Генетическая структура популяций сосны корейской и сосны кедровой европейской и родственные связи видов секции Strobus рода Pinus тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Белоконь, Марьяна Михайловна

• Белоконь, Марьяна Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2007

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Белоконь, Марьяна Михайловна

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Биологические особенности сосен подрода Strobus рода Pinus

1.2. Систематика и межвидовая гибридизация сосен секции Strobus

1.3. Использование генетических маркеров в популяционной генетике хвойных

1.4. Уровни белкового полиморфизма и внутривидовая дифференциация сосен

1.5. Исследования филогенетических связей видов подрода Strobus с помощью молекулярно-генетических маркеров

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Растительный материал. Видовой состав.

Характеристика и локализация выборок

2.2. Хранение материала и подготовка образцов для анализов

2.3. Условия электрофореза

2.4. Изученные изоферментные системы

2.5. Анализ наследования и система обозначений

2.6. Статистические методы

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Аллозимная изменчивость

3.2. Анализ аллельных частот

3.3. Внутрипопуляционная генетическая изменчивость

3.4. Динамика индивидуальной гетерозиготности в популяциях корейской сосны на разных стадиях жизненного цикла

3.5. Межпопуляционная гетерогенность и пространственная дифференциация

3.6. Родственные связи и генетическая дифференциация сосен секции Strobus

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетическая структура популяций сосны корейской и сосны кедровой европейской и родственные связи видов секции Strobus рода Pinus»

За последние сто лет антропогенное давление на биосферу достигло огромных масштабов, что привело к гибели многих видов организмов и исчезновению целых экосистем. Популяционная структура многих видов была нарушена такими процессами, как сокращение численности, фрагментация ареалов, искусственное изменение возрастной и половой структуры популяций, что поставило их на грань вымирания (Алтухов, 1995, 2004). В связи с этим была сформулирована главная задача рационального использования природных ресурсов, состоящая, прежде всего, в сохранении биологического разнообразия через сохранение отдельных видов и их среды обитания.

Леса северного полушария на 70 - 80% состоят из хвойных пород. Хвойные растения, являясь в большинстве своем хозяйственно ценными видами, подвергаются значительному влиянию со стороны человека, что обуславливает необходимость сохранения и восстановления их популяций. Решение этой задачи невозможно без применения знаний о популяционно-генетической структуре видов и основах их адаптивного генетического разнообразия.

Развитие генетики лесных древесных видов за последние десятилетия внесло огромный вклад в селекционную работу, осуществление программ воспроизводства и восстановления природных популяций лесных пород. Охарактеризована генетическая изменчивость множества хозяйственно-ценных видов, а также видов, находящихся под угрозой полного исчезновения. Таким прогрессом генетика лесных древесных растений во многом обязана развитию методов выявления полиморфизма белков и ДНК. Генетические маркеры используются для различных целей, таких как: описание и мониторинг генетического разнообразия в пространстве, включающего как адаптивные, так и нейтральные признаки; выявление ключевых факторов, определяющих динамику генетического разнообразия, например, изучение системы скрещивания, потока генов, истории формирования природных ареалов; исследование родственных связей между различными таксонами; генетическое картирование, поиск локусов контролирующих количественные признаки (QTL) и селекция с помощью маркеров (marker assisted selection, MAS); сертификация и контроль посадочного материала и древесины.

Хвойные растения характеризуются богатым видовым составом, большой протяженностью ареалов, высокой приспособленностью к различным условиям окружающей среды и высокой степенью генетического разнообразия. Благодаря уникальной системе размножения, позволяющей устанавливать наследование и сцепление генных локусов без применения длительных и трудоемких скрещиваний, и возможности одновременного анализа двух поколений (гаплоидные мегагаметофиты и диплоидные зародыши), подробно изучена генетическая изменчивость и процессы, происходящие в популяциях многих видов хвойных.

Актуальность темы. Мониторинг внутривидового разнообразия является одной из наиболее актуальных проблем современной популяционной и природоохранной генетики. Изучение популяций лесных древесных растений представляет не только теоретический, но и прикладной интерес. С применением методов выявления полиморфизма белков и ДНК было показано, что на формирование популяционной структуры сосен влияет ряд факторов, таких как история формирования ареала, система скрещивания, миграция и генные потоки, изоляция и дрейф генов, естественный отбор, а также усиливающееся антропогенное влияние. Несмотря на определенные успехи и практические достижения в этой области, процессы формирования и динамики генофондов экосистемно-образующих видов кедровых сосен, имеющих экономическую ценность, по настоящее время остаются неисследованными. Кроме того, интерес представляет изучение родственных отношений видов секции Strobus рода Pirns. Предпринимавшиеся филогенетические исследования, как традиционные морфологические, так и с применением молекулярно-генетических маркеров, внутри рода Pinus показали однозначную дифференциацию на подроды и секции. Однако, до сих пор не сформировались однозначные взгляды на систематику внутри секции Strobus, поскольку исследования включали небольшое число образцов и давали противоречивые результаты.

Учитывая большую экологическую и хозяйственную ценность сосны корейской и сосны кедровой европейской, а также сложившуюся в последнее время угрозу их генофондам, возникла необходимость исследовать популяционно-генетическую структуру этих видов с различными типами ареалов и историей их формирования, а также проанализировать родственные связи этих видов с другими представителями секции Strobus рода Pirns.

Целью работы явилось изучение аллозимного полиморфизма и дифференциации популяций сосны корейской, Pinus koraiensis Sieb. et Zucc., и сосны кедровой европейской, Pinus cembra L., а также определение их родственных связей с другими видами секции Strobus. Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

- исследовать аллозимную изменчивость двух видов кедровых сосен, сосны корейской и сосны кедровой европейской;

- оценить параметры внутрипопуляционной и межпопуляционной изменчивости для этих двух видов с контрастными типами ареалов;

- сравнить показатели аллозимной изменчивости на разных стадиях жизненного цикла растений (взрослые деревья и зародыши их семян);

- исследовать родственные связи этих сосен с другими представителями секции Strobus.

Научная новизна. Впервые выполнено сравнительное популяционно-генетическое исследование европейской и корейской кедровых сосен на большом количестве популяций из разных частей ареалов с применением большого числа универсальных аллозимных маркеров. Исследованы их связи с пятнадцатью родственными видами - представителями подрода Strobus.

Практическое значение. Данные, представленные в работе, имеют практическую ценность для организаций, занимающихся воспроизводством и охраной генофондов древесных растений. Полученные результаты могут быть использованы Агентством по лесам РФ, ФГУП «Рослесозащита», НИИЛГиС (г.

Воронеж) в разработке программ сохранения и хозяйственного использования этих видов без нанесения урона их генофондам, для сертификации посевного материала при создании семенных плантаций и подбора партий семян для длительного хранения в генетических банках, проверки уровней генетического разнообразия и паспортизации объектов ЕГСК (Единого генетико-селекционного комплекса), идентификации потомства в контролируемых скрещиваниях (в том числе и при межвидовой гибридизации), уточнении границ лесосеменных районов.

Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ (№ 96-04-49465, 99-0448962, 04-04-49795, 05-04-48591), программ Президиума РАН «Динамика генофондов», «Биологические ресурсы России: Фундаментальные основы рационального использования», «Происхождение и эволюция биосферы», а также Программы поддержки ведущих научных школ (НШ-1698.2003.4; НШ-8596.2006.4).

Автор выражает искреннюю признательность и благодарность научным руководителям

Ю.П. Алтухову и Д.В. Политову за всестороннюю помощь и поддержку; П.Н. Разумову, Р. Ханту, Р. Снежко, X. Вангу, Р. Финкельдаю, А.В. Громадину, Ф. Бергманну, Р.Т. Гуту, И. Бладе, С. Н. Горошкевичу и коллективу Хабаровской лесосеменной станции - за предоставленные образцы семян и вегетативных тканей; М.М. Паленовой, Н.Ю. Гордон, Ю.С. Белоконю - за помощь в сборе материала в экспедициях; О.П. Малюченко, Ю.С. Белоконю -за помощь при проведении лабораторных экспериментов. Автор благодарит К.В. Крутовского, Е.А. Салменкову, Д.В. Политова, Ю.С. Белоконя за ценные замечания и обсуждение в ходе подготовки рукописи.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Белоконь, Марьяна Михайловна

127 ВЫВОДЫ

1. На основании анализа изменчивости 30 аллозимных локусов получены оценки уровней генетической изменчивости сосны корейской, Pinus koraiensis Sieb. et Zucc., Дальнего Востока России, Китая и Южной Кореи. Доля полиморфных локусов в 12 популяциях составила от 30% до 43,3%, средняя ожидаемая гетерозиготность - 0,139. Не обнаружено снижения показателей изменчивости с юга на север.

2. Около 97% аллозимной изменчивости сосны корейской относится к внутрипопуляционной. Дифференциация между выборками выражена слабо и не всегда отражает их географическую принадлежность, что объясняется сходством экологических условий на ареале, способствующим

У/ балансирующему отбору/отсутствием серьезных барьеров для миграции.

3. Для популяций сосны кедровой европейской, Pinus cembra L., из разных частей ареала по 30 изученным локусам доля полиморфных составила от 20% до 43,3%), средняя ожидаемая гетерозиготность - 0,101. Более низкие значения показателей изменчивости, чем у сосны корейской, объясняются инбридингом в условиях сокращения и фрагментации ареала. В двух альпийских популяциях проявилась тенденция к снижению показателей генетической изменчивости по сравнению с тремя популяциями из Восточных Карпат.

4. У P. cembra 92,5%) аллозимной изменчивости относится к внутрипопуляционной. Межпопуляционные различия выше, чем у видов с непрерывными ареалами, однако даже между полностью изолированными частями ареала они не столь высоки, как можно предполагать исходя из изоляции и дрейфа генов. Вероятно имеет место действие сходных векторов отбора, выравнивающего частоты. Дифференциация между альпийскими выборками выражена более слабо, чем между карпатскими, что отражает особенности формирования ареала этого вида.

5. При анализе возрастной динамики гетерозиготности в трех популяциях P. koraiensis обнаружена высокая степень инбридинга у зародышей семян. В одной выборке отмечено близкое к равновесному распределение генотипов. У взрослых деревьев во всех выборках выявлен избыток гетерозигот по сравнению с равновесием Харди - Вайнберга. Это свидетельствует о проявлении действия балансирующего отбора в пользу гетерозигот и против инбредного потомства.

6. Анализ семнадцати видов сосен по частотам^ аллозимных локусов показал высокую степень дифференциации между секциями внутри подрода Strobus и отсутствие четкого деления на подсекции Strobi и Cembrae внутри секции Strobus, Кластеризация видов отражает их географическое распространение.

7. Представители подсекции Cembrae формируют два кластера. Один кластер включает P. cembra и P. sibirica, недавно дивергировавших от одного общего предка и сохранивших схожие частоты аллелей, за исключением отличий по аллельному составу нескольких локусов. К нему примыкает Р. albicaulis. В другом кластере - генетически близкие P. koraiensis и P. pumila, сходство которых может быть отражением как происхождения от одного общего предка, так и межвидовой гибридизации в прошлом.

8. Разновидности P. armandii (подсекц. Strobi) генетически различаются на порядок величин больше, чем популяции P. koraeinsis, но не имеют диагностических аллелей. В отдельную группу выделяются P. morrisonicola и P. armandii var. mastersiana с о. Тайвань, что отражает их долговременную изоляцию от континентальной части и вероятный обмен генами между ними.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На основании изоферментного анализа мегагаметофитов и зародышей семян, а также вегетативных тканей, проведен анализ генетического разнообразия сосны корейской и сосны кедровой европейской на их ареалах. Получены данные о пространственной генетической дифференциации популяций этих видов. Слабая дифференциация популяций сосны корейской объясняется как генными потоками между ними, так и, в большей мере, стабилизирующим отбором, действующим на закрепление оптимального соотношения частот аллелей в сходных условиях среды обитания. Подобные процессы имеют место и в популяциях европейской кедровой сосны, однако, в случае разрозненных и малочисленных карпатских популяций возрастает роль таких факторов, как изоляция и инбридинг.

Обнаружены недостаток гетерозигот на ранней стадии жизненного цикла (зародыши) и избыток гетерозигот, по сравнению с равновесием Харди -Вайнберга, у взрослых деревьев корейской сосны. Недостаток гетерозигот возникает вследствие самоопыления и перекрестного опыления между родственными особями. С возрастом гетерозиготность возрастает за счет элиминации инбредных особей и под действием балансирующего отбора, поддерживающего среднюю гетерозиготность популяции, оптимальную для данных условий обитания.

Анализ частот аллелей изоферментных локусов у семнадцати видов сосен подрода Strobus показал четкое разделение на секции, что соответствует современной систематике. Внутри секции Strobus не обнаружено выраженного деления на подсекции, однако отмечена близость кедровых сосен между собой. Учитывая общность происхождения, историю распространения и биологические особенности видов, а также данные мировой литературы о естественной гибридизации современных видов, можно предположить, что эволюция в секции Strobus рода Pinus идет не только путем дивергенции, но и межвидовой гибридизации (ретикулярная эволюция).

Полученные данные представляют теоретический интерес, поскольку они позволяют подойти к познанию факторов формирования современного уровня генетического разнообразия видов и популяций, а также картины внутри- и межвидовой генетической дифференциации у хвойных. Результаты должны учитываться в практике лесного хозяйства при планировании лесохозяйственных мероприятий, уточнении границ лесосеменных районов, генетической сертификации и паспортизации, охране генофондов кедровых сосен, селекции, включая межвидовую гибридизацию.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Белоконь, Марьяна Михайловна, 2007 год

1. Алтухов Ю. П. Внутривидовое генетическое разнообразие: мониторинг и принципы сохранения // Генетика. 1995. Т. 31. № 10. С. 1333-1357.

2. Алтухов Ю. П. Аллозимная гетерозиготность, скорость полового созревания и продолжительность жизни // Генетика. 1998. Т. 34. № 7. С. 908-919.

3. Алтухов Ю. П., Салменкова Е. А. Полиморфизм ДНК в популяционной генетике // Генетика. 2002. Т. 38. № 9. С. 1173-1195.

4. Алтухов Ю. П. Генетические процессы в популяциях. М.: Наука, 2003. 431 с.

5. Алтухов Ю. П. (под ред.). Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях. М.: Наука, 2004. 619 с.

6. Бобров Е. Г. Лесообразующие хвойные СССР. Москва: Наука, 1978. 190 с.

7. Беликов А. В., Потенко В. В. Генетические ресурсы сосны корейской на Дальнем Востоке России: теоретические основы и прикладные аспекты. Москва: Наука, 2006. 174 с.

8. Гончаренко Г. Г., Силин А. Е. Популяционная и эволюционная генетика сосен Восточной Европы и Сибири. Минск: Тэхналопя, 1997. 191 с.

9. Гончаренко Г. Г. Геносистематика и эволюционная филогения лесообразующих хвойных Палеарктики. Минск: Тэхналопя, 1999. 192 с.

10. Гончаренко Г. Г. Генный поток в природных популяциях сосен (Палеарктика) //Лесоведение. 2002. № 4. С. 30-36.

11. Гончаренко Г. Г., Падутов В. Е., Поджарова 3. С., Крутовский К. В. Генетическая изменчивость у кедровой сосны сибирской // Доклады Академии наук БССР. 1987. Т. 31. № 9. С. 848-851.

12. Гончаренко Г. Г., Падутов В. Е., Крутовский К. В., Поджарова 3. С., Киргизов Н. Ю., Политов Д. В. Уровень генетической изменчивости у Pinus sibirica на Алтае // Доклады академии наук СССР. 1988. Т. 299. № 1. С. 222-225.

13. Гончаренко Г. Г., Падутов В. Е., Силин А. Е. Степень генетической подразделенности и дифференциации в природных популяциях кедровых сосен // Доклады Академии Наук СССР. 1991. Т. 317. № 6. С. 1477-1483.

14. Гончаренко Г. Г., Падутов В. Е., Силин А. Е. Генетическая изменчивость и дифференциация у Pinus pumila (Pall.) Regel в популяциях Чукотки и Сахалина //Генетика. 1992а. Т. 28. № 7. С. 107-119.

15. Гончаренко Г. Г., Падутов В. Е., Силин А. Е. Генетическая структура, изменчивость и дифференциация в популяциях Pinus sibirica Du Tour // Генетика. 1992b. Т. 28. № 10. С. 114-128.

16. Гончаренко Г. Г., Силин А. Е., Падутов В. Е. Исследование генетической структуры и уровня дифференциации у Pinus sylvestris L. в центральных и краевых популяциях Восточной Европы и Сибири // Генетика. 1993. Т. 29. № 12. С. 2019-2038.

17. Гончаренко Г. Г., Падутов В. Е., Пауле JI. Геносистематика и эволюционная филогения хвойных Палеарктики. II. Геносистематика и филогения пятихвойных сосен // Проблемы лесоведения и лесоводства: Сб. науч. тр. Гомель: Ин-т леса НАН Б, 2000. С. 115-136.

18. Горошкевич С. Н. О межвидовых взаимоотношениях российских видов Pinus из группы Cembrae в зонах перекрытия их ареалов // Проблемы вида и видообразования. 2000. С. 36-38.

19. Денисова JI. В. Кедровая сосна европейская // Красная книга СССР. М.: Лесная промышленность, 1984. С. 308 309.

20. Каппер О. Г. Хвойные породы (лесоводственная характеристика). М.: Гослесбумиздат, 1954.304 р.

21. Козубов Г. М., Муратова Е. Н. Современные голосеменные. Л.: Наука, 1987. 192 с.

22. Колесников Б. П. Интересные флористические находки в связи с историей растительного покрова в бассейне р. Горин // Вестник ДВФ АН СССР. 1935. №14.

23. Колесников Б. П. Кедровые леса Дальнего Востока. М.-Л.: Изд-во АН СССР, 1956. 262 р.

24. Коропачинский И. Ю., Милютин Л. И. Естественная гибридизация древесных растений. Новосибирск: Академическое издательство Тео", 2006. 223 с.

25. Крутовский К. В., Политов Д. В. Изучение меж- и внутривидовой дифференциации кедровых сосен Евразии с использованиемизоферментных локусов и многомерного анализа. // Молекулярные механизмы генетических процессов. Москва: Наука, 1992. С. 87-96.

26. Крутовский К. В., Политов Д. В., Алтухов Ю. П. Генетическая изменчивость сибирской кедровой сосны Pinus sibirica Du Tour, сообщение I. Механизмы генного контроля изоферментных систем // Генетика. 1987. Т. 23. № 12. С. 2216-2228.

27. Крутовский К. В., Политов Д. В., Алтухов Ю. П. Межвидовая генетическая дифференциация кедровых сосен Евразии по изоферментным локусам // Генетика. 1990. Т. 26. № 4. С. 694-707.

28. Крылов Г. В., Таланцев Н. К., Козакова Н. Ф. Кедр. М.: Лесная промышленность, 1983. 216 с.

29. Крюссман Г. Хвойные породы. М.: Лесная промышленность, 1986. 256 с.

30. Куприянова Л. А., Литвинцева М. В. Группа Cembra рода Pinus, ее объем и связи по палинологическим данным // Ботанический журнал. 1974. Т. 59. № 5. С. 630-644.

31. Литвинцева М. В. Особенности строения клеток паренхимы хвои у видов группы Cembra рода Pinus // Ботанический журнал. 1974. Т. 59. № 10. С. 1501-1505.

32. Малюченко О. П., Политов Д. В., Белоконь Ю. С., Белоконь М. М. Генетическая дифференциация кедрового стланика (Pinus pumila (Pall.) Regel в Прибайкалье // Жизнь популяций в гетерогенной среде. Йошкар-Ола: Периодика Марий Эл, 1998. С. 38-45.

33. Муратова Е. Н., Круклис М. В. Хромосомные числа голосеменных растений. Новосибирск: Наука. Сиб. отделение, 1988. 118 с.

34. Муратова Е. Н. Кариотипы сосен группы Cembra // Ботанический журнал. 1980. Т. 65. №8. С. 1130-1138.

35. Нейштадт М. И. О корейском кедре на советском Дальнем Востоке, как "реликте" третичного времени // Доклады академии наук СССР. 1952. Т. 86. № 2. С. 425-428.

36. Нейштадт М. И. История растительного покрова СССР по данным пыльцевого анализа//Вопросы ботаники. М.: Изд-во АН СССР, 1954. С. 575-590.

37. Нейштадт М. И. История лесов и палеогеография СССР в голоцене. М.: Изд-во АН СССР, 1957. 404 с.

38. Некрасова Т. П. Пыльца и пыльцевой режим хвойных Сибири. Новосибирск: Наука, 1983.169 с.

39. Некрасова Т. П. Изменчивость числа семян в шишках сосны от опыления //Лесоведение. 1986. № 1. С. 38-44.

40. Лрко Я. В. Популяцшно-генетична мшливють трьох коршних вид1в роду Pinus L. в Украшських Карпатах i Розточчь Дисертащя на здобуттянаукового ступеня кандидата бюлопчних наук. Кшв: 1нститут кштинной бюлогп i генетично1шженерп, 2001. 187 с.

41. Пирко Я. В., Коршиков И. И. Генетический контроль изоферментов сосны кедровой европейской {Pinus cembra L.) Украинских Карпат // Цитология и генетика. 2001. № 4. С. 33-37.

42. Подогас А. В. Генетическая дифференциация рода Pinus по аллозимным локусам. Диссертация канд. биол. наук. Москва: Институт общей генетики им. Н. И. Вавилова, 1993. 154 с.

43. Подогас А. В., Шурхал А. В., Семериков В. Л., Ракицкая Т. А. Генетическая изменчивость ферментов хвои сосны кедровой сибирской {Pinus sibirica Du Tour) // Генетика. 1991b. Т. 27. № 4. С. 695-703.

44. Политов Д. В. Аллозимный полиморфизм, генетическая дифференциация и система скрещивания сибирской кедровой сосны Pinus sibirica Du Tour. Диссертация . канд. биол. наук. Москва,: Институт общей генетики им. Н.И. Вавилова АН СССР, 1989. 190 с.

45. Политов Д. В., Крутовский К. В. Генетическая изменчивость сибирской кедровой сосны Pinus sibirica Du Tour, сообщение V. Анализ системы скрещивания//Генетика. 1990. Т. 26. № 11. С. 1309-1316.

46. Политов Д. В. Древесные растения // Динамика популяционных генофондов при антропогенных воздействиях. М.: Наука, 2004. С. 295351.

47. Политов Д. В., Крутовский К. В., Алтухов Ю. П. Характеристика генофондов популяций кедровых сосен по совокупности изоферментных локусов // Генетика. 1992. Т. 28. № 1. с. 93-114.

48. Политов Д. В., Белоконь М. М., Белоконь Ю. С. Динамика аллозимной гетерозиготности в дальневосточных популяциях кедрового стланика Pinus pumila (Pall.) Regel: сравнение зародышей и материнских растений //Генетика. 2006. Т. 42. № 10. С. 1348-158.

49. Потенко В. В., Беликов А. В. Генетическая изменчивость и дифференциация природных популяций корейской кедровой сосны на российском Дальнем Востоке // Лесоведение. 1999. № 4. С. 10-15.

50. Потенко В. В., Беликов А. В. Генетическая изменчивость и система скрещивания Pinus koraiensis Sieb. et Zucc // Лесоведение. 2002. № 4. С. 44-52.

51. Потенко В. В., Попков Б. В. Генетическая изменчивость и филогенетические взаимоотношения сосны густоцветковой и сосны могильной // Лесоведение. 2003. № 6. С. 34-41.

52. Санников С. Н., Гришина И. В. Экспериментальное изучение разлета пыльцы сосны в древостое // Экология. 1979. № 1. С. 91-93.

53. Серов О. Л., Корочкин Л. И., Манченко Г. П. Электрофоретические методы исследования изоферментов // Генетика изоферментов. М.: Наука, 1977. С. 23 64.

54. Смаглюк К. К. Аборигенш хвойш люоутворювачь Ужгород: Карпати, 1972. 112 с.

55. Сукачёв В. Н. Дендрология с основами лесной геоботаники. М.- Л.: Гослестехиздат, 1938. 574 с.

56. Титов Е. В. Опыт скрещивания кедра сибирского с другими соснами в условиях северо-восточного Алтая // Лесоведение. 1977. Т. 4. С. 81-87.

57. Титов Е. В. Межвидовая гибридизация кедровых сосен // Гибридизация лесных древесных пород. Воронеж: Гос. ком. СССР по лесу, ЦНИИЛГиС, 1988. С. 76-84.

58. Третьякова И. Н. Эмбриология хвойных. Новосибирск: Наука, 1990. 156 с.

59. Удра И. Ф. Расселение растений и вопросы палео- и биогеографии. Киев: Наукова Думка, 1988. 200 с.

60. Урусов В. М. Сосны и сосняки Дальнего Востока. Владивосток: Тихоокеанский институт географии ДВО РАН, 1999. 385 с.

61. Шурхал А. В., Подогас А. В., Животовский Л. А. Филогенетический анализ рода Pinus по аллозимным локусам. Генетическая дифференциация подродов//Генетика. 1991. Т. 27. № 5. С. 1193-1205.

62. Nomenclature Committee of the International Union of Biochemistry. Enzyme nomenclature. Academic Press, Orlando, 1984. p.

63. Aagaard J. E., Krutovskii К. V., Strauss S. H. RAPDs and allozymes exhibit similar levels of diversity and differentiation among populations and races of Douglas-fir//Heredity. 1998. V. 81. P. 69-78.

64. Allendorf F. W., Knudsen K. L., Blake G. M. Frequencies of null alleles et enzyme loci in natural populations of ponderosa and red pine // Genetics. 1982. V. 100. №.3. P. 497-504.

65. Andresen J. W., Steinhoff R. J. The taxonomy of Pinus flexilis and P. strobiformis //Phytologia. 1971. V. 22. P. 57-70.

66. Beaulieu J., Simon J.-P. Inheritance and linkage relationships of allozymes in Pinus strobus L. // Silvae Genetica. 1994a. V. 43. №. 4. P. 253-261.

67. Beaulieu J., Simon J.-P. Genetic structure and variability in Pinus strobus in Quebec // Canadian Journal of Forest Research. 1994b. V. 24. P. 1726-1733.

68. Belletti P., Gullace S. Biodiversita' e struttura genetica in popolazioni di pino cembro e pino silvestre dell'arco alpino occidentale // Sherwood Foreste ed Albergi Oggi. 1999. V. 5. №. 5. P. 11-16.

69. Bergmann F., Hattemer H. H. Isozyme gene loci and their allelic variation in Pinus sylvestris L and Pinus cembra L // Silvae Genetica. 1995. V. 44. №. 5-6. P. 286-289.

70. Betancourt J. L., Schuster W. S., Mitton J. В., Anderson R. S. Fossil and genetic history of a piny on pine (Pinus edulis) isolate // Ecology. 1991. V. 72. №. 5. P. 1685-1697.

71. Bingham R. T. Taxonomy, crossability, and relative blister rust resistance of 5-needled white pines // Biology of Rust Resistance in Forest Trees. Washington, DC: U.S. Department of Agriculture, 1972. P. 271-280.

72. Bingham R. Т., Hoff R. J., Steinhoff R. J. Genetics of western white pine. Washington, DC: USDA Forest Service, 1972. 28 p.

73. Blada I. Analysis of genetic variation in a Pinus strobus x P. griffithii Fl-hybrid population // Silvae Genetica. 1992. V. 41. №. 4-5. P. 282-289.

74. Blada I. Interspecific hybridization of Swiss stone pine (Pinus cembra L.) // Silvae Genetica. 1994. V. 43. №. 1. P. 14-20.

75. Blada I. Genetic variation in blister rust resistance and growth traits in Pinus strobus x P. рейсе hybrid at age 17 (experiment 1) // Forest Genetics. 2000. V. 7. №. 2. P. 109-120.

76. Boys J., Cheriy M., Dayanandan S. Microsatellite analysis reveals genetically distinct populations of red pine (Pinus resinosa, Pinaceae) // American Journal of Botany. 2005. V. 92. №. 5. P. 833-841.

77. Bruederle L. P., Tomback D. F., Kelly К. K., Hardwick R. C. Population genetic structure in a bird-dispersed pine, Pinus albicaulis (Pinaceae) // Canadian Journal of Botany. 1998. V. 76. №. 1. P. 83-90.

78. Buchert G. P., Rajora O. P., Hood J. V., Dancik B. P. Effects of harvesting on genetic diversity in old growth eastern white pine in Ontario, Canada // Conservation Biology. 1997. V. 11. №. 3. P. 747-758.

79. Cheliak W. M., Pitel J. A. Techniques for starch gel electrophoresis of enzymes from forest tree species. Chalk River, Ontario: Petawawa National Forestry Institute, 1984. 49 p.

80. Choi W., Suh G., Yeo J., Так W. Genetic variation and structure of Korean pine (Pinus koraiensis) among the populations from Manchuria and Korea // Research Report of the Forest Genetics Research Institute (Kyonggido). 1995. V.№. No. 31. P. 30-41.

81. Clayton J. W., Tretiak D. N. Amino-citrate buffers for pH control in starch gel electrophoresis // Journal of Fisheries Research Board Canada. 1972. V. 29. P. 1169-1172.

82. Conkle M. Т., Hodgskiss P. O., Nunnally L. В., Hunter S. C. Starch gel electrophoresis of conifer seeds: a laboratory manual. Berkeley. California: U.S. Dep. Agric. Forest Serv. GTR PSW-64, 1982. 18 p.

83. Critchfield W. В., Little E. L. Geographic distribution of the pines of the world. Washington, D. C.: U. S. Department of Agriculture Misc. Publ. 991, 1966. 98 p.

84. Critchfield W. B. Hybridization and classification of the white pines (Pinus section Strobus) II Taxon. 1986. V. 35. №. 4. P. 647-656.

85. Critchfield W. В., Kinloch В. B. Sugar pine and its hybrids // Silvae Genetica.1986. V. 35. №. 4. P. 138-145.

86. Delgado P., Pinero D., Chaos A., Perez-Nasser N., Alvarez-Buylla E. R. High population differentiation and genetic variation in the endangered Mexican pine Pinus rzedowskii (Pinaceae) // American Journal of Botany. 1999. V. 86. №. 5. P. 669-676.

87. El-Kassaby Y. A., Meagher M. D., Parkinson J., Portlock F. T. Allozyme inheritance, heterozygosity and outcrossing rate among Pinus monticola near Ladysmith, British Columbia//Heredity. 1987. V. 58. №. 2. P. 173-181.

88. Farjon A. Pines: Drawings and descriptions of the genus Pinus. Leiden: Brill, Buckhuiys, 1984. p.

89. Felsenstein J. PHYLIP Phylogeny Inference Package (Version 3.2) // Cladistics. 1989. V. 5. P. 164-166.

90. Florin R. The systematics of the gymnosperms // A century of progress in the natural science 1853—1953. San Francisco: 1955. P. 323-403.

91. Fowler D. P., Heimburger С. C. Genetic improvement of red pine and eastern white pine // Forestry Chronicle. 1969. V. 45. №. 6. P. 414-420.

92. Fowler D. P., Morris R. W. Genetic diversity in red pine: evidence for low genie heterozygosity // Canadian Journal of Forest Research. 1977. T. 7. C. 343 347.

93. Furnier G. R., Knowles P., Aleksiuk M. A., Dancik B. P. Inheritance and linkage of allozymes in seed tissue of whitebark pine // Canadian Journal of Genetics and Cytology. 1986. V. 28. №. 4. P. 601-604.

94. Furnier G. R., Knowles P., Clyde M. A., Dancik B. P. Effects of avian seed dispersal on the genetic structure of whitebark pine populations // Evolution.1987. V. 41. №. 3. P. 607-612.

95. Gernandt D. S., Lopez G. G., Garcia S. O., Liston A. Phylogeny and classification of Pinus // Taxon. 2005. V. 54. №. 1. P. 29-42.

96. Hamrick J. L. The distribution of genetic variation within and among natural plant populations // Genetics and Wild Population Management. 1983. V. P. 335-348.

97. Hamrick J. L., Godt M. J. W. Allozyme diversity in plant species // Differentiation Patterns in Higher Plants. New York: Academic Press, 1989. P. 53-67.

98. Hamrick J. L., Godt M. J., Sherman-Broyles S. Factors influencing levels of genetic diversity in woody plant species //New Forests. 1992. V. 6. P. 95-124.

99. Hamrick J. L., Schnabel A., Wells P. V. Distribution of genetic diversity within and among populations of Great Basin conifers // Natural History of the Colorado Plateau and Great Basin. Niwot, Colorado: University Press of Colorado, 1994. P. 147-161.

100. Hancock J. M. Microsatellites and other simple sequences: genomic context and mutational mechanisms // Microsatellites. Evolution and application. N. Y.: Oxsford Univ. press, 1999. P. 1-9.

101. Hiebert R. D., Hamrick J. L. Patterns and levels of genetic variation in Great Basin bristlecone pine, Pinus longaeva I I Evolution. 1983. V. 37. №. 2. P. 302310.

102. Holzer K. Genetics of Pinus cembra L11 Annales Forestales (Zagreb). 1975. V. VI/5.P. 139-158.

103. Hutchins H. E., banner R. M. The central role of Clark's nutcracker in the dispersal and establishment of whitebark pine // Oecologia. 1982. V. 55. №. 6. P. 192-201.

104. Jorgensen S., Hamrick J. L., Wells P. V. Regional patterns of genetic diversity in Pinus flexilis (Pinaceae) reveal complex species history // American Journal of Botany. 2002. V. 89. №. 5. P. 792-800.

105. Jorgensen S. M., Hamrick J. L. Biogeography and population genetics of whitebark pine, Pinus albicaulis И Canadian Journal of Forest Research. 1997. V. 27. №. 10. P. 1574-1585.

106. Kim Z.-S., Lee S.-W., Lim J.-H., Hwang J.-W., Kwon K.-W. Genetic diversity and structure of natural populations of Pinus koraiensis (Sieb. et Zucc.) in Korea // Forest Genetics. 1994. V. 1. №. 1. P. 41-49.

107. Kim Z. S., Son W. H., Youn Y. K. Inheritance of leucine-aminopeptidase and glutamate-oxaloacetate transaminase isozymes in Pinus koraiensis II Korean Journal of Genetics. 1982. V. 4. P. 25-31.

108. Kim Z. S., Hwang J. W., Lee S. W., Yang C., Gorovoy P. G. Genetic variation of Korean pine (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.) at allozyme and RAPD markers in Korea, China and Russia I I Silvae Genetica. 2005. V. 54. №. 4-5. P. 235-246.

109. Koski V. On self-fertilization genetic load and subsequent inbreeding in some conifers // Communicationes Instituti Forestalis Fenniae. 1973. V. 78. №. 10. P. 1-40.

110. Krakowski J., Aitken S. N., El-Kassaby Y. A. Inbreeding and conservation genetics in whitebark pine // Conservation Genetics. 2003. V. 4. №. 5. P. 581593.

111. Kriebel H. B. Pinus strobus and introduced Asian and European species // White pines in North and Central America. U.S. Department of Agriculture, Miscellaneous Publication 1221. Washington, DC.: 1972. P. 201-214.

112. Krutovskii К. V., Vollmer S. S., Sorensen F. C., Adams W. Т., Knapp S. J., Strauss S. H. RAPD genome maps of Douglas-fir // Journal of Heredity. 1998. V. 89. №.3. P. 197-205.

113. Ledig F. Т., Conkle M. T. Gene diversity and genetic structure in a narrow endemic, Torrey pine (Pinus torreyana Parry ex Carr) // Evolution. 1983. V. 37. №. l.P. 79-85.

114. Ledig F. T. Genetic variation in Pinus // Ecology and Biogeography of Pinus. Cambridge, UK: Cambridge University Press, 1998. P. 251-280.

115. Lee S. W., Choi W. Y., Norbu L., Pradhan R. Genetic diversity and structure of blue pine (Pinus wallichiana Jackson) in Bhutan // Forest Ecology and Management. 1998. V. 105. №. 1-3. P. 45-53.

116. Lee S. W., Ledig F. Т., Johnson D. R. Genetic variation at allozyme and RAPD markers in Pinus longaeva (Pinaceae) of the White Mountains, California // American Journal of Botany. 2002. V. 89. №. 4. P. 566-577.

117. Lewandowski A. Inheritance and linkage of allozymes in Pinus armandii Franch. // Silvae Genetica. 2000. V. 49. №. 2. P. 79-82.

118. Lewandowski A., Burczyk J. Mating system and genetic diversity in natural populations of European larch (Larix decidua) and stone pine {Pinus cembra) located at higher elevations // Silvae Genetica. 2000. V. 49. №. 3. P. 158-161.

119. Li В., Gu W. C. Distribution of natural resources and research review on Pinus bungeana II Forest Research, Beijing. 2003. V. 16. №. 2. P. 28-36.

120. Li В., Gu W. C., Chen X. Y. Allozyme genetic diversity and conservation strategy of ten natural populations of Pinus bungeana Zucc. ex Endl // Forestry Studies in China. 2003. V. 5. №. 4.

121. Liston A., Robinson W. A., Pinero D., Alvarez-Buylla E. R. Phylogenetics of Pinus (Pinaceae) based on nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer region sequences // Molecular Phylogenetics and Evolution. 1999. V. 11. №. 1. P. 95-109.

122. Liston A., Gernandt D. S., Vining T. F., Campbell C. S., Pinero D. Molecular phylogeny of Pinaceae and Pinus II International Conifer Conference. International Society for Horticultural Science, Brugge.Acta Hort. No.615., 2003. P. 107-114

123. Manchenko G. P. Handbook of detection of enzymes on electrophoretic gels. CRC Press, Inc., USA, 1994. 574 p.

124. Markert C. L., Faulhaber I. Lactate dehydrogenase isozyme patterns in fish // J. Exp. Zool. 1965. V. 159. №. 2. P. 319-332.

125. Mirov N. T. The genus Pinus. New York: The Ronald Press Company, 1967. 602 p.

126. Molina-Freaner F., Delgado P., Pinero D., Perez-Nasser N., Alvarez-Buylla E. Do rare pines need different conservation strategies? Evidence from three Mexican species // Canadian Journal of Botany. 2001. V. 79. №. 2. P. 131-138.

127. Morris R. W., Spieth P. T. Sampling strategies for using female gametophytes to estimate heterozygosities in conifers // Theoretical and Applied Genetics. 1978. V. 51. P. 217-222.

128. Mosseler A., Innes D. J., Roberts B. A. Lack of allozymic variation in disjunct Newfoundland populations of red pine {Pinus resinosa) // Canadian Journal of Forest Research. 1991. V. 21. №. 4. P. 525-528.

129. Muona O., Yazdani R., Rudin D. Genetic change between life stages in Pinus sylvestris: allozyme variation in seeds and planted seedlings // Silvae Genetica. 1987. V. 36. №. 1. P. 39-42.

130. Nei M. Genetic distance between populations // The American Naturalist. 1972. V. 106. P. 283-292.

131. Nei M. F-statistics and analysis of gene diversity in subdivided populations // Ann. Human Genetics. 1977. V. 41. P. 225-233.

132. Nei M. Molecular evolutionary genetics. N. Y.: Columbia Univ. press, 1987. 512 p.

133. Oline D. K., Mitton J. В., Grant M. C. Population and subspecific genetic differentiation in the foxtail pine {Pinus balfouriana) II Evolution. 2000. T. 54. № 5. C. 1813-1819.

134. Park Y. G. Inheritance of leucine aminopeptidase, esterase and peroxidase isozymes in Pinus koraiensis // Korean Journal of Breeding. 1983. V. 15. №. 2. P. 147-153.

135. Peakall R., Smouse P. E. GenAIEx V6: Genetic Analysis in Excel. Population Genetic Software for Teaching and Research // Molecular Ecology Notes. 2006. V. 6. №. l.P. 288-295.

136. Plessas M. E., Strauss S. H. Allozyme differentiation among populations stands and cohorts in Monterey pine // Canadian Journal of Forest Research. 1986. V. 16. №. 6. P. 1155-1164.

137. Politov D. V. Coniferous forests of Baikal Lake region: native population genetic structure and human impact. UNESCO Programme on Man and the Biosphere (MAB), MAB Young Scientist Research Award Scheme Final Scientific Report, 1998. p.

138. Potenko V. V., Velikov A. V. Genetic diversity and differentiation of natural populations of Pinus koraiensis (Sieb. et Zucc.) in Russia // Silvae Genetica. 1998. V. 47. №. 4. P. 202-208.

139. Potenko V. V., Velikov A. V. Allozyme variation and mating system of coastal populations of Pinus koraiensis Sieb. et Zucc. in Russia // Silvae Genetica. 2001. V. 50. №.3-4. P. 117-122.

140. Agriculture, Forest Service, Rocky Mountain Research Station., 2004. P. 192200.

141. Premoli A. C. South American temperate conifer species a Larger list // Biodiversity and Conservation. 1994. V. 3. №. 3. P. 295-297.

142. Price R., Liston A., Strauss S. H. Phylogeny and systematics of Pinus // Ecology and biogeography of Pinus. Cambrige University Press, 1998. P. 4968.

143. Prus-Glowacki W., Stephan B. R. Genetic variation of Pinus sylvestris from Spain in relation to other European populations // Silvae Genetica. 1994. V. 43. №. l.P. 7-14.

144. Prus-Glowacki W., Stephan B. R., Bujas E., Alia R., Marciniak A. Genetic differentiation of autochthonous populations of Pinus sylvestris (Pinaceae) from the Iberian peninsula // Plant Systematics and Evolution. 2003. V. 239. №. 1-2. P. 55-66.

145. Rajora O. P., DeVerno L., Mosseler A., Innes D. J. Genetic diversity and population structure of disjunct Newfoundland and central Ontario populations of eastern white pine (Pinus strobus) II Canadian Journal of Botany. 1998. V. 76. №. 3. P. 500-508.

146. Ridgeway Y. J., Sherburne S. W., Lewis R. D. Polymorphisms in the esterases of Atlantic herring // Transactions of the American Fisheries Society. 1970. V. 99. P. 147-151.

147. Rogers D. L., Millar С. I., Westfall R. D. Fine-scale genetic structure of whitebark pine (Pinus albicaulis): Associations with watershed and growth form // Evolution. 1999. V. 53. №. 1. P. 74-90.

148. Ryu J. В., Eckert R. T. Foliar isozyme variation in twenty seven provenances of Pinus strobus L.: genetic diversity and population structure // Proceedings of the 28th Northeastern Forest Tree Improvement Conference. Durham N.H.: 1983. P. 249-261.

149. Sato T. Morphological variation of cones and ovuliferous scales in Pinus Subgenus Haploxylon on Mt. Tateyama, Toyama Pref., Japan // J. Jpn. Bot. 1993a. V.68.P. 277-288.

150. Sato T. Seed morphology of Pinus Subgenus Haploxylon on Mt. Tateyama, Toyama Prefecture, Japan // J. Phytogeogr. & Taxon. 1993b. V. 41. P. 7-13.

151. Sato T. Multivariative analysis of needle size and its anatomical traits of Pinus Subgenus Haploxylon (soft pines) on Mt. Tateyama, Toyama Prefecture, Japan // J. Jpn. Bot. 1995. V. 70. P. 253-259.

152. Saylor L. C. Karyotype analysis of the genus Pinus subgenus Strobus II Silvae Genetica. 1983. V. 32. P. 119-124.

153. Schuster W. S., Alles D. L., Mitton J. B. Gene flow in limber pine: evidence from pollination phenology and genetic differentiation along elevational transect // American Journal of Botany. 1989. V. 76. №. 9. P. 1395-1403.

154. Schuster W. S. F., Mitton J. B. Paternity and gene dispersal in limber pine (Pinusflexilis James) // Heredity. 2000. V. 84. №. 3. P. 348-361.

155. Shaw G. R. The genus Pinus // Arnold Arboretum Pub. 1914. P. 1-96.

156. Shurkhal A., Podogas A., Zhivotovsky L. Allozyme differentiation in the genus Pinus II Silvae Genetica. 1992. V. 41. №. 2. P. 105-109.

157. Simon J. P., Bergeron Y., Gagnon D. Isozyme uniformity in populations of red pine (Pinus resionosa) in the Abitibiti region, Quebec // Canadian Journal of Forest Research. 1986. V. 16. №. 5. P. 1133-1135.

158. Slatkin M. Gene flow in natural populations // Annual Review of Ecology and Systematics. 1985. V. 16. P. 393-430.

159. Smithies O. Zone electrophoresis in starch gels: group variation in the serum proteins of normal human adults // Biochem. J. 1955. V. 61. P. 629 641.

160. StatSoft I. STATISTIC A for Windows Computer program manual. Tulsa, OK: StatSoft, Inc., 1998. p.

161. Steinhoff R., Joyce D., Fins L. Isozyme variation in Pinus monticola II Canadian Journal ofForest Research. 1983. V. 13. №. 6. P. 1122-1131.

162. Steinhoff R. J., Andresen J. W. Geographic variations in Pinus flexilis and Pinus strobiformis and its bearing on their taxonomic status I I Silvae Genetica. 1971. V. 20. №. 5-6. P. 159-167.

163. Swofford D. L., Selander R. B. BIOSYS-1: a FORTRAN program for the comprehensive analysis of electrophoretic data in population genetics and systematics // Journal of Heredity. 1981. V. 72. P. 281-283.

164. Szmidt A. E. Genetic variation in isolated populations of stone pine (Pinus cembra) И Silva Fennica. 1982. V. 16. №. 2. P. 196-200.

165. Szmidt A. E., Wang X. R. Molecular systematics and genetic differentiation of Pinus sylvestris (L) and P. densiflora (Sieb. et Zucc.) I I Theoretical and Applied Genetics. 1993. V. 86. №. 2-3. P. 159-165.

166. Tani N., Tomaru N., Araki M., Ohba K. Genetic diversity and differentiation in populations of Japanese stone pine (Pinus pumila) in Japan // Canadian Journal ofForest Research. 1996. V. 26. №. 8. P. 1454-1462.

167. Tani N., Maruyama K., Tomaru N., Uchida K., Araki M., Tsumura Y., Yoshimaru H., Ohba K. Genetic diversity of nuclear and mitochondrial genomes in Pinus parviflora Sieb. & Zucc. (Pinaceae) populations // Heredity. 2003. V. 91. №.5.

168. Tomaru N., Tsumura Y., Ohba K. Inheritance of isozyme variants in Korean pine (Pinus koraiensis) II Journal of Japanese Forestry Society. 1990. V. 72. P. 194-200.

169. Tomback D. F. How nutcrackers find their seed stores // The Condor. 1982. V. 82. P. 10-19.

170. Ulber M., Gugerli F., Bozic G. EUFORGEN Techyical Guidelines for genetic conservation and use for Swiss stone pine (Pinus cembra). Rome, Italy: International Plant Genetic Resources Institute, 2004. 6 p.

171. Vendramin G. G., Hansen О. K. Molecular markers for characterizing diversity in forest trees // Conservation and management of forest genetic resources in Europe. Zvolen: Arbora Publishers, 2005. P. 337-368.

172. Walter R., Epperson В. K. Geographic pattern of genetic diversity in Pinus resinosa: contact zone between descendants of glacial refugia // American Journal of Botany. 2005. V. 92. №. 1. P. 92-100.

173. Wang X. R., Szmidt A. E., Lindgren D. Allozyme differentiation among populations of Pinus sylvestris (L.) from Sweden and China // Hereditas. 1991. V. 114. №.3. P. 219-226.

174. Watano Y., Imazy M., Shimizu T. Spatial distribution of cpDNA and mtDNA haplotypes in a hybrid zone between Pinus pumila and P. parviflora var. pentaphylla (Pinaceae) // Journal of Plant Research. 1996. V. 109. P. 403-408.

175. Wright S. The interpretation of population structure by F-statistics with special regard to systems of mating // Evolution. 1965. V. 19. P. 355-420.

176. Wright S. Evolution and the genetics of population, variability within and among natural populations. V. 4. Chicago, Illinois: University of Chicago Press, 1978. 580 p.

177. Yang Y. P., Wang S. L., Yin R. X. Genetic variation of isoenzymes within and among populations of Korean pine (Pinus koraiensis Sieb. et Zucc.) // Scientia Silvae Sinicae. 1989. V. 25. №. 3. P. 201-208.

178. Yeh F. C., Yang R. C., Boyle T. PopGene Version 1.31. Microsoft Windows-based freeware for population genetic analysis. 1998. p.

179. Zhelev P., Gomory D., Paule L. Inheritance and linkage of allozymes in a Balkan endemic, Pinus рейсе Griseb // Journal of Heredity. 2002. V. 93. №. 1. P. 60-63.