Ca2+-регулируемый фотопротеин обелин и его производные как репортеры в биолюминесцентном анализе in vitro тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Борисова, Василиса Валерьевна

• Борисова, Василиса Валерьевна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Борисова, Василиса Валерьевна

ВВЕДЕНИЕ

Условные обозначения

ГЛАВА 1. Использование кальций-регулируемых фотопротеинов в качестве репортеров в диагностики in vitro

1.1. Использование Са -регулируемых фотопротеинов в иммуноферментном анализе

1.2. Использование Са -регулируемых фотопротеинов в гибридизационном анализе

1.3. Одновременный анализ двух мишеней

ГЛАВА 2. Материалы и методы

2.1. Оборудование

2.2. Материалы и реактивы

2.3. Культивирование трансформированных клеток Е. coli, выделение и очистка белков

2.4. Определение концентрации белков, биолюминесцентной активности и спектральные измерения

2.5. Химическая модификация белков и олигонуклеотидов

ГЛАВА 3. Одновременный иммуноферментный анализ двух антигенов с использованием «цветных» мутантных форм обелина в качестве меток

3.1. Основные физико-химические свойства мутантных форм обелина W92F;H22E и Y138F

3.2. Одновременный твердофазный иммуноанализ двух антигенов

ГЛАВА 4. Последовательный иммуноферментный анализ двух антигенов с использованием фотопротеина обелина в паре с целентеразин-зависимой люциферазой Metridia longa

4.1. Основные физико-химические свойства люциферазы Metridia longa

4.2. Использование люциферазы MLuc39 в твердофазном микроанализе

ГЛАВА 5. Гибридизационный биолюминесцентный анализ с использованием фотопротеина обелина

5.1. Гибридизационный анализ с использованием в качестве метки коньюгата стрепт/авидина с обелином или щелочной фосфатазой

5.2. Гибридизационный анализ с использованием в качестве метки коньюгата олигонуклеотидного зонда с обелином или его мутантными вариантами Y138F и W92F;H22E

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Ca2+-регулируемый фотопротеин обелин и его производные как репортеры в биолюминесцентном анализе in vitro»

Важнейшей задачей современной биотехнологии является поиск новых высокоэффективных аналитических инструментов способных отвечать нуждам медицинской диагностики, микробиологии, геномики, экологии и т.д. Ключевыми элементами аналитических систем являются системы регистрации специфических взаимодействий аффинных комплексов. Основными требованиями, предъявляемыми к этим системам, являются их надежность, стабильность, простота мечения и регистрации, а также способность обеспечить выявление сверхмалых количеств биомолекул-мишеней. Этим требованиям в полной мере удовлетворяют подходы, использующие биолюминесцентные метки.

Са2+- регулируемые фотопротеины кишечнополостных представляют собой устойчивый фермент-субстратный комплекс, состоящий из белковой части - апопротеина (одноцепочечный полипептид, -20 кДа) и субстрата 2-гидропероксицелентеразина. В аминокислотной последовательности белка находятся 3 кальций-связывающих сайта. Присоединение ионов Са практически мгновенно вызывает реакцию внутримолекулярного окислительного декарбоксилирования субстрата с образованием целентерамида, СО2 и испусканием кванта света в голубой области. Благодаря этому свойству фотопротеины успешно используются для мониторинга внутриклеточного Са более 40 лет. Клонирование кДНК генов ряда фотопротеинов и получение высокоактивных рекомбинантных белков в практически неограниченном количестве открыло новые возможности их применения, в частности, в качестве репортеров в гибридизационном и иммунном анализах.

В лаборатории фотобиологии СО РАН ведутся многолетние исследования биолюминесцентной системы Са -регулируемого фотопротеина обелина гидроидного полипа Obelia longissima: выделен и изучен природный белок, клонирована его кДНК, получен штамм-суперпродуцент и разработана эффективная технология получения рекомбинантного обелина, установлена его пространственная структура и предложен механизм биолюминесцентной реакции. На основе этих данных сайт-направленным мутагенезом были сконструированы ряд мутантов обелина, обладающих уникальными свойствами, в том числе и новыми спектральными характеристиками излучения. Таким образом, появилась возможность использования мутантных форм обелина в качестве меток для одновременного определения нескольких аналитов и регистрацией сигналов на разных длинах волн.

Одной из задач клинической иммунодиагностики является определение не только количества, но и баланса между содержанием двух антигенов (соотношения ЛГ и ФСГ, тироидных гормонов - трийодтиронина, тироксина, а также их свободных и связанных форм; анализ ряда гормонов и белков-переносчиков, в норме присутствующих в кровяном русле и т.д.). Одновременный анализ содержания нескольких антигенов позволит избежать ошибок из-за разнесенных во времени процедур определения, а также существенным образом сократит временные и материальные затраты на такую диагностику, что особенно важно при проведении широкомасштабных исследований.

Другим видом молекулярной диагностики является метод, основанный на определении определенных нуклеотидных последовательностей с помощью ДНК-гибридизации. В литературе имеются данные о перспективности использования фотопротеина акворина в качестве репортерного белка в таком анализе. Исследований по применению рекомбинантного обелина для этих целей не проводилось.

Целью представленной работы являлось разработка вариантов биолюминесцентного иммуноанализа, позволяющих проводить определение двух антигенов в одном образце, а также вариантов ДНК-гибридизационного анализа с применением фотопротеина обелина в качестве репортера.

Выполнение данного исследования требовало решения следующих экспериментальных задач:

1. Получить высокоочищенные препараты мутантных форм обелина OL W92F;H22E и OL Y138F, имеющих разные спектральные характеристики биолюминесценции, исследовать их основные свойства и с помощью химических модификаций синтезировать активные коныогаты с иммуноглобулинами к двум разным антигенам.

2. Разработать вариант одновременного биолюминесцентного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием полученных коньюгатов в качестве меток.

3. Получить высокоочищенный препарат рекомбинантной мономерной люциферазы Metridia longa изучить ее основные свойства и синтезировать коныогаты люциферазы, пригодные для использования в качестве биолюминесцентной метки в иммуноферментном анализе.

4. Разработать вариант биолюминесцентного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием в качестве репортеров фотопротеина обелина и люциферазы Metridia longa.

5. Синтезировать коньюгаты обелина с авидином или стрептавидином и исследовать их эффективность в качестве меток в твердофазном гибридизационном анализе.

6. Разработать способ получения коньюгатов обелина и его мутантных форм с олигонуклеотидами. Продемонстрировать пригодность полученных коньюгатов в качестве метки в гибридизационном анализе продуктов ПЦР.

При решении поставленных задач были получены новые результаты, которые выносятся на защиту:

1. Разработан вариант одновременного иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием «цветных» мутантных форм обелина в качестве репортерных белков и регистрацией сигналов на разных длинах волн.

2. Разработан метод иммуноанализа двух антигенов в одном образце с использованием двух разных биолюминесцентных репортеров - фотопротеина обелина и целентеразин-зависимой люциферазы Metridia longa с последовательным запуском биолюминесцентных реакций.

3. Показана перспективность использования фотопротеина обелина как репортера в гибридизационном анализе в различных форматах.

Все результаты данной работы получены впервые и могут быть использованы для создания отечественных высокоэффективных и чувствительных биолюминесцентных диагностикумов для определения биологически важных соединений и инфекционных агентов.

Работа выполнена при поддержке грантов: РФФИ 06-04-08076-офи, INTAS № 06-1000014-6163 (2007-2008 гг.) и лаврентьевского конкурса молодежных проектов № 83 (2006-2007 гг.).

Результаты диссертационной работы докладывались на Конференциях молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2006, 2007), Международных симпозиумах по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Йокогама, Япония, 2004; Сан-Диего, США, 2006; Пекин, Китай, 2008), международной конференции по инструментальным методам анализа (Патры, Греция, 2007), международной конференции молодых ученых по молекулярной биологи и генетике, посвященной 120-му юбилею М.И. Вавилова (Киев, Украина, 2007), международной конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006), международном семинаре молодых ученых «Нуклеиновые кислоты как мишени и инструменты» (Новосибирск, 2006).

По результатам исследования опубликовано 3 статьи в рецензируемых журналах и 2 статьи в сборниках материалов международных конференций.

Условные обозначения:

Obe WT - рекомбинантный обелин дикого типа СЕ - целентеразин

СВР - целентеразин связывающий белок

MLuc -люцифераза морских копепод Metridia longa изоформа 39

Bio-MLuc - биотинилированная люцифераза Metridia longa

Bio-БСА - биотинилированный бычий сывороточный альбумин

Avi - авидин

Stavi - стрептавидин

Bio - биотин

SMCC - сукцинимидный эфир 4-(Ы-малеимидометил-) циклогексановой кислоты

BS3 - бис(сульфосукцинимидил) суберат

Bio~Su - iV-гидроксисукцинимидный эфир биотинамидогексановой кислоты

HIgG - человеческие иммуноглобулины G

RIgG - кроличьи иммуноглобулины G

ФСГ - фолликулостимулирующий гормон

ЛГ - лютеинизирующий гормон аФСГ -а субъединица фолликулостимулирующего гормона

ЗФСГ - р субъединица фолликулостимулирующего гормона

РЛГ - Р субъединица лютеинизирующего гормона

ВГС - вирус гепатита С

ИПТГ - изопропил-Р-В-тиогалактопиранозид

БСА - бычий сывороточный альбумин dNTP - дезоксинуклеозидтрифосфорная кислота dATP - дезоксиаденозинтрифосфорная кислота

Био-11-dUTP - 5-[Ы-(Ы-биотинил-8-аминокапроил)-3-аминоаллил]-2'дезоксиуредин-5'-трифосфат

BCIP - 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат

NBT - нитротетразолиевый синий

NPP - п-нитрофенилфосфат

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ПААГ - полиакриламидный гель

TEMED - тетраметилэтилендиамин

ДСН - додецилсульфат натрия

ПСА - персульфат аммония

ДТТ - дитиотреитол

DMSO - диметилсульфоксид

K-Mes - 2№-морфалинэтансульфоновая кислота - КОН ед. акт. - единицы активности мМЕ/мл - миллимеждународные единицы на миллилитр

LB-среда: 20 г/л пептона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 5-7 г/л NaCl, рН 7,4

LB-агар: 1,5% агара в LB-среде

ТЕ буфер-. 20 мМ Трис-HCl рН 7,0, 5 мМ ЭДТА

PBS: 0,1 М NaH2P04, 0,1 М К2НР04, 0,15 М NaCl

SM-буфер: 50 мМ Трис-HCl рН 7,5, 0,1 М NaCl, 10 мМ MgS04,

0,01 % желатина

Кальциевый буфер: 0,1 М СаС12, 0,1 М Трис-HCl рН 8,8

Промывочный буфер №1: 20 мМ Трис-HCl рН 7,5, 100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2,

20% этанола, 0,5% Tween-20

Промывочный буфер №2: 20 мМ Трис-HCl рН 7,5, 100 мМ NaCl, 2 мМ MgCl2, 1% БСА, 0,5% Tween-20

Промывочный буфер №3: 50 мМ Трис-HCl рН 7,0, 0,15 М NaCl, 5 мМ ЭДТА, 0,1% Tween 20

TBS буфер: 10 мМ Трис-HCl рН 8,0, 150 мМ NaCl

TTBS буфер: 10 мМ Трис-HCl рН 8,0, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween-20 SSC буфер-. 15 мМ цитрат натрия, 1,5 мМ NaCl, рН 7,3

Гибридизационный буфер: 10 мг/мл блокирующего реагента, 0,1 М малеиновой кислоты, 0,15 М NaCl, 5 мМ ЭДТА рН 7,5

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Борисова, Василиса Валерьевна

ВЫВОДЫ

1. Получены высокоочищенные препараты мутантных форм обелина OL W92F;H22E и OL Y138F, имеющие разные спектральные характеристики биолюминесценции, исследованы их свойства и синтезированы активные коныогаты с иммуноглобулинами.

2. Разработан вариант одновременного биолюминесцентного иммуноанализа, эффективность которого продемонстрирована на примере определения лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов в контрольных и стандартных сыворотках. Чувствительность одновременного биолюминесцентного анализа составила 0,57 мМЕ/мл для ФСГ и 1,1 мМЕ/мл для ЛГ.

3. Получен высокоочищенный препарат рекомбинантной люциферазы Metridia longa и изучены ее основные свойства. Показано, что целентеразин, иммобилизованный в целентеразин-связывающем белке (СВР) Renilla miielleri является более эффективным «субстратом» для люциферазы (предел обнаружения фермента 1 аттомоль), чем целентеразин в растворе (предел обнаружения 10 аттомоль). Люцифераза термостабильна (время полужизни при 37, 42 и 50 °С составляет 60, 30 и 7 мин, соответственно) и устойчива к химическим модификациям.

4. Разработан вариант иммуноанализа двух антигенов с использованием двух разных репортеров - обелина и люциферазы Metridia с последовательным запуском биолюминесценых реакций.

5. Показано, что синтезированные коныогаты обелина со стрептавидином являются высокочувствительными метками для гибридизационного анализа. Во всех исследованных условиях проведения анализа использование обелиновой метки обеспечило предел обнаружения

ДНК-матрицы Ю-11 М, что на порядок выше такового при колориметрическом анализе с применением щелочной фосфатазы в качестве репортера.

6. Разработан способ получения и очистки коньюгатов обелина и его мутантных форм OL W92F;H22E и OL Y138F с олигонуклеотидами. Полученные коныогаты стабильны при хранении в растворе в течение месяца при 8 °С и в замороженном виде. Пределы обнаружения модельной ДНК-мишени составили 0,3х10"12 М и 1,4х10"12 М при анализе с использованием коньюгатов обелина дикого типа, Y138F и W92FH22E, соответственно. Пределы обнаружения продуктов ПЦР ДНК вируса гепатита С составили 0,86x10"12 М и 4,3x10"12 М при анализе с использованием коньюгатов обелина дикого типа, Y138F и W92FH22E, соответственно.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Представленная работа посвящена изучению применения Са2+-регулируемого фотопротеина обелина гидроидного полипа Obelia longissima и его производных в качестве репортеров в имунно- и гибридизационном микроанализах.

В результате проведенных исследований показано, что мутантные варианты обелина W92F;H22E и Y138F являются высокочувствительными и стабильными репортерными белками. Были синтезированы устойчивые химические производные мутантных форм обелина с иммуноглобулинами и показано их использование в иммуноанализе. Уникальные спектральные характеристики биолюминесценции этих белков делают возможным проведение одновременного анализа двух антигенов в одном образце, что показано на примере биолюминесцентного иммуноноанализа лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов в смешанных стандартных сыворотках. Разделение сигналов осуществляется с помощью двухканального люминометра, в оптические пути которого вмонтированы широкополосные оптические фильтры. Показано, что даже без специальной оптимизации условий анализа, чувствительность одновременного биолюминесцентного иммуноанализа не уступает раздельному радиоизотопному иммуноанализу.

В представленной работе впервые показана перспективность применения целентеразин-зависимой люциферазы морских копепод Metridia longa MLuc39 как репортера для анализ in vitro. Показано, что биолюминесцентная реакция люциферазы Metridia инициируется не только раствором целентеразина, но и кальций зависимым целентеразинI связывающим белком Renilla muelleri при добавлении Са . Разработан вариант иммуноанализа двух антигенов в одном образце, с использованием в качестве репортерных белков фотопротеина обелина и MLuc39. Регистрация сигналов биолюминесцентных репортеров производится последовательным внесением в лунки планшета растворов Са2+ и целентеразин-связывающего белка Renilla muelleri. Суммарное время для измерения сигналов от обеих мишеней составляет 25 секунд, т.е. для измерения стандартного 96-луночного планшета необходимо 40 минут и при этом будут получены данные о содержании 192 антигенов.

Предлагаемые подходы по проведению анализа двух мишеней в одном образце могут быть особенно полезными в случаях, когда для правильной диагностики важно не только определение содержания каждого антигена в отдельности, но и их соотношения. Одновременное определение двух веществ в одном образце поможет интенсифицировать и удешевить анализ, а также избежать ошибок из-за разнесенных во времени процедур определения.

В ходе проведенных экспериментов показано, что синтезированные коньюгаты обелина со стрептавидином или авидином, а также коньюгаты обелина и его мутантных форм W92F;H22E и Y138F с олигонуклеотидом (сГГ)зо являются высокочувствительными метками для гибридизационного анализа. Широкий линейный диапазон зависимости биолюминесцентного сигнала от количества репортера обеспечивает возможность не только выявлять наличие целевой ДНК-последовательности, но и определять ее количество, пользуясь соответствующими стандартами.

Таким образом, полученные в данной работе результаты позволяют сделать заключение о возможности создания эффективных биолюминесцентных диагностикумов на базе Са2+-регулируемого фотопротеина обелина и его мутантных вариантов, а также рекомбинантной люциферазы Metvidia longa для иммуно- и гибридизационного микроанализа биологически-важных веществ, инфекцонных агентов и т.п.

В заключение выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю к.б.н. JI.A. Франк и моим коллегам — сотрудникам лаборатории фотобиологии ИБФ СО РАН за помощь в постановке и проведении экспериментов, интерес к работе и обсуждение полученных результатов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Борисова, Василиса Валерьевна, 2009 год

1. Балаболкин, М.И. Эндокринология / М.И. Балаболкин - М: Универсум паблишинг, 1998. - 416 с.

2. Виноградова, О.А. Повышение эффективности гибридизационного анализа путем ограниченной фрагментации ДНК-пробы / О.А. Виноградова, И.А. Пышная, В.Ф. Зарытова, Е.М. Иванова, Д.В. Пышный // Молекул, биология 2007. - Т. 41. - № 1. - С. 163-172.

3. Высоцкий, Е.С. Выделение и очистка Са2+-зависимого фотопротеина — обелина из гидроидных полипов Obelia longissima / Е.С. Высоцкий, B.C. Бондарь, В.Н. Летунов // Биохимия 1989. - Т. 54. - С. 965-973.

4. Высоцкий, Е.С. Кальций-регулируемые фотопротеины морских кишечнополостных / Е.С. Высоцкий, С.В. Маркова, Л.А. Франк // Молекул, биология 2006. -Т.40. - № 3. - С. 404-417.

5. Зайцев, Г.Н. Математическая статистика в экспериментальной ботанике. М.: «Наука», 1984. -35с.

6. Франк, Л.А. Бондарь B.C., Тюлькова Н.А., Высоцкий Е.С. Са активируемый фотопротеин обелин и бактериальная люцифераза в иммунологическом микроанализе: Препринт 113 Б. Красноярск, 1992. -22 с.

7. Франк, Л.А. Рекомбинатный фотопротеин обелин гидроидного полипа Obelia longissima: выделение и использование в иммуноферментном анализе. Дисс. канд-та биол. наук: 03.00.02 Красноярск, 1997. - 91 с.

8. Франк, Л.А. Синтез коньюгатов1. Са-регулируемого фотопротеина обелина с иммуноглобулинами и их использование в качестве меток в иммуноанализе / Л.А. Франк, А.И. Петунин, Е.С. Высоцкий // Биоорган, химия 2004. - Т. 30. - № 4. - С. 364-368.

9. Actor, J.K. A flexible bioluminescent-quantitative polymerase chain reaction assay for analysis of competitive PCR amplicons / J.K. Actor, J.R. Limor, R.L. Hunter//J. Clin. Lab. Anal. 1999. V. 13. - No. 1 - P. 40-47.

10. Actor, J.K. Bioluminescent quantitation and detection of gene expression during infectious disease / J.K. Actor // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2000. - Vol. 3. - No. 4. - P. 277-288.

11. Adamczyk, M. Dual analyte detection using tandem flash luminescence / M. Adamczyk, J.A. Moore, K. Shreder // Bioorg. Med. Chem. Lett. 2002. -Vol. 12. - P. 395-398.

12. Campbell, A.K. Extraction, partial purification and properties of obelin, the calcium-activated luminescent protein from hydroid Obelia geniculata / A.K. Campbell //Biochem. J. 1974. - V. 143. - P. 4111-4118.

13. Deo, S.K. An immunoassay for Leu-enkephalin based on a C-terminal aequorin-peptide fusion / S.K. Deo, S. Daunert // Anal. Chem. 2001. - Vol. 73.-P. 1903-1908.

14. Deo, S.K. C-terminal and N-terminal fusions of aequorin with small peptides in immunoassay development / S.K. Deo, J.C. Lewis, S. Daunert // Bioconjugate Chem. 2001. - Vol. 12. - P. 378-384.

15. Doleman, L. Bioluminescence DNA hybridization assay for Plasmodium falciparum based on the photoprotein aequorin / L. Doleman, L. Davies, E.A. Moschou, L. Rowe, S. Deo, S. Daunert // Anal. Chem. 2007. - Vol. 79.-No. 11.-P. 4149-53.

16. Elenis, D.S. Quadruple-analyte chemiluminometric hybridization assay. Application to double quantitative competitive polymerase chain reaction / D.S. Elenis, P.C. Ioannou, Т.К. Christopoulos // Anal. Chem. 2007. - Vol. 79.-No. 24.-P. 9433-40.

17. Erikaku, T. Bioluminescent immunoassay using a monomeric Fab"-photoprotein aequorin conjugate / T. Erikaku, S. Zenno, S. Inouye, //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. - Vol. 174. - No. 3. - P. 13311336.

18. Fagan, T.F. Cloning, expression and sequence analysis of cDNA for then i

19. Ca -binding photoprotein, mitrocomin / T.F. Fagan, Y. Ohmiya, J.R. Blinks, S. Inouye, F.I. Tsuji // FEBS Letters. 1993. - Vol. 333. - P. 301305.

20. Fahey, R.C. On the cysteine and cystine content of proteins. Differences between intracellular and extracellular proteins / R.C. Fahey, J.S. Hunt, C.C. Windham //Mol. Evol. 1977. - Vol. 10. - P. 155-163.

21. Frank, L.A. Bioluminescent immunoassay for alphafetoprotein using theл i

22. Ca -activated photoprotein obelin / L.A. Frank, E.C. Vysotski // In: J.W. Hastings, L.J. Kricka, P.E. Stanley eds. Bioluminescence & Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons. Chichester: John Wiley. 1997.-P. 435-438.

23. Frank, L.A. Bioluminescent immunoassay of thyrotropin and thyroxin using the obelin as a label / L.A. Frank, A.I. Petunin, E.C. Vysotski // Anal. Biochem. 2004. - Vol. 325. - P. 240-246.

24. Frank, L.A. Use of proZZ-obelin protein in bioluminescent immunoassay / L.A. Frank, V.A. Illarionova, E.S. Vysotski / Biochem. Biophys. Res. Commun. 1996. - Vol. 219. - P. 475-479.

25. Galvan, В., Bioluminescence hybridization assays using recombinant aequorin. Application to the detection of prostate-specific antigen mRNA / B. Galvan, Т.К. Christopoulos // Anal. Chem. 1996. - Vol. 68. - P. 35453550.

26. Glynou, K. Affinity capture-facilitated preparation of aequorin-oligonucleotide conjugates for rapid hybridization assay / K. Glynou, P.C. Ioannou, Т.К. Christopoulos // Bioconjugate Chem. 2003. - Vol. 14. - P. 1024-1029.

27. Green, N.M. Spectophotometric determination of avidin and biotin / N.M. Green // Methods Enzimol. 1970. - V.15A. -P.418-424.

28. Guenthner, P.C. Quantitative, competitive PCR assay for HIV-1 using a microplate-based detection system / P.C. Guenthner, C.E. Hart // Biotechniques 1998.-Vol. 24.-No. 5.-P. 810-816.

29. Hastings, J.W. Total quantum flux of isotopic sources / J.W. Hastings, G. Weber // J. Opt. Soc. Am. 1963. -V. 53. - P. 1410-1415.

30. Hauber, R. New, sensitive, radioactive-free bioluminescence-enhanced detection system in protein blotting and nucleic acid hybridization / R. Hauber, W. Miska, L. Schleinkofer, R. Geiger // Biolum. Chemilum. 1989. -Vol. 4.-P. 367-372.

31. Hori, K. Structure of native Renilla reinformis luciferin / K. Hori, H. Charbonneau, R.C. Hart, M.J. Cormier //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1977. -Vol. 74.-P. 4285-4287.

32. Inouye, S. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca -activated photoprotein, clytin / S. Inouye, F.I. Tsuji // FEBS Letters. 1993. - Vol. 315.-P. 343-346.

33. Inouye, S. Cloning and sequence analysis of cDNA for the luminescenct protein aequorin / S. Inouye, M. Noguchi, Y. Sakaki, Y. Takagi, T. Miyata, S. Iwanaga, F.I. Tsuji // Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1985. - Vol. 82. - P. 3154-3158.

34. Jablonski, E. The preparation of bacterial luciferase conjugates for immunoassay and application to rubella antibody detection / E. Jablonski // Anal. Biochem. 1985.-Vol. 148.-P. 199-206.

35. Jackson, R.J. Lumonometry: a novel bioluminescent immunoassay enhances the quantitation of mucosal and systematic antibody responses / R.J. Jackson, K. Fujihashi, H. Kiyono, J.R. McGhee // J. Immunol. Methods -1996.-Vol. 190.-P. 189-197.

36. Konstantou, J. Genotyping of single nucleotide polymorphisms by primer extension reaction and dual-analyte bio/chemiluminometric assay / J. Konstantou, P.C. Ioannou, Т.К. Christopoulos // Anal. Bioanal. Chem. -2007.-Vol. 388. -P.1747-1754.

37. Kricka, L. Clinical and biochemical applications of luciferases and luciferins /L.Kricka//Anal. Biochem.-1988. Vol. 175.-P. 14-21.

38. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of the bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - Vol. 227. -P. 680-685.

39. Laios, E. Enzyme-amplified aequorin-based bioluminometric hybridization assays / E. Laios, P.C. Ioannou, Т.К. Christopoulos // Anal.Chem. 2001. -Vol. 73.-P. 689-692.

40. Laios, E. Novel hybridization assay configurations based on in vitro expression of DNA reporter molecules / E. Laios, P.C. Ioannou, Т.К. Christopoulos//Clin. Biochem. 1998.-Vol. 31.-No. 3.-P. 151-158.

41. Law, G.H.E. Mutagenesis of solvent-exposed amino acids in Photinus pyralis luciferase improves thermostability and pH-tolerance / G.H.E. Law, O.A. Gandelman, L.C Tisi, C.R. Lowe, J.A.H. Murray // Biochem.J. 2006. -Vol. 397.-P. 305-312.

42. Lewis, J.C. Bioluminescence and secondary structure properties of aequorin mutants produced for site-specific conjugation and immobilization / J.C. Lewis, J.J. Lopez-Moya, S. Daunert // Bioconjugate Chem. 2000. - Vol. 11.-P. 65-70.

43. Loening, A.M. Consensus guided mutagenesis of Renilla luciferase yields enhanced stability and light output / A.M. Loening, T.D. Fenn, A.M. Wul, S.S. Gambhir // Protein Eng. Des. Sel. 2006. - Vol. 19. - P. 391-400.

44. Lomzov, A.A. Influence of Na2+ and Mg2+ ions on terminal stability of oligonucleotide duplexes / A.A. Lomzov, D.V. Pyshnyi // J. Biomol. Struct. Dyn. 2007. - V. 24. - No. 6. - P. 679-680.

45. Manukhov, V. Folding and refolding of thermolabile and thermostable bacterial luciferases: the role of DnaKJ heat-shock proteins / V. Manukhov, G.E. Eroshnikov, M.Yu. Vyssokikh, G.B. Zavilgelsky // FEBS Letters. -1999. Vol. 448. - P. 265-268.

46. Matveev, S.V. Genetically engineered obelin as a bioluminescent label in an assay for a peptide / S.V. Matveev, J.C. Lewis, S. Daunert // Anal. Biochem. 1999. - No. 270. - P. 69-74.

47. Mirasoli, M. Bioluminescence immunoassay for Cortisol using recombinant aequorin as a label / M. Mirasoli, S.K. Deo, J.C. Lewis, A. Roda, S. Daunert // Anal. Biochem. 2002. - No. 306. - P. 204-211.

48. Мопп, J.G. Coelenterate bioluminescence / J.G. Morin // Coelenterate biology. Reviews and New Perspectives — N.Y.: Acad. Press. — 1974. -P.397-438.

49. Prasher, D. Cloning and expression of cDNA coding for aequorin, a bioluminescent calcium-binding protein / D. Prasher, R.O. McCann, M.J. Cormier // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1985. - Vol. 126. - P. 12591268.

50. Reading, N.S. Engineering a disulfide bond in recombinant manganese peroxidase results in increased thermostability / N.S. Reading, S.D. Aust // Biotechnol. Prog. 2000. - Vol. 16. - P. 326-333.

51. Shatz, P.J. Use of peptide libraries to map the substrate specifity of peptide modifying enzyme: a 13 residue consensus peptide biotinylation in Escherichia coli / P.J. Shatz // Biotechnology 1993. - Vol. 11. - P. 11381143.

52. Shimomura, О. Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Halistaura / O. Shimomura, F.H. Johnson, Y.Saiga // J. Cell. Сотр. Physiol. 1963. -V. 62. - P. 9-15.

53. Shimomura, O. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea / O. Shimomura, F.H. Johnson, Y.Saiga // J. Cell. Сотр. Physiol. 1962. - V. 59.-P. 223-239.

54. Siddiqi, A.M. Evaluation of electrochemiluminescence- and bioluminesce-based assays for quantitating specific DNA / A.M. Siddiqi, V.M. Jennings, M.R. Kidd, J.K. Actor, R.L. Hunter // J. Clin. Lab. Anal. 1996. - Vol. 10. -P. 423.

55. Smith, D.F. Recombinant aequorin, a bioluminescent signal for molecular diagnostics / D.F. Smith, N.L. Stults, M.J. Cormier, J.K. Actor // J. Clin. Ligand Assay 1999. - Vol. 22. - P. 158-172.

56. Song, X. Quantitation of Chlamidia trachomatis 16S rRNA using NASBA amplification and a bioluminescent microtiter plate assay / X. Song, B.K. Coombes, J.B. Mahony // Comb. Chem. High Throughput Screen. 2000. -Vol.3.-P. 303-313.

57. Stults, N.L. Use of recombinant biotinylated aequorin in microtiter and membrane-based assays: purification of recombinant apoaequorin from

58. Escherichia coli / N.L. Stults, N.F. Stocks, H. Rivera, J. Cray, R.O. McCann, D. O'Kane, R.D. Cummings, M.J. Cormier, F. Smith // Biochemistry 1992.-Vol. 31.-P. 1433-1442.

59. Tannous, B.A. Combined flash- and glow-type chemiluminescent reactions for high-throughput genotyping of biallelic polymorphisms / B.A. Tannous, M. Verhaegen, Т.К. Christopoulos, A. Kourakli // Anal. Biochem. 2003. -Vol. 320. -P.266-272.

60. Tatsumi, H. Construction of biotinylated firefly luciferases using biotin acceptor peptides / H. Tatsumi, S. Fukuda, M. Kikuchi, Y. Koyama // Anal. Biochem. 1996. -V. 243. - P. 176-180.

61. Tsuzuki, K. Thermostable mutants of the photoprotein aequorin obtained by in vitro evolution / K. Tsuzuki, L. Tricoire, O. Courjean, N. Gibelin, J. Rossier, B. Lamboler // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280. - P. 34324-34331.

62. Verhaegen, M. Bacterial expression of in v/vo-biotinylated aequorin for direct application to bioluminometric hybridization assays / M. Verhaegen, Т.К. Christopoulos // Anal. Biochem. 2002. - V. 306. - P. 314-322.

63. Ward, W.W. Extraction and purification of calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroe ovata / W.W. Ward, H.H. Seliger//Biochemistry-1974.-V. 13.-P. 1491-1499.

64. White, S.R. Signal amplification system for DNA hybridization assays based on in vitro expression of a DNA label encoding apoaequorin / S.R. White, Т.К. Christopoulos // Nucleic Acids Research 1999. - Vol. 27. - No. 19. -e25.

65. Wilchek, M. Avidin-biotin technology ten years on: has it lived up to its expectations / M. Wilchek, E.A. Bayer // Trends Biochem. Sci. 1989. -Vol. 14. - No. 10. - P. 408-412.

66. Xiao, L. Quantitation of RT-PCR amplified cytokine mRNA by aequorin-based bioluminescence immunoassay / L. Xiao, Y. Chumfu, C.O. Nelson // J. Immunol. Methods 1996. - Vol. 199. - P. 139-147.