Генетические детерминанты инфекционности вируса гриппа и иммуногенности противогриппозных вакцин тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.02, доктор биологических наук Романова, Юлия Романовна

• Романова, Юлия Романовна
• доктор биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации доктор биологических наук Романова, Юлия Романовна

1 ВВЕДЕНИЕ.

2 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

2.1 Высокопатогенный вирус гриппа птиц.

2.2 Современные тенденции в разработке противогриппозных вакцин.

3 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1 Тканевые культуры.

3.2 Вирусы.

3.2.1 Эпидемические штаммы вируса гриппа.

3.2.2 Конструирование вирусов методом обратной генетики.

3.3 Секвенирование.

3.4 Культивирование и титрование вирусов.

3.5 Титрование вируса методом бляшек с/без трипсина.

3.6 Получение и инфицирование макрофагов.

3.7 Индукция ИФН в бронхиальных эпителиальных клетках человека.

3.8 Определение сывороточных и секреторных антител.

3.9 Инфекционность и патогенность вирусов для цыплят.

3.10 Инфекционность и иммуногенность вирусов для мышей.

3.11 Патогенность, иммуногенность и протективная эффективность вирусов для хорьков.

3.12 Патогенность и иммуногенность вирусов для макак.

3.13 Определение цитокинов в носовых смывах макак.

3.14 Гемолиз тест.

3.15 Анализ стабильности вирусов методом атомно- силовой микроскопии

3.16 Инфекционность вирусов in vitro при различном рН среды или в присутствии лизосомотропных агентов.

3.17 Проточная цитометрия.

3.18 Кинетика вирусного роста.

4 РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1 Получение H5N1 вакцинного кандидата с модифицированным NS геном и изучение его свойств.

4.1.1 Конструирование вакцинного кандидата.

4.1.2 Рост вакцинного кандидата VN1203ANS1 в клетках Vero.

4.1.3 Стимуляция ИФН в бронхиальных эпителиальных клетках человека (НВЕ) и макрофагах вакцинным штаммом VN1203ANS1.

4.1.4 Патогенность вакцинного кандидата VN1203ANS1 для цыплят.

4.1.5 Иммуногенные и протективные свойства вакцинного кандидата VN1203ANS для мышей.

4.1.6 Аттенуация, иммуногенность и протекгивная эффективность вакцинного кандидата VN1203ANS1 для хорьков.

4.1.7 Аттенуация и иммуногенность вируса VN1203ANS1 для макак.

4.2 Повышение инфекционности и иммуногенности H5N1 вакцинного кандидата VN1203ANS1.

4.2.1 Зависимость инфекционности вирусов гриппа от рН среды.

4.2.2 Введение мутации 58К—И в НА вакцинного кандидата VN1203ANS1.

4.2.3 Мутация 58К-И снижает рН активации НА вируса VN1203ANS1.

4.2.4 Сравнение стабильности вирусов в кислой среде методом атомно-силовой микроскопии.

4.2.5 Стабильность вирусов при повышенной температуре.

4.2.6 Инфекционность вирусов на клетках Vero и MDCK.

4.2.7 Чувствительность вирусов к лизосомотропным агентам.

4.2.8 Репродукционная активность вирусов в тканевых культурах.

4.2.9 Инфекционность исходного и модифицированного вирусов для мышей.

4.2.10 Иммуногенная активность вирусов для мышей.

4.3 Стабильность НА как фактор иммуногенности сезонных живых противогриппозных вакцин.

4.3.1 Получение ANS1 вакцинных кандидатов сероподтипа H3N2.

4.3.2 Влияние адаптационных мутаций в НА на стабильность вакцинных кандидатов сероподтипа H3N2.

4.3.3 Пассирование H3N2 вакцинных кандидатов в тканевой культуре Vero при пониженном рН среды.

4.3.4 Дестабилизирующие мутации в НА H3N2 вакцинных кандидатов снижают иммуногенность вирусов для хорьков.

4.4 Влияние стабильности НА на урожайность вируса для инактивированных противогриппозных вакцин.

4.4.1 Стабильность вирусов, рекомендованных ВОЗ для производства вакцин

4.4.2 Повышение стабильности вируса при пассировании в тканевой культуре с пониженным рН среды.

5 ОБСУЖДЕНИЕ.

6 ВЫВОДЫ.

7 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетические детерминанты инфекционности вируса гриппа и иммуногенности противогриппозных вакцин»

В 1997 году птичий вирус гриппа подтипа A(H5N1) инфицировал 18 человек, 6 из них со смертельным исходом. Высокая патогенность этих штаммов и беспрецедентное распространение среди птиц создали опасность возникновения новой пандемии и вызвали необходимость усовершенствования существующих противогриппозных вакцин. Результаты клинических испытаний вакцин против вирусов гриппа сероподтипа H5N1 показали, что инактивированные вакцины (в дозе 15 мкг НА) обладают низкой иммуногенностью. Только двукратная иммунизация с двойным количеством антигена обеспечивала протективный иммунитет. При такой эффективности в случае пандемии потребуется в 4 раза больше вакцины, чем обычно и, следовательно, больше времени для полноценной защиты населения. Живые вакцины, в отличие от инактивированных, вызывают более длительную и кросс - протективную защиту. Поэтому в случае пандемии живые вакцины позволяют значительно быстрее защитить население. Их недостатком является репродукция штаммов в респираторном тракте, которая может вызвать нежелательное распространение вакцинного вируса в популяции людей. Результаты испытаний живых холодоадаптированных вакцин сероподтипа Н5 противоречивы. Вакцинные кандидаты, полученные на основе донора A/Ann Arbor/6/60 (H2N2) (США), содержащие поверхностные антигены H5N1 вирусов A/Vietnam/1203/04 или A/Hong Kong/213/03, не репродуцировались в респираторном тракте привитых и почти не вызывали иммунный ответ. Вакцинный штамм, приготовленный на основе донора А/Ленин град/134/17/57 (H2N2) (Россия) и низкопатогенного для птиц штамма А/утка/Potsdam/86/92 (H5N2), наоборот, интенсивно реплицировался в верхнем отделе респираторного тракта привитых и вызывал прирост антител у 31% привитых. Причины различий до настоящего момента не выяснены. В данной работе был использован новый подход, основанный на создании аттенуированных штаммов (ANS1 вирусов гриппа), дефектных по репродукции в компетентных по ИФН клетках, за счет удаления белка NS1. Белок NS1 - один из факторов патогенности вируса гриппа, ответственный за подавление врожденного иммунитета хозяина и позволяющий ему успешно реплицироваться на фоне подавленной системы ИФН. Удаление белка NS1 ведет к абортивной репликации вируса из-за активации широкого круга противовирусных факторов и формирования противовирусного статуса в клетках. Таким образом, ANS1 вирусы индуцируют синтез различных белков, а их антигены презентируются в клетках респираторного тракта аналогично живой вакцине. Эффективность интраназальной живой вакцины зависит от того, как вакцинный вирус инфицирует клетки верхнего респираторного тракта. В этом процессе важным, но не единственным фактором является рецепторная специфичность НА вируса гриппа. Кроме того, клетки дыхательных путей в ответ на воспаление или раздражение начинают выделять протоны, что приводит к снижению кислотности носовой полости человека. Кислая среда, вызывает необратимое конформационное изменение НА, необходимое для слияния вирусной и эндосомальной мембран. Если изменение конформации НА происходит до попадания вируса в эндосомы, то вирус теряет инфекционность. Поэтому, для преодоления мукозного барьера НА вируса гриппа должен обладать определенной стабильностью в кислой среде. Вирусы гриппа человека и птиц отличаются по чувствительности к кислой среде. Мы предположили, что низкая инфекционность высокопатогенных штаммов вируса гриппа птиц для млекопитающих и, как следствие, низкая эффективность полученных на их основе живых аттенуированных вакцин, обусловлены высоким значением рН активации НА, дестабилизирующим его структуру. Выявление генетических детерминант инфекционности вируса гриппа для млекопитающих и иммуногенности противогриппозных вакцин составило цель настоящего исследования.

2 Литературный обзор

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Романова, Юлия Романовна

6 Выводы

1. Удаление гена, кодирующего NS1 белок, в сочетании с модификацией сайта расщепления НА и реассортацией генов, кодирующих внутренние белки, приводит к аттенуации высокопатогенного вируса гриппа птиц сероподтипа H5N1 и позволяет создать вакцинный кандидат, аттенуированный для лабораторных животных при интраназальном введении.

2. Интраназальное введение H5N1 ANS1 вакцинного кандидата не вызывает побочных реакций у цыплят, хорьков и макак и не сопровождается репликацией вируса в респираторном тракте и других органах лабораторных животных, подтверждая фенотип абортивной репликации вируса в компетентных по интерферону клетках.

3. Интраназальная иммунизация H5N1 ANS1 вакцинным кандидатом индуцирует нейтрализующие и секреторные антитела, вызывая кросс-реактивный в пределах подтипа протективный иммунитет, показанный на трех моделях лабораторных животных.

4. Введение мутации K58I в НА2 субъединицу Н5 НА снижает рН активации НА и повышает устойчивость вакцинного кандидата к повышенной температуре и кислой среде.

5. Введение мутации K58I в НА2 субъединицу НА H5N1 вакцинного кандидата обусловливает его более высокую инфекционность в респираторном тракте млекопитающих, повышающую иммуногенность вируса при интраназальном введении.

6. Адаптация вирусов гриппа человека к росту в тканевых культурах приводит к появлению дестабилизирующих мутаций в НА (L194P; G75I), приводящих к

- 137снижению иммуногенности вакцинных штаммов живых интраназальных вакцин.

7. Культивирование вирусов в тканевых культурах при пониженном рН среды предотвращает появление дестабилизирующих мутаций в НА и позволяет повысить иммуногенность вакцинных кандидатов живых вакцин и урожайность штаммов, используемых для производства инактивированных противогриппозных вакцин.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Романова, Юлия Романовна, 2012 год

1. Александрова Г.И., Климов А.И. Живая вакцина против гриппа. СПб: Наука, 1994.

2. Гендон Ю.З. Живые холодоадаптированные реассортантные гриппозные вакцины / Вопросы вирусологии / РАМН 2001, Т.З, с. 5-12.

3. Гендон Ю.З. Вакцины и химиопрепараты для профилактики гриппа: обзор // Вопросы вирусологии. — 2007. — N 1 . — С. 4-10.

4. Киселев О.И., Цыбалова Л.М., Покровский В.И. Состояние разработки вакцин против вируса гриппа H5N1 в мире и России. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2006. №5. С.28-38

5. Киселев О.И. Прогресс в создании пандемических противогриппозных вакцин и технологии их производства // Биотехнология. 2010. - №2. - С. 1-17.

6. Покровский В.И., Киселев О.И. Грипп птиц: происхождение инфекционных биокатастроф СПб.Росток, 2005 - 376 с.

7. AN A, Avalos RT, Ponimaskin E, Nayak DP (2000) Influenza virus assembly: effect of influenza virus glycoproteins on the membrane association of M1 protein. J Virol 74: 8709-8719

8. Alymova IV, Kodihalli S, Govorkova EA, Fanget B, Gerdil C, Webster RG (1998) Immunogenicity and protective efficacy in mice of influenza B virus vaccines grown in mammalian cells or embryonated chicken eggs. J Virol 72: 4472-4477

9. Asahi-Ozaki Y, Yoshikawa T, Iwakura Y, Suzuki Y, Tamura S, Kurata T, Sata T (2004) Secretory IgA antibodies provide cross-protection against infection with different strains of influenza B virus. J Med Virol 74: 328-335

10. Belshe RB, Edwards KM, Vesikari T, Black SV, Walker RE, Hultquist M, Kemble G, Connor EM (2007) Live attenuated versus inactivated influenza vaccine in infants and young children. N Engl J Med 356: 685-696

11. Bernstein Dl, Edwards KM, Dekker CL, Belshe R, Talbot HK, Graham IL, Noah DL, He F, Hill H (2008) Effects of adjuvants on the safety and immunogenicity of an avian influenza H5N1 vaccine in adults. J Infect Dis 197: 667-675

12. Beyer WE, Palache AM, Osterhaus AD (1998) Comparison of Serology and Reactogenicity between Influenza Subunit Vaccines and Whole Virus or Split Vaccines: A Review and Meta-Analysis of the Literature. Clin Drug Investig 15: 1-12

13. Boulay F, Doms RW, Wilson I, Helenius A (1987) The influenza hemagglutinin precursor as an acid-sensitive probe of the biosynthetic pathway. EMBO J 6: 26432650

14. Bresson JL, Perronne C, Launay O, Gerdil C, Saville M, Wood J, Hoschler K, Zambon MC (2006) Safety and immunogenicity of an inactivated split-virion influenza AA/ietnam/1194/2004 (H5N1) vaccine: phase I randomised trial. Lancet 367: 1657-1664

15. Bright RA, Carter DM, Crevar CJ, Toapanta FR, Steckbeck JD, Cole KS, Kumar

16. NM, Pushko P, Smith G, Tumpey TM, Ross TM (2008) Cross-clade protective-143 immune responses to influenza viruses with H5N1 HA and NA elicited by an influenza virus-like particle. PLoS ONE 3: e1501

17. Brown JD, Goekjian G, Poulson R, Valeika S, Stallknecht DE (2009) Avian influenza virus in water: infectivity is dependent on pH, salinity and temperature. Vet Microbiol 136: 20-26

18. Brownlee GG, Fodor E (2001) The predicted antigenicity of the haemagglutinin of the 1918 Spanish influenza pandemic suggests an avian origin. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 356: 1871-1876

19. Bullough PA, Hughson FM, Skehel JJ, Wiley DC (1994) Structure of influenza haemagglutinin at the pH of membrane fusion. Nature 371: 37-43

20. Carr CM, Kim PS (1994) Flu virus invasion: halfway there. Science 266: 234-236

21. Carr CM, Chaudhry C, Kim PS (1997) Influenza hemagglutinin is spring-loaded by a metastable native conformation. Proc Natl Acad Sci U S A 94: 14306-14313

22. Chen H, Li Y, Li Z, Shi J, Shinya K, Deng G, Qi Q, Tian G, Fan S, Zhao H, Sun Y, Kawaoka Y (2006) Properties and dissemination of H5N1 viruses isolated during an influenza outbreak in migratory waterfowl in western China. J Virol 80: 5976-5983

23. Chen Z, Zhou H, Jin H The impact of key amino acid substitutions in the hemagglutinin of influenza A (H3N2) viruses on vaccine production and antibody response. Vaccine 28: 4079-4085

24. Chen Z, Zhou H, Jin H (2010) The impact of key amino acid substitutions in the hemagglutinin of influenza A (H3N2) viruses on vaccine production and antibody response. Vaccine 28: 4079-4085

25. Clements DA, Langdon L, Bland C, Walter E (1995) Influenza A vaccine decreases the incidence of otitis media in 6- to 30-month-old children in day care. Arch Pediatr Adolesc Med 149: 1113-1117

26. Cyranoski D (2005) China's chicken farmers under fire for antiviral abuse. Nature 435: 1009

27. Daniels PS, Jeffries S, Yates P, Schild GC, Rogers GN, Paulson JC, Wharton SA,

28. Douglas AR, Skehel J J, Wiley DC (1987) The receptor-binding and membrane- 145fusion properties of influenza virus variants selected using anti-haemagglutinin monoclonal antibodies. EMBO J 6: 1459-1465

29. Daniels RS, Downie JC, Hay AJ, Knossow M, Skehel JJ, Wang ML, Wiley DC (1985) Fusion mutants of the influenza virus hemagglutinin glycoprotein. Cell 40: 431-439

30. De Filette M, Ramne A, Birkett A, Lycke N, Lowenadler B, Min Jou W, Saelens X, Fiers W (2006) The universal influenza vaccine M2e-HBc administered intranasally in combination with the adjuvant CTA1-DD provides complete protection. Vaccine 24: 544-551

31. Egorov A, Brandt S, Sereinig S, Romanova J, Ferko B, Katinger D, Grassauer A, Alexandrova G, Katinger H, Muster T (1998) Transfectant influenza A viruses with long deletions in the NS1 protein grow efficiently in Vero cells. J Virol 72: 6437-6441

32. England RJ, Homer JJ, Knight LC, Ell SR (1999) Nasal pH measurement: a reliableand repeatable parameter. Clin Otolaryngol Allied Sci 24: 67-68- 146

33. Ernst WA, Kim HJ, Tumpey TM, Jansen AD, Tai W, Cramer DV, Adler-Moore JP, Fujii G (2006) Protection against H1, H5, H6 and H9 influenza A infection with liposomal matrix 2 epitope vaccines. Vaccine 24: 5158-5168

34. Ferko B, Stasakova J, Romanova J, Kittel C, Sereinig S, Katinger H, Egorov A (2004) Immunogenicity and protection efficacy of replication-deficient influenza A viruses with altered NS1 genes. J Virol 78: 13037-13045

35. Fernandez-Sesma A (2007) The influenza virus NS1 protein: inhibitor of innate and adaptive immunity. Infect Disord Drug Targets 7: 336-343

36. Fischer H, Widdicombe JH, lllek B (2002) Acid secretion and proton conductance in human airway epithelium. Am J Physiol Cell Physiol 282: C736-743

37. Fischer H, Widdicombe JH (2006) Mechanisms of acid and base secretion by the airway epithelium. J Membr Biol 211:139-150

38. Flynn KJ, Belz GT, Altman JD, Ahmed R, Woodland DL, Doherty PC (1998) Virus-specific CD8+ T cells in primary and secondary influenza pneumonia. Immunity 8: 683-691

39. Gabriel G, Herwig A, Klenk HD (2008) Interaction of polymerase subunit PB2 and NP with importin alphal is a determinant of host range of influenza A virus. PLoS Pathog 4: e11

40. Garcia-Sastre A, Egorov A, Matassov D, Brandt S, Levy DE, Durbin JE, Palese P, Muster T (1998) Influenza A virus lacking the NS1 gene replicates in interferon-deficient systems. Virology 252: 324-330

41. Garcia-Sastre A, Biron CA (2006) Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science 312: 879-882

42. Garcia MA, Gil J, Ventoso I, Guerra S, Domingo E, Rivas C, Esteban M (2006) Impact of protein kinase PKR in cell biology: from antiviral to antiproliferative action. Microbiol Mol Biol Rev 70: 1032-1060

43. Grubb BR, Boucher RC (1999) Pathophysiology of gene-targeted mouse models for cystic fibrosis. Physiol Rev 79: S193-214

44. Guan Y, Peiris JS, Lipatov AS, Ellis TM, Dyrting KC, Krauss S, Zhang LJ, Webster RG, Shortridge KF (2002) Emergence of multiple genotypes of H5N1 avian influenza viruses in Hong Kong SAR. Proc Natl Acad Sci U S A 99: 8950-8955

45. Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC (2001) X-ray structures of H5 avian and H9swine influenza virus hemagglutinins bound to avian and human receptor analogs.

46. Proc Natl Acad Sci U S A 98: 11181-11186-148

47. Ha Y, Stevens DJ, Skehel JJ, Wiley DC (2002) H5 avian and H9 swine influenza virus haemagglutinin structures: possible origin of influenza subtypes. EMBO J 21: 865-875

48. Hatta M, Gao P, Halfmann P, Kawaoka Y (2001) Molecular basis for high virulence of Hong Kong H5N1 influenza A viruses. Science 293: 1840-1842

49. Hatta M, Hatta Y, Kim JH, Watanabe S, Shinya K, Nguyen T, Lien PS, Le QM, Kawaoka Y (2007) Growth of H5N1 influenza A viruses in the upper respiratory tracts of mice. PLoS Pathog 3: 1374-1379

50. Hayden FG, Fritz R, Lobo MC, Alvord W, Strober W, Straus SE (1998) Local and systemic cytokine responses during experimental human influenza A virus infection. Relation to symptom formation and host defense. J Clin Invest 101: 643-649

51. Hehar SS, Mason JD, Stephen AB, Washington N, Jones NS, Jackson SJ, Bush D (1999) Twenty-four hour ambulatory nasal pH monitoring. Clin Otolaryngol Allied Sci 24: 24-25

52. Hoffmann E, Neumann G, Kawaoka Y, Hobom G, Webster RG (2000) A DNA transfection system for generation of influenza A virus from eight plasmids. Proc Natl Acad Sci U S A 97: 6108-6113

53. Hoffmann E, Lipatov AS, Webby RJ, Govorkova EA, Webster RG (2005) Role of specific hemagglutinin amino acids in the immunogenicity and protection of H5N1 influenza virus vaccines. Proc Natl Acad Sci U S A 102: 12915-12920

54. Holmgren J, Czerkinsky C, Eriksson K, Mharandi A (2003) Mucosal immunisation and adjuvants: a brief overview of recent advances and challenges. Vaccine 21 Suppl 2: S89-95

55. Horcas I, Fernandez R, Gomez-Rodriguez JM, Colchero J, Gomez-Herrero J, Baro AM (2007) WSXM: a software for scanning probe microscopy and a tool for nanotechnology. The Review of scientific instruments 78: 013705

56. Huckriede A, Bungener L, Stegmann T, Daemen T, Medema J, Palache AM, Wilschut J (2005) The virosome concept for influenza vaccines. Vaccine 23 Suppl 1: S26-38

57. Ilyushina NA, Govorkova EA, Russell CJ, Hoffmann E, Webster RG (2007) Contribution of H7 haemagglutinin to amantadine resistance and infectivity of influenza virus. J Gen Virol 88: 1266-1274

58. Jefferson T, Rivetti A, Harnden A, Di Pietrantonj C, Demicheli V (2008) Vaccines for preventing influenza in healthy children. Cochrane Database Syst Rev: CD004879

59. Jegerlehner A, Schmitz N, Storni T, Bachmann MF (2004) Influenza A vaccine based on the extracellular domain of M2: weak protection mediated via antibody-dependent NK cell activity. J Immunol 172: 5598-5605

60. Johansson BE (1999) Immunization with influenza A virus hemagglutinin and neuraminidase produced in recombinant baculovirus results in a balanced and broadened immune response superior to conventional vaccine. Vaccine 17: 20732080

61. Jones T, Allard F, Cyr SL, Tran SP, Plante M, Gauthier J, Bellerose N, Lowell GH, Burt DS (2003) A nasal Proteosome influenza vaccine containing baculovirus-derived hemagglutinin induces protective mucosal and systemic immunity. Vaccine 21: 3706-3712

62. Karlsson H, Hessle C, Rudin A (2002) Innate immune responses of human neonatal cells to bacteria from the normal gastrointestinal flora. Infect Immun 70: 6688-6696

63. Katz JM, Lu X, Frace AM, Morken T, Zaki SR, Tumpey TM (2000) Pathogenesis of and immunity to avian influenza A H5 viruses. Biomed Pharmacother 54: 178-187

64. Kendal AP (1997) Cold-adapted live attenuated influenza vaccines developed in Russia: can they contribute to meeting the needs for influenza control in other countries? Eur J Epidemiol 13: 591-609

65. Kistner O, Howard MK, Spruth M, Wodal W, Brühl P, Gerencer M, Crowe BA,

66. Savidis-Dacho H, Livey I, Reiter M, Mayerhofer I, Tauer C, Grillberger L, Mündt W,-151

67. Falkner FG, Barrett PN (2007) Cell culture (Vero) derived whole virus (H5N1) vaccine based on wild-type virus strain induces cross-protective immune responses. Vaccine 25: 6028-6036

68. Kodihalli S, Goto H, Kobasa DL, Krauss S, Kawaoka Y, Webster RG (1999) DNA vaccine encoding hemagglutinin provides protective immunity against H5N1 influenza virus infection in mice. J Virol 73: 2094-2098

69. Krug RM, Yuan W, Noah DL, Latham AG (2003) Intracellular warfare between human influenza viruses and human cells: the roles of the viral NS1 protein. Virology 309: 181-189

70. Kuiken T, Rimmelzwaan G, van Riel D, van Amerongen G, Baars M, Fouchier R, Osterhaus A (2004) Avian H5N1 influenza in cats. Science 306: 241

71. Leroux-Roels I, Bernhard R, Gerard P, Drame M, Hanon E, Leroux-Roels G (2008) Broad Clade 2 Cross-Reactive Immunity Induced by an Adjuvanted Clade 1 rH5N1 Pandemic Influenza Vaccine. PLoS ONE 3: e1665

72. Liang S, Mozdzanowska K, Palladino G, Gerhard W (1994) Heterosubtypic immunity to influenza type A virus in mice. Effector mechanisms and their longevity. J Immunol 152: 1653-1661

73. Limberis M, Anson DS, Fuller M, Parsons DW (2002) Recovery of airway cystic fibrosis transmembrane conductance regulator function in mice with cystic fibrosis after single-dose lentivirus-mediated gene transfer. Hum Gene Ther 13: 1961-1970

74. Lleonart R, Naf D, Browning H, Weissmann C (1990) A novel, quantitative bioassay for type I interferon using a recombinant indicator cell line. Biotechnology (N Y) 8: 1263-1267

75. Lorenz RJ, Bogel K (1973) Laboratory techniques in rabies: methods of calculation. Monogr Ser World Health Organ: 321-335

76. Maeda T, Ohnishi S (1980) Activation of influenza virus by acidic media causeshemolysis and fusion of erythrocytes. FEBS Lett 122: 283-287-153

77. Matrosovich M, Zhou N, Kawaoka Y, Webster R (1999) The surface glycoproteins of H5 influenza viruses isolated from humans, chickens, and wild aquatic birds have distinguishable properties. J Virol 73: 1146-1155

78. McShane D, Davies JC, Davies MG, Bush A, Geddes DM, Alton EW (2003) Airway surface pH in subjects with cystic fibrosis. Eur Respir J 21: 37-42

79. Meitin CA, Bender BS, Small PA, Jr. (1991) Influenza immunization: intranasal live vaccinia recombinant contrasted with parenteral inactivated vaccine. Vaccine 9: 751-756

80. Mutsch M, Zhou W, Rhodes P, Bopp M, Chen RT, Linder T, Spyr C, Steffen R (2004) Use of the inactivated intranasal influenza vaccine and the risk of Bell's palsy in Switzerland. N Engl J Med 350: 896-903

81. Nicholls JM, Chan MC, Chan WY, Wong HK, Cheung CY, Kwong DL, Wong MP, Chui WH, Poon LL, Tsao SW, Guan Y, Peiris JS (2007) Tropism of avian influenza A (H5N1) in the upper and lower respiratory tract. Nat Med 13: 147-149

82. Nolan T, Richmond PC, Formica NT, Hoschler K, Skeljo MV, Stoney T, McVernon

83. J, Hartel G, Sawlwin DC, Bennet J, Ryan D, Basser RL, Zambon MC (2008) Safetyand immunogenicity of a prototype adjuvanted inactivated split-virus influenza A

84. H5N1) vaccine in infants and children. Vaccine 26: 6383-6391- 154

85. Olsen B, Munster VJ, Wallensten A, Waldenstrom J, Osterhaus AD, Fouchier RA (2006) Global patterns of influenza a virus in wild birds. Science 312: 384-388

86. Palache AM, Brands R, van Scharrenburg GJ (1997) Immunogenicity and reactogenicity of influenza subunit vaccines produced in MDCK cells or fertilized chicken eggs. J Infect Dis 176 Suppl 1: S20-23

87. Pau MG, Ophorst C, Koldijk MH, Schouten G, Mehtali M, Uytdehaag F (2001) The human cell line PER.C6 provides a new manufacturing system for the production of influenza vaccines. Vaccine 19: 2716-2721

88. Pushko P, Tumpey TM, Van Hoeven N, Belser JA, Robinson R, Nathan M, Smith G, Wright DC, Bright RA (2007) Evaluation of influenza virus-like particles and Novasome adjuvant as candidate vaccine for avian influenza. Vaccine 25: 42834290

89. Quan FS, Huang C, Compans RW, Kang SM (2007) Virus-like particle vaccine induces protective immunity against homologous and heterologous strains of influenza virus. J Virol 81: 3514-3524

90. Rachakonda PS, Veit M, Korte T, Ludwig K, Bottcher C, Huang Q, Schmidt MF, Herrmann A (2007) The relevance of salt bridges for the stability of the influenza virus hemagglutinin. Faseb J 21: 995-1002

91. Reed LJ, Muench H (1938) A simple method for estimating fifity percent endpoints. Am J Hyg 27: 493-497

92. Reed ML, Bridges OA, Seiler P, Kim JK, Yen HL, Salomon R, Govorkova EA, Webster RG, Russell CJ (2009) The pH of activation of the hemagglutinin protein regulates H5N1 influenza virus pathogenicity and transmissibility in ducks. J Virol 84: 1527-1535

93. Reed ML, Yen HL, DuBois RM, Bridges OA, Salomon R, Webster RG, Russell CJ (2009) Amino acid residues in the fusion peptide pocket regulate the pH of activation of the H5N1 influenza virus hemagglutinin protein. J Virol 83: 3568-3580

94. Reid AH, Taubenberger JK, Fanning TG (2004) Evidence of an absence: the genetic origins of the 1918 pandemic influenza virus. Nat Rev Microbiol 2: 909-914

95. Rimmelzwaan GF, Kuiken T, van Amerongen G, Bestebroer TM, Fouchier RA, Osterhaus AD (2001) Pathogenesis of influenza A (H5N1) virus infection in a primate model. J Virol 75: 6687-6691

96. Rinia HA, Snel MM, van der Eerden JP, de Kruijff B (2001) Visualizing detergent resistant domains in model membranes with atomic force microscopy. FEBS Lett 501: 92-96

97. Romanova J, Katinger D, Ferko B, Voglauer R, Mochalova L, Bovin N, Lim W, Katinger H, Egorov A (2003) Distinct host range of influenza H3N2 virus isolates in Vero and MDCK cells is determined by cell specific glycosylation pattern. Virology 307: 90-97

98. Sato SB, Kawasaki K, Ohnishi S (1983) Hemolytic activity of influenza virus hemagglutinin glycoproteins activated in mildly acidic environments. Proc Natl Acad Sci U SA80: 3153-3157

99. Scholtissek C (1985) Stability of infectious influenza A viruses at low pH and at elevated temperature. Vaccine 3: 215-218

100. Seo SH, Hoffmann E, Webster RG (2002) Lethal H5N1 influenza viruses escape host anti-viral cytokine responses. Nat Med 8: 950-954

101. Shinya K, Hamm S, Hatta M, Ito H, Ito T, Kawaoka Y (2004) PB2 amino acid at position 627 affects replicative efficiency, but not cell tropism, of Hong Kong H5N1 influenza A viruses in mice. Virology 320: 258-266

102. Shinya K, Ebina M, Yamada S, Ono M, Kasai N, Kawaoka Y (2006) Avian flu: influenza virus receptors in the human airway. Nature 440: 435-436

103. Skehel JJ, Wiley DC (2000) Receptor binding and membrane fusion in virus entry: the influenza hemagglutinin. Annu Rev Biochem 69: 531-569

104. Steel J, Lowen AC, Mubareka S, Palese P (2009) Transmission of influenza virus in a mammalian host is increased by PB2 amino acids 627K or 627E/701N. PLoS Pathog 5: e1000252

105. Stephenson I, Nicholson KG, Colegate A, Podda A, Wood J, Ypma E, Zambon M (2003) Boosting immunity to influenza H5N1 with MF59-adjuvanted H5N3 A/Duck/Singapore/97 vaccine in a primed human population. Vaccine 21: 16871693

106. Stray SJ, Air GM (2001) Apoptosis by influenza viruses correlates with efficiency of viral mRNA synthesis. Virus Res 77: 3-17

107. Suguitan AL, Jr., McAuliffe J, Mills KL, Jin H, Duke G, Lu B, Luke CJ, Murphy B, Swayne DE, Kemble G, Subbarao K (2006) Live, attenuated influenza A H5N1 candidate vaccines provide broad cross-protection in mice and ferrets. PLoS Med 3: e360

108. Suzuki Y (2005) Sialobiology of influenza: molecular mechanism of host rangevariation of influenza viruses. Biol Pharm Bull 28: 399-408-160

109. Takada A, Matsushita S, Ninomiya A, Kawaoka Y, Kida H (2003) Intranasal immunization with formalin-inactivated virus vaccine induces a broad spectrum of heterosubtypic immunity against influenza A virus infection in mice. Vaccine 21: 3212-3218

110. Takeuchi K, Lamb RA (1994) Influenza virus M2 protein ion channel activity stabilizes the native form of fowl plague virus hemagglutinin during intracellular transport. J Virol 68: 911-919

111. Takeuchi O, Akira S (2008) MDA5/RIG-I and virus recognition. Curr Opin Immunol 20: 17-22

112. Tamura S, Tanimoto T, Kurata T (2005) Mechanisms of broad cross-protection provided by influenza virus infection and their application to vaccines. Jpn J Infect Dis 58: 195-207

113. Tamura SI, Asanuma H, Ito Y, Hirabayashi Y, Suzuki Y, Nagamine T, Aizawa C, Kurata T, Oya A (1992) Superior cross-protective effect of nasal vaccination to subcutaneous inoculation with influenza hemagglutinin vaccine. Eur J Immunol 22: 477-481

114. Tellier R (2009) Aerosol transmission of influenza A virus: a review of new studies.

115. J R Soc Interface 6 Suppl 6: S783-790-161

116. Thompson CI, Barclay WS, Zambon MC, Pickles RJ (2006) Infection of human airway epithelium by human and avian strains of influenza a virus. J Virol 80: 80608068

117. To KF, Chan PK, Chan KF, Lee WK, Lam WY, Wong KF, Tang NL, Tsang DN, Sung RY, Buckley TA, Tarn JS, Cheng AF (2001) Pathology of fatal human infection associated with avian influenza A H5N1 virus. J Med Virol 63: 242-246

118. Treanor JJ, Betts RF, Smith GE, Anderson EL, Hackett CS, Wilkinson BE, Belshe RB, Powers DC (1996) Evaluation of a recombinant hemagglutinin expressed in insect cells as an influenza vaccine in young and elderly adults. J Infect Dis 173: 1467-1470

119. Treanor JJ, Campbell JD, Zangwill KM, Rowe T, Wolff M (2006) Safety and immunogenicity of an inactivated subvirion influenza A (H5N1) vaccine. N Engl J Med 354: 1343-1351

120. Treanor JJ, Schiff GM, Couch RB, Cate TR, Brady RC, Hay CM, Wolff M, She D, Cox MM (2006) Dose-related safety and immunogenicity of a trivalent baculovirus-expressed influenza-virus hemagglutinin vaccine in elderly adults. J Infect Dis 193: 1223-1228

121. Tumpey TM, Renshaw M, Clements JD, Katz JM (2001) Mucosal delivery of inactivated influenza vaccine induces B-cell-dependent heterosubtypic cross-protection against lethal influenza A H5N1 virus infection. J Virol 75: 5141-5150

122. Tumpey TM, Basler CF, Aguilar PV, Zeng H, Solorzano A, Swayne DE, Cox NJ, Katz JM, Taubenberger JK, Palese P, Garcia-Sastre A (2005) Characterization of the reconstructed 1918 Spanish influenza pandemic virus. Science 310: 77-80

123. Vanderlinden E, Goktas F, Cesur Z, Froeyen M, Reed ML, Russell CJ, Cesur N, Naesens L Novel inhibitors of influenza virus fusion: structure-activity relationship and interaction with the viral hemagglutinin. J Virol 84: 4277-4288

124. Vanlandschoot P, Beirnaert E, Neirynck S, Saelens X, Jou WM, Fiers W (1996) Molecular and immunological characterization of soluble aggregated AA/ictoria/3/75 (H3N2) influenza haemagglutinin expressed in insect cells. Arch Virol 141: 17151726

125. Vanlandschoot P, Beirnaert E, Grooten J, Jou WM, Fiers W (1998) pH-dependent aggregation and secretion of soluble monomeric influenza hemagglutinin. Arch Virol 143: 227-239

126. Vercammen E, Staal J, Beyaert R (2008) Sensing of viral infection and activation of innate immunity by toll-like receptor 3. Clin Microbiol Rev 21: 13-25

127. Vesikari T, Fleming DM, Aristegui JF, Vertruyen A, Ashkenazi S, Rappaport R,

128. Washington N, Steele RJ, Jackson SJ, Bush D, Mason J, Gill DA, Pitt K, Rawlins DA (2000) Determination of baseline human nasal pH and the effect of intranasally administered buffers. International journal of pharmaceutics 198: 139-146

129. Weldon WC, Wang BZ, Martin MP, Koutsonanos DG, Skountzou I, Compans RW Enhanced immunogenicity of stabilized trimeric soluble influenza hemagglutinin. PLoS ONE 5

130. Wine JJ, Joo NS (2004) Submucosal glands and airway defense. Proceedings of the American Thoracic Society 1: 47-53

131. Wood JM, Major D, Newman RW, Dunleavy U, Nicolson C, Robertson JS, Schild GC (2002) Preparation of vaccines against H5N1 influenza. Vaccine 20 Suppl 2: S84-87183.184.

132. Yoshikawa T, Matsuo K, Suzuki Y, Nomoto A, Tamura S, Kurata T, Sata T (2004) Total viral genome copies and virus-lg complexes after infection with influenza virus in the nasal secretions of immunized mice. J Gen Virol 85: 2339-2346