Идентификация и биохимическая характеристика геновариантов парэховирусов человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Зверев, Владимир Владимирович

• Зверев, Владимир Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Зверев, Владимир Владимирович

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ __5

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ_9

1.1 Открытие парэховирусов человека, их таксономическое положение_10

1.2 Структурная и молекулярная организация парэховирусов_13

1.2.1 Архитектура и физические свойства вириона _13

1.2.2 Организация генома__15

1.2.3 Вирусные протеины__17

1.3 Генетические взаимоотношения ПЭВ_21

1.3.1 Генетические взаимоотношения ПЭВ с другими представителями семейства. Р1согпауичс1ае_21

1.3.2 Генетические взаимоотношения ПЭВ с представителями рода Рагескоуггш__22

1.3.3 Генетическое разнообразие и эволюция парэховирусов человека _23

1.4 Характеристика ПЭВ инфекции_27

1.4.1 Значимость ПЭВ в инфекционной патологии человека_27

1.4.2 Клинические проявления ПЭВ инфекции_28

1.5 Методы обнаружения и типирования ПЭВ__30

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ_38

2.1 Исследуемые объекты_38

2.2 Обнаружение и типирование РНК парэховирусов методом ОТ-ПЦР_39

2.3 Определение нуклеотидной последовательности амплифицированных фрагментов кДНК методом секвенирования_43

2.4 Объемы проведенных исследований_46

2.5 Статистический анализ результатов_46

2.6 Нормативно-методические материалы_47

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ_48

3.1 Оптимизация универсального метода ОТ-ПЦР для выявления РНК

парэховирусов человека и его апробация_48

3.1.1 Выбор праймеров__48

3.1.2 Оптимизация условий проведения ПЦР_54

3.1.3 Апробация методики для обнаружения РНКПЭВ на клиническом материале__55

3.1.4 Обнаружение ПЭВ с использованием оптимизированной методики ОТ-ПЦР_60

3.2 Разработка и применение методики на основе ПЦР для определения типа ПЭВ _63

3.2.1 Разработка «гнездового» варианта ПЦР для идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов_64

3.2.2 Применение ПЦР на основе типовых праймеров для идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов _82

3.3 Молекулярная характеристика ПЭВ: анализ на основе нуклеотидных и аминокислотных последовательностей_83

3.3.1 Филогенетический анализ российских изолятов парэховирусов человека__84

3.3.2 Анализ аминокислотной последовательности фрагментов капсидных белков УР1 и УРЗ__89

ЗАКЛЮЧЕНИЕ__96

ВЫВОДЫ_104

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

105

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

а.о. - аминокислотные остатки

дНТФ - дезоксинуклеозидтрифосфаты

кДНК - комплементарная ДНК

н.о. - нуклеотидные основания

ОГЭ - острый гастроэнтерит

ОКИ - острая кишечная инфекция

ОРС - открытая рамка считывания

ОТ-ПЦР - обратная транскрипция/полимеразная цепная реакция

п.н. - пара нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

пэв - парэховирусы человека

РНК - рибонуклеиновая кислота

ПЭВ - парэховирусы человека

цдд - цитопатогенное действие

эв -энтеровирусы

5'НТР - 5'нетранслируемый регион

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Идентификация и биохимическая характеристика геновариантов парэховирусов человека»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальной проблемой современной биохимии является развитие методов генодиагностики, в том числе для заболеваний, вызываемых некультивируемыми или трудно культивируемыми микроорганизмами и вирусами. Такими трудно культивируемыми вирусами, для которых в нашей стране отсутствуют диагностические тест-системы, являются парэховирусы человека.

Парэховирусы человека (сем. Picornaviridae, род Parechovirus), первоначально классифицированные как вирусы ЕСН022 и ЕСН023 в пределах рода Enterovirus, были открыты R. Wigand и A. Sabin в 1956 году. Подобно энтеровирусам, парэховирусы являются причиной возникновения множества различных инфекционных заболеваний человека, таких как серозный менингит, миокардит, экзантема, миозит, сепсисоподобное заболевание новорожденных, лихорадка, острый гастроэнтерит и респираторные заболевания [71, 96]. Основной группой риска по заболеванию парэховирусной инфекцией являются дети в возрасте до 5 лет [35, 54, 15]. Широкая распространенность и значимость ПЭВ в инфекционной патологии детей первых лет жизни определяют пристальное внимание исследователей к данным вирусам во всем мире. Особое внимание уделяется совершенствованию методов генодиагностики ПЭВ инфекции, в частности методов на основе амплификации нуклеиновых кислот, специфичность и чувствительность которых неразрывно связана со знанием генетического разнообразия возбудителя и с оптимизацией условий проведения ферментативной реакции.

Парэховирусы человека, циркулирующие в мире, характеризуются значительным генетическим разнообразием, заключающемся в существовании как минимум 16-ти типов [www.picornaviridae.com]. Наличие такого количества типов затрудняет разработку ПЦР для выявления и типирования РНК ПЭВ и делает необходимым изучение вариабельности нуклеотидных

последовательностей генома штаммов, циркулирующих на разных территориях.

Важным направлением биохимических исследований является изучение организации биологических структур. Парэховирусы являются недостаточно изученным объектом. Они отличаются от энтеровирусов не только организацией генома, но и структурно-функциональными особенностями капсидных белков [95, 96, 109]. Получение новых знаний о первичной и вторичной структуре белков различных геновариантов парэховирусов будет способствовать решению проблемы их узнавания на молекулярном уровне.

В России исследований по изучению разнообразия парэховирусов до начала наших исследований не проводилось в связи с отсутствием диагностических систем и лабораторных методик для обнаружения ПЭВ, что и определило направление исследований данной работы.

Целью исследования явилась разработка методов на основе ПНР для обнаружения и типовой идентификации парэховирусов человека и биохимическая характеристика их геновариантов. -

Задачи исследования

1. На основе анализа нуклеотидных последовательностей генома ПЭВ, представленных в ОепВапк, провести теоретическую оценку известных праймеров для детекции РНК ПЭВ разных типов методом ОТ-ПЦР. Выбрать эффективную пару универсальных праймеров для амплификации консервативного участка 5'НТР генома ПЭВ, оптимизировать условия постановки реакции, апробировать метод на клиническом материале.

2. С использованием оптимизированного метода ОТ-ПЦР провести поиск ПЭВ у детей с острым гастроэнтеритом, оценить частоту их обнаружения.

3. Разработать метод идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов на основе «гнездовой» ПЦР области УР1 генома. Определить типы парэховирусов и их распределение.

4. Установить первичную структуру нуклеотидных последовательностей фрагментов 5'НТР и области УРЗ-УР1 генома нижегородских изолятов парэховирусов, изучить их вариабельность.

5. На основе анализа нуклеотидных последовательностей фрагментов генома провести филогенетический анализ штаммов, определить генотипы ПЭВ 1-го типа.

6. Проанализировать предсказанные аминокислотные последовательности фрагментов С-концевого участка белка УРЗ и >1-концевого участка белка УР1 ПЭВ различных генотипов.

Научная новизна работы

С использованием оптимизированного метода ОТ-ПЦР впервые, на примере г. Нижнего Новгорода, показана циркуляция парэховирусов среди населения России; установлена частота обнаружения ПЭВ у детей с острой кишечной инфекцией, равная 3,5-10,4%, в разные годы.

Разработан авторский метод идентификации ПЭВ трех наиболее распространенных (1-го, 3-го и 6-го) типов, применение которого впервые показало доминирование в нижегородской популяции парэховирусов ПЭВ 1 -го типа.

Впервые определены нуклеотидные последовательности фрагментов генома 5'НТР и области УРЗ-УР1 российских изолятов парэховирусов человека, которые депонированы в ОепВапк/ЕМВЬЛЖВ1 под номерами 1Р330795-1Р330833,1(2437842-1(2437881, К2437883, Л2437884, что расширило международную базу нуклеотидных последовательностей генов парэховирусов человека из разных регионов мира.

Впервые с использованием анализа нуклеотидных последовательностей фрагмента области УРЗ-УР1 генома и, соответственно предсказанных, аминокислотных последовательностей, выявлен и охарактеризован новый 1С генотип ПЭВ 1-го типа, характеризующийся уникальной аминокислотной последовательностью Ы-конца капсидного белка УР1.

Практическая значимость работы

Методические разработки по оптимизации и апробации на современных штаммах метода ОТ-ПЦР для универсальной детекции РНК парэховирусов человека, могут стать основой создания отечественной ПЦР-тест-системы для диагностики парэховирусной инфекции.

С участием автора составлен проект методических рекомендаций «Молекулярно-генетические исследования при мониторинге энтеровирусной инфекции: III. Обнаружение и генотипирование парэховирусов человека» (вход. ФС Роспотребнадзора №01/26461-1от 25.10.2011).

Научные результаты, полученные в ходе выполнения работы, используются в учебном процессе ННГУ им. H.H. Лобачевского при подготовке магистров и аспирантов, обучающихся по специальности 020201 - биология.

Положения, выносимые на защиту

Разработана и апробирована панель олигонуклеотидных праймеров, позволяющая в оптимизированных условиях постановки ПЦР проводить универсальную и дифференциальную идентификацию РНК парэховирусов человека.

Разнообразие парэховирусов, циркулирующих на территории Нижнего Новгорода, представлено как минимум четырьмя типами парэховирусов (1-й, 3-й, 4-й, 6-й), с преобладанием парэховирусов 1-го типа.

Идентифицирован новый 1С генотип ПЭВ 1-го типа, имеющий уникальную аминокислотную последовательность N-конца белка VP1 (NAEECKQSI) в позиции 18-26, которая может служить его биохимическим маркером.

Апробация работы:

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на:

• X Всероссийской медико-биологической конференции

молодых исследователей «Фундаментальная наука и клиническая

медицина» (г. Санкт-Петербург, 2007 г.)

• VI Нижегородской сессии молодых ученых (г. Нижний Новгород, 2008 г.);

• научно-практической конференции молодых ученых «Инновационные технологии в противоэпидемической защите населения» (г. Нижний Новгород, 2011 г.);

• заседаниях Ученого Совета Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной и проблемных научно-практических семинарах института.

Объем и структура диссертации:

Материалы диссертации изложены на 115 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и указателя литературы, включающего 113 источников литературы отечественных (2) и зарубежных авторов (111). Диссертация иллюстрирована 15 рисунками и 15 таблицами.

По результатам диссертации опубликовано 10 печатных работ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1Л Открытие парэховирусов человека, их таксономическое положение

В 1956 году во время изучения летней диареи Wigand R. и Sabin А. выделили из ректальных тампонов больных детей два ранее неизвестных вируса. Вирионы этих вирусов имели структуру капсида и РНК геном такие же, как у энтеровирусов. В связи с этим новые вирусы первоначально были классифицированы в составе рода Enterovirus семейства Picornaviridae (от лат. pico - маленький, та - тип нуклеиновой кислоты) и названы ECHO 22 (штамм Harris) и ECHO 23 (штамм Williamson) [110].

Однако уже первые результаты, полученные при изучении новых вирусов, показали наличие у них ряда необычных свойств, которые значительно отличались от таковых у энтеровирусов [91]. Вирусы ЕСН022 и ЕСН023 с трудом реплицировались и адаптировались в культуре клеток почек обезьян, при этом отсутствовал цитопатический эффект в периферической части монослоя клеток. При развитии ЦПД наблюдалась явная деградация ядра и хроматина, что было не типично для энтеровирусов, которые вызывают выраженные изменения цитоплазмы и могут реплицироваться в безъядерных клетках [51, 104]. При дальнейшем изучении энтеровирусов было установлено, что вирусы ЕСН022 и ЕСН023 в отличие от типичных энтеровирусов не подавляют синтез клеточных белков [25, 97]. В тоже время известно, что одним из механизмов, приводящих к подавлению белкового синтеза в клетке, инфицированной рино-, афто-, и энтеровирусами, является расщепление белка р220, что не происходит в клетках, инфицированных парэховирусами [26]. Кроме этого, в отличие от других энтеровирусов, репликация ЕСН022 и ЕСН023 не ингибируется 2-(о-гидроксибензил)-бензимидазолом [34]. С использованием методов молекулярной биологии, в частности метода молекулярной гибридизации, было установлено, что эти два вируса не распознаются ДНК-зондами, предназначенными для идентификации энтеровирусов различных подгрупп [7, 8, 47]. С появлением метода ПЦР выяснилось, что геном этих вирусов не амплифицируется при помощи

олигонуклеотидных праймеров, специфичных для энтеровирусов [25, 26]. Детальный молекулярно-генетический анализ этих вирусов, в том числе определение нуклеотидных последовательностей генома и сравнение их с нуклеотидными последовательностями других пикорнавирусов, продемонстрировал, что ЕСН022 и ЕСН023 значительно отличаются от представителей существующих родов семейства и формируют самостоятельную генетическую группу [39, 42, 97]. На основании молекулярно-генетических особенностей в 1999 году вирусы ЕСН022 и ЕСН023 были выделены в самостоятельный род Parechovirus и названы НРБVI и HPEV2 соответственно [59, 71, 95].

В 1998 г. В. Niklasson с соавторами опубликовали сообщение о выделении от рыжих полевок 3-х штаммов нового пикорнавируса, которые имели высокий уровень гомологии аминокислотных последовательностей капсидных белков с аминокислотными последовательностями белков вируса HPEV1. Новый вирус получил название Ljungan. Показано, что гомология аминокислот белка VP3 вируса Ljungan и парэховируса человека превосходит 70%, что больше, например, чем гомология аминокислотных последовательностей белков энтеровирусов некоторых серотипов [74,75]. Эти наблюдения свидетельствовали, что вирус Ljungan и близкие к нему вирусы принадлежат к роду Parechovirus.

В настоящее время род Parechovirus включает два вида вирусов (http://www.picornaviridae.com/parechovirus/parechovirus.htm):

- парэховирус человека (ПЭВ), известно 16 типов;

- вирус Ljungan, известно 4 типа.

Помимо парэховирусов в огромное семейство Picornaviridae, включающее много важных патогенов человека и позвоночных животных, входят 12 родов вирусов (рис.1): Aphthovirus, Avihepatovirus. Cardiovirus, Enterovirus. Erbovirus. Hepatovirus, Kobuvirus, Parechovirus. Sapelovirus, Senecavirus. Teschovirus, Tremovirus.

I _

Ойепка

НРсУ Н{ V*

Рисунок 1 Филогенетические взаимоотношения пикорнавирусов: классификация на роды и виды [44].

Также, в настоящее время известно 15 пикорнавирусов, для которых, полностью или частично, определены нуклеотидные последовательности генома, но не произведена классификация до рода и вида (http://www.picornaviridae.com/unassigned/unassigned.htm).

1.2 Структурная и молекулярная организация парэховирусов 1.2.1 Архитектура и физические свойства вириона

Парэхо вирусы, как и другие представители Picornaviridae, являются мелкими безоболочечными вирусами, вирионы которых имеют диаметр 30 нм (рис.2А). Современные методы криоэлектронной микроскопии в совокупности с пространственной реконструкцией позволили выявить морфологические особенности капсида парэховирусов. Показано, что поверхность вириона имеет рифленую топографию: имеются выступающие плато в форме звезды, окруженные глубокими каньонами, в углублениях которых располагаются сайты связывания клеточных рецепторов [60]. В сравнении с другими пикорнавирусами поверхность вириона Г1ЭВ 1-го типа является более гладкой (рис.ЗБ) [90].

Капсид парэховирусов представляет собой типичный икосаэдр с Т=1 (псевдо Т=3), состоит из 60 протомеров. Протомер (элементарная структурная единица капсида) образован тремя структурными полипептидами - VPO, VP1 и VP3, в общей сложности капсид состоит из 180 белковых субъединиц (рис.2В) [93, 90]. Полипептид VP0 является нерасщепленным предшественником полипептидов VP2 и VP4. Внешняя поверхность протомеров сформирована белками VP I, VP3 и УР2-фрагментом полипептида VP0, в то время как VP4-фрагмент VP0, более мелкий по размерам, находится на внутренней поверхности капсида [97].

По своим физическим свойствам (плавучей плотности в CsCl, равной 1,36 г/см5, стабильности в широком диапазоне рН, в частности устойчивости в кислой среде при рН<3) парэховирусы сходны с другими пикорнавирусами: энтеровирусами, кардиовирусами и вирусом гепатита А [97].

В

- \->"

4 / л

К

Y

шшш

V— VP1

г

'v^ VPO

т

Рисунок 2 Изображение вириона парэховирусов Л) Электронная микрофотография ПЭВ 1-го типа (хЗОО ООО) [Hyypia 1996] Б) Модель капсида парэховирусов. построенная при помощи криоэлектронной микроскопии и 3D реконструкции [Seitsonen 20101

В)Схематическое изображение вириона парэховирусов

[http://viralzone.expasy.org/all_by j)rotein/657.html].

1.2.2 Организация генома

Парэховирусы человека, как и все представители семейства Р1согпаутс1ае, в качестве генома имеют однонитевую РНК положительной полярности длиной около 7300 нуклеотидов [43]. РНК ПЭВ является инфекционной, но высокочувствительной к рибонуклеазам: для утраты инфекционности достаточно одного разрыва, причем независимо от того, изолирована РНК или она находится в составе вирусной частицы [60].

Геномная РНК ПЭВ по своей функциональной активности является матричной РНК, однако ее структурная организация несколько отличается от структуры классической мРНК (Рис. ЗА). На 5'-конце РНК ПЭВ отсутствует сар-структура. Вместо нее к 5'-концу РНК посредством ОН-(5'-уридил)-тирозиновой связи (причем тирозин - всегда третья аминокислота с 1Ч-конца) ковалентно присоединен низкомолекулярный (22 а.о.) белок Этот белок не требуется для проявления инфекционности вирусной РНК и его удаление протеиназами не приводит к ее снижению [38]. УР§ входит в состав белок-нуклеотидной затравки, необходимой для инициации синтеза вирусной РНК РНК-зависимой РНК-полимеразой [73].

На 3'-конце РНК парэховирусов находится поли(А)-последовательность, наличие которой защищает кодирующую область от деградации нуклеазами. Отщепление поли(А)-трека рибонуклеазой заметно снижает инфекционность РНК [93, 97].

Геном парэховирусов, также, как и других пикорнавирусов, представляет собой единственную ОРС, фланкированную двумя нетранслируемыми регионами - 5'НТР и З'НТР.

Область 5'НТР генома пикорнавирусов хорошо изучена в связи с критическим участием данного региона в процессах трансляции и репликации, а также возможностью картирования этой области на предмет мутаций, способных изменять тропизм и патогенность пикорнавирусов [85].

Длинный (712 н.о.) 5'НТР генома парэховирусов имеет сложную вторичную структуру и несколько функциональных элементов, участвующих в трансляции геномной РНК и ее репликации (рис.3).

Рисунок 3 Структурная организация генома ПЭВ (А) и его 5'НТР (Б)

[Stanway G., 1999]

В 5'НТР генома ПЭВ можно выделить 12 основных доменов (A-L), каждый из которых имеет свою организацию и функции. Как оказалось, домены не равноценны в плане своей роли в процессах жизненного цикла вируса, непосредственно связанных с 5'НТР. Первые 112 нуклеотидов геномной РНК формируют так называемую «stem-loop» структуру, состоящую из двух

доменов - А и В, функция которых связана с формированием репликативного комплекса [73]. По вторичной структуре 5'НТР генома парэховирусы сходны с кардио- и афтовирусами, но отличаются от энтеровирусов, у которых первые 100 нуклеотидов формируют структуру «cloverleaf», похожую на лист клевера [95, 5].

Последовательность участка 5'НТР генома парэховирусов с 100 по 156 нуклеотид вариабельна и богата А и С основаниями («AC-rich» область). Роль этого участка в цикле репродукции вируса до конца не ясна, однако полная делеция «AC-rich» области летальна для вируса [73].

Проксимальная часть 5'НТР, включающая домены А, В и псевдоузел С (часть домена В), как уже отмечалось, необходима для геномной репликации -ее удаление приводило к летальному исходу, но не оказывало действия на эффективность трансляции в условиях in vitro. В тоже время удаление доменов Н и L незначительно уменьшало эффективность трансляции in vitro, а удаление доменов I, J, и К приводило к ее полной остановке [73].

Важной функционально-активной, самой протяженной частью 5'НТР является IRES (Internal Ribosomal Entry Site) - последовательность нуклеотидов, формирующая внутренний сайт связывания с рибосомами. Наличие IRES обеспечивает парэховирусам, также, как и другим пикорнавирусам, возможность инициации сар-независимой трансляции вирусной РНК [52]. По особенностям первичной и вторичной структур IRES парэховирусов относится ко П-ому типу и подобен таковому кардио- и афтовирусов [73].

Начиная с инициирующего кодона AUG (позиция 710 для ПЭВ 1-го типа, штамм Harris), начинается единая протяженная открытая рамка считывания, которая кодирует «полипротеин» [85, 86].

1.2.3 Вирусные протеины

ОРС генома ПЭВ имеет протяженность 6539 нуклеотидов (710 - 7249 н.о. по геному ПЭВ 1-го типа, шт. Harris) и кодирует единственный полипротеин. ОРС условно разделена на 3 части: домен Р1, расположенный на 5'-конце рамки

считывания, кодирует капсидные белки, центральный домен Р2 и домен РЗ, расположенный ближе к З'-концу транслируемого региона генома, кодируют неструктурные белки вируса (протеазы, геномный пептид, белки участвующие в репликации, полимеразу). В процессе трансляции полипротеин подвергается каскаду протеолитического расщепления на 10 конечных протеинов, причем в процессе расщепления образуются промежуточные формы протеинов, каждая из которых может выполнять различные функции [85, 86]. Капсидные протеины (1АВ, 1С и Ю, известные как УРО (УР4+УР2), УРЗ и УР1, соответственно) расположены на №конце полипротеина, а неструктурные белки (2А, 2В, 2С, ЗА,В, ЗС и ЗЭ) ближе к С-концу [96].

Сравнительный анализ предсказанной первичной и вторичной структуры белков НРЕУ1 со структурой белков других пикорнавирусов выявил наличие не только их большого сходства, но и существование различий, как на уровне структурной организации, так и на уровне функций [45, 97].

УРО. Отличительной особенностью процессинга структурных белков ПЭВ является отсутствие протеолиза УРО. Это было установлено при исследовании выделенных и очищенных вирионов НРБVI с использованием электрофореза белков. При идентификации капсидных протеинов на электрофореграмме было выявлено 3 главных полосы, образованных белками с молекулярной массой 38.0, 30.5 и 30.0 кБа. По аналогии с другими пикорнавирусами полоса 30.5 Ша соответствовала УР1, а 30.0 Ша - УРЗ. Очищенный протеин 38.0 Ша был подвергнут действию пищевого трипсина с последующим определением аминокислотной последовательности фрагментов. Полученные последовательности были идентифицированы как УР2 и УР4 протеины. Это означает, что молекулы УРО не претерпевают процессинга с образованием УР2 и УР4 во время окончательного созревания протеина [85, 95].

Белок УР2 высоко консервативен в пределах семейства пикорнавирусов. По своей структурной организации УР2-часть белка УРО у ПЭВ обладает сходством с УР2 других пикорнавирусов. Этот полипептид

формирует внешнюю поверхность протомера капсида [97]. УР4-часть VP0 формирует внутреннюю поверхность капсида и участвует во взаимодействии с РНК и ее упаковке в вирион [24, 62].

УР1 - структурный белок капсида вириона, содержит домены, связывающие протомеры. Установлено, что вторичная структура VP1 ПЭВ имеет ряд особенностей: петли между (3-нитями D-E, E-F и H-I короткие и соответствуют таковым у афтовирусов, a G-H петля короче, чем у любого другого проанализированного пикорнавируса [97]. Полипептид VP1 содержит аминокислотные последовательности, определяющие серотип парэховируса и является главным рецепторным локусом. Точное расположение нейтрализующих антигенных сайтов у парэховирусов человека не определено. В отличие от энтеро-, кардио- и афтовирусов иммуногенная активность белка VP1 парэховирусов оказалась низкой [4, 55].

На С-конце белка VP1 ПЭВ некоторых типов идентифицирован RGD мотив (аргинин-глицин-аспарагиновая кислота). Эта последовательность используется многими вирусами для специфической адсорбции на клеточной поверхности в процессе проникновения вируса в клетку. Показана критическая роль RGD мотива VP1 ПЭВ 1-го типа во взаимодействии с клеточными интегринами (а урь о^Рз, OvPó) [20, 90, 105]. Эти интегрины взаимодействуют с VP1 ПЭВ 1-го типа с разной эффективностью, что связано с аминокислотами самих интегринов, а не вируса. Наибольшее сродство RGD-VP1 ПЭВ проявляет к интегрину с^Рб [90].

VP3, также, как и VP1, содержит домены, связывающие протомеры. Белок VP3 парэховирусов отличается от VP3 других пикорнавирусов наличием N-концевого участка с преобладанием положительно заряженных аминокислот длиной примерно в 30 а.о. [45, 97]. VP3 у парэховирусов является основным белком, стимулирующим выработку протективных антител класса IgG. Изучение Т-клеточного ответа у 20-ти взрослых с различными титрами антител к ПЭВ показало, что ответ на белок VP3 наблюдался в 75% случаев [4].

Белок 2А парэховирусов, в отличие от аналогичного белка-протеазы энтеровирусов, не обладает протеолитической активностью. Следствием этого является отсутствие в клетке, инфицированной ПЭВ, подавления «сар»-зависимой трансляции белков хозяина [25, 26]. Показано, что белок 2А ПЭВ способен специфически связываться с вирусной РНК, что указывает на его роль в репликации вируса [87]. Этот белок имеет в своем составе мотивы, гомологичные мотивам клеточных белков, участвующих в пролиферации [109].

Белок 2В участвует в изменении проницаемости мембран, для облегчения выхода новых вирусных частиц из клетки [60].

Белок 2С парэховирусов, подобно 2С других пикорнавирусов, обладает НТФазной/хеликазной активностью и участвует в репликации вирусной РНК и ее упаковке в вирион [61, 62, 87].

Функция ЗА-белка, являющегося гидрофобным белком парэховирусов точно не установлена и, по-видимому, она отличается от функции эквивалентного белка энтеровирусов, который ингибирует клеточную секрецию [62]. Возможно, белок ЗА может участвовать в транспорте геномного белка VPg [60].

ЗВ - это низкомолекулярный белок УР§, который в нативном вирионе ассоциирован с 5'-концом вирусной РНК. Этот протеин входит в состав белок-нуклеотидной затравки \^-рири для РНК-зависимой РНК-полимеразы при синтезе вирусной РНК. Кроме этого, VPg играет важную роль в процессе сборки вириона - только те РНК, у которых 5'-конец связан с VPg, упаковываются в вирусный капсид [73].

Белок ЗС - это вирусная протеаза, участвующая в большинстве актов расщепления «полипротеина». Протеолитической активностью обладает и белок-предшественник ЗСБ [39].

Белок ЗБ - РНК-зависимая РНК-полимераза осуществляет репликацию вирусного генома [61, 95].

1.3 Генетические взаимоотношения ПЭВ

1.3.1 Генетические взаимоотношения ПЭВ с другими представителями

семейства Р1согттпс1ае

В любом регионе генома, за исключением 5'НТР, парэховирусы

значительно отличаются от других пикорнавирусов по своим молекулярно-генетическим свойствам и составляют отдельную молекулярную группу, что отражено на дендрограмме, где проиллюстрированы молекулярные взаимоотношения представителей основных родов пикорнавирусов (рис.4).

Анализ показывает, что энтеровирусы и риновирусы тесно связаны между собой (гомология нуклеотидных последовательностей составляет 65% и выше), также видна связь между афтовирусами и кардиовирусами (гомология нуклеотидных последовательностей на уровне 58%). Такие генетические взаимоотношения коррелируют со сходством геномной организации представителей родов, с функциональными свойствами 2А протеина и наличием/отсутствием Ь протеина. В противоположность, гепатовирусы и парэховирусы не имеют подобных тесных отношений (сходство с другими родами семейства составляет приблизительно 40%) и являются примерами сравнительно различающихся генетических линий. Принадлежность к разным филогенетическим линиям коррелирует с известными различиями в геноме и структуре вирусных частиц данных родов. Например, в случае парэховирусов капсид образован тремя структурными протеинами, вследствие отсутствия расщепления УРО на УР2 и УР4, и отсутствует протеолитическая активность у протеина 2А [95].

е**те»

Епмкт> >0

ШШИ» Н РЛМ

Парэховирусы Ге патов и русы

——{

С*

Ш0»01

ЯМТО АЮ

Энтеровирусы ириновирусы

Кардиовирусы Афтовирусы

% гомологии

Рисунок 4 Дендрограмма, построенная на основе аминокислотных последовательностей протеина УРЗ пикорнавирусов [95].

1.3.2 Генетические взаимоотношения ПЭВ с представителями рода

Рагескоукт

Самые близкие генетические связи парэховирусов человека прослеживаются с группой вирусов, включающей вирус Ь]ип§ап, выделенный в 1998 г. из грызуна - рыжей полевки (С1еИшопотш §1агео1из) в Швеции при поиске инфекционного агента ряда заболеваний человека, таких, как сахарный диабет I типа, миокардит и синдром Гийена-Барре [74, 75, 103]. В то время была отмечена примечательная корреляция между повышением уровня заболеваемости данными болезнями и увеличением популяции этих грызунов. Антигены вируса Ьщг^ап были обнаружены в образцах тканей плода человека в случае внутриутробной смерти. Однако необходимы дальнейшие

исследования для подтверждения роли вируса Цш^ап в качестве возможного агента зоонозных заболеваний [76].

Вирус Ь]Ш^ап обладает значительной гомологией нуклеотидной последовательности в структурном регионе генома с парэховирусом человека. Показано, что степень гомологии аминокислотных последовательностей УРЗ вируса Цшщап и ПЭВ превосходит 70%. Вирус Цшщап обладает такими же характеристиками М-конца УРЗ, которые первоначально были обнаружены только у парэховирусов человека. Другой протеин вируса Цш^ап - УРО также имеет высокую степень гомологии с УРО ПЭВ, хотя Ы-конец протеина, регион высокой вариабельности у парэховирусов человека, на 38 аминокислот короче [74, 75]. На основании этих наблюдения Цшт^ап вирус был классифицирован в составе рода. Рагескоуггж [94].

Выделение близкородственных вирусов из таких различных хозяев, как люди и грызуны, нехарактерно для пикорнавирусов, которые в основном имеют четко определенный круг хозяев и являются видоспецифичными. В связи с вышеизложенным интересным является вопрос о происхождении парэховирусов как патогенов человека, так как они сравнительно недавно появились в человеческой популяции. Не исключено существование природного животного резервуара парэховирусов, способных инфицировать человека, что может объяснить их генетическую связь и наводит на мысль, что Ь]ип§ап вирус может быть непосредственной причиной заболеваний человека и его изучение может иметь значение для объяснения появления патогенных для человека парэховирусов. Ответы на эти вопросы могут иметь большое значение для эпидемиологии вирусных заболеваний и для здоровья человека в целом [74, 75].

1.3.3 Генетическое разнообразие и эволюция парэховирусов человека

Как уже отмечалось, первые типы ПЭВ были идентифицированы как серотипы энтеровирусов ЕСН022 и ЕСН023 в 1956 г. в реакции нейтрализации с типоспецифическими сыворотками. Анализ современных

штаммов ПЭВ 1-го типа показал, что для него характерно большее число генетических вариантов, чем для ПЭВ других типов. В настоящее время показано, что варианты ПЭВ 1-го типа, идентифицированные в разных странах, разделяются на 2 генотипа: 1А и 1В. ПЭВ генотипа 1А менее многочисленны и проявляют генетическое родство с прототипным штаммом Harris, который был выделен в середине XX века. Подавляющее большинство ПЭВ 1-го типа, выявленных в первом десятилетии XXI века, принадлежат генотипу 1В [16].

Следующий тип ПЭВ - 3-й, впервые был идентифицирован в Японии в 2004 году с использованием не только серологических, но и молекулярных методов исследования. Вскоре после открытия ПЭВ 3-го типа был идентифицирован в Северной Америке и Европе [19, 50].

ПЭВ 4-го типа впервые был обнаружен в Нидерландах также с использованием и серологических и молекулярных методов исследования [14]. Корректность выделения 4-го типа ПЭВ была подтверждена в филогенетическом исследовании коллекции изолятов вирусов, при котором также был охарактеризован и ПЭВ 5-го типа. Это был штамм СТ86-6760, первоначально классифицированный как разновидность ПЭВ 2-го типа. Он генетически отличался от других ПЭВ 2-го типа и был реклассифицирован как пятый тип ПЭВ [3]. Эти два исследования обосновали использование для типирования ПЭВ не серологических, а генетических методов. Главным аргументом в пользу молекулярного типирования была потенциальная способность ПЭВ к рекомбинации, которая была впервые обнаружена при филогенетическом анализе ПЭВ 4-го и ПЭВ 5-го типов [3, 14, 16]. Анализ полного генома ПЭВ 3-го типа выявил высокую частоту возникновения внутритиповой рекомбинации в неструктурной области генома. Также было получено свидетельство рекомбинации между вирусами одного типа в области генома, кодирующей капсид, для ПЭВ 1-го и ПЭВ 4-го типов. Филогенетический анализ показал, что штаммы для которых нет данных о

рекомбинации в любой области генома, были отдалены друг от друга по времени не более чем на 35 лет циркуляции [32].

ПЭВ 6-го типа был обнаружен в 2000 г. в цереброспинальной жидкости годовалой девочки, госпитализированной с энцефалопатией и печеночной недостаточностью, в префектуре Ниигата, Япония. Вирус был выделен на клетках Vero, по аминокислотной последовательности он идентифицирован как ПЭВ. В реакции нейтрализации этот вирус отличался от ПЭВ 1-3-го типов, а по нуклеотидной последовательности - от ПЭВ типов 4 и 5. Штамм N11561-2000 был зарегистрирован как прототипный штамм ПЭВ 6-го типа [108]. Усовершенствование методов определения типа ПЭВ позволило провести успешную идентификацию ПЭВ 4-го и ПЭВ 6-го типов в Северной Америке, Японии и Европе [3, 9, 14, 30,108].

При анализе 335 проб стула детей в возрасте до 6 лет, госпитализированных с энтеритом и тяжелой дегидратирующей диареей в Сальвадоре (Бразилия) в период 2006-2007 гг., в одной пробе методом ПЦР был обнаружен ПЭВ. Нуклеотидная последовательность области VP1 обладала низким уровнем гомологии с ПЭВ известных типов. Анализ областей VP0, VP3, 3D также выявил существенные различия. Охарактеризованный штамм BR/217/2006 стал прототипным штаммом ПЭВ 8-го типа [33].

За очень короткий срок число идентифицированных типов ПЭВ увеличилось до 16, однако, нуклеотидные последовательности новых штаммов ПЭВ типов 9 - 13 не представлены в базе данных GenBank [www.picornaviridae.com/parechovirus/hpev/hpev.htm]. Сообщение об идентификации ПЭП 10-го генотипа появилось только в 2010 г. ПЭВ 10-го типа был обнаружен в 2-х из 30-ти ПЭВ-положительных образцов стула детей с острым гастроэнтеритом в Шри-Ланке в 2006 г. [82]. В последнее время стали доступными последовательности еще для двух новых типов, которые были изолированы в Пакистане и Бразилии [33, 66] и в Нидерландах (ПЭВ 14-го типа) [12].

В настоящее время идентифицировано 16 типов ПЭВ. Все выделенные генотипы идентифицированы и классифицированы на основе различий в нуклеотидной последовательности гена VP1 с минимальным порогом расхождения 25-30 % (приблизительно 15%-ое расхождение аминокислотных последовательностей) [13].

По оценкам мутационной изменчивости нуклеотидных последовательностей и эволюции аминокислотных последовательностей VP1 N.R.Farina с соавторами рассчитали, что современное генетическое разнообразие ПЭВ развивалось от единой предковой последовательности в течение приблизительно 400 лет [37].

В Нидерландах был проведен анализ 18-ти полных нуклеотидных последовательностей генома ПЭВ 1-3-го типов, собранных за 14-лет, и 35-ти последовательностей, определенных ранее. Филогенетический анализ современных штаммов ПЭВ 1-го типа и прототипного штамма Harris показал, что генотипы ПЭВ 1-го попадают в две генетически отличные группы и являются намного больше расходящимися друг от друга, чем генотипы в пределах других типов ПЭВ. Авторы отмечают, что при разработке будущих критериев классификации ПЭВ необходимо учитывать вероятность возникновения разновидностей с промежуточными степенями разнообразия в пределах типа вируса [16]. В данном исследовании также была установлена высокая частота возникновения рекомбинаций среди ПЭВ 1-4-го типов, 5-го и 6-го типов; подобное значительно меньше наблюдалось среди штаммов ПЭВ 3-го типа. В отличие от других типов ПЭВ, большинство последовательностей ПЭВ 3-го типа оставались монофилетическими, что является отражением меньшего разнообразия и потенциально более позднего появления ПЭВ 3-го типа, чем других типов ПЭВ. Авторы не исключают существование биологических и/или эпидемиологических факторов, которые ограничивают возможности со-инфекций и соответственно потенциальных партнеров для рекомбинаций ПЭВ 3-го типа [16].

1.4 Характеристика ПЭВ инфекции

1.4.1 Значимость ПЭВ в инфекционной патологии человека

Парэховирусы человека являются широко распространенным

инфекционным агентом, что подтверждается многочисленными публикациями по обнаружению ПЭВ на территории разных стран: в США, Канаде, Финляндии, Швеции, Голландии, Норвегии, Нидерландах, Великобритании, Испании, Израиле, Японии, Китае, Таиланде, Шри-Ланке, Бразилии, на Ямайке. При этом наиболее часто выявляемым ПЭВ является ПЭВ 1-го типа. У больных с подозрением на энтеровирусную инфекцию в США ПЭВ 1-го типа находился на 16 месте по числу обнаружений, а в 2006-08 гг. входил в число 15 наиболее часто регистрируемых энтеро- и парэховирусов [22].

ПЭВ наиболее часто поражают детей первых лет жизни. По данным разных авторов, при определении антител методом нейтрализации, 78-92% детей в возрасте 1-5 лет имеют антитела к ПЭВ 1-го типа, а в возрастной группе 6-10 лет этот показатель достигает 100 % [53, 98]. Следует отметить, что ПЭВ 3-6-го типов также были обнаружены преимущественно у детей младшего возраста. Доля ПЭВ типов 1 и 2 в возрастной структуре ПЭВ-инфекции взрослых (20 лет и старше) составила 2,4% и 11,8%, соответственно. Тестирование сывороток крови детей в возрасте 1 год -19 лет и доноров крови старше 19 лет на антитела к ПЭВ 3-го типа, проведенное в Японии, показало наличие искомых антител, как у детей, так и у взрослых. Частота обнаружения антител к этому вирусу варьировала в разных возрастных группах в пределах 45%-91,3% [50]. По данным голландских ученых ПЭВ 1-го типа в подавляющем большинстве случаев был выявлен у детей в возрасте до 3-х лет, а ПЭВ 3-го типа исключительно у детей младше 1 года [12, 106].

Парэховирусы обусловливают, прежде всего, спорадическую заболеваемость, но регистрировались и случаи групповых заболеваний, связанные с парэховирусной инфекцией.

В результате мониторинга парэховирусной инфекции, проводимого в разных странах, показано, что ПЭВ могут выявляться в течение всего года, при этом выраженная сезонность, как правило, отсутствует.

1.4.2 Клинические проявления ПЭВ инфекции

Парэховирусы человека могут вызывать те же синдромы, что и

энтеровирусы, т.е. ПЭВ-инфекция, подобно энтеровирусной инфекции, характеризуется полиморфизмом клинических проявлений. Однако соотношение ведущих клинических форм для этих вирусов различно, также различно соотношение клинических форм для ПЭВ разных типов, по крайней мере, для наиболее распространенных типов 1-го, 3-го и 6-го.

ПЭВ 1-го типа. Наиболее частыми проявлениями ПЭВ-инфекции являются бессимптомная инфекция и умеренные гастроэнтерит и респираторные заболевания. Заболевания, связанные с поражением центральной нервной системы встречаются редко, также как и другие тяжелые формы инфекции [42]. В тоже время при расследовании двух вспышек диарейных заболеваний, ассоциированных с ПЭВ 1-го типа, 7 из 12-ти детей имели кровавый стул, а рентгеновское исследование показало ранние стадии некротического энтероколита. Большинство случаев инфекции, вызываемой ПЭВ 1-го типа, встречается у детей в возрасте до 1-года, и почти все дети в возрасте 5 лет имеют антитела к ПЭВ 1-го типа [42].

ПЭВ 3-го типа. Из всех известных типов ПЭВ, ПЭВ 3-го типа привлек наибольшее внимание клиницистов. ПЭВ 3-го типа был изолирован из образца стула однолетнего ребенка в Японии с переходным параличом, лихорадкой и диареей [50]. В другом исследовании ПЭВ 3-го типа был изолирован от 3-х младенцев с сепсисом новорожденных в Канаде [19]. Впоследствии было показано, что ПЭВ 3-го типа связан с сепсисом новорожденных, особенно в возрасте до 3 месяцев, и с энцефалитом новорожденных, с поражением белового вещества головного мозга [13, 42, 107]. Возможно, причинами патогенности ПЭВ 3-го типа, обуславливающими повышенный нейротропизм,

являются: использование вирусом различных клеточных рецепторов и более низкий уровень антител у взрослых, по сравнению с ПЭВ 1-го типа, что определяет недостаток материнских защитных антител у новорождённых [42]. Исследования последних лет показывают все большее значение ПЭВ 3-го типа в возникновении тяжёлых форм заболеваний у новорожденных детей. Применение молекулярных методов исследования показало наличие связи сепсиса, энцефалита и гепатита с ПЭВ 3-го типа [40, 44].

ПЭВ 6-го типа был изолирован от ребенка с синдромом Рейе, от детей с гастроэнтеритом, острым респираторным заболеванием, сыпью, а также от ребенка с вялым параличом [108]. В исследованиях, проведенных БаБ^а Р. с соавторами, большинство детей, инфицированных ПЭВ 4-6-го типов, имели желудочно-кишечные или респираторные симптомы. Зафиксировано 6 случаев отита, которые были связаны со всеми 3-мя типами ПЭВ (3 пациента с ПЭВ 4-го типа, 2 пациента с ПЭВ 5-го типа и 1 пациент с ПЭВ 6-го типа. Однако для определения связи отита с ПЭВ инфекцией необходимы дополнительными исследованиями. Связи ПЭВ 4-6-го типов с сепсисоподобными заболеваниями и асептическим менингитов в этих исследованиях не выявлено [13, 28].

8еёшак О. с соавторами сообщили об ассоциации ПЭВ с внезапной младенческой смертью. В течение 17 лет в г. Милуоки (США) исследовали роль вирусов в смертельных случаях детей в возрасте до 2 лет. Хотя энтеровирусы и аденовирусы были наиболее часто идентифицируемыми агентами, ПЭВ 1-го типа был изолирован от 18 трупов, ПЭВ 3-го типа от 3-х, ПЭВ 6-го типа от 1-го. Это были первые подтвержденные случаи ПЭВ-инфекции 3-го типа и ПЭВ-инфекции 6-го типа в Соединенных Штатах и первые фатальные случаи, связанные с ПЭВ 3-го типа [89].

В Нидерландах было проведено обследование 139 пациентов с подозрением на инфекционный увеит методом ПЦР в реальном времени. Положительные результаты были найдены для вируса Эпштейна-Барра, вируса краснухи, герпесвируса 6-го типа и парэховируса человека (у 4-х пациентов).

Авторы предполагают, что ПЭВ может быть этиологически связан с инфекционным керато-увеитом [29].

В Японии при обследовании пациентов с подозрением на вирусную инфекцию в 1999-2008 гг. было собрано в общей сложности 4976 проб стула. ПЭВ были обнаружены в 110 образцах методами культуры клеток и ОТ-ПЦР в реальном времени. В 63 изолятах были обнаружены ПЭВ 1-го типа, в 44 -ПЭВ 2-4-го типов, ПЭВ 6-го типа был обнаружен в 1 случае. Клинические диагнозы ПЭВ-инфекции были различны - гастроэнтерит, ОРЗ, лихорадка, экзантема, ящуроподобный синдром, асептический менингит и герпангина. Авторы обратили внимание на различия в клинических проявлениях инфекции, вызванной ПЭВ 1-го типа и ПЭВ 3-го типа. ПЭВ 1-го типа чаще обнаруживался у детей с ОГЭ, ПЭВЗ - у детей с ОРЗ [49].

Таким образом, накопленные данные свидетельствуют, что ПЭВ вызывает тот же спектр признаков, что и некоторые энтеровирусы, включая главным образом энтерит с диареей и респираторное заболевание. Более редки случаи менингоэнцефалита и вялого паралича, сообщено о случаях сепсиса новорожденных, синдроме Рейе и отите [9]. В связи с этим предложено использовать ПЭВ- и ЭВ-специфическую ПЦР как единую диагностическую группу для госпитализированных детей в возрасте до 5 лет с совпадающими клиническими синдромами, что должно обеспечить высокий уровень расшифровки заболеваний. Используя эту стратегию, Wolthers К.С. с соавторами сообщили, что использование молекулярных методов для ПЭВ увеличило процент этиологически расшифрованных случаев сепсиса новорожденных и менингитов у детей в возрасте до 5 лет на 31 % [111].

1.5 Методы обнаружения и типирования ПЭВ

Выделение ПЭВ на культуре клеток.

С самого начала изучения вирусов ЕСН022 и ЕНС023 было известно, что эти вирусы отличаются от других вирусов ECHO по цитопатическому действию (ЦПД) - они хуже реплицировались и адаптировались в культуре

клеток почек обезьян, характеризовались ограниченным цитопатическим эффектом к периферической части монослоя. При развитии ЦПД наблюдалась явная деградация ядра и хроматина, что не типично для энтеровирусов, которые вызывают выраженные изменения цитоплазмы и могут реплицироваться в безъядерных клетках [25].

После выделения на чувствительной клеточной культуре, парэховирусы, также как и энтеровирусы, идентифицируют в реакции нейтрализации с использованием панели серотиповых сывороток для ПЭВ 1-го и 2-го типов [67]. Этот метод все еще широко используется в диагностике этих инфекций, однако культуральная техника трудоемка и требует много времени [48]. Обычно требуется от 2-х до 3-х недель, чтобы достичь конечного результата. Диагностирование может быть ускорено путем иммуноокрашивания инфицированных клеток антителами [53].

В целом, ввиду плохого роста ПЭВ на клеточной культуре и отсутствия набора сывороток для остальных типов ПЭВ, выделение парэховирусов человека на культуре клеток и их типирование редко применяется для диагностики ПЭВ-инфекции

Серологические исследования.

Серологические методы исследования, базирующиеся на определении уровня сывороточных вирусспецифических антител классов ^М и 1^0, нашли свое применение в диагностике и эпидемилогическом изучении ПЭВ-инфекции.

Результаты исследований, направленных на определение наличия антител к парэховирусу 1-го типа среди населения разных возрастных групп, и проводившихся в начале 1970-х годов в Японии и в 1998 году в Финляндии, показали, что до 95% новорожденных имели нейтрализующие антитела к ПЭВ 1-го типа, очевидно, материнского происхождения; после 6 месяцев уровень антител снижался и вновь резко возрастал после 1 года. По данным разных авторов 78-92% детей в возрасте 1-5 лет имеют антитела к ПЭВ 1-го типа, а в возрастной группе 6-10 лет этот показатель достигает 100%. [53, 72]. Таким

образом, именно сероэпидемиологические исследования показали, что ПЭВ 1-го типа является широко распространенным патогеном, с которым большинство населения встречается в первые годы жизни [35].

Обратная транскрипция/полимеразная цепная реакция.

Биологические особенности ПЭВ обуславливают трудности обнаружения этих вирусов традиционными методами выделения [30]. Имеющиеся в настоящее время данные по частоте обнаружения и ассоциации заболеваний с парэховирусами человека были получены в результате применения новых молекулярно-биологических методов исследования, в частности, метода обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции, ставшего хорошей альтернативой «старым» методам [6, 9, 12]. Метод ОТ-ПЦР проходит гораздо быстрее и имеет более высокую чувствительность и специфичность по сравнению с другими методами, что особенно важно при идентификации типов ПЭВ, связанных с тяжёлым течением заболевания [41, 53, 77, 78, 79].

В 90-х годах XX века, когда были разработаны молекулярные методы для диагностики энтеровирусной инфекции, стало ясно, что эховирусы типов 22 и 23 не могут быть обнаружены с использованием полимеразной цепной реакции специфичной в отношении энтеровирусов [25]. Отсутствие экспресс-методов детекции ПЭВ привело к тому, что ПЭВ-инфекция и до настоящего времени не диагностируется в клинических лабораториях. Такая ситуация определила необходимость разработки чувствительных и быстрых молекулярных методов обнаружения ПЭВ [64].

Первая методика ОТ-ПЦР выявления РНК парэховирусов была разработана для культуральной жидкости [77]. Методики для обнаружения генома ПЭВ в образцах стула появилась относительно недавно, и были предназначены для обнаружения только ПЭВ 1-го типа и не обнаруживали ПЭВ 2-3-го типов или вирус Цш^ап [53, 65, 70]. Позже, несколько исследовательских групп разработали лабораторные методики на основе ПЦР для обнаружения ПЭВ 1-го, 2-го и 3-го типов и даже универсальную систему для идентификации ПЭВ типов 1-6-го, но не вируса Цш^ап [9, 13, 27, 79].

Наконец в 2008 г. W. А. Nix с соавторами разработали метод на основе ПЦР в реальном времени, позволяющий обнаруживать все парэховирусы, включая ПЭВ 1-6 типов и вирус Ljungan, с использованием одной пары праймеров из области 5'НТР генома. Дифференцирование ПЭВ и вируса Ljungan затем может быть проведено методом секвенирования ампликонов. Испытание разработанного метода показало 100-1000-кратно большую чувствительность метода по сравнению с клеточной культурой. Одной из причин такого различия является то, что соотношение суммы вирусных частиц к числу инфекционных частиц в исследуемых образцах составляет приблизительно 100. То есть, существует большое количество копий генома неинфекционных вирионов. Кроме этого, с использованием ПЦР можно также обнаружить и свободную геномную РНК. Из-за неэффективности использования клеточной культуры и реакции нейтрализации для исследований заболеваний, подобных наблюдаемым при энтеровирусных инфекциях, очень немногие лаборатории в настоящее время имеют возможность проводить диагностику ПЭВ-инфекции. Разработанный авторами метод ОТ-ГТЦР более чем в 100 раз чувствительнее, чем клеточная культура и может быть использован для исследования клинических образцов [77]. Широкая доступность и специфичность метода ПЦР должна облегчить обнаружение новых парэховирусов человека и других видов млекопитающих и обеспечить возможность исследования роли этих вирусов в заболеваниях человека и животных. Особенно важным это представляется в отношении вируса Ljungan, который связан с диабетом и миокардитом у полевок и, возможно, может вызывать болезни у людей [74, 75, 103].

Разработан метод ОТ-ПЦР в реальном времени для молекулярного типирования парэховирусов, основанный на амплификации нуклеотидной последовательности, кодирующей белок капсида VP1, всех известных членов рода Parechovirus непосредственно в нативных образцах клинического материала. Метод является вариантом двухраундовой ПЦР с использованием внутренней пары праймеров PCR2A и PCR2B, которые амплифицируют

перекрывающиеся фрагменты, охватывая полный ген УР1, а так же внутреннего праймера РСЯ2С, который амплифицирует более короткий внутренний УР1 фрагмент. Апробация метода на 77 изолятах ПЭВ показала чувствительность на уровне 94 % и 100% для обнаружения ПЭВ в нативных образцах. При этом анализ первичной структуры ампликона позволяет определить тип вируса. Парэховирусы одного типа имеют идентичность нуклеотидных последовательностей большую или равную 77% и идентичность аминокислотных последовательностей УР1 большую или равную 87%, в то время как различные типы выделяют при идентичности нуклеотидов меньшей или равной 73% и идентичности аминокислот меньшей или равной 81%. [77].

Полимеразная цепная реакция все больше используется для одновременного обнаружения и типирования энтеровирусов и парэховирусов человека. Сравнение метода ПЦР с культурой клеток и серотипированием для обнаружения и типирования ЭВ и ПЭВ в образцах стула госпитализированных пациентов показало следующие результаты: при помощи ПЦР в реальном времени, ЭВ/ПЭВ были обнаружены у 221 из 1174 пациентов (18.8 %), с использованием культуры клеток вирусы были изолированы только из 107 ПЦР-положительных образцов. Эффективность культуры клеток коррелировала с типом вируса и используемой линией клеток. Из ПЦР-положительных образцов ЭВ/ПЭВ 47% были УР1-генотипированы и 25% - серотипированы. Полученные результаты свидетельствовали, что обнаружение ЭВ/ПЭВ в образцах стула методом ПЦР более чувствительно, чем выделение вируса в культуре клеток, особенно для вирусов Коксаки А и ПЭВ. Однако метод генотипирования, используемый в данной работе, смог идентифицировать только 47 % штаммов ЭВ/ПЭВ. Очевидно, что необходимы дальнейшая оптимизация и ратификация целесообразности прямого генотипирования ПЭВ и определении клинической значимости обнаружения ПЭВ/ЭВ в образцах стула [11].

Использование молекулярных методов, таких как ПЦР, существенно улучшает идентификацию энтеровирусов по сравнению с классическим

вирусологическим методом - культурой клеток, на которой плохо растут ПЭВ. С целью одновременной детекции ЭВ и ПЭВ разработаны два варианта одношаговой ПЦР в реальном времени для исследования клинических образцов, которые легла в основу создания двух коммерчески доступных комплектов реагентов. Оба метода (метод I - Платиновый комплект; метод II -Экспресс-цРСЯ-комплект) основаны на праймерах, специфичных в отношении 5'НТР генома ЭВ и ПЭВ. Праймеры охватывают весь диапазон групп ЭВ от А до Б и все известные к настоящему времени типы ПЭВ. Анализ чувствительности методов по конечной точке продемонстрировал сопоставимую чувствительность метода для ЭВ и ПЭВ (метод I -приблизительно 10 копий за реакцию для обеих целей; метод II - 20 копий за реакцию). Учитывая, что стандартный срок выполнения работы меньше чем 3 часа, мультиплексный однораундовый метод ОТ-ПЦР обеспечивает быстрое диагностическое тестирование на ЭВ и ПЭВ в случаях инфекций центральной нервной системы в клинически соответствующий период времени [10].

Последние достижения в области разработки методов на основе ПЦР -разработка мультиплексных вариантов. Разработана качественная мультиплексная ПЦР для обнаружения всех пикорнавирусов человека -энтеровирусов, риновирусов, парэховирусов, вируса АюЫ и вируса гепатита А. ПЦР базировалась на праймерах, специфичных в отношении 5'НТР генома, идентификацию проводили методом молекулярной гибридизации с родоспецифичными зондами, мечеными дигоксигенином. Чувствительность такой мультиплексной ОТ-ПЦР была равна 10-100 пикорнавирусным геномным эквивалентам. Результаты моноплексной и мультиплексной постановки ПЦР были сопоставимы при исследовании 23 клинических образцов, включающих спинномозговую жидкость, сыворотку и носоглоточные смывы. Кроме того, проведено исследование 68 проб стула на присутствие парэховирусов. ПЭВ был обнаружен в 1 случае [51]. Полученные результаты позволили авторам позитивно оценить возможности универсальной для пикорнавирусов системы детекции.

При создании тест-систем для одновременного обнаружения вирусов кишечной группы, ПЭВ стали включать в перечень детектируемых патогенов. Так, разработан вариант мультиплексной ПЦР для обнаружения вируса Aichi, парэховирусов человека, энтеровирусов и бокавирусов. Авторы использовали смесь четырех известных пар праймеров - 6261 и 6779, ev 22 (+) и ev22 (-), Fin Rl, 188F и 542R, для амплификации фрагментов четырех различных размеров -519, 270, 440, и 354 и.о., соответственно. Метод был апробирован в общей сложности на 247 фекальных образцах, ранее проверенных на отсутствие рота-, адено-, норо-, cano- и астровирусов, и собранных от младенцев и детей с острым гастроэнтеритом в Японии с июля 2007 по июнь 2008 гг. В сумме, вирус Aichi, ПЭВ, энтеровирусы и бокавирусы были обнаружены в 26.7 % случаев (66 из 247 образцов). Из них ПЭВ, ЭВ и бокавирусы были идентифицированы в 20, 41 и 5 образцах. Вирус Aichi обнаружен не был. Чувствительность и специфичность мультиплексной ПЦР соответствовала моноплексной ПЦР [80]. Это было первое сообщение об одновременном обнаружении четырех вирусов в фекальных образцах детей с острым гастроэнтеритом методом мультиплексной ПЦР.

Новый вариант мультиплексной ПЦР разработан для идентификации 10 вирусов кишечной группы в единственной пробирке, пейзаж которых, кроме ротавирусов групп А и С, аденовируса, норовирусов GI и GII, саповируса, астровируса, вируса Aichi, энтеровирусов включал и парэховирусы. Новая мультиплексная ПЦР обнаружила 9 из 10 типов вирусов. Напротив, мультиплексная ПЦР, созданная ранее на основе набора из 3 пар праймеров, идентифицировала в той же выборке образцов только 8 типов вирусов. Результаты испытания позволили авторам предложить новый формат мультиплексной ПЦР в качестве полезного, быстрого и эффективного диагностического инструмента для обнаружения главных патогенных вирусов, вызывающих диарею [57].

Развитие мультиплексного формата достигло стадии разработки системы для одновременного обнаружения множества вирусов с

использованием полимерной цепной реакции в реальном времени. Система предназначена для идентификации этиологического агента инфекции в клинических образцах от пациентов с сомнительными диагнозами и способна обнаружить 163 человеческих вируса (47 ДНК-содержащих вируса и 116 РНК-содержащих вирусов) в 96-луночном планшете одновременно. Специфичность и чувствительность метода для каждого вируса была подтверждена с использованием культуры клеток, зараженных определенными вирусами. Мультивирусная система ПЦР в реальном времени показала профили вирусной инфекции в образцах от 20 трупов людей с иммунодефицитами, где в различных тканях обнаруживались цитомегаловирус, вирус герпеса 6-го типа человека и вирус Эпштейна-Барра. Однако РНК-содержагцие вирусы обнаруживались редко, за исключением ВИЧ 1-го типа. Были исследованы патологические образцы от 40 пациентов с сомнительными диагнозами, включая случаи энцефалита, гепатита и миокардита. Как причина болезни в четырех случаях энцефалита были идентифицированы вирус простого герпеса 1-го типа, герпесвирус 6-го типа и парэховирус 3-го тип, в то же время другие вирусы не были идентифицированы [56].

Суммируя информацию, представленную в обзоре состояния проблемы, можно заключить, что ПЭВ являются широко распространенным патогеном, который играет важную роль в инфекционной патологии детей первых лет жизни, в том числе в возникновении нейроинфекций. Долгое время ПЭВ-инфекция практически была недиагностируемой. Однако развитие методов молекулярной биологии, в частности ПЦР, специфичной в отношении ПЭВ, привело к интенсивному изучению данного патогена во многих странах и установлению факта генетического и биохимического разнообразия ПЭВ. В России исследований по изучению разнообразия ПЭВ до начала наших исследований не проводилось в связи с отсутствием диагностических систем и лабораторных методик для обнаружения ПЭВ, что и определило направление исследований данной работы.

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Исследуемые объекты

Объектом исследования явилась РНК парэхоеирусов, обнаруженных у детей в возрасте до 14 лет, госпитализированных с ОКИ в инфекционные стационары г. Нижнего Новгорода.

Нуклеотидные последовательности генома парэховирусов человека и других кишечных вирусов были взяты из международной базы данных GenBank/EMBL/ DDBJ [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/].

Последовательности генома парэховирусов^ 2007-863 (GQ183034), 152478 (GQ183018), 252581 (GQ183019), 450343 (GQ183020), 452568 (GQ183035), 550163 (GQ183021), 7555312 (FM178558), BNI-788St (EF051629), Harris (S45208), К54-94 (GQ183024), К63-94 (GQ183025), К129-93 (GQ183022), К150-93 (GQ 183023), PicoBank-HPeVl-a (FM242866), SHI (FJ840477), CT86-6760 (AF055846), Gregory (AJ005695), Can82853-01 (AJ889918), 152037 (GQ 183026), 251360 (GQ183027), 450936 (GQ183028), 651689 (GQ183029), A308-99 (AB084913), K8-94 (GQ183033), Kll-94 (GQ183030), K12-94 (GQ183031), K20-94 (GQ183032), FUK2005-123 (AB433629), K251176-02 (DQ315670), T75-4077 (AM235750), CT86-6760 (AF055846), T92-15 (AM235749), 2005-823 (EU077518), BNI-67 03 (EU024629), N11561-2000 (AB252582), SH6 (FJ888592), PAK5045 (EU556224), BR-217-2006 (EU716175)., BR/77/2006 (HQ696576.1), 87-012G (EF202833.1), 1443-175790-Yamagata-2008 (AB668032.1), AMS573 (EF155423.1), AMS721 (EF155422.1), 64-7855 (EU854568.1), Human parechovirus 7 (EU556224.1), 1361K-162589-Yamagata-2008 (AB668029.1), 145SL (AF327922.2), BR/145/2006 (HQ696574.1). Всего 38 последовательностей.

Последовательности генома кишечных вирусов: ротавирусов - Human rotavirus С (AJ304859), Bovine rotavirus (J04346), Porcine rotavirus С (M74216), Porcine rotavirus Gottfried (M32805), Human rotavirus A KU (AB022765); аденовирусов - тип 41Tak (X52532), тип 40 Dugan (L19443); астровирусов -таксон 12702 (NC001), тип 8 (AF260508); энтеровирусов - Sabinl (V01150),

Sabin 2 (X00595), Leon 12a-lb (K00043), Коксаки A9 Griggs (D00627); вируса гепатита A- HAS 15 (К02990). Всего 14 последовательностей.

Компьютерные программы. Для сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей геномных РНК вирусов, выведенных аминокислотных последовательностей, подбора и оценки праймеров для специфичной амплификации РНК парэховирусов человека были использованы программы MEGA 4.0 (2004) и MEGA 5.0 (2011) [ http://www.megasoftware.net/index.php]; «Oligo 4.0», 1989-91 (США); онлайн-сервис BLAST [http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/]; пакет Lasergene [http://www.dnastar.com].

2.2 Обнаружение и типирование РНК парэховирусов методом ОТ-ПЦР

Выделение РНК парэховирусов

1. Метод солевой очистки (патент №2313792).

К 100 мкл осветленного фекального экстракта добавляли равный объем буферного раствора, содержащего: 4M гуанидинтиоцианата, 50 мМ Трис-НС1 (pH 7,6), 100 мМ ЭДТА, 1% ß-меркаптоэтанола. После инкубации в течение 10 мин при 65°С (Термо 24-15, Biokom, Москва), депротеинизацию и фракционирование проводили в условиях высокой ионной силы раствора при центрифугировании в течение 15 мин при 12 тыс. об/мин. В чистую пробирку осторожно, не захватывая нижний белковый и верхний липидный слои, отбирали 700 мкл водной фазы, добавляли равный объем изопропанола, перемешивали, охлаждали в течение 30 мин при минус 20°С и центрифугировали в течение 20 минут при 12 тыс. об/мин. Осадок отмывали 70% этанолом (500 мкл), высушивали и ресуспендировали в 20 мкл 2 мМ раствора дитиотриитола.

2. Использовали комплект реагентов «РИБО-сорб» производства ФГУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции по применению

Возможность ингибирования на стадии выделения была оценена следующим образом: все пробы, исследуемые на наличие РНК парэховирусов человека, были исследованы также на наличие РНК энтеровирусов, при этом

использовался специфичный ВКО (внутренний контрольный образец), позволивший установить отсутствие ингибирования на этой стадии.

Постановка обратной транскрипции

1. Реакцию обратной транскрипции проводили в объеме 5 мкл. В микропробирку объемом 0,6 мл вносили 2,3 мкл РНК, 1,0 мкл обратного олигонуклеотидного праймера (или рендом-праймера) в количестве 0,2 мкМ и покрывали минеральным маслом. РНК денатурировали при 94°С в течение 1 минуты, охлаждали во льду. К РНК под масло вносили 1,7 мкл реакционной смеси, содержащей: 0,5 мкл буфера для ревертазы M-MLV, 0,5 мМ дНТФ, 0,6 мкл воды, свободной от нуклеаз, и 2 е.а. ревертазы M-MLV. Реакционную смесь инкубировали в течение 35 мин при 42°С. Полученную к ДНК разводили в три раза ТЕ-буфером: 10 мМ трис-HCl (pH 8,0), 1 мМ ЭДТА (pH 8,0) и 5 мкл использовали для постановки ПЦР. Использовали реактивы производства НПАО «Силекс», Москва.

2. Использовали комплект реагентов «РЕВЕРТА» производства ФГУН ЦНИИЭ (Москва), согласно инструкции по применению.

Постановка полимеразной цепной реакции

1. Готовили реакционную смесь следующего состава: 10 мМ трис-HCl (pH 8,8), 50 mM KCl, 1,5 мМ MgCl2, 1,0 % Triton Х-100, по 0,2 мМ каждого из дНТФ, 2 е.а. Диа-Так-полимеразы (НПАО «Силекс», Москва), по 0,2 мкМ прямого и обратного праймеров. 20 мкл смеси вносили в пробирку, содержащую 5 мкл к ДНК, и инкубировали в амплификаторе «Терцик» фирмы «ДНК-Технология» в режиме активного регулирования по универсальной программе:

94 °С-15 мин (94 °С-0 сек, 48 °С-10 сек, 72 °С-10 сек) х 42 цикла; 72 °С-2 мин

На разных этапах исследования использовали праймеры, представленные в таблице 1:

1) для обнаружения парэховирусов применяли праймеры, фланкирующие участок генома в области 5'-НТР генома, предложенные Oberste

РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯi БИБЛИОТЕКА i

M.S. с соавторами, в авторском варианте с оптимизированными условиями постановки реакции;

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Зверев, Владимир Владимирович

ВЫВОДЫ

1) Оптимизирован и апробирован метод выявления РНК ПЭВ разных генотипов с использованием ПЦР 5'НТР генома, показана эффективность его применения для обнаружения современных штаммов ПЭВ, циркулирующих на территории РФ. Впервые установлена частота обнаружения ПЭВ у детей с гастроэнтеритом в Нижнем Новгороде (3,510,4% в разные годы).

2) Разработан метод идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов на основе двухраундовой «гнездовой» ПЦР с использованием которого показано доминированием ПЭВ 1-го типа.

3) Впервые установлены нуклеотидные последовательности фрагментов области VP3-VP1 генома российских (Н. Новгород) ПЭВ (JF330795-JF330833), анализ которых показал существование 3-х генотипов (1АДВ и 1С) ПЭВ 1-го типа.

4) На основании различий в нуклеотидных (14,0-25,0%) и аминокислотных (11,2-24,1%) последовательностях ПЭВ 1-го типа выделен новый генотип 1С.

5) Установлена высокая типоспецифическая консервативность С-концевого участка белка VP3, свидетельствующая о его важной роли в цикле репродукции парэховирусов.

6) Показано, что N-концевой участок характеризуется уникальной аминокислотной последовательностью (NAEECKQSI) в позициях 18-26 может служить биохимическим маркером нового 1С генотипа ПЭВ 1-го типа.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Значимость парэховирусов в инфекционной кишечной паталогии человека, отсутствие отечественных тест-систем и лабораторных методов для обнаружения и типовой дифференциации данных вирусов, отсутствие данных о молекулярно-биологических свойствах ПЭВ, циркулирующих на территории нашей страны, определили актуальность проведенного исследования.

Настоящая работа посвящена оптимизации и разработке методов на основе ПЦР для выявления и генотипирования парэховирусов, с использованием которых были получены первые и единственные данные о циркуляции ПЭВ на территории России, их молекулярных свойствах и генетическом разнообразии.

В ходе работы для достижения поставленной цели решались задачи по анализу нуклеотидных последовательностей генома ПЭВ, представленных в ОепВапк, выбору универсальной пары праймеров для амплификации фрагмента к ДНК генома ПЭВ, оптимизации физико-химических параметров ее проведения и применению методики при обследовании детей с ОКИ. Важной задачей исследования явилась разработка методики на основе ПЦР для идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов, которая включила конструирование типоспецифических праймеров, оптимизацию постановки реакции, и проведение с ее использованием генотипирования выявленных ПЭВ для установления спектра и распределения генотип/серотипов. Отсутствие сведений о разнообразии российских ПЭВ, их биохимических и молекулярно-генетических особенностях, послужило основанием для постановки третьего блока задач, включающего: установление первичной структуры нуклеотидных последовательностей фрагментов 5'НТР и области УРЗ-УР1 генома ПЭВ разных типов; изучение их филогенетических отношений с мировыми штаммами; анализ переведенных аминокислотных последовательностей фрагментов иммунодоминантного белка УРЗ и протомерсвязывающего домена белка УР1 ПЭВ различных генотипов.

На первом этапе исследования была проведена работа по оптимизации универсального метода ОТ-ПЦР для выявления РНК парэховирусов человека и его апробация. В первую очередь была осуществлена теоретическая оценка праймеров, предложенных в научной литературе, с учетом их специфичности в отношении генома ПЭВ и универсальности по отношению к известным типам парэховирусов человека, а также удовлетворяющих требованию эффективности полимеразной цепной реакции. Всего было проанализировано пять пар праймеров, комплементарных участкам генома в области 5'НТР, который является наиболее консервативным регионом генома парэховирусов человека. По результатам формального анализа нами была выбрана пара праймеров К28 и R30, предложеных М. Oberste с соавторами в 1999 году для выявления ПЭВ, пассированых в культуре ткани. Поскольку праймеры были сконструированы на основе последовательностей генома только двух типов ПЭВ больше 10 лет назад, был проведен их детальный анализ, по результатам которого установлено, что участок генома ПЭВ различных типов в области прямого праймера К28 характеризуется незначительной вариабельностью в связи с чем прямой праймер К28 был оставлен нами без изменения. Анализ нуклеотидной последовательности в области обратного праймера R30 выявил ее уникальный абсолютный консерватизм у всех 8-ми типов ПЭВ.

Установленная универсальность праймеров К28 и R30 определила их выбор для использования в нашей дальнейшей работе. Данная пара фланкирует участок генома в 5'-нетранслируемом регионе (5'НТР), размер получаемого фрагмента равен 256 п.н. (по HPEV1 Harris).

Далее был проведен расчет параметров проведения ПЦР для выявления РНК ПЭВ в копрофильтратах, где предполагается наличие генетического материала различных кишечных вирусов, возможность неспецифического отжига праймеров и получения ложноположительных результатов. Проведена оптимизация физико-химических параметров постановки реакции, которая заключалась в теоретическом и эмпирическом подборе температуры отжига праймеров и использовании TagF-ДНК-полимеразы при концентрации Mg , равной 1,5 мМмоля, что позволило обеспечить достаточную специфичность и эффективность реакции в следующем режиме: 94°С - 15 мин, (94°С-10 с, 48°С-10 с, 72°С-10 с) х 42.

В связи с отсутствием в России референтных штаммов ПЭВ и контрольных образцов, содержащих парэховирусы, для апробации оптимизированной методики обнаружения РНК ПЭВ на клиническом материале, была взята случайная выборка проб фекалий детей с острым гастроэнтеритом, отрицательных при ПЦР-тестировании на другие кишечные вирусы. Выбор группы детей, госпитализированных с диагнозом ОКИ, основывался на данных научной литературы, в которых указывалось, что наибольшее количество случаев ПЭВ инфекции было зарегистрировано именно у детей с ОГЭ. При исследовании 140 проб были обнаружены образцы, в которых амплифицировался специфический фрагмент кДНК размером 257 п.н. Специфичность метода была подтверждена секвенированием фрагментов кДНК, амплифицированных из 11-ти случайно выбранных проб. С использованием оптимизированного метода ОТ-ПЦР, нами были впервые проведены исследования по обнаружению РНК ПЭВ у 5881 детей, госпитализированных с ОКИ в инфекционный стационар г. Нижнего Новгорода в 2006 - 2011 гг. РНК парэховирусов была выявлена у 347 детей, что составило 3,5-10,4% случаев инфекции в разные годы.

На втором этапе работы была проведена разработка ПЦР-методики для идентификации наиболее часто встречающихся и клинически значимых ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов. «Генетическое серотипирование» парэховирусов, так же как и других пикорнавирусов, проводят путем анализа нуклеотидной последовательности области, кодирующей капсидный белок VP1, которая характеризуется высокой, по сравнению с 5'НТР генома, вариабельностью. В связи с этим для повышения специфичности реакции генотипирования штаммов ПЭВ мы разработали двухраундовый «гнездовой» вариант ПЦР.

Для постановки первого раунда ПЦР были выбраны олигонуклеотиды, предложенные и использовавшиеся в 2000-2005 гг. Benschop К. с соавторами.

Это праймеры VPl-parEchoFl (2332-2349 и.о.) и VPl-parEchoRl (3071-3090 и.о.), которые фланкируют участок генома размером 759 н.о. Анализ данных праймеров на специфичность в отношении нуклеотидных последовательностей современных штаммов ПЭВ показал необходимость их модификации - в прямой праймер введены 3 вырожденных основания в обратный праймер введены 2 вырожденных основания. На следующем этапе работы проведена оптимизация условий ПЦР первого раунда. В ходе серии постановок реакции ПЦР в пределах температурного диапазона 42°С-52°С с шагом в 2°С была определена наиболее эффективная температура амплификации, составившая 48°С. Амплификацию проводили в режиме: 94°С -15 мин (94°С-10 с, 48°С-10 с, 72°С-10 с) х 42.

Поскольку в научной литературе отсутствует информация о применении для генотипирования ПЭВ типоспецифичных праймеров, то для проведения второго раунда ПЦР нами были созданы собственные праймеры, специфичные в отношении генома ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов. Для подбора праймеров мы оперировали участком генома VP1 размером 759 п. о., (позиции 2332-3090), который фланкирован праймерами первого раунда ПНР.

При конструирования праймеров, специфичных в отношении генома парэховирусов человека 1-го, 3-го и 6-го типов, для каждого типа была создана сессия нуклеотидных последовательностей, включившая геномы штаммов ПЭВ, различающихся по временным и географическим характеристикам. По результатам сравнительного анализа выровненных последовательностей методом Clustal W в программе Mega 4.0 и внесения вырожденных оснований были созданы праймеры для ПЭВ 1-го типа - HPEV1F (19 н.о.) и HPEV1R (17 и.о.), для ПЭВ 3-го типа - HPEV3F (19 н.о.) и HPEV3R (18 и.о.), для ПЭВ 6-го типа - праймеры HPEV6F (21 н.о.) и HPEV6R (17 н.о.) Специфичность сконструированных праймеров в отношении геномов ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов была подтверждена путем сравнительного анализа последовательности олигонуклеотидов с соответствующими последовательностями области VP1 генома ПЭВ других типов.

После теоретического расчета и эмпирического подбора параметров постановки реакции была проведена апробация методик с использованием РНК ПЭВ 1-го, 3-го, 6-го типов, идентифицированных с помощью секвенирования. Результаты теоретической и практической апробации свидетельствовали о специфичности разработанного метода на основе ПЦР для дифференциального обнаружения РНК ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов.

С помощью разработанного метода идентификации ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов было исследовано 132 ПЭВ-содержащих образца, собранных на территории г. Нижнего Новгорода в 2006-2010 гг. Расчет распределения ПЭВ разных типов показал, что доминирующее положение в нижегородской популяции занимают ПЭВ 1-го типа.

Таким образом, применение разработанной нами методики идентификации типа ПЭВ, позволило впервые показать циркуляцию на территории Нижнего Новгорода ПЭВ 1-го, 3-го и 6-го типов, что свидетельствует о генетической гетерогенности местной популяции ПЭВ. Доминирование ПЭВ 1-го типа и представительство ПЭВ 6-го типа и 3-го типов согласуются с данными о широком распространении этих типов ПЭВ в мире.

На третьем этапе работы был проведен анализ фрагментов нуклеотидных и аминокислотных последовательностей изолятов парэховирусов человека разных типов - 82 фрагментов кДНК 70 изолятов ПЭВ в областях генома, кодирующих 5'НТР (11 последовательностей) и УР1 (71 последовательность). Для 6 изолятов были определены последовательности для двух участков генома. Фрагменты депонированы в базу данных ОепВапк/ЕМВЬ/ ББВ! под номерами ^330795-^330833, 1(3437842-1(2437881, 10437883, ^437884, что расширило международную базу нуклеотидных последовательностей генов парэховирусов человека из разных регионов мира.

Филогенетический анализ показал, что большинство нижегородских вариантов ПЭВ 1-го типа принадлежит генотипу 1В, который в последние годы распространен во многих странах. Нижегородская популяция ПЭВ генотипа 1В филогенетически неоднородна. Среди этих вирусов выделяется три группы (условно 1В/№4, - 1В/ЫЫ3), достоверность выделения которых подтверждается высокой бутстрэп-поддержкой. Для вирусов, представляющих эти группы, уровень гомологии нуклеотидных последовательностей с зарубежными или нижегородскими, входящими в другие группы, ПЭВ 1В не превышал 95%.

Шесть ПЭВ 1-го типа, выявленных в Нижнем Новгороде в 2005, 20082010 гг., сформировали отдельный кластер. Уровень дивергенции нуклеотидных последовательностей этих вирусов от охарактеризованных вирусов генотипа 1А составил 18,3-25,0 %, от вирусов генотипа 1В - 14,023,5%. Такие различия дают основание предполагать наличие третьего генотипа ПЭВ 1-го типа, условно - 1С. При построении филогенетического древа, основанного на анализе 5'НТР генома, ПЭВ генотипа 1С также образуют отдельную группу. Уровень гомологии нуклеотидных последовательностей 5'НТР генома вирусов генотипа 1В с ближайшим родственным штаммом был выше алогичного показателя, полученного при анализе фрагмента УРЗ-УР1 генома, и составил, в среднем, 91,0 %. Однако достоверность существования данной группы, образованной вирусами генотипа 1С, подтверждается высокой бутстрэп-поддержкой.

Таким образом, в результате филогенетического анализа нуклеотидных последовательностей генома показано генетическое разнообразие ПЭВ 1-го типа, выявленных в Нижнем Новгороде в 2005-2010 гг.; идентифицированы два известных генотипа ПЭВ-1 (1А, 1В); показана циркуляция ПЭВ 1В типа, относящихся к разным филогенетическим линиям; обнаружен вариант ПЭВ 1 -го типа, который на основании показателей вариабельности нуклеотидных последовательностей двух областей генома (5'НТР и области УРЗ-УР1) может быть охарактеризован, как новый 1С генотип ПЭВ 1-го типа.

Использованный нами способ амплификации и генотипирования по УРЗ-УР1 области генома ПЭВ позволил провести анализ первичной структуры С-конца УРЗ и Ы-конца УР1.

При сравнительном анализе первичной структуры фрагмента УРЗ, установлен консерватизм аминокислотных последовательностей, принадлежащих разных генотипам ПЭВ 1-го типа, включая генотип 1С, и значительная вариабельность среди последовательностей ПЭВ, принадлежащим разным типам.

При анализе аминокислотных последовательностей фрагмента белка УР1 у ПЭВ генотипов 1В и 1С, в сравнении с ПЭВ генотипа 1А, установлены характерные замены аминокислотных остатков в различных позициях. У всех шести нижегородских ПЭВ генотипа 1С на исследуемом участке УР1 идентифицировалась оригинальная аминокислотная последовательность, отличающая их как от ПЭВ 1А, так и от ПЭВ 1В, что подтверждает правомерность выделения этой группы вирусов в отдельный генотип.

Обнаруженный новый генотип 1С ПЭВ 1-го типа характеризуется уникальной аминокислотной последовательностью (ЫЛЕЕСКС^) Оконца капсидного белка УР1.

Суммируя вышесказанное можно заключить, что в результате проведенной работы оптимизирована методика ПЦР для универсального обнаружения парэховирусов разных генотипов; впервые показана циркуляция на территории г. Нижнего Новгорода парэховирусов человека; впервые установлена частота обнаружения парэховирусов человека у детей госпитализированных с ОКИ в г. Нижний Новгород (3,5-10,4% в разные годы); разработан гнездовой вариант метода ОТ-ПЦР для генотипирования ПЭВ, позволившая установить циркуляцию на территории г. Нижнего Новгорода как минимум трех типов ПЭВ, что в свою очередь свидетельствует о генетической гетерогенности местной популяции парэховирусов; показано доминирование ПЭВ 1-го типа и значительное представительство ПЭВ 6-го и 3-го типов; проведено секвенирование, позволившее впервые определить нуклеотидные последовательности российских изолятов ПЭВ; проведен филогенетический анализ определенных последовательностей, позволивший установить их генетическое разнообразие и родственные отношения с известными мировыми штаммами; выявлена группа ПЭВ 1-го типа, которая на основании показателей вариабельности нуклеотидных последовательностей двух областей генома (5'НТР и области УРЗ-УР1 генома) и аминокислотной последовательности фрагмента УРЗ-УР1 может быть определен как новый генотип ПЭВ 1-го типа, характеризующийся уникальной аминокислотной последовательностью (ТЧАЕЕСКСШ) Ы-конца капсидного белка УР1, которая может использоваться в качестве биохимического маркера

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Зверев, Владимир Владимирович, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Лукашев А.Н. Роль рекомбинации в эволюции энтеровирусов // Вопросы вирусол. 2005. №3. С.46-52.

2. Сулимова Т.Е., Удина И.Г., Зинченко В.В. Анализ полиморфизма ДЕПС с использованием метода полимеразной цепной реакции. // М. 2006. 80с.

3. Al-Sunaidi М., Williams С.Н., Hughes P. et al. Analysis of a new human parechovirus allows the definition of parechovirus types and the identification of RNA structural domains. // J. Virol. 2007. Vol. 81. No. 2. P. 1013-1021.

4. Alho A., Marttila J., Ilonen J., Hyypia T. Diagnostic potential of parechovirus capsid proteins // J. Clin. Microbiol. 2003. Vol. 41. No. 6. P. 2294-2299.

5. Andino R., Rieckhof G. E., and Baltimore D. A functional ribonucleoprotein complex forms around the 5' end of poliovirus RNA. // Cell. 1990. V.63. P. 369380.

6. Arola A., Santti J., Ruuskanen O., et al. Identification of enteroviruses in clinical specimens by competitive PCR followed by genetic typing using sequence analysis. // J. Clin. Microbiol. 1996. 34(2):313-318.

7. Auvinen P., Hyypia T. Echoviruses include genetically distinct serotypes. // J. Gen. Virol. 1990. 71:2133-2139.

8. Auvinen P., Stanway G., Hyypia T. Genetic diversity of enterovirus subgroups. // Arch. Virol. 1989. 104:175-186.

9. Baumgarte S., de Souza Luna L.K., Grywna K. Prevalence, types, and RNA concentrations of human parechoviruses, including a six Parechovirus type I stool samples from patients with acute enteritis. // J. Clin. Microbiol. 2008. Vol.46. P.242-248.

1 O.Bennett S., Harvala H., Witteveldt J. et al. Rapid simultaneous detection of enterovirus and parechovirus RNAs in clinical samples by one-step real-time reverse transcription-PCR assay. // J. Clin. Microbiol. 2011. 49(7):2620-2624.

ll.Benschop K., Minnaar R., Koen G. et al. Detection of human enterovirus and human parechovirus (HPeV) genotypes from clinical stool samples: polymerase

chain reaction and direct molecular typing, culture characteristics, and serotyping. // Diagn. Microbiol. Infect. Dis. - 2010. - 68(2): 166-73.

12.Benschop K., Molenkamp R., van der Ham A. et al. Rapid detection of human parechoviruses in clinical samples by real-time PCR. // J. Clin Virol - 2008. -41:69-74.

13.Benschop K. S., Schinkel J., Minnaar R. P. et.al. Human parechovirus infections in Dutch children and the association between serotype and disease severity. // Clin. Infect. Dis. - 2006. - Vol. 42. - P. 204-210.

14.Benschop K. S., Schinkel J., Luken M. E. et.al. Fourth human parechovirus serotype. // Emerg. Infect. Dis. - 2006 - Vol.12. - P. 1572-1575.

15. Benschop K. S., Thomas X., Serpenti C. et.al. High prevalence of human parechovirus genotypes in the Amsterdam region and the identification of specific HPeV variants by direct genotyping of stool samples. // J. Clin. Microbiol. - 2008. -Vol. 46.-P. 3965-3970.

16.Benschop K. S., de Vries M., Minaar R. et.al. Comprehensive full length sequence analyses of human parechoviruses: diversity and recombination. // J. Gen. Virol, -2010.-Vol. 91.-P. 145-154.

17.Bercovich S., Pangan J. Recoveries of virus from premature infants during outbreaks of respiratory disease: the relation of ECHO virus type 22 to desease of upper and lower respiratory tract in premature infant. // Bull. NY Acad. Med. -1968. Vol.-44. P. 377-87.

18.Birenbaum E., Hadsher R., Kuint J. et.al. Echovirus type outbreak associated with gastrointestinal disease in neonatal intensive care unit. // Am. J. Perinatol. - 1997. -V.14.-P. 469-473.

19.Boivin G., Abed Y., Boucher F. D. Human parechovirus 3 and neonatal infections. // Emerg. Infect. Dis. - 2005. - Vol. 11. - P. 103-105.

20.Boonyakiat Y., Hughes P. J., Ghazi F., and G. Stanway. Arginine-glycine-aspartic acid motif is critical for human parechovirus 1 entry. // J. Virol. - 2001. Vol. 75. -P.10000-10004.

21.Calvert J., Chieochansin T., Benschop K. S., et.al. Recombination dynamics of human parechoviruses: investigation of type-specific differences in frequency and epidemiological correlates. // J. Gen. Virol. - 2010. - Vol. 91. - P. 1229-1238.

22.Centers for Disease Control and Prevention (CDC). Nonpolio enterovirus and human parechovirus surveillance in United States, 2006-2008. // MMWR. Morb. Mortal. Rep.-2010. -Dec 10;59(48). - P. 1577-1580.

23.Chen B., Cheng M., Huang T. et.al. Detection and identification of human parechoviruses from clinical specimens. // Diagn. Microbiol, and Infect. Dis. -

2009. - Vol. 65. - P. 254-260.

24.Chow M., Newman J. F. E., Filman D. et al. Myristylation of picornavirus capsid protein VP4 and its structural significance. // Nature. - 1987. - 327:482486.

25.Coller B-A. G., Chapman N. M., Beck M. A. et al. Echovirus 22 is an atypical enterovirus.// J. Virol. - 1990. - Vol. 64. - P. 2692-2701.

26.Coller B-A. G., Tracy S. M., Etchison D. Cap-binding complex protein p220 is not cleaved during echovirus 22 replication in HeLa cells. //J. Virol. - 1991. -Vol.65.-P. 3903-3905.

27.Corless C. E., Guiver M., Borrow R. et al. Development an devaluation of a 'realtime' RT-PCR for the detection of enterovirus and parechovirus in CSF and throat swab samples. // J. Med. Virol. - 2002. - 67:555-562.

28.Dasja Pajkrt M.D., Kimberley S., Benschop K. et al. Clinical Characteristics of Human Parechoviruses 4-6 Infections in Young Children. // The Pediatric Infectious Disease Journal - 2009. - Vol.28.

29.de Groot-Mijnes J.D., de Visser L., Zuurveen S. et.al. Identification of new pathogens in the intraocular fluid of patients with uveitis. // Am. J. Ophthalmol. -

2010.-Vol.150.-P. 628-636.

30.de Vries M., Pyre K., Berkhout R. et al. Human parechovirus type 1,3,4, 5, and 6 detection in picornavirus cultures. // .1. Clin. Microbiol. - 2008. - 46:759-762.

31.Donoso Mantke O., R. Kallies, B. Niklasson, A. Nitsche, and M. Niedrig. A new quantitative real-time reverse transcriptase PCR assay and melting curve analysis

for detection and genotyping of Ljungan virus strains. // J. Virol. Methods. -2007. - 141:71-77.

32.Drexler J.F., Grywna K., Lukashev A. Full genome sequence analysis of parechoviruses from Brazil reveals geographical patterns in the evolution of nonstructural genes and intratypic recombination in the capsid region. // J Gen Virol. -2011. -92(Pt. 3):564-71.

33.Drexler J. F., Grywna K., Stocker A. et al. Novel human parechovirus from Brazil. // Emerg. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 15. - P. 310-313.

34.Eggers H. J., and Tamm L. Spectrum and characteristics of the virus inhibitory action of 2-(a-hydroxybenzyl)-benzimidazole. // J. Exp. Med. - 1961. - 113:657682.

35.Ehrnst A., Erikson M. Epidemiological features of type 22 echovirus infection. // Scand. J. Infect. Dis. -1993. - Vol. 25. - P. 275-281.

36.Ehrnst, A., Eriksson M. Echovirus type 23 observed as a nosocomial infection in infants. Scand. // J. Infect. Dis. - 1996. - 28:205-206.

37.Faria N. R., de Vries M., van Hemert F. J. et al. Rooting human parechovirus evolution in time. // BMC Evol. Biol. - 2009. Jul. - 9: 164.

38.Forss S., Schaller H. A tandem repeat gene in a picornavirus. // Nucleic Acids Res.- 1982.- 10:6441-6450.

39.Ghazi F., Hughes P.J., Hyypia T., Stanway G. Molecular analysis of human parechovirus type 2 (formerly echovirus 23). // J. Gen. Virol. - 1998. - Vol.79. P. 2641-2650.

40.Harvala H., McLeish N., Kondracka J. et al. Comparison of human parechovirus and enterovirus detection frequencies in cerebrospinal fluid samples collected over a 5-year period in Edinburg: HPEV type 3 identified as the most common picornavirus type. // J. Med. Virol. - 2011. - Vol. 83. - P. 889-0896.

41.Harvala H., Robertson I., McWilliam Leitch C. et al. Epidemiology and clinical association of human Parechovirus respiratory infections. // J. Clin. Microbiol. -2008. - Vol. 46. - P. 3446-3453.

42.Harvala H., Robertson I., McWilliam Leitch C. et al. Specific association of human parechovirus type 3 with sepsis and fever in young infants, as identified by direct typing of cerebrospinal fluid samples. // J. Infect. Dis. - 2009. - Vol.199. -P. 1753-1760.

43.Harvala H., Simmonds P. Human parechoviruses: Biology, epidemiology and clinical significance. //J. Clin. Virol. - 2009. Vol. 45. - P. 1-9.

44.Harvala H., Wolthers K.S., Simmonds P. Parechoviruses in children: understanding a new infection. // Curr. Opin. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 23. - P. 224-230.

45.Hyypia T., Horsnell C., Maaronen M. et al. A distinct picornavirus group identified by sequence analysis. // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 1992. - 89: 8847885.

46.Hyypia T., Hovi T., Knowles N. J. et al. Classification of enteroviruses based on molecular and biological properties. // J. Gen. Virol. - 1997. - 78:1-11.

47.Hyypia T., Maaronen M., Auvinen P., et. al. Nucleic acid sequence relationships between enterovirus serotypes. //Mol.Cell. Probes - 1987.-1:169-176.

48.Hyypia T., Puhakka T., Ruuskanen O., et al. Molecular diagnosis of human rhino virus infection: comparison with virus isolation. // J. Clin. Microbiol. - 1998. -36:2081-2083.

49.Ito M., Yamashita T., Tsuzuki H.et.al. Detection of human parechoviruses from clinical stool samples in Aichi, Japan. // J. Clin. Microbiol. - 2010. - Vol. 48. - P. 2683-2688.

50.1to M., Yamashita T., Tsuzuki H. et.al. Isolation and identification of a novel human parechovirus. // J. Gen. Virol. - 2004. - Vol. 85. - P. 391-398.

51.Jamison R. M. An electron microscopic study of the intracellular development of echovirus 22. // Arch. Gesamte Virusforsch. - 1974. - 44:184-194.

52.Jang S.K., Davies M.V., Kaufman R.J. et al. Initiation of protein synthesis by internal entry of ribosomes into the 5' nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA in vivo // J. Virol. - 1989. - Vol.63. - P. 1651 -1660.

53.Joki-Korpela P., Hyypia T. Diagnosis and epidemiology of echovirus 22 infections. // Clin. Infect. Dis. - 1998. - Vol. 26. - P. 129-136.

54. Joki-Korpela P., Marjomaki V., Krogerus C. et.al. Entry of human parechovirus 1. // J. Virol. - 2001. - Vol.75. - P. 1958-1967.

55.Joki-Korpela P., Roivanen M., Lankinen H. et al. Antigenic properties of human parechovirus 1 // J. Gen. Virol. - 2000. - Vol.81. - P. 1709-1718.

56.Katano H., Kano M., Nakamura T. et al. A novel real-time PCR system for simultaneous detection of human viruses in clinical samples from patients with uncertain diagnoses. // J. Med. Virol. - 2011. - 83(2):322-330.

57.Khamrin P., Okame M., Thongprachum A. et al. A single-tube multiplex PCR for rapid detection in feces of 10 viruses causing diarrhea. // J. Virol. Methods. -2011. - 73(2):390-393.

58.Khetsuriani N., Lamonte-Fowlkes A., Oberste M.S. et al. Enterovirus surveillance-United States, 1970-2005. // MMWR Surveill. Summ. - 2006. -55(8). -P.l-20.

59.King A. M., Brown Q. F., Christian P. et. al. Picornaviridae. // Virus taxonomy. Seventh Report of the International Committee for the Taxonomy of Viruses. -1999.-p. 996.

60.Knipe D.M. et al. Fields Virology, 5th Edition // 2007.

61.Krogerus C., Egger D., Samuilova O. et.al. Replication complex of human parechovirus 1. // J. Virol. - 2003. - Vol.77. - P. 8512-8523.

62.Krogerus C., Samuilova O., Poyry T. et al. Intracellular localization and effects of individually expressed human parechovirus 1 non-structural proteins. // J. Gen. Virol. - 2007. - Vol. 88. - P. 831-841.

63.Kumar S., Tamura K., Nei M. MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment // Briefings in Bioinformatics. -2004. - Vol. 5. - P. 150-163.

64.Landry M. The molecular diagnosis of parechovirus infection: Has the time come? // Clin. Infect, dis. - 2010. - Vol. 50. - P. 362-363.

65.Legay V., Chomel J. J., Fernandez E. et al. Encephalitis due to human parechovirus type 1. // J. Clin. Virol. - 2002. - 25:193-195.

66.Li L., Victoria J., Kapoor A. et al. Genomic characterization of novel human parechovirus type. // Emerg. Infect. Dis. - 2009. - Vol. 15. - P. 288-291.

67.Lim K. A., Benyesh-Melnick M. Typing of viruses by combinations of antiserum pools. Application to typing of enteroviruses (coxsackie and ECHO). // J. Immunol. - 1960. - 84:309-317.

V

68.Ljubin-Sternak S., Juretic E., Santak M., et.al Clinical and molecular characterization of a parechovirus type 1 outbreak in neonates in Croatia. // J. Med. Virol.-2011.-Vol. 83.-P. 137-141.

69.Mahy B.W.J, et al. Encyclopedia of Virology (Third Edition) // Oxford. - 2008.

70.Mantke O., Kallies R., Niklasson B. et al. A new quantitative real-time reverse transcriptase PCR assay and melting curve analysis for detection and genotyping of Ljungan virus strains. // J. Virol. - 2007. - 141:71-77.

71.Mayo M. A., Pringle C. R. Virus taxonomy - 1997. // Journal of General Virology. - 1998. - 79: 649-657.

72.Nakao T., Miura R., Sato M. ECHO virus type 22 infection in a premature infant. // J. Exp. Med. - 1970. - 102(1 ):61-68.

73.Nateri A. S., Hughes P. J. and Stanway G. In vivo and in vitro identification o structural and sequence elements of the human parechovirus 5'untranslated region required for internal initiation. // J. Virol. - 2000. - Vol.74. - P.6269-6277.

74.Niklasson B., Hornfeldt B., Lundman B. Could myocarditis, insulin-dependent diabetes mellitus, and Guillain-Barre syndrome be caused by one or more infectious agents carried by rodents? // Emerging. Infect. Dis. - 1998. -Vol. 4. P. 187-193.

75.Niklasson B., Kinnunen L., Hornfeldt B. et. al. A new picornavirus isolated from bank voles (Clethrionomys glareolus). // Virology - 1999. - 255:86-93.

76.Niklasson B., Samsioe A., Papadogiannakis N. et al. Association of zoonotic Ljungan virus with intrauterine fetal deaths. // Birth. Defects. Res. - 2007. -79:488-493.

77.Nix W.A., Maher K., Johansson E.S. et al. Detection of all known parechoviruses by real time-PCR. // J. Clin. Microbiol. - 2008. - 46:2519-2524.

78.Noordhoek G.T., Weel J.F., Poelstra E. et al. Clinical validation of a new real-time PCR assay for detection of enteroviruses and parechoviruses, and implications for diagnostic procedures. // J. Clin. Virol. - 2008. - 41:75-80.

79.0berste M.S., Maher K., Pallansch M.A. Specific detection of echoviruses 22 and 23 in cell culture supernatants by RT-PCR. // J. Med. Virol. - 1999. - 58:178-181.

80.Pham N.T.K., Trinh Q.D., Chan-It W. et al. A novel RT-multiplex PCR for detection of Aichi virus, human parechovirus, enteroviruses, and human bocavirus among infants and children with acute gastroenteritis. // J. Virol. Methods. - 2010. - 169(l):193-7.

81.Pham N.T.K., Trinh Q.D., Khamrin P. Diversity of Human parechoviruses isolated from Stool Samples Collected from Thai children with acute gastroenteritis. // J.Clin. Microbiol. - 2010. - Vol.48. - P. 115-119.

82.Pham N.T.K., Trinh Q.D., Takanashi S. et. al. Novel human parechovirus Sri Lanka. //Emerging. Infect. Dis. - 2010. - Vol. 16. - P. 130-132.

83.Pineiro L., Vicente D., Montes M. et. al. Human parechoviruses in infants with systemic infection. // J. Med. Virol. - 2010. Vol.82. - P. 1790-1796.

84.Read S. J., Jeffery K. J. M., Bangham C. R. M. Aseptic meningitis and encephalitis: the role of PCR in the laboratory. // J. Clin. Microbiol. - 1997. -35:691-696.

85.Rueckert R.R. Picornaviridae: the viruses and their replication // Fields Virology, Third Edition - 1996. - P. 613-616.

86.Ryan M.D., Flint M. Virus-encoded proteinases of the picornavirus super-group //J. Gen. Virol. - 1997. - Vol. 78. - P. 699-723.

87.Samuilova O., Krogerus C., Poyry T. et al. Specific interaction between human parechovirus nonstructural 2A protein and viral RNA. // J. Biol. Chem. - 2004. -279(36):37822-31.

88.Sanden S., Bruin E., VennemaH. et.al. Prevalence of Human parechovirus in Netherlands in 2000 to 2007 // J. Clin. Microbiol. - 2008. - V.46. - P. 2884-2889.

89.Sedmak G., Nix A.W., Jentsen J. et.al. Infant deth associated with human parechovirus infection in Wisconsin. // Clin. Infect. Dis. - 2010. - Vol.50. - P. 357-361.

90.Seitsonen J., Susi P., Heikkila O. et.al. Interaction of avP3 and avP6 Integrins with Human Parechovirus 1 // J. Virol. - 2010. - Vol. 84. - P. 8509-8519.

91.Shaver D. N., Barron A. L., Karzon D. T. Distinctive cytopathology of ECHO viruses types 22 and 23. // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. - 1961. - Vol. 106. P. 648652.

92.Shimizu C., Rambaud C., Cheron G. et al. Molecular identification of viruses in sudden infant death associated with myocarditis and pericarditis. // J. Pediatr. Infect. Dis. - 1995. - 14:584588.

93.Stanway G. Structure, function and evolution of picornaviruses. // J. Gen. Virol. -1990. - Vol. 71. - P. 2483-2501.

94.Stanway G., Brown F., Christian P. et al. Family Picornaviridae. // In Virus Taxonomy, Eighth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. - 2005. - P. 757-778.

95.Stanway G., Hyypia T. Parechoviruses. // J. Virol. - 1999. - Vol. 73. - P. 52495254.

96.Stanway G., Joki-Korpela P. & Hyypia T. Human parechoviruses - biology and clinical significance. // Rev. Med. Virol. - 2000. Vol. 10. - P. 57-69.

97.Stanway G., Kalkkinen N., Roivainen M. et.al. Molecular and biological characteristics of echovirus 22: a representative of a new picornavirus group. // J. Virol. - 1994. - Vol. 68. - P. 8232-8238.

98.Takao S., Fukuda S., Shimasu S. et al. The isolation of human parechovirus 1 from cases of acute respiratory illness in children.// Jpn. J. Infect. Dis. - 2001. -Vol. 54. - P.85-88.

99.Tamura K., Dudley J., Nei M. et al. MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Molecular Biology and Evolution // -2007.-24: 1596-1599.

100. Tamura K., Peterson D., Peterson N. et al. MEGA5: Molecular Evolutionary Genetics Analysis using Maximum Likelihood, Evolutionary Distance, and Maximum Parsimony Methods. Molecular Biology and Evolution // - 2011. - 28: 2731-2739.

101. Tapia G., Cinek O., Witso E. et al. Longitudinal observation of parechovirus in stool samples from Norwegian infants. // J. Med. Virol. - 2008. - Vol. 80. - P. 1835-1842.

102. Tauriainen S., Oikarinen S., Taimen K. et al. Temporal relationship between human parechovirus 1 infection and otitis media in young children. // J. Infect. Dis. - 2008. - Vol. 198. - P. 35-40.

103. Tolf C., Gullberg M., Johansson E.S. et al. Molecular characterization of a novel Ljungan virus (Parechovirus, Picornaviridae) reveals a fourth genotype and indicates ancestral recombination. // J. Gen. Virol. - 2009. - Vol. 90. - no. 4. -843-853.

104. Trant C. M., Jamison R. M. Electron microscopic study of the morphogenesis of echovirus 23. // Exp. Mol. Pathol. - 1975. - 22:55-64.

105. Triantafilou K., Triantafilou M., Takada Y. et al. Human parechovirus 1 utilizes integrins avß3 and avßi as receptors. // J. Virol. - 2000. - Vol. 74. - P. 5856-5862.

106. van der Sanden S., de Bruin E., Vennema H. et al. Prevalence of human parechovirus in The Netherlands in 2000 to 2007. // J. Clin. Microbiol. - 2008. -Vol. 46.-P. 2884-2889.

107. Verboon-Maciolek M.A., Groenendaal F., Hahn C. et al. Human parechovirus causes encephalitis with white matter injury in neonates. // Ann. Neurol. - 2008. -64:266-273.

108. Watanabe K., Oie M., Higuch, M. et al. Isolation and characterization of novel human parechovirus from clinical samples. // Emerg. Infect. Dis. - 2007. - Vol. 13.-P. 889-895.

109. Williams C. H., Panayiotou M., Girling G. D. et al. Evolution and conservation in human parechovirus genomes. // J. Gen. Virol. - 2009. - Vol. 90. - P. 17021712.

110. Wigand, R., Sabin A. B. Properties of ECHO types 22, 23, and 24 viruses. // Arch. Gesamte Virusforsch. - 1961. - Vol. 11. - P. 224-247.

111. Wolthers K., Benshop K.S.M., Schinkel J. et al. Human parechoviruses as an

important viral cause of sepsislike illness and meningitis in young children. // Clin.. Infect. Dis. - 2008. - Vol 47. - P. 358-363.

112. Yamashita T., Sakae K., Tsuzuki H. Complete nucleotide sequence and genetic organization of Aichi Virus, a distinct member of the Picornaviridae Associated with Acute Gastroenteritis in Humans // J. Virol. - 1998. - Vol.72. - P. 84088412.

113. Zhong H., Lin Y., Sun J. et al. Prevalence and genotypes of human parechovirus in stool samples from hospitalized children in Shanghai, China, 2008 and 2009. // J. Med. Virol. - 2011. - Vol.83 - P. 1428-1434.