Генетический и биохимический анализ мутантов Arabidopsis thaliana (L. ) Heynh с измененной чувствительностью к окислительному стрессу тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Маманова, Лира Бакиевна

• Маманова, Лира Бакиевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Маманова, Лира Бакиевна

СОДЕРЖАНИЕ.

Стр.

Список сокращений

Введение

Глава I. Литературный обзор

1.1. Окислительный стресс

1.1.1. Активные радикалы кислорода, вызывающие окислительный стресс

1.1.2. Окислительный стресс, вызванный гербицидами

1.1.2.1. Норфлуразон

1.1.2.2. Плюмбагин

1.1.2.3. Ацифлуорфен

1.2. Антиоксидантные защитные системы растительных клеток

1.2.1. Ферментативные системы защиты от окислительного стресса

1.2.1.1. Супероксиддисмутазы

1.2.1.2. Каталазы

1.2.1.3. Пероксидазы

1.2.1.3.1. Функциональные особенности и внутриклеточная локализация аскорбатпероксидаз (АРХ)

1.2.1.3.2. Функциональные особенности и внутриклеточная локализация гваяколпероксидаз

1.2.2. Неферментативные системы защиты от окислительного стресса

1.3. Использование трансгенных растений для изучения физиологичесских и генетических механизмов устойчивости растений к окислительному стрессу

1.4. Использование мутантов для изучения физиологических и генетических механизмов устойчивости растений к окислительному стрессу. 29 1.4.1. Мутанты, чувствительные к озону. 30 (.4.2. Мутанты, чувствительные к ультрафиолету (УФ)

1.4.3. Мутанты, чувствительные к кадмию

1.4.4. Мутанты с изменённой чувствительностью к фитопатогенам

1.4.4.1. Мутанты, конститутивно зкспрессирующие иммунный ответ и реакцию "гиперчувствительности"

1.4.4.2. Мутанты с конститутивным иммунным ответом, но без некротичесских пятен

1.4.4.3. Мутанты, не имеющие иммунного ответа

I.4.5. Мутанты, толерантные к гербицидам

Экспериментальная часть

Глава И. Материалы и методы

II.1. Растительный материал. 40 Н.2. Методы

11.2.1. Выращивание арабидопсис в асептической и почвенной культуре

11.2.2. Метод отбора устойчивых к норфлуразону растений A.thaiiana

11.2.3. Метод определения чувствительности к НФ

11.2.4. Метод отбора чувствительных к плюмбагину мутантов и определения чувствительности к плюмбагину

11.2.5. Метод отбора ацифлуорфеновых мутантов и определения чувствительности к ацифлуорфену

11.2.6. Метод определения чувствительности к параквату

11.2.7. Метод определения чувствительности к паклобутразолу. 44 ¡1.2.8. Метод регистрации замедленной флуоресценции хлорофилла

11.2.9. Метод электрофоретического выявления изоформ пероксидаз (РХ)

и супероксиддисмутаз (SOD)

11.2.10. Метод определения активностей изоформ пероксидаз и супероксиддисмутаз

11.2.11. Морфологическая характеристика растений

11.2.12. Метод сканирующей электронной микроскопии

11.2.13. Методы статистического анализа

11.2.14. Методы генетического анализа

Глава ill. Результаты и обсуждение. 52 111.1. Создание селективных систем для отбора мутантов с изменённой

чувствительностью к агентам, вызывающим окислительный стресс

111.1.1. Влияние на проростки A.thaliana агентов, ингибирующих биосинтез пигментов в растениях

111.1.2. Влияние на проростки A.thaliana редокс-циклических агентов. 57 IH.1.3. Влияние салициловой кислоты на проростки A.thaliana. 64 lit. 2. Изучение толерантных к норфлуразону мутантов A.tha!iana

111.2.1. Получение мутантов, толерантных к норфлуразону

111.2.2. Фенотипический и генетический анализ мутантов A.thaliana, толерантных

к норфлуразону. 67 IH.2.2.1. Морфологические особенности карликовых мутантов, толерантных к

норфлуразону

111.2.2.2. Генетический анализ карликовых мутантов

111.2.2.3. Морфологические особенности некротических мутантов

111.2.2.4. Генетический анализ некротических мутантов

111.2.2.5. Мутанты nfz12, nfz18, nfz24, толерантные к НФ

111.2.2.6. Генетический анализ мутанта nfz24

111.2.3. Изучение перекрёстной устойчивости к параквату мутантов, толерантных к норфлуразону

111.2.3.1. Влияние параквата на растения расы Dijon и карликовых мутантов, толерантных к норфлуразону

111.2.3.2. Влияние параквата на растения расы Dijon и мутантов nfz18 wnfz24

111.2.3.3. Влияние параквата на растения расы Dijon и некротических мутантов

111.2.4. Влияние параквата на замедленную флуоресценцию хлорофилла в листьях растений расы Dijon и мутантов, толерантных к норфлуразону. 95 III. 3. Изучение мутантов с изменённой чувствительностью к плюмбагину

111.3.1. Отбор мутантов с изменённой чувствительностью к плюмбагину

111.3.2. Морфологические особенности плюмбагиновых мутантов

111.3.3. Генетический анализ мутантов

111.3.4. Изучение чувствительности плюмбагиновых мутантов к параквату. 104 III. 4. Изучение мутантов с изменённой чувствительностью к ацифлуорфену

III .4.1. Отбор мутантов с изменённой чувствительностью к ацифлуорфену

ili.4.2. Фенотипическое и генетическое изучение мутантов

IH.4.2.1. Пигментные мутанты

111.4.2.2. Некротический мутант

111.4.2.3. Мутант с нормальными зелёными листьями. 114 IH.5. Изучение аитиоксидантных ферментов в мутантах с изменённой чувствительностью к норфлуразону

111.5.1. Изучение активности SOD и РХ у мутантов, толерантных к норфлуразону

111.5.1.1. Изучение активности SOD и РХ на разных стадиях онтогенеза

111.5.1.2. Влияние норфлуразона на активность SOD и РХ

111.5.2. Анализ изоферментного состава РХ. 124 Ш.5.3. Изучение изоформ SOD. 130 HI.5.4. Влияние норфлуразона и параквата на относительную активность отдельных изоформ SOD и РХ

Заключение

Выводы

Список публикаций по теме диссертации. Список литературы.

146 147-162

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

АБК - абсцизовая кислота

АЦ - ацифлуорфен

ГАз - гибберелловая кислота

ЗФ - замедленная флуоресценция

ИУК - индолилуксусная кислота

НУК - нафтилуксусная кислота

НФ - норфлуразон

ОС - окислительный стресс

ПААГ - полиакриламидный гель

ПК - паракват

ПЛ - плюмбагин

CK - салициловая кислота

УФ - ультрафиолет

ФС1 - фотосистема I

ФСН - фотосистема II

ЭМС - этилметансульфонат

ЭТЦ - электронно-транспортная цепь

ALS - ацетолактатсинтаза

АРХ - аскорбатпероксидаза

CAT - каталаза

GR - глютатионредуктаза

GST - глютатион-в-трансфераза

Pcb - паклобутразол

PDS - фитоиндесатураза

РРОХ - протопорфириногеноксидаза

РХ - пероксидаза

Rf - электрофоретическая подвижность ROI - активные формы кислорода SAR - системная приобретённая устойчивость SOD - суперокиддисмутаза

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетический и биохимический анализ мутантов Arabidopsis thaliana (L. ) Heynh с измененной чувствительностью к окислительному стрессу»

Введение.

Окислительный стресс (ОС) обусловлен токсическим действием на клеточные структуры активных форм кислорода, перекисей и различных радикалов, образующихся как в процессе жизнедеятельности растений (в частности, при фотосинтезе), так и под воздействием целого ряда стрессовых факторов внешней среды. В клетках растений имеются защитные механизмы, устраняющие токсичные радикалы и обеспечивающие адаптацию к экстремальным условиям. В том числе, важную роль в нейтрализации токсичных радикалов и перекисей играют ферменты антиоксидантной защитной системы - супероксиддисмутазы (SOD), пероксидазы (РХ), катапазы (CAT), глутатионредуктазы (GR), глутатионтрансферазы (GST) и др. Вместе с тем, генетические и физиологические механизмы восприятия растениями стрессового сигнала и его передачи на уровень регуляции действия генов антиоксидантной защитной системы остаются мало исследованными. Эффективными подходами для изучения этих вопросов являются: (1) создание и физиолого-биохимический анализ трансгенных растений с изменённой экспрессией генов антиоксидантной защитной системы; (2) получение и изучение мутантов с изменённым ответом на окислительный стресс. Последний подход является особенно ценным для выявления новых генов, отвечающих за развитие устойчивости к окислительному стрессу у растений.

Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. является модельным генетическим объектом. Короткий жизненный цикл (1,5 - 2 месяца), высокая плодовитость (до 1000 семян с одного растения), миниатюрность растений, позволяющая выращивать их в пробирках в лабораторных условиях, а также мелкий размер семян, дающий возможность анализировать на одной чашке Петри более 1000 проростков, позволяют считать A.thaliana наиболее удобным объектом для получения мутантов, с изменённой чувствительностью к окислительному стрессу. Для получения таких мутантов в качестве селективного агента могут быть использованы гербициды, вызывающие образование активных радикалов кислорода и гибель растений в результате окислительного стресса. Получение мутантов, резистентных к гербицидам, представляет не только научный интерес, но имеет большое практическое значение: небольшой размер генома A.thaliana (около 120 000 т.п.н.) и малое количество повторяющихся последовательностей повышают эффективность экспериментов по клонированию генов, что позволяет использовать гены A.thaliana

для создания устойчивых к гербицидам форм хозяйственно ценных растений (11 I., е! а1., 1992).

Данное исследование направлено на выделение, а также генетическое и физиолого-биохимическое изучение мутантов А.НчаНапа с изменённой чувствительностью к гербицидам с целью идентификации генов, участвующих в адаптивном ответе на окислительный стресс. Задачами работы являлось:

1. Создание надёжных селективных систем для отбора мутантов с изменённой чувствительностью к ОС. И выделение таких мутантов.

2. Фенотипическая характеристика полученных мутантов и их генетический анализ.

3. Изучение перекрёстной устойчивости к другим агентам.

4. Анализ активности ферментов антиоксидантной системы защиты у растений дикого типа и мутантов в нормальных условиях и при воздействии стресса.

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. Окислительный стресс.

Окислительный стресс в растениях может вызываться целым рядом разнообразных абиотических и биотических факторов (Рис.1).Каждый из них тем или иным способом приводит к образованию вредных для растений производных кислорода (ROI - reactive oxygen species), которые являются сильными окислителями: дигидроперекиси водорода Н2О2, гидроксильного радикала - ОН, супероксидного аниона - О'г, синглетного кислорода - 102 (Mehdy М.С., 1994; Bartoz G., 1997).

Биотические и абиотические -----> Озон, ультрафиолет, засуха, стрессовые воздействия тепловой и холодовой стрессы, соли,

р-окисление жирных кислот, фотосинтез,

окислительное фосфорилирование, фотодыхание, старение и др. i

ROI (H202,0H\ 0"2,102. ОН)

окислительный стресс i

адаптивный ответ

Рисунок 1. Возникновение окислительного стресса у растений (Vernooij В., et al.,

4

Фитопатогены, тяжелые металлы, гербицида, засоление и т.д.

1994).

Возникновение окислительного стресса может быть вызвано разными путями, в зависимости от стрессового фактора. При разных стрессовых воздействиях (и

эндогенных, и экзогенных) в развитии окислительного стресса могут принимать разные активные радикалы кислорода.

1.1. Активные радикалы кислорода, вызывающие окислительный стресс.

Большое число химически активных и потому токсичных форм кислорода возникает в процессе фотосинтеза в хлороппастах. Синглетный кислород представляет собой высокоэнергетическое электронное состояние, образующееся в результате переноса энергии электрона от триплетно возбужденных молекул хлорофилла (3Р) на атом кислорода.

Р------>1р—->3Р, 3Р+02------>р+1о2

Эффективными источниками синглетного кислорода являются также предшественники хлорофилла - протохлорофилл, протофеофитин, протопорфирин, мезопорфирины.

Синглетный кислород играет ключевую роль среди активных форм кислорода. Он является сравнительно устойчивым продуктом, способным выходить из компартмента, где он непосредственно генерируется, обладает высокой реакционной способностью и сильным поражающим воздействием на белки, липиды и хлорофилл (Гольдфельд М.Г., Карапетян Н.В., 1989).

Во время кислородного дыхания при работе митохондриальной электрон-транспортной цепи кислород (02) может акцептировать электрон на ферредоксине и превращаться в суперокисдрадикал (0"2). Супероксидрадикал под действием фермента супероксиддисмутазы восстанавливается в перекись водорода (Н2О2). Оба эти ROI хотя и влияют на определенные клеточные структуры и процессы, не являются очень токсичными соединениями. Но в присутствии тяжелых металлов происходит реакция Хаббера-Вайса (Bowler М., et al., 1992): Fe^Fe3*

Н202+0"2------------>0H"+02+0H

В результате этой реакции образуется гидроксиланион, молекулярный кислород и гидроксилрадикап, представляющий собой крайне реакционно-способное и токсичное соединение. Основной мишенью гидроксилрадикала оказываются липиды мембраны, содержащие ненасышенные жирные кислоты; гидроксилрадикап вызывает цепную реакцию перекисного окисления липидов и жирных кислот, в результате которой при действии даже небольшого количества гидроксилрадикала

пораженными оказываются обширные участки мембран. Продуктом перекисного окисления липидов является токсичное соединение малондиальдегид (Гольдфельд М.Г., Карапетян Н.В., 1989). Таким образом, гидроксилрадикал (наряду с синглетным кислородом) является наиболее реакционно-способным агентом среди вызывающих окислительный стресс.

1.2. Окислительный стресс, вызванный гербицидами.

Агентами, вызывающими ОС являются многие гербициды. Хотя гербициды, имеющие разную химическую природу, оказывают влияние на самые разные биохимические процессы в клетках растений, гибель растений под действием гербицидов в большинстве случаев связана именно с окислительным стрессом. Рассмотрим механизмы действия на растения тех гербицидов, которые используются в данной работе.

1.2.1. Норфлуразон.

Гербицид норфлуразон относится к группе пиридазинонов, многие из которых, как и сам норфлуразон, широко применяются в сельском хозяйстве. Эта группа гербицидов названа обесцвечивающими, поскольку их действие приводит к уменьшению содержания хлорофиллов вследствие их фотодеструкции.

^-УН-СНз

а

Норфлуразон обладает множественными действиями на растение:

1. блокирует биосинтез каротиноидов;

2. ингибирует фотосинтетическую цепь переноса электронов;

3. вызывает изменение жирнокислотного состава липидов.

Основным эффектом норфлуразона на растения является ингибирование биосинтеза каротиноидов в хлоропластах растений. Норфлуразон блокирует синтез каротиноидов на стадии десатурации (дегидрирования) фитоина в фитофлуин,

ингибируя посредством неконкурентного связывания фермент фитоин-десатуразу, являющуюся ключевым ферментом биосинтеза каротиноидов (Рис.2). В результате этого происходит накопление бесцветного фитоина и недостаток каротийоидов в хлоропласте (Fraser P.D., et al., 1993; Chamovits D., et al., 1990).

Мевалонат -> фарнезил пирофосфат -» геранилгеранил пирофосфат энт-каурен 4 4* I

АБК фитоин ГА

4» офитоин-десатураза <=*нофлуразон

фитофлуин

4-

р-каротин 4-

АБК

Рисунок 2. Схема биосинтеза каротиноидов в растениях (Pecker I., et al., 1992). Принятые обозначения: <=*- ингибирование.

Следует отметить, что каротиноиды являются предшественниками для синтеза абсцизовой кислоты (АБК), а предшественник фитофлуина - геранилгеранил-пирофосфат является также предшественником синтеза еще одного класса фитогормонов - гиббереллинов (ГА) (Рис.2).

Другое действие норфлуразона заключается в том, что он блокирует перенос электронов по ЭТЦ ФСИ в её акцепторной части. Полной блокировки при этом не происходит. Третье действие норфлуразона заключается в ингибировании образования полиненасыщенных жирных кислот в галактолипидах хлоропластов. Исследования, выполненные на водорослях Spirufina pfatensîs и Monodus subterraneus показали, что наиболее чувствителен к действию НФ, является переход линолевой кислоты в линоленовую кислоту (Cohen Z., et al., 1990).

В конечном счёте обесцвечивание и гибель растений под действием норфлуразона связана с накоплением кислородных радикалов и триплетов хлорофилла, способствующих протеканию процессов окислительной деструкции хлорофилла, свободно-радикального окисления компонентов растительной клетки.

Эти эффекты обусловлены повышенной чувствительностью пигментного аппарата к свету из-за резкого уменьшения содержания каротиноидов, так и из-за подавления активности фотосинтетического переноса электрона, когда энергия света, поглощенного молекулами хлорофилла, не может быть использована в реакционных центрах и поэтому ведёт к фотодеструкции пигментов хлоропластов.

1.2.2. Плюмбагин.

Плюмбагин (5-гидрокси-2 метил-1.4-нафталендион) - вещество, относящееся к классу нафтохинонов. Хиноновые гербициды осуществляют подавления транспорта электронов на уровне связанного пластохинона. На свету акцепторный комплекс ФСН обратимо связывает несколько молекул хинона, вытесняя эндогенный ппастохинон, при этом полностью подавляя дальнейшее восстановление пластохинонового пула и перенос восстановительных эквивалентов далее в электронно-транспортную цепь. Плюмбагин способствует образованию 0"2 благодаря способности отнимать электрон у компонентов, переносящих электроны. При этом превращается в семихинон. Он может вступать в/этот процесс много раз, и поэтому считается редокс-цикличным агентом (Рагг Б.В., 1985).

I II ОН О

1.2.3. Ацифлуорфен.

Гербицид ацифлуорфен (5-(2-хлоро-4-(флуорометил) фенокси)-нитробензойная кислота) относится к дифениловым эфирам, веществам, которые стимулируют накопление порфиринов - предшественников хлорофилла.

О

Гербицид ингибирует фермент протопорфириногеноксидазу (РРОХ), который осуществляет превращение протопорфириногена IX в протопорфирин IX (Рис.3) (Varsano R., et al., 1990; Camadro J., et al., 1991; Duke S.O., et al., 1991; Falbel T.G., et al., 1994; Wettstein D., et al., 1995; Watanabe N., et al., 1998; Lermontova I., et al., 1997). Известно, что существует два типа фермента протопорфириногеноксидазы: митохондриальная и пластидная (Smith A.G., et al.,1993).

Глутамат 45 - аминолевулиновая кислота 4-

порфобилиноген

уропорфириноген III

4- <=уропорфириноген III декарбоксилаза копропорфириноген III

4- <= копропорфириноген III оксидаза протопорфириноген IX 4, i

митохондриальный гем 4> <=протопорфирин IX оксидаза протопорфирин IX

феррохелатаза=> 4—Fe Mg—4- <=Мд-хелатаза

хлоропластный гем Мд-протопорфирин IX

протохлорофиллид hv=>4< хлорофиллид

I

хлорофилл а I

хлорофилл b

Рисунок 3. Схема биосинтеза хлорофилла в растениях (Falbel T.G., et al., 1994; Wettstein D„ etal., 1995).

В результате ингибирования фермента протопорфириногеноксидазы (РРОХ) происходит накопление протопорфириногена IX. Протопорфириноген IX высвобождается из пластид в цитоплазму и превращается в протопорфирин при помощи неспецифичных пероксидаз, связанных с плазматической мембраной (Jacobs J.M., et al., 1993). Mg - хелатаза и феррохелатаза не способны утилизировать протопорфирин, так как локализуются в пластидах, за счёт чего происходит накопление протопорфирина. При световой активации протопорфирина, происходит генерация высокореакционного синглетного кислорода, который способствует возникновению различных повреждений (Becerrll J.M., et al. 1989; Jacobs J. M., eta»., 1991).

Первый растительный ген кодирующий РРОХ был клонирован у A.thaliana по способности одного из кДНК клонов библиотеки A.thaliana функционально комплементировать мутацию hemG в гене РРОХ из E.coli (Narita S., et al., 1996). Показано, что белок состоит из 537 аминокислот и содержит лидерный пептид для транспортировки белка в митохондрии. По данным Саузерн-блот гибридизации ген представлен в геноме A.thaliana одной копией (Narita S., et al., 1996).

Недавно были клонированы ядерные гены, кодирующие пластидную и митохондриальную изоформы РРОХ у табака (Lermontova I., et al., 1997). Оказалось, что нукпеотидные последовательности данных изоформ показывают сходство с РРОХ A.thaliana, Bacillus subtllls, млекопитающих. кДНК пластидной РРОХ кодирует белок из 548 аминокислот, а митохондриальная кДНК - из 504 аминокислот. Доля идентичных аминокислот в обоих изоформах составила всего 27,2%.

2. Антиоксидантные защитные системы растительных клеток.

Несмотря на то, что окислительный стресс может быть вызван различными способами, все они способствуют запуску единого механизма защиты -АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ. Компоненты антиоксидантной защитной системы можно подразделить на 2 группы:

1. Антиоксиданты, имеющие ферментативную природу. Эта система состоит из ферментов таких как каталаза, супероксид-дисмутаза, пероксидаза, глютатион-трансфераза, глютатион-редуктаза, глютатион-дегидрогеназа и др., которые в основном уничтожают ROI после их формирования (Bowler М., et al., 1992; Bartosz G., 1997).

2. Низкомолекулярные неферментативные антиоксиданты аскорбат, глютатион, а-токоферол, фенольные соединения, каротиноиды (Willekens Н., et al., 1994; Alsher R.G., 1994), антоциан (Bart J.B., et al., 1994), пролин, которые предотвращают образование ROI, а также участвуют в нейтрализации ROI и после их формирования (Yogesh К., et al., 1994).

2.1. Ферментативные системы защиты от окислительного стресса.

Важную роль в детоксикации возникающих при ОС радикалов кислорода играют антиоксидантные ферменты. Супероксиддисмутаза (SOD) инактивирует супероксидрадикал в реакции:

0*2 + 2Н+----------->Н202

Образующаяся при этом перекись водорода утилизируется под действием двух разных классов ферментов: каталаз и пероксидаз (Willekens Н., et al., 1994).

Каталазы не нуждаются в каком либо кофакторе-восстановителе перекиси и осуществляют реакцию:

Н202 + 2RH----------->02 + 2 Н20 (Bowler М., et al., 1992)

Пероксидазы переносят электрон с соответствующего кофактора к которым относят аскорбиновую кислоту, глютатион, а-токоферол и др. В общем виде реакцию, катализируемую пероксидазами, можно изобразить следующим образом:

Н202 + 2RH------------> Н20 + 2R

Рассмотрим более подробно биохимическую и генетическую информацию о важнейших антиоксидантных ферментах.

2.1.1. Супероксиддисмутазы.

Все SOD - ферменты, содержащие 2-валентый металл. Реакция, осуществляемая этим ферментом, более подробно может быть описана следующим способом:

O'2 + М3*--------->02 + М2+

0"2 +2М2+ + Н+---------> Н202 + М3*

В качестве металлического кофактора могут выступать медь/цинк (Cu/Zn), марганец (Mn SOD), железо (Fe SOD). На этом признаке основана классификация SOD (Scandados J.G., 1990).

Fe SOD и Mn SOD в эволюционном плане являются, по-видимому, самыми древними, поскольку имеются как у прокариотических, так и зукариотических организмов. Cu/Zn SOD обнаруживается только у высших растений и животных, будучи, таким образом, довольно поздно появившимся ферментом, но тем не менее, его происхождение относится к общему для растений и животных корню (Bowler М., et а!., 1992).

Наиболее подробно изучены SOD кукурузы (Scandalios J.G., 1990). В клетках растений кукурузы обнаружено 5 типов SOD: SOD1, SOD2, SOD3, SOD4, SOD5. SOD3 в качестве кофактора содержит Мп, остальные SOD - Cu/Zn. SOD3- является гомотетрамерным белком, масса субъединицы которого составляет 24 кДа. К свойствам, отличающим SOD3 (как и Mn SOD всех других организмов), относятся: нечувствительность к KCN, Н2О2, дизтилдитиокарбомату и температуре 5°С.

SOD1, SOD2, SOD4, SOD5 - гомодимеры, с массой субъединиц от 14 до 17 кДа, содержащие в качестве кофактора Cu/Zn.

Для супероксиддисмутаз характерна специфичность локализации во внутриклеточных компартментах в зависимости от типа SOD (Baum J., Scandallos J.G., 1979). SOD1 обнаруживается только в пластидах, SOD3 характерна исключительно для митохондрий, а остальные Cu/Zn SOD локализованы в цитозоле. Надо отметить, что для всех растительных и животных объектов характерна локализация Mn-содержащей SOD в митохондриях.

Молекулярно-генетические исследования, проведенные на кукурузе, обнаружили 5 ядерных генов SOD, кодирующих 5 типов изоферментов. Гены получили соответствующие названия: SOD7, SOD2, SOD3, SOD4, SOD5 (Baum J., Scandalios J.G., 1981; 1982).

У A.thaliana недавно идентифицировано 7 генов SOD: три гена Cu/Zn SODs (CSD CSD2, and CSD3), три гена Fe SOD (FSD1, FSD2, and FSD3), и один ген Mn SOD (MSD1) (Kliebenstein D.J., et el., 1998). Обнаружено, что разные стрессовые воздействия - УФ-облучение, озон, разные световые режимы вызывают экспрессию различных SOD-генов.

2.1.2. Каталазы.

Так же как и SOD, каталазная система была хорошо изучена у кукурузы (Scandalios J.G., 1990; Acevedo A., et al., 1991). Были обнаружены три изоформы:

САТ1, САТ2, САТЗ, отличающиеся по локализации в тканях и по стадии жизненного цикла на которой они появлялись. Все 3 типа каталаз представляют собой гомотетрамеры массой 240 кДа. Возможно образование in vitro гетеромеров из субъединиц САТ1, САТ2, в то время как субъединицы САТЗ не образуют комплексов с другими каталазами, что говорит о функциональной обособленности этого изозима.

Каталазы, так же как SOD, имеют характерную внутриклеточную локализацию. Ферменты САТ1 и САТ2 локализованы в пероксисомах, глиоксисомах и цитозоле. САТЗ выделяется только с митохондриями.

В геноме кукурузы обнаружено 3 гена каталаз, соответствующих 3 типам изоферментов: САТ1, САТ2, САТЗ. кДНК всех 3 генов были клонированы и охарактеризованы (Scandaiios J.G., 1990). Исследования показали высокую степень их гомологии, хотя отличие гена САТЗ от САТ1 и САТ2 более существенное, чем отличия между САТ1 и САТ2. Сравнение аминокислотного состава ферментов, кодируемых кДНК кукурузы, с последовательностью аминокислот каталаз растений других видов также показало высокую степень их гомологии (Scandaiios J.G., 1990).

Геном табака (Л/. plumbaginifolia) содержит также 3 типа каталаз (Willekens Нм et al., 1994а). Фермент САТ1 в основном обнаруживается в листьях, САТЗ в семенах. Предположительно, САТ1 вовлечён в процесс обезвреживания перекиси водорода, образовавшуюся при фотодыхании в пероксисомах. САТЗ способствует обезвреживанию перекиси водорода, которая образовалась в глиоксисомах при разрушении жирных кислот. Роль САТ2 не известна (Willekens Н., et al., 1994b).

Семейство каталазных генов A.thaliana также состоит из трех генов: САТ1, САТ2, САТЗ. САТ1 и САТЗ локализованы в 1-ой хромосоме, а ген САТ2 - в 4-й хромосоме. Каждый из генов кодирует отдельную субъединицу белка. Взаимодействие этих субъединиц in vivo приводит к формированию по крайней мере 6 разных изоформ, которые легко идентифицируются при нативном электрофорезе белков (McClung C.R., 1997). Показано тканеспецифичное проявление изоферментов каталазы, а также мРНК, соответствующих отдельным субъединицам белка. Так, например, все 6 изоформ присутствовали в цветках и листьях растений A.thaliana, но только 2 изоформы обнаружены в корнях. Все 3 типа мРНК присутствовали в стеблях растений, но в листьях - только мРНК генов САТ2 and САТЗ. Интересно, что экспрессия генов САТ1 и САТ2 индуцировалась светом, в то время как экспрессия гена САТЗ подавлялась под действием света (McClung C.R., 1997).

2.1.3. Пероксидазы.

Пероксидазы - растительные ферменты, которые катализируют окисление компонентов клетки пероксидом или органическими гидроперекисями. По различным оценкам, каждое растение обычно кодирует от 8 до 15 различных семейств пероксидаз. Согласно современной классификации (\/УеНпс!ег К., е! а1., 1993), пероксидазы растений разделяются на два класса:

1. аскорбат-пероксидазы (АРХ), имеющие высокую степень гомологии (38%) с цианобактериальными цитохром-с-пероксидазами (ССР);

2. классические секреторные пероксидазы (РХ).

Аскорбат-пероксидазы, относящиеся к 1 классу, локализуются в хлоропластах и цитоплазме и отличаются от классических растительных пероксидаз по своей первичной структуре.

Классические секреторные пероксидазы (РХ) относятся к 3 классу (2 класс пероксидаз составляют внеклеточные пероксидазы грибов). Поскольку при работе с классическими пероксидазами в качестве восстанавливающего субстрата обычно используется гваякол, эти ферменты обычно называют гваякол-пероксидазами. Детальное изучение структуры растительных пероксидаз обнаружило значительные различия между аскорбат и гваякол-пероксидазами. В составе АРХ нет дисульфидных мостков и ионов Са++, в то время как РХ имеют в своем составе 4 дисульфидных мостика и два структурных иона Са++. Кроме того, большинство секреторных растительных пероксидаз гликозилированы.

В работе этих типов пероксидаз тоже имеются значительные расхождения. Аскорбат-пероксидазы в качестве восстанавливающего субстрата используют аскорбиновую кислоту, в то время как классические растительные пероксидазы окисляют фенольные соединения, причем со значительно большей скоростью. АРХ очень нестабильны в отсутствие восстанавливающего субстрата, в то время как гваякол-пероксидазы очень стабильны.

На основании этих и других структурно-функциональных отличий, предполагается, что аскорбат- и гваякол-пероксидазы также различаются по своим физиологическим функциям.

2.1.3.1. Функциональные особенности и внутриклеточная локализация

аскорбат-пероксидаз (АРХ).

Основной функцией аскорбат-пероксидаз является утилизация перекисей и следовательно, защита растения от окислительного стресса. АРХ (совместно с аскорбатом) участвует в утилизации Н2О2, образующегося в растительных клетках в норме и при стрессовых воздействиях (см. ниже Рис.4). Предполагается, что продукты окисления (монодегидроаскорбат-кислотные радикалы) не выполняют никакой физиологической роли, поскольку все они восстанавливаются обратно до аскорбата монодегидроаскорбат-редуктазой или образуют два продукта: аскорбат и дегидроаскорбат (Asada К., et ai., 1987; Bowier M., et ai., 1992; Asada К., 1994).

АРХ обнаружена в хлоропластах и цитоплазме и представлена несколькими изоформами. Цитозольная АРХ (сАРХ) существует в растворимой форме и мембран-связанной форме. Хлоропластные ферменты локализованы либо в строме (sAPX) в растворимой форме, либо в тилакоидах (tAPX) в мембранно-связанной форме (Jespersen H.M., et al., 1997). Каэедый из трёх типов аскорбат-пероксидаз катализирует следующую реакцию:

2 аскорбат + Н202 —> монодегидроаскорбат + 2 Н20

Аминокислотная последовательность в области амино-конца тилакоидной аскорбат-пероксидазы (ÎAPX), выделенной из шпината, и чайной стромальной аскорбат-пероксидазы (sAPX) показывают высокую степень гомологии друг с другом и отличаются от цитоплазматической аскорбат-пероксидазы (сАРХ).

Аскорбат-пероксидазы характеризуются высокой специфичностью к аскорбату как к донору электронов, особенно в случае tAPX и sAPX. сАРХ катализирует окисление фенолов в присутствии аскорбата. sAPX и tAPX существуют в виде мономеров, а некоторые из сАРХ способны образовывать димеры.

Все аскорбат-пероксидазы имеют высокую степень гомологии с цитохром-с-пероксидазой дрожжей (34-38%) и несколько меньшую степень (20%) - с растительной гваякол-пероксидазой.

В отсутствие аскорбата АРХ инактивируются и по этой причине долгое время они оставались неизвестны исследователям. В отсутствие аскорбата sAPX и tAPX инактивируются в течение 30 сек., а сАРХ - в течение 2 часов. Цитоплазматическая АРХ не только более стабильна по сравнению с хлоропластными АРХ, но и обладает более широким спектром донорной специфичности. Предполагаемая защитная роль

АРХ против окислительного стресса была подтверждена родом работ, в которых

/

показано присутствие положительной корреляции между применением различных стрессовых воздействий и активностью АРХ (Mittler R., et al., 1993; Yamasaki H., et al., 1997).

В геноме A.thaliana обнаружено 5 генов цитозольной АРХ: 2 гена cs1 и cs2 цитозольных растворимых АРХ и 3 гена цитозольных мембрано-связанных ст1, cmZ стЗ, и два гена, кодирующих хлоропластную АРХ: ген chs, отвечающий за образование стромальной АРХ и ген cht типакоид связанной АРХ (Jespersen Н.М., et al., 1997).

2.1.3.2. Функциональные особенности и внутриклеточная локализация гваякол-

пероксидаз.

В отличие от АРХ, гваякол-пероксидазы (РХ) окисляют широкий спектр органических субстратов и продукты их окисления оказываются вовлеченными в весьма важные биохимические процессы. Предполагается, что РХ выполняют разнообразные физиологические функции в растении, в том числе - биосинтез и распад лигнина, обеспечение жесткости клеточной стенки при росте и развитии растения. Реакции лигнификации осуществляют РХ, связанные с клеточной стенкой, среди которых выделяют 3 типа в зависимости от способа их выделения: ионо-связанные ферменты, ковалентно-связанные и РХ, которые остаются связанными среди нерастворимых остатков клеточной стенки. Эти ферменты катализируют две реакции, в результате которых происходит образование лигнина. Они окисляют монолигнолы до фенокси-радикалов и образуют Н2О2, окисляя восстановленный никотинамиддинуклеотид (NADH) (Gordon J., et al., 1993).

Пероксидазы клеточной стенки растений играют ключевую роль в приобретении ее жёсткости и, соответственно, в прекращении роста клетки. Они уменьшают растяжимость клеточной стенки за счет формирования дифенильных мостиков между полимерами, такими как гидропролины, пектины и гемицеллюлозы. Было показано, что во время активного роста гипокотилей сосны, активность РХ остается низкой, но заметно растет с момента замедления скорости роста клеточной стенки. Таким образом, наблюдается четкая обратная взаимосвязь между ростом растения и пероксидазной активностью (Sancher М.,1993).

Помимо рассмотренных функций, РХ участвуют в катаболизме ауксина, действуя как ИУК-оксидазы и предотвращая закисление межклеточной среды, которое могут вызывать растительные гормоны при их перемещении из внутриклеточного во внеклеточное пространство (Medina М., et al., 1993; Planz Н., 1993; Shynmio A., et al., 1993).

Предполагается, что важную роль РХ играют и в обеспечении защитного ответа на инфекционные, механические, тепловые и холодовые повреиедения. Показано, что под влиянием этих стрессовых воздействий в растениях пшеницы, земляники, томата повышаются уровни активности РХ, появляются новые стресс-специфические изоформы РХ (Edreva А., 1993; Krstic В., et al., 1997; Lurie S., et al., 1997).

Об участии РХ в защите растений от стрессовых воздействий косвенно свидетельствуют и полученные недавно результаты изучения структуры генов РХ A.thaliana. В имеющихся для A.thaliana базах данных о клонированных фрагментах ДНК и кодируемых ими аминокислотных последовательностях, обнаружено около 40 последовательностей, которые могут представлять собой пероксидазные гены. В 23 из 30 подробно изученных нукпеотидных последовательностей предположительных клонов РХ в районе 5'-конца обнаружены нетранслируемые участки, содержащие 4071% аденина. Эта редко встречающаяся особенность характерна для генов, кодирующих белки, индуцируемые стрессом (Ostergaard L., 1998).

2.2. Неферментативные системы защиты от окислительного стресса.

Группа неферментативных, низкомолекулярных антиоксидантов также как и ферментативная группа способствует уничтожению активных радикалов кислорода. Недавно была показана важная роль глютатиона в защите от ОС. Глютатион обладает способностью реактивировать ОН" и О'г, участвует в детоксикации токсичных продуктов переписного окисления липидов. Фермент глютатион-S-трансфераза (GST) катализирует эту детоксикацию реакцией соединения глютатиона с гидрофобными злектрофильными компонентами (Droog F.N., et al., 1993). Кроме того, глютатион может действовать совместно с аскорбиновой кислотой. Аскорбиновая кислота реагирует с Н2О2 в присутствии аскорбат пероксидазы и формирует промежуточный монодегидроаскорбатный радикал.

Монодегидроаскорбатный радикал может превращаться в дегидроаскорбат.

Дегидроаскорбат преобразуется в аскорбиновую кислоту с сопутствующим окислением СвН(восст.) в ОЗвО(окисл.). ввН регенерируется в присутствии ЫАРР глютатионредуктазой (УодеэЬ К., е! а!., 1994). Эта система образует так называемый путь НаШме1-Азас1а (Рис.4).

Н202-

,->дегидроаскорбат-т

аскорбат пероксидаза

Н20<-

-аскорбат<--

г-глютатио^восст.^л

•>NADP

глютатион редуктаза

->глютатион(ок.)-

-NADPH

Рисунок 4. Схема детоксикации супероксида, генерируемого в хлоропластах при участии аскорбатпероксидазы, глютатионредуктазы (Asada К., 1987; Bowler М., et al., 1992; Asada К., et al.,1994).

Интересно, что все выше перечисленные компоненты защитной системы активируются в разное время после начала окислительного стресса. Замечено, что первыми в защиту включаются каталаза и глютатион, и только позже -супероксиддисмутаза и аскорбат пероксидаза.

Помимо глютатиона и аскорбата важную роль в защите от ОС играют каротиноиды. Наиболее важной функцией каротиноидов в фотосинтезирующих тканях является защита хлоропластов от фотоокисления. Как уже отмечалось выше, при поглощении кванта света хлорофилл (Р) переходит в возбужденное триплетное состояние. В таком состоянии он взаимодействует с триплетным кислородом и в результате образуется активный синглетный кислород. Каротиноиды (К) забирают энергию с молекулы хлорофилла и переходят в триплетное состояние, выделяя тепло в окружающую среду.

Р + квант света --> 3Р

К + 3Р --> 3К + Q

При высокой интенсивности солнечного освещения, когда растения оказываются неспособны продуктивно использовать всю поступающую световую энергию, для защиты хлорофилла от фотоокисления растения используют дополнительный механизм защиты, в котором также участвуют каротиноиды - т.н. ксантофилловый цикл. На свету (в условиях избытка энергии возбуждения) из виолаксантина путем

двуступенчатой ферментативной реакции дезпоксидации образуется зеаксантин, накопление которого коррелирует с быстрым нефотохимическим погашением флюоресценции хлорофилла в экспериментах in vitro. Таким образом, благодаря работе ксантофиллового цикла происходит перемещение избытка энергии возбуждения с антенного комплекса ФСН на каротиноидный пигмент зеаксантин (Bartley С.Е., et al., 1995).

Важную роль в защите от ОС играют также а-токоферол, антоциан, флавоноиды (Dixon R.A., et ai., 1995; Shirley B.W., 1996). а-токоферол и флавоноиды используются пероксидазами в качестве кофактора, с которого они переносят электрон на перекись водорода, тем самым обезвреживают его (Miller Е., et а!., 1985; Scheier P., et al., 1985; Yamasaki H., et al., 1997). Также, недавно показано, что флавоноиды могут служить в качестве оптических фильтров (Gouid K.S., et al., 1995).

Таким образом, в настоящее время получена большая информация о физиолого-биохимических системах, участвующих в защите растений от ОС. Генетические исследования позволили идентифицировать, локализовать на генетических картах растений и клонировать основные гены, контролирующие образование антиоксидантных ферментов. Вместе с тем, многие вопросы генетики ОС изучены еще очень слабо. Практически отсутствует информация о механизмах регуляции экспрессии генов, кодирующих антиоксидантные системы защиты, о системах восприятия и передачи стрессовых сигналов. Эффективными подходами для изучения этих вопросов является создание и изучение трансгенных растений с изменённой экспрессией генов антиоксидантной защитной системы.

3. Использование трансгенных растений для изучения физиологических и генетических механизмов устойчивости растений к

окислительному стрессу.

В настоящее время для изучения функций и регуляции генов антиоксидантной защитной системы активно используются трансгенные растения с изменённым уровнем экспрессии антиоксидантных ферментов - SOD, АРХ, GR, CAT, РХ.

Существует два подхода, дающие возможность манипулировать уровнем антиоксидантных ферментов в трансгенных растениях.

Первый подход состоит в том, что создаются генные конструкции, в которых интересующий ген помещают под контроль активного промотора. Во всех

исследованиях цитируемых в данном обзоре использовался промотор рибосомального гена 35S вируса мозаики цветной капусты (CaMV). Трансформация растений агробактериальными векторами, в состав которых включали подобные конструкции приводила к увеличению активности белков, кодируемых трансгеном.

Второй подход заключается в создании антисмысловых конструкций. Для этого нуклеотидная последовательность интересующего гена ставится между промотором и терминатором в инвертированном положении. Экспрессия антисмысловой ДНК в трансгенных растениях приводит к образованию антисмысловой мРНК, образующей стабильный дуплекс со смысловой мРНК, в результате чего происходит снижение активности фермента.

В работе Bowler M. с соавт. (1991) было создано трансгенное растение табака, которое экспрессировало химерный ген, полученный из кДНК Mn SOD у Nicotiana plumbaginifotia. В данном гене нуклеотидная последовательность, кодирующая амино-концевой пептид, ответственный за транспорт белка в митохондрию, была замещена участком гена RuBP-Case гена A.thaliana, кодирующим пептид, который отвечает за транспорт белка в хлоропласт. Эта химерная конструкция была поставлена под контроль 35S CaMV промотора. Растения, которые несли этот новый хлоропластный Mn SOD ген, зкспрессировали уникальную изоформу Mn SOD, которая попадала в строму хлоропластов. Активность Mn SOD в таких растениях была в 1.5-2 раза выше, чем в нетрансформированных растениях. Степень повреждений мембраны и хлоропластов в таких растениях была намного меньше, чем в нетрансформированных растениях. Такие же результаты были получены при переносе этого же химерного гена в другие виды растений. Так было показано заметное увеличение устойчивости к гербициду ацифлуорфену и холодовому стрессу при экспрессии этого трансгена в растениях люцерны (Medicago sailva) (Mc.Kersie B.D., et al., 1993) и хлопчатника (Gossypium hirsuitum) (Trolinder N.L., 1994).

Tepperman J.M. с соавт. (1990) создали трансгенные растения табака, которые зкспрессировали химерный ген хлоропластной Cu/Zn SOD из петунии под контролем промотора 35S CaMV. Эти растения показывали ~30-50-кратное увеличение активности SOD при сравнении с нетрансформированными растениями. Но несмотря на большую активность ферментов, уровень устойчивости к гербициду параквату не отличался от такового у контрольных растений (Pitcher L.H., 1991).

Совершенно другие результаты были получены при экспрессии гена хлоропластной Cu/Zn SOD гороха в табаке (Tepperman J.M., et al., 1990).

Трансгенные растения имели 3-кратное увеличение активности фермента, что приводило к увеличению устойчивости растений к параквату. Этот эффект был замечен только при низких концентрациях гербицида, но отсутствовал при высоких. Таким образом, существует оптимальный диапазон концентраций хлоропластной Cu/Zn SOD, в пределах которого наблюдается увеличение устойчивости; при дальнейшем увеличении концентрации Cu/Zn SOD эта зависимость исчезает. Очевидно, это связано с тем, что чрезмерная продукция Н2О2, катализируемая Cu/Zn SOD, ингибирует фермент и ведет к уменьшению уровня устойчивости (Alien R., 1995; 1997).

Гипотеза о том, что в жёстких условиях окислительного стресса происходит дезактивирование хлоропластной Cu/Zn SOD была подтверждена Schake SA. с соавт. (1995). Для этого сравнивались сверхпродуцирующие Cu/Zn SOD трансгенные растения табака и трансгенные растения табака того же вида, которые сверхэкспрессировали генную конструкцию хлоропластной Mn SOD. Эта Mn SOD трансгенная конструкция похожа на полученную Bowler М. с соавт. (1991), о которой говорилось выше, но состояла из кДНК митохондриальной Mn SOD гороха, в которой нукпеотидная последователоность, кодирующая амино-концевой пептид, ответственный за транспорт белка в митохондрию, был заменён на последовательность гена хлоропластной Cu/SOD, кодирующую пептид ответственный за транспорт в хлоропласт. Анализ показал, что растения, экспрессирующие Mn SOD и Cu/Zn SOD при низких концентрациях параквата (0,6-1,2 мМ) имеют одинаковый уровень повреждения мембран и существенно меньший, чем контрольные ^трансформированные растения. Однако, при более высоких концентрациях гербицида (2,4 мМ) устойчивость Mn SOD экспрессирующих растений сохранялось, в то время как устойчивость Cu/Zn SOD экспрессирующих растений не отличалось от устойчивости контрольных растений.

В данной работе было установлено также, что растения, экспрессирующие хлоропластную Mn SOD более чувствительны к фотоокислительному повреждению, чем Cu/Zn SOD экспрессирующие растения, и лишь незначительно устойчивее, чем контрольные растения (Schake SA., et al., 1995).

Как уже было отмечено выше, сверхэкспрессия MnSOD в строме хлоропласта обеспечивала защиту от окислительного стресса, вызванного паракватом (Bowler М., et al.^\1991), ацифлуорфеном (Mc.Kersie B.D., et al., 1993). Следовательно, устойчивость к различным агентам, индуцирующим окислительный стресс,

определяется не только увеличенной активностью ферментов SOD, но и типом изоферментов и их внутриклеточной локализацией (Allen R., 1995).

Данное положение было подтверждено работами бельгийских ученых (Van Camp W., et al., 1996). Ими были сконструированы трансгенные растения табака (Л/. tabaccum), которые экспрессировали химерный ген, содержащий нуклеотидную последовательность хлоропластной Fe SOD из A.thallana и нуклеотидную последовательность, кодирующую хлоропластный транзитный пептид малой субъединицы рибулозо-1,5-бифосфаткарбоксилазы/оксигеназы (Rubisco) гороха. Эта генная конструкция была помещена под контроль CaMV промотора. Экспрессия трансгенной Fe SOD способствовала защите как плазмапеммы, так и ФСН при обработке паракватом (Van Camp W., et al., 1996).

Интересно, что сверэкспрессия митохондриальной Mn SOD из Nicotians piumbaginifofia в хлороппастах табака способствовала защите только плазмапеммы, но не ФСН при обработке паракватом (Slooten L., et al., 1995). По-видимому, трансгенная хлороппастная Fe SOD имеет большее сродство к мембране, что делает возможным более эффективное дезактивирование супероксидных радикалов рядом с ФС1 и ФСН, т.е. непосредственно на месте их образования, в то время как Mn SOD, ведущий себя как стромальный фермент способен обеспечивать дезактивирование кислородных радикалов в строме (Van Camp W., et al., 1996). Следовательно, эти различия между Mn SOD и Fe SOD связаны с различиями в локализации этих ферментов.

В работе Van Camp W.c соавт. (1996) показано также, что сверхэкспрессия Fe SOD не способствовала увеличению устойчивости к солям и фотоингибированию, вызванному холодом.

Интересные результаты были получены при изучении влияния озона (Оз) на изменение активности фермента аскорбат пероксидазы (АРХ). Рядом исследователей было показано увеличение активности общей АРХ в ответ на действие Оз на пшенице (Bender J., et al., 1994) и на шпинате (Тапако К., et al., 1985). Ими было предположено, что АРХ это важный компонент в защите растений от Оз при ингибировании фотосинтеза в хлоропластах. Для подтверждения этой гипотезы было сделано две независимых работы Pitcher L.H. с соавт. (1994) и Torsethaugen G. с соавт. (1997).

В работе Pitcher L.H. с соавт. (1994) получены трансгенные растения табака, сверхпродуцирующие цитозольную АРХ. Этими же исследователями были созданы

трансгенные растения табака, в которых экспрессировалась генная конструкция, состоящая из последовательности кДНК, кодирующей 5' транзитный хлоропластный пептид и последовательности кДНК цитозольной АРХ. Повышенная устойчивость к параквату наблюдалась в растениях табака, которые сверхэкспрессировали цитозольную АРХ, а растения, сверхэкспрессирующие хлоропластный химерный ген устойчивости не показал. Torsethaugen G. с соавт. (1997) сконструировали трансгенное растение табака (Nicotiana tabacum), в котором экспрессировалась генная конструкция, содержащая нукпеотидную последовательность цитозольной АРХ из гороха (Pisum sativum), слитую с нуклеотидной последовательностью транзитного хлоропластного пептида SSU. Было показано 10-кратное увеличение экспресии АРХ в хлоропластах растений, несущих химерный ген. Но между трансгенными и нетрансгенными растениями не было различий в ответ на обработку Оз. Авторы предполагают, что эти результаты могут быть связаны либо с тем, что цитозольная АРХ не функционирует в хлоропластах, либо с тем, что цитозольная АРХ в трансгенных растениях находится не в тилакоидных мембранах, а в строме хлоропластов. Кроме того, нельзя исключить и предположения, что увеличенный уровень АРХ не способствует защите от Оз индуцируемого окислительного стресса, т.к. в этой стрессовой ситуации максимально активны другие антиоксидантные ферменты например: глютатионредуктаза, дегидроаскорбатредуктаза, моногидроаскорбатредуктаза.

Для изучения роли фермента глютатионредуктазы (GR) в защите растений от стрессовых факторов в растениях был клонирован ген глютатионредуктазы (GOR) из Ecofi (Allen R., 1995). Активность GR в трансгенных растениях табака, экспрессирующих ген GOR была увеличена в 3 раза по сравнению с контрольными растениями. Было показано, что GR находится в цитозоле. Растения, экспрессирующие высокий уровень бактериальной GR не показали большей устойчивости к Оз, но были немного устойчивее к параквату, S02 и сохраняли определенный уровень восстановленного аскорбата более эффективно, чем контрольные растения (Aono М., et al., 1993; Foyer С.Н., et al., 1991). Таким образом, был сделан вывод о том, что GR участвует в защите растений от стрессовых факторов.

Вторым подходом к изучению функций и регуляции антиоксидантных генов является создание так называемых антисмысловых (антисенс-) конструкций.

Так, были созданы трансгенные растения табака {Nicotiana tabacum), экспрессирующие антисенс-конструкцию, содержащую ДНК (1,8 т.п.н.), кодирующую хлоропластную GR из шпината {Spinacia oferacea) в противоположной ориентации под конролем промотора гена ЗВ томата Rubisco (Рис.5). Полученная конструкция была перенесена в растения с помощью агробактериального вектора. Трансгенные растения табака, обладающие пониженной активностью GR, показывали увеличенную чувствительность к параквату. Эти результаты подтверждают важную роль GR в устойчивости растений к окислительному стрессу (Aono M., et al., 1995).

NPTII Rubisco SS ASQR NOS

Рисунок 5. Конструкция Т-ДНК региона плазмиды pASGRI. RB-правая граница; LB -левая граница; В - BamHI; К - Kpnl; S - Sacl; Е - EcoRI; NPTll - ген неомицинфосфотрансферазы; Rubisco SS - промотор гена ЗВ томата Rubisco; NOS - терминатор нопалинсинтазы; ASGR - к-ДНК хлоропластной GR шпината (в обратной ориентации).

В работе Lagrimini L.M. с соавт. (1997) для изучения функций одной из изоформ классической РХ (анионной РХ) использовалась конструкция антисенса. 5х фрагмент кДНК табачной (N.tabacum) анионной РХ (733 п.н. EcoRI-AccI фрагмент) был помещен между промотором 35S CaMV и терминатором в противополжной ориентации. В полученных трансгенных растениях табака (N.tabacum), активность фермента АРХ была снижена в 1600 раз. Антисенс-растения на начальных этапах развития не отличались от контрольных растений, но на более поздних стадиях были более высокими, имели меньше боковых побегов и зацветали раньше, чем контрольные растения. Эти особенности, по мнению авторов, могут быть вызваны более высоким уровнем ауксина (ИУК), что, в свою очередь может быть связано со снижением уровня ИУК-оксидазной активности в трансгенных растениях, дефицитных по РХ.

Интересно, что изменение уровня РХ в трансгенных растениях изменяло их чувствительность в насекомым-вредителям. Так, в работах на табаке и томате, сверхпродуцирующих табачную анионную РХ, было показано существенное

увеличение устойчивости растений к насекомым (Ьадпгтжн 1..М., е! а!.,1997). Антисенс-РХ трансгенные растения табака были более чувствительными к поражениям, вызванным насекомыми. Большая чувствительность к вредителям может быть связана со снижением лигнификации клеток эпидермиса антисенс-трансгенных растений ({.адптигн им., е1 а!., 1997). Эти результаты подтверждают роль РХ в защите от стрессов.

Таким образом, анализ литературных данных показывает, что исследование трансгенных растений является эффективным подходом для изучения функций и регуляции генов антиоксидантной системы. В то же время, необходимо отметить, что трансгенные растения являются достаточно сложными модельными системами. Это связано с тем, что каждое трансформированное растение является уникальным и отличается от других трансформантов по уровню экспрессии трансгенов, что в свою очередь может быть связано с числом копий трансгенов, местом йх встраивания, а также с процессами инактивации чужеродных генов (ЯеЮтапп РА., 1991; 1997). Кроме того, при работе с трансгенными растениями исследователь имеет возможность изменять уровни экспрессии лишь тех генов, которые уже клонированы. Наиболее удобным подходом для выявления новых генов, отвечающих за развитие адаптивного ответа, является получение и изучение мутантов с изменённой чувствительностью к окислительному стрессу.

4. Использование мутантов для изучения физиологических и генетических механизмов устойчивости растений к окислительному

стрессу.

Выделение и изучение мутантов, чувствительных и устойчивых к окислительному стрессу позволяет выявлять новые гены, участвующие в защите растений от окислительного стресса, а также выяснять, каким образом растения воспринимают и передают стрессовый сигнал, включающий экспрессию генов антиоксидантной защитной системы.

Поскольку окислительный стресс сопровождает любой стресс, в качестве селективной системы для отбора мутантов используются различные факторы.

4.1. Мутанты, чувствительные к озону.

Conclin P.I. с соавт. (1996) была создана селективная система по отбору мутантов чувствительных к Оз. С помощью этой системы был отобран полудоминантный, чувствительный к Оз SOZ1 мутант A.thaliana. При изучении этого мутанта оказалось, что он дефицитен по L-аскорбиновой кислоте (витамину С) и образует только 25-30% аскорбата от нормы. Авторы предположили, что аскорбиновая кислота играет роль в устойчивости A.thaliana от Оз.

Эта гипотеза была подтверждена с помощью исследований мутантов. Оказалось, что гетерозиготные SOZ1/soz1 растения показывают промежуточную чувствительность к Оз и имеют промеж/точное содержание аскорбиновой кислоты (75%) в сравнении с нормальными SOZ1/SOZ1 растениями (100%) и гомозиготными мутантными растениями soz1/soz1 (25% аскорбата). Обнаружено также, что уровень аскорбиновой кислоты уменьшался в онтогенезе. Эти изменения коррелировали с повышением чувствительности растений к 03. Добавление предшественника аскорбиновой кислоты (1_-галактоно-1.4-лактон) способствовало увеличению содержания аскорбиновой кислоты в растениях и, одновременно, увеличению устойчивости к Оз. Таким образом, эти эксперименты показали важную роль аскорбиновой кислоты в защите растений от Оз.

4.2. Мутанты, чувствительные к ультрафиолету (УФ).

В настоящее время выделены 5 мутантов Arabidopsis thaliana с повышенной чувствительностью к УФ (uvh1, wh3, wh4, uvhS, uvh6) (Jenkins M.E., et al.,1995). Мутация uvhl локализована в 5 хромосоме, мутации uvh3 и uvh6 локализованы в 3-ей и 1-ой хромосомах, соответственно. Причины чувствительности к УФ у мутантов различны. Чувствительность к УФ мутантов шг1 (Britt A.B., et al., 1993) и uvhl (Harlow J.R., et al., 1994) не связана с изменением работы антиоксидантных систем, а обусловлена неспособностью к репарации повреждений ДНК, вызванных УФ-облучением.

Чувствительность к УФ мутантов Ш, ttö и uvs оказалась связанной и дефицитом флавоноидов в мутантных растениях (Lois R., et al., 1994). Флавоноиды обезвреживают токсичные радикалы, действуя подобно аскорбату, а-токоферолу, т.е служат донором электронов для утилизации Н2О2 (Yamasaki H., et al., 1997). Раннее

было показано, что флавоноиды также действуют как оптические фильтры (Gould K.S., et al., 1995).

Наиболее подробно исследован чувствительный к УФ-В мутант tt5, имеющий мутацию в гене, кодирующем халкон-изомеразу. Обнаружено, что мутантные растения обладают изменнённым уровнем экспрессии антиоксидантных ферментов в ответ на обработку УФ-В и 03 (Rao M.V., et al., 1996). Уровень общей активности SOD при обработке УФ-В у мутантов tt5 увеличивался на 2-ой день после обработки, в то время как у растений LER увеличение активности SOD наблюдалось лишь на 5-й день обработки. Так же показано, что при обработке растений LER УФ-В в течение 5 дней активность фермента GR не была изменена, тогда как у мутанта ttö увеличена на 36% в сравнении с контрольными растениями. Кроме того, в растениях tt5 мутанта при обработке УФ-В были обнаружены новые изоформы РХ и АРХ (Rao M.V., et al., 1996). Эти данные позволяют предположить, что недостаток флавоноидов способствует включению других защитных систем в ответ на стресс. Этого однако не достаточно для полной защиты мутантных растений (Rao M.V., et а!., 1996).

4.3. Мутанты, чувствительные к кадмию.

Большой интерес представляют Cd-чуствительные мутанты A.thaliana cadi, cad2 с пониженным уровнем содержания фитохелатин-синтазы и глютатиона, соответственно (Howden R., et al., 1995b).

Отбор мутантов был основан на наблюдении за цветом корней проростков, выращиваемых в присутствии Cd. Чувствительные к Cd мутанты в присутствии Cd накапливали в корнях бурый пигмент. Природа этого пигмента не ясна, но существует предположение, что данная окраска связана с накоплением металл-сульфидных комплексов вследствие потери мутантами возможности разлагать Cd.

Мутант cadi оказался дефицитным по фитохелатинсинтазе и, соответственно, по фитохелатину, в образовании которого участвует этот фермент (Howden R., et al.,1992). Фитохелатин нейтрализует тяжелые металлы, вступая с ними в комплекс (Rauser W.E.,1990; Steffens J.C., 1990). Биосинтез фитохелатина из глютатиона осуществляется фитохелатинсинтазой в присутствии тяжелых металлов (Grill Е., et al., 1989).

Растения мутанта cad2 также имели пониженное содержание фитохелатина. Однако этот дефицит оказался связанным не с отсутствием фитохелатинсинтазы (как у cad1), а с пониженным уровнем глютатиона, являющегося субстратом для синтеза фитохелатина (Howden R., et al.,1995a).

Таким образом, cadl, cad2 мутанты неспособны формировать необходимое количество фитохелатина, и, возможно, продукция высокого уровня сульфидов является адаптивным ответом на Cd в растениях (Howden R., et al., 1995b).

4.4. Мутанты с изменённой чувствительностью к фитопатогенам.

Большой интерес представляют мутанты с измененной чувствительностью к фитопатогенам (грибным, вирусным, бактериальным). Эти мутанты важны для изучения генетических механизмов растительного иммунитета - так называемой системной приобретенной устойчивостью (systemic acguired resistance - SAR) (Raskin I., 1995). SAR представляет собой долговременную, всеобщую устойчивость к очень широкому спектру патогенов, и поэтому её изучение имеет большое практическое значение. Показано, что растения отвечают на патогенную атаку экспрессией ряда белков - PR-белков (patogénesis related proteins) (Pahl H.L., et al., 1994). Многие из этих белков являются антиоксидантными ферментами (см. раздел 2.1.).

Важную роль в индукции SAR играет салициловая кислота (СК). Исследования СК-связывающегося рецептора показало, что им является фермент каталаза. Салициловая кислота, соединяясь с каталазой, снижала её ферментативную активность на -80%, в результате чего в клетке повышается уровень перекиси водорода (Pahl H.L., et al.,1994; Bi Y., et ai., 1995; Rao M.V., et.al., 1997). Эти данные убедительно показали важную роль перекиси водорода в развитии SAR.

Для получения и изучения мутантов с изменённым иммунным ответом активно используется A.thaliana. Именно для A.thallana получено в настоящее время наибольшее число мутантов, затрагивающих этот признак. Все полученные мутанты можно разделить на 3 основные группы.

4.4.1. Мутанты, конститутивно экспрессирующие иммунный ответ и реакцию

"гиперчувствительности".

К первой группе относятся мутанты A.thaliana, конститутивно экспрессирующие иммунный ответ. Фенотипически это выражается в появлении на листьях мутантов спонтанных некротических пятен. В растениях дикого типа такие некротические пятна обусловлены гибелью клеток вокруг места вторжения патогена, что ограничивает его дальнейшее передвижение (Т н. реакция гиперчувствительности).

У A.thaliana в разных лабораториях выделено несколько групп таких мутантов:

1. мутанты Ísd1 !sd1, IsdZ Isd3Isd4f isd5, Ísd6, Isd7 (lesions simulating disease) (Dietrich DA, et al.,1994; Dangl J.L., et al., 1996);

2. мутанты acdl, acd 2 (accelerated cell death) (Greenberg J.T., et.al., 1994; Dangl J.L., et al., 1996);

3. мутанты cpr1, cpr5, сргб (constitutine expression of PR genes) (Bowling SA, et al., 1994; 1997).

Помимо того, что все мутанты имели некротические пятна на листьях, они также показывали увеличенный уровень экспресии генов PR, высокую концентрацию салициловой кислоты (СК) и устойчивость к патогенам.

Исследование особенностей мутантов позволило высказать предположение, что мутации затрагивают разные гены, участвующие в передачи сигналов, необходимых для направленной гибели клеток при патогенной атаке. Генетические исследования показали, что среди мутантов этой группы есть и рецессивные (например, Isd1,lsd3, /sí/5) и доминантные мутанты {ísd2, ísd4). Следовательно, эти гены могут принимать участие как в формировании определенных компонентов сигнальных путей, так и осуществлять негативную регуляцию их работы (Dietrich DA., et al., 1994).

Для того, чтобы понять причину гибели клеток и развития некрозов на листьях мутантных растений, а также выяснить роль салициловой кислоты в этом процессе, были проведён ряд интересных исследований. Мутанты Ísd1, IsdZ Isd3, Isd4, i$d6, isd7 были скрещены с трансгенными растениями, имеющими в геноме ген NahG из бактерии Pseudomonas putida (Lawton К., et al., 1995). Продукт гена NahG -салицилатгидролаза, блокирует накопление СК, вызывая превращение СК в катехол (Gaffney Т., et al., 1993; Delaney Т., et al.,1994). Двойные мутанты от скрещивания Isd2, isd4, fsd6, Isd7 с NahG-экспрессирующими растениями не показали экспрессию гена PR1 (одного из генов PR, кодирующих кислые формы PR-1a, PR-1b, PR-1c)

(Ward E.R., et al., 1991). В то же время показано, что мутации IsdZ isd4 вызывают клеточную гибель и появление спонтанных некрозов независимо от содержания СК (некрозы развивались и у двойных мутантов). А у /sett, Isd6 и Isd7 мутантов на фоне гена NahG формирование некрозов было супрессировано (Neunschwander et al., 1995). Таким образом, для гибели клеток в этих мутантах необходима СК (Kauss Y., et al., 1992; Mauch-Mani В., et al., 1996; Ryals J A, et al., 1996).

Результаты, полученные от скрещиваний fsd мутантов с NahG растениями, противоречивы, так как они указывают на то, что формирование некрозов может происходить как до накопления СК, так и после накопления СК. Эти противоречия можно объяснить, если предположить, что не сама СК, а продуцируемая при её взаимодействии с каталазой перекись водорода играет основную роль в развитии реакции гиперчувствительности (Rao M.V., et al., 1997; Chamnoogpol S., et al., 1996; Neunschwander U., 1995; Leon J., et al., 1995). Таким образом, процесс индукции и развития иммунного ответа тесно связан с процессами, протекающими в растениях в ответ на воздействие окислительного стресса.

4.4.2. Мутанты с конститутивным иммунным ответом, но без некротичесских

пятен.

К этой группе относятся мутанты cim (cimZ cim3) A.thaliana (constitutive immunity) (Lawton К., et al., 1993; Ryals J.A., et al., 1996). Мутанты имеют увеличенный уровень салициловой кислоты (СК), конститутивную экспрессию генов PR, характеризуются устойчивостью к патогенной вирулентной бактерии P.syringae DC3000 и патогенному грибу P.parasiticae. В то же время, в отличие от мутантов первой группы у мутантов cim отсутствуют некрозы. Исследования мутантов cim показали, что накопление СК, устойчивость к P.parasiticae, экспрессия PR-генов ингибируются в cim3 мутанте экспрессией гена NahG (Lawton К., et al., 1993).

4.4.3. Мутанты, не имеющие иммунного ответа.

Наряду с мутантами, имеющими повышенную устойчивость к патогенам, были получены мутанты А.{{та1|'апа, не имеющие иммунитета и характеризующиеся повышенной чувствительностью к патогенам ^уа1э ЗА., е1 а1., 1997):

1. аплельные мутанты по гену eds (enhanced disease susceptibility);

2. аллельные мутанты по гену nim {nonincfucibíe immunity) (Hammond-Kosack K.E., et al., 1996; Delaney Т., etal., 1995).

3. мутант nprl (nonexpressen of PR) (Cao H., et al., 1994);

Рецессивные мутанты nim и nprl очень похожи друг на друга. Они не отвечают на экзогенную обработку СК или SAR-активаторами, такими как INA (2,6-дихлоро-исоникотиновая кислота) (Metraux J.Р., et al., 1991; Vernoolf В., et al., 1995) или бензо(1,2,3) тидиазол-7-карботиоиковая кислота S-метил (BTN) индукцией PR-белков (Friedrich L., et al., 1996, Gorlach J., et al., 1996, Lawton K., et al.,1996). В то же время, они имеют некоторое количество СК в клетках. Поскольку комплементационных тестов между мутантами nprl и nim не проводилось, нельзя исключить, что мутанты аллельны.

Фенотипы мутантов nim и nprl позволили предположить, что эти мутанты имеют блок в сигнальном пути имунного ответа. Мутанты способны накапливать СК в ответ на патогенную атаку, но являются нечувствительными к СК или имеют нарушение в последующих СК-зависимых процессах (Ryals J А, 1996).

4.S. Мутанты, толерантные к гербицидам.

Наиболее удобной системой отбора мутантов, с изменённой чувствительностью к ОС, является использование гербицидов. Получение мутантов устойчивых и чувствительных к гербицидам имеет важное промышленное значение, так как многие гербициды используются в сельском хозяйстве.

Так в 1993 году была опубликована работа о получении мутантного растения табака, толерантного к гербициду паракват (ПК) (Вагпа В., et al., 1993). Этот мутант РТ {paraguat-toferanf) показал перекрёстную устойчивость к различным стрессовым факторам (холод, засуха, сульфодиоксид, озон, НдСЬ, инфекции: Botrytiscinerea и Altérnala, вирус табачной мозаики (TMV)) в сравнении с мутантом PS (paraguat sensitive). Оказалось, что растения РТ показывали повышенную (40-50%) активность антиоксидантных ферментов (SOD, GST, АРХ, GR). Также было замечено, что растения РТ немного отстают в развитии от растений PS, дольше задерживаясь на ювенильной стадии. Авторы заметили корреляцию активности SOD и степенью развития растений, что позволило сделать вывод о том, что молодые растения имеют повышенную активность SOD, что способствует повышению толерантности к

окислительному стрессу. Также растения РТ характеризовались отсутствием некрозов, что указывает на то, что в растениях РТ ингибируется процесс возникновения некрозов, следовательно, уменьшен эффект действия активных свободных радикалов. Обобщая полученные данные, авторы заключили, что отставание в развитии играет большую роль в устойчивости табака РТ к ПК, патогенам и другим факторам вызывающим окислительный стресс. Селекция in vitro и применение методов генной инженерии с использованием мутантов, характеризующихся отставанием в развитии могут быть использованы для создания сортов, устойчивых к широкому спектру агентов, вызывающих окислительный стресс.

О получении мутантных растений с изменённой чувствительностью к гербициду ацифлуорфен на настоящее время сведений в литературе не имеется. Как было сказано выше, ацифлуорфен является ингибитором биосинтеза хлорофилла, ингибируя фермент протопорфириногеноксидазу (РРОХ). В результате чего происходит накопление порфиринов - активного источника кислородных радикалов. Механизм действия ацифлуорфена рассмотрен в главе 1.1.5. В 1998 году удалось получить, устойчивые к действию ацифлуорфена фотомиксотрофные мутантные клетки табака (N.tabacum) штамма YSI-1S (Ichinose К., et al., 1995). Дальнейшие исследования данных мутантных клеток проводили Watanabe N. с соавт. (1998). Оказалось, что устойчивость мутантных клеток YS1-1S обуславливается тем, что накопившийся в результате ингибирования фермента РРОХ протопорфириноген IX утилизируется митоходриальной протопорфириногеноксидазой. Сравнительный анализ клеток дикого типа и YSI-1S показал сходство аминокислотного состава пластидной и митохондриальной РРОХ. Уровни мРНК пластидной РРОХ мутантных клеток YSI-1S и клеток дикого типа были одинаковы, в то время как уровень мРНК митохондриальной РРОХ был в 10 раз выше, чем у клеток дикого типа. Таким образом, авторами был сделан вывод, что устойчивость мутантных клеток штамма YSI-1S обуславливается повышением содержания (сверхпродукцией) митохондриальной РРОХ.

Мутации устойчивости к норфлуразону у растений в настоящее время не известны, несмотря на попытки их получения у A.thaliana (Pecker I., et al., 1992). Мутации устойчивости к норфлуразону и другим пиридазиноновым гербицидам выделены у цианобактерий и связаны с заменой отдельных нукпеотидов в генах, продуцирующих ферменты, являющиеся мишенями действия гебицидов. Так в 1990 году Linden Н. с соавт. (1990) у цианобактерии Synechococcus РСС 7942 были

получены мутанты (NFZ-4, NFZ-13-1, NFZ-18, NFZ-49), устойчивые к гербициду норфлуразон (НФ). НФ, как описано в главе 1.1.2.1, блокирует биосинтез каротиноидов, ингибируя фермент фитоиндесатуразу (PDS), который является ключевым ферментом биосинтеза каротиноидов, превращая фитоин в каротин (Sandmann G., et al., 1989). Немного позже был клонирован ген pds и определена его последовательность (Chamovitz D., et al., 1991). Биохимические исследования показали, что мутанты в ~2-7 раза более устойчивы к НФ по сравнении с диким типом. Интересно, что NFZ-4 показал перекрёстную устойчивость к другому ингибитору PDS - флуорохлоридону, но меньшую, чем к НФ. Химическая структура этого гербицида имеет большое сходство со структурой НФ. В то жв время, NFZ-4 не показывает устойчивости к другим ингибиторам PDS. В отличие от мутанта NFZ-4, мутант NFZ-49 не показывал устойчивости к флуорохлоридону. В более поздних исследованиях авторы показали, что у линии NFZ-4 имеется точечная мутация в кодоне 403 гена pds, приводящая к замене в этом положении аминокислоты валина на глицин. В мутанте NFZ-49 таю«© была выявлена точковая мутация, приводящая к аминокислотной замене (Camovitz D., et al., 1991). Авторами было предложено следующее объяснение механизма устойчивости к НФ у полученных мутантов. Аминокислотные замены у мутантов произошли в сайте связывания PDS с НФ, что приводит к аллостерическим изменениям белка, в результате которых снижается эффективность взаимодействия НФ с PDS. Различные ингибиторы PDS взаимодействуют с ферментом в сходных, но не идентичных районах полипептида. У мутанта NFZ-4 в результате мутации, по-видимому, заменена аминокислота, которая одновременно вовлечена в связывание с НФ и флуорохлоридоном. А мутант NFZ-49 содержит аминокислоту, которая является рецептором только для норфлуразона.

Также, известны мутанты устойчивые к другим типам гербицидов. Так был получен мутант A.thaliana csr1-2f устойчивый к гербициду триазолпиримидин (Mourad G., et al., 1992), который показал перекрёстную устойчивость к гербициду сульфурон. Ранее у A.thaliana были получены мутант устойчивый к сульфурону csrt (Haughn G.W., et al., 1986) и мутант устойчивый к имазапиру csrl-1 (Haughn G.W., et al., 1990). Учёные провели исследования, в которых данные мутанты сравнивались с растениями дикого типа по устойчивости к гербицидам; сульфунирон, триазолпиримидин, имазапир, пиримидин-окси-бензоат. Известно, что данные гербициды ингибируют фермент ацетолактатсинтазу (ALS) (Chaleff R.S., et al., 1984;

Saxena P.K., et а!., 1988; Schioss J.V., et а!., 1988; Subramanian M.V., et al.,1990), катализирующий первый этап биосинтеза аминокислот лейцина, валина, изолейцина (Miflin B.J., et al.,1972; Umbager Н.Е., et al., 1983). В ходе исследований оказалось, что мутант csrJ-2 устойчивый к триазолпиримидину, устойчив к сульфунирону, но не показывает устойчивость к пиримидин-окси-бензоату и имазапиру. Мутант csr1 устойчивый к сульфунирону показывает устойчивость к триазолпиримидину, но не устойчив к пиримидин-окси-бензоату и имазапиру. Мутант с$г1-1 устойчивый к имазапиру показывает устойчивость к пиримидин-окси-бензоату. Исследователи сделали вывод о том, что два разных гербицида (триазолпиримидин и сульфунирон, или пиримидин-окси-бензоат и имазапир) могут иметь схожий или частично схожий участок связывания в белке, с которым они взаимодействуют. Ранее такое же предположение было выдвинуто Sathasivan с соавторами, при изучении имидазолин-устойчивых растений A.thaliana (Sathasivan К., et al., 1991).

Более ранними работами было показано, что устойчивость мутанта сsr1 возникла в результате единичной замены цитозина на тимин в нукпеотиде 870, что приводит к замене пролина на серин по аминокислоте 197 в белке ALS (Haughn G.SN., et al., 1988). Таким образом, единичная замена в гене ALS мутанта сsrl приводит к неспособности триазолпиримидина и сульфунирона связываться с белком ALS, но в то же время не влияет на связывание с имазопиром и пиримидин-окси-бензоатом. Так же показано, что устойчивость мутанта csr1-1 обуславливается заменой гуанина на аденин в гене ALS в нукпеотиде 2239 (Mazur B.J., et а!.,1987), что приводит к замене серина на аспарагин по аминокислоте 653 в белке ALS (Sathasivan К., et al., 1990,1991). Следовательно, единичная замена в гене ALS мутанта csr1-1 способствует неспособности имидазолина и пиримидин-окси-бензоата связываться с ALS, но не влияет на связывание с сульфунороном и триазолпиримидином.

Другими исследователями были получены имазаквин-устойчивые клеточные линии пшеницы методом клеточной селекции in vitro (Anderson P.C., et al., 1989). Амазаквин относится к группе имидазолиноновых гербицидов. Взрослые растения были получены из 5 линий, из которых только 4 растения показали устойчивость к гербициду амазаквин. Одно растение из 4-х показало перекрёстную устойчивость к гербициду другого класса сульфунирон/, тогда как другие 3 линии такой устойчивости не показали. При отсутствии гербицида каллусные ткани линии ХА17 показывали такой же фенотип как и у контрольных каллусных тканей. При обработке

рост контрольных каллусов был подавлен на 50% при концентрациях от 1х10'6 до ЗхЮ"8 М, в то время как 50% ингибирование каллусов ХА17 произошла при концентрациях гербицида, который в 30-600 раз выше. Линия показала перекрёстную устойчивость и к другим имидазолиноновым гербицидам, к таким как имазапир, имазетапир. Уровень устойчивости был увеличен в 300 раз. В ходе экспериментов было установленно, что устойчивость была достигнута благодаря уменьшению чувствительности к гербицидам фермента ацетолактат синтазы (ALS).

Мутанты, показывающие устойчивость к сульфурону были получены и в других видах растений, например, A.thaliana (Haughn G.W., et al.,1988). Ген A.thaliana, кодирующий сульфурон-устойчивый ALS был введён в табак, в результате чего были получены растения табака толерантные к гербициду. (Haughn G.W., et al.,1988).

Таким образом, при селекции на устойчивость к различным стрессовым факторам могут быть получены мутанты, имеющие разные механизмы устойчивости. Наряду с мутантами, обладающими специфическими механизмами устойчивости к данному стрессовому агенту, могут быть отобраны мутанты с неспецифической устойчивостью, связанной с изменением регуляции антиоксидантного адаптивного ответа. Очевидно, причина этого заключается в том, что действие большинства стрессовых факторов на растения сопровождается возникновением активных радикалов кислорода и перекисей. Поскольку работа всех антиоксидантных защитных систем сбалансирована, неспецифическая устойчивость не может быть высокой (в отличие, например, от устойчивости, связанной с изменением белка-мишени). Об этом убедительно свидетельствуют данные по изучению степени устойчивости к стрессам у трансгенных растений с разным уровнем экспрессии генов SOD (Pitcher L.H., 1991). В то же время, изменение в генах регулирующих образование и работу антиоксидантных систем будет приводить к перекрёстной устойчивости к стрессовым факторам разной природы, что несомненно, имеет большое практическое значение.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Маманова, Лира Бакиевна

ВЫВОДЫ:

1. Разработаны селективные системы для отбора мутантов A.thaliana с изменённой чувствительностью к ОС.

2. Впервые выделены мутанты A.thaliana, толерантные к ацифлуорфену, норфлуразону и чувствительные к плюмбагину, ацифлуорфену. Установлено, что среди мутантов с изменённой чувствительностью к НФ, АЦ, ПЛ преобладают мутанты разных фенотипических групп.

3. В большинстве исследованных линиях фенотипические изменения наследуются как рецессивные моногенные мутации. Для двух мутаций NANA и ас5 показан доминантный тип наследования.

4. Мутации устойчивости к НФ Ie2, nfz24, NANA локализованы на генетической карте A.thaliana в 1-й и 2-й хромосомах.

5. Установлено, что большинство мутантов, толерантных к НФ показывают устойчивость к ПК. Мутанты pbg2 и pbg8, чувствительные к плюмбагину показывают чувствительность и к ПК. Эти данные свидетельствуют о изменении активности антиоксидантных систем у отобранных мутантов.

6. Выявлены количественные и качественные изменения изоформ РХ и SOD у мутантов в сравнении с растениями дикого типа в нормальных условиях и при воздействии гербицидов. Показано, что изменения спектра РХ у мутанта /е2 наследуются кодоминантно и совместно с признаком карликовости.

Автор выражает огромную благодарность научному руководителю данной диссертационной работы - к.б.н, доценту Т.А.Ежовой; особую признательность -старшему научному сотруднику кафедры генетики МГУ, к.б.н О.П.Солдатовой за руководство методической частью диссертации. Кроме того автор глубоко признателен за неоценимую практическую помощь, ценные советы и важные замечания заведующему кафедрой генетики и селекции МГУ профессору С.В.Шестакову, профессору С.А.Гостимскому, к.б.н. ТАКокшаровой и всему коллективу кафедры генетики и селекции МГУ; сотруднику кафедры биофизики МГУ д.б.н. Д.Н.Маторину; сотрудникам Института общей генетики им Н.И.Вавилова профессору В АПухальскому, профессору И.А.Захарову, к.б.н. ААПоморцеву; сотрудникам Института биохимии им. Баха к.б.н. А.В.Софьину, к.б.н. Н.Л.Радюкиной, к.б.н. Н.Н.Кудрявцевой; сотруднику НИИ картофельного хозяйства к.б.н. С.М.Мусину, а также студентам кафедры генетики и селекции МГУ А.Пенину, КАлексееву, И.Полянской.

Список публикаций по теме диссертации.

1. Ежова ТА, Ондар У.Н., Солдатова О.П., Маманова Л.Б. Генетическое и физиологическое изучение карликовых мутантов Arabidopsis thaiiana (L) Heynh // Онтогенез. 1997. T. 28. № 5. С. 344-351.

2. Ежова Т.А., Солдатова О.П., Ондар У.Н., Маманова Л.Б., Радюкина Н.Л., Софьин A.B., Романов В.И., Шестаков C.B. Толерантные к норфлуразону карликовые мутанты Arabidopsis thaiiana (L.) Heynh. как объекты изучения резистентности к окислительному стрессу // Физиология растений. 1997. Т.44. №5. С. 665- 670.

3. Ежова ТА, Солдатова О.П., Мусин С.М., Маманова Л.Б., Радюкина Н.Л., Пенин АА. Изоферментный состав пероксидаз у мутантов Arabidopsis thaiiana (L.) Heynh. с изменённым фитогормональным статусом // Тезисы на V Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений", июнь 1999. Москва. МСХА им. Тимирязева.

4. Маманова Л.Б., Ежова ТА., Солдатова О.П., Маторин Д.Н. Влияние синтетических хиноновых соединений на развитие проростков Arabidopsis thaiiana (L) Heynh // Тезисы на 111 ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений и биотехнологии". 1997. Москва.

5. Ежова ТА., Солдатова О.П., Маманова Л.Б., Полянская И.Ю. Генетическая трансформация агробактерии in planta как альтернатива метода трансформации in vitro // Тезисы на VI! Международной конференции по биологии клеток растений in vitro, биотехнологии и сохранения генофонда. 1997. Москва.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

На основании изучения влияния 10 агентов, вызывающих ОС, на проростки А.йтайапа были разработаны селективные системы для отбора мутантов, с изменённой чувствительностью к норфлуразону (НФ), ацифлуорфену и плюмбагину. Их использование позволило отобрать мутанты, толерантные к НФ, мутанты толерантные и чувствительные к ацифлуорфену, а также мутанты, чувствительные к плюмбагину. Интересно, что мутанты, отобранные на разных селективных средах, имели разный спектр фенотипических особенностей (Табл.24). Так, среди ацифлуорфеновых мутантов преобладали мутанты, имеющие изменение окраски листьев (8 мутантов), среди плюмбагиновых мутантов - с изменением морфологии корня (4 мутанта), среди НФ-ых - карликовые мутанты (3 мутанта) и мутанты с некротическими пятнами на листьях (3 мутанта).

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Маманова, Лира Бакиевна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Алтухов Ю.П. Генетические процессы в популяциях. М.: Наука, 1983.

2. Гольдфельд М.Г., Карапетян Н.В. Физико-химические основы действия гербицидов // Итоги науки и техники. Сер. биол. химия. М.: ВИНИТИ, 1989. Т. 30. 162.С.

3. Ежова Т.А., Ондар У.Н., Солдатова О.П., Маманова Л.Б. Генетическое и физиологическое изучение карликовых мутантов Arabidopsis thaüana (L) Heynh // Онтогенез. 1997а. Т. 28. № 5. С. 344-351.

4. Ежова ТА, Солдатова О.П., Ондар У.Н., Маманова Л.Б., Радюкина Н.Л., Софьин A.B., Романов В.И., Шестаков C.B. Толерантные к норфлуразону карликовые мутанты Arabidopsis thaüana (L.) Heynh. как объекты изучения резистентности к окислительному стрессу // Физиология растений. 19976. Т.44. №5. С. 665- 670.

5. Ежова ТА., Солдатова О.П., Мусин С.М., Маманова Л.Б., Радюкина Н.Л.,Пенин A.A. Изоферментный состав пероксидаз у мутантов Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. с изменённым фитогормональным статусом if Тезисы на V Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений", июнь 1999. Москва. МСХА им. Тимирязева.

6. Иванов В.Б., Быстрова Е.И., Дубровский И.Г. Проростки огурца как тест объект для обнаружения эффективных цитостатиков // Физиология растений. 1986. Т. 33. вып.1.

7. Квитко К.В. Асептическая культура Arabidopsis thaüana и перспектива её использования в ботанических исследованиях // Вестн. ЛГУ. Сер. биология. 1960. Т. 15. № 3. С. 47-56.

8. Коф Э.М. Рост растений и иактвность фитогормонов в связи с действием мутантных генов: Автореферат дис.докт.биол.наук. Киев: Ин-т физиологии растений и генетики АН УССР. 1991. 39 С.

9. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учебное пособие для биологических специальностей вузов. М.: Изд-во "Высшая школа". 1990. 352 С.

10. Маторин Д.Н., Венедиктов П.С., Рубин А.Б. Замедленная флуоресценция и её использование для оценки состояния растительного организма // Известия АН СССР. Сер. биол. 1985. № 4.

11. Мусина РА. Исследование белковых маркёров и паспортизация генофонда Soianum tuberosum L in vivo и in vitro: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1992.

12. Ондар У.Н. Изучение гормональных мутантов Arabidopsis thafiana (L) Heynh: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 1996.

13. Писарев Б.А., Трофимец Л.Н., Анисимов Б.В., Мусин С.М. Методы оценки оздоровленных сортов и меристемных линий в элитном семеноводстве картофеля. М.: НИИ картофельного хозяйства, 1991.

14. Плохинский Н.А. Биометрия. М.: Изд-во МГУ, 1970. 367 С.

15. Серебровский А.С. Генетический анализ. М.: Наука, 1970. 342 С.

16. Смирнов В.Г., Соснихина С.П. Генетика ржи. Л.: Изд-во ЛГУ, 1984. 264 С.

17. Солдатова О.П., Ежова Т.А., Ондар У.Н., Гостимский С.А., Конрад У., Арцаенко О. Мутанты Arabidopsis thaiiana (L.) Heynh., толерантные к ингибитору биосинтеза каротиноидов норфлуразону // Генетика. 1996. Т. 32. № 7. С. 956961.

18. Федтке К. Биохимия и физиология действия гербицидов. М.: Агропромиздат, 1985. 224. С.

19. Янушкевич С.И. Использование арабидопсис в практических занятиях по общей генетике. М.: Изд-во МГУ, 1985. 62. С.

20. Acevedo A., Scandatios J.G. Catalase and superoxide dismutase gene expression and distribution during stem development in maize // Devel. Genet. 1991. V. 12. P. 423-430.

21. Allen R.D. Dissection of oxidative stress tolerance using transgenic plants // Plant Physiol. 1995a. V. 107. P. 1049-1054.

22. Allen R.D. Overexpression of chloroplastic Cu/Zn superoxide dismutase in plants // Methods Mol. Biol. 1995b. V. 44. P. 309-323.

23. Allen R.D., Webb R.P., Schake SA Use of transgenic plants to study antioxidant defenses // Free Radic. Biol. Med. 1997. V. 23. P. 473-479.

24. Alscher R.G., Hess J.L. Antioxidants in Higher Plants. CRC Press, Boca Raton, FL. 1993.

25. Anderson P.C., Georgeson M. Herbicide-tolerant mutants of corn // Genome. 1989. V. 31. P. 994-999.

26. Aono M., Kubo A., Saji H., Natori Т., Tanaka K., Kondo N. Resistance to active oxygen toxicity of transgenic Nicotiana tabacurn that expresses the gene for

glutathione reductase from Escherichia ColiU Plant Cell Physiol. 1991. V. 32. P. 691697.

27. Aono M., Kubo A., Saji H., Tanaka K., Kondo N. Enhanced tolerance to photooxidative stress of transgenic Nicotiana tabacum with high chloroplastic glutathione reductase activity// Plant Cell Physiol. 1993. V. 34. P. 129-135.

28. Aono M., Saji H., Fujiyama K., Sugita M., Kondo N., Tanaka K. Decrease in activity of glutathione reductase enhances paraquat sensitivity in transgenic Nicotiana tabacum //Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 645-648.

29. Asada K. Production and action of active oxygen species in photosynthetic tissues // In: Causes of Photooxidative Stress and Amelioration of Defence Systems in Plants. Eds.: Foyer C.H., Mullineaux P.M. CRC Press, Boca Raton, FL. 1994. P. 77 - 104.

30. Asada K., Takashi M. Production and scavending of active oxigen in photosynthesis // In: Photoinhibition. Eds.: Kurkle D.J., Osmond C.B., Arrtzen C.J. Amsterdam. 1987. P. 227-287.

31. Barna B., Adam L., Kiraly 2. Juvenility of a superoxide-tolerant plant to diseases and other stresses // Naturwissenschaften. 1993. V. 80. P. 420-422.

32. Bart J .B., Feys E.B., Penfold C .N., Turner J.G. Arabidopsis mutant selected for resist to the phutoxin coronative are male sterile, insensitive to metil jasmonate // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 751-779.

33. Bartley C.E., Scolnik PA. Plant carotenoids: pigments for photoprotection, visual attraction, and human health // Plant Cell. 1995. V. 7. P. 1027-1038.

34. Bartosz G. Oxidative stress in plants /7 Acta Physiologiae Plantarum. 1997. V. 19. P. 47-64.

35. Baum J., Scandalios J.G. Developmental expression and intracellular localisation of superoxide dismutase in maize // Differentiation (Berlin). 1979. V. 13. P. 133-140.

36. Baum J., Scandalios J.G. Isolation and characterisation of cytosolic and mitochondrial superoxide dismutase of maize//Arch. Biochem. Biophys. 1981. V. 206. P. 249-264.

37. Baum J., Scandalios J.G. Multiple genes controlling superoxide dismutase expression in maize //J. Heredity. 1982. V. 73. P. 95-100.

38. Becerril J.M., Duke S.O. Protoporphyrin IX content correlates with activity of photobleaching herbicides//Plant Physiol. 1989.V. 90. P. 1175-1181.

39. Beyer W.F., and Fridovich I. Assaying for superoxide dismutase activity: some large consequences of minor changes in conditions // Anal. Biochem. 1987. V. 161. P. 559566.

40. Bender J., Weigel H.J., Wegner U., Jager H.J. Response of cellular antioxidants to ozone in wheat flag leaves at different stages of plant development // Environ. Pollut. 1994. V. 84. P. 15-21.

41. Bi Y.-M., Kenton P., Mur L.,Darby R., Draper J. Hydrogen peroxide does not function downstream of salicylic acid in the induction of PR protein expression // Plant J. 1995. V. 8.P. 235-245.

42. Bowler C., Slooten L., Vandenbranden S., De Rycke R., Botterman J., Sybesma C., Van Montagu M., Inze D. Manganese superoxide dismutase can reduce celluiar damage mediated by oxigen radicals in transgenic plants // EMBO J. 1991. V. 10. P. 1723-1732.

43. Bowler M., Van Montagu M., inze D. Superoxide dismutase and stress tolerance // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1992. V. 43. P. 83-116.

44. Bowling S.A., Clarke J.D., Liu Y., Klessig D.F., Dong X. The cpr5 mutant of Arabidopsis expresses both NPR1-dependent and NPR1-independent resistance // Plant Cell.1997. V. 9. P. 1573-1584.

45. Bowling S.A., Guo A., Cao H., Gordon A.S., Klessig D.F., Dong X. A mutation in Arabidopsis that leads to constitutive expression of systemic acquired resistance // Plant Ceil. 1994. V. 6. P. 1845-1857.

46. Britt A.B., Chen J.J., Wycoff D.I. A UV-sensitive mutant of Arabidopsis thaiiana defective in repaire of pyrimidine (6-4) pyrimidinone dimers // Science. 1993. V. 261. P. 1571-1574.

47. Broadbent P., Creissen G.P., Kular B., Wellburn A.R., Mullineaux P.M. Oxidative stress responses in transgenic tobacco containing altered levels of glutathione reductase activity// Plant J. 1995. V. 8. P. 247-255.

48. Camadro J., Martinger M.5 Scalla R., Labbe P. Kinetic studies on protoporphyrinogen oxidase inhibition by diphenyi ether herbicides // Biochem. J. 1991. V. 277. P. 17-21.

49. Cao H., Bowling S.A., Gordon A.S., Dong X. Characterization of an Arabidopsis mutant that is nonresponsive to inducers of systemic acquired resistance // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 1583-1592.

50. Casano L.M., Martin M., Sabater B. 1994. Sensitivity to superoxide dismutase transcript levels and activities to oxidative stress is lower in mature-senescent than in young barley leaves // Plant Physiol. V. 106. P. 1033-1039.

51. Chaleff R.S., Mauvais C.J. Acetolactate synthase is the site of action of two sulfonylurea herbicides in higher plants // Science. 1984. V. 244. P. 1443-1445.

52. Chaleff R.S., Ray T.B. Herbicide-resistant mutants from tobacco cell cultures /./ Science. 1984. V. 223. P. 1148-1151.

53. Chaloupkova K., Smart C.C. The abscisic acid induction of a novel peroxidase is antagonized by cytokinin in Spirodela polyrrhiza L. /7 Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 497-507.

54. Chamnongpo! S., Wiilekens H., Langebartels C., Van Montagu M., Inze D., Van Camp W. Transgenic tobacco with a reduced catalase activity develops necrotic lesions and induces pathogenesis-related expression under high light // Plant J. 1996. V. 10. P. 491-503.

55. Chamovitz D., Pecker I., Sandmann G., Boger P., Hirschberg J. Cloning a gene coding for norphlurason resistance in Cyanobacteria // Z. Naturforsch. 1990. V. 45. P. 482-486.

56. Chamovitz D., Pecker I, Hirschberg J. The molecular basis of resistance to the herbicide norflurazon // Plant Mol. Biol. 1991. V. 16. P. 967-974.

57. Cohen Z., Heimer Y.M. A6 desaturase inhibition. A novel mode of action of norflurazon // Plant Physiol. 1990. V. 93. P. 347-349.

58. Chance B., MaehlyA.C. Assay of catalases and peroxidases // Methods in Enzymology. New Yor. Acad.Press.19f5. V. 2. P. 764-775.

59. Conklin P.L., Williams E.H., Last R.L. Environmental stress sensitivity of an ascorbic acid-deficient Arabidopsls mutant //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. V. 93. P. 99709974.

60. Dangl J.L., Dietrich RA, Richberg M.H. Death dont have no mercy: cell death programs in plant-microbe interactions // Plant Cell. 1996. V. 8. P.1793-1807.

61. Davis B.J. Disk electrophoresis to human serum protein // Ann. N.-Y. Acad. Sci. 1964. V. 121. P. 404-427.

62. Delaney T., Friedrich L., Ryals J. Arabidopsls signal transduction mutant defective in chemically and biologically induced disease resistance // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 6602-6606.

63. Delaney T., Uknes S., Vernooij B., Friedrich L., Weymann K., Negrotto D., Gaffney T., Gut-Rella M., Kessmann H., Ward E., Ryals J. A central role of salicylic acid in plant disease resistance // Science. 1994. V. 266. P. 1247-1250.

64. Dietrich R.A., Delaney T.P., Uknes S.J., Ward E.R., Ryals JA, Dangl J.L. Arabidopsis mutants simulating disease resistance response // Ceil. 1994. V. 77. P. 565-577.

65. Dixon RA., Paiva N. Stress-induced phenylpropanoid metabolism // Plant Cell. 1995. V. 7.P. 1085-1097.

66. Donahue J.L., Okpodu C.M., Cramer C.L., Grabau E.A., Alscher R.G. Responses of antioxidants to paraquat in pea leaves // Plant Physiol. 1997. V. 113. P. 249-257.

67. Droog F.N., Hooykaas P.J., Libbenga K.R., van der Zaal E.J. Proteins encoded by an auxin-regulated gene family of tobacco share limited but significant homology with glutathione S-transferases and one member indeed shows in vitro GST activity // Plant. Mol. Biol. 1993. V. 21. P.965-972.

68. Duke S.O., Becerril J.M., Sherman T.D., Lehnen L.P., Matsumoto H. Protoporphyrinogen oxidase-inhibiting herbicides // Weed Sei. 1991. V. 39. P. 465473.

69. Edreva A., Salcheva G., Georgeieva D. Stress damage is related to peroxidase induction in wheat plants If In: Plant peroxidase: biochemistry and physiology, 3 intern, symp. 1993. P. 401-404.

70. Falbel T.G., Staehelin L.A. Characterisation of a family of chlorophyll-deficient wheat (Triticum) and barley (Hordeum vulgare) mutants with defects in the magnesium-insertion step of chlorophyll biosynthesis // Plant Physiol. 1994. V.104. P. 639-648.

71. Farr S.B., Natvig D.O., Kogoma T. Toxicity and mutagenicity of plumbagin and the induction of a possible new DNA repair pathway in Escherichia coli ff J. Bacterid. 1985. V. 164. P. 1309-1316.

72. Feldmann K.A. T-DNA insertion mutagenesis in Arabidopsis: mutational spectrum if Plant J. 1991. V. 1. P. 71-82.

73. Feldmann KA, Marks M.D. Agrobacterium-mediated transformation of germinating seeds of Arabidopsis thaüana plants // Mol. Gen. Genet. 1987. V. 208. P. 1-9.

74. Finkelstein R.R., Zeevart JA. Gibberelin and abscisic acid biosynthesis and response //Arabidopsis / Eds Meyerowits E.M., Somerville C.R. N.Y.: Cold Spring Harbor Lab. Press. 1994. P. 523-553.

75. Foyer C.H., Lelandais M., Galap C., Kunert K.J. Effects of elevated cytosolic glutathione pool and photosynthesis in leaves under normal and stress conditions // Plant Physiol. 1991. V. 97. P. 863-872.

76. Foyer C.H., Descourvieres P., Kunert K.J. Protection against oxygen radicals: an important defence mechanism studied in transgenic plants if Plant Cell. Environ. 1994. P. 507-523.

77. Fräser P.D., Linden H., Sandmann.G. Purification and reactivation of recombinant Synechococcus phytoene desaturase from an overexpressing strain of Escherichia coli ff Biochem J.1993. V.1. № 291 ( Pt 3). P. 687-92.

78. Friedrich L., Lawton K., Dincher S., Winter A., Staub T., Uknes S., Kessmann H., Ryals J. Benzothiadiazoie induces systemic acquired resistance in tobacco // Plant J. 1996. V. 10. P. 61-70.

79. Gaffney T., Friedrich L., Vernooij B., Negrotto D., Nye G., Uknes S., Ward E., Kessmann H., Ryals J. Requirement of salicylic acid for the induction of systemic acquired resistance // Science. 1993. V. 261. P. 764-756.

80. Gazaryan LG., Ashby GA, Thorneiey R.N.F., Lagrimini L.M. Unusual kinetic properties of anionic tobacco peroxidase related to the mechanism of oxidation of indole-3-acetic acid //Appl. Biochem. Biotechnol. 1997. V. 61. P. 1-12.

81. Gazaryan I.G., Lagrimini L.M. Tobacco anionic peroxidase overexpressed in transgenic plants: aerobic oxidation of indole-3-acetic acid // Phytochemistry. 1996. V. 42. P. 1271-1278.

82. Gorlach J., Volrath S., Knauf-Beiter G., Hengy G., Beckhove U., Kogel U., Oosterndorp M., Staub T ., Ward E., Kessman H., Ryals J. Benzothiadiazoie, a novel class of inducers of systen\matic acguired resistance, activates gene expression and disease resistance in wheat // Plant Ceil.1996. V. 8. P. 629-643.

83. Gould K.S., Kuhn D.N., Lee D.W., Oberbauer S.T. Why leaves are sometimes red if Nature. 1995. V. 378. P. 241-242.

84. Gordon J., Dougall M. Covalently bound peroxidase and lignification // Plant peroxidase: biochemistry and physiology, 3 international symposium. 1993. P.277-282.

85. Greenberg J.T., Guo A., Klessig D.F., Ausubel F.M. Programmed cell death in plants - A pathogen-triggered response activated coordinate^ with multiple defense functions//Cell. 1994. V. 77. P. 551-563.

86. Grill E., Loffler S., Winnacker E-L., Zenk M.H. Phytochelatins, the heavy-metal-binding peptides of plants, are synthesized from glutathione by a specific -glutamyicysteine dipeptidyl transpeptidase (phytochelatin synthase) // Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 1989. V. 86. P. 6838-6842.

87. Grisebach H. Lignins if In: The biochemistry of plants. Eds.: Stumpf P.K., Conn E.E. Academic Press, New York. 1981. P. 457-477.

88. Hammond-Kosack K.E., Jones J.D.G. Resistance gene-dependent plant defense responses//Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1773-1791.

89. Haughn G.W., Somerville C.P. Suifonylurea-resistant mutants of Arabidopsis thaliana // Mol. Gen. Genet. 1986. V. 204. P. 430-434.

90. Haughn G.W., Somerville C.P. A mutation causing imidazolinone resistance maps to the Csr1 locus of Arabidopsis thaliana 11 Plant Physiol. 1990. V. 92. P. 1081-1085.

91. Harlow G.R., Jenkins M.E., Pittalwala T.S. Isolation of uvhl ,an Arabidopsis thaiiana mutant hypersensitive to ultraviolet light and ionizing irradiation // Plant Cell. 1994. V. 6. P. 227-235.

92. Howden R., Andersen C.R., Goldsbrough P.B., Cobbett C.S. A cadmium-sensitive, glutathione-deficient mutant of Arabidopsis thaiiana // Plant Physiol. 1995a. V. 107. P. 1067-1073.

93. Howden R., Cobbett C.S. Cadmium-sensitive mutants of Arabidopsis thaiiana // Plant Physiol. 1992. V. 100. P. 100-107.

94. Howden R., Goldsbrough P.B., Andersen C.R., Cobbett C.S. A cadmium-sensitive, cadi mutants of Arabidopsis thaiiana are phytochelatin deficient // Plant Physiol. 1995b. V. 107. P. 1059-1066.

95. Jacobs J.M., Jacobs N.J. Porphyrin accumulation and export by isolated barley (Hordeum vuigare) plastid // Plant Physiol. 1993. V. 101. P. 1181-1187.

96. Jacobs J.M., Jacobs N.J., Sherman T.D., Duke S.O. Effect of diphenil ether herbicides on oxidation of protoporphyrinogen to protoporphyrin in organella and miasma membrane enriched fractions of barley // Plant Physiol. 1991. V. 97. P. 197203.

97. Jenkins M.E., Greg R., Harlow G.R., Zongrang Liu. Radiation-sensitive mutants of Arabidopsis thaiiana// Genetics. 1995. V.140. N. 2.

98. Jespersen H.M., Kjaersgard I.V., Ostergaard L., Welinder K.G. From sequence analysis of three novel ascorbate peroxidases from Arabidopsis thaiiana to structure, function and evolution of seven types of ascorbate peroxidase // Biochem. J. 1997. V. 326(Pt2). P. 305-310.

99. Jones R.L. The control of plant cell elongation by auxin and gibberelin // In: Plant Growth Substances. Eds.: Bopp M. Berlin: Springer. 1985. P. 275-283.

100. Ichinose K., Che F.S., Kimura Y., Matsunobu A., Sato F., YoshidaS. Selection and characterisation of protoporphyrinogenoxidase inhibiting herbicide (S23142) resistant

photomixotrophic cultured cells of Nicotiaria tsbscum // J. Plant Physiol. V. 146. P. 693-698.

101. Kardish N., Magal N., Aviv D. 1994. The tomato gene for the chloroplastic Cu,Zn superoxide dismutase regulation of expression imposed in transgenic tobacco plants by a short promoters// Plant Mol. Biol. V. 26. P. 887-897.

102. Kauss H., Jeblick W. Pretreatment of parsley suspension cultures with salicylic acid enhances spontaneous and elicidet production of H2O2// Plant Physiol. 1992. V. 108. P.1171-1178.

103. Keiko V., Mitsukawa N. The Arabidopsis Erecta gene encoded putative receptor protein kinase with extracellular leucine-rich repeats // The Plant Cell. 1996. V. 8. P. 735-746.

104. Kini D.P., Pandey S.,Shenoy B.D., Singh U.V., Udupa N.. Umadevi.P., Kamath R. Antitumor and antifertiiity activities of piumbagin controlled release formulations // Indian J Exp Bioi. 1997. V. 35. P. 374-379.

105. Kliebenstein D.J., Monde R.A., Last R.L. Superoxide dismutase in Arabidopsis: An eclectic enzyme family with disparate regulation and protein localization // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 637-650.

Kliebenstein D.J., Monde R.A., Last R.L. Superoxide dismutase in arabidopsis: An eclectic enzyme family with disparate regulation and protein localization // Free Radic Biol Med. 1997. V. 23. P. 489-496.

106. Koornneef M., Elgersma A., Hanhart C.J., van Loenen-Martinet E.I. Gibbereiin-insensitive mutant if Arabidopsis thaiiana if Plant Physiol. 1985a. V. 65. P. 33-39.

107. Koornneef M., Elgersma A., Hanhart C.J., van Loenen-Martinet E.P. New linkage data of chromosome 1 with a case of very close linkage of three genes affecting plant height. // Arabidopsis Information Service. 1985b. V. 22. P. 43-48.

108. Krstic B., Vico I., Tosic M., Stojanovic G. Peroxidase isoenzyemes in strawberry roots injected with binucleate Rhyzoctonia spp. and their implication in desease resistance //J. Phytopathology. 1997. V. 145. P. 429-433.

109. Kvaratsheiia M., Winkei C., Thorneley N. Purification and characterisation of a novel class III peroxidase isoensyme from tea leaves // Plant Physiol. 1997. V. 114. P.1237-1245.

110. Lagrimini L.M., Gingas V., Finger F., Rothstein S., Liu T.-T.Y. Characterization of antisense transformed plants deficient in the tobacco anionic peroxidase // Plant Physiol. 1997. V. 114. P. 1187-1196.

111. Lagrimini L.M., Burkhart W., Moyer M., Rohtstein S. Molecular cloning of complementary DNA encoding the lignin-forming peroxidase from tobacco: Molecular analysis and tissue-specific expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. V. 84. P. 7542-7546.

112. Lawton K., Weymann K., Friedrich L., Vernooij B., Uknes S., Ryals. Systemic acquired resistance in Arabidopsis requires salicylic acid but not ethylene // J. Mol. Plant Microbe Interact. 1995. V. 8. P. 863-870.

113. Lawton K.A.., Friedrich L, Hunt M., Weymann K., Delaney T., Kessmann H., Staub T.,Ryals J. Benzothiadiazole induces disease resistance in Arabidopsis by activation of the systemic acquired resistance signal transduction pathway // Plant J. 1996. V. 10. P. 71-82.

114. Leon J., Lawton MA, Raskin I. Hydrogen peroxide stimulates salisylic acid biosinthesis in tobacco // Plant Phisiol. 1995. V. 108. P. 1673-1678.

115. Lermontova I., Kruse E., Mock H.P., Grimm B. Cloning and characterization of a plastidai and a mitochondrial isoform of tobacco protoporphyrinogen IX oxidase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 5. 94(16). P. 8895-8900.

116. Li Z., Hoyashimoto A., Murai N. A sylfonyiyrea herbicide resistance gene from Arabidopsis thaiiana as a new selectable marker for production of fertile transgenic rice plants // Plant Phisiol. 1992. V. 100. P. 662-668.

117. Linden H., Sandmann G., Chamovitz D., Hirschepberg J. Biochemical characterization of Synechococcus mutants selected against the bleaching herbicide norflurazon // Pesticide biochemestry and physiology. 1990. V. 36. P. 46-51.

118. Lois R., Buchanan B.B. Severe sensitivity to ultraviolet radiation in an Arabidopsis mutant deficient in fiavonoid accumulation II. Mechanisms of UV resistance in Arabidopsis // Planta. 1994. V. 194. P. 504-509.

119. LowryO.H., Rosebrough N.G., FarrA.L., Rendall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent //J.Bioi.Chem. 1951. V. 193. N. 1. P. 265-275.

120. Lurie S., Fallic E., Handros A., Sharipa R. The possible involvement of peroxidase in resistant to Botrytis cinerea in heat treated tomato fruit // Physiol, and moiec. plant pathology. 1997. V. 50. P. 141-149.

121. Mauch-Mani B., Slusarenko A.J. Production of salicylic acid precursors is major function of phenylalanine ammonia-lyase in the resistance of Arabidopsis to Peronospora parasitica // Plant Cell. 1996. V. 6. P. 203-212.

122. Mazur B.J., Chiu C.-F., Smith J. Isolation and characterisation of plant genes coding for aceloctate syntase, the target enzyme of two classes of herbicedes // Plant Phisiol. V. 85. P 1110-1117.

123. McClung C.R. Regulation of catalases in Arabidopsis // Free Radic. Biol. Med. 1997. V. 23. P. 489-496.

124. McKersie B.D., Chen Y., de Beus M., Bowley S.R., Bowler C., Inze D., D'Halluin K., Botterman J. Superoxide dismutase enhances tolerance of freezing stress in transgenic alfalfa (Medicago sativaL) // Plant Physiol. 1993. V. 103. P. 1155-1163.

125. McCordJ.M., Fridovich I. Superoxide dismutase. An enzymatic

126. function for erythrocuprein (hemocuprein). //J.Biol.Chem. 1969. N. 5. P. 6049-6055.

127. Medina M., Forchetti S., Tigier H. Kinetic properties of alfalfa root isoperoxidases with IAA oxidase and siringalgazine oxidase activities // In: Plant peroxidase: biochemistry and physiology, 3 intern, symp. 1993. P. 175-180.

128. Mehdy M.C. Active oxygen species in plant defense against pathogens // Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 467-472.

129. Metraux J.P., Ahl Goy P., Staub T.H., Speich J., Steinemann A., Ryals J., Ward E. induce sistemic resistance in cucumber in responce to 2,6-dicloro-isonicotinic acid and patogens // In: Advances in Molecular Genetics of Plant-Microbe Interaction. Eds.: Henncke H., Verma D.P.S. Dordreht, The Netherlands: Kluwer Academic Publisher. 1991. V. 1. P.432-439.

130. Miflin B.J., Cave P.R. The control of leucine, isoleucin and valine biosynthesis in a range of higher plants //J.Exp.Bot. V. 23. P. 511-516.

131. Miller E., Schreier P. Studies on flavonol degradation by peroxidase (donor: H2O2-oxidoreductase, EC 1.11.1.7). Part 1: kaempferol // Food Chem. 1985. V. 17. P. 143154.

132. Mittler R., Zilinskas B.A. Detection of ascorbate peroxidase activity in native gels by inhibition of ascorbate-dependent reduction of nitroblue tetrazolium // Anal. Biochem. 1993. V. 212. P. 540-546.

133. Mourad G., King J. Effect of four classes of herbicide on growth and acetolactate-synthase activity in several variants of Arabidopsis thafiana // Pianta. 1992. V. 188. P. 491-497.

134. Narita S., Tanaka R., Ito T., Okada K., Taketani S., Inokuchi H. Molecular cloning and characterization of a cDNA that encodes protoporphyrinogen oxidase of Arabidopsis thaliana//Gene. 1996. V. 5. P.169-175.

135. Neuenschwander U., Vernooij B., Friedrich L., Uknes S., Kessmann H., Ryals J. Is hydrogen peroxide a second messenger of salicylic acid in systemic acquired resistance? // Plant J. 1995. V. 8. P. 227-233.

136. Nielsen O.F., Macromolecular physiology of plastids. XII. Tigrina mutants of barley // Hereditas. 1974. V. 76. P. 269-304.

137. Ostergaard L., Pedersen A.G., Jespersen H.M., Brunak S., Welinder K.G. Computational analyses and annotations of the Arabidopsis peroxidase gene family // FEBS Lett. 1998. V. 14. N.433(1-2). P/98-102.

138. Pahl H.L., Baeueler P.A. Oxigen and the control of gene expression // BioEssays. 1994. V. 16. P. 497-502.

139. Pecker I., Chamovitz D., Mann V. et al. Molecular characterization of carotinoid biosinthesis in plants the phytoene desaturase gene in tomato // Res. in photosynthesis. 1992. V. 3. P. 11-18.

140. Perl-Treves R., Galun E. The tomato Cu.Zn superoxide dismutase genes are developmentally regulated and respond to light and stress // Plant Mol. Biol. 1991. V.17. P. 745-760.

141. Pickett F.B., Champagne M. M., Meeks-Wagner D.R. Temperatute-sensitive mutations that arrest Arabidopsis shoot development // Development. 1996. V. 122. P. 3799-3807.

142. Pinhero R.G., Rao M.V., Paliyath G., Murr D.P., Fletcher R.A. Changes in activities of antioxidant enzymes and their relatioship to genetic and paclobutazol-induced chiling tolerance of, maize seedling // Plant Physiol. 1997. V. 114. P. 695-704.

143. Pitcher L.H., Brennan E., Hurley A., Dunsmuir P., Tepperman J.M., Zilinskas BA Overproduction of petunia copper / zinc superoxide dismutase does not confer ozone tolerance in transgenic tobacco // Plant Physiol. 1991. V. 97. P. 452-455.

144. Pitcher L.H., Repetti P., Zilinskas BA. Overproduction of ascorbate peroxidase protects transgenic tobacco plants against oxidative stress (abstract No. 623) // Plant Physiol. 1994. V. 105. P. S-169.

145. Planz H. Oxidation of IAA by exstraceliular peroxidase /./ In: Plant peroxidase: biochemistry and physiology, 3 intern, symp. 1993. P. 169-174.

146. Rao M.V., Paiiyath G., Ormrod D.P. Ultraviolet-B- and ozone-induced biochemical changes in antioxidant enzymes of Arabidopsis thaiiana if Plant Physiol. 1996. V. 110. P. 125-136.

147. Rao M.V., Paiiyath G., Ormrod D.P., Murr D.P., Watkins C.B. Influence of salicylic acid on H2O2 production, oxidative stress, and H202-metabolizing enzymes if Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 137-149.

148. Raskin I. Salicylic acid // In.: Plant Hormones. Eds.: Davies P.J. Amsterdam. 1995. P. 188-205.

149. Rauser W.E. Phytochelatins //Annu. Rev. Biochem. 1990. V. 59. P. 61-86.

150. Ryals J.A., Neunschwander U.H., Willits M.G., Molina A., Steiner H.-Y., Hunt M.D. Systemic acguired resistance // Plant Cell. 1996. V. 8. P. 1809-1819.

151. Sandmann G., Boger P. Inhibition of carotenoid biosynthesis by herbisides // In: Target sites of herbiside action". Eds.: Boger P., Sandmann G. CRC Press, Boca Raton, FL. 1989. P. 25.

152. Sakihama Y., Ikehara N. Flavonoid-peroxidase reaction as a detoxification mechanism of plant cells against H202 // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 1405-1412.

153. Sancher M. Role of cell wall peroxidase in the cessation of growth in pine hypocotyls // Plant peroxidases: biochemistry and physiology, 3 international sumposium. 1993. P. 283-286.

154. Sathasivan K., Haugh G.W., Murai N. Nucleotide seguence of a mutant acetolactate syntase gene from an imidazolinone-resistance in Arabidopsis thaiiana var.Columbia // Nucleic acids Res. 1990. V. 18. P. 2188.

155. Sathasivan K., Haugh G.W., Murai N. Molecular basis for imidazoiinone herbicide resistance in Arabidopsis thaiiana var.Columbia // Plant Physiol. 1991. V. 97. P. 10441050.

156. Saxena P.K., King J. Herbicide resistance in Datura innoxia // Plant Physiol. 1988. V. 86. P. 863-867.

157. Scandalios J.G. Response of plant antioxidant defense genes to environmental stress //Adv. Genet. 1990. V. 28. P. 1-41.

158. Schake S.A. Analysis of pea chloroplastic Mn SOD overexpressed in tobacco. MS thesis, Texas Tech. University, Lubbock, TX. 1995.

159. SchJoss J.V., Ciskanik L.M., Van Dyk D.E. Origin of the herbicide bindning site of acetoiactate synthase // Nature. V. 331. P. 360-262.

160. Schreier P., Miller E. Studies on flavonol degradation by peroxidase (donor: H2O2-oxidoreductase, EC 1.11.1.7). Part 2: quercetin // Food Chem. 1985. V. 18. P. 301317.

161. Shirley B.W. Flavonoid biosynthesis: "new" functions for an "old" pathway // Trends Plant Sci. 1996. V. 1. P. 377-382.

162. Shynmio A., Fujiyama K., Kawaoka A. Structure and expression of peroxidase isosyme genes in horseradish and Arabidopsis if In: Plant peroxidase: biochemistry and physiology, 3 intern, symp. 1993. P. 222-228.

163. Slooten L., Capiau K., Van Camp W., Van Montagu M., Sybesma C., Inze D. Factors affecting the enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco overexpressing manganese superoxide dismutase in the chloroplasts // Plant Physiol. 1995. V. 107. P. 737-750.

164. Smith A.G., Marsh O., Elder G.H. Investigation of the subcellular location of the tetrapyrrole-biosynthesis enzyme coproporphyrinogen oxidase in higher plants // Biochem J.1993. V.1. 292 ( Pt 2). P. 503-508.

165. Steffens J.C. The heavy-metai binding peptides of plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1990. V. 41. P. 553-575.

166. Subramanian M.V., Huang H-Y., Dias J.M., Miner V.W., Butler J.H., Jachetta J.J. Properties of mutant acetoiactate synthases resistant to triazolopyrimidine sulfonamide // Plant Physiol. 1990. V. 94. P. 239-244.

167. Sugimoto M., Sakamoto W. Putative phospholipid hydroperoxide glutathione peroxidase gene from Arabidopsis thaiiana induced by oxidative stress // Genes Genet. Syst. 1997. V. 72. N. 5. P. 311-316.

168. Tanatra K. Gene structures and expression control of active oxygen scavenging ensymes in rice // In: Stress responses of photosynthetic organisms. Eds.: Satoh K., Murata N. Elsevier science, Amsterdam. 1998. P. 53-68.

169. TanaKa K., Suda Y., Kondo N., Sugahara K. 03 tolerance and the ascorbate-dependent H202 decomposing system in chloroplasts // Plant Cell Physiol. 1985. V. 26. P. 1425-1431.

170. Teppermann J.M., Dunsmuir P. Transformed plants with elevated levels of chloroplastic SOD are not more resistant to superoxide toxicity if Plant Mol. Biol. 1990. V. 14. P. 501-511.

171. Thomas D.J., Avenson T.J., Thomas J.B., Herbert S.K. 1998. A Cyanobacterium lacking iron superoxide dosmutase is sensitized to oxidative stress induced with methyl vioiogen but is not sensitized to oxidative stress induced with notfiurazon. Plant Physiol., 116,4: 1593-1602.

172. Torsethaugen G., Pitcher L.H., Zilinskas B.A., Pell E.J. Overproduction of ascorbate peroxidase in the tobacco chloroplast does not provide protection against ozone // Plant Physiol. 1997. V. 114. P. 529-537.

173. Troiinder N.L., Alien R.D. Expression of chloroplast localized Mn SOD in transgenic cotton //J. Cell Biochem. 1994. V. 18A. P. 97.

174. Troll W. Die infioresznzen. Fischer Verlag, Jena. 1964. 615 P.

175. Ulmasov T., Ohmiya A., Hagen G., Guilfoyle T. The soybean GH2/4 gene that encodes a glutathione S-transferase has a promoter that is activated by a wide range of chemical agents // Plant Physiol. 1995. V. 108. P. 919-927.

176. Umbarger H.E. The biosynthesis of isoleucine and valin and its regulation // In: Amino acids: Biosynthesis and genetic regulation. Eds.: Hermann K.K., Somerville R.L. Addision-Wersley, London. 1983. P. 245.

177. Van Camp W., Capiau K., Van Montagu M., Inze D., Slooten L. Enhancement of oxidative stress tolerance in transgenic tobacco plants overproducing Fe-superoxide dismutase in chloroplasts // Plant Physiol. 1996. V. 112. P. 1703-1714.

178. Varsano R., Matringe M., Magnin N., Mornet R., Scalla R. Competitive interaction of three peroxidizing herbicides with the binding of [3Hjacifiuorfen to corn etioplast membranes //FEBS Lett.1990. V. 15. 272(1-2). P.106-8.

179. Vermeulen A., Pautot H., Chupcau Y. Agrobacterium mediated transfer of mutant Arabidopsis thaliana //Plant Cell. 1992. Rep. V.11. P.243-247.

180. Vernooij B., Friedrich L., Morse A., Reist R., Kolditz-Jawhar R., Ward E., Uknes S., Kessmann H., Ryals J. Salicylic acid is not the translocated signal responsible for inducing systemic acquired resistance but is required in signal transduction // Plant Celf. 1994. V. 6. P. 959-965.

181. Vernooij B., Friedrich L., Ahl Goy P., Staub T., Kessmann H., Ryals J. 2,6-Dichloroisonicotinic acid-induced resistance to patogens does not reguired the salacylic acid //Mol.Plant-Microbe Interact. 1995. V. 8. P. 228-234.

182. Ward E.R., Uknes S.J., Williams S.C., Dincher S.S., Wiederhold D.L., Alexander D.C., Ahl-Goy P., Metraux J.-P., Ryals J A Coordinate gene activity in responce to

agent that induce systemic acguaired resistance // Plant Cell. 1991. V. 3. p. 10851094.

183. Watanabe N., Fang-Sik Che, Iwano T., Takayama S., Nakano T., Yoshida S., Isogai A. Molecular characterization of photomixotrohic tobacco cells resistance to protoporhyrinogen oxidase-inhibiting herbicides // Plant Physiol. 1998. V.118. P. 751758.

184. Welinder K., Gajhede. Structure and evolution of peroxidase // In: Plant peroxidase: biochemistry and physiology, 3 intern, symp. 1993. P. 227-228.

185. Wettstein D., Gough S., Kannangara C.G. Chlorophyll biosynthesis //The plant Cell. 1995. V. 7. P. 1039-1057.

186. Willekens H., Langebartels C., Tire C., Van Montagu M., Inze D., Van Camp W. Differential expression of catalase genes in Nicotians pfumbaginifoiia (L.) // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994a. V. 91. P. 10450-10454.

187. Willekens H., Van Camp W., Van Montagu M., Inze D., Langebartels C., Sandermann Jr H. Ozone, sulfur dioxide, and ultraviolet B have similar effects on mRNA accumulation of antioxidant genes in Nicotiana piumbaginifoiia (L) // Plant Physiol. 1994b. V. 106. P. 1007-1014.

188. Willekens H., Villarroel R., Van Montagu M., Inze D., Van Camp W. Molecular identification of catalase from Nicotiana piumbaginifoiia (L) // FEBS Lett. 1994c. V. 352. P. 79-83.

189. Williamson J., Scandalios J.G. Differential response of maize catatases to abscisic acid: vp1 transcriptional activator is not required for abscisic acid- regulated Cat1 expression // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V. 89. P. 8842- 8846.

190. Wilkinson J.Q., Grawford N.H. Identification of Arabidopsis thaliana CHL3 gene as the nitrate reductase structural gene NIA2 // Plant Cell. 1991. V. 3. P.461-471.

191. Yamasaki H., Sakihama Y., Ikehana N. Flavonoid-peroxidase reaction as detoxification mechanism of plant cells against H2O2 // Plant Physiol. 1997. V. 115. P. 1405-1412.

192. Yogesh K., Sharma T. Ozon-induced expression of stress-related genes in Arabidopsis thaiiana ÍÍ Plant Physiol. 1994. V. 105. P. 1089-1096.

193. Zeevart J.A.D., Creelman R.A. Metabolism and Physiology of abscisic acid // Ann. Rev. Physiol, and Plant Mol. Biol. 1988. V. 39. P. 439-531.