R. Molecular epidemiology and restriction site mapping of adenovirus type 3 genome types //J. Clinical Microbiol. 1989. - Vol. 27» Ш 6. - P. 1329-1334.

14. Adrian Т., de Jong J.C., Wermenbol A.G. et al. Genome type analyses of adenovirus 37 isolates //J.Med.Virol. 1988. -Vol.25. - P. 77-83.

15. Adrian Т., Sassinek J*., Y/igand R. Genome type analysis of 480 isolates of adenovirus types 1,2 and 5 //Arch.Virol. -1990. — Vol. 112. — P. 235-248.

16. Adrian T., Wigand R., Hierholzer J.C. Immunological and biochemical characterization of human adenoviruses from subgenus B. H DUA restriction analysis //Arch.Virol. — 1985. Vol.84. - P. 79-89.

17. Adrian T., VJigand R., Wadell G. Serological and biochemical characteristics of intermediate adenovirus strains of subgenus D //Arch.Virol. 1987- - Vol. 97, K? 3-4. - P. 347-357.

18. Adrian T., Wigand R. Genome type analysis of adenovirus 31, a potential causative agent of infants enteritis //Arch.Virol. 1989. ~ Vol. 105. - P. 81-87.

19. Aird P., King J.J., Jounghusband B. Identification of a new strain of adenovirus type 2 by restriction endonuclease analysis //Gene. 1983. - Vol. 22, If? I. — P. 133-134.

20. Allar a A.K., Wadell G.t Evander K.M., Lindman G.K.K. Specific properties of two enteric adenovirus 41 clones mapped within early region IA //J.Virol. — 1985» — Vol.54, W I. P. 145-150.

21. Araki K"., Ushijima H., Kobayashi M. et al. Molecular epidemiology of enteric adenovirus (Ad 40 and Ad 41) //Bupy-cy « Virus. 1988. - Vol. 38, If? I. - P. 59-68.

22. Arens M. A uniquely homogeneous population of adenovirus3 and 7 genomie types //Abstr. 87th Annu.Me et .Amer. So c .Microbiol., Atlanta, Ga Washington, DC, 1987. - P. 310.

23. Arens I.I., Dilworth V. Remarkably homogeneous population of adenovirus type 3 and 7 genome types //J.Clinical Microbiol.- 1988. Vol.26, IB 8. - P. 1604—1608 •

24. Arrand J.R., Roberts R.J. The nucleotide sequences at the termini of adenovirus 2 DNA //J.Mol.Biol. 1979. - Vol. 128. - P. 577-594.

25. Bailey A.S., Richmond S.J". Genetic geterogeneity of recent isolates of adenovirus types 3*4 and 7 //J.Clin.Microbiol. 1986. - Vol. 24, HI. - P. 30-35.

26. Berencsi G., Dyachenko U.S., Tarassishin L.A. et al. Changes of adenovirus hexon associated with different passage history of Adh I //Acta Microbiol .Hung. 1986. - Vol. 33, n. -P. 233-243.

27. Bhatti A.R., Weber J. Protease of adenovirus type 2 subcellular localization //J.Biol.Chem. 1979. - Vol. 254. -P. I2265-I2268.

28. Bonifas V., Schlesinger R.W. nutritional requirement for plaque production by adenovirus //Fed.Proc. 1959. — Vol. 18. - P. 560.

29. Botstein D., Susslcind . Regulation of lysogeny and the evolution of temperate bacterial viruses //Mechanisms of viral disease /Ed. by V7.S.Robinson, C.F.Fox. Menlo Park, CA, 1974. - P. 363-334.

30. Brown M., Petric M., Middleton P.J. Diagnosis of fastidious enteric adenoviruses 40 and 41 in stool specimens

31. J.Clinical Microbiol. 1984. - Vol.20, B 3. - P. 334-338.

32. Brucova II., Wadell G., Sundell G. et al. An outbreak of respiratory disease due to a type 5 adenovirus identified as genome type 5a //Acta Virol. 1980. - Vol. 24. - P. I6I-I65.

33. Brummitt C.P., Cherrington J.H., Katzenstein D.A. et al.

34. Nosocomial adenovirus infections: molecular epidemiology of an outbreak due to adenovirus 3a //J .Infect .Dis. — 1988.- Vol. 158, I* 2. P. 423-432.

35. Burger H., Doerfler W. Intracellular forms of adenovirus D1IA. III. Integration of the DITA of adenovirus type 2 into host DITA in productively infected cells //J.Virol. 1974.- Vol. 13, m 5. P. 975-992.

36. Chastel C., Adrian T., Demazure M. et al. Molecular epidemiology of two consecutive outbreaks of adenovirus 8 keratoconjunctivitis //J.Med.Virol. 1988. - Vol. 24,2. -P. 199-204.

37. Dery C.V., Teth M., Brown M. et al. The structure of adenovirus chromatin in infected cells //J.Gen.Virol. 1985«- Vol.66, iff 10. P. 2671-2684.

38. DlHalluin J.C., Milleville M., Martin G.R. et al. Morphogenesis of human adenovirus type 2 studied with fiber and penton base-defective temperature sensitive mutants //J»Virol. 1980. - Vol. 33, m I. - P. 88-99.

39. Drouin J. Cloning of human mitochondrial D1TA in Escherichia coli //J.Mol.Biol. 1980. - Vol.140. - P. 15-34.

40. Budding B.A., Viagner S.C., Zeller J.A. et al. Fatal pneumonia associated with adenovirus type 7 in three military-trainees //M.Engl.J.Med. 1972. - Vol. 236. - P. 1289-1292.

41. Edvardsson B., Ustacelebis S., Williams J., Philipson L. Aeembly intermediaty among adenovirus type 5 temperature— -sensitive mutants //J.Virol. 1978. - Vol.25, S? 2. - P. 641-651»

42. Fife K.H., Ashley R., Corey L. Isolation and characterization of six new genome types of human adenovirus type I and 2 //J.Clinical Microbiol. 1985. - Vol. 21. - P.20-23.

43. Fife K.H., Ashley R., Shields A.F. et'al. Comparison of neutralization and D1TA restriction enzyme methods for typing clinical isolates of human adenovirus //J .Clinical Microbiol. 1985. - Vol.22, R X. - P. 95-100.

44. Taint S.J. Adenovirus cytopathology //Comprehensive Tirol. -Hew York ; Plenum Press, 1934. Vol. 19. - P. 297-358.

45. Plint S.J., Broker T.R. Lytic infection by adenoviruses //The molecular biology of tumor viruses Pt2. DITA tumor vi-. ruses (Toose J.) Cold Spring Harbor. -,1980. - P. 433-456.

46. Friefeld B.R., Lichy J.H., Field J. et al. The in vitro replication of adenovirus DITA //Curr.Top .Microbiol, and Immunol. 1934. - Vol. 110. - P. 221—255*

47. Futterer J., Winnakcer E.L. Adenovirus UNA replication //Curr.Top.Microbiol, and Immunol. — 1984. — Vol. III. — P. 41-64.

48. Garon C.F., Berry K.\7., Hierholzer J.C., Rose J.A. Mapping of base sequence heterologies between genomes from different adenovirus serotypes //Virol. 1973. - Vol. 54. - P. 414426. ^

49. Garon C.F., Berry K.W., Rose J .A. A unique form of terminal redundancy in adenovirus DMA molecules //Proc.Natl.Acad.

50. Sci.USA. 1972. - Vol.69. - P. 2391-2395.

51. Gema G., Cattaneo E., Greasig Revello M., Battaglia M. Grouping of human adenoveruses by early antigen reactivity //j.Inf.Dis. 1982. - Vol.45. -P. 678-682.

52. Ginsberg H.S., Ensingler M.J., Kaufman R.S. et al. Cell transformation; a study of regulation with type 5 and T2 adenovirus temperature-sensitive mutants //Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol. X975. - Vol.39. - P. 419-426.

53. Ginsberg H.S., Pereira H.G., Valentine R.C., Wilcox W.C.

54. A proposed terminology for the adenovirus antigens and virion morphological subunita //Virol. 1966. - Vol. 28. -P. 782-783.

55. Green M. Oncogenic viruses //Annu.Rev.Biochem. 1970. -Vol. 39. - P. 701-756.

56. Green M., Mackey J.K., Wold W.S., Rigden P. Thirty-one human adenovirus serotypes (AdI—31) from five groups (A—E) based upon MA genome homologies //Virol. 1979. - Vol. 9.3, № 2. - P.* 481-492.

57. Green Pina M. Biochemical studies on adenovirus multiplication. IY. Isolation, purification and chemical analysis of adenovirus //Virol. 1963. - Vol.20. - P. 199-207.

58. Green M., Wold W.S.M., Mackey J., Rigden P. Analysis of human tonsil and cancer DNA and RITAs for DNA sequences of group C (serotypes 1,2,5 and 6) human adenoviruses //Proc. ITatl. Acad.Sci .USA. 1979. - Vol.76, B 12. - P. 6606-66X0.

59. Guo Deng fu., Shibata R., Shinagawa M. et al. Genomic comparison of adenovirus type 3 isolates from patients with acute conjunctivitis in Japan, Australia and the Philippines //Microbiol. and Immunobiol. 1988. - Vol.32, U8. -P. 833-342.

60. Hammond G.W., Mauthe G., Joshua J,, Hannan O.K. Examination of uncommon clinical isolates of human adenoviruses by restriction endonuclease analysis //J•Clinical Microbiol. 1985. - Vol. 21, ST 4. - P. 6II-6I6.

61. Hassell J.A., Weber J. Genetic analysis of adenovirus 2. VHI. Physical locations of temperature—sensitive mutations //J.Virol. 1978. - Vol.23, R 3. - P. 671-678.

62. Hatch M.H., Siem R.A. Viruses isolated from children with infectious hepatitis //Am.J.Epidemiol. 1966. -Vol. 84,- P. 495-509.

63. Hierholzer J.C., Wigand R., de Jong J.C. Evalution of human adenoviruses 38,39,40 and 41 as new serotypes //Interviro-logy. -.1933. Vol. 29. - P. 1-10.

64. Higuchi M., llakazono VI., Ishii K". et al. Antigenic and restriction endonuclease analyses of new adenovirus types19 and 37 causing acute conjunctivitis //Jap. J .Ophthalmol. —,- 1987. Vol. 3r, Iff 4. - P. 547-557.

65. Horne R.W., Bonner S., V/aterson A.P., Wil'.dy P. The icosa-hedral form of an adenovirus //J.Mol.Biol. -1959. Vol.1.- P. 84-36.

66. Huebner R.J. Adenovirus directed tumor and T-antigens

67. Perspect.Virol. 1967. - Vol. 5. -.P. 147-166.

68. Hyypia T. Detection of adenovirus in nasopharyngeal specimens by radioactive and nonradioactive DITA probes //J. Clin .Microbiol. 1985. - Vol.21, !R 5. - P. 730—733.

69. Xshibashi M., Maizel J.V., Jr. The polypeptides of adenovirus. V. Young virion, structural intermediates between top components and aged virions //Virol. 1974. - Vol. 57, № 3. - P. 409-424.

70. Kaier B., Wigand R. Antigenic homogeneity of adenovirus types 1,2,5 and 6 //J.Med.Virol. 1986. - Vol.18, W 3. -P. 233-287.

71. Kang W.G. Molecular cloning and comparative analysis of the genome of adenovirus type 35 //Ann.Immunol.Hung. — 1986. Vol. 26, № 2. - P. I003-I0I3.

72. Kannemeyer J.R., Brooks L.A., Dumb ell K.R., Keen G.A. Two new genome types of adenovirus 7C //J .Med.Virol. — 1938. Vol, 24, TS X. -,P. I0I-I08.

73. Kathmann P., Schick J., Winnacker E.L., Doerfler Yf. Isolation and characterization of temperature-sensitive mutants of adenovirus 2 //J.Virol. 1976. - Vol. 19. - P. 43-53.

74. Kelly T.J. Adenovirus DNA replication //The adenoviruses (Ginsberg H.S.) Hew York, London; Plenum Press. -1984.- P. 271-308»

75. Kemp M.C., Hierholzer J.C. Three adenovirus type 8 genome types defined by restriction enzyme analysis: prototype stability in geographically separated populations //J.Clin. Microbiol. 1986. - Vol, 23, m 3. - P. 469-474.

76. Kidd A»H. Genome variants of adenovirus 41 (subgroup G) from children with diarrhea in South Africa //J.Med.Virol.- 1984» Vol.14. - P. 49-59.

77. Kidd A.H., Berkowitz F.E., Blaskovic P.J., Schoub B.D. Genome variants of human adenovirus 40 (subgroup F) //J. Med .Virol. 1984. - Vol. 14, U 3. - P. 235-246.

78. Kidd A.H., Harley E.H., Erasmus M.J. Specific detection and typing of adenovirus types 40 and 41 in stool specimens by dot-blot hybridisation //J .Clin.Microbiol. 1985. -Vol. 22, Hi 6. P-» 934-939.

79. Ledinko II. Temperature sensitive mutants of adenovirus type 12 defective in viral DNA synthesis //J.Virol. 1974.- Vol. X4. P. 457-468.

80. Li Q.-G., Wadell G. Analysis of 15 different genome typesof adenovirus type 7 isolated on five continents //J.Virol. 1986. - Vol. 60, B I. - P. 331-335.

81. Li Q.-G., Wadell G. The degree of genetic variability among adenovirus type 4 strains isolated from man and chimpann zee //Arch.Virol. 1988. - Vol. 101, H? T.-2. -P. 65-77.

82. Li Q»—G.r Wadell G. Comparison of 17 genome types of adenovirus type 3 identified among strains recovered from six continents //J.Clin.Microbiol. — 1988. Vol.26, its 5.- P. I009-IOI5.

83. Liebowitz J., Horwits M.S. Synthesis and assembly of adenovirus type 2 polypeptides. H. Reversible inhibition of hexon assembly at 42° //Virol. 1974. - Vol. 61. - P. 129-139.

84. Liebowitz J., Horwitz M.S. Synthesis and assembly of adenovirus polypeptides. III. Reversible inhibition of hexon assembly in adenovirus type 5 temperature-sensitive mutants //Virol. 1975* - Vol. 66. - P. 10-24.

85. Lutter L.C. Precise location of DITase I cutting sites in the nucleosome core determined by high resolution gel electrophoresis //iTucl.Acids Res. 1979« - Vol. 6. — P. 41-56.

86. Mak S. Transcription and replication of viral deoxyribo—nucleic acid in cells coinfected with adenovirus types 2 and 12 //J.Virol. 1969. - Vol. 4. - P. 651-656.

87. Uak X., Ezoe H., Mak S. Structure and function of adenovirus type 12 defective virions //J.Virol. 1979. - Vol. 32, № I. -.P. 240-250.

88. Meinschad C., Ullrich K., Winnacker E.-L. Recombination events in adenovirus infected cells //Zbl.Bakteriol, IAbt. Orig.A. 1980. - Abt.I, o Vol. A246, B 4. - P. 463-464.

89. Munz P.L., Young C.S.H. Polarity in adenovirus recombination //Virol. 1984. - Vol. 135, B 2. - P. 503-5X4»

90. Neumann R., Burkhar «It U., Eggers H.J. Detection of adenovirus DITA sequences in DNA isolated from human tonsilsand from cell cultures established from tonsillar tissue //Zbl.Bakteriol., Mikrobiol. und Hyg. 1985. - V0I.A26O, № 4. - P. 499.

91. Neumann R., Genersch E., Eggers H.J. Detection of adenovirus nucleic acid sequences in human tonsils in the absence of infectious virus //Virus Res. 1987. - Vol.7,1.f I. P. 92-97.

92. Neumann R., Liedhegner 0., Genersch E., Eggers H.J. Persistent infections of humans with adenoviruses //Zbl.Bakteriol .»Mikrobiol . und Hyg. 1987. - Vol. A267, »-I. -P. 138.

93. Noda M., Otagaki Y», IkedaV. et al. Genome types of adenovirus types 19 and 37 isolated from patients with conjunctivitis in Hiroshima City //J .Med.Virol. 1988.vol. 26, m 1. p. 15-22.

94. Norrby E. The structural and functional diversity of adenovirus capsid components //J.Gen.Virol. 1969. - Vol.5, in 2. - P. 221-236.

95. Norrby E., Bartha A., Boulanger P. et al. Adenovirid6e //Intervirology. 1976. - Vol.7, K8 I. - P. II7-I25.

96. Peng Z.-V7., Song Z.-J., Li J.-T., Hong J.-R. Epidemicoutbreaks of pharyngoconjunctival fever caused by adenovirus 7 //Chin.J.Pediatr. 1982. - Vol.20. - P. 248. /

97. X26. Reed I.J., Muench H. Simple method of estimating fifty per cent endpoints //Amer.J.Hyg. 1938. - Vol. 27. - P. 493-497.

98. X27. Robinson C.C., Tibbets C. Polar encapsidation of adenovirus DNA: evolutionary variants reveal dispensable sequences near the left ends of Ad 3 genomes //Virol. — 1984. Vol. 137. - P. 276-286.- 2П

99. Rosahl Т., Doerfler W. Predominant association of adenovirus type 12 ША with human chromosome I early in productive infection //Virol. 1988. - Vol. 162, W 2. — P. 494-497.

100. Rose H.M., Lamson Т.Н., Buescher E.L. Adenovirus infection in military recruits //Arch.Environ.Helth. 1970. -Vol. 21. - P. 356-361.

101. Rosen L. A hemagglutination-inhibition technique for typing adenoviruses //Amer.J.Hyg. I960. - Vol. 71, Ш I. - P. X20-126.

102. X3I. Rowe W.P., Hartley J.W., Huebner R.J. Serotype composition of the adenovirus group //Proc.Soc.Exp.Biol.Med. — 1958. Vol. 97. - P. 465-470.

103. X32. Russel W.C., Patel G., Precious B. et al. Monoclonal antibodies against adenovirus type 5: preparation and preliminary characterization //J. Gen.Virol. I98X. - Vol. 56, Ш 2. - P. 393-403.

104. Sambrook J. The evolution of the adenoviral genome //Ann. IT.Y.Acad.Sci. 1980. - Vol.354, Ш 3. - P. 426-452.

105. X34. Sambrook J.t Williams J., Sharp P.A., Grodzicker T. Physical mapping of temperature-sensitive mutations of adenoviruses //J.MoI.Biol. 1975. - Vol. 97, $ 3. - P. 369390.

106. Salas M. A new mechanism for the initiation of replication of^29 and adenovirus D1TA: priming by the terminal protein //Curr.Top.Microbiol. and Immunol. 1983. - Vol. 109. —1. P. 89-106.

107. Sawada H., Aoki K., Kawane R. et al. Molecular epidemiology of adenoviral conjunctivitis in Sapporo, Japan, and Manila, the Philippines //Jap.J.Ophthalmol. 1987. - Vol.31, ü 4. P. 533-546.

108. Schmitz H., Wigand R., Heinrich W. Worldwide epidemiology of human adenovirus infections //Am.J.Epidemiol. 1983.- Vol. 117. — P. 455-466.

109. Shiroki K., Irisawa J., Shimojo H. Isolation and preliminary characterization of temperature-sensitive mutants of adenovirus 12 //Virol. 1972. -Vol. 49. - P. I-II.

110. Shiroki K.,Saito I., Maruyama K., Shimojo H. Isolation of a nondefective recombinant between adenovirus type 5 and early region IA of adenovirus type 12 //J.Virol. — 1983. ~ Vol. 46, m 2. P. 632-637.

111. Sirailä S., Linna 0.^ lanning P. et al. Chronic lung damage caused by adenovirus type 7: a ten-year follow-up study //Chest. 1981. - Vol.80. - P. I27-I3I.

112. T4I. Steenberg P.H., Maat J., ran Ormondt H., Sussenbach J.S. The sequence at the termini of adenovirus type 5 DNA //Nucleic Acids Res. 1977. - Vol.4. - P. 4371-4389.

113. Spaeren U., Waldeck W., Eliasson R. Hybridization method for quantitation of replicating polyoma DNA sequences //Anal.Biochera. 1979. - Vol.96. - P. 378-383.

114. Sundquist B., Everitt E., Philipson L. et al. Assembly of adenoviruses //J.Virol. 1973. - Vol. II, if 3. -,P. 449-459.

115. Suzuki E., Shimojo H. A temperature-sensitive mutant of adenovirus 31 is defective in viral DNA replication //Virol. -.1971. Vol. 43. - P. 488-494.

116. Svensson L., Wadell G., Uhnoo.I. et al. Cross-reactivity between enteric adenovirus and adenovirus type 4: analysis of epitopes by solid-phase immune electron microscopy //J. Gen .Virol. -,1983. Vol. 64. - P. 2517-2520.

117. Takafugi E.T., Gaydos J.C., Allen R.G., Top E.H.Jr. Simultaneous adnrLnietration of live, enteric and coated adenovirus types 4, 7 and 21 vaccines; safety and iiratminogeni-city //J.Infect.Dier. 1979. - Vol. 140. - P. 48-53.

118. Takemori N. Genetic studies with tumorigenic adenoviruses HI. Recombination of adenovirus type 12 //Virol. 1972. -/Vol.47. - P. 157-167.

119. Takemori N., Riggs J.L., Aldrich C. Genetic studies with tumorigenic adenoviruses. I.Isolation of cytocidal (cyt) mutants of adenovirus type 12 //Virol. 1968. - Vol. 36. - P. 575-596.

120. Takiff H.E., Seidlin M"., Krause P. et al. Detection of enteric adenoviruses by dot—blot hybridization using a mole-culary cloned viral DNA probe //J.Med.Virol. 1985. - Vol. 16, m 2. - P. I07-II8.

121. Turner M., Istre G.R., Beauchamp H. et al. Community outbreak of adenovirus type 7a infections associated with a swimming pool //South.Med.J. 1987. - Vol. 80, ff 6. - P. 712-715.

122. Tyrrell D.A.J., BalduccI D., Zaiman T.E. Acute infections of the respiratory tract and adenoviruses //Lancet. 1956. - Vol. ii. - P. 1326-1330.

123. Umene K. Restriction endonucleases recognizing DNA sequences of four base pairs facilitate differentiation of herpes simplex virus type I strains //Arch.Virol. 1987. -Vol.97, 9 3-4. - P* 197-214.

124. Victanelc M., Laalcsonen M., Soderlund H. et al. Hovel test for rapid viral diagnosis; detection of adenovirus in na-sopharyngeal mucus aspirates by means of nucleic-acid sandwich-hybridization //Lancet. 1953. - Yol. X, 8321.- P. 381-333.

125. X63. V/adell G. Classification of human adenoviruses by SD3polyacrylamide gel electrophoresis of structural polypeptides //Intervirilogy. 1979. - Vol. II, I I. - P. 47-57.

126. Wadell G. Molecular epidemiology of human adenoviruses //Curr.Top.Microbiol, and Immunol. 1984. — Vol. 110. — P. 191-220.

127. Wadell G., Cooney M.K., da Costa Linhares A. et al. Molecular epidemiology of adenoviruses; global distribution of adenovirus 7 genome types //J.Clin.Microbiol. 1985. -Vol. 21, ffi 3. ~ P. 403-408.

128. Wadell G., Hammarskj51d M.-L., Varsanyi T. Incomplete virus particles of adenovirus type 16 //J.Gen.Virol. 1973.- Vol. 20, W 2. -P. 287-302.

129. Vtedell G., Hammarskjtfld M.-L., Winberg G. et al. Genetic variability of adenoviruses //Ann.lT.Y.Acad.Sci. 1980. — Vol. 354, W I. - P. 16-42.

130. Wadell G., de Jong J.C. Restriction endonucleases in identification of a genome type of adenovirus 19 associated v/ith Keratoconjunctivitis //infect, and Immun. -. 1980. — Vol. 27, m 2. P. 292-296.

131. Wadell G., Varsanyi T.M. Demonstration of three different subtypes of adenovirus type 7 by DTTA restriction site mapping //Infect, and Immun. 1978. - Vol. 21, № I. - P. 238-246.

132. Vfadell G., Varsanyi T.M., lord A., Sutton R.N.P. Epidemic outbreaks of adenovirus type 7 with special reference to the pathogenicity of adenovirus genome type 7b //Am.J.Epidemiol. 1980. - Vol. H2. - P. 619-628.

133. T74. Webb D.H., Shields A.F., Fife K.H. Genomic variation of adenovirus type 5 isolates recovered from bone marrow transplant recipients //J.Clin.Microbiol. 1987. - Vol.25, » 2. - P. 305-308.

134. Weber J., Begin M., Cartens E.B. Genetic analysis of adenovirus type 2. TV.Coordinate regulation of polypeptides 80K, IHa and V //Virol. 1977. - Vol. 76. - P. 709-724.

135. Weber J.M., Dery C.V., Mirza M.A. et al. Adenovirus DNA synthesis is coupled to virus assembly //Virol. 1985. -Vol. 140, IS 2. - P. 351-359♦

136. Werner G., Zur Hausen H. Deletions and insertions in adenovirus type 12 DNA after viral replication in VERO cells //Virol. 1978. - Vol. 86, M I. - P. 66-77.

137. Wigand R., Adrian T., Sehn N., Hierholzer J.C. Serological and biochemical characterization of subgenus B adenovirus //Zbl. Bakteriol .Mikrobiol. und Hyg. 1984. - Vol. A257, M I. - P. 166.

138. Wigand R., Bartha A., Dreizin R.S. et al. Adenoviridaej second report //intervirology. 1982. - Vol. 18, B I. -P. 169-176.

139. Wigand R., Baumeister H.G., Maass G. et al. Isolation and identification of enteric adenoviruses //J.Med.Virol. -1983. -Vol. II. -P. 233-240.

140. Wigand R., Gelderblom H., Ozel M. et al. Characterization of mastadenovirus h8, the causative agent of epidemic keratoconjunctivitis //Arch.Virol. 1983. - Vol. 76, IS 4. -P. 207-3X9.

141. Williams J.P., Young H., Austin P. Genetic analysis of human adenovirus type 5 in permissive and nonpermissivecells //Cold Spring Harbor Symp .Quant .Biol • 1315* - Vol. 39. - P. 427-437.

142. Tfolfson J., Dressier D. Adenovirus MA contains an inverted terminal repetition //Proc.Natl.Acad.Sci.USA -1972. -Vol. 69. P. 3054-3057.

143. Zahradnicek S., Adrian T., Spazierer J. The genetic variability of adenoviruses; a comparison of AV4 and AVI6 genome types //Zbl. Bakteriol.Mikrobiol. und Hyg A. 1987* - Vol. A264, HT 1-2. - P. 276.