Значение ДНК-связывающего транскрипционного фактора Opbp в регуляции работы TRF2-зависимых промоторов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.07, кандидат наук Осадчий Игорь Сергеевич

• Осадчий Игорь Сергеевич
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Осадчий Игорь Сергеевич

Список сокращений

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цель и задачи исследования

Научная новизна и практическая значимость работы

Методология и методы исследования

Положения, выносимые на защиту

Степень достоверности и апробация результатов

Публикации

Тезисы конференций

Личное участие автора в проведении исследований

Структура и объем работы

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Инициация транскрипции

1.2. Эволюция механизма инициации транскрипции

1.2.1. Инициация транскрипции у бактерий

1.2.2. Инициация транскрипции у архей

1.3. Особенности инициации транскрипции у эукариот

1.4. Специфичность связывания TBP с TATA-боксом

1.5. SAGA или TFIID?

1.6. Паралоги TBP в геноме

1.7. Промоторы

1.7.1. Коровый промотор

1.8. Комплексы ремоделирования хроматина

1.9. Транскрипционные факторы

1.9.1. ДНК-связывающий домен типа «цинковый палец» C2H2-ram

1.10. Архитектура хроматина

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Общие методы работы с ДНК

2.1.1. Приготовление компетентных клеток E. Coli, штамм DH5a

2.1.2. Трансформация клеток DH5a

2.1.3. Выделение плазмидной ДНК из большого объёма бактерий (50 мл)

2.1.4. Получение плазмидных векторов

2.1.5. Препаративная рестрикция ДНК

2.1.6. Лигирование ДНК

2.2. Дрожжевая двугибридная система (ДДС)

2.2.1. Принцип создания делеционных производных для ДДС

2.3. Иммунопреципитация хроматина с последующим секвенированием (ChIP-seq)56

2.3.1. Получение хроматина для иммунопреципитации

2.3.2. Анализ данных ChIP-seq

2.4. Наработка и выделение рекомбинантных белков из E. Coli

2.5. Глютаральдегидная сшивка

2.6. Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле при денатурирующих условиях (SDS-PAGE)

2.7. Метод смещения электрофоретической подвижности ДНК в геле (EMSA)

2.8. Визуализация белков в акриламидном геле с помощью Coomassie Blue R250

2.9. Визуализация белков в акриламидном геле с помощью окрашивания серебром

2.10. Визуализация белков методом Вестерн-блот

2.11. Коиммунопреципитация (CoIP)

2.12. Получение антител

2.13. Получение линий мух с заменой гена на последовательность для сайт-специфической рекомбинации

2.14. Получение конструкций для сайт-специфической интеграции в геном

3. РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. Дополнительный N-концевой домен длинной изоформы TRF2 является эволюционно новым доменом, состоящим из повторов

3.2. Экспрессия длинной изоформы trf2 p175 более эффективно восстанавливает функции удаленного trf2 гена, чем экспрессия короткой изоформы trf2 p75

3.3. Участок в составе N-концевого домена длинной изоформы и общий для обеих изоформ C-концевой домен способны взаимодействовать с ДНК-связывающими белками в ДДС

3.4. Терминальная часть C-концевого домена консервативна среди насекомых

3.5. Opbp как модельный белок для изучения TRF2-зависимых промоторов

3.6. Доменная организация белка Opbp

3.7. Картирование участков взаимодействий Opbp, CP190, Pzg и TRF2

3.8. Делеция гена Opbp летальна

3.9. Эффекты делеций взаимодействующих с CP190 и Pzg участков Opbp

3.10. Opbp связывает небольшое число сайтов в геноме

3.11. Определение специфичного ДНК-мотива, связываемого Opbp

3.12. Opbp колокализуется с CP190/Pzg/TRF2 на промоторах генов рибосомальных белков

3.13. Opbp напрямую регулирует экспрессию рибосомальных белков in vivo

3.14. Opbp содержит димеризационный домен

3.15. Эффект делетирования димеризующегося участка Opbp

3.16. Мотивы для связывания Opbp способны опосредовать дистанционные взаимодействия

3.17. Мотивы для связывания Opbp обладают энхансер-блокирующей активностью

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

Список сокращений

TRF2 - TBP-related factor 2, паралог TATA-связывающего белка (TBP)

GTF - General Transcription Factors, общие факторы для инициации транскрипции ДНК-

зависимых РНК-полимераз

ПИК - преинициаторный комплекс, комплекс GTF и РНК-пол на промоторной области гена

TSS - Transcriptional Start Site (сайт начала транскрипции) ТФ - транскрипционный фактор

piPHK - Piwi-interacting РНК, короткие РНК, взаимодействующие с белком Piwi мРНК - матричная РНК мяРНК - малые ядерные РНК

ZnF - Zinc finger, ДНК-связывающий домен типа «цинковый палец»

ZAD - Zinc finger associated domain - Домен, ассоциированный с цинковыми

Пальцами

3С-методы - метод фиксации топологии хроматина (Chromosome Conformation Capture) и его модификации 4C, Hi-C и другие

ТАДы - Топологически ассоциированные домены хроматина наблюдаемые при использовании 3С-методов

ChIP - Chromatin ImmunoPrecipitaion - метод иммунопреципитации хроматина ChIP-seq - ChIP-sequencing - метод иммунопреципитации хроматина с последующим выскопроизводительным секвенированием ChIP-qPCR - метод иммунопреципитации хроматина с последующей количественной ПЦР

EMSA - Electrophoretic mobility shift assay - Метод торможения в геле ДНК-белковых комплексов

6xHis - участок для аффинной очистки, состоящий из 6 остатков гистидина

3xFLAG - 3 повтора октопептида FLAG, используемые как эпитоп для распознавания

высокоаффинными моноклональными a-FLAG антителами (белковый таг)

GST - глутатион^-трансфераза

MBP - мальтозасвязывающий белок

ПЦР - полимеразная цепная реакция

кПЦР - количественная ПЦР

FDR - False discovery rate

IgG - преиммунная сыворотка

мМ - миллимоль

нг - нанограмм

мг - миллиграмм

п.н. - пара нуклеотидов

т. п. н. - тысяча пар нуклеотидов

млн. п. н. - миллион пар нуклеотидов

а. о. - аминокислотный остаток

ИП - ингибиторы протеаз

DTT - Dithiothreitol (Дитиотреитол)

wt - интактная последовательность или линия (дикий тип)

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Значение ДНК-связывающего транскрипционного фактора Opbp в регуляции работы TRF2-зависимых промоторов»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы

Инициация транскрипции является важнейшим этапом реализации генетической информации. В настоящее время наиболее изученной является инициация транскрипции с промоторов, содержащих TATA-бокс. Инициация транскрипции на таких промоторах начинается с распознавания и связывания TBP (TATA-binding protein) непосредственно с данной последовательностью в коровой части промотора. Однако последовательности TATA-бокса обнаруживаются лишь в незначительной части эукариотических промоторов [1,2]. Кроме того, известны такие процессы как двунаправленная транскрипция piPHK, осуществляемая с зарепрессированного piwi-локуса, не содержащего какие-либо известные ДНК-мотивы коровых промоторов [3]. Наличие транскрипции в таких случаях предполагает существование инициации транскрипции, не связанной напрямую с набором коровых элементов, при которой TFIID или аналогичный комплекс привлекается на ДНК опосредованно, взаимодействуя с ДНК-связывающими белками. Достаточно рано в процессе эволюции произошла дупликация гена, кодирующего ТВР, в результате которой возник паралог TRF2 (TBP-related factor 2), потерявший специфичную ДНК-связывающую активность, но способный, замещая TBP, формировать комплексы, альтернативные TFIID [4]. Показано, что инициация транскрипции с большинства промоторов генов домашнего хозяйства D. melanogaster и некоторой части тканеспецифичных промоторов опосредуется белком TRF2 [5,6]. Однако в настоящее время остаётся плохо изученным механизм рекрутирования TRF2 на промоторы, состав преинициаторного комплекса и функциональное различие разных изоформ TRF2. Для построения модели рекрутирования TRF2 на промоторы, нами был выбран, обнаруженный в ходе скрининга потенциальных рекрутеров TRF2 на промоторы генов, белок Opbp (Optix binding protein). Opbp взаимодействует с CP190, Pzg, TRF2, и имеет небольшое число сайтов связывания в геноме (около 30), большинство из которых находится в промоторах генов рибосомальных белков. Нарушение взаимодействий с CP190 и Pzg, белками, ассоциированнами с большинством промоторов генов «домашнего хозяйства», или делеция гена Opbp

летальна; при этом другие нарушения функции Opbp проявляются визуально хорошо различимым bobbed-фенотипом, ассоциированным с нарушением процесса трансляции мРНК. Данные обстоятельства делают его удобным модельным рекрутером. Изучение альтернативных путей инициации и поддержания транскрипции позволит расширить понимание устройства промоторов эукариот, что, в свою очередь, имеет большое фундаментальное и прикладное значение.

Цель и задачи исследования

Основной целью настоящей работы явилось изучение роли ДНК-связывающих белков в процессах организации ТКР2-зависимых промоторов генов.

В ходе выполнения работы были поставлены следующие задачи:

1. Провести анализ структурно-функциональных особенностей длинной и короткой изоформ белка TRF2. Осуществить поиск ДНК-связывающих белков, потенциально способных привлекать TRF2 на промоторы генов, и определить необходимые для взаимодействия с ними участки.

2. Из выявленных потенциальных рекрутеров выбрать и охарактеризовать модельный белок, взаимодействующий также с белками СР190 и Pzg - компонентами ТЯР2-комплекса и кофакторами архитектурных белков хроматина. Определить геномные сайты связывания модельного белка в эмбрионах дрозофилы.

3. Картировать домены в составе модельного белка, необходимые для взаимодействия с белками CP190 и Pzg, определить роль этих доменов в регуляции активности генов.

4. Исследовать модельный белок на наличие N-концевого домена, способного к гомодимеризации, что является характерной чертой архитектурных белков хроматина.

5. Исследовать на модельных системах in vivo способность искусственных мультиплицированных сайтов связывания модельного белка поддерживать дистанционные взаимодействия и функционировать как инсулятор.

Научная новизна и практическая значимость работы

В настоящей работе представлено исследование белка Opbp - нового, обнаруженного нами рекрутера базального фактора транскрипции TRF2 на промоторы генов. Opbp является представителем многочисленного и слабо изученного семейства транскрипционных факторов эукариот, проявляет свойства архитектурного белка хроматина и опосредует формирование TRF2-зависимого преинициаторного комплекса на небольшом количестве промоторов генов рибосомальных белков. Достаточно полно описаны и изучены строение и функциональная значимость доменов Opbp. Найден новый димеризационный домен и продемонстрирован эффект его удаления. Определены участки взаимодействий с кофактором архитектурных белков CP 190, и с Pzg, компонентом TRF2-содержащего преинициаторного комплекса. Определён ДНК-мотив и промоторы, регулируемые Opbp. Показана in vivo необходимость кофактора CP190 для осуществления экспрессии генов рибосомальных белков.

В настоящей работе также представлен и успешно проверен экспериментальный подход, являющийся комбинацией методов in silico и ДДС, позволяющий осуществлять рациональное разделение неизвестной по вторичной/ третичной структуре аминокислотной последовательности на структурно-функционально значимые участки (домены). Данный подход может быть широко востребован в дальнейших исследованиях в виду отсутствия структурных данных для подавляющего числа эукариотических белков и неструктурированностью участков вовлечённых в белок-белковые взаимодействия.

Изучение феномена функциональной специализации систем инициации транскрипции и процесса рекрутирования ключевого компонента одной из таких систем - TRF2 - может стать основой для создания гетерологичных систем транскрипции для экспрессии белков, востребованных в биотехнологии или медицине, так как в такой системе будет исключена конкуренция с другими промоторами за компоненты преинициаторного комплекса.

Методология и методы исследования

Работа выполнена с использованием современного оборудования и методов молекулярной биологии и генетики (выделение ДНК, молекулярное клонирование, ПЦР, получение трансгенных линий D. melanogaster путём направленного редактирования генома (CRISPR/Cas9), иммунопреципитация хроматина, анализ белок-белковых взаимодействий), а также биоинформатики (первичный анализ последовательностей, планирование, обработка данных).

Положения, выносимые на защиту

1. Показано, что короткая и длинная изоформы белка TRF2 функционально эквивалентны. Обнаружены необходимые для установления взаимодействий с ДНК-связывающими белками участки - общий для обеих изоформ C-концевой участок и участок в составе длинной изоформы TRF2. Выявлено около 50 новых потенциальных рекрутеров TRF2 на промоторы генов.

2. Исследован новый ДНК-связывающий рекрутер TRF2 - белок Opbp, который специфично связывается с протяжённым, ранее не охарактеризованным и редко встречающимся в геноме ДНК-мотивом in vitro и in vivo. Для белка Opbp найдено около 30 сайтов связывания в эмбрионах дрозофилы в промоторах генов домашнего хозяйства в непосредственной близости от точки начала транскрипции. Среди таких генов значительная часть кодирует белковые компоненты рибосом, и на их промоторах Opbp колокализуется c белками CP190, Pzg и TRF2.

3. Идентифицированы N-концевой и C-концевой домены в составе белка Opbp, взаимодействующие одновременно с белками СР190 и Pzg - компонентами TRF2-комплекса, определяющего функциональную активность большой группы промоторов генов домашнего хозяйства. Фенотипически делеция данных доменов in vivo проявляется как делеция всего гена.

4. В составе N-концевой части Opbp картирован способный к гомодимеризации домен; подобные домены являются характерным свойством архитектурных белков. Фенотипически делеция данного домена in vivo проявляется как генокопия слабых мутаций генов компонентов рибосом.

5. В модельных трансгенных линиях показано, что Opbp обладает свойствами архитектурных белков - искусственные сайты связывания для белка Opbp могут выполнять функцию инсулятора и поддерживать дистанционные взаимодействия.

Степень достоверности и апробация результатов

По результатам диссертационной работы было опубликовано 2 статьи в рецензируемых научных журналах и сделано 5 докладов на научных конференциях.

Публикации

1. Zolotarev N., Maksimenko O., Kyrchanova O., Sokolinskaya E., Osadchiy I., Girardot C., Bonchuk A., Ciglar L., Furlong E. E. M., Georgiev P. Opbp Is a New Architectural/Insulator Protein Required for Ribosomal Gene Expression. // Nucleic Acids Research 45(21):12285-12300, 2017.

2. Осадчий И. С., Георгиев П. Г., Максименко О. Г. Сравнение функциональной роли короткой и длинной изоформ белка TRF2 у Drosophila melanogaster. // Доклады Академии Наук, Том 486, № 4 (2019), с. 514-518.

Тезисы конференций

1. Осадчий И. С., Максименко О. Г., Георгиев П. Г. Белки D. Melanogaster, участвующие в привлечении фактора TRF2 на промоторы генов. // VII Международная школа молодых учёных по молекулярной генетике «Геномика и биология живых систем», Звенигород, Россия, 2016, с. 47.

2. Осадчий И. С., Максименко О. Г., Георгиев П. Г. Изучение рекрутирования TRF2 на промоторы генов. // Международная конференция «Хромосома 2018», Новосибирск, Россия, 2018, с. 151.

3. Осадчий И. С., Золотарев Н. А., Максименко О. Г., Георгиев П. Г. Изучение сборки транскрипционного комплекса на промоторах генов рибосомальных белков. // Международный конгресс «CRISPR-2018», Новосибирск, Россия, 2018, с. 80.

4. Zolotarev N., Maksimenko O., Kyrchanova O., Osadchiy I., Furlong E.E.M., Georgiev P. Transcription complex assembly at the promoters of ribosomal protein genes. // 43th FEBS Congress, Prague, Czech Republic, FEBS Open Bio 8 (Suppl. S1) (2018) 91-103, c. 99

5. Osadchiy I., Maksimenko O., Georgiev P. Opbp is a new architectural protein involved in organization of the housekeeping TRF2 dependent promoters in Drosophila melanogaster. // 44th FEBS Congress, Krakow, Poland, 2019, FEBS Open Bio 9 (Suppl. 1) (2019) 65-431, с. 147

Личное участие автора в проведении исследований

Большая часть представленных результатов была получена автором самостоятельно, либо при непосредственном участии автора. Лично автором были созданы плазмидные конструкции для тестирования делеционных производных белков в ДДС и значительная часть конструкций для получения трансгенных линий мух. Соответственно этому, автором был осуществлён скрининг в ДДС и получено большинство линий. Иммунопреципитация хроматина осуществлялась совместно с Н. А. Золотарёвым, анализ белок-белковых взаимодействий in vitro совместно с А. Н. Бончуком, получение и анализ линий, содержащих модельную систему для анализа инсуляторной активности, совместно с О. В. Кырчановой. Автор непосредственно участвовал в обсуждении, интерпретации результатов и подготовке публикаций. Другие соавторы указаны в соответствующих опубликованных работах.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, трёх глав («Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты»), заключения, выводов и приложения. Работа изложена на 130 страницах, содержит 47 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 177 источников.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Транскрипция - это катализируемый РНК-полимеразой синтез молекулы РНК на матрице ДНК, являющийся ключевым этапом в реализации генетической информации. Процесс транскрипции подразделяют на инициацию, элонгацию и терминацию. Для осуществления инициации транскрипции у эукариот и архей необходима сборка с 5-конца от транскрибируемой последовательности преинициаторного комплекса, который, в свою очередь, осуществляет позиционирование РНК-полимеразы, плавление ДНК и переход РНК-полимеразы в активное элонгирующее состояние.

1.1. Инициация транскрипции

Первые эксперименты по проведению транскрипции in vitro показали, что очищенная РНК-полимераза эукариот не способна осуществлять синтез РНК с ДНК-матрицы сама по себе, что повлекло за собой поиск дополнительных белковых факторов - участников данного процесса. Вскоре такие факторы были обнаружены исследователями при хроматографическом фракционировании клеточных экстрактов из различных организмов. Оказалось, что экстракты, полученные из клеток эволюционно отдалённых видов, в том числе человека, крысы, плодовой мушки, дрожжей, содержали сходный набор консервативных белков, способных инициировать синтез РНК, получивших название общих факторов транскрипции (General Transcription Factors или GTF) [7].

В отличие от бактерий и архей, у которых имеется всего одна мультисубъединичная ДНК-зависимая РНК-полимераза (РНК-пол), в ходе эволюции у эукариот возникло три типа РНК-полимераз, каждый из которых приобрёл специализацию в транскрипции определённого функционального класса последовательностей, что подразумевает различия в факторах, необходимых для её инициации. РНК-пол I транскрибирует 47S предшественника входящих в состав рибосомы РНК (рРНК), который далее процессируется в 28S, 18S и 5,8S рРНК; транскрипция 47S рРНК составляет около 60% транскрипционной активности клетки [8]. РНК-пол II синтезирует предшественников матричных РНК для синтеза белка, а

также большинство некодирующих РНК (таких как малые ядерные РНК (ядрышковые, микроРНК, piРНК, РНК сплайсосомы) и длинные некодирующие РНК) [9]. РНК-пол III осуществляет транскрипцию транспортных РНК, 5S рРНК, 5и РНК сплайсосомы и некоторых других малых ядерных РНК [10]. Все эукариотические полимеразы имеют общность происхождения, что отражается в консервативности их основных структурных и функциональных элементов; при этом структура РНК-пол II имеет наибольшую схожесть с РНК-полимеразой архей и бактерий [4]. Вследствие этого, и вовлечённости в транскрипцию белок-кодирующих генов, инициация транскрипции и необходимые для этого GTF наиболее хорошо охарактеризованы для РНК-пол II-зависимой транскрипции. Описанные общие факторы транскрипции для РНК-пол II были названы TFПA, TFIЮ, TFIГО, TFПE, TFПF и TFIШ в соответствии с хроматографическими профилями элюции и порядку их обнаружения [7], а комплекс, образуемый ими вместе с РНК-пол II в 5-области выше транскрибируемой последовательности (промотором) - преинициаторный комплекс (ПИК).

Дальнейшие исследования [11] позволили определить, что образование ПИК на близлежащей к месту инициации транскрипции части промотора (коровом промоторе) осуществляется последовательно: TFIID связывается с ДНК, привлекает TFIIA, а также ДНК-связывающий TFIIB; образовавшийся на коровом промоторе комплекс TFIIA-TFIID-TFIIB привлекает и стабилизирует комплекс TFIIF и РНК-пол II, формируя закрытый комплекс - набор GTF и РНК-пол II, внутри главного канала которой находится нерасплетённый двухцепочечный участок ДНК. Для дальнейшей инициации транскрипции необходима ассоциация TFIIE и TFIIH, приводящая к образованию открытого комплекса, способного к определению сайта начала транскрипции, эффективному плавлению ДНК, и запуску синтеза РНК, который, однако, носит нестабильный характер (абортивная транскрипция) [12]. Переход транскрипции, осуществляемой РНК-пол II, в активное элонгирующее состояние является высоко регулируемым процессом и зависит от множества факторов, так как транскрипция белок-кодирующих генов сопряжена с процессами созревания РНК, такими как 5'-кэпирование, сплайсинг, а также от взаимодействия ПИК с регуляторными факторами, определяющими количественные и пространственно-временные параметры экспрессии гена. В общем случае элонгация транскрипции сопровождается диссоциацией TFIIB из

открытого комплекса, что приводит к его дестабилизации, диссоциацией TFПE и связывания занимаемого им участка на РНК-пол II с фактором элонгации Spt4-Spt5, который замыкает главный канал коровой части РНК-пол II, физически препятствуя диссоциации РНК-пол II с транскрибируемой ДНК [13].

1.2. Эволюция механизма инициации транскрипции

Несмотря на установление общих факторов, необходимых для инициации транскрипции, точное назначение, состав, структура и порядок сборки на промоторе GTF, некоторые из которых содержат более 10 субъединиц, остаются не до конца выясненными. TFПB, ТВР (главная субъединица TFIГО) и их паралоги являются наиболее изученными факторами, способными связывать ДНК (с разной аффинностью в зависимости от наличия специфических последовательностей и дополнительных факторов, стабилизирующих их на промоторе), рекрутировать РНК-пол II и осуществлять дальнейшую сборку ПИК. Эксперименты по привлечению главных субъединиц TFIID или TFIIB на промоторную область гена в составе химерных белков с ДНК-связывающими доменами также приводят к образованию ПИК [14,15], подтверждая их центральную роль в этом процессе. Развитие методов структурного анализа, а также накопление данных по инициации транскрипции у трёх групп живых организмов - бактерий, архей и эукариот - позволяет проследить постепенное усложнение необходимых для этого факторов в ходе эволюции и их соотношения при формировании ПИК.

1.2.1. Инициация транскрипции у бактерий

Специфическое связывание РНК-пол с промоторами и инициация транскрипции у бактерий зависит, главным образом, от образования холофермента РНК-пол с одним из а-факторов; так, большинство конститутивно работающих промоторов у Е. со\1 узнаются холоферментом, в состав которого входит фактор а70 [16]. В составе холофермента фактор а70 распознаёт и связывает фиксировано расположенные относительно друг друга последовательности промотора «-10» (ТАТААТ) и «-35» (TTGACA) выше точки начала транскрипции с помощью структурных доменов а2 и а4,

позиционируя таким образом полимеразу. Он также участвует в изомеризации холофермента (ведущему к плавлению ДНК) и его переходу в открытый комплекс, который далее, после образования коротких транскриптов, может перейти в элонгирующее состояние. Регуляция экспрессии генов в зависимости от условий окружающей среды и физиологического состояния, достигается за счёт ряда альтернативных а-факторов, ряда белков-репрессоров, активаторов и других механизмов. Принцип работы активаторов построен на компенсировании дефектов промоторных последовательностей - ДНК-связывающие белки могут связываться выше корового промотора и, взаимодействуя с РНК-пол/а-холоферментом, стабилизировать его на промоторе в случае отличия от консенсуса коровых элементов, или, в случае неправильного расстояния между -35 и -10 элементами, связывать и сгибать ДНК между ними, нивелируя стерические ограничения для связывания этих элементов а-фактором [17]. Механизм работы репрессоров заключается в зависимом от стимула блокировании промотора, транскрипционного активатора, а-фактора или участка РНК-пол, взаимодействующего с а-фактором.

1.2.2. Инициация транскрипции у архей

Археи являются прокариотическими организмами, однако сочетают в себе как черты бактерий, так и эукариот, занимая промежуточное положение с точки зрения организации базового транскрипционного аппарата. Согласно современным представлениям, эукариоты произошли от близкой к археям группы [18] и для инициации транскрипции у архей и эукариотической РНК-пол II необходим схожий минимальный набор GTF [19]. Возможно археи возникли как гипертермофилы, с чем связано появление у архей специализированных белков, связывающих и уменьшающих плавкость ДНК при высоких температурах и способствующих её компактизации -гистонов, Alba, Cren7 и других [20], однако в отличии от эукариотических гистонов, формирующих октамеры и, в зависимости от посттрансляционных модификаций и расположения, репрессирующих инициацию и элонгацию транскрипции, для гистонов архей, существующих в растворе в виде димеров и способных формировать полимеры

in vivo, не показано значительного влияния на инициацию транскрипции и связывание общих факторов транскрипции.

Инициация транскрипции у архей начинается со связывания TBP (TATA binding protein), гомолога главной субъединицы TFIID у эукариот, с последовательностью T-A-T-A-(A/T)-A-(A/T)-(A/G) (TATA-бокс) в коровой части промотора, и TFB, гомолога а-фактора бактерий и TFIIB-фактора эукариот, с последовательностями BRE (TFB responsible element) выше и ниже от ТАТА-бокса. Оба белка, взаимодействуя, стабилизируются на промоторе; показано, что в отличие от TBP эукариот, ассоциация TBP архей с ДНК носит транзиентный характер [21]. Далее, TFB рекрутирует РНК-пол в комплексе с TFE. У архей, в отличие от системы РНК-пол II эукариот, для плавления ДНК внутри ПИК не требуется АТФ [22]. Значение TFE недостаточно изучено, однако известно, что он способствует инициации транскрипции при более низких температурах и способен компенсировать дефекты структурных частей TFB необходимых для плавления ДНК [23]. В известных геномах архей не обнаруживается гомологов для TFIIA, TFIIF, TFIIH и TBP-ассоциированных факторов [22], в виду чего, TBP, TFB и TFE можно рассматривать как прототипический набор общих факторов для инициации транскрипции у эукариот [24].

TBP

TBP состоит из консервативной части, размером около 180 а.о., и слабо консервативных N- и C-концевых последовательностей, длина которых незначительна у архей. Консервативная часть представлена двумя TBP-доменами, образующими симметричную, седлообразную структуру, вогнутая часть которой сформирована Р-листом, составленным из 10-ти Р-тяжей, и участвует во взаимодействии с ДНК; внешняя поверхность этой структуры составлена из 4-х a-спиралей, и участвует во взаимодействии с белковыми факторами. Несмотря на консервативность этого домена между археями и эукариотами, его гомологов не обнаруживается у бактерий, однако подобные p/a-структуры, соответствующие единичному TBP-домену, представлены среди некоторых бактериальных нуклеаз (РНКаза HIII) и ДНК-гликозилаз (Рисунок 1).

Согласно современным представлениям ТВР возник в результате дупликации подобной структуры [25].

Рисунок 1. Структурная гомология единичного TBP-домена (обозначен синим) и бактериальных ДНК-гликозилазы (серый цвет) и РНКазы HIII (красный цвет). Из [25].

TBP с помощью набора гидрофобных аминокислот Р-листа связывает содержащую ТАТА-бокс малую бороздку ДНК, при этом два набора консервативных фенилаланинов вклиниваются между двумя цепями внутри сайта TATA, приводя к изгибу ДНК примерно на 90 градусов (Рисунок 2) [26]. Вследствие этого, после сборки ПИК, ДНК оборачивается вокруг РНК-пол, сближая точку начала транскрипции и активный центр. Транзиентность ассоциации TBP с ДНК возможно связана с более кислым аминокислотным составом по сравнению с эукариотическими гомологами [27]. Взаимодействие с TFB стабилизирует данный процесс и является необходимым для некоторых TBP архей [21].

от

Эй 2

Р1 Р2 П'

58

шз

159

58 Ш

56

94

а а

Н. Баржею М. тизси/иБ О. melanogaster Б. свгеуЫав А. МаНапа твр1 ¡.оШагсИаеМе эр. сс14_75 твр2 ¡.окюгснаеоге эр. 6с14_75 твр1 Р. /игюзиэ М. /аппахЬП Т. Тепах 5. $о1/ыапси$ $. асИосаМапиБ

136

173

61

19

32 |—Г~

12

Р2'

339

316

353

240

200

и

215 227

197

1

184 191

е

183

1

е

е

е

Б

1М-конец

С-конец

В

1\1-конец

С-конец

186 203

189 198

Г

189 197

Рисунок 2. Структурная консервативность ТВР. A Сравнение эукариотических (чёрный шрифт) и археальных (голубой шрифт) гомологов ТВР. Консервативная часть (серый цвет), соответствующая ДНК-связывающему домену, содержит два прямых повтора (DR1 и DR2). К-концевые части эукариотических ТВР содержат богатые глутамином (Q) участки, размером 5-38 а.о.; С-концевые части археальных ТВР являются богатыми глутаматом (Е) последовательностями. Б Схематичное изображение на основе данных рентгеноструктурного анализа ТВР дрожжей Saccharomyces cerevisiae (PDB 1YTB), К-концевая часть не представлена; гидрофобные Р-тяжи (S 1-5, S10-50), составляющие Р-листы обозначены оранжевым цветом, консервативные фенилаланины ^1-2, F10-20) жёлтым; а-спирали (Н1-2, Н1-2Л) обозначены красным. В Сгибание связанного ТВР участка ДНК с ТАТА-боксом (синий) (PDB 1CDW). Г Детализация вклинивания фенилаланинов между основаниями 7 (Т7/А7) и 8 (Т8/А8) ТАТА-бокса ^В Из [28].

TFB

Общий фактор транскрипции TFB архей является гомологом TFПB эукариот и а-факторов бактерий [29]. Однако, в то время как TFB и TFПB имеют значительное сходство по аминокислотной последовательности и структуре, при сравнении с а-факторами обнаруживается в основном лишь структурное и топологическое сходство (Рисунок 3). Первые данные о структуре TFПB были получены при обработке белка протеазами, согласно которым TFIIB состоит из неустойчивого к протеазам Оконца и устойчивого С-домена [30].

Рисунок 3. Топологическое и структурное сходство связанных с РНК-полимеразой (показаны домены стенка, руль, зажим, крышка и спираль заслонки) TFB (слева) и бактериального фактора а70 (справа). B-линкер, C-концевой B-кор, B-лента и B-ридер совпадают по структуре и расположению с участками а2, а3, а4 и а региону 3.2 соответственно (обозначено цветом). Из [31].

Согласно современным данным рентгеноструктурного анализа N-конец включает в себя B-цинковую ленту (B-ribbon) и B-палец, который подразделяют на B-ридер (B-reader) и B-линкер (B-linker); C-концевой домен, также называемый кором, составляет примерно 2/3 белка и представлен двумя повторами, каждый из которых состоит из 5 а-спиралей (называемых BH1-BH5 для первого повтора и BH1-BH5' для второго) и имеет циклиноподобную третичную структуру (циклиновый фолд). Структуры, полученные

для комплекса TBP-TFIIB-PHK-пол II на промоторной ДНК, позволили определить функции данных участков. TFIIB взаимодействует с докинг-доменом РНК-пол II с помощью B-ленты; B-ридер, располагающийся рядом с каналом выхода РНК и активным центром, участвует в выборе сайта начала транскрипции, B-линкер контактирует с доменами «зажим» и «руль» полимеразы и участвует в плавлении ДНК, коровые повторы взаимодействуют с двумя участками ДНК с обеих сторон от TATA-бокса (первый повтор с BRE, второй повтор с PPE (promoter proximal element)), TBP и контактируют с доменом «стенка» полимеразы [31]. Взаимодействия с BRE и PPE определяют направление транскрипции. Образующийся транскрипт упирается в B-палец, создавая напряжение в комплексе, достаточное для его диссоциации.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Осадчий Игорь Сергеевич, 2020 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Ohler U. et al. Computational analysis of core promoters in the Drosophila genome. // Genome Biol. 2002. Vol. 3, № 12. P. RESEARCH0087.

2. Yang C. et al. Prevalence of the initiator over the TATA box in human and yeast genes and identification of DNA motifs enriched in human TATA-less core promoters. // Gene. NIH Public Access, 2007. Vol. 389, № 1. P. 52-65.

3. Andersen P.R. et al. A heterochromatin-dependent transcription machinery drives piRNA expression. // Nature. 2017. Vol. 549, № 7670. P. 54-59.

4. Duttke S.H.C. Evolution and diversification of the basal transcription machinery // Trends Biochem. Sci. 2015. Vol. 40, № 3. P. 127-129.

5. Wang Y.-L. et al. TRF2, but not TBP, mediates the transcription of ribosomal protein genes // Genes Dev. 2014. Vol. 28, № 14. P. 1550-1555.

6. Kedmi A. et al. Drosophila TRF2 is a preferential core promoter regulator // Genes Dev. 2014. Vol. 28, № 19. P. 2163-2174.

7. Orphanides G., Lagrange T., Reinberg D. The general transcription factors of RNA polymerase II. // Genes Dev. 1996. Vol. 10, № 21. P. 2657-2683.

8. Goodfellow S.J., Zomerdijk J.C.B.M. Basic Mechanisms in RNA Polymerase I Transcription of the Ribosomal RNA Genes // Sub-cellular biochemistry. 2013. Vol. 61. P. 211-236.

9. Bywater M.J. et al. Dysregulation of the basal RNA polymerase transcription apparatus in cancer // Nat. Rev. Cancer. 2013. Vol. 13, № 5. P. 299-314.

10. Abascal-Palacios G. et al. Structural basis of RNA polymerase III transcription initiation // Nature. 2018. Vol. 553, № 7688. P. 301-306.

11. Sainsbury S., Bernecky C., Cramer P. Structural basis of transcription initiation by RNA polymerase II // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2015. Vol. 16, № 3. P. 129-143.

12. Engel C., Neyer S., Cramer P. Distinct Mechanisms of Transcription Initiation by RNA Polymerases I and II // Annu. Rev. Biophys. 2018. Vol. 47, № 1. P. 425-446.

13. Blombach F. et al. Archaeology of RNA polymerase: factor swapping during the transcription cycle. // Biochem. Soc. Trans. 2013. Vol. 41, № 1. P. 362-367.

14. Gonzalez-Couto E., Klages N., Strubin M. Synergistic and promoter-selective activation of transcription by recruitment of transcription factors TFIID and TFIIB. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 1997. Vol. 94, № 15. P. 8036-8041.

15. Chatterjee S., Struhl K. Connecting a promoter-bound protein to TBP bypasses the need for a transcriptional activation domain // Nature. 1995. Vol. 374, № 6525. P. 820-822.

16. Paget M. Bacterial Sigma Factors and Anti-Sigma Factors: Structure, Function and Distribution // Biomolecules. 2015. Vol. 5, № 3. P. 1245-1265.

17. Lee D.J., Minchin S.D., Busby S.J.W. Activating Transcription in Bacteria // Annu. Rev. Microbiol. 2012. Vol. 66, № 1. P. 125-152.

18. Koonin E. V., Yutin N. The Dispersed Archaeal Eukaryome and the Complex Archaeal Ancestor of Eukaryotes // Cold Spring Harb. Perspect. Biol. 2014. Vol. 6, № 4. P. a016188-a016188.

19. Werner F., Grohmann D. Evolution of multisubunit RNA polymerases in the three domains of life // Nat. Rev. Microbiol. 2011. Vol. 9, № 2. P. 85-98.

20. Visone V. et al. Chromatin Structure and Dynamics in Hot Environments: Architectural Proteins and DNA Topoisomerases of Thermophilic Archaea // Int. J. Mol. Sci. 2014. Vol. 15, № 9. P. 17162-17187.

21. Blombach F., Grohmann D. Same same but different: The evolution of TBP in archaea and their eukaryotic offspring // Transcription. 2017. Vol. 8, № 3. P. 162-168.

22. Nagy J. et al. Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule FRET and NPS // Nat. Commun. 2015. Vol. 6, № 1. P. 6161.

23. Micorescu M. et al. Archaeal transcription: function of an alternative transcription factor B from Pyrococcus furiosus. // J. Bacteriol. American Society for Microbiology Journals, 2008. Vol. 190, № 1. P. 157-167.

24. Blombach F. et al. Molecular Mechanisms of Transcription Initiation—Structure, Function, and Evolution of TFE/TFIIE-Like Factors and Open Complex Formation // J. Mol. Biol. 2016. Vol. 428, № 12. P. 2592-2606.

25. Fouqueau T., Blombach F., Werner F. Evolutionary Origins of Two-Barrel RNA Polymerases and Site-Specific Transcription Initiation // Annu. Rev. Microbiol. Annual Reviews , 2017. Vol. 71, № 1. P. 331-348.

26. Patikoglou G.A. et al. TATA element recognition by the TATA box-binding protein has

been conserved throughout evolution // Genes Dev. 1999. Vol. 13, № 24. P. 3217-3230.

27. Adachi N., Senda T., Horikoshi M. Uncovering ancient transcription systems with a novel evolutionary indicator. // Sci. Rep. Nature Publishing Group, 2016. Vol. 6. P. 27922.

28. Kramm K., Engel C., Grohmann D. Transcription initiation factor TBP: old friend new questions. // Biochem. Soc. Trans. 2019. Vol. 47, № 1. P. 411-423.

29. Burton S.P., Burton Z.F. The a enigma: bacterial a factors, archaeal TFB and eukaryotic TFIIB are homologs. // Transcription. Taylor & Francis, 2014. Vol. 5, № 4. P. e967599.

30. Thomas M.C., Chiang C.-M. The General Transcription Machinery and General Cofactors // Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 2006. Vol. 41, № 3. P. 105-178.

31. Kostrewa D. et al. RNA polymerase II-TFIIB structure and mechanism of transcription initiation // Nature. 2009. Vol. 462, № 7271. P. 323-330.

32. Naji S., Grünberg S., Thomm M. The RPB7 Orthologue E' Is Required for Transcriptional Activity of a Reconstituted Archaeal Core Enzyme at Low Temperatures and Stimulates Open Complex Formation // J. Biol. Chem. 2007. Vol. 282, № 15. P. 11047-11057.

33. Schulz S. et al. TFE and Spt4/5 open and close the RNA polymerase clamp during the transcription cycle // Proc. Natl. Acad. Sci. 2016. Vol. 113, № 13. P. E1816-E1825.

34. Bywater M.J. et al. Inhibition of RNA Polymerase I as a Therapeutic Strategy to Promote Cancer-Specific Activation of p53 // Cancer Cell. 2012. Vol. 22, № 1. P. 51-65.

35. Murano K. et al. Reconstitution of human rRNA gene transcription in mouse cells by a complete SL1 complex // J. Cell Sci. 2014. Vol. 127, № 15. P. 3309-3319.

36. Schmitz K.-M. et al. TAF12 Recruits Gadd45a and the Nucleotide Excision Repair Complex to the Promoter of rRNA Genes Leading to Active DNA Demethylation // Mol. Cell. 2009. Vol. 33, № 3. P. 344-353.

37. Naidu S. et al. TAF1B Is a TFIIB-Like Component of the Basal Transcription Machinery for RNA Polymerase I // Science (80-. ). 2011. Vol. 333, № 6049. P. 16401642.

38. Male G. et al. Architecture of TFIIIC and its role in RNA polymerase III pre-initiation complex assembly // Nat. Commun. 2015. Vol. 6, № 1. P. 7387.

39. Layat E., Probst A. V., Tourmente S. Structure, function and regulation of Transcription

Factor IIIA: From Xenopus to Arabidopsis // Biochim. Biophys. Acta - Gene Regul. Mech. 2013. Vol. 1829, № 3-4. P. 274-282.

40. van Nuland R. et al. Multivalent Engagement of TFIID to Nucleosomes // PLoS One / ed. Defossez P.-A. 2013. Vol. 8, № 9. P. e73495.

41. Patel A.B. et al. Structure of human TFIID and mechanism of TBP loading onto promoter DNA // Science (80-. ). 2018. Vol. 362, № 6421. P. eaau8872.

42. Kadonaga J.T. Perspectives on the RNA polymerase II core promoter // Wiley Interdiscip. Rev. Dev. Biol. 2012. Vol. 1, № 1. P. 40-51.

43. Rhee H.S., Pugh B.F. Genome-wide structure and organization of eukaryotic pre-initiation complexes // Nature. 2012. Vol. 483, № 7389. P. 295-301.

44. Ravarani C.N.J. et al. Affinity and competition for TBP are molecular determinants of gene expression noise // Nat. Commun. 2016. Vol. 7, № 1. P. 10417.

45. Olson W.K. et al. DNA sequence-dependent deformability deduced from protein-DNA crystal complexes. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 1998. Vol. 95, № 19. P. 11163-11168.

46. Baptista T. et al. SAGA Is a General Cofactor for RNA Polymerase II Transcription // Mol. Cell. 2017. Vol. 68, № 1. P. 130-143.e5.

47. Akhtar W., Veenstra G.J.C. TBP-related factors: a paradigm of diversity in transcription initiation. // Cell Biosci. BioMed Central, 2011. Vol. 1, № 1. P. 23.

48. Duttke S.H.C. et al. TRF2 and the evolution of the bilateria // Genes Dev. 2014. Vol. 28, № 19. P. 2071-2076.

49. Martianov I. et al. Distinct functions of TBP and TLF/TRF2 during spermatogenesis: requirement of TLF for heterochromatic chromocenter formation in haploid round spermatids. // Development. 2002. Vol. 129, № 4. P. 945-955.

50. Kamenova I., Warfield L., Hahn S. Mutations on the DNA Binding Surface of TBP Discriminate between Yeast TATA and TATA-Less Gene Transcription // Mol. Cell. Biol. 2014. Vol. 34, № 15. P. 2929-2943.

51. Vorontsova Y.E., Cherezov R.O., Simonova O.B. Effect of mutations in lawc/Trf2 gene on development of chromocenter and chromosome disjunction in Drosophila melanogaster. // Genetika. 2013. Vol. 49, № 6. P. 669-680.

52. Morgunova V. et al. Telomeric repeat silencing in germ cells is essential for early

development in Drosophila // Nucleic Acids Res. 2015. Vol. 43, № 18. P. 8762-8773.

53. Kopytova D. V. et al. Two Isoforms of Drosophila TRF2 Are Involved in Embryonic Development, Premeiotic Chromatin Condensation, and Proper Differentiation of Germ Cells of Both Sexes // Mol. Cell. Biol. 2006. Vol. 26, № 20. P. 7492-7505.

54. Isogai Y. et al. Transcription of histone gene cluster by differential core-promoter factors // Genes Dev. 2007. Vol. 21, № 22. P. 2936-2949.

55. Hochheimer A. et al. TRF2 associates with DREF and directs promoter-selective gene expression in Drosophila // Nature. 2002. Vol. 420, № 6914. P. 439-445.

56. Fan W. et al. Drosophila TRF2 and TAF9 regulate lipid droplet size and phospholipid fatty acid composition // PLOS Genet. / ed. Barsh G.S. Public Library of Science, 2017. Vol. 13, № 3. P. e1006664.

57. Kugler S.J., Nagel A.C. A Novel Pzg-NURF Complex Regulates Notch Target Gene Activity // Mol. Biol. Cell. American Society for Cell Biology, 2010. Vol. 21, № 19. P. 3443.

58. Verboon J.M. et al. Wash Interacts with Lamin and Affects Global Nuclear Organization // Curr. Biol. Cell Press, 2015. Vol. 25, № 6. P. 804-810.

59. Hochheimer A., Tjian R. Diversified transcription initiation complexes expand promoter selectivity and tissue-specific gene expression // Genes Dev. 2003. Vol. 17, № >11. P. 1309-1320.

60. Baumann D.G., Gilmour D.S. A sequence-specific core promoter-binding transcription factor recruits TRF2 to coordinately transcribe ribosomal protein genes // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № 18. P. 10481-10491.

61. Girard A. et al. A germline-specific class of small RNAs binds mammalian Piwi proteins // Nature. Nature Publishing Group, 2006. Vol. 442, № 7099. P. 199-202.

62. Pritykin Y. et al. Integrative analysis unveils new functions for the Drosophila Cutoff protein in noncoding RNA biogenesis and gene regulation // RNA. 2017. Vol. 23, № 7. P.1097-1109.

63. Shiraki T. et al. Cap analysis gene expression for high-throughput analysis of transcriptional starting point and identification of promoter usage // Proc. Natl. Acad. Sci. 2003. Vol. 100, № 26. P. 15776-15781.

64. Ni T. et al. A paired-end sequencing strategy to map the complex landscape of

transcription initiation // Nat. Methods. 2010. Vol. 7, № 7. P. 521-527.

65. Lenhard B., Sandelin A., Carninci P. Metazoan promoters: emerging characteristics and insights into transcriptional regulation // Nat. Rev. Genet. 2012. Vol. 13, № 4. P. 233245.

66. Haberle V., Lenhard B. Promoter architectures and developmental gene regulation // Semin. Cell Dev. Biol. 2016. Vol. 57. P. 11-23.

67. Hendrix D.A. et al. Promoter elements associated with RNA Pol II stalling in the Drosophila embryo // Proc. Natl. Acad. Sci. 2008. Vol. 105, № 22. P. 7762-7767.

68. Scheidegger A., Nechaev S. RNA polymerase II pausing as a context-dependent reader of the genome // Biochem. Cell Biol. 2016. Vol. 94, № 1. P. 82-92.

69. Luger K. et al. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 Ä resolution // Nature. 1997. Vol. 389, № 6648. P. 251-260.

70. Iwasaki W. et al. Contribution of histone N-terminal tails to the structure and stability of nucleosomes. // FEBS Open Bio. Wiley-Blackwell, 2013. Vol. 3. P. 363-369.

71. Radman-Livaja M., Rando O.J. Nucleosome positioning: How is it established, and why does it matter? // Dev. Biol. Academic Press, 2010. Vol. 339, № 2. P. 258-266.

72. Clapier C.R., Cairns B.R. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes // Annu. Rev. Biochem. 2009. Vol. 78, № 1. P. 273-304.

73. Collings C.K., Anderson J.N. Links between DNA methylation and nucleosome occupancy in the human genome // Epigenetics Chromatin. 2017. Vol. 10, № 1. P. 18.

74. Längst G., Manelyte L. Chromatin Remodelers: From Function to Dysfunction. // Genes (Basel). Multidisciplinary Digital Publishing Institute (MDPI), 2015. Vol. 6, № 2. P. 299-324.

75. Flaus A. et al. Identification of multiple distinct Snf2 subfamilies with conserved structural motifs // Nucleic Acids Res. 2006. Vol. 34, № 10. P. 2887-2905.

76. Taverna S.D. et al. How chromatin-binding modules interpret histone modifications: lessons from professional pocket pickers // Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. Vol. 14, № 11. P. 1025-1040.

77. Szerlong H. et al. The HSA domain binds nuclear actin-related proteins to regulate chromatin-remodeling ATPases // Nat. Struct. Mol. Biol. Nature Publishing Group, 2008. Vol. 15, № 5. P. 469-476.

78. Filippakopoulos P., Knapp S. The bromodomain interaction module // FEBS Lett. 2012. Vol. 586, № 17. P. 2692-2704.

79. Sims J.K., Wade P.A. SnapShot: Chromatin Remodeling: CHD // Cell. 2011. Vol. 144, № 4. P. 626-626.e1.

80. Stokes D.G., Perry R.P. DNA-binding and chromatin localization properties of CHD1. // Mol. Cell. Biol. 1995. Vol. 15, № 5. P. 2745-2753.

81. Ryan D.P. et al. The DNA-binding domain of the Chd1 chromatin-remodelling enzyme contains SANT and SLIDE domains // EMBO J. 2011. Vol. 30, № 13. P. 2596-2609.

82. Watson A.A. et al. The PHD and Chromo Domains Regulate the ATPase Activity of the Human Chromatin Remodeler CHD4 // J. Mol. Biol. 2012. Vol. 422, № 1. P. 3-17.

83. Murawska M., Brehm A. CHD chromatin remodelers and the transcription cycle. // Transcription. Taylor & Francis, 2011. Vol. 2, № 6. P. 244-253.

84. Zhang W. et al. The Nucleosome Remodeling and Deacetylase Complex NuRD Is Built from Preformed Catalytically Active Sub-modules. // J. Mol. Biol. Elsevier, 2016. Vol. 428, № 14. P. 2931-2942.

85. Reynolds N. et al. NuRD-mediated deacetylation of H3K27 facilitates recruitment of Polycomb Repressive Complex 2 to direct gene repression. // EMBO J. European Molecular Biology Organization, 2012. Vol. 31, № 3. P. 593-605.

86. Wu S. et al. A YY1-INO80 complex regulates genomic stability through homologous recombination-based repair // Nat. Struct. Mol. Biol. 2007. Vol. 14, № 12. P. 11651172.

87. Papamichos-Chronakis M. et al. Global Regulation of H2A.Z Localization by the INO80 Chromatin-Remodeling Enzyme Is Essential for Genome Integrity // Cell. 2011. Vol. 144, № 2. P. 200-213.

88. Bhatia S. et al. Chromatin remodeling protein INO80 has a role in regulation of homeotic gene expression in Drosophila // Genes to Cells. 2010. Vol. 15, № 7. P. 725735.

89. Charoensawan V., Wilson D., Teichmann S.A. Genomic repertoires of DNA-binding transcription factors across the tree of life // Nucleic Acids Res. Oxford University Press, 2010. Vol. 38, № 21. P. 7364.

90. Degnan B.M. et al. Early evolution of metazoan transcription factors // Curr. Opin.

Genet. Dev. Elsevier Current Trends, 2009. Vol. 19, № 6. P. 591-599.

91. Itzkovitz S., Tlusty T., Alon U. Coding limits on the number of transcription factors // BMC Genomics. BioMed Central, 2006. Vol. 7, № 1. P. 239.

92. Aravind L. et al. The many faces of the helix-turn-helix domain: transcription regulation and beyond. // FEMS Microbiol. Rev. 2005. Vol. 29, № 2. P. 231-262.

93. Minezaki Y., Homma K., Nishikawa K. Genome-Wide Survey of Transcription Factors in Prokaryotes Reveals Many Bacteria-Specific Families Not Found in Archaea // DNA Res. Oxford University Press, 2006. Vol. 12, № 5. P. 269-280.

94. Pérez-Rueda E., Janga S.C. Identification and genomic analysis of transcription factors in archaeal genomes exemplifies their functional architecture and evolutionary origin. // Mol. Biol. Evol. Oxford University Press, 2010. Vol. 27, № 6. P. 1449-1459.

95. de Mendoza A. et al. Transcription factor evolution in eukaryotes and the assembly of the regulatory toolkit in multicellular lineages. // Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. National Academy of Sciences, 2013. Vol. 110, № 50. P. E4858-66.

96. Yesudhas D. et al. Proteins Recognizing DNA: Structural Uniqueness and Versatility of DNA-Binding Domains in Stem Cell Transcription Factors // Genes (Basel). 2017. Vol. 8, № 8. P. 192.

97. Fedotova A.A. et al. C2H2 Zinc Finger Proteins: The Largest but Poorly Explored Family of Higher Eukaryotic Transcription Factors. // Acta Naturae. National Research University Higher School of Economics, 2017. Vol. 9, № 2. P. 47-58.

98. Razin S. V. et al. Cys2His2 zinc finger protein family: Classification, functions, and major members // Biochem. 2012. Vol. 77, № 3. P. 217-226.

99. Wolfe S.A., Nekludova L., Pabo C.O. DNA Recognition by Cys2 His2 Zinc Finger Proteins // Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 2000. Vol. 29, № 1. P. 183-212.

100. Klug A. The Discovery of Zinc Fingers and Their Applications in Gene Regulation and Genome Manipulation // Annu. Rev. Biochem. 2010. Vol. 79, № 1. P. 213-231.

101. Persikov A. V., Singh M. De novo prediction of DNA-binding specificities for Cys2His2 zinc finger proteins // Nucleic Acids Res. 2014. Vol. 42, № 1. P. 97-108.

102. Emerson R.O., Thomas J.H. Adaptive Evolution in Zinc Finger Transcription Factors // PLoS Genet. / ed. Myers S. Public Library of Science, 2009. Vol. 5, № 1. P. e1000325.

103. Iuchi S. Three classes of C2H2 zinc finger proteins // Cell. Mol. Life Sci. 2001. Vol. 58,

№ 4. P. 625-635.

104. Pearson R. et al. Krüppel-like transcription factors: A functional family // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2008. Vol. 40, № 10. P. 1996-2001.

105. Vizcaino C., Mansilla S., Portugal J. Sp1 transcription factor: A long-standing target in cancer chemotherapy // Pharmacol. Ther. 2015. Vol. 152. P. 111-124.

106. Arzate-Mejia R.G., Recillas-Targa F., Corces V.G. Developing in 3D: the role of CTCF in cell differentiation // Development. 2018. Vol. 145, № 6. P. dev137729.

107. Rimel J.K., Taatjes D.J. The essential and multifunctional TFIIH complex // Protein Sci. 2018. Vol. 27, № 6. P. 1018-1037.

108. van Steensel B., Furlong E.E.M. The role of transcription in shaping the spatial organization of the genome // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. Nature Publishing Group, 2019. Vol. 20, № 6. P. 327-337.

109. Papantonis A., Cook P.R. Transcription Factories: Genome Organization and Gene Regulation // Chem. Rev. 2013. Vol. 113, № 11. P. 8683-8705.

110. Chen Y., Belmont A.S. Genome organization around nuclear speckles // Curr. Opin. Genet. Dev. Elsevier Current Trends, 2019. Vol. 55. P. 91-99.

111. Гаврилов А.А., Разин С.В. Компартментализация клеточного ядра и пространственная организация генома // Молекулярная биология. 2015. Vol. 49, № 1. P. 26-45.

112. Akbari O.S. et al. An Entry/Gateway® cloning system for general expression of genes with molecular tags in Drosophila melanogaster // BMC Cell Biol. BioMed Central, 2009. Vol. 10, № 1. P. 8.

113. Rosin L.F., Nguyen S.C., Joyce E.F. Condensin II drives large-scale folding and spatial partitioning of interphase chromosomes in Drosophila nuclei // PLOS Genet. / ed. Bosco G. Public Library of Science, 2018. Vol. 14, № 7. P. e1007393.

114. Ma T. et al. Developing novel methods to image and visualize 3D genomes // Cell Biol. Toxicol. Springer Netherlands, 2018. Vol. 34, № 5. P. 367-380.

115. Ou H.D. et al. ChromEMT: Visualizing 3D chromatin structure and compaction in interphase and mitotic cells // Science (80-. ). 2017. Vol. 357, № 6349. P. eaag0025.

116. Ulianov S. V et al. Active chromatin and transcription play a key role in chromosome partitioning into topologically associating domains. // Genome Res. Cold Spring Harbor

Laboratory Press, 2016. Vol. 26, № 1. P. 70-84.

117. Vatolina T.Y. et al. Identical Functional Organization of Nonpolytene and Polytene Chromosomes in Drosophila melanogaster // PLoS One / ed. Singh A. Public Library of Science, 2011. Vol. 6, № 10. P. e25960.

118. Cubenas-Potts C. et al. Different enhancer classes in Drosophila bind distinct architectural proteins and mediate unique chromatin interactions and 3D architecture // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № 4. P. 1714-1730.

119. Corrales M. et al. Clustering of Drosophila housekeeping promoters facilitates their expression // Genome Res. 2017. Vol. 27, № 7. P. 1153-1161.

120. Zykova T.Y. et al. Polytene Chromosomes - A Portrait of Functional Organization of the Drosophila Genome. // Curr. Genomics. Bentham Science Publishers, 2018. Vol. 19, № 3. P. 179-191.

121. Kolesnikova T.D. Banding Pattern of Polytene Chromosomes as a Representation of Universal Principles of Chromatin Organization into Topological Domains // Biochem. Pleiades Publishing, 2018. Vol. 83, № 4. P. 338-349.

122. Eagen K.P., Hartl T.A., Kornberg R.D. Stable Chromosome Condensation Revealed by Chromosome Conformation Capture // Cell. Cell Press, 2015. Vol. 163, № 4. P. 934946.

123. Zolotarev N. et al. Architectural proteins Pita, Zw5,and ZIPIC contain homodimerization domain and support specific long-range interactions in Drosophila // Nucleic Acids Res.

2016. Vol. 44, № 15. P. gkw371.

124. Chung H.-R., Löhr U., Jäckle H. Lineage-specific expansion of the Zinc Finger Associated Domain ZAD // Mol. Biol. Evol. 2007. Vol. 24, № 9. P. 1934-1943.

125. Bonchuk A. et al. Functional role of dimerization and CP190 interacting domains of CTCF protein in Drosophila melanogaster. // BMC Biol. BioMed Central, 2015. Vol. 13. P. 63.

126. Weintraub A.S. et al. YY1 Is a Structural Regulator of Enhancer-Promoter Loops // Cell.

2017. Vol. 171, № 7. P. 1573-1588.e28.

127. Payre F. et al. Two types of zinc fingers are required for dimerization of the serendipity delta transcriptional activator. // Mol. Cell. Biol. 1997. Vol. 17, № 6. P. 3137-3145.

128. Harrison D.A. et al. A leucine zipper domain of the suppressor of Hairy-wing protein

mediates its repressive effect on enhancer function. // Genes Dev. 1993. Vol. 7, № 10. P. 1966-1978.

129. Bonchuk A. et al. Drosophila BTB/POZ Domains of "ttk Group" Can Form Multimers and Selectively Interact with Each Other // J. Mol. Biol. 2011. Vol. 412, № 3. P. 423436.

130. Read D. et al. Functional studies of the BTB domain in the Drosophila GAGA and Mod(mdg4) proteins. // Nucleic Acids Res. Oxford University Press, 2000. Vol. 28, № 20. P. 3864-3870.

131. Phillips-Cremins J.E., Corces V.G. Chromatin Insulators: Linking Genome Organization to Cellular Function // Mol. Cell. 2013. Vol. 50, № 4. P. 461-474.

132. Bohla D. et al. A functional insulator screen identifies NURF and dREAM components to be required for enhancer-blocking. // PLoS One. Public Library of Science, 2014. Vol. 9, № 9. P. e107765.

133. James P., Halladay J., Craig E.A. Genomic libraries and a host strain designed for highly efficient two-hybrid selection in yeast. // Genetics. 1996. Vol. 144, № 4. P. 1425-1436.

134. Gietz R.D., Schiestl R.H. High-efficiency yeast transformation using the LiAc/SS carrier DNA/PEG method // Nat. Protoc. 2007. Vol. 2, № 1. P. 31-34.

135. Letunic I., Bork P. 20 years of the SMART protein domain annotation resource // Nucleic Acids Res. Narnia, 2018. Vol. 46, № D1. P. D493-D496.

136. Dosztanyi Z. Prediction of protein disorder based on IUPred // Protein Sci. 2018. Vol. 27, № 1. P. 331-340.

137. Bitard-Feildel T. et al. Order in Disorder as Observed by the "Hydrophobic Cluster Analysis" of Protein Sequences // Proteomics. John Wiley & Sons, Ltd, 2018. Vol. 18, № 21-22. P. 1800054.

138. Edgar R.C. MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput // Nucleic Acids Res. 2004. Vol. 32, № 5. P. 1792-1797.

139. Langmead B. et al. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. // Genome Biol. BioMed Central, 2009. Vol. 10, № 3. P. R25.

140. Landt S.G. et al. ChIP-seq guidelines and practices of the ENCODE and modENCODE consortia // Genome Res. 2012. Vol. 22, № 9. P. 1813-1831.

141. Zhang Y. et al. Model-based Analysis of ChIP-Seq (MACS) // Genome Biol. 2008. Vol.

9, № 9. P. R137.

142. Bailey T.L. et al. MEME SUITE: tools for motif discovery and searching // Nucleic Acids Res. 2009. Vol. 37, № Web Server. P. W202-W208.

143. Hertz G.Z., Stormo G.D. Identifying DNA and protein patterns with statistically significant alignments of multiple sequences // Bioinformatics. 1999. Vol. 15, № 7. P. 563-577.

144. Gratz S.J. et al. Highly specific and efficient CRISPR/Cas9-catalyzed homology-directed repair in Drosophila. // Genetics. 2014. Vol. 196, № 4. P. 961-971.

145. Gohl D.M. et al. A versatile in vivo system for directed dissection of gene expression patterns // Nat. Methods. Nature Publishing Group, 2011. Vol. 8, № 3. P. 231-237.

146. Schlötterer C. Genes from scratch--the evolutionary fate of de novo genes. // Trends Genet. Elsevier, 2015. Vol. 31, № 4. P. 215-219.

147. Bornberg-Bauer E., Heames B. Becoming a de novo gene // Nat. Ecol. Evol. 2019. Vol. 3, № 4. P. 524-525.

148. Zhao L. et al. Origin and Spread of de Novo Genes in Drosophila melanogaster Populations // Science (80-. ). 2014. Vol. 343, № 6172. P. 769-772.

149. Arnold C.D. et al. A high-throughput method to identify trans-activation domains within transcription factor sequences // EMBO J. 2018. Vol. 37, № 16. P. e98896.

150. Peter A. et al. Mapping and identification of essential gene functions on the X chromosome of Drosophila. // EMBO Rep. 2002. Vol. 3, № 1. P. 34-38.

151. Bartkuhn M. et al. Active promoters and insulators are marked by the centrosomal protein 190 // EMBO J. 2009. Vol. 28, № 7. P. 877-888.

152. Ahanger S.H., Shouche Y.S., Mishra R.K. Functional sub-division of the Drosophila genome via chromatin looping // Nucleus. 2013. Vol. 4, № 2. P. 115-122.

153. Eggert H., Gortchakov A., Saumweber H. Identification of the Drosophila interband-specific protein Z4 as a DNA-binding zinc-finger protein determining chromosomal structure // J. Cell Sci. 2004. Vol. 117, № 18. P. 4253-4264.

154. Kenyon K.L. et al. Fly Six-type homeodomain proteins Sine oculis and Optix partner with different cofactors during eye development // Dev. Dyn. 2005. Vol. 234, № 3. P. 497-504.

155. Thomas P.D. et al. PANTHER: A Library of Protein Families and Subfamilies Indexed

by Function // Genome Res. 2003. Vol. 13, № 9. P. 2129-2141.

156. Mi H. et al. Assessment of Genome-Wide Protein Function Classification for Drosophila melanogaster // Genome Res. 2003. Vol. 13, № 9. P. 2118-2128.

157. Marion R.M. et al. Sfp1 is a stress- and nutrient-sensitive regulator of ribosomal protein gene expression // Proc. Natl. Acad. Sci. 2004. Vol. 101, № 40. P. 14315-14322.

158. Xu Z., Norris D. The SFP1 gene product of Saccharomyces cerevisiae regulates G2/M transitions during the mitotic cell cycle and DNA-damage response. // Genetics. 1998. Vol. 150, № 4. P. 1419-1428.

159. Maksimenko O. et al. Two new insulator proteins, Pita and ZIPIC, target CP190 to chromatin. // Genome Res. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2015. Vol. 25, № 1. P. 89-99.

160. Lambertsson A. The minute genes in Drosophila and their molecular functions. // Adv. Genet. 1998. Vol. 38. P. 69-134.

161. Marygold S.J. et al. The ribosomal protein genes and Minute loci of Drosophila melanogaster // Genome Biol. 2007. Vol. 8, № 10. P. R216.

162. Butcher R.D.J. et al. The Drosophila centrosome-associated protein CP190 is essential for viability but not for cell division. // J. Cell Sci. The Company of Biologists Ltd, 2004. Vol. 117, № Pt 7. P. 1191-1199.

163. Thomas S. et al. Dynamic reprogramming of chromatin accessibility during Drosophila embryo development // Genome Biol. 2011. Vol. 12, № 5. P. R43.

164. Huang D.W., Sherman B.T., Lempicki R.A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources // Nat. Protoc. 2009. Vol. 4, № 1. P. 44-57.

165. Stampfel G. et al. Transcriptional regulators form diverse groups with context-dependent regulatory functions // Nature. 2015. Vol. 528, № 7580. P. 147-151.

166. Bischof J. et al. An optimized transgenesis system for Drosophila using germ-line-specific C31 integrases // Proc. Natl. Acad. Sci. 2007. Vol. 104, № 9. P. 3312-3317.

167. Lindsley D.L., Zimm G.G., Lindsley D.L. The genome of Drosophila melanogaster. Academic Press, 1992. 1133 p.

168. Terracol R., Prud'homme N. 26S and 18S rRNA synthesis in bobbed mutants of Drosophila melanogaster // Biochimie. Elsevier, 1981. Vol. 63, № 5. P. 451-455.

169. Endow S.A., Komma D.J. One-step and stepwise magnification of a bobbed lethal chromosome in Drosophila melanogaster. // Genetics. Genetics Society of America, 1986. Vol. 114, № 2. P. 511-523.

170. Kyrchanova O. et al. Orientation-dependent interaction between Drosophila insulators is a property of this class of regulatory elements. // Nucleic Acids Res. Oxford University Press, 2008. Vol. 36, № 22. P. 7019-7028.

171. Kyrchanova O. et al. Functional Interaction between the Fab-7 and Fab-8 Boundaries and the Upstream Promoter Region in the Drosophila Abd-B Gene // Mol. Cell. Biol. 2008. Vol. 28, № 12. P. 4188-4195.

172. Maksimenko O., Golovnin A., Georgiev P. Enhancer-Promoter Communication Is Regulated by Insulator Pairing in a Drosophila Model Bigenic Locus // Mol. Cell. Biol. 2008. Vol. 28, № 17. P. 5469-5477.

173. Rodin S. et al. New properties of Drosophila fab-7 insulator. // Genetics. Genetics, 2007. Vol. 177, № 1. P. 113-121.

174. Kyrchanova O. et al. Effective Blocking of the White Enhancer Requires Cooperation between Two Main Mechanisms Suggested for the Insulator Function // PLoS Genet. / ed. White R.A.H. Public Library of Science, 2013. Vol. 9, № 7. P. e1003606.

175. Doyle B. et al. Chromatin Loops as Allosteric Modulators of Enhancer-Promoter Interactions // bioRxiv. Cold Spring Harbor Laboratory, 2014. P. 003087.

176. Ahanger S.H. et al. Ectopically tethered CP190 induces large-scale chromatin decondensation // Sci. Rep. 2015. Vol. 4, № 1. P. 3917.

177. Ali T. et al. Chromatin binding of Gcn5 in Drosophila is largely mediated by CP190 // Nucleic Acids Res. 2017. Vol. 45, № 5. P. 2384-2395.

ПРИЛОЖЕНИЕ

МС5АУКК6РС5РТК11]Ё^У^АКР1КЫЕР1РРЕНРУЕНРРЕР5РКЕМ|Ц5РЫ|05Р1\|РКА16РСЕЦ6РР1СКРТ1ЫР

|\1ЕАР0Р55ЕЕУЕКЫЕАМ55СЫЕ56СРАКМ5ЯРК1555Н5ЕРЕ01М0ЕУ5Т55565Т1СМКЕ065РУ6КР|Т55Р||\ГЁ~

APQFSNEEVEKNEANSSGNESYGDACNSSPRLSSSNSEPEQLHQEYSTSSRGRTREYAQSPLNPGYQp[LNIGNaP

LNQ^VNREYQË[SNNEYQv[SNQEYQн[LNTEYaELNHGPQфNPEYQELNHGNQфNPEYQESNHGNQp[SNDË7 QELNHSNQфNPEYQELNHGDQP[SSPEYQPLNHVNQфNHEYQAWNHEYQфNHEYQALNREYQY|PESPEEE AARKRNIYTRLRSYACQVHLPRLGESEVPSPPRRH[NPIN|QPFN[QPM^RPNQKSDSSLESSSPERQDSESESRQASPE ESSSGPSPYLIPPVTGWLSRRRETSTEREEKSPQSQQESSEEITPEQKEESPPVEQQSPAEHTSSPRRPHSPPKQQ NKRKSLGTGNSSYSKKPLLPGPKGPPRSHLSSLGSRRSLKRKWPFPCTPSKKFKPNLQ|SEEPI<|SEEEI^REPTESECS

РЕ^Р5Р5$фрт]р5Ы5Р^Р5Ы1Р1|р5Р5Р^Н5РРЕ55555ЕфАЦРРАРЕ0ф"РЦРРАРЕ0^РЦРРАРЕ0(5|уРЦ

РРАРЕОО^РЦРРАРЕО^УРЦРРАРЕОЕ^РЦРЕАРЕОС^УРЦРРАРЕЕО^ГРС^РРНРУУМРС^РРАРУУРРЦРРА^ YYPPн}lCPSEEPYKPFIFSKERKFLKFVTNPLGPPKSSLPLSIQLYKVFGAYKLEPVYSSIPEEGQPEQPLQLKQQQK HLKKYQKLQLVVFWHQEKFFSKEQLLLYEYLKLLLQKFFPQ^QQEKRLQQEKLL|QQEKLLQQEKRljQQEKRLQQËк' Rl|QQEKRLQQEKRl^QQKLLQQQKL[^

?^QLRQLQQKKELEEQRERKRHLFEQQKQFVLEKLRQQKEQHRRQQNRVKRERKLRQKKEKQRLEYERFLKEYRE PCKRQLRLQREHYLIKIKQLEKASQRSLKGNRKHKLMQNPMVSIPVANLNGGLKAASSGSGVGVVTSGGVVSSAV LANAPRVYLTPSSTFMTNRQMAGVASTGRMSGQVVGGSSGTASTAGTVRYFSQFSKMQTAGGPSLQRKLANGP Т1УЕАТ65КММРЕТ55ЕМКАЫЕРТ\/А5МСМ6Е1ТАКМР1ЕЕЕЕ\/МЦ51Т\/1РРРРЕЕККЕ\/АЕРЕЕЕ55ММАКР1РЕ HQPIAPNEHELPIVINNVVCSFSVGCHLKLREIALQGSNVEYRRENGMVTMKLRHPYTTASIWSSGRITCTGATSES MAKVAARRYARCLGKLGFPTRFLNFRIVNVLGTCSMPWAIKIVNFSERHRENASYEPELHPGVTYKMRPPPPKATL

ТВР

KIFSTGSVTVTAASVNHVESAIQHIYPLVFPFRKQRSAEELQHLRQKQRLQAGGPPHELEKNVLAPNKTASLPNIFV NTTAAHSKSSSNPQTSAPATILSSTVDSMPRLKQMVNYHQMMKQTQEERRHIMFNGEKANPASTSSAAAAPSTS Б2 SSSSSSGPNICANARRRATECWATKLQNKRPRYNDPGTTGTINAASSTASAATSSLASQATHLRNPLKTAALANAR мЕСАКУттсткмБПУаарарщмаааааащраааатзРБРЗЕРРУРРИЕЕЕЕымЕЕРМРР

Рисунок 1. Аминокислотная последовательность длинной изоформы белка TRF2. Повторы в составе К-концевой части длинной изоформы, общие для обеих изоформ участки S1, S2 и ТВР-подобный домен обозначены цветом.

Рисунок 2. Анализ консервативности гидрофобных кластеров среди некоторых ортологов ОрЬр

Таблица 1. Взаимодействия СР190 и ОрЬр в ДДС

pGв^ Г СР190

1-470 245-524

-3 -4 -3 -4

114-562 ДБ 1 1 + + ? -

орЬр + + - + + ? 1

30-562 + + + +

Д[1](492) НТ НТ + -

Д[1] (438) ~ - ~ -

Д[2] (297) НТ НТ + -

Д[2] НТ НТ +

А[1] + + + ~

Д[4-8] (438) - - + + 1

Д28 Д114 Д[4-8] (438) НТ НТ - -

Д28 Д114 Д[4-8] (492) НТ НТ - -

Д28 Д114 (492) НТ НТ - -

Д[4-8] (492) + - + + 1 1

A114 (297) HT HT + -

A28 A114 (297) - - 5 1

A28 - + + ? 1

A114 + - + + ? + ~ 1

A28A114 i 1 + ~ ? -

A[4-8] HT HT + + ? + ~ 1

438 - ~ -

438 AD - - ~ -

297 - + ~

221 - + -

174 - + ~

90 - - + ~

112-298 - - - -

457-562 - - - -

ZnF's[4-8] - - - -

A[1-2] (297) HT HT + + ? 1

A64 + + ~ 1 1 + + + 1 1

A64 A[2-3] + - + ~

A[4-5] + - + +

A[6-8] + - + +

A[2-3] + + + 1 1 + + + + + +

A[9] + + 1 + + + ~

A64 A[9] - + ~

A64 (297) - - - -

A[1-8] + + ? 1 + + ? 1

A[1-8] A114 + - + -

A[1-9] + - + -

A[1-9] A114 + - + -

A[1-9] A64 - - + -

A64 A[1-3]'[9] + - HT HT

A64 A[1-5]'[9] + - HT HT

A64 A[1-3]'[6-9] + - HT HT

1-544 + - + -

A508 + - + ~

A64 A508 - - ~ -

A64 (544) - - - -

pGAD - - - -

Tаблица 2. Взаимодействия Pzg и Opbp в ДДС.

pGBT_Pzg

1-520 целый

-3(0,5 мМ 3AT) -4 -3(0,25 мМ 3AT)

opbp + + 9.4

A114 (297) + + + HT

A[1-2](297) + + + ? ? HT

A[2] (297) + + HT

90 - - -

174 + - ~

A[4-8](438) + i HT

A[2] + + HT

438 + ~ -

438 AD + ~ -

A[4-8] + +, + HT

221 + - ~

297 + ~ +

A28 + + HT

A114 + +, + HT

A28 A114 + + HT

A[1] + ~ +

A[1](492) + - HT

A[1] (438) - -

457-562 - - -

A28 A114 A[4-8] (492) + + HT

A28 A114 (492) - HT

A28 A114 (297) + i HT

114-562 AD + i -

A[4-8] (492) + +, + HT

30-562 + + HT

ZnF's[4-8] - - -

A64 +-- ? i i i HT

A64 A[2-3] - HT

A[4-5] + + HT

A[6-8] + + HT

A[2-3] + + + +, +, + HT

A[9] + +, + HT

A64 A[9] ~ HT

A64 (297) - - HT

A[1-8] + +, + HT

A[1-8] A114 + + HT

A[1-9] + + HT

A[1-9] A114 + + HT

A[1-9] A64 - - HT

A64 A[1-3]'[9] - - HT

A64 A[1-5]'[9] - - HT

A64 A[1-3]'[6-9] - - HT

A64 A[1-3]'[9] - - HT

A64 A[1-5]'[9] - - HT

A64 A[1-3]'[6-9] - - HT

1-544 + ~ HT

A508 + + HT

A64 A508 - - HT

A64 (544) - - HT

pGAD - - -

Таблица 3. Взаимодействия TRF2 (S2) и Opbp в ДДС. 0.7 Ade - 70% аденина от стандартного количества.

pGBT S2

-3 (0.7 Ade) -4

114-562 C + + - + 1

Opbp + +

30-562 + + ~ +

Д[1](492) - -

Д[1] (438) - -

Д[1] + +

Д[4-8](438) - -

Д28 Д114 Д[4-8] (438) - -

Д28 Д114 Д[4-8] (492) - -

Д28 Д114 (492) - -

Д[4-8] (492) - -

Д114 (297) - -

Д28 Д114 (297) - -

Д28 + + •>

Д114 + + •>

Д28 Д114 + + •>

Д[4-8] ? 5

438 - -

438-C - -

221 - -

174 - -

297 - -

90 - -

Д[1-2](297) - -

Д64 + ~ + 1 1 + - - 1 1

Д64 Д[2-3] + +

Д[4-5] + +

Д[6-8] + +

Д[2-3] + + + +-- 1 1

Д[9] + +

Д64 Д[9] -

Д64 (297) - -

Д[1-8]

Д[1-8] Д114 - -

Д[1-9]

Д[1-9] Д114 - -

Д[1-9] Д64 - -

Д64 Д[1-3] [9] - -

Д64 Д[1-5]'[9] - -

Д64 Д[1-3] [6-9] - -

1-544 -

Д508 + ~

Д64 Д508 - -

Д64 (544) - -

pGAD - -

Таблица 4. Оценка выживаемости линии мух с делецией ДOpbp

Скрещиваемые линии Гетерозиготы CyO,GFP Гомозиготы ДОрЬр Соотношение CyO,GFP / ДOpbp

ДOpbp{attP} / СуО^Р X ДOpbp {attP}/ СуО^Р 530 5 106:1

Таблица 5. Расположение сайтов связывание ОрЬр по данным Chip-seq. (референсный геном dm3)

хромосом а начало пика конец пика вершина пика ген FlyBase Идентификатор расстояние от вершины до TSS расположение пика направление транскрипции расположенного рядом промотора

3Я 16383499 16384344 16384022 С05180 FBgn0043457 -3 5'НТР противонаправл.

3L 22068880 22069416 22069175 RpLP0 FBgn0000100 16 5'НТР противонаправл.

2Я 4982498 4982963 4982741 Uhg4 FBgn0083124 36 промотор противонаправл.

2L 5052459 5053136 5052782 е^-3р40 FBgn0022023 -2 5'НТР противонаправл.

3L 3222716 3223249 3222994 RpL28 FBgn0035422 -34 промотор противонаправл.

3Я 1615014 1615426 1615231 Rpn5 FBgn0028690 -17 5'НТР противонаправл.

2L 2855662 2856448 2856081 RpS21 FBgn0015521 -12 5'НТР противонаправл.

3L 19827143 19827717 19827435 ^с FBgn0003744 -31 промотор противонаправл.

2Я 8523844 8524445 8524163 Iswi FBgn0011604 12 5'НТР противонаправл.

3Я 18295789 18296150 18295973 №х-1 FBgn0038975 -774 5'НТР противонаправл.

3Я 14973590 14974169 14973848 Ppcs FBgn0261285 -216 промотор сонаправлена

3L 17005397 17005939 17005683 СС3764 FBgn0036684 -18 промотор сонаправлена

3Я 5226611 5227333 5226960 RpL34b FBgn0037686 -12 промотор противонаправл.

3Я 5403128 5403716 5403452 Kap-alpha3 FBgn0027338 3 5'НТР противонаправл.

3L 13997061 13997521 13997273 upSET FBgn0036398 -2047 интрон противонаправл.

2L 8958082 8958774 8958416 СС31886 FBgn0032079 -303 интрон/ промотор сонаправлена

3Я 10715652 10716297 10715959 С03731/СусС FBgn0038271 -7 5'НТР противонаправл.

2L 9967052 9967582 9967327 RpL13 FBgn0011272 2 5'НТР противонаправл.

3Я 6698185 6698629 6698436 СС4596 FBgn0037849 323 промотор противонаправл.

2Я 11819222 11819620 11819399 bdg FBgn0034049 41 5'НТР сонаправлена

X 1377229 1377525 1377372 sta FBgn0003517 -47 5'НТР противонаправл.

X 9448264 9448985 9448617 RpS28b FBgn0030136 38 промотор противонаправл.

2L 4458090 4458570 4458347 RpL27A FBgn0261606 -3 5'НТР сонаправлена

3R 21072951 21073538 21073211 RpS27 FBgn0039300 -17 5'HTP npoTHBOHanpaB^.

X 16531736 16532126 16531921 RpS19a FBgn0010412 5 5'HTP npoTHBOHanpaB^.

3L 3905055 3905691 3905351 ida FBgn0041147 -8 5'HTP coHanpaBneHa

2R 17389406 17389679 17389505 MESK2 FBgn0043070 96 npOMOTOp npoTHBOHanpaB^.

2R 19746035 19746562 19746274 bgcn FBgn0004581 170 5'HTP coHanpaB^eHa

2R 14526489 14526999 14526749 CG30122 FBgn0050122 26 5'HTP npoTHBOHanpaB^.

3R 25574216 25574833 25574551 ATPsyn-gamma FBgn0020235 40 5'HTP npoTHBOHanpaB^.

3R 5775727 5775957 5775831 Glut4EF FBgn0267336 -21193 HrnpOH -

Taön^a 6. npaÖMepbi.

npaHMepw gna CRISPR/Cas9

Opbp

5'target GACTACCCCGAACCTCCACGTGG

3'target GAAGTCGGCTCACGGTTTGGTGG