Структурная и функциональная организация границы Fab-7 bithorax – комплекса Drosophila melanogaster тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.07, кандидат наук Сабиров Марат Садекович

• Сабиров Марат Садекович
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Сабиров Марат Садекович

Введение

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Цель и задачи исследования

Научная новизна. Теоритическая и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Личное участие автора в проведении исследований

Структура и объем работы

1. Обзор литературы

1.1. Устройство эукариотических промоторов и энхансеров. Взаимодействия между энхансерами и промоторами в геноме дрозофилы

1.1.1. Методы картирования в геноме регуляторных элементов

1.1.2. Промоторы эукариот

1.1.2.1. Разнообразие и принципы работы промоторов эукариот

1.1.2.2. Устройство эукариотических промоторов мРНК-кодирующих генов

1.1.2.2.1. ТАТА-бокс

1.1.2.2.2. Инициатор

1.1.2.2.3. Нижележащий элемент ядра промотора (downstream core promoter element — DPE)

1.1.2.2.4. TFIIB - распознающий элемент (TFIIB recognition element — BRE)

1.1.2.2.5. CpG-островки

1.1.3. Энхансеры - второй ключевой регуляторный элемент транскрипции

1.1.3.1. Принцип работы и основная функция энхансеров

2.1.3.2. Устройство и свойства энхансеров

1.1.4. Принципы взаимодействия между элементами в геноме дрозофилы

1.1.4.1. Контакты между энхансером и промотором обогащены внутри ТАД

1.1.4.2. Специфичность взаимодействия между энхансером и промотором определяется дополнительными последовательностями

1.1.4.3. В осуществлении транскрипции генов домашнего хозяйства и генов развития

участвуют разные классы энхансеров со специфичным составом ТФ и кофакторов

1.2. Пространственная организация хроматина и её роль в функционировании генома Drosophila

1.2.1. Доменная и иерархическая организация хроматина

1.2.1.1. Разделение хроматина на домены разного типа

1.2.1.2. Иерархия архитектурной организации генома дрозофилы

1.2.2. Инсуляторы и их роль в определении границ топологических и функциональных хроматиновых доменов

1.2.3. Polycomb-комплекс играет важную роль в связи между эпигенетической регуляцией и пространственной организацией хроматина

1.3. Bithоrax-комплекс Drosophila melanogaster

1.3.1. Генетика мутаций и молекулярная организация ВХ-С

1.3.2. Принципы работы ВХ-С

1.3.3. Доменная организация цис-регуляторных регионов ВХ-С

1.3.4. Границы ВХ-С

1.3.5. Модели работы границ

1.3.5.1. Классическая модель последовательной активации доменов и инактивации инсуляторов

1.3.5.2. Альтернативная модель преодоления инсуляторов за счёт взаимодействия границ

1.3.6. Устройство границы Fab-7 и факторы, участвующие в её функционировании

2. Материалы и методы

2.1. Молекулярное клонирование

2.1.1. Методы работы с E. coli

2.1.1.1. Приготовление компетентных клеток

2.1.1.2. Трансформация E. coli

2.1.1.3. Использование бактерий в качестве ДНК матрицы для ПЦР

2.1.2. Общие методы работы с ДНК

2.1.2.1. Выделение плазмидной ДНК

2.1.2.2. Реакция с эндонуклеазами рестрикции

2.1.2.3. Реакция лигирования

2.1.2.4. ПЦР - полимеразная цепная реакция

2.1.2.5. Горизонтальный электрофорез ДНК в агарозном геле

2.1.2.6. Выделение фрагментов ДНК из геля

2.1.2.7. Количественная ПЦР (кПЦР)

2.2. Получение Fab-7attP50 замещенных линий

2.2.1. Стратегия создания линий с заменой Fab-7

2.2.2. Создание трансгенных линий D. melanogaster

2.3. Приготовление кутикулярных препаратов

2.4. Иммуноокрашивание эмбрионов

2.5. Метод торможения в геле ДНК-белковых комплексов (EMSA - electrophoretic mobility shift assay)

2.6. Иммунопреципитация хроматина (ChIP)

2.6.1. Сбор и фиксация эмбрионов

2.6.2. Выделение хроматина из эмбрионов

2.6.3. Выделение хроматина из куколок

2

Иммунопреципитация хроматина с последующей количественной ПЦР

3. Результаты

3.1. Изучение коровых элементов границы Fab-7

3.1.1. Сайты связывания белка Pita помогают участку dHS1 в организации функциональной границы

3.1.2. Влияние взаимного расположения последовательностей dHS1 и сайтов связывания Pita на функционирование границы Fab-7

3.2. Роль LBC-комплекса в функциональной активности границы Fab-7

3.2.1. LBC комплекс участвует в коммуникаторной активности dHS1

3.2.2. Выявление ключевых сайтов в составе dHS1, необходимых для функциональной активности границы Fab-7

3.3. HS3 обеспечивает функционирование границы HS1

3.4.1. Выявление ключевых элементов в последовательности HS3, требующихся для полноценной функциональной активности границы dHS1+HS3

3.4.2. LBC связывает HS3 in vitro за счёт GAGAG мотивов

3.4.3. Роль GAGAG-мотивов и сайтов связывания Pho в привлечении компонентов LBC на участки границы dHS1+HS3

3.4.4. Участие белков GAF и CLAMP в функциональной активности границы Fab-7 может иметь стадия-специфичный характер

Заключение

Выводы

Список литературы

Список использованных сокращений и терминов

PRE - Polycomb group response element, регуляторный элемент, с которым связываются белки группы Polycomb

TAD - Topologically Associating Domains - топологически ассоциированные домены хроматина

BX-C - Bithorax-комплекс

ChIP - Chromatin immunoprecipitaion - метод иммунопреципитации хроматина ChlP-seq - ChlP-sequencing - метод иммунопреципитации хроматина с последующим выскопроизводительным секвенированием

ChIP-on-chip - метод иммунопреципитации хроматина с последующим анализом с помощью ДНК-микрочипов

ChIP-qPCR - метод иммунопреципитации хроматина с последующей количественной ПЦР

EMSA - electrophoretic mobility shift assay - метод торможения в геле ДНК-белковых комплексов

ПЦР - полимеразная це.н.ая реакция

дцРНК - двуцепочечные РНК

IgG - иммуноглобулин

input - образец до иммунопреципитации

пИК — пре-инициаторый комплекс

GOF — gain-of-function, усиление проявления признака

LOF — loss-of-function, ослабление функции признака

ТФ — транскрипционный фактор

ТСС —сайт старта транскрипции

PcG — белки группы Polycomb

РНКП II — РНК - полимераза II

т.п.н. - тысяч пар нуклеотидов

п.н. — пар нуклеотидов

PTS — promoter targeting sequence, регуляторный элемент, способствующий взаимодействию энхансера с промотором

PTE — promoter-proximal tethering element, предпромоторный регуляторный элемент, специфично привлекающий только определенные энхансеры, находящиеся на больших дистанциях от промотора.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурная и функциональная организация границы Fab-7 bithorax – комплекса Drosophila melanogaster»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

В процессе эмбрионального развития многоклеточного организма реализуется очень сложная и крайне точная программа пространственно-временной экспрессии генов. Одними из главных регуляторов правильного развития тканей и органов являются Нох-гены, которые кодируют особую группу транскрипционных факторов. Наличие этих ТФ в определенной концентрации в клетке управляет профилем экспрессии других генов.

т~ч u u u 1 и

Вследствие крайней важности поддержания правильной тканеспецифичной концентрации продуктов Нох-генов в конкретном месте развивающегося эмбриона, их контролем занимаются сложные регуляторные сети. Bithorax - комплекс (ВХ-С) у D. melanogaster контролирует правильную парасегмент-специфичную экспрессию трех Нох-генов, которые определяют развитие заднего грудного и всех абдоминальных сегментов мухи: Ubx, abd-A и Abd-B. Это большой регион размером 300 т.п.н., который состоит из отдельных регуляторных доменов, которые включают в себя энхансеры и PRE, а на границах таких доменов описаны границы / инсуляторы, обеспечивающие автономность регуляторных событий в домене. Каждый регуляторный домен обеспечивает экспрессию одного из трех Hox-генов в одном из парасегментов, что является необходимым для развития соответствующего сегмента дрозофилы. При этом сложные взаимодействия между элементами, а также с промоторами Нох-генов формируют уникальный профиль экспрессии этих генов в каждом парасегменте. Несмотря на уже достаточно долгое изучение этой регуляторной сети, принципы её работы до сих пор являются предметом активных дискуссий. Особенно это касается роли границ BX-C в обеспечение правильной активации регуляторными доменами промоторов Hox генов.

Способность границы функционировать как инсулятор, ранее усложняло объяснение взаимодействие регуляторных доменов и промотора, находящихся с разных сторон от гранцицы. Однако этот парадокс получил объяснение, когда недавно было показано, что границы обеспечивают специфичную коммуникацию регуляторных доменов с промоторами Hox-генов. В настоящее время считается, что гранцицы в ВХ-С выполняют две основные функции: 1) инсулируют друг от друга регуляторные элементы,

находящиеся в регуляторных доменах, 2) обеспечивают специфичную коммуникацию между активными регуляторными доменами и промоторами Нох-генов.

Граница Fab-7 является удобной моделью для изучения роли отдельных компонентов границы в контексте обеспечения двух своих основных функций. Граница Fab-7 разделяет регуляторные домены iab-6 и iab-7, которые активируют ген Abd-B соответственно в пятом и шестом брюшных сегментах. Ранее, в большом количестве исследований было показано, что граница Fab-7 может выступать в роли инсулятора, которая блокирует взаимодействия между модельными энхансерами и промоторами, в трансгенных линиях дрозофилы.

Таким образом, ВХ-С является уникальной модельной системой для изучения таких мало исследованных областей в регуляции экспрессии высших эукариот, как механизмы регуляции и организации специфичных дистанционных взаимодействий, механизмы инсуляции и формирования независимых регуляторных доменов. Целью настоящего проекта является исследование границы Fab-7, картирование наиболее важных доменов, выяснение белков, которые определяют функции границы.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является определение минимальных функционально значимых участков границы Fab-7

В связи с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать различные варианты границы Fab-7 в контексте генома, используя платформу Fab-7attP50.

2. Исследовать функциональную активность мультиплицированных сайтов связывания для архитектурного белка Pita.

3. Исследовать функциональную активность коровых элементов границы Fab-7 в комбинации с сайтами связывания для архитектурного белка Pita.

4. Выяснить роль позднего эмбрионального комплекса (LBC) в организации специфичного дистанционного взаимодействия между iab-6 энхансером и Abd-B промотором.

5. Исследовать роль Ро1усотЬ-зависимого сайленсера (iab-7 PRE) из HS3, а также связывающихся с ним белков, в активности границы Fab-7.

Научная новизна. Теоритическая и практическая значимость работы

Работа выполнена с использованием платформы, на основе которой можно вместо границы Fab-7 в регуляторной области BX-C встраивать различные регуляторные элементы, сайты связывания ДНК-связывающих белков или производные самой границы Fab-7. Такой подход позволяет исследовать разные свойства тестируемых элементов и обладает рядом преимуществ. Во-первых, для BX-C хорошо охарактеризованы эффекты внесения мутаций в различные регуляторные элементы и известны фенотипические проявления разных типов мутаций в составе регуляторных элементов. Во-вторых, за счёт встраивания тестируемых элементов точно в исходное место в геноме границы Fab-7, исключен факт воздействия гетерогенного геномного окружения.

В результате становится возможным достаточно легко интерпретировать свойства тестируемых регуляторных элементов. Детальный анализ компонентов границы Fab-7 позволил нам определить ключевые элементы, необходимые для выполнения границей двух основных функций: блокирование активирующего сигнала энхансеров из соседних регуляторных доменов и обеспечение коммуникации специфичного энхансера из регуляторного домена iab-6 с промоторной областью гена Abd-B в парасегменте 11, что определяет правильное развитие соответствующего абдоминального сегмента (А6) мухи. Детальный анализ позволил нам выявить не только ключевые регуляторные модули Fab-7, но и специфичные сайты связывания белков, участвующих в обеспечении активности границы. Впервые была показана роль PRE из регуляторной области iab- 7 в обеспечении функциональной активности границы Fab-7. Также впервые были продемонстрированы характер рекрутирования белков CLAMP и GAF на участки границы Fab-7 и необходимость их кооперативного присутствия для обеспечения правильного функционирования границы.

Методология и методы исследования

Работа произведена с использованием современных методов молекулярной биологии и генетики, с применением современных лабораторных инструментов (приборы для ПЦР в реальном времени, конфокальный микроскоп, стереомикроскоп, центрифуги и другие). Среди применявшихся в работе методов можно выделить следующие:

полимеразная цепная реакция, молекулярное клонирование, трансформация бактериальных штаммов, выделение и очистка плазмидной и геномной ДНК, электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле, торможение ДНК-белковых комплексов в геле, выделение и иммунопреципитация хроматина, количественная ПЦР, иммуноокрашивание и другие.

Положения, выносимые на защиту

1. Работа границы Fab-7 зависит от наличия в своем составе корового участка (dHS 1) и нескольких взаимозаменяемых регуляторных модулей, что может свидетельствовать об функциональной избыточности регуляторных модулей в составе данной границы.

2. Мультиплицированные сайты связывания архитектурного белка Pita, замещающие границу Fab-7, выполняют функцию классического инсулятора: изолируют соседние iab-6 и iab-7 домены и препятствуют взаимодействию iab-6 энхансера с промотором гена Abd-B. Находясь в составе с коровым участком dHS1 (dHS1+Pitax5), сайты связывания белка Pita позитивно влияют на выполнение элементом dHS 1 коммуникаторной функции.

3. Мультимеризованные сайты связывания для архитектурного белка Pita в комбинации с участком dHS 1 способны формировать функционально активную границу регуляторного домена, обладающую свойствами эндогенной границы Fab-7, которая поддерживает специфичное дистанционное взаимодействие между энхансером iab-6 и промотором гена Abd-B и блокирует контакты между доменами iab-6 и iab-7.

4. К одному из участков границы Fab-7 (dHS1) привлекается поздний эмбриональный комплекс (LBC), необходимый для обеспечения функциональной активности корового элемента в процессе организации дистанционных контактов между энхансером iab-6 и промотором гена Abd-B.

5. Polycomb-зависимый сайленсер (PRE), который находится в Щ3-участке границы Fab-7, может выполнять функции инсулятора. HS3 совместно с коровым dHS1-элементом создают полностью функциональную границу между iab-6 и iab-7 регуляторными доменами bithorax - комплекса. Белки GAF и CLAMP, привлекающиеся к участку PRE в составе Fab-7, определяют его инсуляторную активность.

Степень достоверности и апробация результатов

Работа была апробирована на двух международных конференциях. По результатам работы опубликованы две статьи в международных журналах. Цель, поставленная в работе, достигнута.

Публикации:

1. O. Kyrchanova, A. Kurbidaeva, M. Sabirov, N. Postika, D. Wolle, T. Aoki, O. Maksimenko, V. Mogila, P. Schedl, P. Georgiev. The bithorax complex iab-7 Polycomb Response Element has a novel role in the functioning of the Fab-7 chromatin boundary // PLOS Genet. 2018. Vol. 14, № 8. P. e1007442.

2. O. Kyrchanova*, M. Sabirov*, V. Mogila, A. Kurbidaeva, N. Postika, O. Maksimenko, P. Schedl, P. Georgiev. Complete reconstitution of bypass and blocking functions in a minimal artificial Fab-7 insulator from Drosophila bithorax complex // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2019. Vol. 116, № 27. P. 13462 - 13467.

Тезисы конференций:

1. M. Sabirov, N. Postika, O. Maksimenko, P. Georgiev, O. Kyrchanova. Mapping of functional elements in Fab7 boundary involved in regulation of Drosophila hox gene AbdB // // 43th

FEBS Congress, Prague, Czech Republic, FEBS Open Bio 8 (Suppl. S1) (2018) 107-496, P. 133.

2. M. Sabirov, N. Postika, O. Maksimenko, P. Georgiev, O. Kyrchanova. Functional redundancy of the Fab-7 boundary in the Bithorax-complex is defined by dual activity of the iab-7 Polycomb Response Element // Abstracts of papers presented at the 13th EMBL Conference: Transcription and Chromatin. Heidelberg, Germany 2018, P. 384

Личное участие автора в проведении исследований

Большая часть представленных результатов была получена автором самостоятельно, либо при непосредственном участии автора. Самостоятельно были произведены сбор и фиксация материала для иммунопреципитации хроматина для трех стадий развития (эмбрионы, личинки и куколки) полученных трансгенных линий D. melanogaster с последующим выделением хроматина. Была произведена серия

иммунопреципитаций хроматина в трех биологических повторностях с последующим анализом посредством количественной ПЦР и статистическая оценка полученных результатов. Молекулярное клонирование генетических конструкций было проведено совместно с О.В. Кырчановой. Имунноокрашивание эмбрионов и приготовление кутикулярных препаратов осуществлялось совместно Н.Е. Постикой. Эксперименты по торможению ДНК-белковых комплексов в геле (ЕМ8А) проведены А. Курбидаевой (Принстонский Университет, США). Другие соавторы указаны в соответствующих опубликованных работах. Автор принимал непосредственное участие в обсуждении и планировании экспериментов, а также в интерпретации результатов и подготовке данных для публикаций.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, трех глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты»), заключения и выводов. Работа изложена на 123 страницах, содержит 31 рисунок. Список литературы включает 183 источника.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Устройство эукариотических промоторов и энхансеров. Взаимодействия между энхансерами и промоторами в геноме Вго8орЫ1а

Транскрипция генов эукариот - это сложный процесс, который требует точной координации в сборке транс-действующих факторов на регуляторных последовательностях ДНК. Промотор и энхансер представляют из себя регуляторные участки, ответственные за обеспечение правильного профиля пространственно-временной экспрессии эукариотических генов [1]. Прежде чем описывать известные свойства этих регуляторных элементов, ознакомимся с основным набором методов, которые используются в настоящее время для поиска регуляторных элементов в геноме.

1.1.1. Методы картирования в геноме регуляторных элементов

В эукариотическом геноме выделяют несколько типов регуляторных элементов, каждый из которых выполняет свои функции. Это промоторы, энхансеры, сайленсеры и инсуляторы. За счёт их кооперативной работы обеспечивается правильная пространственно-временная организация генома, выражающаяся в своевременной экспрессии определенных групп генов. Несмотря на то, что каждый тип регуляторного элемента выполняет определенную функцию, структурно они имеют ряд общих свойств. Благодаря этому часто для картирования и описания свойств разных регуляторных элементов используют общие методы (Рисунок 1):

Рисунок 1. Различные геномные подходы картирования и предсказания регуляторных элементов. А: СЫР^ед с использованием специфичных антител для определения профиля связывания ТФ по геному. Не все сайты связывания ТФ в геноме соответствуют функциональным регуляторным элементам; Б: зоны активных регуляторных элементов «обеднены» нуклеосомами, в результате их ДНК становится доступной воздействию нуклеаз. Такие регионы детектируются благодаря эффективному разрезанию ДНКазой I и микроккоковой нуклеазой с последующим глубоким секвенированием; В: нуклеосомы, фланирующие регуляторные элементы, несут характерные гистоновые модификации, которые могут быть детектированы с помощью СЫ1Р-8ед с использованием антител к специфичным гистоновым модификациям; Г: энхансеры сближены с соответствующими им промоторами через хроматиновые петли, которые формируются за счёт установления комплексов с Медиатором и когезинами. При помощи СЫ1Р-8ед-анализа можно детектировать точки контактов когезина и медиатора на промоторах и энхансерах и предсказывать расположение энхансеров; Д: анализ хроматиновых взаимодействий путем секвенирования парно-концевых тэгов совместно с С-методами (методы определения фиксированной конформации хромосом) детектирует пространственные контакты за счёт формальдегидной сшивки, фрагментации ДНК с последующим лигированием фрагментированных участков ДНК и глубоким секвенированием. СЫ1А-РЕТ включает

шаг иммунопреципитации хроматина, в результате чего происходит обогащение комплексами «белок-хроматин», которые содержат специфичный белок (например, РНКП II). Взято из [21] с изменениями.

1. Иммунопреципитация хроматина с использованием антител к интересующему белку с последующим глубоким секвенированием (ChIP-seq), гибридизацией на микрочипах или количественной ПЦР.

Данный подход является крайне удобным для определения профиля распределения и поиска мотивов связывания исследуемого ТФ in vivo (Рисунок 1А). За счёт химической сшивки все ядерные белки ковалентно сшиваются с хроматином, после чего хроматин фрагментируется. Далее проводится реакция иммуннопреципитации с использованием специфичных к изучаемому белку антител. В конечном итоге выделяется набор коротких участков ДНК, с которыми был связан исследуемый белок. Далее полученные фрагменты ДНК используются для приготовления библиотек для глубокого секвенирования и, в результате аннотирования данных, получают информацию о полногеномном распределении изучаемого белка, а также мотив связывания [2]. Поскольку любой регуляторный элемент представляет из себя участок ДНК занятый различным набором белковых комплексов, то определение мест в геноме, которые занимает тот или иной белок, способствует пониманию того, какую функцию может выполнять занимаемый этим белком фрагмент ДНК. Кроме того, данные по полногеномногу распределению компонентов комплексов, чьи функции известны, помогают предсказывать свойства регуляторного элемента. Например, известно, что энхансеры находятся в тесной пространственной близости с их целевыми промоторами в процессе активации транскрипции, таким образом, зная профиль геномного распределения белковых комплексов, участвующих в установлении и поддержании подобных контактов, можно предсказать, где располагаются энхансеры. Например, известно, что когезины и Медиатор вовлечены в процесс объединения энхансеров и промоторов [3], поэтому по их ChIP-профилям можно предсказывать места расположения энхансеров (Рисунок 1Г).

2. Ферментативное разрезание доступной ДНК с использованием ДНКазы I или микрококковой нуклеазы (МНказа) совмещенное с глубоким секвенированием (DNase-seq и MNase-seq, соответственно).

Ранее было установлено различие в степени доступности ДНК между участками с активными генами и транскрипционно подавленными областями [4]. На настоящий момент известно, что участки с регуляторными элементами истощены нуклеосомами, в результате ДНК в этих местах является более доступной. Такие участки хроматина называют «открытыми» (Рисунок 1Б). Данное свойство хроматина используется при ферментативном разрезании доступной ДНК ферментами ДНКазой I (Б№8е-8ед ) или микрококковой нуклеазой (МЫа8е^ед) с последующим секвенированием [5, 6] . С помощью высокого разрешения можно детектировать не только участки ДНК,

свободные от нуклеосом, но и «следы» отдельных ТФ внутри протяженных «открытых» участков ДНК. Свойства открытых участков хроматина определяется набором транскрипционных факторов, которые с ним связываются, поэтому данные по доступности ДНК и данные связывания ТФ (СЫ1Р-8ед) используются совместно для описания свойств таких участков [7]. Например, промоторные регионы, окружающие ТСС, представляют из себя ДНКазо-доступные участки [8]. Энхансеры и инсуляторы так же представляют из себя доступные участки ДНК, с которыми способны связываться ТФ и их кофакторы [9, 10]. Наконец, доступные области могут быть заняты репрессионными ТФ и быть инактивированы [11].

3. Анализ транспозаза-доступности хроматина с использованием полногеномного секвенирования (ATAC-seq)

Альтернативная техника для оценки полногеномной доступности хроматина [12]. Идентификация доступных ДНК-регионов осуществляется посредством маркирования

и и гр ^ и

открытого хроматина гиперактивной мутантной Тп5-транспозазой, которая встраивает адаптеры для секвенирования в открытые участки хроматина. Тп5-транспозаза разрезает и добавляет к двухцепочечной ДНК адаптеры для секвенирования. Фрагменты ДНК с адаптерами очищаются, амплифицируются и секвенируются. По результатам секвенирования делается заключение о степени доступности участков, а так же становится возможным картировать районы связывания ТФ и позиции нуклеосом. Количество ридов на регион коррелирует со степенью доступности хроматина в данном участке генома [13].

4. Иммунопреципитация хроматина с использованием антител к специфичным посттрансляционным модификациям гистонов.

Активные регуляторные элементы истощены нуклеосомами, однако гистоны, в составе фланкирующих регуляторные элементы нуклеосом, несут специфичные посттрансляционные модификации [14, 15]. Характерной особенностью является то, что определенному регуляторному элементу соответствует своя «гистоновая метка» или их определенное сочетание (Рисунок 1В).

Активные промоторы обычно маркированы меткой Н3К4ме3, а энхансеры -Н3К4ме1, при этом оба элемента дополнительно содержат метку Н3К27ац [16, 17]. Напротив, метку Н3К9ме3 обычно несут гистоны в составе нуклеосом гетерохроматиновых областей [18]. Репрессированные энхансеры и промоторы часто заняты нуклеосомами, содержащими метку Н3К27ме3, которая связана с репрессией, ассоциированной с белками группы Polycomb. Данная метка может маркировать промоторы и энхансеры вдоль очень протяженных доменов, но, что интересно, не сосуществует с меткой Н3К27ац на одних и тех же гистонах [19].

Полногеномные работы по гистоновым модификациям выявили несколько удивительных фактов в процессе регуляции транскрипции. Например, молчащие энхансеры (не участвующие в данный момент времени в данной клетке в транскрипции) несут гистоновые модификации, ассоциированные и с активным и с неактивным состояниями (Н3К4ме1 и Н3К27ме3) [16]. Также интересно отметить что гистоновая модификация Н3К79ме3, обнаруженная в теле активно транскрибируемых генов, также наблюдается на активных энхансерах, и, параллельно со связыванием РНКП II, является хорошим предсказателем активности элемента [17]. Учитывая широкое использование гистоновых модификаций для предсказания энхансеров, стоит отметить, что не существует единого консенсуса, по которому метки предсказывали бы статус регуляторного элемента. Например, такое предсказание часто требует наличия Н3К4ме1 и Н3К27ац, низкого уровня Н3К4ме3 и отсутствия Н3К27ме3 [16]. Комбинация гистоновых модификаций Н3К4ме1, Н3К27ац и Н3К79ме3 были описаны как хорошие предсказатели энхансеров развития для D. melanogaster [17].

5. Фиксация конформации хромосом (3С) и его производные

Выше, обсуждались методы, которые позволяют предсказать или идентифицировать тот или иной регуляторный элемент за счёт оценки

последовательности ДНК или свойств хроматина, а также описания связывающих этот регион ТФ и кофакторов. В контексте пространственной архитектуры хроматина регуляторные элементы могут взаимодействовать друг с другом физически посредством связывающихся с ними ТФ и кофакторов. Такие взаимодействия несут функциональное значение и организуют специфичную пространственно-временную работу генома.

Хроматиновые физические контакты могут быть детектированы, используя метод фиксации конформации хромосом (3С - chromosome conformation capture) и его варианты: 4С, 5С и Hi- C [20]. В данных методах хросомные контакты фиксируются формальдегидом, линейная геномная ДНК фрагментируется, и пространственно сближенные фрагменты ДНК лигируются друг с другом. Образованные химерные молекулы ДНК содержат фрагменты, которые не располагаются рядом в линейной геномной последовательности, но которые отражают пространственные контакты. Такие контакты затем можно идентифицировать с помощью количественной ПЦР (кПЦР/qPCR) или глубоким секвенированием (Рисунок 1Д). Существует ещё одна вариация вышеописанных методов - анализ хроматиновых взаимодействий с секвенированием парно-концевых тэгов (ChIA-PET - chromatin interaction analysis with paired-end tag sequencing). Данный метод объединяет 3С-методы и ChIP, тем самым детектируя хромосомные контакты, в организации которых участвует определенный белок. Одно из применений ChIA-PET с использованием специфичных антител к РНКП II - для идентификации транскрипционных энхансеров и их генов-мишеней (Рисунок 1Д) [21].

Каждый метод по отдельности, несмотря на большое количество генерируемых данных, обладает рядом ограничений. Например, для типичного ДНК-связывающего ТФ, данные ChIP-seq могут предсказывать тысячи сайтов связывания, при этом, только часть из них будет соответствовать мотиву связывания для данного ТФ, и многие участки не будут соответствовать функциональным регуляторным элементам. Кроме этого, связывание ТФ далеко не всегда приводит к изменению транскрипции близлежащего гена [23]. Так же стоит понимать, что любой регуляторный элемент состоит из целого ансамбля сайтов связывания для разных ТФ и только их кооперативное присутствие обеспечивает функциональную активность элемента. Поэтому, в процессе поиска и предсказания регуляторных элементов с помощью данных ChIP-seq надо анализировать

сразу ряд ТФ и на основе данных их колоколизации выдвигать предположения о принципах организации регуляторных элементов генома [24].

Стратегия предсказания регуляторных элементов с использованием данных о доступности хроматина - очень полезный инструмент, но не является достаточным без данных о наборе ТФ, которые занимают исследуемый участок генома. Профиль гистоновых модификаций фланкирующих регуляторные элементы нуклеосом, на первый взгляд, кажется наиболее универсальным подходом, однако также имеет целый ряд исключений. Во-первых, ни одна из известных гистоновых модификаций не коррелирует однозначным образом с активностью регуляторного элемента. Особенно это относится к энхансерам, которые являются наиболее динамичными регуляторными элементами. Так что даже комбинация меток не является совершенным предсказателем. Например, половина мезодермальных энхансеров эмбрионов D. melanogaster не предсказывается только наличием метки Н3К27ац [17]. Во-вторых, функциональная роль большинства хроматиновых модификаций, ассоциированных с активными энхансерами, не известна. Не существует доказательств того, что гистоновые метки Н3К4ме1 или Н3К27ац являются достаточными, необходимыми или даже механистически вовлеченными в транскрипцию [25]. Схожим образом, метка Н3К4ме3 не является необходимой для инициации транскрипции [26]. Подобные исключения и ограничения, в основном, связаны с тем, что природа и функции гистоновых модификаций на настоящее время не является достаточно изученной.

ЗС-основанные методы изначально были разработаны для зондирования пространственной организации генома, то есть для детекции, в первую очередь, физических контактов, а не регуляторных взаимодействий. Поэтому важно внимательно рассматривать их свойства при применении этих методов с целью изучения генной регуляции. Сильным ограничением может стать недостаточное разрешение получаемых карт пространственных контактов, учитывая, что контакты между смежными регионами (менее чем 10 т.п.н., где располагаются многие энхансеры относительно промоторов целевых генов) сложно детектировать из-за высокого фона на малых расстояниях. Наконец, ЗС-основанные методы оценивают физические контакты, которые не обязаны строго соответствовать регуляторным взаимодействиям [27].

Таким образом, успешное картирование регуляторных элементов генома достигается за счёт комплексного использования описанных подходов. Несмотря на

закономерные ограничения каждого из подходов по отдельности, комплексное использование геномных методов - очень мощный инструмент картирования регуляторных элементов генома.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Сабиров Марат Садекович, 2020 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Kim T.-K., Shiekhattar R. Architectural and Functional Commonalities between Enhancers and Promoters // Cell. 2015. Vol. 162, № 5. P. 948-959.

2. Johnson D.S. et al. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions // Science. 2007. Vol. 316, № 5830. P. 1497-1502.

3. Kagey M.H. et al. Mediator and cohesin connect gene expression and chromatin architecture // Nature. 2010. Vol. 467, № 7314. P. 430-435.

4. Weintraub H., Groudine M. Chromosomal subunits in active genes have an altered conformation // Science. 1976. Vol. 193, № 4256. P. 848-856.

5. Boyle A.P. et al. High-resolution mapping and characterization of open chromatin across the genome // Cell. 2008. Vol. 132, № 2. P. 311-322.

6. Yuan G.-C. et al. Genome-scale identification of nucleosome positions in S. cerevisiae // Science. 2005. Vol. 309, № 5734. P. 626-630.

7. Pique-Regi R. et al. Accurate inference of transcription factor binding from DNA sequence and chromatin accessibility data // Genome Res. 2011. Vol. 21, № 3. P. 447-455.

8. Thurman R.E. et al. The accessible chromatin landscape of the human genome // Nature. 2012. Vol. 489, № 7414. P. 75-82.

9. Arnold C.D. et al. Genome-wide quantitative enhancer activity maps identified by STARR-seq // Science. 2013. Vol. 339, № 6123. P. 1074-1077.

10. Xi H. et al. Identification and characterization of cell type-specific and ubiquitous chromatin regulatory structures in the human genome // PLoS Genet. 2007. Vol. 3, № 8. P. e136.

11. Gray S., Levine M. Transcriptional repression in development // Curr. Opin. Cell Biol. 1996. Vol. 8, № 3. P. 358-364.

12. Buenrostro J. et al. Transposition of native chromatin for multimodal regulatory analysis and personal epigenomics // Nat Methods. 2013. Vol. 10, № 12. P. 1213-1218.

13. Buenrostro J. et al. ATAC-seq: A Method for Assaying Chromatin Accessibility Genome-Wide // Curr. Protoc. Mol. Biol. 2015. Vol. 109 № 29. P. 291-299.

14. Kouzarides T. Chromatin modifications and their function // Cell. 2007. Vol. 128, № 4. P. 693-705.

15. Bell O. et al. Determinants and dynamics of genome accessibility // Nat. Rev. Genet. 2011. Vol. 12, № 8. P. 554-564.

16. Rada-Iglesias A. et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans // Nature. 2011. Vol.470, №7333. Р. 279-283

17. Bonn S. et al. Tissue-specific analysis of chromatin state identifies temporal signatures of enhancer activity during embryonic development // Nat. Genet. 2012. Vol. 44, № 2. P. 148-156.

18. Peters A.H.F.M. et al. Histone H3 lysine 9 methylation is an epigenetic imprint of facultative heterochromatin // Nat. Genet. 2002. Vol. 30, № 1. P. 77-80.

19. Simon J.A., Kingston R.E. Mechanisms of polycomb gene silencing: knowns and unknowns // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2009. Vol. 10, № 10. P. 697-708.

20. van Steensel B., Dekker J. Genomics tools for unraveling chromosome architecture // Nat. Biotechnol. 2010. Vol. 28, № 10. P. 1089-1095.

21. Li G. et al. Extensive promoter-centered chromatin interactions provide a topological basis for transcription regulation // Cell. 2012. Vol. 148, № 1-2. P. 84-98.

22. Shlyueva D., Stampfel G., Stark A. Transcriptional enhancers: from properties to genome-wide predictions // Nat. Rev. Genet. 2014. Vol. 15, № 4. P. 272-286.

23. Fisher W.W. et al. DNA regions bound at low occupancy by transcription factors do not drive patterned reporter gene expression in Drosophila // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2012. Vol. 109, № 52. P. 21330-21335.

24. Spitz F., Furlong E.E.M. Transcription factors: from enhancer binding to developmental control // Nat. Rev. Genet. 2012. Vol. 13, № 9. P. 613-626.

25. Hodl M., Basler K. Transcription in the absence of histone H3.2 and H3K4 methylation // Curr. Biol. CB. 2012. Vol. 22, № 23. P. 2253-2257.

26. Dorighi K.M. et al. Mll3 and Mll4 Facilitate Enhancer RNA Synthesis and Transcription from Promoters Independently of H3K4 Monomethylation // Mol. Cell. 2017. Vol. 66, № 4. P. 568-576.e4.

27. Gibcus J.H., Dekker J. The hierarchy of the 3D genome // Mol. Cell. 2013. Vol. 49, № 5. P. 773-782.

28. Zabidi M.A., Stark A. Regulatory Enhancer-Core-Promoter Communication via Transcription Factors and Cofactors // Trends Genet. TIG. 2016. Vol. 32, № 12. P. 801-814.

29. Льюин Б. Гены; пер. 9-го англ. Бином. Лаборатория знаний. 2011. 896 p.

30. 4.3 Regulation of Gene Expression in Eukaryotic Cells | Life Science | University of Tokyo [Electronic resource]. URL: http://csls-text.c.u-tokyo.ac.jp/inactive/04_03.html (accessed: 18.07.2019).

31. Orphanides G., Lagrange T., Reinberg D. The general transcription factors of RNA polymerase II // Genes Dev. 1996. Vol. 10, № 21. P. 2657-2683.

32. Butler J.E.F., Kadonaga J.T. The RNA polymerase II core promoter: a key component in the regulation of gene expression // Genes Dev. 2002. Vol. 16, № 20. P. 2583-2592.

33. Berk A.J. TBP-like factors come into focus // Cell. 2000. Vol. 103, № 1. P. 5-8.

34. Holmes M.C., Tjian R. Promoter-selective properties of the TBP-related factor TRF1 // Science. 2000. Vol. 288, № 5467. P. 867-870.

35. Kaltenbach L. et al. The TBP-like factor CeTLF is required to activate RNA polymerase II transcription during C. elegans embryogenesis // Mol. Cell. 2000. Vol. 6, № 3. P. 705-713.

36. Zolotarev N. et al. Opbp is a new architectural/insulator protein required for ribosomal gene expression // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № 21. P. 12285-12300.

37. Smale S.T., Baltimore D. The "initiator" as a transcription control element // Cell. 1989. Vol. 57, № 1. P. 103-113.

38. Hultmark D., Klemenz R., Gehring W.J. Translational and transcriptional control elements in the untranslated leader of the heat-shock gene hsp22 // Cell. 1986. Vol. 44, № 3. P. 429-438.

39. Chalkley G.E., Verrijzer C.P. DNA binding site selection by RNA polymerase II TAFs: a TAF(II)250-TAF(II)150 complex recognizes the initiator // EMBO J. 1999. Vol. 18, № 17. P. 4835-4845.

40. Weis L., Reinberg D. Transcription by RNA polymerase II: initiator-directed formation of transcription-competent complexes // FASEB J. Off. Publ. Fed. Am. Soc. Exp. Biol. 1992. Vol. 6, № 14. P. 3300-3309.

41. Burke T.W., Kadonaga J.T. Drosophila TFIID binds to a conserved downstream basal promoter element that is present in many TATA-box-deficient promoters // Genes Dev. 1996. Vol. 10, № 6. P. 711-724.

42. Burke T.W., Kadonaga J.T. The downstream core promoter element, DPE, is conserved from Drosophila to humans and is recognized by TAFII60 of Drosophila // Genes Dev. 1997. Vol. 11, № 22. P. 3020-3031.

43. Kutach A.K., Kadonaga J.T. The downstream promoter element DPE appears to be as widely used as the TATA box in Drosophila core promoters // Mol. Cell. Biol. 2000. Vol. 20, № 13. P. 4754-4764.

44. Willy P.J., Kobayashi R., Kadonaga J.T. A basal transcription factor that activates or represses transcription // Science. 2000. Vol. 290, № 5493. P. 982-985.

45. Lagrange T. et al. New core promoter element in RNA polymerase II-dependent transcription: sequence-specific DNA binding by transcription factor IIB // Genes Dev. 1998. Vol. 12, № 1. P. 34-44.

46. Evans R., Fairley J.A., Roberts S.G. Activator-mediated disruption of sequence-specific DNA contacts by the general transcription factor TFIIB // Genes Dev. 2001. Vol. 15, № 22. P. 29452949.

47. Qureshi S.A., Jackson S.P. Sequence-specific DNA binding by the S. shibatae TFIIB homolog, TFB, and its effect on promoter strength // Mol. Cell. 1998. Vol. 1, № 3. P. 389-400.

48. Adachi N., Lieber M.R. Bidirectional gene organization: a common architectural feature of the human genome // Cell. 2002. Vol. 109, № 7. P. 807-809.

49. Bird A. DNA methylation patterns and epigenetic memory // Genes Dev. 2002. Vol. 16, № 1. P. 6-21.

50. Antequera F., Bird A. Number of CpG islands and genes in human and mouse // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993. Vol. 90, № 24. P. 11995-11999.

51. Banerji J., Rusconi S., Schaffner W. Expression of a beta-globin gene is enhanced by remote SV40 DNA sequences // Cell. 1981. Vol. 27, № 2 Pt 1. P. 299-308.

52. Grosschedl R., Birnstiel M.L. Spacer DNA sequences upstream of the T-A-T-A-A-A-T-A sequence are essential for promotion of H2A histone gene transcription in vivo // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1980. Vol. 77, № 12. P. 7102-7106.

53. Banerji J., Olson L., Schaffner W. A lymphocyte-specific cellular enhancer is located downstream of the joining region in immunoglobulin heavy chain genes // Cell. 1983. Vol. 33, № 3. P. 729-740.

54. Gillies S.D. et al. A tissue-specific transcription enhancer element is located in the major intron of a rearranged immunoglobulin heavy chain gene // Cell. 1983. Vol. 33, № 3. P. 717728.

55. Guarente L. UASs and enhancers: common mechanism of transcriptional activation in yeast and mammals // Cell. 1988. Vol. 52, № 3. P. 303-305.

56. Brodsky A.S. et al. Genomic mapping of RNA polymerase II reveals sites of co-transcriptional regulation in human cells // Genome Biol. 2005. Vol. 6, № 8. P. R64.

57. May D. et al. Large-scale discovery of enhancers from human heart tissue // Nat. Genet. 2011. Vol. 44, № 1. P. 89-93.

58. Visel A. et al. ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers // Nature.

2009. Vol. 457, № 7231. P. 854-858.

59. ENCODE Project Consortium. An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome // Nature. 2012. Vol. 489, № 7414. P. 57-74.

60. Rada-Iglesias A. et al. A unique chromatin signature uncovers early developmental enhancers in humans // Nature. 2011. Vol. 470, № 7333. P. 279-283.

61. Jin Q. et al. Distinct roles of GCN5/PCAF-mediated H3K9ac and CBP/p300-mediated H3K18/27ac in nuclear receptor transactivation // EMBO J. 2011. Vol. 30, № 2. P. 249-262.

62. Kim T.-K. et al. Widespread transcription at neuronal activity-regulated enhancers // Nature.

2010. Vol. 465, № 7295. P. 182-187.

63. De Santa F. et al. A large fraction of extragenic RNA pol II transcription sites overlap enhancers // PLoS Biol. 2010. Vol. 8, № 5. P. e1000384.

64. Sanyal A. et al. The long-range interaction landscape of gene promoters // Nature. 2012. Vol. 489, № 7414. P. 109-113.

65. Natoli G., Andrau J.-C. Noncoding transcription at enhancers: general principles and functional models // Annu. Rev. Genet. 2012. Vol. 46. P. 1-19.

66. Mikhaylichenko O. et al. The degree of enhancer or promoter activity is reflected by the levels and directionality of eRNA transcription // Genes Dev. 2018. Vol. 32, № 1. P. 42-57.

67. Vietri Rudan M., Hadjur S. Genetic Tailors: CTCF and Cohesin Shape the Genome During Evolution // Trends Genet. TIG. 2015. Vol. 31, № 11. P. 651-660.

68. Ulianov S.V. et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains // Genome Res. 2016. Vol. 26, № 1. P. 7084.

69. Guo Y. et al. CRISPR Inversion of CTCF Sites Alters Genome Topology and Enhancer/Promoter Function // Cell. 2015. Vol. 162, № 4. P. 900-910.

70. Calhoun V.C., Stathopoulos A., Levine M. Promoter-proximal tethering elements regulate enhancer-promoter specificity in the Drosophila Antennapedia complex // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2002. Vol. 99, № 14. P. 9243-9247.

71. Zhou J., Levine M. A novel cis-regulatory element, the PTS, mediates an anti-insulator activity in the Drosophila embryo // Cell. 1999. Vol. 99, № 6. P. 567-575.

72. Ohtsuki S., Levine M., Cai H.N. Different core promoters possess distinct regulatory activities in the Drosophila embryo // Genes Dev. 1998. Vol. 12, № 4. P. 547-556.

73. Kadonaga J.T. Perspectives on the RNA polymerase II core promoter // Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2012. Vol. 1, № 1. P. 40-51.

74. Yanez-Cuna J.O. et al. Dissection of thousands of cell type-specific enhancers identifies dinucleotide repeat motifs as general enhancer features // Genome Res. 2014. Vol. 24, № 7. P. 1147-1156.

75. Cavalli G., Misteli T. Functional implications of genome topology // Nat. Struct. Mol. Biol. 2013. Vol. 20, № 3. P. 290-299.

76. Kharchenko P.V. et al. Comprehensive analysis of the chromatin landscape in Drosophila melanogaster // Nature. 2011. Vol. 471, № 7339. P. 480-485.

77. Dixon J.R. et al. Topological domains in mammalian genomes identified by analysis of chromatin interactions // Nature. 2012. Vol. 485, № 7398. P. 376-380.

78. Cohen J. Position-effect variegation at several closely linked loci in Drosophila melanogaster // Genetics. 1962. Vol. 47. P. 647-659.

79. Lewis E.B. The Theory and Application of a New Method of Detecting Chromosomal Rearrangements in Drosophila Melanogaster // Genes, Development, and Cancer: The Life and Work of Edward B. Lewis / ed. Lipshitz H.D. Dordrecht: Springer Netherlands, 2007. P. 117131.

80. Csink A.K., Henikoff S. Genetic modification of heterochromatic association and nuclear organization in Drosophila // Nature. 1996. Vol. 381, № 6582. P. 529-531.

81. Chan C.S., Rastelli L., Pirrotta V. A Polycomb response element in the Ubx gene that determines an epigenetically inherited state of repression // EMBO J. 1994. Vol. 13, № 11. P. 2553-2564.

82. Kellum R., Schedl P. A position-effect assay for boundaries of higher order chromosomal domains // Cell. 1991. Vol. 64, № 5. P. 941-950.

83. Muller H.J. Types of visible variations induced by X-rays inDrosophila // J. Genet. 1930. Vol. 22, № 3. P. 299-334.

84. Lewis E.B. The Relation of Repeats to Position Effect in Drosophila Melanogaster // Genetics. 1945. Vol. 30, № 2. P. 137-166.

85. Dejardin J. Switching between Epigenetic States at Pericentromeric Heterochromatin // Trends Genet. TIG. 2015. Vol. 31, № 11. P. 661-672.

86. Zhimulev I.F. Morphology and structure of polytene chromosomes // Adv. Genet. 1996. Vol. 34. P. 1-497.

87. Schwartz Y.B. et al. Genome-wide analysis of Polycomb targets in Drosophila melanogaster // Nat. Genet. 2006. Vol. 38, № 6. P. 700-705.

88. Filion G.J. et al. Systematic protein location mapping reveals five principal chromatin types in Drosophila cells // Cell. 2010. Vol. 143, № 2. P. 212-224.

89. van Steensel B., Henikoff S. Identification of in vivo DNA targets of chromatin proteins using tethered dam methyltransferase // Nat. Biotechnol. 2000. Vol. 18, № 4. P. 424-428.

90. modENCODE Consortium et al. Identification of functional elements and regulatory circuits by Drosophila modENCODE // Science. 2010. Vol. 330, № 6012. P. 1787-1797.

91. Lucchesi J.C., Kuroda M.I. Dosage compensation in Drosophila // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2015. Vol. 7, № 5.

92. Schwartz Y.B., Cavalli G. Three-Dimensional Genome Organization and Function in Drosophila // Genetics. 2017. Vol. 205, № 1. P. 5-24.

93. Sexton T. et al. Three-dimensional folding and functional organization principles of the Drosophila genome // Cell. 2012. Vol. 148, № 3. P. 458-472.

94. Hou C. et al. Gene density, transcription, and insulators contribute to the partition of the Drosophila genome into physical domains // Mol. Cell. 2012. Vol. 48, № 3. P. 471-484.

95. Ho J.W.K. et al. Comparative analysis of metazoan chromatin organization // Nature. 2014. Vol. 512, № 7515. P. 449-452.

96. Jost D. et al. Modeling epigenome folding: formation and dynamics of topologically associated chromatin domains // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42, № 15. P. 9553-9561.

97. Boettiger A.N. et al. Super-resolution imaging reveals distinct chromatin folding for different epigenetic states // Nature. 2016. Vol. 529, № 7586. P. 418-422.

98. Ghavi-Helm Y. et al. Enhancer loops appear stable during development and are associated with paused polymerase // Nature. 2014. Vol. 512, № 7512. P. 96-100.

99. Van Bortle K. et al. Insulator function and topological domain border strength scale with architectural protein occupancy // Genome Biol. 2014. Vol. 15, № 6. P. R82.

100. Udvardy A., Maine E., Schedl P. The 87A7 chromomere. Identification of novel chromatin structures flanking the heat shock locus that may define the boundaries of higher order domains // J. Mol. Biol. 1985. Vol. 185, № 2. P. 341-358.

101. Geyer P.K., Corces V.G. DNA position-specific repression of transcription by a Drosophila zinc finger protein // Genes Dev. 1992. Vol. 6, № 10. P. 1865-1873.

102. Zhao K., Hart C.M., Laemmli U.K. Visualization of chromosomal domains with boundary element-associated factor BEAF-32 // Cell. 1995. Vol. 81, № 6. P. 879-889.

103. Gaszner M., Vazquez J., Schedl P. The Zw5 protein, a component of the scs chromatin domain boundary, is able to block enhancer-promoter interaction // Genes Dev. 1999. Vol. 13, № 16. P. 2098-2107.

104. Moon H. et al. CTCF is conserved from Drosophila to humans and confers enhancer blocking of the Fab-8 insulator // EMBO Rep. 2005. Vol. 6, № 2. P. 165-170.

105. Cuartero S. et al. Ibf1 and Ibf2 are novel CP190-interacting proteins required for insulator function // EMBO J. 2014. Vol. 33, № 6. P. 637-647.

106. Maksimenko O. et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin // Genome Res. 2015. Vol. 25, № 1. P. 89-99.

107. Wolle D. et al. Functional Requirements for Fab-7 Boundary Activity in the Bithorax Complex // Mol. Cell. Biol. 2015. Vol. 35, № 21. P. 3739-3752.

108. Dorn R., Reuter G., Loewendorf A. Transgene analysis proves mRNA trans-splicing at the complex mod(mdg4) locus in Drosophila // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2001. Vol. 98, № 17. P. 9724-9729.

109. Van Bortle K. et al. Drosophila CTCF tandemly aligns with other insulator proteins at the borders of H3K27me3 domains // Genome Res. 2012. Vol. 22, № 11. P. 2176-2187.

110. Aoki T. et al. Elba, a novel developmentally regulated chromatin boundary factor is a hetero-tripartite DNA binding complex // eLife. 2012. Vol. 1. P. e00171.

111. King M.R. et al. The RNA-binding protein Rumpelstiltskin antagonizes gypsy chromatin insulator function in a tissue-specific manner // J. Cell Sci. 2014. Vol. 127, № Pt 13. P. 29562966.

112. Herold M., Bartkuhn M., Renkawitz R. CTCF: insights into insulator function during development // Dev. Camb. Engl. 2012. Vol. 139, № 6. P. 1045-1057.

113. Muravyova E. et al. Loss of insulator activity by paired Su(Hw) chromatin insulators // Science. 2001. Vol. 291, № 5503. P. 495-498.

114. Cai H.N., Shen P. Effects of cis arrangement of chromatin insulators on enhancer-blocking activity // Science. 2001. Vol. 291, № 5503. P. 493-495.

115. Kyrchanova O. et al. Orientation-dependent interaction between Drosophila insulators is a property of this class of regulatory elements // Nucleic Acids Res. 2008. Vol. 36, № 22. P. 70197028.

116. Fujioka M. et al. Determinants of Chromosome Architecture: Insulator Pairing in cis and in trans // PLoS Genet. 2016. Vol. 12, № 2. P. e1005889.

117. Schwartz Y.B. et al. Nature and function of insulator protein binding sites in the Drosophila genome // Genome Res. 2012. Vol. 22, № 11. P. 2188-2198.

118. Golovnin A. et al. Integrity of the Mod(mdg4)-67.2 BTB domain is critical to insulator function in Drosophila melanogaster // Mol. Cell. Biol. 2007. Vol. 27, № 3. P. 963-974.

119. Bonchuk A. et al. Drosophila BTB/POZ domains of "ttk group" can form multimers and selectively interact with each other // J. Mol. Biol. 2011. Vol. 412, № 3. P. 423-436.

120. Bonchuk A. et al. Functional role of dimerization and CP190 interacting domains of CTCF protein in Drosophila melanogaster // BMC Biol. 2015. Vol. 13. P. 63.

121. Zolotarev N. et al. Architectural proteins Pita, Zw5,and ZIPIC contain homodimerization domain and support specific long-range interactions in Drosophila // Nucleic Acids Res. 2016. Vol. 44, № 15. P. 7228-7241.

122. Struhl G., Akam M. Altered distributions of Ultrabithorax transcripts in extra sex combs mutant embryos of Drosophila // EMBO J. 1985. Vol. 4, № 12. P. 3259-3264.

123. Ingham P.W. Differential expression of bithorax complex genes in the absence of the extra sex combs and trithorax genes // Nature. 1983. Vol. 306, № 5943. P. 591-593.

124. Busturia A., Bienz M. Silencers in abdominal-B, a homeotic Drosophila gene // EMBO J. 1993. Vol. 12, № 4. P. 1415-1425.

125. Pirrotta V., Rastelli L. White gene expression, repressive chromatin domains and homeotic gene regulation in Drosophila // BioEssays News Rev. Mol. Cell. Dev. Biol. 1994. Vol. 16, № 8. P. 549-556.

126. Klymenko T. et al. A Polycomb group protein complex with sequence-specific DNA-binding and selective methyl-lysine-binding activities // Genes Dev. 2006. Vol. 20, № 9. P. 1110-1122.

127. Franke A. et al. Polycomb and polyhomeotic are constituents of a multimeric protein complex in chromatin of Drosophila melanogaster // EMBO J. 1992. Vol. 11, № 8. P. 2941-2950.

128. Alkema M.J. et al. Identification of Bmi1-interacting proteins as constituents of a multimeric mammalian polycomb complex // Genes Dev. 1997. Vol. 11, № 2. P. 226-240.

129. Shao Z. et al. Stabilization of chromatin structure by PRC1, a Polycomb complex // Cell. 1999. Vol. 98, № 1. P. 37-46.

130. Wang H. et al. Role of histone H2A ubiquitination in Polycomb silencing // Nature. 2004. Vol. 431, № 7010. P. 873-878.

131. Cao R. et al. Role of histone H3 lysine 27 methylation in Polycomb-group silencing // Science. 2002. Vol. 298, № 5595. P. 1039-1043.

132. Fischle W. et al. Molecular basis for the discrimination of repressive methyl-lysine marks in histone H3 by Polycomb and HP1 chromodomains // Genes Dev. 2003. Vol. 17, № 15. P. 18701881.

133. Boyer L.A. et al. Polycomb complexes repress developmental regulators in murine embryonic stem cells // Nature. 2006. Vol. 441, № 7091. P. 349-353.

134. Piunti A., Shilatifard A. Epigenetic balance of gene expression by Polycomb and COMPASS families // Science. 2016. Vol. 352, № 6290. P. aad9780.

135. Loubiere V. et al. Coordinate redeployment of PRC1 proteins suppresses tumor formation during Drosophila development // Nat. Genet. 2016. Vol. 48, № 11. P. 1436-1442.

136. Grimaud C. et al. RNAi components are required for nuclear clustering of Polycomb group response elements // Cell. 2006. Vol. 124, № 5. P. 957-971.

137. Li H.-B. et al. Insulators target active genes to transcription factories and polycomb-repressed genes to polycomb bodies // PLoS Genet. 2013. Vol. 9, № 4. P. e1003436.

138. Bantignies F. et al. Polycomb-dependent regulatory contacts between distant Hox loci in Drosophila // Cell. 2011. Vol. 144, № 2. P. 214-226.

139. Schoenfelder S. et al. Polycomb repressive complex PRC1 spatially constrains the mouse embryonic stem cell genome // Nat. Genet. 2015. Vol. 47, № 10. P. 1179-1186.

140. Isono K. et al. SAM domain polymerization links subnuclear clustering of PRC1 to gene silencing // Dev. Cell. 2013. Vol. 26, № 6. P. 565-577.

141. Lewis E.B. A gene complex controlling segmentation in Drosophila // Nature. 1978. Vol. 276, № 5688. P. 565-570.

142. Sánchez-Herrero E. et al. Genetic organization of Drosophila bithorax complex // Nature. 1985. Vol. 313, № 5998. P. 108-113.

143. Maeda R.K., Karch F. The ABC of the BX-C: the bithorax complex explained // Dev. Camb. Engl. 2006. Vol. 133, № 8. P. 1413-1422.

144. Martin C.H. et al. Complete sequence of the bithorax complex of Drosophila // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1995. Vol. 92, № 18. P. 8398-8402.

145. Martinez-Arias A., Lawrence P.A. Parasegments and compartments in the Drosophila embryo // Nature. 1985. Vol. 313, № 6004. P. 639-642.

146. Kyrchanova O. et al. The boundary paradox in the Bithorax complex // Mech. Dev. 2015. Vol. 138 Pt 2. P. 122-132.

147. Pankratz M.J., Jäckle H. Making stripes in the Drosophila embryo // Trends Genet. TIG. 1990. Vol. 6, № 9. P. 287-292.

148. Small S., Levine M. The initiation of pair-rule stripes in the Drosophila blastoderm // Curr. Opin. Genet. Dev. 1991. Vol. 1, № 2. P. 255-260.

149. Maeda R.K., Karch F. The bithorax complex of Drosophila an exceptional Hox cluster // Curr. Top. Dev. Biol. 2009. Vol. 88. P. 1-33.

150. Qian S., Capovilla M., Pirrotta V. The bx region enhancer, a distant cis-control element of the Drosophila Ubx gene and its regulation by hunchback and other segmentation genes // EMBO J. 1991. Vol. 10, № 6. P. 1415-1425.

151. Starr M.O. et al. Molecular dissection of cis-regulatory modules at the Drosophila bithorax complex reveals critical transcription factor signature motifs // Dev. Biol. 2011. Vol. 359, № 2. P. 290-302.

152. Iampietro C. et al. Initiator elements function to determine the activity state of BX-C enhancers // PLoS Genet. 2010. Vol. 6, № 12. P. e1001260.

153. Maeda R.K., Karch F. Gene expression in time and space: additive vs hierarchical organization of cis-regulatory regions // Curr. Opin. Genet. Dev. 2011. Vol. 21, № 2. P. 187193.

154. Schwartz Y.B., Pirrotta V. Polycomb complexes and epigenetic states // Curr. Opin. Cell Biol. 2008. Vol. 20, № 3. P. 266-273.

155. Müller J., Kassis J.A. Polycomb response elements and targeting of Polycomb group proteins in Drosophila // Curr. Opin. Genet. Dev. 2006. Vol. 16, № 5. P. 476-484.

156. Pirrotta V. et al. Distinct parasegmental and imaginal enhancers and the establishment of the expression pattern of the Ubx gene // Genetics. 1995. Vol. 141, № 4. P. 1439-1450.

157. O'Kane C.J., Gehring W.J. Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1987. Vol. 84, № 24. P. 9123-9127.

158. Bender W., Hudson A. P element homing to the Drosophila bithorax complex // Dev. Camb. Engl. 2000. Vol. 127, № 18. P. 3981-3992.

159. White R.A.H., Akam M.E. Contrabithorax mutations cause inappropriate expression of Ultrabithorax products in Drosophila // Nature. 1985. Vol. 318, № 6046. P. 567.

160. Karch F. et al. The abdominal region of the bithorax complex // Cell. 1985. Vol. 43, № 1. P. 81-96.

161. Gyurkovics H. et al. A new homeotic mutation in the Drosophila bithorax complex removes a boundary separating two domains of regulation // EMBO J. 1990. Vol. 9, № 8. P. 2579-2585.

162. Barges S. et al. The Fab-8 boundary defines the distal limit of the bithorax complex iab-7 domain and insulates iab-7 from initiation elements and a PRE in the adjacent iab-8 domain // Dev. Camb. Engl. 2000. Vol. 127, № 4. P. 779-790.

163. Bender W., Lucas M. The border between the ultrabithorax and abdominal-A regulatory domains in the Drosophila bithorax complex // Genetics. 2013. Vol. 193, № 4. P. 1135-1147.

164. Holohan E.E. et al. CTCF genomic binding sites in Drosophila and the organisation of the bithorax complex // PLoS Genet. 2007. Vol. 3, № 7. P. e112.

165. Kyrchanova O. et al. Architectural protein Pita cooperates with dCTCF in organization of functional boundaries in Bithorax complex // Dev. Camb. Engl. 2017. Vol. 144, № 14. P. 26632672.

166. Zhou J. et al. The Fab-7 element of the bithorax complex attenuates enhancer-promoter interactions in the Drosophila embryo // Genes Dev. 1996. Vol. 10, № 24. P. 3195-3201.

167. Gruzdeva N. et al. The Mcp element from the bithorax complex contains an insulator that is capable of pairwise interactions and can facilitate enhancer-promoter communication // Mol. Cell. Biol. 2005. Vol. 25, № 9. P. 3682-3689.

168. Peifer M., Karch F., Bender W. The bithorax complex: control of segmental identity // Genes Dev. 1987. Vol. 1, № 9. P. 891-898.

169. Mihaly J. et al. Dissecting the regulatory landscape of the Abd-B gene of the bithorax complex // Dev. Camb. Engl. 2006. Vol. 133, № 15. P. 2983-2993.

170. Chen Q. et al. Multiple Promoter Targeting Sequences exist in Abdominal-B to regulate longrange gene activation // Dev. Biol. 2005. Vol. 286, № 2. P. 629-636.

171. Akbari O.S. et al. A novel promoter-tethering element regulates enhancer-driven gene expression at the bithorax complex in the Drosophila embryo // Dev. Camb. Engl. 2008. Vol. 135, № 1. P. 123-131.

172. Hogga I. et al. Replacement of Fab-7 by the gypsy or scs insulator disrupts long-distance regulatory interactions in the Abd-B gene of the bithorax complex // Mol. Cell. 2001. Vol. 8, № 5. P. 1145-1151.

173. Maksimenko O., Golovnin A., Georgiev P. Enhancer-promoter communication is regulated by insulator pairing in a Drosophila model bigenic locus // Mol. Cell. Biol. 2008. Vol. 28, № 17. P.5469-5477.

174. Kyrchanova O. et al. Selective interactions of boundaries with upstream region of Abd-B promoter in Drosophila bithorax complex and role of dCTCF in this process // Nucleic Acids Res. 2011. Vol. 39, № 8. P. 3042-3052.

175. Kyrchanova O. et al. Functional interaction between the Fab-7 and Fab-8 boundaries and the upstream promoter region in the Drosophila Abd-B gene // Mol. Cell. Biol. 2008. Vol. 28, № 12. P. 4188-4195.

176. Kyrchanova O.V., Georgiev P.G. [The bithorax Complex of Drosophila melanogaster as a Model for Studying Specific Long-Distance Interactions between Enhancers and Promoters] // Genetika. 2015. Vol. 51, № 5. P. 529-538.

177. Galloni M. et al. The bluetail transposon: evidence for independent cis-regulatory domains and domain boundaries in the bithorax complex // EMBO J. 1993. Vol. 12, № 3. P. 1087-1097.

178. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. Fab-7 functions as a chromatin domain boundary to ensure proper segment specification by the Drosophila bithorax complex // Genes Dev. 1996. Vol. 10, № 24. P. 3202-3215.

179. Hagstrom K., Muller M., Schedl P. A Polycomb and GAGA dependent silencer adjoins the Fab-7 boundary in the Drosophila bithorax complex // Genetics. 1997. Vol. 146, № 4. P. 13651380.

180. Kyrchanova O. et al. Functional Dissection of the Blocking and Bypass Activities of the Fab-8 Boundary in the Drosophila Bithorax Complex // PLoS Genet. 2016. Vol. 12, № 7. P. e1006188.

181. Kaye E.G. et al. Drosophila Dosage Compensation Loci Associate with a Boundary-Forming Insulator Complex // Mol. Cell. Biol. 2017. Vol. 37, № 21. P. e00253-17.

182. Cleard F. et al. Different Evolutionary Strategies To Conserve Chromatin Boundary Function in the Bithorax Complex // Genetics. 2017. Vol. 205, № 2. P. 589-603.

183. Aoki T et. al. A stage-specific factor confers Fab-7 boundary activity during early embryogenesis in Drosophila // Mol Cell Biol. 2008. Vol.28, №3.P:1047-1060.