Эпитопное картирование С-концевого домена ангиотензин-превращающего фермента человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Наперова, Ирина Александровна

• Наперова, Ирина Александровна
• кандидат химических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат химических наук Наперова, Ирина Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1. МЕТОДЫ ЭПИТОПНОГО КАРТИРОВАНИЯ.

1.1. Общая характеристика антител и антигенов.

1.2. Определение эпитопов связывания мопоклональных антител методами PEP SCAN, Domain Scan, Matrix Scan.

1.3. Использование фаговых библиотек.

1.4. Определение антигенных детерминант с помощью масс-спектрометрии.

1.5. Сайт-направленный мутагенез.

1.6. Определение кристаллической структуры комплексов антиген-антитело

2. АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИЙ ФЕРМЕНТ.

2.1. Физиологическая значимость ангиотензин-превращающего фермента.

2.2. Структура ангиотензин-превращающего фермента.

2.3. Гликозилирование ангиотензин-превращающего фермента.

2.4. Трехмерная структура доменов ангиотензин-превращающего фермента

3. ЭПИТОПНОЕ КАРТИРОВАНИЕ МОЛЕКУЛЫ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.

3.1. Предсказание эпитопов связывания моноклональных антител на поверхности доменов АПФ с помощью метода PEPSCAN.

3.2. Выявление антигенных детерминант на поверхности ангиотензин-превращающего фермента.

3.3. Локализация эпитопов связывания моноклональных антител, специфичных к N-домепу ангиотензин-превращающего фермента.

3.3.1. Локализация эпитопа связывания м Ат 3 А5.

3.3.2. Локализация эпитопа связывания мАт 9В9.

3.3.3. Локализация эпитопов связывания мАт 3G8.

3.3.4. Локализация эпитопов связывания мАт i2H5, 1G12 и 6А12.

3.3.5. Локализация эпитопа связывания мАт 5F1.

3.4. Использование моноклональных антител к N-домену при изучении структуры и функционирования ангиотензин-превращающего фермента

3.4.1. Исследование возможной связи между димеризацией и шеддингом ангиотензин-превращающего фермента с поверхности клеточных мембран.

3.4.2. Изучения каталитической активности N-домена ангиотензин-превращающего фермента.

3.4.3. Изучение конформационных изменений соматического ангиотензин-превращающего фермента при взаимодействии с ингибитором.

3.5. Картирование эпитопа связывания моноклональных антител 1ВЗ.

3.5.1. Локализация эпитопов связывания моноклональных антител 1ВЗ

3.5.2. Использование моноклональных антител 1ВЗ.

3.6. Эпитопное картирование денатурированного тАПФ.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

4.1. Материалы.

4.2. Методы.

4.2.1. Выделение и очистка соматического ангиотензин-превращающего фермента.

4.2.2. Выделение и очистка тестикулярного ангиотензин-превращающего фермента.

4.2.3. Фазовое разделение ангиотензин-превращающего фермента в присутствии тритона Х-114.

4.2.4. Определение активности ангиотензин-превращающего фермента

4.2.5. Определение концентрации активных центров ангиотензин-превращающего фермента.

4.2.6. Модификация ангиотензин-превращающего фермента.

4.2.7. Подбор оптимальных концентраций фермента и моноклональных антител для иммуносорбции.

4.2.8. Характеристика связывания моноклональных антител с разными формами ангиотензин-превращающего фермента.

4.2.9. Определение констант связывания моноклональных антител с тестикулярным ангиотензин-превращающим ферментом.

4.2.10. Выявление моноклональных антител, обладающих ингибирующей активностью по отношению к тестикулярному ангиотензин-превращающему ферменту.

4.2.11. Определение конкуренции моноклональных антител за связывание с ангиотензин-превращающим ферментом.

4.2.12. Эпитопное картирование поверхности С-домена АПФ.

4.2.13. Оценка площади поверхности фермента, покрываемой олигосахаридом.

4.2.14. Моделирование открытой конформации С-домена ангиотензин-превращающего фермента.

4.2.15. MALDI-TOF.

4.2.16. Построение модели двудоменного ангиогензин-превращающего фермента.

4.2.17. Статистическая обработка результатов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

5. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНКУРЕНЦИИ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ЗА СВЯЗЫВАНИЕ С С-ДОМЕНОМ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА ЧЕЛОВЕКА.

5.1. Подбор оптимальных условий для иммуносорбции.

5.2. Определение связывания панели моноклональных антител с тестикулярным ангиотензин-превращающим ферментом.

5.3. Определение констант диссоциации комплексов моноклональных антител с тестикулярным ангиотензин-превращающим ферментом.

5.4. Определение конкуренции моноклональных антител за связывание с тестикулярным ангиотензин-превращающим ферментом.

6. ЭПИТОПНОЕ КАРТИРОВАНИЕ С-ДОМЕНА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.

6.1. Сравнение связывания моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом из различных организмов.

6.2. Сравнение связывания моноклональных антител с химерами и мутантами ангиотензин-прсвращающего фермента.

7. МОДЕЛИРОВАНИЕ ОТКРЫТОЙ КОНФОРМАЦИИ С-ДОМЕНА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.

8. ПРЕДСКАЗАНИЕ СТРУКТУРЫ ДВУДОМЕННОГО АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА.

9. ВЛИЯНИЕ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ НА СВЯЗЫВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИМ ФЕРМЕНТОМ.

9.1. Моделирование углеводных остатков на поверхности молекулы ангиотензин-превращающего фермента.

9.2. Определение связывания моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом из различных тканей и биологических жидкостей.

9.3. Десиалирование и дегликозилирование ангиотензин-превращающего. фермента.

9.4. Выявление сайтов гликозилирования ангиотензин-превращающего фермента с помощью MALDI-TOF масс-спектрометрии.

10. СВЯЗЫВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ С АНГИОТЕНЗИН

ПРЕВРАЩАЮЩИМ ФЕРМЕНТОМ ПРИ РАЗВИТИИ ПАТОЛОГИИ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Эпитопное картирование С-концевого домена ангиотензин-превращающего фермента человека»

Моноклональные антитела благодаря их селективности и чувствительности являются чрезвычайно важным инструментом при исследовании структурно-функциональных особенностей белков. В фундаментальных исследованиях моноклональные антитела используются для идентификации и локализации белков, для дифференциации клеток различных типов, для очистки белка или для исследования экспрессии белков [1]. На практике моноклональные антитела находят применение как биохимические и клеточные маркеры, в диагностике и терапии [2]. Эпитопное картирование — определение областей на поверхности белковой глобулы, к которым специфичны различные моноклональные антитела - является важным шагом для характеристики взаимодействия антигеп-антитело. Картирование важно для определения специфичности антител [3, 4], для предсказания перекрестной реактивности [5], при разработке вакцин и дизайне лекарственных средств [6-8], а также для понимания фундаментальных аспектов белок-белковых взаимодействий [911].

Объектом исследования в настоящей работе является ангиотензин-превращающий фермент. Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, пептидил-дипептидаза А, КФ 3.4.15.1) - Zn2+-3aBHCHMaa пептидаза, состоящая из одной полипептидной цепи, которая содержит два домена (N- и С-домены), при этом каждый домен содержит каталитически активный центр [12]. АПФ является одним из главных регуляторов кровяного давления и содержания вазоактивных пептидов в организме [13, 14]. Также АПФ вовлечен в метаболизм нейропептидов, иммунную и репродуктивную функции [15, 16]. В настоящее время установлены структуры отдельных доменов АПФ [17, 18], но структура полноразмерного фермента пока неизвестна.

Ранее была получена панель из 8 моноклональных антител к N-домепу АПФ и идентифицированы эпитопы связывания этих антител на поверхности белка [19-22]. Работы по эпигопному картированию N-домена продемонстрировали важный исследовательский, диагностический и даже терапевтический потенциал данных антител. Моноклональные антитела были успешно использованы для количественного определения АПФ в растворе методом ELISA [23] и на поверхности клеток жидкостной цитометрией [24], для исследования структуры и функций АПФ [19, 22], для доставки ферментов к легочному эндотелию, как метод диагностики лсгочно-сосудистых заболеваний [25, 26]. С помощью иммунопреципитации клеток моноклональными антителами ВВ9 было показано [27], что АПФ экспрессируется гематопоэтическими клетками на всех стадиях гематопоэза. Таким образом, возможно, АПФ участвует в физиологической регуляции гематопоэза.

Известно, что в крови людей содержатся в низких концентрациях антитела практически ко всем группам эндогенных антигенов. Эти антитела являются естественными антителами. При повышении уровня белка происходит индукция иммунологических механизмов, что может приводить к повышению уровня естественных антител к этому белку. Известно, что при развитии некоторых патологий в крови увеличивается уровень естественных антител к АПФ [28-31]. Таким образом, данные антитела являются индикатором развития патологии. С помощью эпитопного картирования моноклональных антител можно очертить области на поверхности фермента, в которых расположены эпитопы естественных антител. Не исключено, что при развитии разных патологий изменяется уровень естественных антител, специфичных к разным частям молекулы фермента, что, возможно, даст шанс понять развитие данных заболеваний на молекулярном уровне, а также применить полученные знания для диагностики этих патологий.

Данная работа является продолжением изучения иммунологических свойств фермента. Целью работы явилось эпитопное картирование С-домена ангиотензин-превращающего фермента с помощью панели из 8 моноклональных антител.

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Наперова, Ирина Александровна

выводы

1. Определено связывание 8 моноклональных антител с тестикулярным АПФ, выявлены антитела 4ЕЗ, ингибирующие активность тАПФ, определены константы диссоциации комплексов мАт 1ВЗ, 1В8, 2Н9 и 3F11 с нативным тАПФ, мАт 1В8 и 2Н9 с рекомбинантным тАПФ и мАт 1В8 с С-домепом в составе соматического АПФ.

2. Определено расположение эпитопов связывания 8-ми моноклональных антител на поверхности С-домена ангиотензин-превращающего фермента человека па основе конкуренции антител к С-домену АПФ человека за связывание с тестикулярным АПФ, сравнения аминокислотных последовательностей С-доменов АПФ из различных организмов и анализа связывания антител с АПФ из различных организмов, а также анализа связывания моноклональных антител с различными химерами и мутантами фермента.

3. Проведен анализ связывания моноклональных антител с С-доменом и двудоменным АПФ, выявлены мАт 1Е10, эпитоп связывания которых на поверхности С-домена экранирован N-доменом в составе полноразмерного фермента, выявлены мАт, эпитопы которых на разных доменах АПФ пространственно сближены друг по отношению к другу в составе полноразмерного фермента. Предложена модель двудоменного АПФ.

4. Показаны различия в связывании моноклональных антител с нативным и рекомбинантным тестикулярным АПФ, а также с АПФ из различных тканей и биологических жидкостей человека.

5. Выявлены различия в связывании моноклональных антител с АПФ из сыворотки крови в норме и при развитии саркоидоза и болезни Гоше.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Наперова, Ирина Александровна, 2009 год

1. Zola, Н. Monoclonal antibodies (2000) Springer-Verlag, New York, 1-10.

2. Irving, M.B., Pan, O., Scott, J.K. Random-peptide libraries and antigen-fragment libraries for epitope mapping and the development of vaccines and diagnostics (2001) Curr. Opin. Chem. Biol., 5, 314-324.

3. Staindl, В., Berger, P., Kofler, R., Wick, G. Monoclonal antibodies against human, bovine and rat prolactin: epitope mapping of human prolactin and development of a two-site immunoradiometric assay (1987) J. Endocrinol., 114, 311-318.

4. Castric, P.A., Cassels, F.J. Peptide epitope mapping in vaccine development: introduction (1997) J. Ind. Microbiol. Biotechnol., 19, 56-57.

5. Mullen, L.M., Nair, S.P., Ward, J.M., Rycroft, A.N., Henderson, B. Phage display in the study of infectious diseases (2006) Trends Microbiol., 14, 141-147.

6. Chao, G., Cochran, J.R., Wittrup, K.D. Fine epitope mapping of anti-epidermal growth factor receptor antibodies through random mutagenesis and yeast surface display (2004) J. Mol. Biol., 342, 539-550.

7. Davies, D.R., Cohen, G.FI. Interactions of protein antigens with antibodies (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93, 7-12.

8. Soubrier, F., Alhenc-Gelas, F., Hubert, C., Allegrini, J., John, M., Tregear, G., Corvol, P. Two putative active centers in human angiotensin I-converting enzyme revealed by molecular cloning (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 9386-9390.

9. Erdos, E.G., Skidgel, R.A. The angiotensin I-converting enzyme (1987) Lab. Invest., 56, 345-348.

10. Soffer, R.L., El-Dorry, H.A. Angiotensin-converting enzyme: immunologic, structural, and developmental aspects (1983) Fed. Proc., 42, 2735-2739.

11. Suzuki, Y., Ruiz-Ortega, M., Lorenzo, O., Ruperez, M., Esteban, V., Egido, J. Inflammation and angiotensin 7/(2003) Int. J. Biochem. Cell Biol., 35, 881-900.

12. Corradi, H.R., Schwager, S.L.U., Nchinda, A.T., Sturrock, E.D., Acharya, K.R. Crystal structure of the N domain of human angiotensin I-converting enzyme providesa structural basis for domain-specific inhibitor design (2006) J. Mol. Biol., 357, 964974.

13. Natesh, R., Schwager, S.L.U., Sturrock, E.D., Acharya, K.R. Crystal structure of the human angiotensin-converting enzyme-lisinopril complex (2003) Nature, 421, 551554.

14. Danilov, S.M., Savoie, F., Lenoir, В., Jeunemaitre, X., Azizi, M., Tamow, L., Alhenc-Gelas, F. Development of enzyme-linked immunoassays for human angiotensin I converting enzyme suitable for large-scale studies (1996) J. Hypertens., 14, 719-727.

15. Muzykantov, V.R., Danilov, S.M. Targeting of radiolabeled monoclonal antibody against angiotensin-converting enzyme to the pulmonary vasculature (1995) In Handbook of targeting delivery of imaging agents,

16. Егоров, A.M., Осипов, А.П., Дзантиев, Б.Б., Гаврилова, E.M. Теория и практикаиммуноферментного анализа (1991) Высшая школа, Москва, 9-33.

17. Ройт, А., Бростофф, Д., Мейл, Д. Иммунология (2000) Мир, Москва, 100-105.

18. Галактионов, В.Г. Иммунология (2004) Академия, Москва, 63-73.

19. Бутеренко, Р.Г., Гусев, М.В., Киркин, А.Ф. Биотехнология. Клеточнаяинженерия (1987) Высшая школа, Москва, 96-119.

20. Geysen, Н.М., Meloen, R.H., Barteling, S.J. Use of peptide synthesis to probe viral antigens for epitopes to a resolution of a single amino acid (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81, 3998-4002.

21. Carter, J.M. Epitope mapping of a protein using the Geysen (PEPSCAN) procedure (1994) Methods Mol. Biol., 36, 207-223.

22. Bodjo, S.C., Kwiatek, O., Diallo, A., Albina, E., Libeau, G. Mapping and structural analysis of B-cell epitopes on the morbillivirus nucleoprotein amino terminus (2007) J. Gen. Virol., 88, 1231-1242.

23. Smith, G.P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface (1985) Science, 228, 1315-1317.

24. Щелкунов, C.H. Генетическая инэ/сенерия (2004) Сибирское университетское издательство, Новосибирск, 196-204.

25. An, T.Q., Zhou, Y.J., Qiu, H.J., Tong, G.Z., Wang, Y.F., Liu, J.X., Yang, J.Y. Identification of a novel В cell epitope on the nucleocapsid protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by phage display (2005) Virus Genes, 31,81-87.

26. Schwyzer, M., Weil, R., Frank, G., Zuber, H. Amino acid sequence analysis of fragments generated by partial proteolysis from large simian virus 40 tumor antigen (1980) J. Biol. Chem., 255, 5627-5634.

27. Sheshberadaran, H., Payne, L.G. Protein antigen-monoclonal antibody contact sites investigated by limited proteolysis of monoclonal antibody-bound antigen: protein "footprinting" (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 1-5.

28. Suckau, D., Kohl, J., Karwath, G., Schneider, K., Casaretto, M., Bitter-Suermann, D., Przybylski, M. Molecular epitope identification by limited proteolysis of an50,51.52,53,54,55,56