Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Фёдорова, Оксана Фёдоровна

• Фёдорова, Оксана Фёдоровна
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фёдорова, Оксана Фёдоровна

I. ВВЕДЕНИЕ.

П.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Значимость РВГЭ в инфекционной патологии детей на современном этапе.

2. Структурная и молекулярная организация ротавириона.

2.1. Вирион и его структурные белки.

2.2. Неструктурные белки ротавируса.

2.3. Геном.

3. Разнообразие G[P] типов ротавирусов.

3.1. G[P] типы ротавируса человека и их распределение в мире.

3.2. Механизмы изменчивости и возникновения новых G[P] типов ротавирусов.

3.3. Разработка ротавирусной вакцины.

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

1. Исследуемые объекты.

2. Иммуноферментный анализ.

3. Электронная микроскопия.

4. Электрофоретипирование РНК ротавирусов в ПААГ.

5. Обратная транскрипция-полимеразная цепная реакция.

6. G и [Р]-генотипирование ротавирусов с использованием ПЦР.

7. Определение нуклеотидной последовательности гена энтеротоксина NSP4.

8. Статистический анализ результатов.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Разработка методологии [Р]-генотипирования ротавирусов.

1.1. Оптимизация метода ОТ-ПЦР для выявления РНК гена VP4 и оценка его эффективности.

1.2. Оптимизация метода ОТ-ПЦР для [Р]- генотипирования ротавирусов.

2. Особенности циркуляции ротавирусов разных G[P] типов в Нижегородской области в 1997-2005 гг.

2.1. Электрофоретипирование РНК ротавирусов.

2.2. G и [Р] генотипирование природных изолятов ротавируса и анализ их распределения

2.3. Определение субтипа ротавирусов Р[8] генотипа.

2.3.1. Разработка методики субтипирования аллелей гена VP4 генотипа Р[8].

2.3.2. Анализ смены субгенотипа в процессе многолетней циркуляции ротавирусов G1P[8] типа.

2.3.3. Клинические проявления РВГЭ, вызванного ротавирусом типа G1P[8]-2.

3. Молекулярно - биологическая характеристика ротавирусов, выделенных от новорожденных детей.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация, молекулярно-биологическая характеристика и анализ циркуляции ротавирусов разных G[P] типов»

Актуальность проблемы. Ротавирусы (семейство Reoviridae, род Rotavirus) являются основным этиологическим агентом острого гастроэнтерита у детей первых лет жизни. Анализ исследований, опубликованных в период с 1986 по 2000 годы показал, что каждый год в мире регистрируется 111 млн эпизодов ротавирусного гастроэнтерита, 25 млн визитов в клинику, 2 млн госпитализаций и 352,000-592,000 (в среднем 440 тыс.) смертей среди детей в возрасте до 5 лет [144], что определяет необходимость разработки ротавирусной вакцины и совершенствования эпиднадзора за инфекцией. К настоящему времени в мире накоплена обширная информация об экстраординарном генетическом и антигенном многообразии ротавирусов. Среди ротавирусов человека группы А различают 10 G серотипов (детерминируются гликопротеином VP7), 9 «Р»-серотипов (детерминируются протеазочувствительным белком VP4) и И [Р]-генотипов. Гены, кодирующие VP4 и VP7, могут подвергаться независимому перераспределению, что увеличивает многообразие природных штаммов ротавируса, за счет существования различных комбинаций G и [Р] [163].

К настоящему времени показано существование географических различий в распространенности различных серотипов и генотипов ротавируса, установлен факт их временного перераспределения, зафиксировано появление большого количества нетипируемых штаммов и постоянно сообщается о находках новых, эпидемически значимых вариантов ротавируса [68]. В связи с этим для разработки универсальной вакцины и оценки эффективности уже разработанных вакцин необходимо знание антигенного (генетического) спектра ротавирусов, распространенных на той или иной территории, и проведение мониторинга за циркуляцией ротавирусов разных G[P] типов. Такие исследования в мире носят широкомасштабный характер [185]. Однако в России научные работы подобного плана не проводятся. Ранее в Нижегородском НИИЭМ было проведено изучение генетических и антигенных вариантов РВ, доминировавших на Европейской территории России в 1984-96 гг. Были получены новые данные об особенностях многолетней циркуляции ротавирусов основных G серотипов и прослежены последовательные сдвиги во времени от одного доминирующего варианта вируса к другому. В тоже время исследований по изучению разнообразия [Р]-генотипов ротавируса, G[P] ассоциаций, их распределению и установлению особенностей смены [Р]-генотипа РВ, не проводилось.

Цель исследования: оптимизация метода ОТ-ПЦР для [Р]-генотипирования ротавирусов, изучение временных особенностей циркуляции ротавирусов разных G[P] типов и их молекулярно-биологическая характеристика.

Задачи исследования:

1. Оптимизировать метод ОТ-ПЦР для выявления гена VP4 ротавирусов группы А и дать оценку его эффективности.

2. Разработать праймеры для идентификации [Р]-генотипов и Р[8] субтипов ротавирусов.

3. Определить электрофоретипы РНК и G[P] типы ротавирусов, обнаруженных на территориях г. Нижнего Новгорода и г. Дзержинска в период 1997-05 гг., рассчитать их относительное распределение.

4. Изучить особенности смены доминирования субтипов Р[8]-1 и Р[8]-2 в процессе многолетней циркуляции ротавирусов G1P[8] типа.

5. Дать сравнительную характеристику клинических проявлений инфекции, вызванной ротавирусами генотипов G1P[8]-1 и GlP[8]-2.

6. Охарактеризовать молекулярно-биологические свойства ротавирусов, выделенных от новорожденных детей.

Научная новизна и практическая значимость работы:

Оптимизирован метод ОТ-ПЦР для обнаружения РНК ротавирусов разных электрофоретипов, эффективный в отношении штаммов, актуальных для России, что может служить основой для создания диагностической амплификационной тест-системы.

Впервые рассчитано распределение G[P] типов ротавируса, идентифицированных на двух территориях Нижегородской области в 1997-05 гг. Территории городов Нижний Новгород и Дзержинск являются единственными в Российской Федерации, для которых установлен антигенный профиль природных штаммов РВ, что может быть использовано для оценки эффективности применения разработанных в мире ротавирусных вакцин.

Разработан способ субтипирования аллелей гена VP4 генотипа Р[8] с использованием ПЦР. Научная новизна подтверждена патентом (Патент № 2264469, приоритет от 24 ноября 2003 года).

Разработана новая технология G[P] генотипирования ротавирусов с использованием полимеразной цепной реакции, включающая: набор оригинальных праймеров, совместимых для мультиплексной постановки, контрольную постановку и универсальную программу амплификации. Рекомендована к утверждению расширенным заседанием Секции по эпидемиологии, инфекционным болезням и вирусологии Ученого совета МЗ РФ (Пр. № 168-уч. от 6 декабря 2004 года).

Впервые показаны связанные с субгенотипом Р[8] различия в клинических проявлениях ротавирусной инфекции, свидетельствующее о существовании «респираторного» (G1P[8]-1) и «кишечного» вариантов ротавируса GlP[8]-2.

Выявлен и охарактеризован новый вариант ротавируса генотипа G9P[6]NSP4(A), вызывающий бессимптомную инфекцию у новорожденных детей.

Впервые определена первичная структура гена NSP4 трех российских изолятов ротавируса с генотипом G9P[6]NSP4(A) (DQ270101, DQ270102, DQ270103), что расширяет представления о вариабельности гена энтеротоксина NSP4 ротавируса в мире.

Внедрение результатов исследования в практику:

В процессе работы была установлена этиологическая роль РВ в возникновении 2454 эпизодов ОКИ. Результаты использованы в официальной статистике. При оперативном проведении исследований результаты использовались лечащим врачом для выбора адекватной стратегии лечения детей.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Оптимизированные и разработанные праймеры для обнаружения РНК ротавирусов группы A (Ro4-l, Ro4-2), для идентификации [Р]-генотипа (P[4]R, P[8]R) и субгенотипа Р[8] (R-P[8]-l, R-P[8]-2), обеспечивают генотипирование штаммов ротавируса, актуальных для территорий России.

2. Спектр G[P] типов ротавирусов циркулировавших среди детей на территории Нижегородской области в период 1997-05 гг. включает основные G1-4 серотипы и Р[4], Р[6], Р[8], Р[9] генотипы, представленные семью G[P] комбинациями, распределение которых изменяется во времени.

3. Особенностью циркуляции ротавируса G1P[8] является постоянное доминирование, поддерживаемое сменой субтипа Р[8]-генотипа, сопровождающейся изменениями в клинических проявлениях инфекции.

4. Ротавирус, обнаруженный у новорожденных детей с бессимптомной формой инфекции имеет генотип G9P[6]NSP4(A) и реорганизованный 11-й геномный сегмент.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены:

• на VII Нижегородской сессии молодых ученых (г. Н. Новгород, 2002 г.);

• на заседании Нижегородского научного биохимического общества (г. Н.

Новгород, 2004 г.);

• на заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной и проблемных научнопрактических семинарах института.

Диссертация апробирована на межлабораторной конференции Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии 15 декабря 2005 г.

Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 145 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 192 источника литературы отечественных и зарубежных авторов. Диссертация иллюстрирована 18 рисунками и 9 таблицами.

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Фёдорова, Оксана Фёдоровна

VI. ВЫВОДЫ:

1. Показано, что метод ОТ-ПЦР для выявления гена VP4 ротавируса группы А на основе оптимизированных праймеров Ro4-l и Ro4-l универсален в отношении ротавирусов разных [Р]-генотипов и позволяет повысить относительную чувствительность выявления ротавирусов в клиническом материале по сравнению с РНК-ПААГ на 18,9%, по сравнению с ИФА на 24,5%.

2. Разработаны оригинальные версии праймеров для идентификации генотипов Р[4], Р[8] и субгенотипов Р[8]-1 и Р[8]-2, адаптированные к вариантам ротавируса, актуальным для территорий России.

3. Установлено, что в период 1997-05 гг. на территории Нижегородской области циркулировали ротавирусы семи G[P] типов: G1P[8] (78,6%), G1P[6] (2,6%), G2P[4] (9,0%), G3P[8] (4,6%), G3P[6] (0,9%), G3P[9] (1,3%) G4P[8] (2,6%), н/т (0,4%). В сезон 2004-05 гг. зафиксировано перераспределение генотипов ротавируса: G1P[8] (24%), G2P[4] (37%), G3P[8] (21%), G3P[9] (3,8%), G4P[8] (12%), н/т (2%).

4. Показано, что ротавирус G1P[8] типа имеет как минимум два субгенотипа Р[8], перераспределение которых во времени поддерживает активную циркуляцию вариантов ротавируса серотипа G1. Период 1997-05 гг. в Нижегородской области характеризовался доминированием ротавирусов генотипа Р[8]-2 (75,1%) .

5. Впервые показаны связанные с субгенотипом Р[8] особенности в клинических проявлениях РВГЭ. Установлено, что эпидемически значимый вариант ротавируса GlP[8]-2-61 вызывает гастроэнтерит, характеризующийся интенсивным диарейным синдромом и отсутствием или слабой выраженностью симптомов ОРВИ.

6. Обнаружен и охарактеризован новый необычный вариант ротавируса генотипа G9P[6]NSP4(A) с реорганизованным 11-м геномным сегментом, вызывающий бессимптомную инфекцию у новорожденных детей.

V. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Отсутствие знаний о G[P] типах природных штаммов ротавируса, распространенных на территориях России, и необходимость оптимизации методик [Р]-генотипирования, определили актуальность проведения настоящего исследования.

Работа посвящена изучению разнообразия G[P] типов ротавируса группы А человека, анализу их временного распределения и комплексной характеристике природных штаммов ротавируса, изолированных на двух относительно удаленных территориях России в период 1997-05 гг., с использованием оптимизированных и разработанных методик ОТ-ПЦР для обнаружения и [Р]-генотипирования РНК.

Необходимость периодического проведения исследований по оптимизации методик ОТ-ПЦР для обнаружения и генотипирования РНК ротавируса и адаптации их к местным штаммам постулируется в научной литературе, так как в процессе длительной циркуляции ротавирусов может произойти накопление мутаций в области типовых праймеров, что снижает эффективность применяемых методик. Наиболее актуальны такие исследования в отношении гена VP4 ротавируса, т.к. праймеры, используемые для идентификации G типа находятся в консервативных областях, кодирующих серотиповые детерминанты.

На первом этапе работы была проведена оптимизация метода ОТ-ПЦР для обнаружения РНК гена VP4. С использованием программы «GeneDoc» был проведен сравнительный анализ 56-ти выровненных нуклеотидных последовательностей гена VP4, представленных в GenBank/EMBL/DDBJ к началу наших исследований. Установлено, что в области универсальных праймеров для обнаружения РНК гена VP4, предложенных ранее Gentsch J. R. с соавторами (праймеры conl и соп2) наблюдается вариабельность последовательностей. Мы оптимизировали данные праймеры с учетом имеющихся нуклеотидных замен путем введения вырожденных оснований и создали собственную версию универсальных праймеров. Праймеры Ro4-l и

Ro4-2, предложенные нами, фланкируют фрагмент гена VP4 размером 211 н.о., расположенный в области с 676 по 887 н.о. Проведена теоретическая оценка специфичности разработанных праймеров путем сравнительного анализа последовательностей праймеров и 15-ти нуклеотидных последовательностей генома ряда кишечных вирусов (энтеровирусов, астровирусов, калицивирусов, аденовирусов, ротавирусов групп А и С). Анализ показал, что оптимизированные олигонуклеотиды специфичны в отношении гена VP4 ротавирусов группы А человека и животных и не имеют существенной гомологии с другими нуклеотидными последовательностями генома кишечных вирусов.

Теоретическая специфичность праймеров была подтверждена экспериментально на 150-ти коллекционных природных штаммах ротавируса группы А, имеющих различные электрофоретипы РНК - «длинные», геногруппа Wa; «короткие», геногруппа DS-1; «широкие», геногруппа AU-1; «аномальные». В результате однораундовой ПЦР с использованием собственной версии праймеров РНК ротавируса данных геногрупп была обнаружена в 100% случаев, что подтверждает их универсальность в отношении различных аллелей гена VP4.

Проведено сравнение эффективности обнаружения ротавирусов у больных с диагнозом острый гастроэнтерит с использованием разработанной методики ОТ-ПЦР и методов РНК-ПААГ и ИФА на основе поликлональных антител. При исследовании случайной выборки из 233 образцов фекалий от детей с ОКИ ротавирусы были обнаружены методом ИФА в 47,6±3,3 % случаев, методом РНК-ПААГ - в 45,9±3,3 %, с использованием ОТ-ПЦР гена VP4 - в 57,9±3,2 % случаев (р<0,01). Достоверно более высокий процент положительных находок, полученных при использовании ОТ-ПЦР, наглядно демонстрирует относительно большую результативность метода генодиагностики, которая, несомненно, связана с его высокой аналитической чувствительностью. В наших исследованиях результаты обнаружения ротавирусов с использованием ОТ-ПЦР и РНК-ПААГ совпали на 88,4 %, ОТ

ПЦР и ИФА на 76,0 %, электрофореза РНК и ИФА - в 80,2 % случаев. Совпадение положительных и отрицательных результатов в трех используемых методах составило 72,1 ±2,9 %. Для установления относительной чувствительности метода ОТ-ПЦР был исследован 151 образец фекалий, положительный на ротавирусы по итогам трех методов. Установлено, что метод ОТ-ПЦР, основанный на праймерах Ro4-l и Ro4-2, при индикации РВ в клиническом материале обладает относительной чувствительностью, превосходящей метод РНК-ПААГ на 18,9%, метод ИФА - на 24,5%. Полученные результаты имеют практическое значение, т.к. оптимизированная лабораторная методика, адаптированная к российским штаммам ротавируса, может служить основой для конструирования диагностической тест-системы на основе ОТ-ПЦР.

Проведенная теоретическая разработка и лабораторные испытания показали, что метод ОТ-ПЦР на основе праймеров Ro4-l и Ro4-2 универсален в отношении ротавирусов различных [Р]-генотипов, что позволило использовать его для контрольной постановки, подтверждающей наличие гена VP4 в пробе при генотипировании природных штаммов ротавируса.

Следующим этапом работы явилась оценка эффективности известных методик и схем G и [Р]-генотипирования и их применимости для анализа местных штаммов ротавируса.

Методология определения G серотипа с использованием ОТ-ПЦР, представленная в научной литературе, основана на праймерах, расположенных консервативных областях последовательности гена VP7, кодирующих серотиповые детерминанты. При этом показана строгая корреляция между G генотипом и G серотипом ротавируса. В наших исследованиях была применена схема G типирования, разработанная Das В.К. с соавторами (1994 г.). Однако в процессе работы возникла необходимость ее модификации. Если праймеры, предложенные для определения Gl, G2, G4, и G9, на наших штаммах работали стабильно, то праймер для G3 серотипа давал неоднозначные результаты. В совместной работе с Н.В. Епифановой была сконструирована оригинальная стабильно работающая версия праймера G3R. В качестве прямого общего праймера GF также была использована другая версия, предложенная И.Н. Бессараб с соавторами (1990 г.).

Для определения [Р]-генотипа штаммов ротавируса использовали схему, предложенную Gentch J.R. с соавторами (1992 г.). Однако при работе с праймерами 2Т-1 и 1Т-1 для идентификации генотипов Р[4] и Р[8], соответственно, возникли сомнения в их специфичности. Так, при анализе выборок штаммов ротавируса, выделенных в один эпидсезон на одной территории и имеющих один ЭФ-тип РНК, что предполагает их клональное родство, часть штаммов типировалась с использованием праймеров, предложенных Gentch J.R., а часть нет. В связи с этим был проведен сравнительный анализ 56 полных выровненных нуклеотидных последовательностей гена VP4 в области типовых праймеров. Установлено, что наибольшее количество нуклеотидных замен находится в регионах, принадлежащих олигонуклеотидам, определяющим генотипы Р[8] и Р[4], что свидетельствовало о необходимости их оптимизации. Праймеры для идентификации генотипов Р[6] и Р[9] не требовали модификации. С учетом обнаруженной вариабельности последовательности нуклеотидов в регионах типовых праймеров нами сконструированы модифицированные праймеры R-Р[4]т и R-P[8]m, имеющие в ряде позиций вырожденные основания и нуклеотидные замены. Апробация собственных версий олигонуклеотидов показала их эффективность в отношении штаммов РВ, актуальных для изучаемых территорий и дававших неоднозначные результаты при использовании исходных версий праймеров.

Кроме модификации праймеров для обнаружения РНК гена VP4 и идентификации генотипов Р[8], Р[4] и G3, была разработана универсальная программа амплификации специфических фрагментов кДНК и подобраны пулы совместимых типовых праймеров для мультиплексной постановки. Разработанная методология определения G[P] типа и метод электрофоретипирования РНК ротавирусов были использованы для изучения природных штаммов ротавируса группы А человека, обнаруженных на территориях России (г. Н.Новгород, г. Дзержинск и г. Омск) в период 1997-05 г.

С использованием молекулярно-генетических методов были исследованы 4950 образец фекалий от детей в возрасте до 14 лет с диагнозом ОКИ из г. Н. Новгорода и 1595 образцов из г. Дзержинска. Ротавирусы обнаружены в 1774 (35,8+0,68%) и 748 (46,9+1,25%) случаях, соответственно. Среди заболевших 91% составили дети в возрасте до 3-х лет. Среднемноголетний показатель заболеваемости РВГЭ детей в данной возрастной группе составил для г. Н. Новгорода - 7 о/оо, для г. Дзержинска — 15 о/оо. По всей вероятности высокий уровень заболеваемости РВГЭ детей г. Дзержинска связан с экологическим фактором, т.к. территория г. Дзержинска является зоной экологического неблагополучия. Результаты обнаружения ротавирусов у детей с ОКИ сообщались в Центр СЭН в Нижегородской области, где использовались в официальной статистике. При оперативном проведении исследований результаты сообщались лечащему врачу для выбора адекватной стратегии лечения детей.

Проведено изучение генетической гетерогенности обнаруженных ротавирусов. С использованием электрофоретипирования в ПААГ было идентифицировано 60 профилей миграции сегментов РНК: 35 вариантов «длинных» Wa-подобных, 12 вариантов «коротких» DS-1-подобных и 13 вариантов «широких» Аи-1 подобных ЭФ-типов РНК. Доминирующим генетическим вариантом на обеих территориях явился 61-й ЭФ-тип РНК, на долю которого пришлось 39,0% и 38,5% на территории г. Н. Новгорода и г. Дзержинска, соответственно. Следует отметить, что доминирующие генетические варианты ротавируса, обнаруженные в г. Н. Новгороде и г. Дзержинске, были идентичны. Идентифицировано 28 общих вариантов ротавируса. В тоже время в г. Н. Новгороде выявлено 26 вариантов РВ, которые не обнаружены в изолятах из г. Дзержинска. Среди штаммов РВ из г. Дзержинска обнаружено только 6 вариантов вируса, характерных для данной территории. Большая гетерогенность популяции РВ в г. Н. Новгороде может быть связана как с большим числом типированных изолятов РВ, так и с более интенсивной миграцией населения.

Проведено определение G серотипа и [Р]-генотипа природных штаммов ротавируса с доминирующими и необычными ЭФ-типами РНК, собранных в анализируемый период времени на обеих территориях. Проанализирован 1721 ротавирус-содержащий образец из г. Н. Новгорода и 733 изолята РВ из г. Дзержинска. В ходе исследования установлено, что на обеих территориях выявляются ротавирусы основных глобально распространенных G1-4 серотипов в комбинациях с одинаковым спектром [Р]-генотипов. Эти результаты послужили основанием для расчета распределения антигенных типов РВ по суммарным данным обеих территорий.

Рассчитано распределение G серотипов ротавируса: G1 - 81,3%; G2 -8,9%; G3 - 6,8%; G4 - 2,6%; G9 - 0%; и/т - 0,4%.

Рассчитано распределение [Р]-генотипов ротавируса: Р[8] - 85,8 %; Р[4] -8,9%; Р[6] - 3,5 %; Р[9]-1,3%; н/т- 0,4%.

Рассчитано распределение G[P] типов ротавируса: G1P[8] — 78,6%; G1P[6] - 2,6%; G2P[4] - 9,0%; G3P[8] - 4,6%; G3P[6] - 0,9%; G3P[9] - 1,3%; G4P[8] - 2,6%; h/T - 0,4%.

Из представленных результатов видно, что на территориях г. Н. Новгорода и г. Дзержинска Нижегородской области России циркулируют ротавирусы, относящиеся как минимум к 7-ми антигенным типам. Данное распределение, рассчитанное нами впервые и свидетельствующее об абсолютном доминировании на изученной территории Нижегородской области ротавируса G1P[8], соответствует распределению типов ротавируса, рассчитанному для территорий Европы, Северной Америки и Австралии в аналогичный период времени.

Проведен анализ многолетней динамики частоты обнаружения РВ разных G[P] типов на территориях г. Н. Новгорода и г. Дзержинска. Установлено, что на фоне стабильного доминирования РВ G1P[8] типа в период 1997-05 гг., в последние годы отмечено перераспределение доминирования типов ротавируса. В сезоны РВГЭ 2003-04 гг. в Н. Новгороде и 2004-05 гг. в г. Дзержинске зафиксирована смена доминирования PB-G1P[8] на G1P[6] и G2P[4], соответственно. Зафиксировано пять G[P] типов, распределение которых в сезон 2004-05 гг. по суммарным данным было следующим: G1P[8]-24%, G2P[4]-37%, G3P[8]-21%, G3P[9]-3,8%, G4P[8]-12%, н/т-2%. Увеличение активности циркуляции новых вариантов ротавируса может свидетельствовать о формировании иммунной прослойки населения, устойчивой к ротавирусу G1P[8], и являться предвестником смены доминирующего типа ротавируса. Представленные результаты изучения спектра G[P] типов ротавируса с использованием разработанной методологии ОТ-ПЦР для обнаружения и генотипирования РНК являются первым сообщением по изучению распределения G[P] типов ротавируса на одной из территорий России, что имеет значение для теоретической оценки эффективности созданных в мире ротавирусных вакцин и разработки стратегии вакцинопрофилактики РВГЭ. Представляется вероятным, что предсказываемая нами смена доминирующего G[P] типа ротавируса может снизить эффективность использования моновалентной вакцины Rotarix в последующие годы.

При анализе ЭФ-типов РНК изолятов ротавируса одного G[P] типа было установлено существование в пределах PB-G1P[8] генетических вариантов, кардинально различающихся электрофоретической подвижностью 4-го геномного сегмента. Обнаружены варианты вируса с медленно-мигрирующим и быстромигрирующим геном VP4, что свидетельствовало о существовании у исследуемых нами штаммов ротавируса как минимум двух аллелей гена, определяющих Р[8] генотип. К началу наших исследований было уже известно существование, по данным разных авторов, 2-3-х субгенотипов Р[8], которые определяли с использованием секвенирования соответствующих участков гена VP4. Учитывая возможности лаборатории, была поставлена задача сконструировать праймеры для идентификации субгенотипов Р[8] методом ПЦР. Проведен сравнительный анализ 33-х выровненных нуклеотидных последовательностей гена VP4 ротавируса Р[8] генотипа. Сравнивали области нуклеотидной последовательности гена VP4, кодирующей консервативные аминокислоты, соответствующие трем известным субтипам. По результатам анализа нами впервые сконструированы праймеры P[8]-1R и P[8]-2R, которые позволяют проводить дифференциацию субтипов ротавируса генотипа Р[8] с использованием ПЦР, не применяя при этом секвенирование. Предложенные праймеры в однораундовой ПЦР с общим F-праймером, фланкируют участок гена VP4 размером 410 п.н. Оценку специфичности предложенных праймеров проводили с использованием референтного ротавируса человека - шт. Wa, имеющего субтип Р[8]-1. В настоящем исследовании нами установлена строгая корреляция между электрофоретической подвижностью четвертого геномного сегмента и субтипом последовательности гена VP4. РНК всех исследуемых штаммов РВ (3, 4, 34 ЭФ-тип РНК), имеющая медленно мигрирующий четвертый сегмент, амплифицировалась с использованием праймера, специфичного в отношении субгенотипа Р[8]-1, а РНК, имеющая быстро мигрирующий четвертый сегмент, амплифицировалась только с праймером, специфичным в отношении субгенотипа Р[8]-2. Способ определения субгенотипов Р[8]-1 и Р[8]-2 с использованием ПЦР предложен нами впервые. Новизна подтверждена патентом № 2264469, приоритет от 24 ноября 2003 года.

Разработка нового методического приема дифференциации субаллелей Р[8] позволила нам более углубленно изучить штаммы PB-G1P[8]. Проведен анализ ассоциаций различных субгенотипов Р[8] с G серотипом. Анализ комбинаций различных G серотипов с субтипами Р[8] показал, что и тот и другой субтипы были ассоциированы с серотипами Gl, G3 и G4, основная масса которых была связана с субтипом Р[8]-2. Комбинации G3P[8]-1 и G4P[8]-1 были представлены только единичными изолятами (два G3P[8]-1- в г. Н. Новгороде и один G4P[8]-1- в г. Дзержинске). Соотношение субгенотипов Р[8] в изучаемый нами период времени 1997-2005 гг. было следующим: в г. Н. Новгороде 12,3% изолятов составляли РВ с субгенотипом Р[8]-1 и 73,5% - РВ с субгенотипом Р[8]-2; в г. Дзержинске частота обнаружения субаллелей Р[8] составила 7,0% для РВ-Р[8]-1 и 78,6% для РВ-Р[8]-2. В суммарном распределении G[P] типов ротавируса на долю вариантов ротавируса с генотипом Р[8]-1 пришлось 10,7 %, с генотипом Р[8]-2 - 75,0%. Наиболее часто обнаруживались варианты ротавируса GlP[8]-2, доля которого составила 68,0% в выборке изученных штаммов ротавируса. Определение доминирующего субгенотипа Р[8] ротавируса проведено впервые.

С учетом данных, полученных в Нижегородском НИИЭМ при мониторинге антигенных типов РВ в 1984-1996 гг., стабильно активная циркуляция ротавирусов серотипа G1 продолжается на территории г. Н. Новгорода уже более 20 лет. Мы проанализировали многолетнюю динамику циркуляции PB-G1P[8] по материалам текущего и ретроспективного определения субгенотипов Р[8]. Установлено, что в процессе многолетней циркуляции (1984-2005 гг.) ротавирусов, происходило постепенное замещение генетических вариантов PB-G1P[8]-1 на варианты PB-GlP[8]-2. На полное замещение штаммов с новым субгенотипом Р[8] ротавирусу серотипа G1 потребовалось 15 эпидемических лет. Для этого PB-GlP[8]-2 типа сменил пять генетических вариантов. Представляется вероятным, что смена субгенотипа Р[8] поддерживала активную циркуляцию РВ G1 серотипа.

Нами установлено, что изучаемый период времени абсолютно-доминирующее положение в г. Н. Новгороде занял 61-й генетический вариант ротавируса GlP[8]-2. В период доминирования в 2001-02 гг. РВ GlP[8]-2-(61) вызвал резкий подъем заболеваемости РВГЭ, обусловив 75% госпитализаций. Представляло научный интерес оценить клинические особенности РВГЭ, вызванного ротавирусом этого типа. Проведен анализ выписок из историй болезни 51-го ребенка с моноротавирусной инфекцией, выделявших РВ G1P[8]-2-(61). Результаты частоты регистрации максимально выраженных и продолжительных симптомов РВГЭ при инфицировании GlP[8]-2-(61) сравнили с аналогичными архивными показателями, установленными для GlP[8]-l-(3). Установлено, что при инфицировании детей PB-GlP[8]-2-(61) достоверно чаще наблюдался диарейный стул в течение более 4-х дней, многократная рвота наблюдалась достоверно реже, симптомы ОРВИ зарегистрированы у меньшего числа детей и были выражены слабо. Ведущим синдромом в определении тяжести заболевания был токсикоз с эксикозом. Это отличало ротавирус GlP[8]-2-(61) от ротавируса GlP[8]-l-(3), при инфицировании которым ведущим синдромом, определяющим тяжесть течения заболевания, был токсикоз в сочетании с симптоматическими поражениями верхних отделов респираторного тракта. По всей вероятности, различия в частоте проявлений и выраженности поражений слизистых верхних дыхательных путей и выраженности диарейного синдрома при инфицировании ротавирусами G1P[8]-1 и GlP[8]-2 не связаны с G серотиповой принадлежностью вируса, а определяются субаллелями гена VP4. Ротавирус GlP[8]-l-(3) типа определен нами как респираторный вариант вируса, a G1P[8]-2-(61) - как кишечный. Различия в клинических проявлениях РВГЭ, связанные с субгенотипом Р[8], показаны нами впервые.

На следующем этапе работы проведено изучение молекулярно-генетических особенностей штаммов РВ, выделенных от новорожденных, госпитализированных в ГКПЦ г. Омска. Обследование новорожденных на ротавирусный антиген методом ИФА, проводилось сотрудниками Омской государственной медицинской академии Стасенко B.JI. и Милениной В.М., совместно с сотрудниками ЦГСЭН в Омской области. В нашей лаборатории было исследовано 82 образца фекалий детей, положительных на ротавирусы, собранных в период с мая 2002 года по сентябрь 2004 года. Изоляты РВ, были изучены с использованием молекулярно-генетических методов: G[P] типирования, ЭФ типирования РНК, секвенирования гена NSP4.

ЭФ-типирование РНК штаммов показало наличие двух видов профилей РНК - длинного, типичного для РВ группы А (20,7% и аномального (79,3%). Необычный профиль миграции сегментов содержал в четвертом классе генов один сегмент, а втором классе — три. Такое изменение стандартной картины распределения сегментов РНК на классы, характерной для РВ группы А, свидетельствует о геномных перестройках у штаммов РВ.

С использованием разработанной нами методологии G[P] типирования установлено, что РВ с типичным ЭФ-типом РНК (соответствует 72-ому нижегородскому ЭФ-типу) имели генотип GlP[8]-2, а с аномальным - G9P[6]. При инфицировании новорожденных данным вариантом РВ в 75% наблюдалось бессимптомное течение инфекции, в 25% наблюдался жидкий стул (%=10,1 р=0,001). Эти значения свидетельствуют, что о существовании связи между G9P[6] типом и бессимптомным течением инфекции.

Проведено секвенирование полноразмерного гена NSP4 трех изолятов PB-G9P[6], собранных в разные годы, определенные нуклеотидные последовательности депонированы в базе данных GenBank/EMBL/DDBJ под номерами DQ270101, DQ270102, DQ270103. Сравнительный анализ полных нуклеотидных последовательностей гена NSP4 омских изолятов и штаммов РВ с известным генотипом NSP4 показал, что омские изоляты PB-G9P[6] находятся в одном кластере со штаммами РВЧ, имеющими генотип NSP4(A). Аллель гена NSP4 генотипа А ведет свое происхождение от ротавирусов животных. Вариант РВ G9P[6] является новым в глобальной коллекции штаммов.

Полученные нами результаты обнаружения РВ с использованием молекулярно-генетических методов (ОТ-ПЦР, РНК-ПААГ) и генотипирования штаммов сообщались в Омскую медицинскую академию и ЦГСЭН в Омской области, где были учтены при расшифровке причин роста внутрибольничной заболеваемости ОКИ новорожденных детей. Эпидемиологическое расследование позволило установить, что штамм ротавируса G9P[6]NSP4(A) с реорганизованным геномом был занесен в перинатальный центр из родильного дома, где получил внутрибольничное распространение и циркулировал в течение трех лет. По результатам комплексных исследований с учетом полученных нами результатов сотрудниками Омской медицинской академии и Центра ГСЭН для предупреждения заноса и распространения РВИ в стационарах и отделениях для новорожденных детей разработан комплекс профилактических рекомендаций и проведены адекватные противоэпидемические мероприятия.

Суммируя все вышесказанное, можно заключить, что в результате проведенной работы, направленной на адаптацию методологии G[P] генотипирования к местным штаммам ротавируса, оптимизированы универсальные олигонуклеотидные праймеры Ro4-l и Ro4-2 для обнаружения гена VP4 ротавирусов группы А, предложены собственные версии праймеров для идентификации генотипов Р[4] и Р[8], разработана оригинальная пара праймеров для субгенотипирования Р[8] аллелей гена VP4 методом ОТ-ПЦР. С использованием разработанных методик установлено распределение G[P] типов ротавирусов, циркулировавших среди населения двух городов Нижегородской области в период 1997-2005 гг., свидетельствующее об абсолютном доминировании генетических вариантов ротавируса G1P[8] и отсутствии штаммов серотипа G9. В 2003-5 гг. зафиксировано увеличение активности циркуляции РВ генотипов G1P[6], G2P[4] и G3P[8], что может служить предвестником смены доминирующего G[P] типа ротавируса. Показано существование генетических вариантов PB-G1, различающихся субгенотипом Р[8], впервые продемонстрирована многолетняя динамика их смены и установлены различия в кинических проявлениях инфекции, вызванной ротавирусами G1P[8]-1 и GlP[8]-2. Обнаружен и охарактеризован новый необычный вариант ротавируса с реорганизованным 11-м сегментом G9P[6]NSP4(A) типа, наиболее часто вызывающий бессимптомное течение РВИ и явившийся причиной нозокомиальной инфекции новорожденных детей на втором этапе выхаживания.

Опыт применения G[P] генотипирования в практике здравоохранения показал эффективность разработанных методик в расшифровке локальных вспышек ОКИ в закрытых коллективах; установлении внутрибольничной циркуляции ротавирусов; осуществлении мониторинга за циркулирующими вариантами ротавируса с целью установления смены доминирующего G[P] типа ротавируса, сопровождающейся ростом заболеваемости РВГЭ.

125

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фёдорова, Оксана Фёдоровна, 2006 год

1. Васильев Б.Я. Острые кишечные заболевания. Ротавирусы и ротавирусная инфекция / Васильев Б.Я., Васильева Р.И., Лобзин Ю.В. — СПб.: «Лань», 2000. 272 с.

2. Гланц С. Медико-биологическая статистика. М.: Практика, 1999. -459 с.

3. Дроздов С.Г., Покровский В.И., Шекоян Л.А., Машилов В.П. Ротавирусный гастроэнтерит. М.: Медицина, 1982. - 160 с.

4. Инфекционная заболеваемость в Российской Федерации в 2000-2001 гг. Информационный сборник статистических и аналитических материалов. М., 2002.

5. Карпович Л.Г., Петухов В.Г., Евреинова Е.Э. Калашникова Т.В., Карпова Е.В. Оценка эффективности препаратов для диагностики ротавирусной инфекции в условиях натуральных испытаний // Вопр. вирусол. — 1999. — N 2. — С.82-85.

6. Королев М.Б. Электронно-микроскопические методы выявления вирусов // Итоги науки и техники. Вирусология. Т.9 М., 1980. - С. 114-151.

7. Мухина А.А., Шипулин Г.А. Боковой А.Г. и др. Диагностика ротавирусной инфекции методом полимеразной цепной реакции // Эпидемиол. и инф. болезни. 2002. - N 2. - С.43-47.

8. Новикова Н.А., Анцупова А.С., Епифанова Н.В., Альтова Е.Е. Электрофоретический анализ геномной РНК ротавирусов человека // Молекул, генетика. 1989. -N 5. - С.45-49.

9. Новикова Н.А., Альтова Е.Е., Носкова Н.В. и др. Обнаружение ротавирусной РНК в носоглоточных смывах методов молекулярной гибридизации // Журн. микробиол. 1991. - N 4 - С.23-25.

10. Новикова Н.А., Епифанова Н.В., Альтова Е.Е. и др. Электрофоретипирование ротавирусов при клинико-эпидемиологическом изучении инфекции // Журн. микробиол. 1992. - N 2 - С.31-34.

11. Новикова Н.А. Генетические и антигенные варианты ротавируса человека, циркулирующие на европейской территории России: Автореф. дис.д-ра биол. наук. Москва, 1998.-49 с.

12. Приоритетные направления научных исследований, предпринимаемых в целях создания вакцин против диарейных болезней: меморандум ВОЗ // Бюл. ВОЗ. 1991.-N6.-С. 19-28.

13. Сенгер М., Берг П. Гены и геномы: в 2-х томах. М. - 1998. - 373 с.

14. Сироткин А.К., Романовская-Романько Е.А., Третьякова Н.В. Циркуляция ротавирусов группы А в Санкт-Петербурге в 2002-2003 гг. // Матер. 3-й Междунар конф.: Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. СПб. -2003.-С. 118.

15. Цилинский Я.Я. Популяционная структура и эволюция вирусов. М.: Медицина, 1988.-240 с.

16. Anand Т., Narasa Raju T.A., Vishnu C. et al. Development of Dot-ELISA for the detection of rotavirus antigen and comparison with RNA-PAGE // Letters of Appl. Microbiol. 2001. - Vol. 32. - P. 176 - 180.

17. Arias C., Isa P., Guerrero A. et al. Molecular biology of rotavirus cell entry //Arch, of Med. Research. 2002. - Vol. 33.-P. 356-361.

18. Arias C., Dector M., Segovia L. et al. RNA silencing of rotavirus gene expression // Virus Research. 2004. - Vol. 102. - P. 43-51.

19. Banyai K., Gentsch J.R., Glass R.I. et al. Eight-year survey of human rotavirus strains demonstrates circulation of unusual G and P types in Hungary // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42, N 1. - P. 393-397.

20. Barro M, Patton J.T. Rotavirus nonstructural protein 1 subverts innate immune response by inducing degradation of IFN regulatory factor 3 // PNAS USA. -2005.-Vol.102.-P. 4114-9.

21. Beards G. M., Desselberger U., Flewett Т. H. Temporal and geographical distributions of rotavirus serotypes, 1983 to 1988// J. Clin. Microbiol. 1989. - Vol. 27.-P. 2827-2873.

22. Besalaar T. G., Rosenblatt A., Kidd A.H. Atypical rotavirus from South African neonates: Brif report // Arch. Virol. 1986. - Vol. 87. - P. 327-330.

23. Bhan M. K., Lew J.F., Sazawal S. et al. Protection conferred by neonatal rotavirus infection against subsequent diarrhea // J. Infect. Dis. 1993. - Vol. 168. -P. 282-287.

24. Bines J. E, Ivanoff В., Justice F., Mulholland K. Clinical case definition for the diagnosis of acute intussusception // J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 2004. - Vol. 39.-P. 511-518.

25. Bines J.E. Rotavirus vaccines and intussusception risk // Curr. Opin. Gastroenterol. 2005. - Vol. 21. - P. 20-25.

26. Bishop R.F., Unicomb L.E., Barnes G.L. Epidemiology of rotavirus serotypes in Melbourn, Ausralia, from 1973-1989 // J. Clin. Microbiol. 1991. -Vol. 29, N 5. - P. 862-868.

27. Bishop R. F., Masendycz P.J, Bugg H.C. et al. Epidemiological patterns of rotaviruses causing severe gastroenteritis in young children throughout Australia from 1993 to 1996//J. Clin. Microbiol.-2001.-Vol. 39.-P. 1085-1091.

28. Bowman G.D., Nodelman I., Levy O. et al. Crystal structure of the oligomerization domen of NSP from rotavirus reveals a core metal-binding site // J. Mol. Biol. 2000. - Vol. 304. - P. 861-871.

29. Bresse J.S., Glass R.I., Ivanoff В., Gentsch J.R. Current status and future priorities for rotavirus vaccine development, evaluation and implementation in developing countries // Vaccine. 1999. - Vol. 17. - P. 2207-2222.

30. Broor S., Ghosh D., Mathur P. Molecular epidemiology of rotaviruses in India // Indian. J. Med. Res. 2003. - Vol. 118. - P. 59-67.

31. Brussow H., Bruttin A., Marc-Martin S. Polypeptide composition of rotavirus empty capsids and their possible use as a subunit vaccine // J. Virol. 1990. -Vol. 64, N8.-P. 3635-3642.

32. Carpio R.V., Gonzalez-Nilo F.D., Jayaram H. Role of the histidine triadlike motif in nucleotide hydrolysis by the rotavirus RNA-packaging protein NSP2 // J. Biol Chem. 2004. - Vol. 279. - P. 10624-33.

33. Chen Y., Zhao J., Yan L. Comparison of three methods in detection of rotavirus in neonates // Zhongulua Shi Yan He Lin Chuang Bing Du Xue Za Zhi -1999.-Vol. 31.-P. 180-182.

34. Clark H.F., Bernstein D.I., Dennehy P.H. et al. Safety, efficacy, and immunogenicity of a live, quadrivalent human-bovine reassortant rotavirus vaccine in healthy infants // J. Pediatr. 2004. - Vol. 144. - P. 558.

35. Clarke I.N., McCrae. A rapid and sensitive method for analyzing the genome profiles of field isolates of rotavirus // J. of Virol. Methods. 1981. - Vol. 2. -P. 203-209.

36. Coluchi N., Munford V., Manzur J. et al. Detection, subgroup specifity and genotype diversity of rotavirus strain in children with acute diarrhea in Paraguay // J. Clin. Microbiol. -2002. Vol. 40. - P. 1709-1714.

37. Cook JP, McCrae MA. Sequence analysis of the guanylyltransferase (VP3) of group A rotaviruses // J. Gen Virol. 2004. - Vol. 85. - P. 929-932.

38. Costa P., Cardoso D., Grisi S. et al. Rotavirus A infections and reinfecrions genotyping and vaccine implications // J. Pediatr (Rio J). 2004. - Vol.80. - P. 119122.

39. Coulson B.S., Gentsch J.R., Das B.K., et al. Comparison of enzyme immunoassay and reverse transcriptase PCR for identification of serotype G9 rotaviruses//J. Clin. Microbiol. 1999.-Vol. 37, N 10. - P. 3187 - 3193.

40. Crawford Sue E., Mukherjee S.K., Estes M.K. et al. Trypsin cleavage stabilizes the rotavirus VP4 spike // J. of Virology. 2001. - Vol.75, N 13. - P. 60526061.

41. Cunliffe N.A., Gondwe J.S., Graham S.M. et al. Rotavirus strain diversity in Blantyre, Malawi from 1997 to 1999 // J. of Clin. Microbiol. 2001. - Vol. 39, N 3.-P. 836-843.

42. Cunliffe N.A., Breses J.S., Gentsch J.R. et al. The expanding diversity of rotaviruses // Lancet. 2002. - Vol. 359. - P. 640-641.

43. Cunliffe N.A., Nakagomi O. A clinical time for rotavirus vaccine: a review // Expert Rev Vaccines. 2005. - V. 4. - P. 521-532.

44. Das B.K., Gentsch J.R., Cicirello H.G. et al. Characterization of rotavirus strains from newborns in New Delhi, India // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32, N 7.-P. 1820-1822.

45. De Leener K., Rahman M., Matthijnssens J. et al. Human infection with a P14., G3 lapine rotavirus // Virology 2004. - Vol. 20. - P. 11-17.

46. De Vos В., Vesikari Т., Linhares A.C. et al. A rotavirus vaccine for prophylaxis of infants against rotavirus gastroenteritis // Pediatr. Infect. Dis. J. -2004.-Vol. 23.-P. 179-182.

47. Dormitzer P.R., Greenberg H.B., Harrison S.C. Proteolysis of monomeric recombinant rotavirus VP4 yields an oligomeric VP5* core // J. Virol. 2001. - Vol. 75.-P. 7339-7350.

48. Dormitzer P.P., Sun Z-Y. J., Wagner G., Harrison S.C. The rhesus rotavirus VP4 sialic acid binding domain has a galestin fold with a novel carbohydraten binding site // The EMBO Journal. 2002. - Vol. 21, N 5. - P. 885-897.

49. Dus Santos M. J., Wigdorovitz A. Transgenic plants for the production of veterinary vaccines // Immunol. Cell. Biol. 2005. - Vol. 83. - P. 229-38.

50. Eichwald C., Rodriguez J.F., Burrone O.R. Characterization of rotavirus NSP2/NSP5 interactions and the dynamics of viroplasm formation // J. Gen Virol. 2004-Vol. 85.-P. 625-34.

51. Estes M.K., Cohen J. Rotavirus gene structure and function // Microbiological Reviews. 1989. - P.410-449.

52. Estes M.K. Rotaviruses and their replication. In Fields B.N., Knipe D.N., Howley P.M. et al. Fields virology, Raven Press, New York, 1996. P. 1625-1655.

53. Estes M. K. Rotaviruses and their replication. In Fields B.N. Knipe D.N., Howley P.M., Griffin D.E. et al. Virology, Philadelphia, 2001. P. 1747-1785.

54. Fischer Т.К., Steinsland H., Molbak K. et al. Genotype profiles of rotavirus strains from children in a suburban community in Guinea-Bissau, Western Africa // J. of Clin. Microbiol. 2000.-Vol. 38, N l.-P. 264-267.

55. Fischer Т.К., Eugen-Olsen J., Pedersen A.G. Characterization of rotavirus strains in a Danish population: high frequency of mixed infections and diversitywithin the VP4 gene of P8. strains I I J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P. 10991104.

56. Flewett Т.Н., Woode G.N. The rotaviruses. Brief review // Arch. Virol. -1978. Vol.57, N 1,-P. 1-23.

57. Gault E., Chikhi-Brachet R., Delon S. et al. Distribution of human rotavirus G types circulating in Paris, Frace, during the 1997-1998 epidemic: high prevalence of type G4 // J. Clin. Microbiol. 1999. - Vol. 37. - P. 2373-2375.

58. Gault E., Schnepf N., Poncet D. et al. A human rotavirus with rearranged genes 7 and 11 encodes a modified NSP3 protein and suggests an additional mechanism for gene rearrangement// J. Virol. 2001. -Vol. 75. - P. 7305-14.

59. Gentsch J.R., Glass R.I., Woods P. et al. Identification of group A rotavirus gene 4 types by polymerase chain reaction // J. Clin. Microbiol. 1992. - Vol. 30. -P. 1365-1373.

60. Gentsch J.R., Woods P.A., Ramachandran M. et al. Review of G and P typing results from a global collection of rotavirus strains: implications for vaccine development // J. Infect. Dis. 1996. Vol. 174, N 1. - P. 30 -36.

61. Gentsch JR, Laird AR, Bielfelt B. et al. Serotype Diversity and Reassortment between Human and Animal Rotavirus Strains: Implications for Rotavirus Vaccine Programs // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 12. - P. 146-59.

62. Gerna G., Sarasini A., Matteo A. et al. Serotype 3 human rotavirus strains with subgroup I specificity // J. Clin. Microbial. 1990. - Vol. 26, N 6. - P. 13421347.

63. Gilbert J.M., Feng N., Patton J.T., Greenberg H.B. Rotavirus assembly -interaction of surface protein VP7 with middle layer protein VP6 // Arch. Virol. -2001.-Vol. 146. P. 1155-1171.

64. Glass R.I., Kilgore P.E., Holman R.C. et al. The epidemiology of rotavirus diarrhea in the United States: surveillance and estimates of disease burden // J. Infect. Dis. 1996. - Vol. 174, N 11. - P. 5-11.

65. Glass R.I., Bresee J.S., Ivanoff B. Rotavirus vaccines for developing countries // Weakly Epidemiol. Rep. 1997. - Vol. 6. - P. 35-40.

66. Glass R.I., Bhan M.K., Ray P. et al. Development of candidate vaccines derived from neonatal strain in India // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 192. - P. 30-35.

67. Glass R.I., Bresee J.S., Turcios R. et al. Rotavirus vaccines: targeting the developing world // J. Infect Dis. 2005. - Vol. 192. - P. 160-6.

68. Golantsova N.E., Gorbunova E.E., Mackow E.R. Discrete domains the rotavirus VP5* direct peripheral membrane association and permeability // J. Virol. -2004. Vol.78. - P. 2037-44.

69. Gouvea V., Glass R., Wood P. Polymerase chain reaction amplification and typing of rotavirus nucleic acid from stool specimens // J. Clin. Microbiol. 1990. -Vol. 28, N2.-P. 276-282.

70. Gouvea V., Lima R., Linhares R. et al. Identification of two lineages (Wa-like and F45-like) within the major rotavirus genotype P8. // Virus Research. 1999. -Vol. 59.-P. 141-147.

71. Gunson R.N., Miller j., Leonard A. et al. Importance of PCR in the diagnosis and understanding of rotavirus illness in the community // Common. Dis. Public. Health. 2003. - Vol. 6. - P. 63 - 65.

72. Haber P., Chen R.T., Zanardi L.R. et al An analysis of rotavirus vaccine reports to the vaccine adverse event reporting system: more than intussusception alone? // Pediatrics. 2004. - Vol. 113. - P. 353-9.

73. Haffejee I. Neonatal rotavirus infections // Rev. Infec. Diseases. 1991. -Vol. 13, N5.-P. 957-962.

74. Heaton P.M., Gouvea M.G., Miller J.M. et al. Development of a Pentavalent Rotavirus Vaccine against Prevalent Serotypes of Rotavirus Gastroenteritis // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 192. - P. 17-21.

75. Herring A.J., Inglis N.F., Ogen C.K. et al. Rapid diagnosis of rotavirus infection by direct detection of viral nucleic acid in silver-stained polyacrilamide gels // J. Clin. Microbiol. 1982. - V. 16, N 3. - P. 473-477.

76. Herrmann J.E., Chan S.C., Fynan E.F. Protection against rotavirus infection by DNA vaccination // J. Infect. Dis. 1996. - Vol. 174, N 11. - P. 93-97.

77. Herrmann J.E., Chan S.C., Jones D.H. et al. Immune responses and protection obtained by oral immunization with rotavirus VP4 and VP7 DNA vaccine encapsulated in microparticles // Virology. 1999. - Vol. 259, N 1. - P. 148-153.

78. Holmes J.L., Kirkwood C.D., Gerna G., et al. Characterization of unusual G8 rotavirus strains isolated from Egyptian children // Arch. Virol. 1999. - Vol. 144, N 7. - P.1381-1396.

79. Hoshino Y., Kapikian A.Z. Classification of rotavirus VP4 and VP7 serotypes // Arch Virol. 1996. - Vol. 12. - P. 99-111.

80. Hoshino Y, Jones RW, Ross J et al. Human rotavirus strains bearing VP4 gene P6. allele recovered from asymptomatic or symptomatic infections share similar, if not identical, VP4 neutralization // Virology. 2003. - Vol. 10. - P. 1-8.

81. Hoshino Y., Jones R. W., Ross J., Kapikian A. Z. Porcine rotavirus strain Gottfried-based human rotavirus candidate vaccines: construction and characterization // Vaccine. 2005. - Vol. 31. - P. 3791-9.

82. Iturriza-Gomara M., Green J., Brown W.G. David et all. Diversity within the VP4 gene of rotavirus P8. strains: implications for reverse transcription-PCR genotyping//J. of Clin. Microbiol. 2000. - Vol. 898-901.-P. 898-901.

83. Iturriza-Gomara М., Green J., Brown W.G., David. Molecular epidemiology of human group A rotavirus infections in the United Kingdom between 1995 and 1998 //J. of Clin. Microbiol. 2000.-Vol.38, N 1. - P. 4394-4401.

84. Iturriza-Gomara M., Isherwood В., Desselberger U., Gray J. Reassortment In Vivo: Driving Force for Diversity of Human Rotavirus Strains Isolated in the United Kingdom between 1995 and 1999 // J. Virology. 2001. - Vol. 75. - N 8. - P. 3696-3705.

85. Iturriza-Gomara M., Anderton E., Kang G. et al. Evidence for genetic linkage between the gene segments encoding NSP4 and VP6 proteins in common and reassortant human rotavirus strains // J. Clin Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 3566-3573.

86. Iturriza-Gomara M., Kang G., Gray J. Rotavirus genotyping keeping up with an evolving population of human rotaviruses // J. Clin Virol. 2004. — Vol. 31. -P. 259-65.

87. Iturriza-Gomara M., Kang G., Mammen A. et al. Characterization of G10P11. rotaviruses causing acute gastroenteritis in neonates and infants in Vellore, India // J. Clin. Microbiol. 2004. - Vol. 42. - P. 2541-2547.

88. Jayaram H., Estes M.K., Prasad V. Emerging themes in rotavirus cell entry, genome organization, transcription and replication // Virus Research. 2004. - Vol. 101.-P. 67-81.

89. Johansen K., Bernet R., Bondesson K. et al. Incidence and estimates of the disease burden of rotavirus in Sweden // Acta Paediatr. 1999. - Vol. 88, N 426. - P. 20-23.

90. Kapikian A.Z., Hoshino R.M., Chanock I.P.-S. Advances in the development of a rotavirus vaccine for preventing severe pediatric gastroenteritis // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями. Междунар. симп., поев, году Пастера. — 1995, СПб.-Р. 146-146.

91. Kapikian A.Z., Simonsen L., Vesikari Т. et al. A Hexavalent Human Rotavirus-Bovine Rotavirus (UK) Reassortant Vaccine Designed for Use in

92. Developing Countries and Delivered in a Schedule with the Potential to Eliminate the Risk of Intussusception // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 192. - P. 22-29.

93. Kasule M., Sebunya Т.К., Gashe B.A. et al. Detection and characterization of human rotavirus among children with diarrhea in Botswana // Trop. Med. Int. Health. 2003. - Vol. 8. - P. 1137 - 42.

94. Kearney K., Chen D., Taraporewala Z.F. et al. Cell-line-induced mutation of the rotavirus genome alters expression of an IRF3-interacting protein // The EMBO Journal. 2004. - Vol. 23. - P. 4072-81.

95. Kelkar S.D., Ray P.G., Bedekar S.S. Assay of neutralizing antibodies to animal rotavirus strains and human rotavirus serotype G8 by a modified method in the residents of Pune, India // J. Diarrhoeal. Dis. Res. 1996. - Vol. 14, N 2. - P. 101-106.

96. Khalili B, Cuevas LE, Reisi N. et al. Epidemiology of rotavirus diarrhea in Iranian children // J. Med. Virol. 2004. - Vol. 73. - P. 309-312.

97. Kilgore P.E., Unicomb L.E., Gentsch J.R. et al. Neonatal rotavirus infection in Bangladesh: strain characterization and risk factors for nosocomial infection // Pediatr. Infect. Dis. J. 1996. - Vol. 15, N 8. - P. 672-677.

98. Kirkwood C.D., Bishop R.F., Coulson B.S. Human rotavirus VP4 contains strain-specific, serotype-specific and cross-reactive neutralization sites // Arch. Virol. 1996. - Vol. 141, N 3-4. - P. 587-600.

99. Kirkwood C., Palombo E. Genetic characterization of the rotavirus nonstructural protein, NSP4 // Virology. 1997. - Vol. 236. - P. 257-265.

100. Kirkwood C.D., Gentsch J.R., Hoshino Y. et al. Genetic and antigenic characterization of a serotype P6.G9 human rotavirus strain isolated in the United States // Virology. 1999. - Vol. 256, N 1. - P. 45-53.

101. Kirkwood C., Bogdanovic-Sakran N., Ruth B. et al. Report of the Australian Rotavirus Surveillance Program 2003-2004 // Commun. Dis. Intell. -2004.-Vol. 28.-P. 481-485.

102. Kojima К., Taniguchi К., Kawagishi-Kobayashi M. et al. Rearrangement generated in double genes, NSP1 and NSP3, of viable progenies from a human rotavirus strain // Virus Res. 2000. - Vol. 67. - P. 163-171.

103. Laemmli U.K. Cleavage of structure proteins during the assembly of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680-685.

104. Laird A. R., Gentsch J. R., Nakagomi T. et al. Characterization of Serotype G9 rotavirus strain isolated in the United States and India 1993-2001 // J. of Clin. Microbiol. 2003. - Vol. 41. - P. 3100 -3111.

105. Larralde G., Gorziglia M. Distribution of conserved and specific epitopes on the VP8 subunit of rotavirus VP4 //J. Virol. 1992. - Vol. 66, n 12. - P. 74387443.

106. Laubereau В., Gateau S., Ehlken B. et al. Rotavirus gastroenteritis in infants and children. Results of a prospective study in the area of Geneva and Basel 1997/1998 // Schweiz. Med. Wochenschr. 1999. -Vol. 129, N 7. - P. 1822-1830.

107. Lepault J., Peptidas I., Erk I.et.al. Structural polymorphism of the major capsid protein of rotavirus // The ENBO Journal. 2001. - Vol. 20, N 7. - P. 1498 -1507.

108. Linhares A.C., Mascarenhas I.D., Gusmao R.H. et al. Neonatal rotavirus infection in Belem, Northen Brazil: Nosocomial transmission of a P6.G2 strain // J. Met. Virol. 2002. - Vol. 67, N 3. - P. 418-426.

109. Linhares A.C., Ruiz-Palacios G.M., Guerrero M.L. et al. A short report on hinhlights of worl-wide development of RIX4414: A Latin American experience // Vaccine.-2005.

110. Liprandi F., Gerder M., Bastidas Z. et al. A novel type of VP4 carried by a porcine rotavirus strain // Virology. 2003. - Vol. 25. - P. 373-80.

111. Liu X., Li J. Q., Xiong X. Y. et al. Protective efficacy of recombinant rotavirus epitope-based vaccine in mice // Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2005. - Vol. 27. - P. 216-22.

112. Lo J.Y., Szeto K.C., Tsang D.N. et al. Changing epidemiology of rotavirus G-types circulating in Hong Kong, China // J. Med. Virol. 2005. - Vol. 75. - P.170.173.

113. Lopes Т., Camacho M., Zayas R. et al. Silencing the morphogenesis ofф rotavirus // J. Virol. 2005. - Vol. 79. - P. 184-192.

114. Mascarenhas I.D., Linhares A.C., Gabbay Y.B. Detection and characterization of rotavirus G and P types from children participating in a rotavirus vaccine in Belem, Brazil // Met. Inst. Oswaldo Cruz. 2002. - Vol. 97, N 1. - P. 113-117.

115. Masendycz P.J., Unicomb L.E., Kirkwood C.D., Bishop R.F. Rotavirus serotypes causing severe acute diarrhea in young children in six Australian cities, 1989 to 1992 // J. Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32, N 9. - P. 2315-2317.

116. Mattion N.M., Bellinzoni R.C., Blackhall J.O. et al. Genome rearrangements in porcine rotaviruses: Biochemical and comparisons between a supershort strain and standard counterpart // J. Gen. Virol. 1990. - Vol. 71. - P. 335-362.

117. Maunula L., Bonsdorff C.-H. Short sequences define genetic lineage's phylogenetic analysis of group A rotavirus based on partial sequences of genome segment 4 and 9 // J. Gen. Virol. 1998. - Vol.79. - P.321-332.

118. Mclntyre M., Rosenbaum V., Rappold W. et al. Biophysical characterization of rotavirus particles containing rearranged genomes // J. Gen. Virol.- 1987. Vol. 68. - P. 2961-2966.

119. Midthun K., Halsey N.A., Jett-Goheen M. et al. Safety and immunogenicity of human rotavirus vaccine strain M37 in adults, children and infants // J. Infect. Dis.- 1991. Vol. 164. - P. 792-796.

120. Min B.S., Noh Y.J., Shin J.H. et al. Surveillance study (2000 to 2001) of G- and P-type human rotaviruses circulating in South Korea // J. Clin. Microbiol. -2004.-Vol. 42.-P. 4297-99.

121. Mohan K.V., Muller J., Som I., Atreya C.D. The N- and C-terminal regions of rotavirus NSP5 are the critical determinants for the formation of viroplasm-like structures independent of NSP2 // J Virol. 2004. - Vol. 78 - P. 4951.

122. Mori Y, Sugiyama M, Takayama M. et al. Avian-to-mammal transmission of an avian rotavirus: analysis of its pathogenicity in a heterologous mouse model // Virology. 2001. - Vol. 15. - P. 63-70.

123. Nakata S., Gatheru Z., Ukae S., Adachi N. et al. Epidemiological study of the G serotype distribution of group A rotaviruses in Kenya from 1991 to 1994 // J. Med. Virol. 1999. - Vol. 58, N 3. - P. 296-303.

124. Nakagomi O., Nakagomi Т., Akatani K., Ikegami N. Identification of rotavirus genogroups by RNA-RNA hybridization // Mol. and cell. Probes. 1989. -Vol. 9.-P. 251-261.

125. Nakagomi O., Isegawa Y., Heola S. et al. Nucleotide sequence comparison of the VP4 gene of rotaviruses processing AU-1 gene 4 allele // J. Gen. Virol. 1993. -Vol. 74, N8.-P. 1709-1713.

126. O'Brien G.J., Bryant C.J., Voogd C. et al. Rotavirus VP6 expressed by PVX vectors in Nicotiana benthamiana coats PVX rods and also assembles into virus-like particles // Virology. 2000. - Vol. 270, N 2. - P. 444-453.

127. Offit P.A. The rotavirus vaccine // J. Clin. Virology. 1998. - Vol. 11. - P. 155-159.

128. Oh D.Y., Gaedicke G., Schreier E. Viral agents of acute gastroenteritis in

129. German children: prevalence and molecular diversity // J. Med. Virol. 2003. - Vol.71, N 1. P. 82-93. i

130. OMahony J., Foley В., Morgan S. VP4 and VP7 genotyping of rotavirus samples recovered from infected children in Ireland over a 3-year period // J. of Clin. Microbiol. 1999.-Vol. 38, N6.-P. 1699-1703.

131. Padilla-Noriega L., Mendez-Toss M., Menchaca G. et al. Antigenic and genomic diversity of human rotavirus VP4 in two consecutive epidemic seasons in Mexico // J. Clin Microbiol. 1998. - Vol. 36, N 6. - P. 1688-1692.

132. Palombo E.A. Genetic and antigenic diversity of human rotaviruses: potential impact on the success of candidate vaccines // FEMS Microbiol. Lett. -1999.-Vol. 181,N1.-P. 1-8.

133. Parashar U.D., Hummelman E.G., Bresee J.S. et al. Global illness and deaths caused by rotavirus disease in children // Emerg. Infect. Dis. 2003. - Vol. 9. -P. 562-572.

134. Parra G.I., Bok K., Martinez M., Gomez J.A. Evidence of rotavirus intragenic recombination between two sublineages of the same genotype // J. Gen. Virol. 2004. - Vol. 85. - P. 1713-6.

135. Patton J. and Spencer E. Genome replication and packaging of segmented double-stranded RNA viruses // Virology. 2000. - Vol. 277. - P. 217-225.

136. Patton J.T., Taraporewala Z., Chen D. et al. Effect of intragenic rearrangement and changes in the 3' consensus sequence on NSP1 expression and rotavirus replication // J. Virol. 2001. - Vol. 75. - P. 2076-86.

137. Pesavento J.B., Lawton J., Estes M.K. The reverse consideration and expansion of the rotavirus genome // PNAS. 2001. - Vol. 98, N 4. - P. 1381-1386.

138. Phua K.B., Quak S.H., Lee B.W. et al. Evaluation of RIX4414, A Live, Attenuated Rotavirus Vaccine, in a Randomized, Double-Blind, Placebo-Controlled Phase 2 Trial Involving 2464 Singaporean Infants // J. Infect. Dis. 2005. - Vol. 192. -P. 6-16.

139. Podewils L.J., Antil L., Hummelman E. et al. Projected cost-effectiveness of rotavirus vaccination for children in Asia // J. Infec.t Dis. 2005. — Vol. 192. - P. 133-45.

140. Pongsuwanna Y., Guntapong R., Chiwakul M. et al. Detection of a human rotavirus with G12 and P9. specificity in Thailand // J. Clin Microbiol. 2002. -Vol. 40.-P. 1390-1394.

141. Prasad B.V., Marietta E., Estes M.K., Chiu W. Localization of VP4 neutralization sites in rotavirus by threedimensional cryo-electron microscopy // Nature. 1990. - Vol. 343, N 6257. - P. 476-479.

142. Protocol on rotavirus surveillance and health care utilization for gastroenteritis in children. WHCW&B/02.15. 2002.

143. Rahman M., Sultana R., Podder G. et al. Typing of human rotavirus: Nucleotide mismatches between the VP4 gene and primer are associated with genotyping failure // Virol. 2005. - Vol. 24. - P. 24.

144. Rahman M., Matthijnssens J., Goegebuer T. et al. Predominance of rotavirus G9 genotype in children hospitalized for rotavirus gastroenteritis in Belgium during 1999-2003 // J. Clin Virol. 2005. - Vol. 33. - P. 1-6.

145. Rahman M., Matthijnssens J., Nahar S. Characterization of a novel P25.,G11 human group a rotavirus // J. Clin Microbiol 2005. - Vol .43. - P. 32083212.

146. Ramachandran M., Gentsch J.R., Parashar U.D. et al. Detection and characterization of novel rotavirus strains in the United States // J. Clin. Microbiol. 1998. V. 36, N 11. - P. 3223-3229.

147. Ramachandran M., Kirkwood C. D., Unicomb L. et al. Molecular characterization of Serotype G9 rotavirus strain from a global collection // Virology. 2000. - Vol. 278. - P. 436-444.

148. Raming R. F. Genetics of the rotaviruses // Annu. Rev. Microbiol. 1997. -Vol. 51.-P. 225-55.

149. Raming R. Pathogenesis of intestinal and systemic rotavirus infection // J. Virol. 2004. - Vol. 78, N 19.-P. 10213-10220.

150. Sanchez-Fauquier A., Wilhelmi I., Colomina J. et al. Diversity of group A human rotavirus types circulating over a 4-year period in Madrid, Spain // J. Clin.r Microbiol.-2004.-Vol. 42.-P. 1609-1613.

151. Santos N-et al. VP4 genotyping of human rotavirus in the United States // J. ф Clin. Microbiol. 1994. - Vol. 32, N 1. - P. 205-208.

152. Santos N, Hoshino Y. Global distribution of rotavirus serotypes/genotypes and its implication for the development and implementation of an effective rotavirus vaccine // Rev. Med. Virol. 2005. - Vol. 15. - P. 29-56.

153. Shuttleworth G., Eckery D.C., Awram P. Oral and intraperitoneal immunization with rotavirus 2/6 virus-like particles stimulates a systemic and mucosal immune response in mice // Arch. Virol. -2005. Vol. 150. - P. 341-9.1. Y'

154. Silvestri L.S., Taraporewala Z.F., Patton J.T. Rotavirus replication: plus-sense templates for double-stranded RNA synthesis are made in viroplasm // J. Virol. 2004. - Vol. 78. - P. 7763-74.

155. Simonsen L., Morens D.M., Eixhauser A. et al. Effect of rotavirus vaccination programme on trend in admission of infants to hospital for intussusception // Lancet. 2001. - Vol. 358. - P. 1224-1229.

156. Simonsen L., Viboud C., Elixhauser A. et al. More on RotaShield and Intussusception: The Role of Age at the Time of Vaccination // J. Infect. Dis. 2005.1л -Vol. 192.-P. 36-43.

157. Soares-Weiser K., Goldberg E., Tamimi G. et al. Rotavirus vaccine for ^ preventing diarrhea // Cochrane Database Syst Rev. 2004.

158. Song M.O., Kim K.J., Chung S. I. et al. Distribution of human group a rotavirus VP7 and VP4 types circulating in Seoul, Korea between 1998 and 2000 // J. Med. Virol. 2003. - Vol. 70. - P. 324-328.

159. Souza M.B., Racz M.L., Leite J.P. et al. Molecular and serological characterization of group a rotavirus isolates obtained from hospitalized children in Goiania, Brazil, 1998-2000 // Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 2003. - Vol. 22. -P. 441-443.

160. Taraporewala Z.F., Patton J.T. Nonstructural proteins involved in genome packaging and replication of rotaviruses and other members of the Reoviridae // Virus Res. 2004. - Vol. 101. - P. 57-66.

161. Tsai C., Chiu H., Abe T. Epidemiologic features infection in Taiwan: A review // Pediatrics International. 2000. - Vol.42. - P. 411-414.

162. Unicomb L.E., Bishop R.F. Epidemiology of rotavirus strains infecting children throughout Australia during 1986-1987. A study of serotype and RNA electrophoretype // Arch. Virol. 1989. - Vol. 106, N 2. - P. 23-35.

163. Ushijima H., Koike H., Mukoyama A. et al. Detection and serotyping of rotaviruses in stool specimens by using reverse transcription and polymerase chain reaction amplification // J. Med. Virol. 1992. - Vol. 38, N 4. - P. 292-297.

164. Van der Heide R., Koopmans M.P., Shekary N. et al. Molecular characterizations of human and animal group a rotaviruses in the Netherlands // J. Clin. Microbiol. 2005. - Vol. 43. - P. 669-75.

165. Varghese V., Das S., Singh N.B. et al. Molecular characterization of a human rotavirus reveals porcine characteristics in most of the genes including VP6 and NSP4 // Arch Virol. 2004. - Vol. 149. - P. 155-72.

166. Vende P., Tortorici M.A., Taraporewala Z.F., Patton J.T. Rotavirus NSP2 interferes with the core lattice protein VP2 in initiation of minus-strand synthesis // Virology. 2003. - Vol. 313. - P. 261-73.

167. Vesikari Т., Karvonen A., Puustinen L. et al. Efficacy of RIX4414 live attenuated human rotavirus vaccine in Finnish infants // Pediatr. Infect. Dis. J. -2004. Vol. 23.-P. 937-43.

168. Villena C., El-Senousy W.M., Abad F. X. et al. Group A rotavirus in sewage samples from Barcelona and Cairo: Emergence of unusual genotypes // Applied and Environmental Microbiol. 2003. - Vol.69, N 7. - P. 3919-3923.

169. Vitour D., Lindenbaum P., Vende P. et al. RoXaN, a novel cellular protein containing TPR, LD, and zinc finger motifs, forms a ternary complex with eukaryotic initiation factor 4G and rotavirus NSP3 // J. Virol. 2004 Vol. 78. - P. 3851-62.

170. Wang L., Huang J.A., Nagesha H.S. et al. Bacterial expression of the major antigenic regions of porcine rotavirus VP7 induces a neutralizing immune in mice. Order this document. // Vaccine. 1999. - Vol.17, N 20-21. - P. 2636-2645.

171. Ward RL. Rotavirus vaccines: is the second time the charm? // Curr. Opin. Investig. Drugs. 2005. - Vol. 6. - P.798-803.

172. Watanabe M, Nakagomi T, Koshimura Y, Nakagomi O. Direct evidence for genome segment reassortment between concurrently-circulating human rotavirus strains. // Arch. Virol. 2001. - Vol. 146, N 3. - P. 557-70.

173. Wilhelmi I., Mier C., Roman E. et al. The molecular epidemiology of the rotavirus in Spanish children // Enferm. Infecc. Microbiol. Clin. 1999. - Vol. 17, N 10.-P. 509-514.

174. Wood D. WHO informal consultation on quality, safety and efficacy specifications for live attenuated rotavirus vaccines Mexico City, Mexico, 8-9 February 2005 // Vaccine 2005.

175. Yuan L., Azevendo M.S., Gonzales A.M. et al. Mucosal and systemic antibody responses and protection induced by a prime/boost rotavirus-DNA vaccine in a gnotobiotic pig model // Vaccine. 2005. - Vol. 23. - P. 3925-36.

176. Zarate S., Romero P., Espinosa R. et al. VP7 mediates the interaction of rotaviruses with integrin alphavbeta 3 through a novel integrin-binding site // J. Virol. 2004. - Vol. 78. - P. 10839-47.

177. Zbinden R., Kunz J., Schaad U. et al. Incidence and diagnosis of infection in neonates: result of two studies // J. Perinat Med. 1990. - Vol. 18. - P. 363-368.

178. Zeng M., Zhu Q.R., Zhang Y. et al. Molecular epidemiologic survey of rotaviruses from infants and children with diarrhea in Shanghai // Zhonghua Er Ke Za Zhi.- 2004. -Vol. 42. -P. 10-15.

179. Zhang M., Zeng C., Morris A. et al. A functional NSP4 enterotoxin peptide secreted from rotavirus-infected cells // J. of Virology. 2000. - Vol. 74. - P. 1166311670.

180. Zhang L.J., Du Z.Q., Zhang Q. et al. Rotavirus surveillance data from Kunming Children's Hospital, 1998 2001 // Zhonghua Liu Xing Bing Xue Za Zhi. -2004.-Vol. 25.-P. 369-399.

181. Zimmerman C.M., Bresee J.S., Parashar U.D. et al. Cost of diarrhea-associated hospitalizations and outpatient visits in an insured population of young children in the United States // Pediatr. Infect. Dis. J. 2001. - Vol. 20, N 1. - P. 1419.