Генетическая характеристика штаммов вируса болезни Ньюкасла, выделенных на территории России и сопредельных государств тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Усачев, Евгений Валерьевич

• Усачев, Евгений Валерьевич
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Усачев, Евгений Валерьевич

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. ф 1.1. Классификация возбудителя.

1.2. Молекулярно-биологическая характеристика вируса болезни Ньюкасла.

1.2.1. Структура вириона.

1.2.2. Геном вируса и кодируемые им белки.

1.2.2.1. ИР - нуклеокапсидный белок.

1.2.2. 2. Белки, кодируемые геном Р.

1.2.2.2.а. Фосфопротеин (Р). ф 1.2.2.2.Ъ. Белки

1.2.2.3. Белок М.

1.2.2.4. Белок Б.

1.2.2.5. Белок НЫ.

1.2.2.6. Белок Ь.

1.2.3. Протеолитическая активация белка слияния.

1.2.4. Адсорбция и проникновение вируса в клетку.

1.2.5. Репликация генома вируса БН.

1.2.6. Транскрипция мРНК вируса БН.

1.2.7. Сборка вирионов вируса БН. ф 1.3. Молекулярно-генетические основы патогенности вируса болезни

Ньюкасла.

1.4. Детекция и типирование штаммов ВБН.

Глава 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Анализируемые штаммы из базы данных ОепВапк.

2.2. Исследуемые штаммы.

2.3. Места сбора и объем полевых материалов в Приморском крае в * 2004 г.

2.4. Олигонуклеотиды использованные в экспериментах.

2.5. Выделение РНК.

2.6. Реакция обратной транскрипции (ОТ).

2.7. Проведение полимеразной цепной реакции.

2.8. Определение 5'-концевой последовательности геномной РНК.

2.9. Электрофорез ДЕК.

2.10. Приготовления ДНК для секвенирования.

2.11. Секвенирование ДНК.

2.12. Построение алайментов и филогенетический анализ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Создание лабораторного варианта ОТ-ПЦР тест-системы для детекции РНК вируса БН в биологических образцах.

3.2. Генетическая характеристика штаммов ВБН, выделенных на территории России и сопредельных государств.

3.2.1. Исследование штаммов ВБН, изолированных на территории России, Украины и Белоруссии.

3.2.2. Анализ штаммов ВБН, изолированных от сельскохозяйственных птиц в Казахстане в 1988-2004 гг.

3.3. Изучение генетического разнообразия вируса БН, циркулировавшего среди диких птиц и домашних в Приморском крае в 2004 г.

3.4. Филогенетические взаимоотношения исследуемых штаммов ВБН и ПЦР-положительных образцов в пределах генетических групп.

3.5. Анализ сайта расщепления белка F исследуемых штаммов и ПЦР-положительных образцов.

3.6. Анализ полного генома штамма ВБН Sterna/Astrakhan/2755/2001.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетическая характеристика штаммов вируса болезни Ньюкасла, выделенных на территории России и сопредельных государств»

Вирус болезни Ньюкасла (ВБН) или APMV-1 (Avian Paramyxovirus 1) принадлежит к семейству парамиксовирусов (Paramyxoviridae), подсемейству Paramyxovirinae, роду Avulavirus [70,71]. Семейство парамиксовирусов включает ряд вирусов, вызывающих опасные заболевания человека и животных, среди них особенно печально известны такие вирусы, как вирус кори {measles), респираторно синцитиальный вирус (RSV), вирус парагриппа {parainfluenza), вирус инфекционного паротита {mumps), вирус болезни Ньюкасла {NDV), вирус чумы рогатого скота {rinderpest).

Актуальность проблемы

Впервые вспышки болезни Ньюкасла (БН) среди домашней птицы были зарегистрированы на Индонезийском острове Ява и собственно в Ньюкасле в 1926 году [103]. На сегодняшний день вирус БН широко распространен в различных регионах мира, поражает многие виды диких и домашних птиц и внесён в список наиболее важных патогенов (лист А). Несмотря на проведение повсеместной вакцинопрофилактики, болезнь Ньюкасла до последнего времени остается самой массовой инфекцией птиц, трудно поддающейся контролю. С развитием промышленного птицеводства это заболевание приобрело пандемический характер, нанося огромный экономический ущерб отрасли. Немаловажную роль в этом процессе сыграл широкий международный обмен высокопродуктивными породами домашних птиц, часто проводимый без учета эпизоотической ситуации в конкретных странах [109, 120].

За последние 80 лет множество эпизоотических вспышек БН нанесли удар по птицеводческой индустрии многих стран, причём некоторые из них переросли в форму панзоотии. Полагается, что первая панзоотия началась в середине 1920-х гг. и утихла только в конце 1950-х гг., когда стала распространённой вакцинация. О развитии второй панзоотии имеются две версии. Согласно одной она началась на Дальнем Востоке в начале 1960-х гг. и распространилась до Европы через Ближний Восток. Другая версия предполагает, что вторая панзоотия имеет южноамериканское происхождение в результате импорта экзотических птиц (попугаев) в Европу и Северную Америку [11, 47, 69]. Инфекция почтовых голубей вариантом вируса БН (PPMV-1) в конце 1970-х гг. на Ближнем Востоке ознаменовала начало третьей панзоотии, которая к настоящему моменту охватила многие страны всего мира. В настоящий момент, несмотря на проведение вакцинации практически повсеместно, существует опасность возникновения новой панзоотии.

Лавинообразное накопление экспериментальных данных показывает огромное генетическое разнообразие вируса БН. К сожалению, в настоящий момент не существует общепринятой системы классификации вируса в пределах рода. Среди наиболее известных систем классификации ВБН выделяются две, основанные на анализе участка гена F. По системе, предложенной авторами Lomniczi et al. (1998), Alexander et al. (1999), Herczeg et al. (1999, 2001), Ke et al. (2001), Yu et al. (2001) существует восемь основных линий (I-VIII) [69, 15, 49, 50, 57, 120]. Другая система, предложенная Aldous et al. (2003, 2004), предполагает наличие всего шести основных линий 1-6 [9, 10].

Несмотря на то, что филогенетический анализ выполнен для огромного числа штаммов ВБН по всему миру и определены основные генотипы, остаётся неясным вопрос - какие генотипы ВБН представлены на территории России и сопредельных государств. Из известных "российских" изолятов ВБН к моменту написания работы в базе данных GenBank были представлены частичные нуклеотидные последовательности гена F только четырёх представителей генотипов За, ЗЬ и 4а, выделенных с 1947 по 1974 гг. от домашней птицы [3, 6]. Однако совершенно не изучено разнообразие вариантов штаммов БН, циркулирующих в популяциях диких птиц.

В связи с повсеместно расширяющейся программой вакцинации, начавшейся в начале 1950-х гг. и увеличивающимся числом вакцинных вариантов вируса, возникает вопрос о возможности выплеска вакцинных штаммов в популяции диких птиц и об их дальнейшей судьбе.

Для детекции вируса болезни Ньюкасла в образцах органов птиц, а также аллантоисной жидкости куриных эмбрионов в настоящее время разработаны несколько ОТ-ПЦР систем. В основном, все они основаны на амплификации участка гена Б или М. Как правило, они адаптированы к штаммам, выделенным на определённой территории, а постоянное накопление фактического материала (в данном случае речь идёт о первичных нуклеотидных последовательностях генов штаммов ВБН) сужает область применения данной системы. Поэтому, из-за недостатка данных по распространению генотипов ВБН на территории России и сопредельных государств, необходимо создать ОТ-ПЦР систему для детекции РНК вируса БН адаптированную к вариантам вируса, циркулирующего на территории нашей страны. Для оптимизации ранее предложенных методов детекции мы считали целесообразным создать систему выявления вирусного генома на основе ОТ-ПЦР анализа с последующим использованием амплифицированных фрагментов ДНК для секвенирования и выяснения филогенетических взаимоотношений исследуемых вариантов ВБН с ранее известными.

Для наиболее полной характеристики штамма вируса, необходимо знать полную нуклеотидную последовательность его генома. К настоящему моменту данные о штаммах, выделенных на территории России и сопредельных государств, отсутствуют.

Цель и задачи исследования.

Целью, настоящего исследования явилась генетическая характеристика вариантов вируса болезни Ньюкасла (ВБН), циркулирующих на территории России и сопредельных государств в популяциях домашних и диких птиц, а также определение первичной структуры генома варианта вируса БН, наиболее распространённого на территории России. Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

1. Провести определение первичной структуры гена Б или его участка "культуральных" штаммов вируса БН (всего 59), выделенных на территории России (11), Украины (3), Белоруссии (1) и Казахстана (44) от диких и домашних птиц в период с 1983 по 2004 г.

2. Разработать лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы на основе анализа нуклеотидных последовательностей известных штаммов ВБН, депонированных в базе данных ОепВапк.

3. Испытать разработанную детекционную систему на образцах полевого материала (182), собранного от диких птиц на территории Приморского края в 2004 г.

4. Провести генотипирование исследуемых штаммов вируса и вариантов из полевого материала, а также сравнить их между собой и с ранее охарактеризованными штаммами, представленными в базе данных ОепВапк, с помощью филогенетического анализа.

5. Определить первичную структуру полную генома российского штамма 81егпа/Аз1гак11ап/2755/2001 вируса БН субтипа 5Ь.

6. Провести корреляционный анализ соответствия результатов генотипирования по фрагменту гена Б (374 н.о.) и результатов генотипирования по практически полному геному.

Научная новизна и практическая значимость.

1. Создан и апробирован лабораторный вариант ОТ-ПЦР тест-системы для детекции вируса БН.

2. Установлено, что на территориях Астраханской области (2002 г.) и Приморского края России (2001-2004 гг.) в популяциях диких птиц циркулировали варианты вируса БН генотипа 1, а также субтипов За и 5Ь.

3. Установлено, что выделенные от домашней птицы штаммы ВБН на территории Казахстана в эпизоотический и межэпизоотический периоды с 1988 по 2004 гг. принадлежат к генотипам 1, 2, а также субтипам За, 5Ь и 5<±

4. Установлено, на основании анализа аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния, что все изученные штаммы и изоляты, отнесённые к субтипам За, 5Ь и 5с1, соответствуют велогенному характеру патогенности, в то время как варианты вируса БН генотипов 1 и 2 - лентогенному характеру патогенности.

5. Продемонстрировано, что за эпизоотическую ситуацию в обследованных регионах отвечает циркуляция штаммов ВБН, принадлежащих субтипам 5Ь, 5(1 и За. Учитывая, что последние эпизоотии в Казахстане были вызваны вирусами в основном субтипа 5Ь, а также то, что именно этот субтип преобладает в популяциях диких птиц, обитающих на территории России, данный субтип представляет наибольшую опасность для птицеводческих хозяйств России и сопредельных государств.

6. Генетически охарактеризован, на основе определённой нами первичной структуры генома, первый российский велогенный штамм 81ета/Аз1га1<±.ап/2755/2001 вируса БН, принадлежащий субтипу 5Ь.

7. Проведённый анализ соответствия результатов генотипирования по фрагменту гена Б (374 н.о. от начала открытой рамки считывания белка Б -по классификации АЫош с соавт., 2003) и результатов генотипирования по практически полному геному показал высокую степень их корреляции (К=0,98). Таким образом, показано правомерное использование участка гена Б (374 н.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Ауи1ау1гиз и внутри основных генетических линий.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Создан лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР системы, позволяющий обнаружить различные варианты вируса БН, циркулирующие на территории России и сопредельных государств. С помощью данной системы обнаружены варианты вируса БН четырёх основных генетических линий из шести, известных к настоящему времени.

2. На основе сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей участка гена Б (374 н.о.) штаммы ВБН, изолированные на территории России и сопредельных государств, принадлежат к генотипам 1 и 2, а также субтипам За, 5Ь и 5с1.

3. Анализ аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния позволил установить, что на территории России и Казахстана циркулируют штаммы как велогенного, так и лентогенного патотипов. Штаммы различной степени патогенности встречаются как среди домашних, так и диких птиц.

4. Впервые определена полная нуклеотидная последовательность генома российского штамма вируса БН, который также оказался первым представителем субтипа 5Ь с известной первичной структурой генома. Установленная полная нуклеотидная последовательность генома штамма 81егпа/Аз1гакЬап/275 5/2001 вируса болезни Ньюкасла позволяет использовать его в качестве эталонного представителя субтипа 5Ь с велогенным патотипом.

5. Сравнение результатов филогенетического анализа по участку гена Б и последовательности практически полного генома ВБН показало высокую степень их корреляции (К=0,98). Полученные данные позволяют сделать заключение о правомерном использовании участка гена Б (374 н.о.) для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода А\чйа\чгы8 и внутри основных генетических линий.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Усачев, Евгений Валерьевич

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Среди иарамиксовирусов птиц вирус болезни Ньюкасла (АРМУ-1) считается, пожалуй, самым распространённым и наносит огромный

• экономический ущерб народному хозяйству. К настоящему моменту известен факт четырёх панзоотий ВБН, причём четвёртая продолжается в настоящее время в популяциях голубей разных видов и вызвана циркуляцией вируса генотипа 4Ь.

Из всех известных классификаций вируса БН в пределах рода Ауи1ау1гш наиболее широко используемыми являются две, предложенные Ьотшсг1 et а1. (1998) и АШош а1. (2003). Они основаны на филогенетическом анализе участка гена Б. Накопление данных по

• нуклеотидным последовательностям различных участков генома разных штаммов ВБН происходит лавинообразно. Не вызывает сомнения очевидность необходимости типирования вновь охарактеризованных штаммов для создания более полной картины генетического разнообразия циркулирующих вариантов вируса на той или иной территории с целью проведения эффективной вакцинации. Однако проведению качественной вакцинопрофилактики в нашей стране мешают несколько факторов:

1. Отсутствие данных о циркуляции генетических вариантов вируса БН на территории России и стран, через которые пролегают пути миграции птиц, обитающих на территории России;

• 2. Отсутствие жёсткого контроля за закупкой кормов и племенной птицы;

3. Отсутствие контроля за применением вакцинных штаммов;

4. Отсутствие вакцинации домашней птицы в малых хозяйствах и подворьях.

К моменту выполнения данной работы в базе данных ОепВапк были представлены только четыре представителя генотипов За, ЗЬ и 4а л выделенные в России с 1947 по 1974 гг. от домашней птицы [3,6].

В связи с этим была предпринята попытка типирования российских штаммов БН последних лет, выделенных на территории Астраханской области и Приморского края от диких птиц (главных точек пересечения путей миграции диких птиц), нескольких более ранних штаммов из музея вирусов НИИ вирусологии им. Д. И. Ивановского, а также казахстанских штаммов от домашней птицы. Кроме культуральных штаммов были обследованы образцы полевого материала (клоакальные смывы 142 диких птиц и 40 домашних птиц), собранные в Приморском крае в 2004 г.

Для осуществления задуманного нами был создан лабораторный вариант детекционной ОТ-ПЦР тест . системы. Для подбора олигонуклеотидных праймеров мы проводили сравнение различных участков генома разных штаммов ВБН, представленных в базе данных ОепВапк. Важно отметить, что к моменту выполнения данной работы в базе данных отсутствовали нуклеотидные последовательности представителей шестого генотипа. Поэтому разработанная ОТ-ПЦР система может не отличаться высокой универсальностью и специфичностью. Однако, теоретически, на основе алайментов нуклеотидных последовательностей, соответствующих местам посадки праймеров, можно предположить, что с помощью данной системы можно будет детектировать в вируссодержащих пробах представителей вируса БН, по меньшей мере, пяти генотипов из шести, известных к настоящему моменту.

С помощью созданной ОТ-ПЦР системы были получены фрагменты ДНК участка гена Б всех исследуемых российских и казахстанских штаммов. Кроме того, для большинства российских штаммов были получены фрагменты ДНК целого гена Б, а для всех казахстанских фрагмент ДНК длиной 1083 н.о., охватывающий участок гена М (100 а.о. С-конец), расстояние между кодирующими последовательностями генов М и Б и начало гена Б (206 а.о.). При анализе 182 образцов полевого материала, собранного в Приморском крае в 2004 г. был получен фрагмент ДНК участка гена Б вируса БН только для 8 образцов. Общая зараженность птиц вирусом

БН составила 4,4 %, а в частности диких - 4,9 %. Для последующего филогенетического анализа нами была определена нуклеотидная последовательность фрагментов ДНК штаммов ВБН и ПЦР-положительных образцов. Нуклеотидные последовательности практически всех российских штаммов были депонированы нами в базу данных ОепВапк.

На основе филогенетического анализа по участку гена Б в пределах рода Ал>и1атгт была установлена генотиповая принадлежность исследуемых штаммов и ПЦР-положительных образцов. Российские штаммы были отнесены нами к генотипам 1, 2, и 5Ь. Разнообразие генотипов среди казахстанских штаммов оказалось несколько большим (генотипы 1, 2, За, 5Ь и 5(1). Среди ПЦР-положительных образцов Приморского края 2004 г. были обнаружены представители генотипов 1, За й 5Ь.

На основе филогенетического анализа по участку гена Б в пределах обнаруженных генотипов мы установили более подробные генетические взаимоотношения исследуемых штаммов. В пределах первого генотипа исследуемые изоляты были отнесены нами к западноевропейскому кластеру, причём приморские штаммы 2000-2001 гг. выделения образовали отдельную группу от группы казахстанских штаммов 1988-1998 гг. и приморских ПЦР-положительных образцов 2004 г. Поскольку этот генотип распространён по всему миру и среди него встречаются в основном лентогенные варианты, то можно считать исследованные изоляты эндемичными вариантами вируса БН, характерными для данных территорий.

Внутри второго генотипа исследуемые штаммы отошли к кластеру вакцинных штаммов ряда Ьа8о1а. Все эти штаммы были выделены от домашней птицы, и с большой вероятностью они являются генетическими вариантами широко применяющегося вакцинного штамма Ьа8о1а.

Среди представителей генотипа За невозможно было провести более подробную кластеризацию в виду малого количества известных штаммов. Однако исследованные казахстанские штаммы и один приморский образец оказались генетически однородными и довольно близкими аттенуированному вакцинному штамму ГАМ-61. Исходя из этого, можно предположить, что они могут быть вариантами этого вакцинного штамма или эндемичными штаммами обследованных регионов. Недостаток знания об использовании вакцинных вариантов вируса БН в этих регионах не позволяет сделать заключение о происхождении исследуемых штаммов, и идёт ли речь об интродукции вакцинного варианта вируса в популяции диких птиц.

История выявления представителей пятого генотипа насчитывает около двадцати лет на территориях почти всех континентов, кроме Австралии и Северной Америки. Существует опасность занесения представителей этого генотипа на территорию последних двух. Это может ознаменовать начало пятой панзоотии. Причём, вызвана она, может быть совместной циркуляцией всех субтипов этой генетической линии, но основная роль, по-видимому, будет за генотипом 5Ь.

Исследуемые штаммы и образцы, отнесённые нами к этому генотипу, вошли в состав европейского кластера, при этом разбившись на две отдельные группы. В первую группу вошли казахстанские штаммы выделения 2000-2001 гг., астраханские штаммы 2001 г. и один образец Приморского края 2004 г. Вторую группу образовали казахстанские штаммы 1998 г. и четыре образца Приморского края 2004 г. Все представители генотипа 5Ь, известные к настоящему моменту, имеют велогенный характер патогенности. Все исследуемые казахстанские штаммы этого генотипа были выделены в эпизоотические периоды от домашней птицы, а российские штаммы и образцы от дикой птицы. Из чего можно заключить, что преимущественно циркуляция вируса БН генотипа 5Ь в настоящее время определяет эпизоотическую ситуацию в данных регионах.

Интересным оказался факт интродукции эпизоотических штаммов ВБН генотипа 5с1 на территорию обследованных областей Казахстана в период с 2001 г. по 2003 г. В пределах этой генетической линии, исследованные штаммы, по-видимому, образуют собственный кластер среди ранее выделенных кластеров: 1 - штаммов из Китая и Ближнего Востока и 2 штаммов, выделенных на Тайване. Из чего можно заключить: на эпизоотическую ситуацию в Казахстане и близлежащих территориях России также будет иметь влияние циркуляция штаммов ВБН этого генотипа.

Молекулярно-генетический анализ главного маркера патогенности вируса БН - аминокислотной последовательности сайта протеолитической активации белка слияния позволил установить, что все исследованные штаммы ВБН и ПЦР-положительные образцы, относящиеся к генотипам За, 5Ь и 5(1 имеют последовательность этого сайта соответствующую велогенному патотипу. Штаммы ВБН и ПЦР-положительные образцы, относящиеся к генотипам 1 и 2, имеют последовательность сайта активации, соответствующую лентогенному патотипу.

Следует отметить, что к началу данной работы было опубликовано всего 27 полноразмерных последовательностей вирусного генома представителей генотипов 1, 2, ЗЬ, Зс, 4а, 4Ь, 5а и 5с1. Позднее были опубликованы три последовательности практически полного генома представителей генотипа 6. Также нужно отметить, что в базе данных не было опубликовано ни одной полноразмерной нуклеотидной последовательности генома отечественного изолята. Для определения полной нуклеотидной последовательности генома российского изолята вируса БН был взят штамм 81егпа/Аз1гак11ап/2755/2001. Нуклеотидная последовательность полного генома первого российского штамма ВБН была зарегистрирована нами в базе данных ОепВапк [АУ865652].

Реальная картина филогенетических взаимоотношений изучаемых штаммов ВБН возможна лишь при анализе нуклеотидных последовательностей полного генома всех существующих вариантов вируса. Однако определение последовательности полного генома вируса является очень трудоёмким и дорогостоящим процессом. Поэтому исследователями для установления филогенетических взаимоотношений штаммов вируса используются последовательности различных участков генома, так или иначе отображающих реальную картину филогении вируса. В связи с этим, нами была предпринята попытка сравнения результатов филогенетического анализа по практически полноразмерным последовательностям генома и аналогичного анализа по участку гена Б (374 и.о., согласно классификации АМош с соавторами, 2003 г.). Сравнение данных этих анализов по разным фрагментам генома показало их высокую степень корреляции (К=0,98), что позволяет сделать заключение о правомерности использования данного участка гена Б для установления филогенетических взаимоотношений штаммов ВБН в пределах рода Ауи1см1гш и внутри основных генетических линий.

На основании анализа первичной структуры генома исследуемого штамма 81егпа/Аз1так]1ап/275 5/2001 и штаммов с известными биологическими свойствами, а также молекулярно-генетических признаков патогенности (аминокислотный состав вирусных белков, последовательность сайта протеолитической активации белка Бо и белка НИ, кратность геномной РНК шести нуклеотидным остаткам, наличие биологически активного белка V) был установлен его велогенный характер патогенности.

105