Функциональная роль доменов белка MSL2 в привлечении комплекса дозовой компенсации на Х-хромосому самцов Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Тихонова Евгения Андреевна

• Тихонова Евгения Андреевна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Тихонова Евгения Андреевна

1.1 Актуальность работы

1.2 Цель и задачи исследования

1.3 Научная новизна и практическая значимость работы

1.4 Методология и методы исследования

1.5 Положения, выносимые на защиту

1.6 Степень достоверности и апробация результатов

1.7 Личное участие автора в проведении исследований

1.8 Объем и структура диссертации

2 Обзор литературы

2.1 Эволюция половых хромосом и механизмы дозовой компенсации

2.2 Регуляция дозовой компенсации у В. melanogaster

2.2.1 Определение пола у В. melanogaster

2.2.2 Белок Sxl предотвращает образование КДК у самок

2.3 Комплекс дозовой компенсации у В. melanogaster

2.4 Структура КДК у В. melanogaster

2.4.1 М8Ь1

2.4.2 М8Ь2

2.4.3 М8Ь3

2.4.4 МОБ

2.4.5 МЬБ

2.4.6 РНК гоХ

2.5 Регуляция транскрипции Х-хромосомы у самцов В. melanogaster

2.6 Модели активации транскрипции комплексом дозовой компенсации у самцов В. melanogaster

2.7 Механизмы специфичного рекрутирования КДК на Х-хромосому самцов В. melanogaster

3 Материалы и методы

3.1 Молекулярное клонирование

3.1.1 Приготовление компетентных клеток

3.1.2 Трансформация бактериальных клеток

3.1.3 Выделение плазмидной ДНК из большого объёма бактерий

3.1.4 Выделение плазмидной ДНК из маленького объема бактериальной культуры

3.1.5 Препаративная рестрикция

3.1.6 Тупление выступающих концов ДНК

3.1.7 Горизонтальный гель-электрофорез

3.1.8 Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

3.1.9 Переосаждение ДНК

3.1.10 Дефосфорилирование ДНК

3.1.11 Лигирование

3.2 Дрожжевая двугибридная система

3.2.1 Использованный штамм дрожжей

3.2.2 Плазмиды для дрожжевой двугибридной системы

3.2.3 Трансформация дрожжей

3.3 Методы работы с рекомбинантными белками

3.3.1 Использованные плазмиды

3.3.2 Соосаждение рекомбинантных белков («pull down assay»)

3.3.3 Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле при денатурирующих условиях (SDS-PAGE)

3.4 Методы работы с культурой клеток Drosophila

3.4.1 Использованная клеточная культура

3.4.2 Использованные плазмиды

3.4.3 Коиммунопреципитация белков в S2-клетках

3.4.4. Иммуноблот-анализ

3.5 Методы работы с линиями мух

3.5.1 Использованные линии мух

3.5.2. Использованные плазмиды

3.5.3. Получение трансгенных линий дрозофил

3.5.4. Генетические скрещивания

3.5.5. Подсчет выживаемости трансгенных линий мух

3.5.6. Приготовление белкового экстракта из дрозофил

3.6 Иммуноокрашивание политенных хромосом у дрозофилы

3.6.1. Приготовление препаратов политенных хромосом у дрозофилы

3.6.2. Иммуноокрашивание политенных хромосом

3.7 Иммунопреципитация хроматина с последующей количественной ПЦР (кПЦР)

3.7.1. Приготовление хроматина для иммунопреципитации

3.7.2 Иммунопреципитация хроматина с последующей кПЦР

3.8 Работа с РНК

3.8.1 Выделение РНК

3.8.2 Обратная транскрипция

3.8.3 ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени

4 Результаты

4.1 Картирование доменов, необходимых для взаимодействия друг с другом белков CLAMP и MSL2

4.2 Исследование роли СХС-домена белка MSL2 в рекрутировании комплекса дозовой компенсации на Х-хромосому

4.3 Исследование роли домена MSL2, взаимодействующего с белком CLAMP, в рекрутировании КДК на Х-хромосому

4.4 Исследование совместной роли ССД- и СХС-доменов белка MSL2 в рекрутировании КДК на Х-хромосому

4.5 Исследование роли пролин-богатого домена (P-домен) и домена, богатого положительно заряженными аминокислотами (B-домен), в привлечении КДК на Х-хромосому

4.6 Исследование роли СХС-, ССД- и P- доменов MSL2 в рекрутировании КДК на Х-хромосому

4.7 Роль доменов MSL2 в экспрессии РНК roX

5 Обсуждение

Выводы

Список цитированной литературы

Список используемых сокращений и терминов

6xHis - участок для аффинной очистки, состоящий из 6 остатков гистидина ChIP - Chromatin immunoprecipitaion - метод иммунопреципитации хроматина ChIP-qPCR - метод иммунопреципитации хроматина с последующей количественной ПЦР

ChIP-seq - ChIP-sequencing - метод иммунопреципитации хроматина с последующим выскопроизводительным секвенированием GST - глутатион^-трансфераза

input - образец исходного материала (до иммунопреципитации или соосаждения) MBP - мальтоза-связывающий белок

output - образец после истощения материала в результате иммунопреципитации или соосаждения (обычно супернатант)

RNA-seq - метод определения молекул РНК в образце при помощи

высокопроизводительного секвенирования

а.о. - аминокислотные остатки

ДДС -- дрожжевая двугибридная система

дцРНК - двуцепочечные РНК

КДК - комплекс дозовой компенсации

кПЦР - количественная ПЦР

МСК - мотив связывания КДК

п.н. - пары нуклеотидов

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СПП - сайты первичной посадки КДК

ССД - CLAMP-связывающий домен

т.п.н. - тысячи пар нуклеотидов

ТФ - транскрипционный фактор

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Функциональная роль доменов белка MSL2 в привлечении комплекса дозовой компенсации на Х-хромосому самцов Drosophila melanogaster»

1 Введение 1.1 Актуальность работы

У дрозофилы выравнивание доз экспрессирующихся на половых хромосомах генов достигается путем усиления экспрессии генов на единственной Х-хромосоме у самцов. Основную роль в этом процессе играет мультисубъединичный комплекс дозовой компенсации (КДК) [1-3]. Одним из ключевых вопросов является понимание того, как именно обеспечивается специфичное связывание КДК с Х-хромосомой самцов. Этот вопрос имеет принципиальное значение в фундаментальных исследованиях, направленных на изучение общих механизмов специфического связывания белковых комплексов с определенными регуляторными последовательностями ДНК in vivo.

КДК состоит из пяти белков MSL1, MSL2, MSL3, MOF и MLE и включает две длинные некодирующие РНК roX1 (3,7 т.п.н.) и roX2 (0,6 т.п.н.), выполняющие сходные функции [2,3]. Белки MSL1, MSL3, MOF и MLE также присутствуют у самок и участвуют в регуляции экспрессии генов по механизму, независимому от дозовой компенсации [1]. Белки MSL1 и MSL2 образуют структурное ядро КДК, C-концевой домен PEHE MSL1 отвечает за взаимодействие с MSL3 и MOF [4-6]. Белок MLE, АТФ-зависимая РНК/ДНК-хеликаза семейства DExH, взаимодействует с двумя некодирующими РНК roX и индуцирует их раскручивание [7,8]. Неполный комплекс MSL1-MSL2 связывает воспроизводимый набор из примерно 200 сайтов на Х-хромосоме, которые были названы сайтами первичной посадки (СПП) [9,10]. Последовательность СПП содержит GA-богатый мотив (МСК), который распознается КДК [9,10].

Белок MSL2 экспрессируется исключительно у самцов и считается ключевым компонентом комплекса дозовой компенсации [3]. В составе MSL2 можно выделить два высоко консервативных домена: N-концевой RING-домен и СХС-домен [11,12]. Структурный анализ показал, что MSL2 распознает МСК с помощью CXC-домена [13,14]. При помощи полногеномного анализа in vitro было показано, что MSL2 специфически связывается с подклассом СПП, названным PionX (pioneering sites on

the X) [15]. Предполагается, что на первом этапе сборки КДК происходит связывание модуля MSL1-MSL2 с данными сайтами. На следующем этапе roX, MLE и MSL3 участвуют в распространении КДК на близлежащие СПП и гены, транскрипция которых должна быть повышена [1]. Также в исследовании связывания in vitro было показано, что транскрипционный фактор CLAMP связывается с GA-богатыми последовательностями, в том числе и с МСК [16,17]. ChIP-seq-анализ показал, что CLAMP связывается не только с СПП, но и с более чем 5000 сайтами по всему геному, большинство из которых распределены на аутосомах [18]. Последнее открытие усложняет понимание роли CLAMP в специфическом привлечении КДК на Х-хромосому.

Неструктурированный С-конец белка MSL2 содержит два участка: богатый пролином (Prolin-rich, P-домен) и обогащенный основными аминокислотными остатками (Basic, B-домен). Предполагается, что С-конец специфично связывается с РНК roX, что обеспечивает эффективную сборку КДК и включение в него белка MLE [19]. Некоторые экспериментальные данные предполагают, что С-конец участвует в специфичном узнавании СХС-доменом GA-участков на Х-хромосоме самцов [15]. Согласно предложенной модели, КДК связывается специфично с СПП в результате кооперативного узнавания ДНК-последовательностей СХС-доменом и пролин-богатым доменом белка MSL2. Длинные некодирующие РНК roX, как предполагается, участвуют в увеличении специфичности рекрутирования КДК на участки хроматина. В то время как белок CLAMP участвует в формировании зон открытого хроматина в области СПП. Однако эта модель имеет много недостатков, требует более детального изучения и усовершенствования. Данная работа посвящена исследованию функциональной роли белка MSL2 в специфическом рекрутировании КДК на Х-хромосому самцов Drosophila melanogaster.

1.2 Цель и задачи исследования

Целью данной работы является изучение функциональной роли отдельных доменов белка М8Ь2 в специфическом привлечении КДК на Х-хромосому самцов Б. melanogaster. В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Определить, взаимодействуют ли друг с другом белки MSL2 и CLAMP, используя различные подходы in vitro и in vivo.

2. Картировать домены в составе белков CLAMP и MSL2, необходимые для взаимодействия между ними.

3. Исследовать в системе in vivo роль доменов MSL2 в процессе рекрутирования КДК на GA-богатые последовательности в составе СПП на Х-хромосоме самцов.

4. Выяснить роль в привлечении КДК на Х-хромосому самцов С-концевых доменов MSL2: обогащенных пролиновыми а.о. (P-домен) и основными а.о. (B-домен).

5. Определить роль отдельных доменов MSL2 в активации транскрипции генов roX1 и roX2.

1.3 Научная новизна и практическая значимость работы

В диссертационной работе было впервые обнаружено прямое взаимодействие белков MSL2 и CLAMP и картирован CLAMP-связывающий домен (ССД) MSL2. Благодаря исследованию, проведенному на самках и самцах трансгенных линий мух, была определена роль CXC и ССД MSL2 в рекрутировании КДК на Х-хромосому in vivo. Данная работа позволила пересмотреть значимость доменов MSL2 и белка CLAMP в привлечении КДК на Х-хромосому самцов. Было показано, что СХС и ССД кооперативно участвуют в специфичном привлечении КДК на Х-хромосому самцов. Было продемонстрировано, что С-концевые домены Р- и В-домены MSL2 не являются необходимыми модулями в процессе рекрутирования КДК на хроматин, что опровергает общепринятое представление о ключевой роли этих доменов в загрузке РНК roX в состав КДК. В ходе работы были получены экспериментальные данные, которые предполагают недостаточность MSL2 и CLAMP для селективного привлечения КДК на СПП. Таким образом, можно предположить, что другие субъединицы КДК также способны взаимодействовать с CLAMP или другими транскрипционными факторами, связанными с СПП. Это позволяет сформулировать гипотезу, согласно которой белок CLAMP в комбинации с другими

транскрипционными факторами связывается с СПП и с помощью множественных белок-белковых взаимодействий определяет высокоспецифичное привлечение КДК на хроматин. Нужно отметить, что у млекопитающих существует гомологичный комплекс, состоящий из белков MSL1, MSL2, MSL3 и MOF, который участвует в активации транскрипции многих генов, но не в дозовой компенсации. Поэтому принципы привлечения КДК на хроматин и механизмы регуляции транскрипции с его помощью могут быть универсальными и реализовываться сходным образом и другими регуляторными комплексами. Таким образом, диссертационная работа вносит существенный вклад в исследование механизмов привлечения регуляторных комплексов к определенным последовательностям ДНК в составе хроматина in vivo.

1.4 Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной биологии и генетики. Среди применявшихся в работе методов можно выделить следующие: молекулярное клонирование, выделение ДНК, количественный ПЦР, выделение РНК с последующей обратной транскрипцией, анализ белок-белковых взаимодействий методами: ДДС, ко-иммунопреципитации в 82-клеточной линии, соосаждения рекомбинантных белков in vitro. А также были использованы методы получения трансгенных линий D. melanogaster, иммуноокрашивание политенных хромосом у дрозофилы, иммунопреципитация хроматина.

1.5 Положения, выносимые на защиту

1. N-концевой цинковый палец С2Н2-типа белка CLAMP взаимодействует с неструктурированным С-концевым доменом (618-655 а.о.) белка MSL2.

2. Домены CXC и CLAMP-связывающий (ССД) белка MSL2 кооперативно участвуют в привлечении КДК на Х-хромосому самцов дрозофилы.

3. Одновременная инактивация доменов CXC и ССД в составе MSL2 у самцов лишь частично нарушает процесс привлечения КДК на Х-хромосому.

4. Делеция С-концевого В-домена повышает стабильность белка и не влияет на активность MSL2 в установлении дозовой компенсации.

5. Р-домен М8Ь2 не нужен для привлечения КДК на Х-хромосому самцов, но участвует в активации транскрипции гена тХ2.

1.6 Степень достоверности и апробация результатов

Работа выполнена в соответствии с общепринятыми этическими и научными принципами на высоком научно-методическом уровне с использованием современных методов молекулярной генетики и молекулярной биологии. Цели, поставленные в работе, достигнуты. Выводы и положения, выносимые на защиту, обоснованы фактическим материалом, полученным в результате проведения экспериментов, анализа и интерпретации данных.

По результатам работы опубликовано 3 статьи в рецензируемых научных журналах, входящих в международные и российские базы цитирования. Основные положения диссертации были представлены на 4 международных конференциях.

Публикации:

1. Tikhonova E., Fedotova A., Bonchuk A., Mogila V., Larschan E.N., Georgiev P., Maksimenko O. The simultaneous interaction of MSL2 with CLAMP and DNA provides redundancy in the initiation of dosage compensation in Drosophila males. // Development. 146 (19): dev179663, 2019.

2. Albig C., Tikhonova E., Krause S., Maksimenko O., Regnard C., Becker P.B. Factor cooperation for chromosome discrimination in Drosophila. // Nucleic Acids Res. 47(4):1706-1724, 2019.

3. Tikhonova E.A., Georgiev P.G., Maksimenko O.G. Functional Role of C-terminal Domains in the MSL2 Protein of Drosophila melanogaster. // Biochemistry (Moscow) - Vol. 89, No. 4, pp. 663-673-2024

Тезисы и конференции:

1. Cherkasova E., Babosha V., Georgiev P., Maksimenko O. The new DNA-binding protein factors of MSL-complex in Drosophila melanogaster. // International conference for young scientists «Molecular control of gene expression», Moscow, Russia, 2015, C. 25.

2. Tikhonova E., Bonchuk A., Mogila V., Maksimenko O., Georgiev P. Interaction between CLAMP and MSL2 is required for specific recruiting of MSL complex to X chromosome. // 42nd FEBS Congress, Jerusalem, Israel, 2017, С. 219.

3. Tikhonova E., Mogila V., Maksimenko O., Georgiev P. Role of MSL2 domains in specific recruiting of the dosage compensation complex on the X chromosome in Drosophila melanogaster. // 43rd FEBS Congress, Prague, Czech Republic, 2018, C. 139.

4. Tikhonova E., Maksimenko O., Georgiev P. Role of direct MLE-CLAMP interaction in recruiting of dosage compensation complex on the male X chromosome in Drosophila // 44th FEBS Congress, Krakow, Poland, 2019, C. 396.

1.7 Личное участие автора в проведении исследований

Большая часть представленных результатов была получена автором самостоятельно, либо при непосредственном участии автора. Самостоятельно автором были созданы плазмидные конструкции для тестирования делеционных производных белков в ДДС (дрожжевая двугибридная система), для исследования белок-белковых взаимодействий in vitro и in vivo и для получения трансгенных линий мух. Лично автором осуществлён анализ белок-белковых взаимодействеий в ДДС и с помощью ко-иммунопреципитации в S2-клеточной линии. Также автором были произведены работы по выведению, скрещиванию и анализу трансгенных линий мух. Большая часть препаратов иммуноокрашеных политенных хромосом была получена автором. Иммунопреципитация хроматина и измерение уровня РНК осуществлялись совместно с О. Г. Максименко, анализ белок-белковых взаимодействий in vitro совместно с А. Н. Бончуком, иммуноокрашивание политенных хромосом совместно с А. А. Федотовой. Автор непосредственно

участвовал в обсуждении, интерпретации результатов и подготовке публикаций. Другие соавторы указаны в соответствующих опубликованных работах.

1.8 Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, трёх глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты»), заключения, выводов. Работа изложена на 113 страницах, содержит 39 рисунков. Список литературы включает 190 источников.

2 Обзор литературы 2.1 Эволюция половых хромосом и механизмы дозовой компенсации

У диплоидных организмов поддержание правильной дозы генов необходимо для нормального функционирования и развития клеток. Многие организмы в своем кариотипе содержат пару половых хромосом. Так, у Вгоъоркйа melanogaster и ряда млекопитающих половые хромосомы самок представлены двумя Х-хромосомами, идентичными как по морфологии, так и в генетическом контексте. В свою очередь, у самцов присутствуют только одна Х-хромосома и гетероморфная ей У-хромосома. У чешуекрылых, птиц и некоторых пресмыкающихся гетерогаметным полом являются самки ^Ш), а самцы имеют две идентичные 2-хромосомы. Половые хромосомы X и Y, а также Z и W существенно отличаются друг от друга по морфологии, размеру и генетическому контексту. Хромосомы Y и W состоят в основном из формирующих гетерохроматин повторяющихся последовательностей ДНК и содержат незначительное по сравнению с хромосомами X и Z число генов [2,20,21].

Предполагается, что хромосомы X и Y возникли независимо в разных таксонах и ведут свое происхождение от пары гомологичных аутосом. Однако в результате дивергенции У-хромосома стала специфичной для самцов, в то время как Х-хромосома, помимо генов, ответственных за развитие пола, содержит гены домашнего хозяйства и гены, участвующие в эмбриональном развитии. Считается, что появление на одной из хромосом аллеля, дающего преимущество развития по мужскому типу, привело к подавлению рекомбинации между Х- и У-хромосомами вблизи данного гена [22-24]. Подавление рекомбинации, в свою очередь, способствует накоплению мутаций и расширению нерекомбинируемой области. Это происходит из-за того, что такие мутации очень редко переходят в гомозиготное состояние. Таким образом, различные мутации, включая делеции и транслокации, постепенно распространяются за пределы исходного участка подавления рекомбинации, что ведет к прогрессирующему вырождению одной из первоначально гомологичных хромосом. Конечным результатом данного процесса

может стать потеря всей У-хромосомы, что, по-видимому, и произошло у самцов Caenorhabditis elegans. Аналогичный процесс, вероятно, привел к дивергенции 2- и Ш-хромосом [20,25].

Среди насекомых наиболее изучены половые хромосомы дрозофилы. У Б. melanogaster небольшая У-хромосома состоит в основном из повторяющихся последовательностей и мобильных элементов. Она содержит всего около 20 генов, большинство из которых кодируют белки со специфичными для самцов функциями, (например, отвечающие за подвижность сперматозоидов) [26-29]. Самцы Б. melanogaster, лишенные У-хромосомы, жизнеспособны, но стерильны, что указывает на то, что гены на У-хромосоме играют ключевую роль только в фертильности самцов [30,31]. Интересно, что все У-сцепленные гены у Б. melanogaster, по-видимому, имеют аутосомное происхождение [32]. Более того, отсутствие какой-либо гомологии между X- и У-хромосомами у Б. melanogaster привело к предположению, согласно которому У-хромосома дрозофилы имеет другую эволюционную историю, чем канонические У-хромосомы (например, У-хромосомы млекопитающих), и не происходит от гомологичной Х-хромосомы [33,34].

Появление гетероморфных половых хромосом приводит к несбалансированной дозе генов, что потенциально может нарушить баланс экспрессии между сцепленными с полом и аутосомными генами. Эта «опасность гемизиготности» решается специфическими для пола регуляторными процессами на X (2)-хромосоме, которые уравнивают дозы генов между самцами и самками, а также между Х ^)-сцепленными генами и аутосомами [35]. Исходя из способа достижения паритета Х:А (аутосомы) и дозового баланса на Х^)-хромосоме у самок и самцов, выделяют три типа дозовой компенсации [36,37].

Первый тип дозовой компенсации встречается только у организмов с системой половых хромосом ХХ/ХУ и подробно описан у Б. melanogaster. Дозовая компенсация достигается за счет регуляции только у гетерогаметного пола путем двукратного увеличения транскрипции генов, которые находятся на единственной Х-хромосоме [38,39]. Эта одноэтапная стратегия компенсирует экспрессию Х-сцепленных генов относительно аутосом и одновременно восстанавливает баланс

между самцами и самками. Поэтому никаких дальнейших компенсационных шагов не требуется.

Второй тип распространен у нематод и териообразных млекопитающих и, согласно гипотезе Оно С (ОИио 8.), включает два этапа дозовой компенсации, благодаря которым достигается баланс дозировки генов между самцами и самками, а также между Х-сцепленной и аутосомной экспрессией [35]. Классический взгляд на дозовую компенсацию у млекопитающих и С. elegans предполагает, что у гомогаметного пола происходит двукратное снижение экспрессии Х-сцепленных генов, чтобы уравнять экспрессию генов между полами. Однако такое подавление Х-хромосомы только увеличивает разницу дозировок между Х-сцепленной и аутосомной экспрессией [21,35,40,41]. Таким образом, было высказано предположение, что существует регуляторный механизм, который первоначально повышает экспрессию Х-сцепленных генов у обоих полов, корректируя дисбаланс дозировки генов между Х-хромосомой и аутосомами у самцов и тем самым приводя к избыточной транскрипции у самок (тетрасомия). Далее, чтобы восстановить правильную дозу генов между Х-хромосомой и аутосомами у гомогаметного пола, происходит снижение экспрессии Х-сцепленных генов [42,43]. Так, у самок млекопитающих полностью подавляется транскрипция генов на одной из двух Х-хромосом, а у гермафродитов С. elegans в два раза снижается уровень экспрессии генов одновременно на обеих Х-хромосомах [44]. Хотя молекулярные механизмы, которые управляют репрессией Х-хромосомы у млекопитающих и С. elegans,

и и и и -г г

хорошо изучены, предполагаемый первый этап двойной регуляции экспрессии Х-хромосомы остается спекулятивным.

В случае, когда сцепленная с полом экспрессия значительно снижена у гетерогаметного пола по сравнению с гомогаметным, происходит неполная дозовая компенсация по третьему типу. Данный механизм повсеместно распространен среди организмов с системой половых хромосом где гетерогаметным полом

является самка (2Ш). Единственным известным исключением является отряд насекомых Lepidoptera (мотыльки и бабочки), в котором происходит репрессия 2-хромосомы у самцов по типу нематоды [45,46].

Третий тип дозовой компенсации лучше всего описан у птиц, в частности у курицы. Предполагалось, что у гетерогаметного пола (2Ш), по аналогии с дозовой

компенсацией у Б. melanogaster, будет компенсирована 2-хромосома. Однако полногеномный анализ экспрессии с использованием микрочипов и КЫА^ед показал, что экспрессия 2-сцепленных генов у самок на 30% ниже, чем у самцов [40,47,48]. При этом большинство локусов на 2-хромосоме у самок проявляют эффекты частичной дозовой компенсации и только некоторые полностью компенсируются. Кроме этого, протеомный анализ показал, что многие Z-сцепленные гены имеют дополнительную дозовую компенсацию во время трансляции белка [49]. Таким образом, у всех птиц дозовая компенсация функционирует на уровне отдельных генов посредством различных транскрипционных и трансляционных регуляторных механизмов. Стоит отметить, что при неполной дозовой компенсации возникает проблема гемизиготности по ряду 2-сцепленных генов. Известно, что гемизиготность по нескольким генам или небольшим районам генома может и не иметь каких-либо последствий для организма, тогда как гемизиготность более продолжительных сегментов или целых хромосом смертельна. Возможно, в случае птиц, обедненность обеднённость генами 2-хромосомы позволяет обходиться без механизмов дозовой компенсации, затрагивающих полностью всю хромосому [50].

В исследованиях Гу (Ыщ1 Ои) описан случай комбинированной дозовой компенсации у Бanaus plexippus (бабочки-монарха) [37]. Б. plexippus вызывает особый интерес из-за своей 2-хромосомы (пео^), которая возникла в результате слияния предковой 2-хромосомы (апс^) и аутосомы. Эта генетическая система предоставляет уникальную возможность изучить две группы сцепленных с полом генов с разными эволюционными путями на одной половой хромосоме. Сравнение уровней экспрессии генов между пео-2-хромосомой и аутосомами у Б. plexippus обнаруживает удивительно разные механизмы дозовой компенсации на двух Z-сегментах, происходящих от предковой 2-хромосомы и после слияния с аутосомой (апс-2- и пео-2-сегментах). На апс-2-сегменте экспрессируемые гены демонстрируют в среднем почти половину аутосомных уровней у обоих полов, как и ожидалось, учитывая предыдущие исследования чешуекрылых [45,51,52] Однако на пео-2-сегменте такого снижения уровне экспрессии генов не наблюдается ни у одного пола. Этот результат предполагает развитие полной дозовой компенсации у гетерогаметных самок в этом недавно возникшем сегменте 2-хромосомы. Более

того, метка Н4К16ас, ассоциированная с активно транскрибируемым хроматином, по-разному распределена на сегментах 2-хромосомы. В предковом апс-2-сегменте наблюдается пониженный уровень Н4К16ас, что согласуется с уменьшением уровня транскрипции генов на этом участке у самцов почти вдвое (подобно нематодам). И наоборот, пео-2-сегмент демонстрирует повышенный уровень метки Н4К16ас (как у дрозофилы). Новый двойной режим дозовой компенсации, выявленный у бабочки монарха, представляет собой интересную модельную систему для изучения эволюции дозовой компенсации.

В отличие от инактивации Х-хромосомы, которая активно изучается уже более полувека, эксперименты по изучению активации Х-хромосомы на уровне всего генома стали возможны только в последние десятилетия, когда стали доступны подходы по полногеномным исследованиям уровней экспрессии генов, профилей связывания хроматин-ассоциированных белков, гистоновых меток.

2.2 Регуляция дозовой компенсации у D. melanogaster

2.2.1 Определение пола у D. melanogaster

Дозовая компенсация Х-хромосомы и определение пола у дрозофилы достигаются двумя независимыми и взаимосвязанными механизмами, которые включают ген sxl (sex lethal). В отличие от млекопитающих, у которых пол определяется наличием или отсутствием Y-хромосомы, у D. melanogaster детерминация пола зависит от числа Х-хромосом. Сигнал о дозе Х-хромосом передается через регуляторные белки таким образом, что белок Sxl активно экспрессируется только у особей с двумя X-хромосомами [53,54]. Еще ранние исследования установили, что мухи с набором половых хромосом XY и XO — самцы (при этом XO стерильны), а мухи XX и XXY — самки (обе фертильны) [55].

Ген sxl находится на Х-хромосоме и по данным FlyBase кодирует 24 различных транскрипта. Экспрессия белка Sxl происходит с двух промоторов: с раннего промотора SxlP(e), обеспечивающего временную специфическую для самок экспрессию Sxl на стадии синцитиальной бластодермы; и с конститутивного -SxlP(m), включающегося на стадии клеточной бластодермы у самок и самцов и обеспечивающего экспрессию белка на протяжении всей жизни [56-58].

Все мРНК sxl, специфичные для самцов, экспрессируются с позднего промотора SxlP(m) и включают третий экзон, содержащий стоп-кодон, вследствие чего транслируются усеченные, неактивные варианты белка. В свою очередь у самок мРНК xl транскрибируются с SxlP(m) промотора и при сплайсинге 3й экзон вырезается, что необходимо для получения функционального белка (Рисунок 1) [56,58,59]. Дополнительные структурные различия возникают за счет альтернативного сплайсинга.

Рисунок 1. Схема образования продуктов гена sxl. Ген sxl длиной ~20 т.п.н., содержащий 11 экзонов, за счет использования двух промоторов и альтернативного сплайсинга дает 24 различных транскрипта, которые можно разделить на три класса. Специфичный для эмбрионов экзон E1 синего цвета. Терминирующий специфичный для самцов экзон красного цвета. Остальные экзоны серого цвета. Взято с изменениями из [60]

Ранние, специфичные для самок, мРНК sxl, транскрибируемые с SxlP(e) промотора, имеют консервативный паттерн сплайсинга, в котором 2ой и 3ий (терминирующий) экзоны исключаются из зрелых транскриптов и экзон Е1 сплайсируется с четвертым экзоном (Рисунок 1) [60]. Следовательно, ранние и поздние белки Sxl у самок отличаются N-концевой аминокислотной последовательностью.

Считается, что все биологические функции Sxl связаны с его способностью распознавать и избирательно связывать РНК. Sxl содержит два высококонсервативных РНК-связывающих домена типа RRM6. Анализ in vitro показал, что Sxl преимущественно связывается с длинными поли(и)-участками, прерываемыми гуанозинами [61]. Удивительно, но эта консенсусная последовательность — UUU UGU U(G/U) U(G/U) UUU (G/U) UU - относительно распространена, в геноме идентифицированы тысячи копий [62]. Вырожденность мотива связывания с белком Sxl позволяет предположить, что в дополнение к своей РНК-связывающей активности для достижения специфического связывания, Sxl требуются белок-белковые взаимодействия [60].

Регуляцию экспрессии sxl в соматических клетках можно разделить на две фазы: инициацию и поддержание (Рисунок 2). Инициация - это, прежде всего, транскрипционный ответ с промотора SxlP(e) на дозу Х-хромосомы, который может быть запущен в короткий период, заканчивающийся на клеточной стадии бластодермы. Далее происходит переключение транскрипции с промотора 8х1Р(е) на SxlP(m). Поддержание экспрессии зависит от установки положительного авторегуляторного контроля сплайсинга поздних транскриптов с промотора SxlP(m). После чего происходит «запирание» sxl во включенном режиме на протяжении всей жизни особи [57,60].

Инициация

синцитиальная бластодерма

клеточные деления

Поддержание

начиная с гаструляции

SxlP(e) 1

пре-мРНК

I

мРНК (Е1-4) 1

SXL белок —

XSE

♦ SxlP(m)

I

пре-мРНК

-I

мРНК (L1-2-4) 1

SXL белок —

Sxl(m)

I

пре-мРНК мРНК (L1-2-4)

I

SXL белок-

Рисунок 2. Схема регуляции экспрессии гена sxl. На протяжении инициирующей фазы транскрипция sxl активируется в ответ на две дозы белков XSE, экспрессирующихся с Х-хромосом. Белок Sxl, наработанный с промотора SxlP(e), регулирует сплайсинг вновь транскрибированной РНК с промотора SxlP(m) по обратной положительной связи. Во время поддерживающей фазы происходит выключение промотора SxlP(e) и транскрипция sxl идет только с SxlP(m) как у самок, так и у самцов. Установление положительной авторегуляторной петли приводит к конститутивной работе промотора SxlP(m). Взято с изменениями из [60]

Включение транскрипции гена sxl с раннего промотора зависит от уровня экспрессии четырех белков (Scute, SisA, Runt и Unpaired), гены которых расположены на Х-хромосоме. Данную группу белков назвали Х-сцепленными сигнальными элементами (XSE, X-linked signal elements) [54,63-67]. Эти белки служат первичными детерминантами дозы Х-хромосомы у эмбриона. Белки Scute, SisA, Runt непосредственно активируют промотор SxlP(e), связываясь с ним в качестве гетеродимерных комплексов: Scute-Da (Daughterless), SisA-Runt. В свою

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Тихонова Евгения Андреевна, 2024 год

3.5.1 Использованные линии мух

Для работы были использованы следующие линии мух: y1w1118 - лабораторная линия мух с мутациями генов yellow и white. Тело, крылья, щетинки и глаза лишены пигментации.

y1w1118; KrIf-1/SM5 - лабораторная линия с балансером второй хромосомы.

y1w1118; Sb[1] / TM6B, Tb[1], Hu - лабораторная линия с балансером третьей

хромосомы.

y1w1118; KrIf-1/SM5; Sb[1] / TM6B, Tb[1], Hu - лабораторная линия с балансерами второй и третьей хромосом.

msl-2[227] bw[1]/CyO - линия мух из Bloomington Drosophila Stock Center, #5871. Данная линия несет мутантный аллель гена msl-2[227], летальный в гомозиготном состоянии для самцов.

Линии D. melanogaster содержались при температуре 25°C на стандартной дрожжевой среде.

3.5.2. Использованные плазмиды

Для получения трансгенных мух использовали плазмиду, содержащую сайт attB для фС31 -зависимой интеграции, сильный промотор гена Ubi63E с его 5'НТО, последний интрон гена dctcf с его 3'НТО и сигнал полиаденилирования вируса SV40; безинтронный ген yellow использовался в качестве репортера для поиска трансформантов. Ген yellow отвечает за пигментацию кутикулярных структур личинки и имаго, и находится под контролем нескольких тканеспецифичных энхансеров [182]. Отбор трансгенных мух осуществляли визуально на основе фенотипического проявления гена yellow.

3.5.3. Получение трансгенных линий дрозофил

Трансгенные конструкции инъецировали в пребластодермальные эмбрионы. Встройка конструкций в геном осуществлялась с помощью фС31-опосредованной сайт-специфической интеграции в локусе 86F8 в соответствующую линию (линия 86Fb) с встроенным сайтом аиР [183]. Полученные после инъекции мухи скрещивались с мухами лабораторной линии у1^1118, и трансгенное потомство идентифицировали по пигментации кутикулярных структур. Гомозиготные линии получали путем серии скрещиваний через балансер третьей хромосомы. Линии, летальные в гомозиготном состоянии, поддерживали на балансерных хромосомах.

3.5.4. Генетические скрещивания

Для выведения дрозофил, экспрессирующих варианты MSL2-Fх3, встроенные в район 86F8 на третьей хромосоме, на фоне нуль-мутации, трансгенные мухи и несущие мутантный аллель msl-2[227] на второй хромосоме, скрещивали на линию мух с двумя балансерными хромосомами у^1118; Кг^-1^Ы5; Sb[1] / ТМ6В, ТЬ[1], Ни.

3.5.5. Подсчет выживаемости трансгенных линий мух

Для подсчета выживаемости самцов, экспрессирующих варианты MSL2-Fх3 на фоне нуль-мутации msl-2[227], были поставлены скрещивания в трех повторах для каждой трансгенной линии:

$ msl-2[227]/SM5;+/TM6B х $ msl-2[227]/SM5;консmрукция/TM6B Выживаемость самцов считалась как отношение количества самцов (msl-2[227];конструкция/+) к сумме самок (msl-2[227];конструкция/+) и самцов (msl-2[227];кон струкция/+).

3.5.6. Приготовление белкового экстракта из дрозофил

Двадцать взрослых 2-3 дневных мух гомогенизировали пестиком в 200 мкл 1*PBS, содержащем 1% Р-меркаптоэтанола, 10 мМ PMSF и 5 мкг/мл коктейль полного ингибитора протеаз VII (Calbiochem). Суспензию обрабатывали ультразвуком 3 раза по 5 секунд при мощности 5 Вт. Затем добавляли 200 мкл буфера для нанесения 4х SDS-PAGE, смесь инкубировали в течение 10 минут при 95°C и центрифугировали при 16000 g в течение 10 минут.

3.6 Иммуноокрашивание политенных хромосом у дрозофилы 3.6.1. Приготовление препаратов политенных хромосом у дрозофилы

Все растворы, используемые в протоколе, готовили ex tempore и охлаждали до 4°C. Личинки 3-го возраста Drosophila melanogaster выращивали при 25°C в стандартных условиях. Самцов от самок отличали по наличию семенников. Для препарирования слюнных желез, личинки отмывали в PBS. После помещали в каплю 1-го раствора (PBS, 0,5% NP-40) на предметное стекло и под бинокуляром, с использованием пинцетов, слюнные железы выдирали и очищали от жировой ткани. Далее слюнные железы последовательно инкубировали по 40 сек. в фиксирующих растворах: во 2-ом (PBS, 2% NP-40, 3,7% формальдегида) и 3-ем (45% уксусная кислота, 3,7% формальдегида). После 3-го раствора слюнные железы переносили в 45% раствор уксусной кислоты и под покровным стеклом постукиванием разрушали, одновременно расправляя политенные хромосомы. Качество препаратов проверяли под микроскопом. Далее препараты раздавливали под покровным стеклом, замораживали в жидком азоте, скалывали покровное стекло и помещали в охлажденный этиловый спирт или PBS. Если была необходимость, препараты хранили при -20°C в этиловом спирте.

3.6.2. Иммуноокрашивание политенных хромосом

Препараты политенных хромосом отмывали 2 раза по 10 минут в PBST (PBS, 0,1% Tween-20) при комнатной температуре на ротаторе. Далее проводили забивку в растворе (PBS, 0,1% Tween-20, 3% BSA, 10% молоко) в течение 30 мин при комнатной температуре во влажной камере. После удаления забивочного раствора, препараты инкубировали с первичными антителами в PBST, 3% BSA, 10% молоке (a-FLAG мышиные в разведении 1:50, a-MSL1 кроличьи в разведении 1:500, a-MSL2 кроличьи в разведении 1:500) в течение ночи при 4°C во влажной камере. Далее проводили отмывки на ротаторе 4 раза по 10 минут в PBST. Инкубировали со вторичными антителами в PBST, 3% BSA, 10% молоке (слитые с Alexa Fluor 488, козьи анти-мышиные в разведении 1:2000 и слитые Alexa Fluor 555 козьи антикроличьи в разведении 1:2000 (Invitrogen)). После инкубации с антителами проводили отмывки на ротаторе 4 раза по 10 минут в PBST. и окрашивали DAPI (AppliChem). Изображения получали на флуоресцентном микроскопе Nikon Elclipse Ti с использованием цифровой камеры Nikon DS-Qi2, обрабатывали с помощью ПО ImageJ 1.50c4 и Fiji bundle 2.0.0-rc-46.

3.7 Иммунопреципитация хроматина с последующей количественной ПЦР

(кПЦР)

3.7.1. Приготовление хроматина для иммунопреципитации

Все процедуры проводились на льду с ледяными растворами. Мух 2-3-дневного возраста собирали, замораживали в жидком азоте и измельчали (500 мг) в гомогенизаторе Поттера в 10 мл буфера A (15 мМ HEPES-KOH, pH 7,6, 60 мМ KCl, 15 мМ NaCl, 13 мМ EDTA, 0,1 мМ EGTA, 0,15 мМ спермина, 0,5 мМ спермидина, 0,5% NP-40, 0,5 мМ DTT, 0,5 мМ PMSF и коктейль ингибиторов протеаз Calbiochem Complete Protease Inhibitor Cocktail V). Затем суспензию гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса и фильтровали через 70 мкм найлоновую сеточку (BD Biosciences, США). Ядра осаждали центрифугированием при 4000 g, 4°C, в течение

5 мин в буфере с добавлением сахарозы, ресуспендировали в буфере для промывки (15 мМ HEPES-KOH, pH 7,6, 60 мМ KCl, 15 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0,1 мМ EGTA, 0,1% NP-40, коктейль ингибиторов протеаз Calbiochem Complete Protease Inhibitor Cocktail V) и сшивали в 1% формальдегиде в течение 15 минут при комнатной температуре. Сшивку останавливали путем добавления глицина до конечной концентрации 125 мМ. Ядра промывали тремя порциями по 10 мл буфера для промывки и ресуспендировали в 1 мл лизис-буфера (15 мМ HEPES, pH 7,6, 140 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0,1 мМ EGTA, 1% Triton X-100, 0,5 мМ DTT, 0,1% натрия деоксихолата, 0,1% SDS, коктейль ингибиторов протеаз Calbiochem Complete Protease Inhibitor Cocktail V). Суспензию обрабатывали ультразвуком (20x30 с с интервалами в 60 с, на льду), аликвоту объемом 50 мкл использовали для проверки эффективности обработки хроматина и измерения концентрации ДНК. Остатки мембран удаляли центрифугированием при 14000 g, 4°C, в течение 10 минут. Далее пробы использовали для иммунопреципитации или замораживали в жидком азоте и хранили при -70°C.

3.7.2 Иммунопреципитация хроматина с последующей кПЦР

Хроматин в количестве 10-100 мкг эквивалента ДНК доводили до объема 5001000 мкл лизис-буфером и инкубировали с Protein A-агарозой (Pierce), блокированной БСА и ДНК спермы лосося. Затем образцы хроматина центрифугировали и супернатант разделяли на отдельные аликвоты, содержащие по 10-20 мкг эквивалента ДНК, доводили до 1 мл лизис-буфером, инкубировали в течение ночи при 4°C с антителами против MSL1 (1:500), MSL2 (1:200), CLAMP (1:200) или с неспецифическими IgG кролика (контроль). Затем к смеси лизата с антителами добавляли блокированную Protein A-агарозу и инкубировали при 4°C в течение 5 часов. После трех раундов промывки лизисным буфером с 500 мМ NaCl и однократной промывкой TE-буфером (10 мМ Tris-HCl, pH 8; 1 мМ EDTA) ДНК элюировали, проводя инкубацию в буфере для элюции (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0; 1 мМ EDTA, 1% SDS) при 65°C, белки и РНК удаляли путем добавления протеиназы К и РНКазы А. ДНК очищали при помощи фенол-хлороформной экстракции с

последующим переосаждением. Обогащение специфических фрагментов ДНК анализировали методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени на QuantStudio 12K Flex Cycler (Applied Biosystems).

Для каждой линии мух было получено три независимых образца хроматина. Результаты иммунопреципитации хроматина представлены в виде процента обогащения ДНК тестируемого района после иммунопреципитации по отношению к ДНК хроматина до иммунопреципитации, нормализованного относительно положительного контроля (геномный сайт вне СПП, с которым связывается изучаемый белок). Кодирующий участок гена тубулина-y37C (не содержащий участков связывания для тестируемых белков) использовался в качестве отрицательного контроля; аутосомный MSLl-связывающий район 26E3, MSL2-связывающий район 25A3 и CLAMP-связывающий район 39A1 использовались в качестве положительных контролей.

3.8 Работа с РНК 3.8.1 Выделение РНК

РНК выделяли из взрослых 2-3-дневных самцов и самок при помощи реагента TRI (Molecular Research Center, США) в соответствии с инструкциями производителя. РНК обрабатывали двумя единицами ДНКазы I Turbo (Ambion) в течение 30 минут при 37°C для удаления геномной ДНК.

3.8.2 Обратная транскрипция

Реакцию обратной транскрипции проводили в 20 мкл реакционной смеси. Синтез кДНК проводили при 42 °C в течение 2-3 часов. Для синтеза кДНК брали 2 мкг выделенной РНК, 50 единиц обратной транскриптазы ArrayScript (Ambion) и 1 мкМ олиго^Т) в качестве праймера.

3.8.3 ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени

Количество специфических фрагментов кДНК, соответствующих гоХ1 и гоХ2, определяли методом ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени.

dir

RoX1 CTTGTGCГTTCTCCT

GAATGTG RoX2 TTCGAAACGTTCTCC GAAGC

RpL34 ACAACACACGCTCC ААСА

rev

TGTATTAGGCGGAGCT

тегте

AGTCGTACTCATCTCA CTGTCC

GGGTGATACCCTTCAA CTTCTC

Taqman probe

FAM-AGCCTATGAAATCCGGTCCAACCC-

BHQ1

FAM-

AGCAAGAGTAACGATTTCCGCATAGTCG -BHQ1

FAM-TGGTAAACCAGACGACCACCGG-BHQ

4 Результаты

4.1 Картирование доменов, необходимых для взаимодействия друг с другом

белков CLAMP и MSL2

Белок CLAMP был найден в скрининге как фактор, стимулирующий транскрипцию с СПП в S2-клетках [180]. Последующие исследования подтвердили связь CLAMP с КДК [17]. Частичная инактивация CLAMP с помощью РНК-интерфереции приводила к снижению присутствия MSL2 и MSL3 на Х-хромосоме самцов. Полногеномный ChiP-seq-анализ показал, что CLAMP способен узнавать GA-богатые последовательности в составе МСК [18]. Значительная роль белка CLAMP в рекрутировании КДК на Х-хромосому предполагает непосредственное взаимодействие этого белка с MSL-белками. Поэтому первой задачей работы была проверка этого предположения.

Для исследования возможности прямого взаимодействия CLAMP с компонентами КДК была использована дрожжевая двугибридная система. Были получены конструкции, которые экспрессировали в дрожжах белки MSL2, MSL1 и CLAMP, слитые либо с ДНК-связывающим доменом (ДСД) либо с активационным доменом (АД) дрожжевого белка GAL4. Дрожжи штамма pJ69-4A, ауксотрофные по гистидину, могут расти на чашках в отсутствие гистидина, когда тестируемые белки, слитые с ДСД и АД, взаимодействуют друг с другом. В такой системе белок, слитый с ДСД, связывается с GAL4-зависимым промотором репортерного гена his3, а взаимодействующий с ним белок, слитый с АД транскрипционного фактора GAL4, активирует промотор гена. Все слитые с АД или ДСД белки были протестированы на отсутствие взаимодействия с ДНК-связывающим доменом и активационным доменом дрожжевого белка GAL4. Анализ выявил устойчивое и воспроизводимое взаимодействие ДСД-MSL2 и АД-CLAMP (Рисунок 11А, Б).

Следующей задачей стало картирование доменов в белках CLAMP и MSL2, с помощью которых они взаимодействуют друг с другом. С этой целью были получены делеционные производные белка CLAMP в векторах для дрожжевой двугибридной системы: CLAMP [1-377] а.о., CLAMP [1-259] а.о., CLAMP [1-196]

а.о., CLAMP [1-153] а.о., CLAMP AN-ZnF1 (Рисунок 11 А). Все полученные варианты белка CLAMP были исследованы на взаимодействие с белком MSL2 в дрожжевой двугибридной системе. В результате было установлено, что для взаимодействия с MSL2 необходим N-концевой C2H2-домен белка CLAMP (Рисунок 11А).

Рисунок 11. Тестирование делеционных производных MSL2 и CLAMP на взаимодействие в дрожжевой двугибридной системе. А. Фрагменты CLAMP были слиты с активационным доменом GAL4 и тестировались против ДСД-MSL2. Б. Делеционные производные MSL2 были слиты с ДНК-связывающим доменом GAL4 и тестировались против АД-CLAMP. Для проверки функциональности делеционных производных MSL2 было подтверждено, что АД-MSL2 [1-463] а.о., АД-MSL2 [1-573] а.о., АД-MSL2 [1-708] а.о. все еще могут взаимодействовать с ДСД-MSL! через N-концевой мотив лейциновой молнии в дрожжевой двугибридной системе. Результаты представлены в колонке справа, где "+" и "-" означают наличие или отсутствие взаимодействия, соответственно.

Для картирования участка белка MSL2, который связывается с CLAMP, были сделаны производные с делецией С-конца: MSL2 [1-463] a^., MSL2 [1-573] a^., MSL2 [1-708] a^. В качестве контроля функциональности делеционных производных MSL2 было проведено исследование на взаимодействие производных MSL2 c MSL1. В результате было показано, что АД-MSL2 [1-463] а.о., АД-MSL2 [1573] а.о., АД-MSL2 [1-708] а.о. взаимодействуют с ДСД-MSLl, в то время как с АД-CLAMP взаимодействует только ДСД -MSL2 [1-708] а.о. (Рисунок 11Б). Таким образом, было показано, что участок MSL2 573-708 а.о. участвует во взаимодействии с N-концевым доменом CLAMP.

Для подтверждения результатов дрожжевой двугибридной системы и более детального картирования взаимодействующих участков в белках CLAMP и MSL2 был использован метод соосаждения рекомбинантных белков (pull-down). С этой целью были созданы конструкции для экспрессии в бактериях фрагментов CLAMP и MSL2, слитых с GST либо с тиоредоксин-6xHis (TRX-His). В качестве отрицательных контролей были использованы пептид GST и рекомбинантный белок TRX-His-MSL2[1-195], который содержит только RING-домен белка MSL2. Проведенный анализ подтвердил взаимодействие между CLAMP [1-153] а.о. и MSL2[573-708] а.о. (Рисунок 12А). Используя производные TRX-His-CLAMP и GST-MSL2[573-708] а.о. было показано, что фрагмент CLAMP [86-153] а.о., содержащий C2H2-цинковый палец, взаимодействует с MSL2 (Рисунок 12Б).

Рисунок 12. Картирование участка CLAMP, взаимодействующего с MSL2 [573-708] а.о. in vitro. А. Подтверждение взаимодействия между CLAMP [1-153] а.о. и MSL2 [573-708] а.о. in vitro Б. Тестирование взаимодействия in vitro между GST-MSL2 [573-708] а.о. и производными TRX-His-CLAMP. Звездочкой обозначено положение GST-MSL2 [573-708] а.о.

Для идентификации консервативных аминокислот в последовательности 573708 а.о. белка MSL2, было проведено сравнение этого района у основных изученных видов дрозофилы (Рисунок 13). Выравнивание аминокислотной последовательности выявило высокую консервативность региона (618 - 685 а.о.).

618

685

Dmel/MSL2

Dsim/GD15895

Dsec/GM11132

Dyak/GE14867

Dere/GG24438

Dana/GF23410

Dper/GL18894

Dpse/GA16882

Dgri/GH10188

Dmoj/GI14252

Dvir/msl-2

Dwil/GK238 60

ISLVPLNNLQQSQHPLVLVQNEKGEYQGFNIFQGSKPLDPVTVGFTIRVQLQHTDG-FGSLPQYAYIMP ISLVPLNNLQHSQHPLVLVQNEQGDYQGFNIFQGNKPLDPVAAGFTMRVQLQHTDG-NGSVPQHAYMMP

islvplnnlqhsqhplvlvqneqgdyqgfnifqgnkpldpvaagftmrvqlqhtdg-ngsvpqhaymmp islvplnnlqhsqhplvlvqnelgdyqgfnifqgskpvdpatvgf-Mrvqlqhsdg-ngsvpqyaymmp

ISLVPLSNLQQCQHPLVLVQNELGEYQGFNIFQGSKPVDPATVGF-IRVPLRHSDG-NGTVPQYAYIMP LTFVPLSNLQQSQHPLVLVQNKKGEFQGFNILRNNVPLHPATLGW-PCIQLQNNDG-NSSIPQFAYLYP ISLVPLSNLQQSQHPLVLVQNENGEYQGFNIFQGTVPIDPATVGF-LRVQLQNNDP-KSKVPQYAYVMP ISLVPLSNLQQSQHPLVLVQNENGEYQGFNIFQGTVPIDPATVGF-LRVQLQNNDP-KSKVPQYAYVMP FTLVPAAQQ—SEHPLVYMMNETGDYQGFNIFNGNAPLDPAQLGF-PRIPFPSKDG-KKSTTEFIYFMP FTLVPLDNLQQSQHPLVLMQNENGQYQGFNIFNGSEPVDPATLGF-QRVPLRSNDG-NSSIPEFAYIMP FTLVPLDNLQQTQHPLVLMQNENGQYQGFNIFNGTEPVDPAQLGF-QRVPLRSNDG-NTSIPEFAYVMP LTLVALSNPEQSQHPLVLVQNENNEMQCFNIFQGDVPIDPANYGF-QRVQLQNKDSGNNSIPQYAYMAM

Рисунок 13. Сравнение аминокислотной последовательности MSL2 и его гомологов из различных видов Drosophila. Желтым обозначены аминокислоты с консервативностью 100%, включая замены аминокислот со схожими свойствами (полярные, неполярные, отрицательно заряженные, положительно заряженные), синим - аминокислоты с консервативностью 80%, зеленым - аминокислоты с консервативностью 60%.

Основываясь на консервативности аминокислотной последовательности С-конца MSL2, был разработан набор фрагментов для более точного картирования участка, взаимодействующего с CLAMP (Рисунок 14А). Были созданы делеционные производные MSL2, слитые с GST, которые тестировались на соосаждение с рекомбинантным белком TRX-His-CLAMP [1-153] а.о. Анализ показал, что критическими для его взаимодействия с CLAMP являются аминокислоты 618-655 MSL2 (Рисунок 14Б).

Рисунок 14. Исследование взаимодействия CLAMP и фрагментов MSL2 in vitro. А. Схема полученных фрагментов MSL2, используемых в экспериментах pull-down. Результаты анализа взаимодействия фрагментов MSL2 с TRX-His-CLAMP [1-153] а.о. представлены как "+" и "-", означающие наличие или отсутствие взаимодействия, соответственно. Б. Тестирование

взаимодействия in vitro между TRX-His-CLAMP [1-153] а.о. и производными GST-MSL2. Звездочкой обозначено положение TRX-His-CLAMP [1-153].

При исследовании взаимодействий между эукариотическими белками in vitro иногда наблюдаются неспецифичные взаимодействия, связанные с неправильной конформацией некоторых белков или пептидов, синтезируемых в бактериях, и их высокой концентрацией, приводящей к агрегации белковых молекул. Поэтому был проведен дополнительный контрольный эксперимент с целью подтвердить найденное взаимодействие непосредственно в клетках дрозофилы. С этой целью были созданы конструкции, экспрессирующие CLAMP, слитый с эпитопом 3хHA, и MSL2, слитый с эпитопом 3хFLAG. Исследование взаимодействия между белками было проведено при их коэкспрессии в S2-клетках дрозофилы. Неожиданно оказалось, что полноразмерный белок MSL2 крайне нестабилен при его избыточной экспрессии в S2-клетках. Этот результат можно объяснить тем, что белок MSL2 содержит RING-домен, обладающий убиквитин-лигазной активностью [108]. Было показано, что MSL2 может индуцировать убиквитинирование самого себя, а также других белков КДК. При этом убиквитинированию и последующей деградации подвергается преимущественно свободный белок MSL2, что и наблюдается при его оверэкспресси в S2-клетках. Поэтому мутантный белок MSL2, у которого удален RING-домен или сайты убиквитинирования, проявляет более высокую стабильность при экспрессии в S2-клетках. Вследствие этого был проведен повторный эксперимент, для которого были созданы конструкции, экспрессирующие 3хFLAG-MSL2 белок без N-концевого RING домена (Д41-81 а.о.) или С-концевого домена, богатого положительно заряженными аминокислотами и содержащего сайт убиквитинирования (Basic - 714-726 а.о.) [108] (Рисунок 15). Анализ показал, что наибольшей стабильностью при оверэкспрессии в S2-клетках обладал мутантный белок MSL2 с делецией региона Basic (3хF-MSL2ДB).

Рисунок 15. Иммуноблот-анализ белковых экстрактов из S2-клеток, трансфицированных экспрессионными

плазмидами, содержащими последовательности 3хРЬАО-М8Ь2 (WT), 3xFLAG-MSL2ДB (ДБ) и 3xFLAG-MSL2ДRING (ДRING). Детекция вариантов белка MSL2 проводилась антителами против эпитопа 3хFLAG. Качество белкового экстракта контролировалось антителами против белка GAF.

В результате коиммунопреципитации белковых экстрактов, выделенных из 82-клеток, коэкспрессирующих 3xHA-CLAMP и 3xFLAG-MSL2AB, было подтверждено взаимодействие между CLAMP и MSL2 in vivo. Для доказательства, что именно участок 618-655 а.о. белка MSL2 отвечает за взаимодействие, была создана конструкция для экспрессии в 82-клетках белка MSL2 c делецией 642-654 а.о. и С-концевого домена Basic (3xFLAG-MSL2A13AB). В результате было показано, что 3xHA-CLAMP эффективно коиммунопреципитирует белок 3xFLAG-MSL2AB, но не 3xFLAG-MSL2A 13AB, демонстрируя, что участок 642-654 MSL2 необходим для взаимодействия с CLAMP in vivo (Рисунок 16).

Рисунок 16. Тестирование делеционных производных MSL2 на взаимодействие с CLAMP in vivo. Ядерный экстракт из S2-клеток, котрансфицированный 3xHA-CLAMP и 3xFLAG-MSL2, был иммунопреципитирован антителами против CLAMP. Иммунопреципитаты (IP) были проанализированы с помощью вестерн-блот-анализа на присутствие 3xFLAG-MSL2. Неспецифические кроличьи IgG использовались в качестве отрицательного контроля. Качество иммунопреципитации контролировали вестерн-блот-анализа на наличие 3xHA-CLAMP. "Input" -образцы исходного белкового экстракта, до иммунопреципитации; "output" - супернатант после удаления иммунопреципитата.

Проведенные эксперименты in vitro и in vivo позволили установить взаимодействие CLAMP и MSL2 и продемонстрировали необходимость для этого связывания N-концевого C2H2-домена CLAMP и участка 618-655 а.о. в составе MSL2.

4.2 Исследование роли СХС-домена белка MSL2 в рекрутировании комплекса

дозовой компенсации на Х-хромосому

Структурный анализ показал, что MSL2 с помощью CXC-домена способен связываться с ДНК и узнавать динуклеотидную последовательность через аргинин в положении 543 [14]. Полногеномное исследование связывания геномной ДНК in vitro продемонстрировало, что MSL2 специфически связывается с особым подклассом СПП, которые назвали PionX (pioneering sites on the X) [15].

Для исследования роли CXC-домена в специфичном связывании КДК с Х-хромосомой были созданы трансгенные мухи, экспрессирующие мутантные варианты белка MSL2, содержащие эпитоп 3xFLAG на С-конце. Для инактивации CXC-домена использовалась ранее охарактеризованная точечная мутация [14], которая заменяет критический для связывания ДНК аргинин в положении 543 на аланин (MSL2R543A-3xF). Также была сделана производная MSL2 с полной делецией CXC-домена (MSL2ACXC-3xF). В качестве контрольной линии использовались трансгенные мухи, экспрессирующие полноразмерный белок (MSL2-3xF). Все производные MSL2 экспрессировались с помощью убиквитинового промотора. Для интеграции конструкций в геном был использован метод, основанный на сайт-специфичной рекомбинации, осуществляемой интегразой фага фС31 [183]. Все конструкции были встроены в один геномный сайт на 3-й хромосоме в район 86F8. Вестерн-блот-анализ показал, что все варианты MSL2 экспрессировались в трансгенных мухах на эквивалентном уровне (Рисунок

17).

Рисунок 17. Иммуноблот-анализ белковых экстрактов из взрослых мух, экспрессирующих MSL2-3xF (WT), MSL2R543A-3xF (R*) и MSL2ACXC-3xF (ACXC). Детекция вариантов белка MSL2 проводилась антителами против эпитопа 3хFLAG. Качество белкового экстракта контролировалось антителами против белка GAF.

Известно, что эктопическая экспрессия MSL2 у самок инициирует сборку функционального КДК на Х-хромосоме [89], что приводит к сильному повышению экспрессии генов и, как следствие, снижению жизнеспособности. Как и ожидалось, самки, экспрессирующие MSL2 дикого типа, имели низкую жизнеспособность. Наблюдалось практически полное отсутствие самок, гомозиготных по трансгену MSL2-3xF (около 1% от общего числа самок) и сниженное количество гетерозиготных самок (38% самок относительно гетерозиготных самцов) (Рисунок 18А). Стоит отметить, что эктопическая экспрессия MSL2-3xF приводила и к снижению гомозиготных самцов. В то же время наблюдалась нормальная выживаемость у гомозиготных как самок, так и самцов, экспрессирующих мутантные по CXC-домену производные MSL2 (Рисунок 18Б). Эти результаты показывают, что функциональная активность мутантных вариантов MSL2 была, по крайней мере, частично нарушена.

Рисунок 18. Выживаемость трансгенных мух. А. Процентное соотношение гомозиготных и гетерозиготных особей в трансгенной линии мух, экспрессирующей MSL2-3xF (WT). Б. Процентное соотношение количества самок и самцов в линиях мух, несущих трансген MSL2-3xF ^Т) в гетерозиготе, MSL2R543A-3xF и MSL2ЛCXC-3xF (А) в гомозиготе. В. Выживаемость самок и самцов трансгенных мух, экспрессирующих MSL2-3xF ^Т), MSL2R543A-3xF и

MSL2ЛCXC-3xF (ЛСХС) на фоне нуль-мутации msl27227. В качестве внутреннего контроля использовались мухи, экспрессирующие соответствующие производные MSL2 на гетерозиготном фоне т,?!2у227/СуО. Результаты представлены в виде среднего значения с погрешностями, показывающими стандартное отклонение трех независимых экспериментов. Звездочка отражает уровень значимости: * 0,01< р< 0,05, ** 0,001< р < 0,005, *** р < 0,001.

Для исследования роли CXC-домена в специфическом рекрутировании КДК на Х-хромосому самцов, были получены линии, в которых трансгены были соединены с нуль-мутацией msl2y227 (Zhou et al., 1995). В линии мух msl2y227/CyO гомозиготными по мутации msl2y227 выживают только самки, что связано с полным нарушением формирования КДК на Х-хромосоме на фоне нуль-мутации по msl2. Как и ожидалось, трансген, экспрессирующий MSL2-3xF, полностью комплементировал нуль-мутацию msl2y227, что выражалось в сравнимой выживаемости самцов и самок (Рисунок 18В). Неожиданно оказалось, что трансгены, кодирующие мутантные MSL2-белки (MSL2ACXC-3xF и MSL2R543A-3xF), также комплементировали нуль-мутацию msl2y227, что выражалось в значительном (но не полном) восстановлении жизнеспособности самцов. Например, в линии, экспрессирующей MSL2R543A-3xF на фоне мутации msl2y227, количество самцов снижалось до 39% относительно самок (Рисунок 18В).

Ранее в исследованиях специфического рекрутирования КДК уже использовались политенные хромосомы самок с эктопической экспрессией белка MSL2 [12,19,184]. Поэтому мы также использовали эту удобную модельную систему для определения белковых доменов, необходимых для рекрутирования КДК на Х-хромосому. В наших экспериментах характер связывания белков КДК определяли по меньшей мере у пяти независимых самок из каждой трансгенной линии, экспрессирующей варианты MSL2. Трансгенная экспрессия MSL2-3xF у самок привела к локализации как MSL2, так и MSL1 на Х-хромосоме, подтверждая, что MSL2, экспрессируемый под убиквитиновым промотором, способен инициировать сборку КДК на Х-хромосоме самок. Инактивация домена CXC в трансгенных личинках, экспрессирующих MSL2R543A-3xF или MSL2ACXC-3xF, приводила к связыванию комплекса MSL1-MSL2 с центромерной областью и аутосомными сайтами (Рисунок 19). При этом наблюдалось почти полное отсутствие связывания на Х-хромосоме. Стоит отметить, что колокализация MSL1 и MSL2 указывает на то, что инактивация CXC-домена способствует неспецифическому рекрутированию КДК.

MSL2-3xFLAG

WT дсхс R*

aMSLl aMSLl aMSLl

aFLAG aFLAG aFLAG

• / х » . / x

merged 1 X merged merged

Рисунок 19. Связывание КДК с политенными хромосомами у личинок самок, экспрессирующих MSL2-3xF (WT), MSL2ACXC-3xF (ACXC) и MSL2R543A-3xF (R*). Иммуноокрашивание проводилось мышиными антителами против эпитопа FLAG (зеленый) и кроличьими антителами против MSL1 (красный). Окрашивание ДНК было сделано DAPI (синий).

Далее связывание КДК на политенных хромосомах было протестировано у самцов, экспрессирующих производные MSL2-FLAG на фоне нуль-мутации msl2y227 (Рисунок 20).

WT ДСХС R *

i

Jwi А »

aMSLl aMSLl f Mf aMSLl

* У ... -г"

ч I

д aFLAG 1 4 у' ll'fr ■ | aFLAG • \ 1 • ч aFLAG

\ merged merged V ? '1 V.» merged

Рисунок 20. Распределение КДК на политенных хромосомах у Зх-дневных личинок самцов, экспрессирующих MSL2-3xF (WT), MSL2ACXC-3xF (ACXC) и MSL2R543A-3xF (R*) на фоне ms!2y227. Иммуноокрашивание было произведено мышиными антителами против эпитопа FLAG (зеленый) и кроличьими антителами против MSL1 (красный). Окрашивание ДНК сделано DAPI (синий).

Во всех случаях наблюдалась полная колокализация MSL2-FLAG и эндогенного MSL1 на политенной Х-хромосоме, что предполагает правильное рекрутирование КДК. У самцов, экспрессирующих MSL2R543A-3xF или MSL2ACXC-3xF, наблюдалось снижение уровня связывания КДК с Х-хромосомой (Рисунок 21). При этом паттерн связывания MSL1/MSL2 на Х-хромосоме при точечной мутации R543A и полной делеции CXC-домена не отличается.

Рисунок 21. Иммуноокрашивание политенных хромосом у личинок самцов, экспрессирующих М8Ь2-3хР (WT), М8Ь2АСХС-3хР (АСХС) и М8Ь2Я543Л-3хР (Я*) на фоне т,?12у227, с использованием кроличьих антител против М8Ь2 (красный). Окрашивание ДНК сделано БЛР1 (синий).

Стоит отметить, что дополнительные полосы MSL1/MSL2 были обнаружены на аутосомных хромосомах во всех протестированных мутантных трансгенных линиях, что позволяет предположить, что инактивация СХС-домена приводит к снижению специфичности связывания М8Ь2 с СПП на Х-хромосоме и привлечению КДК на сайты с более низкой аффинностью на аутосомах.

4.3 Исследование роли домена MSL2, взаимодействующего с белком CLAMP,

в рекрутировании КДК на Х-хромосому

Многие исследования показали, что присутствие CLAMP влияет на привлечение КДК на Х-хромосому [17,180,185]. Ранее в нашей работе было показано, что CLAMP-связывающий домен (ССД) находится в области 618-655 а.о. белка MSL2. Чтобы исследовать вклад белка CLAMP в специфическое привлечение

КДК на Х-хромосому были созданы трансгенные мухи, экспрессирующие под Ubi-промотором мутантные варианты белка MSL2 с делецией всей области, взаимодействующей с CLAMP, 620-655 а.о. (MSL2A36-3xF), или только дистальной части 642-654 а.о. (MSL2A13-3xF). Конструкции были встроены на третью хромосому в район 86F8 с помощью рекомбиназы фага ФС31. Вестерн-блот-анализ показал, что все варианты MSL2 экспрессировались в трансгенных мухах на эквивалентном уровне (Рисунок 22).

Рисунок 22. Иммуноблот-анализ белковых экстрактов из взрослых мух, экспрессирующих белок MSL2-3xF ^Т), MSL2A36-3xF (Д36) и MSL2Д13-3xF (Д13). Детекция вариантов белка MSL2 проводилась антителами против эпитопа 3хFLAG. Качество белкового экстракта контролировалось окрашиванием антителами против белка GAF.

Как и в случаях мутации CXC-домена, при делеции домена, отвечающего за связывание с CLAMP, наблюдалась нормальная выживаемость у самок, в отличие от трансгенных мух, экспрессирующих полноразмерный MSL2 (Рисунок 23А), что указывает на нарушение функциональной активности данных мутантных вариантов MSL2.

Рисунок 23. Выживаемость трансгенных мух. А. Процентное соотношение количества трансгенных мух, экспрессирующих MSL2-3xF (^Г), MSL2A36-3xF (А36) и MSL2A13-3xF (А13). Б. Процентное соотношение трансгенных мух, экспрессирующих MSL2-3xF ^Т), MSL2A36-3xF (А36) и MSL2A13-3xF (А13) и выведенных в гомозиготу по нуль-мутации msl2y227/msl2y227. В качестве

внутреннего контроля использовались мухи, экспрессирующие соответствующие производные MSL2 на гетерозиготном фоне ms!2y227/CyO. Результаты представлены в виде среднего значения с погрешностями, показывающими стандартное отклонение в трех независимых экспериментах. Звездочка отражает уровень значимости: * 0,01< p< 0,05, ** 0,001< p < 0,005, *** p < 0,001.

Для исследования роли CLAMP в специфическом рекрутировании КДК на Х-хромосому самцов, были получены линии, в которых трансгены были объединены с нуль-мутацией msl2y227 (msl2y227; msl2A36-3xFи msl2y227; msl2A13-3xF). По сравнению с полной комплементацией мутации msl2y227 у самцов, экспрессирующих MSL2-3xF, в трансгенных линиях с экспрессией мутантных производных MSL2 (MSL2A36-3xF и MSL2A13-3xF) у самцов наблюдалось неполное восстановление жизнеспособности (Рисунок 23Б). Так, в линиях, экспрессирующих MSL2A36-3xF и MSL2A13-3xF, количество самцов сокращалось до 30% и 38% по сравнению с контрольной линией, несущей трансген MSL2-3xF, где количество самцов составило 55% от общего количества мух.

При исследовании распределения КДК на политенных хромосомах у самок, экспрессирующих мутантный белок MSL2A36-3xF или MSL2A13-3xF, наблюдалось практически полное отсутствие связывания комплекса с Х-хромосомой. Как и при инактивации CXC-домена, комплекс MSL1-MSL2 локализовался в некоторых аутосомных сайтах и центромерной области (Рисунок 24).

WTA13__Д36

Ч 4, «

aMSLl aMSLl aMSLl

• 1 . ч l

aFLAG aFLAG aFLAG

* * 9 J ' f / x V- ' / x

merged merged merged

Рисунок 24. Распределение КДК на политенных хромосомах у личинок самок, экспрессирующих MSL2-3xF (WT), MSL2A36-3xF (А36) и MSL2A13-3xF (А13). Иммуноокрашивание было проведено мышиными антителами против эпитопа FLAG (зеленый) и кроличьими антителами против MSL1 (красный). Окрашивание ДНК сделано DAPI (синий).

Далее связывание КДК на политенных хромосомах было протестировано у самцов на фоне нуль-мутации msl2y227. Во всех случаях наблюдалось снижение уровня связывания КДК с Х-хромосомой. Также эндогенный MSL1 и MSL2-FLAG полностью колокализовались на политенной Х-хромосоме, что указывает на правильное рекрутирование КДК (Рисунок 25).

WT Д13 Л36

щт •

aMSLl aMSLl aMSLl

•• r • > %

\ Ш 4 f V г * •яи

w r •

aFLAG aFLAG aFLAG

4" \ V

* * \

Sv \

> %

merged merged merged

Рисунок 25. Распределение КДК на политенных хромосомах у самцов, экспрессирующих MSL2-3xF (WT), MSL2A36-3xF (Д36) и MSL2A13-3xF (А13) на фоне мутации msl2r227. Иммуноокрашивание было проведено мышиными антителами против эпитопа FLAG (зеленый) и кроличьими антителами против MSL1 (красный). Окрашивание ДНК сделано DAPI (синий).

Политенные хромосомы у личинок самцов, экспрессириющих MSL2A36-3xF и MSL2A13-3xF, имеют одинаковый паттерн окрашивания антителами к FLAG-эпитопу и MSL1. В свою очередь, при сравнении иммуноокрашенных препаратов политенных хромосом у личинок самцов с инактивацией CXC- (MSL2R543A) и ССД-(MSL2A13) доменов наблюдаются очевидные отличия в паттерне связывания мутантных вариантов MSL2-3xF на Х-хромосоме (Рисунок 26). Сайты связывания MSL1/MSL2, детектируемые в районе 11CD и 12AB на Х-хромосоме, при внесении мутации R543A в CXC-домен пропадают у личинок самцов, экспрессирующих MSL2A13-3xF.

го

ш

РАР!

/Г7

12а

с 4 7А

Ч

юс/ 9а

0АР1

12а 11ср

| уд

. ' аМ51_2

Рисунок 26. Иммуноокрашивание политенных хромосом у личинок самцов, экспрессирующих MSL2-3xF (WT), MSL2A13-3xF (А13) и MSL2R543A-3xF на фоне

мутации т,?!2у227, с использованием кроличьих антител против MSL2 (красный). Окрашивание ДНК сделано DAPI (синий).

При делеции CLAMP-связывающего домена также происходит снижение специфичности связывания MSL2 с СПП, что выражается в появлении на всех препаратах политенных хромосом дополнительных сайтов связывания MSL1/MSL2 в центромерном районе и на аутосомах. Таким образом, делеция CLAMP-связывающего домена приводит к сходным нарушениям привлечения КДК на Х-хромосому, что и при инактивации CXC-домена.

4.4 Исследование совместной роли ССД- и СХС-доменов белка MSL2 в рекрутировании КДК на Х-хромосому

Внесение мутаций в CXC- и ССД-домены приводило к схожим, но не идентичным изменениям в распределении КДК на Х-хромосоме. Чтобы исследовать совместное влияние данных мутаций на привлечение КДК была создана кДНК, кодирующая белок MSL2 с двумя мутациями, которые инактивировали СХС

(мутация R543A) и удаляли ССД (делеция 642-654 a.o.). Для экспрессии мутантного белка, тагированного эпитопом FLAGx3 (MSL2R543AA13-3xF), был использован, как и в предыдущих экспериментах, иЫ-промотор. Конструкция была встроена в 86F8-район с помощью рекомбиназы фага ФС31. С помощью вестерн-блот-анализа было показано, что экспрессия MSL2R543AA13-3xF находится на уровне MSL2 дикого типа, описанного ранее (Рисунок 27А).

А Б

Рисунок 27. А. Иммуноблот-анализ белковых экстрактов из взрослых мух, экспрессирующих мутантный белок MSL2-3xF (^Г) и MSL2R543AA13-3xF (R*A13). Детекция вариантов белка MSL2 проводилась антителами против эпитопа 3хFLAG. Качество белкового экстракта контролировалось окрашиванием антителами против белка GAF. Б. Процентное соотношение трансгенных мух, экспрессирующих MSL2-3xF (^Г), MSL2A13-3xF (А13), MSL2R543A-3xF (R*) и MSL2R543AA13-3xF (R*A13) и выведенных в гомозиготу по нуль-мутации msl2y227/msl2y227. В качестве внутреннего контроля использовались мухи, экспрессирующие соответствующие производные MSL2 на гетерозиготном фоне т,?12у227/СуО. Результаты представлены в виде среднего значения с погрешностями, показывающими стандартное отклонение трех независимых скрещиваний. Звездочка отражает уровень значимости: * 0,01< р< 0,05, ** 0,001< р < 0,005, *** р < 0,001.

Как и ожидалось, экспрессия мутантного белка MSL2 не влияла на выживаемость самок, что предполагает сильное нарушение процесса связывания КДК с Х-хромосомой (Рисунок 27Б). Для исследования мутантных вариантов MSL2 в самцах была создана трансгенная линия, гомозиготная по мутации msl2y227 и содержащая конструкцию Ubi-MSL2R543AA13 на 3-й хромосоме. В отличие от трансгенных линий, экспресирующих мутантные MSL2-белки с инактивацией только одного из доменов, самцы MSL2R543AA13 имели очень низкую жизнеспособность и раннюю смертность (на 5-7 день). Так, количество самцов, экспрессирующих MSL2R543AA13-3xF, снижалось до 15% от общего количества

мух, что на 40% меньше, чем в контрольной линии и на 22-23% меньше по сравнению с линиями, экспрессирующими М8Ь2Я543Л-3хР и MSL2RД13-3xF (Рисунок 27Б).

Исследование распределения КДК на политенных хромосомах у самок дало такой же результат, как и с другими трансгенными линиями, экспрессирующими мутантные варианты белка MSL2-3xF. Наблюдалось практически полное отсутствие связывания MSL1-MSL2 комплекса с Х-хромосомой и появлялись дополнительные сайты связывания в центромерной области и на аутосомах (Рисунок 28).

Рисунок 28. Распределение КДК на политенных хромосомах у личинок самок, экспрессирующих MSL2-3xF (WT) и MSL2R543AA13-3xF (R*A13). Иммуноокрашивание было проведено мышиными антителами против эпитопа FLAG (зеленый) и кроличьими антителами против MSL1 (красный). Окрашивание ДНК сделано DAPI (синий).

У самцов, экспрессирующих MSL2R543AA13 на фоне нуль-мутации, связывание MSL1 и MSL2-3хF значительно уменьшалось по сравнению с линиями, экспрессирующими производные MSL2 с мутацией только в ССД- или CXC-домене (Рисунок 29).

• *•

С*"" « *v—ь

aMSLl aFLAG . merged

aMSLl ( ЩГ aFLAG merged

MSL2WT MSL2R*A13

Ж"

13a

12A V ч

13А^12А' Х11А

Рисунок 29. Распределение КДК на политенных хромосомах у личинок самцов, экспрессирующих MSL2-3xF (WT) и MSL2R543AA13-3xF (R*A13) на фоне мутации msl2y227. Иммуноокрашивание было проведено кроличьими антителами против MSL1 (красный) и мышиными антителами против эпитопа FLAG (зеленый) или кроличьими антителами против MSL2 (красный). Окрашивание ДНК сделано DAPI (синий).

Таким образом, комбинация мутаций, приводящих к нарушению связывания с CLAMP и инактивации CXC-домена (связывающегося с ДНК), усиливает нарушение распространения КДК вдоль Х-хромосомы самцов, что также подтверждается снижением выживаемости самцов с экспрессией мутантного белка MSL2R543AA13.

4.5 Исследование роли пролин-богатого домена (Р-домен) и домена, богатого положительно заряженными аминокислотами ф-домен), в привлечении КДК

на Х-хромосому

Помимо хорошо охарактеризованных RING- и CXC-доменов белок MSL2 на С-конце содержит два консервативных участка: пролин-богатый мотив (685-713 а.о.) и следующий за ним участок, насыщенный основными аминокислотными остатками (714-725 а.о.) (Р- и В-домен соответственно). Функциональные роли данных доменов плохо изучены, есть только некоторые данные, указывающие на возможность их участия во взаимодействии с РНК roX и в связывании с СПП [15,19]. Чтобы исследовать роль пролин-богатого и основного домена в привлечении КДК на Х-хромосому, были сделаны варианты MSL2 с делецией 684-712 а.о. (MSL2AP-3xF) и 714-727 а.о. (MSL2AB-3xF). Созданные конструкции были встроены на третью хромосому в район 86F8 с помощью интегразы фага фС31. Вестерн-блот-анализ показал, что белок MSL2AP-3xF присутствует у трансгенных мух на таком же уровне, что и MSL2-3xF (Рисунок 30А). В свою очередь, белок MSL2AB-3xF экспрессируется на более высоком уровне. Таким образом, MSL2AB-3xF проявляет более высокую стабильность, чем белок дикого типа, как в S2-клетках, так и в мухах.

А Б

■ гомозиготы

9WT cfWT 9ДВ с?ДВ

Рисунок 30. А. Иммуноблот-анализ белковых экстрактов из взрослых мух, экспрессирующих различные варианты М8Ь2, меченого эпитопом ЗхБЬАО (М8Ь2-3хР, М8Ь2ДР-ЗхБ и М8Ь2ДБ-3хР). Детекция вариантов белка М8Ь2 проводилась антителами против эпитопа ЗхБЬАО. Качество белкового экстракта контролировалось окрашиванием антителами против белка ОАБ. Б. Процентное соотношение гомозиготных и гетерозиготных особей в трансгенных линиях мух, экспрессирующих М8Ь2-3хБ или MSL2ДB-3xF.

Эктопическая экспрессия мутантного белка MSL2ДB-3xF приводила к резкому снижению количества гомозиготных по трансгену самок (8% относительно общего количества самок) и при этом не влияла на выживаемость гомозиготных самцов (Рисунок 30Б). Жизнеспособность гетерозиготных самок, несущих трансген MSL2ДB-3xF, была также снижена (количество самок снизилось до 31% по сравнению с самцами) (Рисунок 31 А). Наблюдалась нормальная выживаемость гомозиготных мух, экспрессирующих мутантный белок MSL2ДP-3xF, и при этом количество самок не снижалось (Рисунок 30Б, 31 А). Эти результаты предполагают, что делеция основного домена не имела выраженного влияния на способность MSL2 формировать КДК и привлекать его на СПП, в то время как функциональная активность MSL2ДP-3xF была, по крайней мере, частично нарушена.

Рисунок 31. Выживаемость трансгенных мух. А. Процентное соотношение трансгенных мух, экспрессирующих М8Ь2-3хБ, М8Ь2АВ-3хБ и М8Ь2АР-3хБ. Б. Выживаемость самок и самцов трансгенных мух, экспрессирующих М8Ь2-3хБ, М8Ь2АР-3хБ и выведенных в гомозиготу по нуль-мутации msl2y227/msl2y227. В качестве внутреннего контроля использовались мухи, экспрессирующие соответствующие производные MSL2 на гетерозиготном фоне т,?12у227/СуО. Результаты представлены в виде среднего значения с погрешностями, показывающими стандартное отклонение трех независимых эксперимента. Звездочка отражает уровень значимости: * 0,01<р<0,05, ** 0,001<р<0,005, *** р<0,001.

Для дальнейшего исследования роли пролин-богатого домена в специфическом рекрутировании КДК на Х-хромосому самцов, была получена линия, в которых трансген т&12АР-3х¥ был объединен с нуль-мутацией msl2y227. Неожиданно оказалось, что экспрессия мутантного белка MSL2ДP-3xF, полностью комплементирует нуль-мутацию msl2y227, что выражалось в сравнимой выживаемости самцов и самок (Рисунок 31Б).

Исследование распределения КДК на политенных хромосомах личинок самок, экспрессирующих М8Ь2АВ-3хБ, показало такую же картину связывания

MSL1/MSL2, что и при экспрессии MSL2-3xF (Рисунок 32А). При этом связывание MSL-белков визуально усиливается на Х-хромосоме личинок, экспрессирующих MSL2AB-3xF, что можно объяснить значительным увеличением стабильности мутантного белка. Полученные результаты согласуются с функциональным тестом, согласно которому выживаемость самок, экспрессирующих MSL2AB-3xF значительно ниже по сравнению с самками MSL2-3xF. А

MSL2-3XFLAG

aMSll

aFLAG

» i'

/ И »:,

merged

Рисунок 32. Распределение КДК на политенных хромосомах у личинок самок, экспрессирующих MSL2 с делециями С-концевых доменов. А. Сравнение связывания MSL1 и MSL2 c политенными хромосомами личинок самок, гетерозиготных по трансгену, экспрессирующему MSL2-Fx3 (WT), MSL2AB-Fx3 (AB) или MSL2AP-Fx3 (AP). Б. Сравнение

распределения белка MSL2 вдоль политенной Х-хромосомы в самках, гетерозиготных по трансгену, экспрессирующему один из вариантов MSL2-Fx3 (MSL2WT) или MSL2 AP-Fx3 (MSL2AP). Показаны по два независимых окрашивания. Иммуноокрашивание было произведено кроличьими антителами против MSL1 (красный) и мышиными антителами против эпитопа FLAG (зеленый) или кроличьими антителами против MSL2 (красный). Окрашивание ДНК сделано DAPI (синий).

В свою очередь связывание MSL2AP-3xF и MSL1 c Х-хромосомой самок значительно снижается (Рисунок 32Б). Интенсивное окрашивание антителами к MSL1 и FLAG (MSL2) наблюдается только в отдельных участках хромосомы, которые, по всей видимости, совпадают с наиболее сильными СПП. Таким образом, MSL2AP-3xF нарушает эффективное связывание КДК с Х-хромосомой самок.

Однако на фоне нуль-мутации msl2y227 у самцов белки MSL1 и MSL2AP-3xF продолжают эффективно связываться с Х-хромосомой, что согласуется со способностью MSL2AP-3xF комплементировать мутацию msl2y227 (Рисунок 33).

_MSL2-3xFLAG_

WT АР

Л

DAPI DAPI

Г * % *

\ юс "ч /а юс 9а ^

7а / • 4d / Ча ___4d

aMSL2 3fx зр/ hh aMSL2

Рисунок 33. Распределение КДК на политенных хромосомах у личинок самцов, экспрессирующих MSL2-3xF ^Т) и MSL2AР-3xF (АР) на фоне мутации msl27227. Иммуноокрашивание было проведено кроличьими антителами против MSL1 (красный) и кроличьими антителами против MSL2 (красный). Окрашивание ДНК сделано БАРТ (синий).

Таким образом, результаты связывания белков MSL1 и MSL2 с политенными хромосомами полностью подтверждают результаты функционального теста (Рисунок 31Б), согласно которому в самцах, экспрессирующих MSL2AP-3xF, не происходит нарушений в процессе формирования комплекса дозовой компенсации.

4.6 Исследование роли СХС-, ССД- и P- доменов MSL2 в рекрутировании КДК

на Х-хромосому

С помощью иммуноокрашивания политенных хромосом можно детектировать только сильные сайты связывания белка с хроматином, что связано с ограниченной чувствительностью данного метода. Для получения более детальной картины эффективности связывания КДК с сайтами на Х-хромосоме была проведена иммунопреципитация хроматина 2-3 дневных самцов с антителами против MSL1, CLAMP и эпитопа FLAG с последующей количественной ПЦР (ChIP-qPCR). Для анализа были взяты ранее охарактеризованные сайты связывания КДК: СПП [9], сайты PionX [15] и несколько сайтов на аутосомах, у которых детектируется связывание MSL2 [139]. Как и ожидалось, связывание MSL2 и MSL1 происходило на всех сайтах PionX и СПП у трансгенных самцов, экспрессирующих MSL2-3xF на фоне msl2y227 (Рисунок 34).

Рисунок 34. Сравнение связывания MSL1, MSL2 и CLAMP на выбранных сайтах СПП и PionX (11A1, 11F5, 13A8, 16D4) у самцов, экспрессирующих MSL2-3xF (WT), MSL2A13-3xF (A13), MSL2R543A-3xF (R*), MSL2R543AA13-3xF (R* A13) на фоне msl2y227. Результаты представлены в процентах обогащения ДНК после иммунопреципитации к исходной ДНК (% input), нормированных относительно соответствующих положительных контрольных участков связывания MSL1 (26E3), MSL2 (25A3) и CLAMP (39A1) на аутосомах. На гистограммах показано сравнение уровня связывания белка у мух, экспрессирующих мутантный MSL2 (MSL2A13-3xF, MSL2R543A-3xF, MSL2R543AA13-3xF), с уровнем связывания у мух, экспрессирующих MSL2-3xF (на шкале приведен к "1"). Иммунопреципитация хроматина осуществлялась мышиными антителами против эпитопа FLAG и кроличьими антителами против MSL1, CLAMP. Усы показывают стандартные отклонения для трех независимых экспериментов. *0,01<p<0,05, **0,001<p<0,005.

При этом у трансгенных самцов, экспрессирующих мутантные производные MSL2, наблюдалось снижение уровня связывания MSL1 и MSL2 в большинстве тестируемых сайтов на Х-хромосоме. При этом паттерн связывания белков MSL1 и MSL2 у самцов в линиях мух, несущих трансгены MSL2R543A-3xF или MSL2A13, был сходен: в 12 сайтах связывание MSL1 и MSL2 снижалось почти на 50%; в трех сайтах (2B14, 11B16 и 13D4) связывание обоих белков не изменялось. Также в подтверждение результатам, полученным на политенных хромосомах, одновременное внесение мутаций, приводящих к нарушению взаимодействия как с CLAMP, так и с ДНК (MSL2R543AA13-3xF), способствует еще большему снижению связывания MSL2 по сравнению с одиночными мутациями (MSL2R543A-3xF или MSL2A13-3xF) в большинстве анализируемых сайтах (Рисунок 34). Так, в двух сайтах (2B14 и 11B16) уменьшалось связывание только MSL2R543AA13-3xF, но не MSL2R543A-3xF и MSL2A13-3xF.

В большинстве случаев связывание CLAMP не изменяется во всех трансгенных линиях, экспрессирующих производные MSL2-3xF (Рисунок 34). Однако наибольшее снижение связывания CLAMP наблюдается в сайтах 1B14, 5C2 и 9A3 у самцов, экспрессирующих MSL2R543AA13-3xF. Таким образом, в некоторых случаях связывание CLAMP зависит от присутствия КДК, что отражает синергию, обусловленную взаимодействием между MSL2 и CLAMP [18,185].

Точечная мутация R543A в CXC-домене (MSL2R543A-3xF) и его полная делеция (MSL2ACXC-3xF) приводят к сходным изменениям в связывании MSL1/MSL2/CLAMP с выбранными сайтами (Рисунок 35). Что подтверждает результаты исследования распределения КДК на политенных хромосомах у личинок самцов.

Рисунок 35. Сравнение связывания MSL1, MSL2 и CLAMP на выбранных сайтах СПП и PionX (11A1, 11F5, 13A8, 16D4) у самцов, экспрессирующих MSL2R543A-3xF (R*) и MSL2ACXC-3xF (ACXC) на фоне msl2Y227. Результаты представлены в процентах обогащения ДНК после иммунопреципитации к исходной ДНК (% input), нормированных относительно соответствующих положительных контрольных участков связывания MSL1 (26E3), MSL2 (25A3) и CLAMP (39A1) на аутосомах. На гистограммах показано сравнение уровня связывания белка у мух, экспрессирующих мутантный MSL2 (MSL2R543A-3xF, MSL2ACXC-3xF), с уровнем связывания у мух, экспрессирующих MSL2-3xF (на шкале приведен к "1"). Иммунопреципитация хроматина осуществлялась мышиными антителами против эпитопа FLAG и кроличьими антителами против MSL1, CLAMP .Усы показывают стандартные отклонения для трех независимых экспериментов. *0,01<p<0,05-, **0,001<p<0,005.

Интересно отметить, что у самцов, экспрессирующих MSL2R543А-3xF и MSL2Д13-3xF, на некоторых аутосомных сайтах усиление связывания мутантных производных MSL2 происходило независимо от MSL1 (Рисунок 36). Этот результат предполагает альтернативный механизм привлечения MSL2 на сайты не в составе КДК.

Рисунок 36. Сравнение связывания MSL1, MSL2 и CLAMP на аутосомных сайтах у самцов, экспрессирующих MSL2-3xF (WT), MSL2A13-3xF (Д13), MSL2R543A-3xF (R*) на фоне ms!27227. Результаты представлены в процентах обогащения ДНК после иммунопреципитации к исходной ДНК (% input), нормированных относительно положительного

контрольного участка связывания MSL1, MSL2 и CLAMP на аутосоме (31E1). На гистограммах показано сравнение уровня связывания белков MSL2A13d-3xF и MSL2R543A-3xF с уровнем связывания MSL2-3xF (на шкале приведен к "1"). Иммунопреципитация хроматина

осуществлялась мышиными антителами против эпитопа FLAG и кроличьими антителами против MSL1, CLAMP. Усы показывают стандартные отклонения для трех независимых экспериментов. *0,01<p<0,05.

Предыдущие исследования показали, что инактивация РНК гоХ или MLE приводит к привлечению КДК только к небольшой части районов, соответствующих основным СПП, включая области генов, кодирующих гоХ1 (3F) и гоХ2 (10С) [9,157]. Таким образом, экспрессия в самцах MSL2ДР-3xF может приводить к снижению эффективности формирования КДК, что визуализируется сохранением связывания

белков МЗЫ и МЗЬ2 с наиболее сильными СПП на Х-хромосоме и снижением связывания со вторичными сайтами привлечения КДК. В результате было обнаружено, что MSL2ДР-3xF и MSL2-3xF связываются со всеми сайтами с примерно одинаковой эффективностью, что подтверждает результаты исследования распределения КДК на политенных хромосомах в личинках самцов (Рисунок 37). При этом на части сайтов наблюдается избыточное накопление белка MSL2ДР-3xF, что может объясняться частичным перераспределением комплекса в линии, экспрессирующей MSL2ДР-3xF.

Рисунок 37. Сравнение связывания белков MSL1, MSL2 и CLAMP на выбранных сайтах СПП и PionX (11A1, 11F5, 13A8, 16D4, 13D4) у самцов, экспрессирующих MSL2-3xF (WT) и MSL2AP-3xF (АР) на фоне ms!27227. Результаты представлены в процентах обогащения ДНК после иммунопреципитации к исходной ДНК (% input), нормированных относительно соответствующих положительных контрольных участков связывания MSL1 (26E3), MSL2 (25A3) и CLAMP (39A1) на аутосомах. На гистограммах показано сравнение уровня связывания белка у мух, экспрессирующих

MSL2AP-3xF, с уровнем связывания у мух, экспрессирующих MSL2-3xF (на шкале приведен к "1"). Иммунопреципитация хроматина осуществлялась мышиными антителами против эпитопа FLAG и кроличьими антителами против MSL1, CLAMP. Усы показывают стандартные отклонения для трех независимых экспериментов. *0,01<p<0,05.

Аналогичные результаты были получены для MSL1. Белок CLAMP во всех линиях связывается с тестируемыми СПП с одинаковой эффективностью. Таким образом, полученные результаты подтверждают, что MSL2AP-3xF продолжает достаточно эффективно связываться с СПП на Х-хромосоме.

4.7 Роль доменов MSL2 в экспрессии РНК roX

РНК roX1 и roX2 играют ключевую роль в первоначальном рекрутировании КДК на СПП и его дальнейшем распространении вдоль всей X-хромосомы самцов [7,177,186]. Одним из важнейших регуляторов транскрипции генов roX1 и roX2 является белок MSL2 [157]. Поэтому для более детального изучения функциональной роли доменов MSL2 в процессе дозовой компенсации была исследована экспрессия РНК roX у мух, экспрессирующих мутантные варианты MSL2 (MSL2R543A-3xF, MSL2A13-3xF, MSL2AB-3xF и MSL2AP-3xF).

В норме у самок РНК roX не экспрессируется из-за отсутствия КДК, однако эктопическая экспрессия MSL2 приводит к активации roX2 и в меньшей степени roX1 [187]. В ходе эксперимента было подтверждено, что экспрессия MSL2 дикого типа у самок индуцирует транскрипцию РНК roX (Рисунок 38 А). Однако уровень экспрессии roX у таких самок воспроизводимо ниже по сравнению с самцами, экспрессирующими MSL2 на фоне нуль-мутации msl2y227. Транскрипты РНК roX обнаруживались и у самок, экспрессирующих MSL2AР-3xF и MSL2AB-3xF, но не с мутациями в CXC- и ССД-доменах (Рисунок 38А). При этом экспрессия MSL2AB-3xF у самок приводила к приблизительно в 2 раза более сильной экспрессии РНК roX по сравнению с контрольной линией мух, экспрессирующей MSL2-3xF. Данный факт отражает прямую корреляцию между повышенной концентрацией MSL2 и активацией генов roX. В свою очередь, мутантный белок MSL2AP-3xF более чем в 2 раза слабее стимулирует активность генов roX по сравнению с MSL2-3xF у самок.

Рисунок 38. Сравнение roX1 и roX2 в мухах, экспрессирующих MSL2-3xF, MSL2R543A-3xF, MSL2A13-3xF MSL2AP-3xF и MSL2AB-3xF. А. Уровни экспрессии РНК roX1 и roX2 в личинках самцов и самок мух линии y1w1118 и мух, экспрессирующих MSL2-3xF (wt), MSL2R543A-3xF (R*), MSL2A13-3xF (A13), MSL2AP-3xF (АР) и MSL2AB-3xF (AB) на фоне нуль-мутации ms!2y227. Гистограммы показывают изменение уровня мРНК тестируемых генов roX в трансгенных линиях по сравнению с уровнем экспрессии у самцов линии y1w1118 (соответствует отметке «1» на шкале). Б. Сравнение связывания белков MSL1, MSL2, CLAMP в линиях, экспрессирующих MSL2-3xF, MSL2R543A-3xF, MSL2A13-3xF MSL2AP-3xF и MSL2AB-3xF, в районах генов roX1 и roX2. Стандартные отклонения расчитывались на основе трех независимых экспериментов, в каждом из которых было произведено четыре технические повторности измерения. Звездочки обозначают уровень значимости: *0,01< p< 0,05- **0,001< p < 0,005.

В составе генов roX находятся СПП, необходимые для регуляции их транскрипции у самцов и самок [181,188]. Поэтому был исследован уровень связывания белков MSL2, MSL1 и CLAMP с этими сайтами у трансгенных мух. Иммунопреципитация хроматина показала, что MSL2 и MSL1 эффективно связываются с СПП roX у личинок самок, экспрессирующих белки MSL2-3xF и MSL2AB-3xF. В то же время MSL2R543A-3xF и MSL2A13-3xF переставали локализоваться на этих сайтах у самок (Рисунок 38Б). Однако у самцов, экспрессирующих MSL2R543A-3xF и MSL2A13-3xF, при падении уровня связывания MSL2, белок MSL1 продолжал локализоваться на СПП roX. В случае самок линии MSL2AР-3xF белок MSL1 связывается с СПП roX примерно в 1,8-2 раза слабей по сравнению с контрольной линией MSL2-3xF, а белок MSL2 так же в 2 раза

слабей - с СПП roX1, и примерно в 1,2 раза - с СПП roX2. При этом у самцов, экспрессирующих MSL2AР-3xF, не удалось детектировать статистически значимых изменений в силе связывания белков MSL1 и MSL2 на СПП roX1 и roX2 по сравнению с контрольной линией, несущей трансген MSL2-3xF. На связывание белка CLAMP ни одна из мутациий MSL2 не повлияла.

Стоит отметить, что в личинках самок, экспрессирующих MSL2AB-3xF, белок MSL1 связывается примерно в 1,5 раза сильней с СПП roX1 и в 1,2 раза сильней с СПП roX2 по сравнению с контрольной линией мух, экспрессирующей MSL2-3xF. Более выраженное усиление связывания с исследуемыми СПП детектировалось для белка MSL2 (для СПП roX1 в 1,8 раз и для СПП roX2 в 1,6 раз сильней по сравнению с контрольной линией MSL2-3xF). Так как экспрессия белка MSL2AB-3xF у самок приводит к усилению экспрессии РНК roX примерно в 2 раза можно сделать вывод, что существует прямая корреляция между эффективностью связывания MSL1/MSL2 с СПП и активацией транскрипции генов roX. Данный результат согласуется с данными для roX1, полученными для линии, экспрессирующей MSL2AP-3xF: примерно двукратное снижение связывания белков MSL1/MSL2 сопровождается пропорциональным снижением уровня экспрессии roX1. Однако в случае roX2 при экспрессии MSL2AP-3xF наблюдается несколько другая картина: уровень РНК roX2 падает в 3,7 раз при незначительном снижении уровня связывания MSL2 (1,2 раза) по сравнению с контрольной линией MSL2-3xF. Полученная разница может объясняться условной точностью метода ChIP-qPCR при измерении количества белка на хроматине. Однако полученная значительная разница между количеством связанного с СПП MSL2 и уровнем экспрессии roX2 дает основания предположить, что Р-домен в составе белка MSL2 участвует в активации транскрипции гена roX2.

5 Обсуждение

Процесс дозовой компенсации у дрозофилы представляет собой модель для изучения общих принципов избирательного связывания хроматин-ассоциированных комплексов с регуляторными элементами. Жизнеспособность самцов дрозофилы прямо коррелирует с эффективностью связывания КДК с Х-хромосомой. Ранее MSL2 как фактор, экспрессирующийся только у самцов, был предложен в качестве ключевого белка в рекрутировании КДК на Х-хромосоме [19,175]. В дальнейшем было показано, что специфичность связывания КДК, по крайней мере частично, обусловлена функциональным сотрудничеством между ДНК-связывающим CXC-доменом MSL2 и белком с «цинковыми пальцами» C2H2-ram CLAMP [14,15,18,180]. Интересно, что оба фактора имеют общее свойство связываться с GA-богатыми последовательностями МСК и их истощение приводит к нарушению дозовой компенсации. В подтверждение этих результатов, нами было выявлено физическое взаимодействие между N-концевым C2H2-доменом CLAMP и C-концевой областью MSL2.

При исследовании роли ДНК-связывающего домена MSL2 было обнаружено, что делеция домена CXC и точечная замена R543A оказывали незначительное влияние на дозовую компенсацию у самцов. Этот результат согласуется с результатами предыдущей работы [175], в которой было показано, что мутации двух цистеинов (C544A;C546A), образующих архитектуру домена CXC, несущественно снижают выживаемость самцов. CXC является единственным ДНК-связывающим доменом, участвующим в избирательном связывании КДК на Х-хромосоме [14,15]. Наши результаты показали, что домен CXC имеет решающее значение для рекрутирования КДК на Х-хромосому только у самок, в которых была осуществлена эктопическая экспрессия разных вариантов MSL2. Делеция ССД в MSL2 также умеренно снижает связывание КДК с Х-хромосомой у самцов, но полностью нарушает связывание КДК у самок. В то же время, мутантный белок MSL2R543AA13, лишенный обеих активностей (связывание с ДНК и взаимодействие с CLAMP), лишь частично поддерживает рекрутирование КДК на Х-хромосому и не может эффективно компенсировать нуль-мутации msl2y227 у

самцов. Таким образом, взаимодействие MSL2-CLAMP и узнавание МСК доменом CXC синергетически способствуют избирательному рекрутированию КДК на СПП.

Важно отметить, что MSL2R543AA13 все еще способен собирать КДК на СПП за счет взаимодействия RING-домена с MSL1 и через рекрутирование РНК roX с помощью MLE. Ранее были получены экспериментальные данные, позволяющие предположить, что N-концевой домен MSL1 (1-84 а.о.) играет важную роль в процессе узнавания Х-хромосомы комплексом дозовой компенсации [6,104]. MSL3 также способствует распространению КДК вдоль Х-хромосомы самцов [114]. Поскольку MSL1 и MSL3 не способны напрямую связываться с ДНК и взаимодействовать с CLAMP, вполне вероятно, что эти белки взаимодействуют с дополнительными, пока неизвестными, белками, связанными с СПП (Рисунок 39).

Белок MSL2 способен стимулировать транскрипцию в составе КДК, а также имеет независимую функцию в активации транскрипции группы аутосомных промоторов [189]. Для млекопитающих было показано, что ортолог MSL2 убиквитинирует гистон Н3 по лизину 24 [109]. Гистоны обогащены данной меткой в областях интенсивной транскрипции. Также было показано, что MSL2 может регулировать специфичную для самцов экспрессию РНК гоХ [187]. Предполагается, что этот механизм поддерживает стабильное соотношение КДК/гоХ, необходимое для избирательной локализации комплекса на Х-хромосоме. Нами было подтверждено, что MSL2 участвует в активации транскрипции РНК гоХ у самок. Было показано, что богатая пролином область MSL2 участвует в активации транскрипции. В заключение следует отметить, что полученные нами данные

Рисунок 39. Модель, объясняющая избыточность и кооперативное действие ССД- и CXC-доменов в функциональной активности MSL2. Красные пунктирные линии показывают потенциальные ДНК-белковые контакты, зеленые пунктирные линии — белок-белковые взаимодействия.

показывают, что сниженный уровень РНК roX в самках, экспрессирующих MSL2AP, негативно влияет на эффективность формирования КДК. Это проявляется в снижении количества связанных с СПП roX белков MSL1/MSL2, что является дополнительным подтверждением ключевой роли РНК roX в дозовой компенсации.

Помимо первичного рекрутирования КДК на СПП, РНК roX играют ключевую роль в распространении КДК по всей X-хромосоме [7,177,186]. Это объясняет, почему делеция доменов CXC и ССД критична для самок, у которых связывание MSL2/MSL1 с промоторами roX1 и roX2 имеет решающее значение для экспрессии этих РНК. Домен CXC белка MSL2 и С2Н2-домены в белке CLAMP необходимы для первичного рекрутирования субкомплекса MSL1-MSL2 (который, вероятно, также включает MSL3 и MOF) в регуляторные области генов roX. Далее привлечение roX/MLE в комплекс индуцирует образование полного КДК, что способствует его последующему распространению по всей длине Х-хромосомы [105]. Таким образом, у самок специфическое связывание комплекса MSL1-MSL2 полностью зависит от CXC- и ССД-доменов MSL2. У самцов экспрессия РНК roX в меньшей степени зависит от связывания с КДК [101,188]. Это может объяснять, почему инактивация CXC- или ССД-доменов в MSL2 приводит лишь к частичному снижению уровня рекрутирования КДК на X-хромосому самцов.

Как E3-убиквитин-лигаза, MSL2 способен к автоубиквитинированию, что важно для регуляции формирования правильного комплекса [4,108]. Полученные в данной работе результаты предполагают, что В-домен MSL2 участвует в регуляции стабильности MSL2 и содержит потенциальные сайты для убиквитинирования (К715, К716). Можно предположить, что при взаимодействии с MSL1 происходит снижение катализирующей активности RING-домена, и как следствие белок MSL2, находящийся в комплексе с MSL1, стабилизируется. Таким образом, повышается эффективность формирования комплекса, и одновременно снижается концентрация свободного MSL2.

Наши результаты показывают модульную организацию белка MSL2 и вовлеченность в различные регуляторные механизмы дозовой компенсации благодаря активностям его доменов. Согласно доминирующим в настоящее время представлениям, ДНК-связывающий домен CXC и С-конец белка MSL2, взаимодействующий с РНК roX, являются критичными для сборки КДК [110,190].

Однако в работе не было показано, что Р- и В- домены имеют видимое влияние на активность функционирования КДК у самцов. Можно предположить, что прилегающие к ССД-, Р- и В-доменам участки С-конца отвечают за специфичное взаимодействие MSL2 с РНК roX, что требует дальнейшего изучения.

В целом, наши результаты согласуются с моделью, согласно которой множественные белок-белковые взаимодействия и связывание CXC-домена с мотивом МСК кооперативно определяют специфичное рекрутирование КДК на Х-хромосому. Таким образом, идентификация дополнительных ДНК-связывающих белков, непосредственно взаимодействующих с компонентами КДК, является ключом к пониманию механизмов избирательного рекрутирования КДК на СПП.

102 Выводы

1. Установлено, что N-концевой цинковый палец C2H2-ram белка CLAMP взаимодействует с неструктурированным С-концевым участком (618-655 а.о.) белка MSL2.

2. Было показано кооперативное участие доменов CXC и ССД MSL2 в привлечении КДК на Х-хромосому самцов дрозофилы.

3. Одновременная инактивация доменов CXC и ССД в составе MSL2 у самцов лишь частично нарушает привлечение КДК на Х-хромосому. Одиночные мутации доменов ССД и CXC в составе MSL2, экспрессированного в самках дрозофилы, приводят к полному нарушению процесса привлечения КДК на Х-хромосому и частичному перемещению комплекса на низкоаффинные сайты на аутосомах.

4. Делеция С-концевого В-домена повышает стабильность белка и не влияет на активность MSL2 в установлении дозовой компенсации.

5. С-концевой Р-домен белка MSL2 не играет важную роль в процессе привлечения КДК на Х-хромосому самцов, а участвует в активации транскрипции гена roX2.

Список цитированной литературы

1. Kuroda M.I., Hilfiker A., Lucchesi J.C. Dosage Compensation in Drosophila —a Model for the Coordinate Regulation of Transcription // Genetics. 2016. Vol. 204, № 2. P. 435-450.

2. Lucchesi J.C., Kuroda M.I. Dosage Compensation in Drosophila // Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015. Vol. 7, № 5. P. a019398.

3. Samata M., Akhtar A. Dosage Compensation of the X Chromosome: A Complex Epigenetic Assignment Involving Chromatin Regulators and Long Noncoding RNAs // Annu. Rev. Biochem. 2018. Vol. 87, № 1. P. 323-350.

4. Hallacli E. et al. Msl1-Mediated Dimerization of the Dosage Compensation Complex Is Essential for Male X-Chromosome Regulation in Drosophila // Molecular Cell. 2012. Vol. 48, № 4. P. 587-600.

5. Kadlec J. et al. Structural basis for MOF and MSL3 recruitment into the dosage compensation complex by MSL1 // Nat Struct Mol Biol. 2011. Vol. 18, № 2. P. 142-149.

6. Li F., Parry D.A.D., Scott M.J. The amino-terminal region of Drosophila MSL1 contains basic, glycine-rich, and leucine zipper-like motifs that promote X chromosome binding, self-association, and MSL2 binding, respectively // Mol Cell Biol. 2005. Vol. 25, № 20. P. 8913-8924.

7. Ilik I.A. et al. A mutually exclusive stem-loop arrangement in roX2 RNA is essential for X-chromosome regulation in Drosophila // Genes Dev. 2017. Vol. 31, № 19. P. 1973-1987.

8. Maenner S. et al. ATP-Dependent roX RNA Remodeling by the Helicase maleless Enables Specific Association of MSL Proteins // Molecular Cell. 2013. Vol. 51, № 2. P. 174-184.

9. Alekseyenko A.A. et al. A sequence motif within chromatin entry sites directs MSL establishment on the Drosophila X chromosome // Cell. 2008. Vol. 134, № 4. P. 599-609.

10. Straub T. et al. The chromosomal high-affinity binding sites for the Drosophila dosage compensation complex // PLoS Genet. 2008. Vol. 4, № 12. P. e1000302.

11. Straub T., Becker P.B. Transcription modulation chromosome-wide: universal features and principles of dosage compensation in worms and flies // Current Opinion in Genetics & Development. 2011. Vol. 21, № 2. P. 147-153.

12. Zhou J.N. et al. A sex difference in the human brain and its relation to transsexuality // Nature. 1995. Vol. 378, № 6552. P. 68-70.

13. Fauth T. et al. The DNA binding CXC domain of MSL2 is required for faithful targeting the Dosage Compensation Complex to the X chromosome // Nucleic Acids Research. 2010. Vol. 38, № 10. P. 3209-3221.

14. Zheng S. et al. Structural basis of X chromosome DNA recognition by the MSL2 CXC domain during Drosophila dosage compensation // Genes Dev. 2014. Vol. 28, № 23. P. 2652-2662.

15. Villa R. et al. PionX sites mark the X chromosome for dosage compensation // Nature. 2016. Vol. 537, № 7619. P. 244-248.

16

17

18

19

20

21

22

23

24

25

26

27

28

29

30

31

32

33

34

35

Kuzu G. et al. Expansion of GA Dinucleotide Repeats Increases the Density of CLAMP Binding Sites on the X-Chromosome to Promote Drosophila Dosage Compensation // PLoS Genet. 2016. Vol. 12, № 7. P. e1006120. Soruco M.M.L., Larschan E. A new player in X identification: the CLAMP protein is a key factor in Drosophila dosage compensation // Chromosome Res. 2014. Vol. 22, № 4. P. 505-515.

Soruco M.M.L. et al. The CLAMP protein links the MSL complex to the X chromosome during Drosophila dosage compensation // Genes Dev. 2013. Vol. 27, № 14. P. 1551-1556.

Li F., Schiemann A.H., Scott M.J. Incorporation of the Noncoding roX RNAs Alters the Chromatin-Binding Specificity of the Drosophila MSL1/MSL2 Complex // Molecular and Cellular Biology. 2008. Vol. 28, № 4. P. 1252-1264. Brockdorff N., Turner B.M. Dosage compensation in mammals // Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015. Vol. 7, № 3. P. a019406.

Ayling L.-J., Griffin D.K. The evolution of sex chromosomes // Cytogenet Genome Res. 2002. Vol. 99, № 1-4. P. 125-140.

Charlesworth B. The evolution of sex chromosomes // Science. 1991. Vol. 251, № 4997. P. 1030-1033.

Charlesworth B. The evolution of chromosomal sex determination and dosage compensation // Curr Biol. 1996. Vol. 6, № 2. P. 149-162. Kaiser V.B., Bachtrog D. Evolution of Sex Chromosomes in Insects // Annu. Rev. Genet. 2010. Vol. 44, № 1. P. 91-112.

Marshall Graves J.A., Shetty S. Sex from W to Z: evolution of vertebrate sex chromosomes and sex determining genes // J Exp Zool. 2001. Vol. 290, № 5. P. 449-462.

Carvalho A.B. et al. Identification of five new genes on the Y chromosome of Drosophila melanogaster // Proc Natl Acad Sci U S A. 2001. Vol. 98, № 23. P. 13225-13230.

Carvalho A.B., Lazzaro B.P., Clark A.G. Y chromosomal fertility factors kl-2 and kl-3 of Drosophila melanogaster encode dynein heavy chain polypeptides // Proc Natl Acad Sci U S A. 2000. Vol. 97, № 24. P. 13239-13244. Gepner J., Hays T.S. A fertility region on the Y chromosome of Drosophila melanogaster encodes a dynein microtubule motor // Proc Natl Acad Sci U S A. 1993. Vol. 90, № 23. P. 11132-11136.

Vibranovski M.D., Koerich L.B., Carvalho A.B. Two new Y-linked genes in Drosophila melanogaster // Genetics. 2008. Vol. 179, № 4. P. 2325-2327. Bridges C.B. Non-Disjunction as Proof of the Chromosome Theory of Heredity // Genetics. 1916. Vol. 1, № 1. P. 1-52.

Brosseau G.E. Genetic Analysis of the Male Fertility Factors on the Y Chromosome of Drosophila Melanogaster // Genetics. 1960. Vol. 45, № 3. P. 257-274. Carvalho A.B. Origin and evolution of the Drosophila Y chromosome // Curr Opin Genet Dev. 2002. Vol. 12, № 6. P. 664-668.

Bernardo Carvalho A., Koerich L.B., Clark A.G. Origin and evolution of Y chromosomes: Drosophila tales // Trends Genet. 2009. Vol. 25, № 6. P. 270-277. Hackstein J.H. et al. Is the Y chromosome of Drosophila an evolved supernumerary chromosome? // Bioessays. 1996. Vol. 18, № 4. P. 317-323. Ohno S. Sex Chromosomes and Sex-Linked Genes. Berlin, Heidelberg: Springer, 1967. Vol. 1.

36

37

38

39

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

Duan J., Larschan E.N. Dosage Compensation: How to Be Compensated.. .Or Not? // Current Biology. 2019. Vol. 29, № 23. P. R1229-R1231. Gu L. et al. Dichotomy of Dosage Compensation along the Neo Z Chromosome of the Monarch Butterfly // Current Biology. 2019. Vol. 29, № 23. P. 4071-4077.e3. Pal A., Vicoso B. The X Chromosome of Hemipteran Insects: Conservation, Dosage Compensation and Sex-Biased Expression // Genome Biol Evol. 2015. Vol. 7, № 12. P. 3259-3268.

Richard G. et al. Dosage compensation and sex-specific epigenetic landscape of the X chromosome in the pea aphid // Epigenetics Chromatin. 2017. Vol. 10. P. 30. Julien P. et al. Mechanisms and evolutionary patterns of mammalian and avian dosage compensation // PLoS Biol. 2012. Vol. 10, № 5. P. e1001328. Lin F. et al. Expression reduction in mammalian X chromosome evolution refutes Ohno's hypothesis of dosage compensation // Proc Natl Acad Sci U S A. 2012. Vol. 109, № 29. P. 11752-11757.

Ercan S. Mechanisms of x chromosome dosage compensation // J Genomics. 2015. Vol. 3. P. 1-19.

Vicoso B., Bachtrog D. Progress and prospects toward our understanding of the evolution of dosage compensation // Chromosome Res. 2009. Vol. 17, № 5. P. 585602.

Ferrari F. et al. Transcriptional control of a whole chromosome: emerging models for dosage compensation // Nat Struct Mol Biol. 2014. Vol. 21, № 2. P. 118-125. Huylmans A.K., Macon A., Vicoso B. Global Dosage Compensation Is Ubiquitous in Lepidoptera, but Counteracted by the Masculinization of the Z Chromosome // Mol Biol Evol. 2017. Vol. 34, № 10. P. 2637-2649.

Walters J.R., Hardcastle T.J. Getting a full dose? Reconsidering sex chromosome dosage compensation in the silkworm, Bombyx mori // Genome Biol Evol. 2011. Vol. 3. P. 491-504.

Ellegren H., Parsch J. The evolution of sex-biased genes and sex-biased gene expression // Nat Rev Genet. 2007. Vol. 8, № 9. P. 689-698. Itoh Y. et al. Sex bias and dosage compensation in the zebra finch versus chicken genomes: General and specialized patterns among birds // Genome Res. 2010. Vol. 20, № 4. P. 512-518.

Uebbing S. et al. Quantitative Mass Spectrometry Reveals Partial Translational Regulation for Dosage Compensation in Chicken // Mol Biol Evol. 2015. Vol. 32, № 10. P. 2716-2725.

Gu L., Walters J.R. Evolution of Sex Chromosome Dosage Compensation in Animals: A Beautiful Theory, Undermined by Facts and Bedeviled by Details // Genome Biol Evol. 2017. Vol. 9, № 9. P. 2461-2476.

Gu L., Walters J.R., Knipple D.C. Conserved Patterns of Sex Chromosome Dosage Compensation in the Lepidoptera (WZ/ZZ): Insights from a Moth Neo-Z Chromosome // Genome Biol Evol. 2017. Vol. 9, № 3. P. 802-816. Smith G. et al. Complete dosage compensation and sex-biased gene expression in the moth Manduca sexta // Genome Biol Evol. 2014. Vol. 6, № 3. P. 526-537. Penalva L.O.F., Sánchez L. RNA binding protein sex-lethal (Sxl) and control of Drosophila sex determination and dosage compensation // Microbiol Mol Biol Rev. 2003. Vol. 67, № 3. P. 343-359, table of contents.

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66

67

68

69

70

Lu H. et al. Maternal Groucho and bHLH repressors amplify the dose-sensitive X chromosome signal in Drosophila sex determination // Dev Biol. 2008. Vol. 323, № 2. P. 248-260.

Piergentili R. Multiple roles of the Y chromosome in the biology of Drosophila melanogaster // ScientificWorldJournal. 2010. Vol. 10. P. 1749-1767. Bell L.R. et al. Sex-lethal, a Drosophila sex determination switch gene, exhibits sex-specific RNA splicing and sequence similarity to RNA binding proteins // Cell. 1988. Vol. 55, № 6. P. 1037-1046.

Salz H.K. Sex determination in insects: a binary decision based on alternative splicing // Current Opinion in Genetics & Development. 2011. Vol. 21, № 4. P. 395400.

Samuels M.E., Schedl P., Cline T.W. The complex set of late transcripts from the Drosophila sex determination gene sex-lethal encodes multiple related polypeptides // Mol Cell Biol. 1991. Vol. 11, № 7. P. 3584-3602.

Salz H.K. et al. The Drosophila female-specific sex-determination gene, Sex-lethal, has stage-, tissue-, and sex-specific RNAs suggesting multiple modes of regulation // Genes Dev. 1989. Vol. 3, № 5. P. 708-719.

Salz H.K., Erickson J.W. Sex determination in Drosophila: The view from the top // Fly (Austin). 2010. Vol. 4, № 1. P. 60-70.

Singh R., Valcárcel J., Green M.R. Distinct binding specificities and functions of higher eukaryotic polypyrimidine tract-binding proteins // Science. 1995. Vol. 268, № 5214. P. 1173-1176.

Robida M.D., Rahn A., Singh R. Genome-wide identification of alternatively spliced mRNA targets of specific RNA-binding proteins // PLoS One. 2007. Vol. 2, № 6. P. e520.

Cline T.W. Evidence that sisterless-a and sisterless-b are two of several discrete "numerator elements" of the X/A sex determination signal in Drosophila that switch Sxl between two alternative stable expression states // Genetics. 1988. Vol. 119, № 4. P. 829-862.

Duffy J.B., Gergen J.P. The Drosophila segmentation gene runt acts as a position-specific numerator element necessary for the uniform expression of the sex-determining gene Sex-lethal // Genes Dev. 1991. Vol. 5, № 12A. P. 2176-2187. Jinks T.M. et al. The JAK/STAT signaling pathway is required for the initial choice of sexual identity in Drosophila melanogaster // Mol Cell. 2000. Vol. 5, № 3. P. 581-587.

Sánchez L., Granadino B., Torres M. Sex determination in Drosophila melanogaster: X-linked genes involved in the initial step of sex-lethal activation // Dev Genet. 1994. Vol. 15, № 3. P. 251-264.

Sefton L. et al. An extracellular activator of the Drosophila JAK/STAT pathway is a sex-determination signal element // Nature. 2000. Vol. 405, № 6789. P. 970-973. Avila F.W., Erickson J.W. Drosophila JAK/STAT pathway reveals distinct initiation and reinforcement steps in early transcription of Sxl // Curr Biol. 2007. Vol. 17, № 7. P. 643-648.

ten Bosch J.R., Benavides J.A., Cline T.W. The TAGteam DNA motif controls the timing of Drosophila pre-blastoderm transcription // Development. 2006. Vol. 133, № 10. P. 1967-1977.

Liang H.-L. et al. The zinc-finger protein Zelda is a key activator of the early zygotic genome in Drosophila // Nature. 2008. Vol. 456, № 7220. P. 400-403.

71

72

73

74

75

76

77

78

79

80

81

82

83

84

85

86

87

88

Yang D. et al. Interpretation of X chromosome dose at Sex-lethal requires non-E-box sites for the basic helix-loop-helix proteins SISB and daughterless // Mol Cell Biol. 2001. Vol. 21, № 5. P. 1581-1592.

Barbash D.A., Cline T.W. Genetic and molecular analysis of the autosomal component of the primary sex determination signal of Drosophila melanogaster // Genetics. 1995. Vol. 141, № 4. P. 1451-1471.

Erickson J.W., Quintero J.J. Indirect effects of ploidy suggest X chromosome dose, not the X:A ratio, signals sex in Drosophila // PLoS Biol. 2007. Vol. 5, № 12. P. e332.

Estes P.A., Keyes L.N., Schedl P. Multiple response elements in the Sex-lethal early promoter ensure its female-specific expression pattern // Mol Cell Biol. 1995. Vol. 15, № 2. P. 904-917.