Поиск эндогенных эффекторов ангиотензин-превращающего фермента в плазме крови человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат наук Крюкова Ольга Владимировна

• Крюкова Ольга Владимировна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Крюкова Ольга Владимировна

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕМ ФЕРМЕНТЕ

2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ИЗМЕНЕНИЙ ПОВЕРХНОСТИ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

3. ЭНДОГЕННЫЕ ЭФФЕКТОРЫ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

3.1. Ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента, способные поступать в организм человека с

продуктами питания

3.2. Эндогенные ингибиторы ангиотензин-превращающего фермента

3.3. Эндогенные активаторы ангиотензин-превращающего фермента

3.4. Эффектор, способный связываться с ангиотензин-превращающим ферментом, но не обладающий ингибирующим или активирующим действием на фермент

4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Материалы

4.2. Методы исследования

4.2.1. Синтез аффинного сорбента

4.2.2. Выделение и очистка соматического ангиотензин-превращающего фермента

4.2.3. Определение активности соматического ангиотензин-превращающего фермента

4.2.5. Определение концентрации активных молекул выделенных соматических ангаотензин-превращающих ферментов из разных источников

4.2.6. Иммобилизация соматического ангиотензин-превращающего фермента быка

4.2.7. Определение связывания моноклональных антител c ангиотензин-превращающим ферментом

4.2.8. Диализ плазмы крови человека и раствора рекомбинантного соматического ангиотензин-превращающего фермента человека

4.2.9. Определение влияния разбавления плазмы крови и тушения компонентами плазмы на активность АПФ человека

4.2.10. Ультрацентрифугирование образцов плазмы крови человека на фильтрах с различным диаметром пор мембраны

4.2.11. Ингибирование активности очищенного ангиотензин-превращающего фермента и отдельных доменов фермента под действием фильтратов плазмы

4.2.12. Ингибирование активности очищенного гиотензин-превращающего фермента эналаприлатом и тепротидом

4.2.13. Хроматография 3 кДа фильтратов плазмы крови человека на колонке PeptideSuperdex 10/300

4.2.14. Оценка площади поверхности фермента, покрываемой олигосахаридом

4.2.15. Десиалилирование ангиотензин превращающего фермента

4.2.16. Протеолиз ангиотензин превращающего фермента и масс-спектрометрия

4.2.17. Определение возможности ингибирования АПФ быка билирубином

4.2.18. Статистическая обработка результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

5. ПОЛУЧЕНИЕ И ХАРАКТЕРИСТИКА ПУЛА ПЛАЗМЫ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА И ОЧИЩЕННЫХ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩИХ ФЕРМЕНТОВ ИЗ РАЗНЫХ ИСТОЧНИКОВ

5.1 Подготовка пула плазмы крови

5.2. Выделение и очистка ангиотензин-превращающего фермента из разных источников

6. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРИРОДЫ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА НА ЕГО КАТАЛИТИЧЕСКИЕ И КОНФОРМАЦИОННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ

6.1. Активность и ингибирование ангиотензин-превращающего фермента из семенной жидкости и из

легких

6.2. Иммунологическая характеристика ангиотензин-превращающего фермента из легких и семенной жидкости человека

6.3. Определение сайтов Ы-гликозилирования в ангиотензин-превращающем ферменте из легких и из семенной жидкости

6.4 Сравнительная оценка влияния компонентов биологических жидкостей на конформацию поверхности

ангиотензин-превращающего фермента из легких и семенной жидкости

7. ПОИСК ЭНДОГЕННЫХ ИНГИБИТОРОВ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

7.1 Влияние разбавления плазмы крови человека на определяемую активность ангиотензин-

превращающего фермента

7.2. Влияние диализа на активность ангиотензин-превращающего фермента в плазме крови человека

7.3. Влияние фильтрования на мембранах c различной пропускной способностью на активность ангиотензин-превращающего фермента в составе плазмы крови человека

7.4. Ингибирование отдельных доменов ангиотензин-превращающего фермента 3кДа фильтратом плазмы крови человека

8. ПОИСК ЭНДОГЕННЫХ ЭФФЕКТОРОВ, ВЛИЯЮЩИХ НА КОНФОРМАЦИЮ ПОВЕРХНОСТИ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА В ПЛАЗМЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА

8.1. Определение влияния разбавления плазмы крови на эффективность связывания моноклональных

антител с ангиотензин-превращающим ферментом в составе плазмы крови человека

8.2. Определение влияния очистки ангиотензин-превращающего фермента из плазмы крови на связывание моноклональных антител

8.3. Проверка возможной видовой специфичности эндогенного эффектора, содержащегося в плазме крови человека

8.4. Влияние диализа на связывание моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом в составе плазмы крови человека

8.5. Влияние ультрафильтрации плазмы крови на фильтрах с различной пропускной способностью мембран на эффективность связывания моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом в составе плазмы

8.6. Влияние фильтратов плазмы на связывание моноклональных антител с очищенным ангиотензин-превращающим ферментом человека

8.7. Определение связывания моноклональных антител с ангиотензин-превращающим ферментом при добавлении фильтратов и экзогенных ингибиторов к плазме крови

9. ИДЕНТИФИКАЦИЯ ЭФФЕКТОРОВ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

9. Характеристика низкомолекулярного эффектора в плазме крови человека

9.2 Разделение компонентов 3 кДа фильтрата плазмы крови методом гель-фильтрацией

9.4. Анализ фракций

9.5. Определение возможности ингибирования ангиотензин-превращающего фермента быка билирубином

9.6. Разделение смеси билирубина, эналаприлата и тепротида методом гель-фильтрацией

9.7. Влияния билирубина на связывание панели мАт с ангиотензин-превращающим ферментом

9.8. Высокомолекулярныйэффектор ангиотензин-превращающего фермента в плазме крови человека

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АПФ - ангиотензинЛ-превращающий фермент; СНО - клетки яичников китайского хомячка;

Хепес (Hepes) - 4-(2-гидроксиэтил)-1 -пиперазинэтансульфоновая кислота;

FA-Phe-Gly-Gly (FPGG) - Na-3-(2-фурил)-акрилоил-L-фенилаланил-L-глицил-L-глицин;

Cbz-Phe-His-Leu (ZPHL)-карбобензокси-L-фенилаланил-L-гистидил-L-лейцин;

Hip-His-Leu (HHL) - гиппурил-L-гистидил-L-лейцин;

His-Leu (КЬ)-Ь-гистидил-Ь-лейцин;

БСА - бычий сывороточный альбумин;

ЧСА - человеческий сывороточный альбумин;

мАт- моноклональные антитела;

Ds-Na - додецилсульфат натрия;

wtД - рекомбинантный фермент, без якоря;

Ds-Na - додецилсульфат натрия

Лизиноприл - (8)-Ма-(1-карбокси-3-фенилиропил)-Ь-лизил-Ь-пролин Эналаприлат - (25)-1 -[(25)-2-{[(18)-1 -карбокси-3 -фенилпропил] амино }пропаноил] -пирролидин-2-карбоновая кислота Тепротид - <Glp-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro

Буфер А - 50мМ фосфатный буфер, содержащий 0,15 М №С1, 1 мкМ ZnCl2,рН 7,5; Буфер Б - 50мМ боратный буфер, рН 9,5;

Буфер В - 50 мМ Hepes-буфер, содержащий 150 мМ NaCl и 1 мкМ ZnCl2, pH 7,5; Буфер Г - 100мМ фосфатный буфер, содержащий 0,3 М №С1 и 1мкМ ZnСl2, рН 8,3; Буфер Д - 100 мМ Hepes-буфер, содержащий 150 мМ №С! и 1 мкМ ZnCl2, pH 7,5;

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Поиск эндогенных эффекторов ангиотензин-превращающего фермента в плазме крови человека»

ВВЕДЕНИЕ

Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, пептидил-дипептидаза А, КФ 3.4.15.1) является одним из важнейших составляющих и связующим звеном ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем. Его тщательное и многолетнее исследование вызвано участием этого фермента в многочисленных процессах, связанных с регуляцией кровяного давления, кроветворением, репродукцией, нейромедиаторной функцией и т.д. Сегодня фармацевтическая промышленность выпускает в огромном количестве ингибиторы АПФ в качестве эффективных лекарственных гипотензивных средств.

Экзогенные ингибиторы АПФ поступают в организм человека в различных вариантах (как в виде специально принимаемых лекарств, так и с пищей), однако имеются сведения о существовании и эндогенных ингибиторов, которые для некоторых млекопитающих были даже выделены. Можно предполагать, что они служат для того, чтобы часть активности АПФ в организме была «непроявленной», а смещение равновесия «фермент-ингибитор» протекало при физиологической необходимости или в случае патологий. Не исключено также, что, помимо влияния на собственно активность фермента, при связывании эндогенных ингибиторов могут изменяться и физиологические функции АПФ, напрямую не связанные с пептидазной активностью. Более того, вероятно, что АПФ в различных тканях, а также в составе биологических жидкостей, способен образовывать комплексы с другими белками и низкомолекулярными соединениями не являющиеся ингибиторами, которые тем не менее способны модулировать физиологические функции фермента.

Поэтому проблема доказательства существования эндогенных ингибиторов и эффекторов АПФ в организме человека, определение их природы для подробного исследования является чрезвычайно актуальной. Именно в рамках этой проблемы и проведена данная работа.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ ОБ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕМ ФЕРМЕНТЕ

Ангиотензин-превращающий фермент (АПФ, пептидил-дипептидаза А, КФ 3.4.15.1) -цинк-металлопептидаза, относящаяся к классу глюцинкинов, интегральный мембранный белок типа I, располагающийся на мембране с помощью трансмембранного якоря с С-конца полипептидной цепи. АПФ функционирует в организме в основном как пептидил-дипептидаза, отщепляя С-концевые дипептиды у ангиотензина I и брадикинина, являющихся компонентами ренин-ангиотензиновой и калликреин-кининовой систем, соответственно. Отщепление С-концевого дипептида от вазонеактивного ангиотензина I приводит к образованию октапептида ангиотензина II, который является одним из наиболее важных констрикторов-то есть вызывающих спазмы кровеносных сосудов. Катализируемое АПФ последовательное удаление двух С-концевых дипептидов приводит к деградации вазоактивного нонапептида брадикинина, который вызывает расслабление стенок кровеносных сосудов и увеличение проницаемости капилляров. Таким образом, основная и наиболее известная функция АПФ в организме заключается в регуляции кровяного давления, как общего, так и местного [1,2]. Физиологическая значимость АПФ определяет широкое применение его ингибиторов в терапевтической практике для лечения гипертонии и сердечно-сосудистой недостаточности [3].

Помимо регуляции артериального давления АПФ принимает участие и в других физиологических процессах. АПФ расщепляет такие пептиды, как вещество Р [4], нейротензин [4], люлиберин [5], отрицательный регулятор гемопоэза (АсББКР) [6], бета-амилоидный пептид [7] и др. Таким образом, АПФ вовлечен в работу центральной нервной системы, в регуляцию эмоций, передачу болевого сигнала, в течение воспалительных, иммунных процессов и др.

В организме синтезируются две изоформы фермента. Соматическая форма с молекулярной массой от 150 до 180 кДа, состоящая из двух гомологичных доменов (рис 1) экспрессирована в эндотелиальных, эпителиальных и нервных клетках [8-9], выполняет основные физиологические функции АПФ в организме. Также в организме синтезируется и более легкая тестикулярная изоформа с молекулярной массой от 90 до 110 кДа, найденная в сперматозоидах и семенниках (рис 1) [10-11]. Тестикулярный АПФ необходим для репродуктивных функций. Механизмы участия тестикулярного АПФ в оплодотворении пока не выяснены окончательно. Было показано, что у мышей с нокаутом каталитической функции тестикулярного АПФ, но с сохранением его как белка с содержанием,

соответствующим содержанию у нормальных особей, репродуктивная функция резко снижалась, их потомство составляло лишь 4 % от потомства нормы [12].

Соматический НЕ.М.ОН АПФ -и-

Тестикулярный АПФ

М-домен

НЕМОН

НЕМОН —\-/_

ВИ

НЕМОН \/

Клеточная мембрана

Рис. 1. Схематическое представление различных форм ангиотензин-превращающего фермента.

Однако, с другой стороны, не было получено никаких доказательств действия ингибиторов АПФ на репродуктивную функцию у пациентов [13], что может быть связано и с неспособностью полностью ингибировать тестикулярный АПФ взятой в исследовании дозой ингибитора АПФ. Кроме того, была выдвинута гипотеза, что роль тестикулярного фермента в репродуктивной функции может заключаться не в его дипептидазной активности, а другой специфической, а именно, его способности гидролизовать и "слущивать с поверхности" мембранные белки, закрепленные на мембране с помощью гликозилфосфатидилинозитольного (GPI-) якоря [14]. Однако, эта гипотеза была оспорена другими исследованиями [12,15]. Таким образом, точная роль тестикулярного АПФ в репродуктивной функции мужчин остается неизвестной.

Гомология доменов в молекуле АПФ составляет 67-73% (в зависимости от вида), а в центральной части доменов, содержащей цинк-связывающий мотив HEMGH (рис. 1),

идентичность аминокислотных остатков достигает 89%. Полагают, что эта особенность структуры АПФ является результатом дупликации гена, кодировавшего однодоменный фермент [16]. У человека ген АПФ локализован в длинном плече 17 хромосомы [17], он имеет длину порядка 21 тысячи пар нуклеотидов и состоит из 25 интронов и 26 экзонов [18]. Ген кодирует обе изоформы АПФ, как соматическую, так и тестикулярную, при этом транскрипция каждой инициируется разными промоторами. Соматическая изоформа транскрибируется с 5'-конца первого экзона, при этом зрелая мРНК содержит все экзоны с 1 по 26, кроме 13, который удаляется при сплайсинге [18]. Тестикулярный АПФ начинает транскрибироваться с промотора длиной в 91 пару нуклеотидов, находящегося в 12 интроне гена АПФ; его зрелая мРНК содержит экзоны гена АПФ с 13 по 26 [19]. Это позволяет заключить, что в 13 экзоне закодирована уникальная для тестикулярного АПФ последовательность вплоть до 36 аминокислотного остатка, а экзоны с 14 по 26 содержат совпадающую у обеих изоформ последовательность С-домена АПФ. Экзоны 4-11 и 17-24, которые кодируют области К- и С-доменов соответственно, очень близки как по размеру, так и по нуклеотидной последовательности [18].

У АПФ человека в процессе посттрансляционной модификации с К-конца фермента отщепляется сигнальный гидрофобный пептид, состоящий из 29 аминокислот. Оставшиеся аминокислоты подразделяются на следующие участки: С-концевые 30 аминокислот располагаются внутриклеточно и составляют цитоплазматический домен, далее идет гидрофобная трансмембранная последовательность из 19 аминокислот, прикрепляющая верхнюю основную часть белка к поверхности клетки. Верхняя основная часть фермента содержит два гомологичных структурных домена, названных К- и С-доменами и отделенных друг от друга пептидной перемычкой [20]. Между С-доменом и трансмембранным участком, в непосредственной близости от клеточной мембраны, располагается так называемый стебельковый участок (рис 1). Характерной особенностью АПФ является зависимость его активности от присутствия в среде анионов хлора [21 -22]. В своем составе С-домен имеет два потенциальных сайта связывания ионов хлора, в то время, как №домен содержит только один такой сайт. Оба домена содержат три дисульфидных мостика и свободный цистеин [2].

Форма АПФ представляющая собой К-домен белка (рис 1), была обнаружена в значительных количествах в кишечной жидкости больных при хирургических операциях [23]. Вероятно, индивидуальный К-домен АПФ, продуцируется в организме под действием ограниченного протеолиза соматической формы фермента [24-25].

Свои основные физиологические функции АПФ исполняет, будучи закрепленным на клеточной мембране [1]. Однако, при помощи специальной секретазы возможен переход

его из мембраносвязанного состояния в растворимое путем расщепления полипептидной цепи в примембранной области, называемый шеддингом [26-27]. Шеддинг может зависеть от множества причин, таких, например, как связывание фермента на мембране с антителом [28-29] или наличия мутаций АПФ в примембранной области[30-31].

АПФ, находящийся в растворенной форме, присутствует в организме в биологических жидкостях: плазме крови и семенной жидкости [1], лимфе и спинно-мозговой жидкости [32]. Концентрация АПФ в биологических жидкостях является весьма важным клиническим параметром; ее повышение или понижение может сопровождать различные заболевания; так, у пациентов с хронической обструктивной болезнью легких, раком легких, туберкулезом и муковисцидозом был значительно снижен уровень АПФ в сыворотке крови по сравнению с контролем [33], а у пациентов с системными заболеваниями, такими, как саркоидоз [33-34] или болезнь Гоше [35-36] уровень АПФ был сильно повышен.

Кроме того, изменение концентрации АПФ в биологических жидкостях, связанное с нарушением экспрессии гена АПФ, наблюдается при его полиморфизме [37] - наличии или отсутствии Alu-повтора в 16 интроне гена АПФ ([/О полиморфизм). Поскольку этот отрезок расположен в интроне, он удаляется при сплайсинге и не может прямо влиять на активность секретируемого АПФ; тем не менее, средний уровень АПФ в плазме крови у носителей гомозиготного по делеции (ОО) генотипа приблизительно на 60% больше, чем у носителей генотипа, гомозиготного по (II) [37]. Носители гетерозиготного типа имеют промежуточные уровни активности АПФ в крови. Следствием этих наблюдений стало множество работ, связывающих [/О полиморфизм с риском сердечно-сосудистых заболеваний, развитием патологий или осложнением системных заболеваний [38].

Соматический АПФ представляет собой характерный ^гликозилированный гликопротеин, на поверхности белковой глобулы которого расположены олигосахаридные цепи, структура и состав которых, скорее всего, отличаются в АПФ, синтезируемых в разных тканях и у разных видов животных. Последовательность соматического АПФ человека содержит 17 потенциальных сайтов ^гликозилирования, десять - на №домене и семь - на С-домене [8]. В литературе еще мало сведений о структуре и точных позициях гликанов в соматическом АПФ человека из разных тканей. Сообщалось, что в АПФ в составе семенной жидкости семь из 17 потенциальных участков гликозилированы (в частности Asn9). Гликаны в двух сайтах гликозилирования представляли собой высокоманнозные цепи, а пять участков содержали №гликаны комплексного типа, большинство из которых имели биантенную структуру [3 9]. Кроме того, для соматического АПФ из почек человека было показано, что из 17 потенциальных возможных сайтов

гликозилирования 6 сайтов (Asn9, Asn25, Asn82, Asn117, Asn480 и Asn913) точно гликозилированы, при этом все эти сайты гликозилирования располагаются на ^домене, кроме Asn913, располагающегося на С-домене АПФ [40]. Кроме того, сайт Asn1196 на С-домене АПФ оказался негликозилированным. Данных по оставшимся десяти потенциальным сайтам гликозилирования не было получено. Для АПФ плазмы крови человека известно, что три сайта Asn 480, 666 и 685 действительно гликозилированы [41]. Основным поставщиком АПФ в кровь - по-видимому до 75% [42] - являются капилляры легких, что делает возможным предположение о том, что и в АПФ лёгких человека эти три сайта гликозилированы.

Микрогетерогенность гликозилирования по типу и интенсивности гликозилирования, характерная для гликопротеинов, мешала получению кристаллов АПФ и определению их 3Б структуры. К настоящему времени получены кристаллические структуры только отдельных доменов АПФ после того, как были экспрессированы рекомбинантные формы однодоменных АПФ с однородными гликанами [43,44].

Показано, что молекула С-домена АПФ имеет эллипсоидную форму с размерами 72х57х48А. Структура С-домена АПФ содержит 27 спиралей. Лишь 4% аминокислотных остатков составляют 6 относительно коротких Р-листов, два из которых находятся около активного центра. В центральной части белка находится туннель, вытянутый приблизительно на 30А, который разделяет фермент на две части (на два субдомена). В этом туннеле, сформированном четырьмя а-спиралями и одним Р-листом, располагается активный центр. В структуре С-домена были идентифицированы 504 молекулы воды [43]. Ион цинка является необходимым для катализа компонентом АПФ. Как и ожидалось, этот ион, имеющий тетраэдрическое окружение, был обнаружен в активном центре С-домена [43]. Он играет важную роль в связывании субстрата с ферментом, координируя карбонильную группу при гидролизе пептидной связи субстрата под действием фермента. Ион 2п2+ координационно связан с двумя остатками гистидина (рКа боковых групп равно 6,04) и остатком глютаминовой кислоты. Четвертым лигандом иона цинка принято считать молекулу воды из растворителя, однако, в кристаллической структуре С-домена четвертым лигандом оказался ацетат-анион из кристаллизационной среды [43].

Активный центр К-домена так же, как у С-домена, находится внутри глубокого канала [44]. При этом ион цинка активного центра у обоих доменов расположен в наиболее узкой части канала. Данное сужение разделяет канал на две части: в меньшей части (длиною около 8А) связывается отщепляемый С-концевой дипептид субстрата, в более длинной части (длиною около 17А) связывается оставшаяся К-концевая часть субстрата. Возможно, именно длина канала является лимитирующим фактором при связывании и гидролизе длинных

10

пептидов. Кроме того, расположение канонической последовательности His-Glu-Xaa-Xaa-His консервативно в обоих доменах.

Так же как и С-домен, N-домен имеет эллипсоидную форму, посредине глобулы проходит туннель, который делит белок на два субдомена [44]. Структура N-домена состоит из 21 а-спирали, шести 3ю-спиралей и шести антипараллельных Р-листов.

Оба домена в составе соматического АПФ каталитически активны, но неравноценны. Отдельный N-домен обладает более высокой стабильностью при высоких температурах, чем отдельный С-домен или двудоменная форма АПФ [45-46]. Важно, что различная термостабильность доменов позволяет избирательно проводить денатурацию только одного из них (С-) с получением каталитически активного индивидуального N-домена (после протеолиза) или N-домена в составе полноразмерного фермента с денатурированным С-доменом, причем присутствие денатурированного С-домена не оказывало влияния ни на стабильность, ни на каталитические функции N-домена [45]. Таким образом, можно утверждать, что домены в составе молекулы соматического АПФ денатурируют независимо, что свидетельствует об их независимом фолдинге. О независимом фолдинге двух доменов также свидетельствует возможность расщепления пептидной перемычки между доменами без их денатурации [24].

Оба активных центра АПФ гидролизуют широкий круг синтетических и природных пептидных субстратов [1-2,20,46-49]. Как правило, фермент отщепляет дипептид (-ы) с С-конца гидролизуемого субстрата, однако в ряде случаев АПФ способен отщеплять и трипептиды, а также проявлять эндопептидазную активность, как, например, при гидролизе люлиберина, от молекулы которого АПФ отщепляет N-концевой трипептид [5].

Природные субстраты декапептид ангиотензин I и нонапептид брадикинин гидролизуются обоими активными центрами фермента in vitro со сравнимыми скоростями. АПФ способен также расщеплять гемопоэтический пептид N-AcSDKP, являющийся фактором регуляции пролиферации стволовых клеток и стимулирующий ангиогенез [50-51]. Оба домена АПФ человека гидролизуютAcSDKP со значениями Км 31 и 39 мкМ, соответственно. Тем не менее, N-домен гидролизует данный пептид в 50 раз быстрее по сравнению с C-доменом, с kcat значениями 0,5 и 0,01 с-1 соответственно [50]. Также показано, что бета-амилоид, накапливающийся при болезни Альцгеймера, преимущественно расщепляется под действием именно N-домена АПФ [52-53].

В настоящее время считают, что активный центр, расположенный на С-домене АПФ, является основным местом превращения ангиотензина1 в организме, т.е. именно он участвует в регуляции кровяного давления, поскольку специфичный для С-домена ингибитор в низких концентрациях полностью блокировал вазоконстрикцию, вызываемую

11

ангиотензином II [54], а использование специфичного ингибитора ^домена не приводило к такому эффекту. Роль ^домена, судя по всему, менее связана с функцией ренин-ангиотензиновой системы, а больше связана с гидролизом других биологически активных пептидов, таких как АсББКР [50-51], бета-амилоидный пептид [52-53], ангиотензин 1-7, являющийся антагонистом ангиотензина II [55].

Существование в составе молекулы АПФ тандема из двух активных центров, гидролизующих широкий круг пептидных субстратов и контролирующихся содержанием в среде хлорид-анионов [1], по-видимому, обеспечивает высокую чувствительность фермента на изменение условий функционирования и может существенно влиять на проявляемую ферментом активность в определенных тканях и органах, в том числе при развитии патологии. Ситуацию еще более осложняет тот факт, что функционирование активных центров фермента может быть взаимосвязано. Если при гидролизе ангиотензина! оба центра работают независимо как два отдельных фермента [1 -2,20], то при гидролизе трипептидных субстратов два центра АПФ проявляют ярко выраженную отрицательную кооперативность [47-48]. Таким образом, связывание субстрата на одном из активных центров АПФ приводит к существенному ухудшению связывания второй молекулы субстрата на втором активном центре. Аналогичные данные были получены и для связывания с АПФ обычных коммерческих ингибиторов, применяемых в клинике, таких как каптоприл, лизиноприл, эналаприлат [47]. Несмотря на то, что в работе [46] показано, что фолдинг доменов при синтезе АПФ идет независимо, эти домены при функционировании фермента явно связаны, т.к. именно связывание лиганда глубоко внутри одного из доменов может приводить к изменению функционального состояния активного центра на другом домене.

Поскольку пока не удалось получить кристаллы двух-доменного соматического АПФ, его структура не известна. Поэтому многими лабораториями были предприняты попытки построения модели двудоменного АПФ.

В 2007 году была предложена модель двудоменного АПФ, базирующаяся на данных о топологии поверхности АПФ, полученных с помощью анализа связывания моноклональных антител (мАт) к разным эпитопам на поверхности фермента [56]. К этому времени было завершено картирование всех эпитопов мАт против АПФ, имеющихся в наличии - 8 мАт к К-домену и 8 мАт к С-домену АПФ. Эпитопы связывания мАт 1Е10 и 4Е3 к С-домену располагаются в области контакта доменов в структуре полноразмерного АПФ [56-57]. Эпитоп связывания антитела Ш12 расположен в С-концевой области К-домена, а эпитоп связывания 1Е10 на С-домене, причем связывание обоих мАт отдельными доменами гораздо эффективнее, чем полноразмерным АПФ, что свидетельствует об экранировании эпитопов связывания этих мАт соседними доменами [56,58]. Кроме того, в работе [56] была

12

протестирована способность мАт, специфичных к К-домену, конкурировать за связывание ферментом мАт, специфичных к С-домену, и наоборот. Таким образом были выявлены пары мАт направленные к разным доменам АПФ, но конкурирующие между собой за связывание с двудоменным ферментом. В результате была предложена модель структуры АПФ, представленная на рис 2.

С-с1оташ >Мотат

Рис. 2. Модель двудоменного АПФ, построенная на основе анализа связывания мАт с однодоменными и двудоменной формами АПФ, а также конкуренции мАт к разным доменам фермента за связывание с двудоменной формой АПФ [56]. Стрелками указаны эпитопы связывания мАт. Розовым цветом указан эпитоп связывания мАт 3F11, желтым - мАт 1Е10, фиолетовым - мАт 9В9/3G8, синим - мАт Ш12/6А12. Зеленым цветом отмечены потенциальные сайты гликозилирования.

Затем была получена электронная микрофотография двудоменного АПФ почки свиньи [59] и построена модель соматического АПФ человека [60]. Построение модели было основано на: 1) аминокислотной последовательности АПФ свиньи и человека; 2) знаниях о трехмерных кристаллических структурах ^домена, С-домена АПФ и однодоменного фермента АПФ2, который является гомологом С-домена АПФ; 3) трехмерной электронно-микроскопической фотографии АПФ из почки свиньи [43-44, 59-62]. Все эти исследования позволяют представить АПФ человека, как показано на рис. 3. К-домен молекулы начинается с аминокислотного остатка Leu1 и продолжается до Рго601 [44], связывание

Рис. 3. Двудоменная модель соматического АПФ человека [60].

цинка осуществляется на этом домене аминокислотами H361EMGH365 и Glu389. Междоменный линкер составляет около 11 аминокислот от Pro602 до Asp612, за которым следует ^концевой домен, который начинается с Leu613 и продолжается до Pro1193 (последней аминокислоты, наблюдаемой в кристаллической структуре С-домена) [43,61]. В этом домене за координацию цинка отвечают аминокислоты H959EMGH963 и Glu987. Следом за С-доменом следует примембранный стебель приблизительно от Gln1194 до Arg1227, гидрофобный трансмембранный домен от Val1228 до Ser1248 и внутриклеточная С-концевая последовательность от Gln1249 до Ser1277 в конце молекулы. При ограниченном гидролизе АПФ эндопротеиназой Asp-N расщепление пептидных связей происходит между ^^15-Asp616 и Leu1219-Asp1220 с генерацией двух каталитических доменов в активной форме, которые могут быть разделены с помощью афинной хроматографии на колонке со специфическим ингибитором АПФ лизиноприлом [24].

2. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ИЗМЕНЕНИЙ ПОВЕРХНОСТИ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

Моноклональные антитела (мАт) благодаря их селективности и чувствительности являются чрезвычайно важным инструментом при исследовании структурно-функциональных особенностей белков. В фундаментальных исследованиях мАт используются для идентификации и локализации белков, для дифференциации клеток различных типов, для очистки белка или для исследования экспрессии белков [63-64]. Для получения моноклональных антител обычно используется слияние миеломных клеток с клетками селезенки иммунизированного животного. Полученные гибридные клетки (гибридомы) наследуют от опухолевых клеток способность неограниченно размножаться, а от клеток селезенки - синтезировать антитела предполагаемой специфичности - это общий принцип [64]. Эпитопное картирование - определение областей на поверхности белковой глобулы, к которым специфичны различные мАт - является важным шагом для характеристики взаимодействия антиген-антитело [64-65].

Несмотря на интенсивное и успешное изучение механизмов катализа и ингибирования АПФ, его первичной структуры, иммунохимическая, антигенная структура АПФ долго была практически не исследована. Преимущества, присущие мАт, обусловлены их гомогенностью, стандартностью, абсолютной специфичностью и единообразием, что позволяет изучать тонкую антигенную структуру белков наиболее точно. Ограниченная и небольшая поверхность "отпечатка" моноклональных антител (мАт) на белковой молекуле (640-750 А2) [66] позволяет предполагать, что мАт могут быть очень чувствительным инструментом для изучения функциональной значимости разных эпитопов молекулы АПФ. В первых исследованиях полученные мАт к АПФ из легких крысы не обладали антикаталитической активностью, но взаимодействовали с АПФ эндотелия мыши, быка и человека [67]. мАт, полученные к АПФ легких крысы в другой лаборатории, не имели перекрестной реакции с ферментом человека и быка и также не проявляли антикаталитическую активность [68]. Другие мАт к АПФ легких крысы [69] использовали в основном для визуализации АПФ в тканях головного мозга. Меченые антитела взаимодействовали с АПФ практически всех отделов мозга, однако не взаимодействовали с АПФ из других органов.

Первые мАт к АПФ человека были получены более 20 лет назад, причем все первые

мАт были получены к N-домену АПФ [70]. Для выяснения антигенных детерминант на

обоих АПФ была получена панель, состоящая из 14 мАт. Для первичного скрининга

гибридом использовали метод ELISA с очищенными препаратами фермента из легких

15

человека. Вторичный скрининг проводился с помощью метода иммуносорбции, при котором фермент связывается с антителами, иммобилизованными на планшете, и образование комплекса детектируется с помощью определения активности связавшегося фермента. Используя этот метод, исследовали [70] видовую специфичность полученной панели мАт к АПФ. Было определено, с АПФ каких видов животных взаимодействуют мАт против АПФ человека (из 14 исследованных). Оказалось, что по способности узнавать АПФ из разных животных 14 полученных мАт разбиваются на 6 групп: (1) 9В9; (2) 5G5, 3А5, 1С7; (3) 5Б1; (4) НА8, 7Б5, 3G8 и 1В1; (5) 12Н5, 1G12 и 2G6, (6) 6А12и 4Н4. При этом ни одно из полученных антител не взаимодействовало с АПФ козла, собаки, быка и мыши. мАт 9В9 и антитела из второй группы (5G5, 3А5, 1С7) узнают наиболее консервативные антигенные детерминанты (то есть детерминанты, присущие ферментам из разных видов, например, АПФ приматов, человека, кроликов, быка, морских свинок), тогда как антитела из пятой группы связывают только АПФ человека. Таким образом, консервативность антигенных детерминант, узнаваемых антителами, растет от пятой группы к первой. Все полученные антитела относятся к классу иммуноглобулинов G и подклассу IgG2 и IgGз, также были обнаружен и тип ^М с молекулярной массой около 160 кДа, и характеризуются достаточно высокими константами связывания (10 -8 - 10-10 М) [70].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Крюкова Ольга Владимировна, 2018 год

ИСТОЧНИКОВ

5.1 Подготовка пула плазмы крови

Для поиска эндогенных ингибиторов и эффекторов АПФ в крови нам было необходимо иметь достаточное количество плазмы или сыворотки крови человека. В работе мы использовали плазму или сыворотку крови условно здоровых доноров, т.е. кровь людей, не болеющих саркоидозом, болезнью Гоше и легочными заболеваниями, которые, как было описано в обзоре литературы, сопровождаются сильными изменениями уровня АПФ в крови. Кроме того, для достоверности всех экспериментов было необходимо избежать существенных отличий в уровне и характеристиках АПФ в плазме или сыворотке крови, которые могут быть связаны с наличием мутаций или присутствием в крови экзогенных ингибиторов АПФ, влияющих на измерение активности [108] и на характеристическую конформацию поверхности АПФ [58]. Поэтому для работы было необходимо создать пул из образцов плазмы крови специально отобранных доноров со «стандартным» АПФ. После создания такого пула все эксперименты в работе были сделаны с его использованием.

Уровень АПФ в крови у здоровых людей варьирует до 4 раз при переходе от одного индивидуума к другому [94-95]. Поэтому, например, определяемая пониженная активность АПФ в крови может свидетельствовать как о возможном использовании донорами ингибиторов АПФ в качестве гипотензивных лекарственных средств, так и об индивидуальных особенностях организма. Ранее был разработан подход для определения присутствия в крови экзогенных ингибиторов АПФ, где в качестве критерия используется отношение скоростей гидролиза двух субстратов ZPHL и HHL - ZPHL/HHL (Z/H соотношение) в строго определенных условиях [108]. Было показано, что для каждого типа АПФ характерно свое отношение скоростей гидролиза Z/H: соматический АПФ -1, N-домен 4.5 и С-домен 0,7 [108, 128]. На основании этих значений было сделано предположение [108] о том, что увеличение соотношения Z/H от 1 к более высоким значениям может служить сигналом об инактивации или селективном ингибировании С-домена в составе соматического АПФ, тогда как инактивация или селективное ингибирование N-домена должно уменьшить соотношение к более низким значениям. Кроме того, повышение соотношения может свидетельствовать о связывании коммерческих коротких ингибиторов,

принимаемых в качестве лекарственных средств, на любом домене вследствие отрицательной кооперативности функционирования активных центров АПФ при связывании лигандов такого рода [46]. Поэтому использование Z/H соотношения позволяет нам обнаружить как избирательную инактивацию С- и N-доменов соматического АПФ, так и присутствие в крови обычных экзогенных ингибиторов АПФ.

Другим подходом к проверке плазмы крови доноров на предмет обнаружения экзогенных ингибиторов АПФ и для составления стандартного пула сывороток/плазм с АПФ было определение относительной эффективности связывания мАт 1G12, направленного к N-домену фермента, с АПФ [58, 79]. Этот метод позволяет детектировать изменения, происходящие с молекулой АПФ при связывании ингибиторов различной структуры [58] и при действии токсинов [79]. В присутствии обычных экзогенных ингибиторов АПФ (эналаприлат, каптоприл, лизиноприл) сильно возрастает связывание мАт 1G12 с АПФ в составе плазмы крови [58]. Поэтому мы использовали преципитацию АПФ из крови исследуемых доноров этими антителами наряду с соотношением Z/H для отсеивания из пула тех образцов, в которых могут присутствовать ингибиторы АПФ. Следует отметить, однако, что нельзя использовать только эти мАт, так как мы уже упоминали, что уровень АПФ в крови сильно изменяется у разных людей, поэтому для корректного исследования необходимо реперное антитело, на эффективность связывания которого не влияют различные эффекторы. Таким антителом является мАт 9B9, также направленное к N-домену фермента [70-71]. Уровень АПФ, связавшегося с мАт 9B9 также показывает уровень АПФ как нативного белка [95]. Таким образом, мы использовали два соотношения - Z/H и 1G12/9B9 для выявления образцов плазмы крови, содержащих ингибиторы АПФ. Для формирования пула сывороток с АПФ отбрасывали образцы, в которых любой из параметров превышал среднее значение на величину в 2 стандартных отклонения и более.

Для первого тестирования мы взяли 28 образцов гепариновой плазмы крови условно здоровых доноров (каждый образец по 1 мл). Предварительно был проведен визуальный осмотр образцов на наличие гемолиза, так как гемолиз может влиять на корректное определение активности АПФ (неопубликованные данные) и на эффективность связывания ряда мАт с АПФ [79]. Поэтому с методологической точки зрения важно отметить, что для корректного определения активности АПФ и связывания мАт с АПФ должна использоваться плазма крови, не содержащая гемолизованных эритроцитов. Образцы плазмы крови с явным гемолизом эритроцитов не были обнаружены в этой серии. Затем мы провели тестирование всех образцов плазмы для того, чтобы выявить (и затем удалить) те образцы, которые, возможно, содержат экзогенный ингибитор АПФ, принятый как лекарство. Для этого измерили активность АПФ по скорости гидролиза двух субстратов (с определением

51

соотношения Z/H) и определили соотношение связывание двух мАт 1G12 и 9В9 с АПФ из плазмы во всех образцах. Результаты по измерению активности АПФ представлены на Рис.8 (A-B). Видно, что активность АПФ в образце № 26, выше чем у других образцов, и больше, чем среднее + 2SD при гидролизе обоих субстратов. Следовательно, активность АПФ в образце 26 сильно отличается от остальных, что может свидетельствовать как о генетических особенностях данного донора, так и о возможном заболевании, поэтому мы уже на этой стадии можем исключить этот образец из будущего пула. На рис 8 (С) представлены данные по связыванию мАт 9В9 с АПФ в составе плазмы крови доноров-то есть по уровню иммунореактивного белка. Видно, что уровень АПФ отличается более чем в 3 раза в исследуемой популяции, что подтверждают литературные данные [94-95] о сильном разбросе уровня АПФ в крови у разных людей.

60000 50000 40000 30000 20000 10000 0

60000 50000 40000 30000 20000

0

100000 90000 80000 70000 60000 50000 40000 30000 20000 10000 0

A

п

1*1 й

п

C

Номер образца плазмы

10000

Рис.8. Уровень АПФ в плазме крови 28 доноров.

А: Активность АПФ в реакции гидролиза субстрата Ир-Ив-Ьеи (5 мМ); В: Активность АПФ в реакции гидролиза субстрата Cbz-Phe-His-Leu (2 мМ); Условия: 100 мМ фосфатный буфер рН 8,3, содержащий 0,3 М №С1 и 1мкМ ZnСl2, разбавление плазмы в реакционной среде в 30 раз.

С. Активность АПФ, осажденного из плазмы крови доноров (разбавление плазмы в реакционной среде в 5 раз) на плашке с мАт 9В9.

Зеленым цветом на графике отмечено среднее значение, рассчитанное из всех образцов; красным цветом отмечены те образцы, в которых уровень АПФ превысил среднее значение + 2ББ.

На Рис. 9 представлены данные по сотношениям Z/H и 1G12/9B9 для образцов плазмы крови доноров. Из 28 образцов плазмы крови мы можем отметить 3 образца с соотношением Z/H, превышающем среднее значение +2SD (Z/H + 2SD) - №№ 3, 16 и 17, что предполагает наличие экзогенных ингибиторов в крови этих доноров (Рис. 9A). Измерение соотношения преципитации АПФ из крови антителами 1G12 и 9В9 (Рис. 9В) выявляет 4 донора с повышенным соотношением 1G12/9B9, из которых у двух доноров (№№ 16 и 17) оба соотношения увеличены. На основании проведенного исследования 28 образцов гепариновой плазмы мы выявили 2 образца (№№ 16 и 17), которые содержат экзогенные ингибиторы АПФ и должны быть исключены из формирования пула. Образец от донора №28 должен быть исключен из пула, так как может содержать АПФ с измененной конформацией, который (в силу этого) может характеризоваться уменьшенной чувствительностью к действию ингибиторов АПФ [79].

га

к

s е Sc

S о

g И

о 5

S (N S . 0) s

о S

0,12

0,10

О

0,00

\ г Ъ * «J «1 Л

rvil

kn >? # >9 £ <{• fy <5> ^ Ф Ф $ $

ЕЙ

Номер образца плазмы

A

0,16

B

0,14

0,06

0,04

0,02

Рис. 9. Применение критериев ZPHL/HHL и Ш12/9В9 для формирования пула плазм крови (28 первичных плазм).

A. Отношение скоростей гидролиза Cbz-Phe-His-Leu (2 мМ) и Ир-Ив^еи (5 мМ) под действием различных образцов плазмы крови человека.

B. Отношение связывания мАт Ш12/9В9 с АПФ в составе плазмы крови человека. Зеленым цветом на графике отмечено среднее значение, рассчитанное из всех образцов, попадающих в интервал значений ± 2SD; красным цветом отмечены те образцы, в которых среднее значение превышено на + 2SD.

Таким образом, для формирования пула АПФ мы выбрали 22 донора из 28 проверенных. Нам любезно предоставили для формирования пула по 200 мл цитратной плазмы от 6-ти доноров: №№ 5,13,14,18,19,21. Так как нельзя было исключить ошибки при передаче образцов, мы снова провели все вышеописанные тестирования (рис.10). При повторном измерении оказалось, что у образца 19 соотношение Ш12/9В9 повышено, поэтому этот образец был тоже исключен при формировании пула.

I I

I

о.

N

I

ф

Э

0

1

н

О

<С

к

1е

ГО С т <£

о

к СП

0 т

° а>

01

5 т-

1 О

3 -

0

1

н

О

140 120 100 80 60 40 20 0

250 -| 200 -150 -

А

100

50

В

т г

13 14 18 19

I I

21 среднее

Номер образца плазмы

Рис.10. Применение критериев ZPHLШHL и Ш12/9В9 для формирования пула плазмы крови (6 отобранных плазм после первичной проверки).

A. Отношение скоростей гидролиза Ир-Ив^еи (5 мМ) и Cbz-Phe-His-Leu (2 мМ) 2РНЬ/ННЬ у различных образцов плазмы крови доноров

B. Отношение связывания мАт Ш12/9В9 с АПФ в составе плазмы крови человека. Зеленым цветом на графике отмечены средние значения, рассчитанные из всех образцов, попадающих в интервал значений ± 2SD; красным цветом отмечен образец, в котором уровень АПФ превысил среднее значение + 2SD.

Таким образом, из оставшихся 5 мешков цитратной плазмы был приготовлен общий пул (1,0 л) для использования в дальнейших исследованиях. Из пула были приготовлены аликвоты, которые были заморожены и хранились при -20°С. Этот пул плазмы использовали для нахождения в нем возможного нового эффектора АПФ, а также в качестве стандарта.

0

5

5.2. Выделение и очистка ангиотензин-превращающего фермента из разных

источников

В большинстве работ, посвященных АПФ, обычно используют рекомбинантную форму АПФ или АПФ, выделенный из тканей животных. В нашей работе мы планировали определить присутствие в крови человека эндогенных эффекторов и ингибиторов, влияющих как на активность, так и на конформацию АПФ, поэтому рекомбинантная форма для нашей работы не подходила, так как рекомбинантная форма продуцируется клетками яичников китайских хомячков (СНО-клетки), в которых АПФ может быть иначе гликозилирован. Кроме того, не исключено, что кинетические характеристики рекомбинантного АПФ могут отличаться от нативного АПФ человека.

В работе мы не только использовали АПФ в составе физиологической среды (АПФ в составе гомогенатов, плазмы крови), но и выделили и очистили соматический АПФ человека из легких и семенной жидкости до электрофоретической гомогенности, а также частично очистили АПФ из плазмы крови. Кроме того, для отдельного эксперимента также был выделен соматический АПФ быка. При выделении ферментов из ткани легких использовали экстракцию фермента детергентом Тритоном Х-100 без добавления ЭДТА для перевода фермента из мембраносвязанного состояния в раствор. В этих условиях не происходит подавления металлопротеиназы, так называемой секретазы, отщепляющей гидрофобный якорный пептид от молекулы АПФ. Получаемый таким образом фермент представляет собой преимущественно растворимую форму АПФ [26]. АПФ в биологических жидкостях, а именно в семенной жидкости и в крови, находится уже в растворимой форме, т.е. без якорного пептида. Ферменты очищали с помощью аффинной хроматографии и концентрировали до конечного объема 1,5-2 мл на 100 кДа фильтрах Vivaspin-500.

Гомогенность полученных препаратов АПФ оценивали по результатам электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии 0,1% додецилсульфата натрия. В денатурирующих условиях очищенные нами препараты АПФ человека и быка мигрировали одной полосой как белок с молекулярной массой около 180 кДа (рис.11, А-С).

Содержание активных молекул в препаратах АПФ из семенной жидкости и легких, а также в препарате АПФ быка было определено с помощью титрования ингибитором -лизиноприлом по [47,127] в идентичных условиях при рН 7,5 с использованием Н^ в качестве субстрата. Типичная кривая титрования приведена на рис 12. Концентрация легочного АПФ в исходном препарате составила 1,6 мкМ, концентрация АПФ из семенной жидкости составила 1,5 мкМ, а АПФ быка - 1,4 мкМ.

Рис. 11. Электрофорез различных препаратов АПФ в 7,5% ПААГ в присутствии Бэ-Ыа.

(A) 1,3- соматический АПФ быка; 2,4 - белки-стандарты;

(B) 2- соматический АПФ человека из семенной жидкости, 3- соматический АПФ человека из легких, 1,4 - белки-стандарты;

(C) 1,3,4- соматический АПФ человека из плазмы крови, 2,5 - белки-стандарты.

л н о о и и к

£

80

60

40

20

10

20

30

[I], нМ

0

0

Рис. 12. Титрование АПФ быка специфическим ингибитором лизиноприлом. Условия: 50 мМ Hepes-буфер, рН 7,5, содержащий 150 мМ №С1, 1 мкМ ZnCl2, 25°. Концентрация Н^ 0,1 мМ, концентрация фермента (по белку) 15 нМ, разведение АПФ в реакционной среде 1000 раз.

6. ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ПРИРОДЫ АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА НА ЕГО КАТАЛИТИЧЕСКИЕ И КОНФОРМАЦИОННЫЕ

ХАРАКТЕРИСТИКИ

6.1. Активность и ингибирование ангиотензин-превращающего фермента из семенной

жидкости и из легких

В работе мы определяли возможность присутствия в плазме крови эндогенных ингибиторов АПФ, способных влиять на каталитическую активность фермента, и эффекторов, которые способны изменять конформацию доступной поверхности фермента. За изменением конформации доступной поверхности мы можем следить, оценивая эффективность связывания панели мАт, направленных к различным эпитопам на обоих доменах АПФ человека. Ранее было показано [56, 79, 128], что связывание мАт с соматическим АПФ из различных тканей и биологических жидкостей может отличаться, что свидетельствует о различной топографии эпитопов связывания этих мАт у разных АПФ. Это может в свою очередь быть причиной различий в действии эффекторов на доступность поверхности фермента для связывания с мАт, а также влиять на кинетические характеристики фермента. Поэтому перед началом работы по определению наличия эффекторов и ингибиторов АПФ в крови человека мы провели сравнение характеристик АПФ, происходящего как из эпителиальных, так и из эндотелиальных клеток человека. Для этого были выбраны АПФ из семенной жидкости человека (из эпителиальных клеток) и легких (эндотелиальные клетки) как источников с наибольшим содержанием АПФ. Прежде всего следует отметить, что нами не было отмечено каких-либо значительных отличий в каталитических характеристиках этих АПФ, т.к. ферменты проявили одинаковую каталитическую активность в реакциях гидролиза ZPHL и Н^ при одинаковых концентрациях.

Мы также провели исследование влияния экзогенных ингибиторов, таких как эналаприлат (аналог трипептида) и тепротид (нонапептид), на ферментативную активность очищенных препаратов АПФ легкого и АПФ семенной жидкости при их одинаковых исходных концентрациях и при фиксированной концентрации ZPHL (0,1 мМ). Оказалось, что оба АПФ в равной степени ингибируются данными ингибиторами с ГС50 около 6 нМ для эналаприлата и 10 нМ для тепротида (кривые не приведены).

Таким образом активные центры двух ферментов работают, в целом, одинаково, так как при одинаковых концентрациях АПФ из легких и семенной жидкости у них одинаковая

активность, и они одинаково ингибируются ингибиторами. С другой стороны, на активность АПФ могут влиять ингибиторы/эффекторы, которые не затрагивают активный центр фермента, а образуют с АПФ комплексы, изменяя поверхность фермента, что может привести и к изменению внутренней структуры и изменению активности фермента. Как уже было упомянуто в литературном обзоре, ранее [110] было показано ингибирующее действие альбумина на активность АПФ в составе плазмы крови, а также рекомбинантного фермента. Поскольку АПФ - пептидаза, ингибирующее действие альбумина могло быть отнесено к образованию комплекса этого белка с АПФ, а не к внедрению цепей альбумина в активный центр фермента. Однако мы не подтвердили эти наблюдения [110], поскольку не обнаружили ингибирующего действия ни бычьего, ни человеческого альбуминов на активность как очищенных АПФ из семенной жидкости и легких, так и на АПФ в составе плазмы крови человека. (концентрация альбумина в работе [110] 20 мг/мл, мы в работе использовали концентрацию 30 мг/мл)

Мы также проверили ингибирующее действие анти-каталитических мАт 3А5 и i2H5 к N домену [66, 70], и мАт 1Е10 и 4Е3к С-домену [56] на активность АПФ из легких и семенной жидкости (рис. 13). Моноклональные антитела к ^домену (3А5 и i2H5) понижали активность обоих ферментов при гидролизе субстрата ZPHL, который одинаково гидролизуется обоими доменами АПФ при рН 8,3, в то время как падения активности с субстратом Н^ практически не происходило (рис. 13, А-В), так как Н^ в 9 раз быстрее гидролизуется в этих условиях С-доменом фермента, чем ^доменом [70]. Падение активности обоих АПФ было практически одинаковым, однако эти мАт можно рассматривать как несколько более эффективные по отношению к АПФ из семенной жидкости, о чем свидетельствует более заметное уменьшение отношения ZPHL/HHL (рис. 13, С), характеризующее предпочтительное ингибирование ^домена АПФ этими мАт [66, 70]. Ингибирующее действие анти-каталитических мАт, направленных к С-домену, оказалось субстрат- и ткане-специфическим. Оба мАт (1Е10 и 4Е3) ингибировали ферменты при гидролизе субстрата ННЬ, при этом мАт 4Е3 вызывало более заметный эффект, чем мАт 1Е10, и более эффективно ингибировало активность АПФ из легких (Рис. 13 А). В то же время, влияние этих мАт на активность АПФ с ZPHL в качестве субстрата было довольно парадоксально: связывание анти-каталитических мАт на С-домене АПФ из семенной жидкости, но не АПФ из легких, приводило к достоверному повышению активности АПФ (рис 13, В).

в

1=

<

и н

о

0

1

ш

5

н

^

го го

I £

X

5

^

0 ф

У 5

н

5

с; го н

го ^

1

5 II

ГО

£ ф

-8-8-о

250 200 -150 -100 50 0

250 200 150 100 50

АПФ из семенной жидкости

АПФ из легких

0

250 200 150 100 50 0

9В9

3А5 121-15 N -домен

НН1_

100 -50 0

грнь

100 50 0

отношение ИРНШНЬ

100 50 0

1Е10 4Е3 С-домен

9В9

3А5 12Н5 N -домен

рН

—I- нн

1Е10 4Е3 С-домен

мАт

А

В

С

Рис. 13. Влияние анти-каталитических моноклональных антител на активность очищенных АПФ из семенной жидкости и легких. АПФ (5 мЕ/мл) инкубировали с антикаталитическими мАт (10 мкг/мл) к ^домену ^2Н5 и 3Л5), а также к С-домену (1Е10 и 4E3) АПФ. Остаточную активность АПФ определяли по скорости гидролиза субстратов ННЬ (А) и ZPHL (В). (С) Эффект мАт на отношение скоростей гидролиза ZPHL/HHL. Данные представлены, как среднее из 10 экспериментов ± SD.

Мы можем рассматривать этот факт как признак конформационных изменений на ^домене АПФ из семенной жидкости (но не АПФ легких), индуцированных связыванием мАт с соседним С-доменом.

Таким образом, антикаталитические мАт оказали несколько различный эффект на активность АПФ из семенной жидкости и легких, что может быть связано с различиями в топографии поверхностей этих ферментов.

6.2. Иммунологическая характеристика ангиотензин-превращающего фермента из

легких и семенной жидкости человека

Для характеристики конформации поверхности АПФ, очищенных из легких (происходит из эндотелиальных клеток) и семенной жидкости (происходит из эпителиальных клеток эпидидимиса и предстательной железы), мы использовали панель из 17 моноклональных антител, направленных к различным эпитопам на N и С доменах человеческого АПФ - "конформационный фингерпринтинг" или " конформационный портрет" [79,128]. Используемые нами мАт были получены к нативному, не денатурированному АПФ, т.е. эти мАт распознают эпитопы на поверхности фермента, сформированные в совершенно различных областях его аминокислотной последовательности и зависящие только от третичной структуры белка, как было упомянуто в главе 2 литературного обзора. Из рис 14, видно, что профили иммунопреципитации профили чистых АПФ из семенной жидкости и легких резко отличаются. Так как мы знаем расположение эпитопов связывания всех 17 мАт на поверхности АПФ [56,58,66,70-72,75], мы можем сделать вывод, что АПФ из семенной жидкости и АПФ из легких демонстрируют различия в конформациях их поверхностей, что, видимо, обусловлено различиями в посттрансляционных модификациях молекул АПФ в разных клетках.

Ткане- и клеточно-специфические пост-трансляционные модификации (ПТМ) являются общими для различных белков [129-134]. ПТМ точно регулируют функции белков путем индукции конформационных изменений, которые слабо или сильно изменяют поверхность белка или его общую третичную структуру. Наиболее распространенным ПТМ является гликозилирование [130,131].

Как мы уже писали в главе 2 литературного обзора, соматический АПФ человека содержит 17 потенциальных сайтов №гликозилирования [8]. Показано, что у соматического АПФ в составе семенной жидкости гликозилированы семь из 17 потенциальных участков гликозилирования, (в частности Аэп 9) [39]. АПФ в составе плазмы крови человека содержит

500 п 400 300 -200 -100

0

A

Asn731

Asn25

Asn289

0

500 400 -300 200 100 0

500 400 300 200 100

£=1

/ \

П

I I I I I I I I I I I

I I

B

Asn117

рЬ гЬ т _

Г1! —±— 1

C

9Б9 ББ9 3A5 i1A8 3G8 i2H5 1G126A12 5F1 N-домен

мАт

1Б3 1Б8 3F10 1Е10 4Е3 2Н9 3F11 2Б11 С-домен

Рис. 14. Эффективность связывания мАт с АПФ из разных источников.

A. Отношение связывания мАт с очищенным АПФ из семенной жидкости к связыванию мАт с очищенным АПФ из легких, в %;

B. Отношение связывания мАт с АПФ в составе гомогената простаты к связыванию мАт с АПФ в составе гомогената легких, в %.

C. Отношение связывания мАт с АПФ в составе гомогената эпидидимиса к связыванию мАт с АПФ в составе гомогената легких, в %.

Красным цветом на графике отмечено увеличение связывания мАт с АПФ более чем на 100%; оранжевым цветом отмечено увеличение связывания мАт с АПФ более чем на 20%; желтым цветом отмечено уменьшение связывания мАт с АПФ более чем на 20%; синим цветом уменьшение связывания мАт с АПФ более чем на 50%.

три сайта гликозилирования: Asn 480, 666 и 685 [41]. Данных по гликозилированию АПФ из легких человека нет.

Как мы уже упоминали в обзоре (глава 2), присутствие гликана в эпитопе связывания мАт может сильно влиять на связывание мАт. Расчет площади возможного контакта биантенной олигосахаридной цепи комплексного типа с поверхностью белка показал, что она составляет от 200 до 400 А. Так как средняя площадь эпитопа связывания мАт на поверхности белка составляет 400-750 А2 [66], можно заключить, что олигосахаридные цепи могут контактировать со значительной частью эпитопа связывания мАт. Очевидно, что наличие или отсутствие олигосахарида (а также его определенная структура, то есть количество антенн, сиалилирование, фукозилирование и т.д.) в пределах эпитопа может сильно влиять на связывание моноклональных антител с АПФ.

С помощью электрофореза (Рис. 11) нами показано, что АПФ из семенной жидкости и легких достаточно близки по массе, что указывает на отсутствие существенных различий в степени гликозилирования этих АПФ. Тем не менее, было получено свидетельство о возможном различном сиалировании этих.

Сиаловые кислоты отличаются от других углеводов не только наличием отрицательно заряженной карбоксильной группы во втором положении пиранозного кольца, но и терминальной позицией в олигосахаридах комплексного типа. Часто именно сиаловые кислоты оказывают решающее влияние как на физико-химические и биологические свойства того или иного гликопротеина, так и на его взаимоотношения с другими компонентами клетки [135]. Для определения количества сиаловых кислот было проведено десиалирование двух очищенных препаратов АПФ в соответствии со схемой, изображенной на рис. 15.

нейраминидаза

-Asn — GlcNAc — GlcNAc — Man

Fuc

ЧуМап — GlcNAc — Оа1

Man — ОШАс — Оа1 — №иАс/№иОс /

\

Рис. 15. Схема отщепления концевых остатков сиаловых кислот под действием нейраминидазы.

Десиалирование образцов АПФ контролировали с помощью ионобменной хроматографии. Анализ полученных результатов показал, что в условиях проведения

десиалирования (0,5 М Мес-буфер, рН 6,0, содержащий 0,15 М KCl, 4 мМ CaCh, 1мкМ ZnCl2, сутки, 30°С) не выявлено появления нейраминовой кислоты, в случае АПФ из семенной жидкости но от гликанов АПФ из легких отщеплялись 5 остатков сиаловых кислот, причем на хроматограмме наблюдалось два пика - один соответствовал N-ацетилнейраминовой кислоте (3 остатка), другой соответствовал N-гликолилнейраминовой кислоте (2 остатка). Интересно, что ранее присутствие гликолилнейраминовой кислоты в соматическом АПФ человека из почек отмечено не было, но было отмечено присутствие этой кислоты у тестикулярного АПФ [41].

Различия в связывании антител с АПФ из легких и семенной жидкости, показанные на Рис. 14 (А), могут быть вызваны отличиями в структуре гликанов в потенциальных сайтах гликозилирования АПФ: Asn 25 в эпитопах связывания мАт BB9, 3A5 и i1A8, Asn 289 в эпитопах связывания мАт i2H5 и 6A12 на N-домене, Asn 666 в эпитопах связывания мАт 1Е10, и Asn 685 в эпитопах связывания мАт 4E3 и 2H9 в C-домене (рис.14 (А)). Большая разница в связывании мАт 1В8 и 3F10 с АПФ из семенной жидкости и АПФ из легких может быть связана с разницей в гликозилировании остатка Asn731, который находится в центре эпитопов связывания этих двух мАт на C-домене АПФ [75]. С другой стороны, эта разница могла быть связана с присутствием трансмембранного якоря в некоторых молекулах АПФ из легких, который понижает связывание именно этих мАт к АПФ [75]. Так как АПФ из семенной жидкости представляет собой растворимую форму фермента, якоря в нем нет а priori. Для оценки возможного присутствия в АПФ из легких молекул, несущих гидрофобный трансмембранный якорь, мы провели фазовое разделение с помощью детергента Triton X-114. Оказалось, что более 90% АПФ в гомогенате легких переходило в водную фазу, в то время как менее 10% оказались в органической фазе. В качестве контроля метода проводили фазовое разделение препарата растворимой формы АПФ, при этом в органической фазе активность АПФ составляла менее 2% от общей активности фермента. Можно сделать вывод, что действительно, часть молекул АПФ из лёгких содержит якорь, но основное количество фермента представляет собой растворимую форму.

Чтобы убедиться все же, что наблюдаемые сильные различия в связывании мАт1В8 и 3F10 с АПФ из легких и семенной жидкости (рис 14, А), связаны с вероятным различием гликозилирования Asn 731, мы сравнили конформационный фингерпринтинг АПФ из гомогенатов эпидидимиса и предстательной железы (рис. 14, В-С) как потенциальных источников АПФ в семенной жидкости и АПФ из гомогената легких, приготовленных в одинаковых условиях экстракцией фермента буфером с равным содержанием детергента Triton X-100. Это сравнение наглядно демонстрирует значительные отличия в конформации АПФ из легких, предстательной железы и из эпидидимиса. Лучшее связывание мАт 1В8 и

64

3F10 для АПФ в составе гомогенатов простаты и эпидидимиса по сравнению с АПФ в составе гомогената легких воспроизводит лучшее связывание этих мАт с очищенным АПФ из семенной жидкости по сравнению со связыванием с очищенным АПФ из легких, что, прежде всего, указывает, что причиной такого серьезного отличия является не наличие якоря, а скорее различное гликозилирование остатка Asn731, входящего в эпитоп связывания этих мАт 1В8 и 3F10, в АПФ из эндотелиальных клеток и АПФ из эпителиальных клеток (рис. 14, В-С). Большая эффективность связывания этих двух мАт, а также мАт 1В3 (направленного на эпитоп в области С-конца С-домена [75]), с АПФ из эпидидимиса и АПФ из простаты позволяет предположить, что в них лучше доступность для мАт области С-конца С-домена фермента по сравнению с АПФ из легких.

Следует также указать, что активности АПФ в гомогенатах тканей, приготовленных в одинаковых условиях (ткани: буфер = 1:9) существенно отличались. Простата продуцирует с меньшей эффективностью АПФ (44 мЕд/г), чем эпидидимис (720 мЕд/г), у которого активность АПФ сопоставима с активностью АПФ в легких - 1063 мЕд / г (в качестве субстрата использовали ZPHL). Эти данные согласуются с литературными (www.proteinatlas.org), согласно которым экспрессия АПФ в эпидидимисе в 6 раз выше, чем в чем предстательной железе. Однако высокое содержание АПФ в эпидидимисе, скорее всего, компенсируется более высокой массой простаты, что приводит к приблизительно равному количеству АПФ в обоих органах [136]. В литературе [137] высказывалось предположение о том, что АПФ в семенной жидкости может продуцироваться и предстательной железой, и эпидидимисом. Полученные нами данные хорошо согласуются с этой идеей, поскольку сравнение конформационного фингерпринтинга АПФ (Рис 14) показывает, что эффективность связывания мАт с АПФ из семенной жидкости представляет собой нечто среднее между эффективностью связывания мАт с АПФ из предстательной железы и эффективностью связывания мАт с АПФ из эпидидимиса. Например, высокое связывание мАт 1Е10 с С-доменом АПФ в составе семенной жидкости отражает с поступление фермента из эпидидимиса. С другой стороны, за счет АПФ, поступающего из простаты, снижается связывание мАт ВВ9, ПА8 и i2H5 с ^доменом АПФ из семенной жидкости по сравнению с АПФ из легких (рис. 14, А).

Кроме того, следует отметить, что АПФ из гомогената простаты характеризуется очень низким связыванием мАт 5F1, в то время как связывание этого мАт с АПФ из гомогената эпидидимиса и очищенного АПФ из семенной жидкости достаточно высокие. Эпитоп связывания этого мАт содержит потенциальный сайт гликозилирования Asn117 [71] и в непосредственной близости от этого эпитопа находится Asn480 [71]. Ранее было показано, что, по крайней мере, в плазме крови, куда основное количество АПФ (до 80 %) поступает из

65

капилляров легких, Asn480 гликозилирован [41]. Таким образом, мы можем предположить, что гликозилирование Asn117 и/или Asn480 резко отличается в АПФ простаты по сравнению с АПФ в эпидидимисе и легких (рис. 14, В-С).

Таким образом, мы показали, что топография поверхности АПФ, продуцированных разными типами клеток, различна, видимо, из-за разного гликозилирования этих ферментов, что в свою очередь может привести к различиям в ответе фермента на связывание ингибиторов/эффекторов.

6.3. Определение сайтов N-гликозилирования в ангиотензин-превращающем ферменте

из легких и из семенной жидкости

Для подтверждения предположения о различном гликозилировании АПФ, продуцированного различными типами клеток мы провели анализ вероятного гликозилирования АПФ. Для этого АПФ, выделенные из легких человека и семенной жидкости, расщепляли с помощью трипсина и полученные пептиды анализировали с помощью MALDI TOF масс-спектрометрии. После первичного поиска соответствия пептидов с помощью программы MASCOT выяснили, что покрытие последовательности белка в обоих случаях было около 50%. После обнаружения дополнительных пептидов с помощью программы FindPept охват последовательности стал выше: 69% для АПФ из легких и 62% для АПФ из семенной жидкости. Негликозилированные пептиды, идентифицированные с помощью программы FindPept в триптических гидролизатах АПФ из разных тканей человека, представлены в Таблице 1 и в Приложении 1. В гидролизате АПФ из семенной жидкости были найдены негликозилированные пептиды, которые содержат четыре потенциальных сайта гликозилирования Asn131, 494, 666 и 1196 (отмечены в Таблице 1 жирным шрифтом). Гидролизат АПФ из легких содержал те же пептиды, но еще и пептид, содержащий потенциальный сайт гликозилирования Asn731 (Таблица 1).

Необходимо заметить, что если какая-либо масса пика на масс-спектре соответствовала одновременно негликозилированному и гликозилированному пептидам, мы относили эту массу только к негликозилированному пептиду. Тем самым мы не учитывали возможность существования частично гликозилированных сайтов гликозилирования в составе АПФ и ужесточали требования к обнаружению возможных гликозилированных пептидов. Единственным исключением стали пептиды 661-677, содержащие потенциальный сайт N-гликозилирования Asn666, в гидролизатах АПФ из семенной жидкости и из легких (Таблица 1). Интенсивность пиков на масс-спектрах, соответствующих этому негликозилированному

Таблица 1. Найденные [М + Н]+ ионы негликозилированных пептидов трипсиновых гидролизатов в масс-спектрах АПФ из легких и семенной жидкости человека_

АПФ из легких АПФ из семенной жидкости

Пептиды Найденные Теоретические Пептиды Найденные Теоретические

ш/г ш/г ш/г ш/г

53-71° 2191.1 2191.1 53-71° 2191.1 2191.1

54-71 2035.0 2035.0 54-71 2035.0 2035.0

97-107 1084.6 1084.6 97-107 1084.7 1084.6

127-132а 744.4 744.4 127-132а 744.4 744.4

133-151а 2135.1 2135.0 133-151а 2135.1 2135.0

152-187 4117.1 4117.0 152-187 4117.2 4117.0

152-187ь 4133.0 4133.0 152-187ь 4132.9 4133.0

188-199 1416.6 1416.6 188-199 1416.6 1416.6

200-230 3837.9 3837.9 200-230 3837.8 3837.9

231-236° 808.4 808.5 231-236° 808.5 808.5

241-245 678.4 678.4 241-245 678.4 678.4

296-326 3526.7 3526.7 296-326 3526.7 3526.7

296-326ь 3542.7 3542.6 296-326ь 3542.7 3542.6

327-340а 1767.8 1767.8 327-340а 1767.8 1767.8

327-341а'° 1895.9 1895.9 327-341а'° 1895.9 1895.9

342-346° 678.4 678.4 342-346° 678.4 678.4

351-373 2821.4 2821.3 351-373 2821.3 2821.3

351-373ь 2837.4 2837.3 351-373ь 2837.3 2837.3

374-380 799.5 799.5 374-380 799.5 799.5

381-407° 2852.5 2852.5 381-407° 2852.5 2852.5

382-407 2696.4 2696.4 382-407 2696.4 2696.4

408-413 686.4 686.4 408-413 686.5 686.4

433-446 1724.9 1724.9 433-446 1724.9 1724.9

447-453 808.4 808.4 447-453 808.4 808.4

459-467 1362.6 1362.6 459-467 1362.7 1362.6

468-479° 1362.7 1362.7 468-479° 1362.7 1362.7

470-479 1133.6 1133.6 470-479 1133.6 1133.6

490-500 1342.7 1342.7 490-500 1342.8 1342.7

490-517° 3429.5 3429.8

501-532° 3837.9 3837.8 501-532° 3837.8 3837.8

518-532а 1821.8 1821.8 518-532а 1821.8 1821.8

542-557° 1826.0 1826.0 542-557° 1826.0 1826.0

543-557 1697.9 1697.9 543-557 1697.9 1697.9

558-572 1598.9 1598.8 558-572 1598.9 1598.8

623-629 957.4 957.4 623-629 957.5 957.4

661-677° 1973.9 1974.0 661-677° 1973.8 1974.0

671-676 695.4 695.3 671-676 695.4 695.3

694-700° 887.5 887.5 694-700° 887.5 887.5

701-713 1475.8 1475.7 701-713 1475.8 1475.7

750-762° 1751.9 1751.9 750-762° 1751.9 1751.9

751-762 1623.8 1623.8 751-762 1623.8 1623.8

751-767° 2151.1 2151.0 751-767° 2151.1 2151.0

768-775 979.6 979.6 768-775 979.6 979.6

776-785 1176.7 1176.6 776-785 1176.7 1176.6

786-797 1352.6 1352.6 786-797 1352.6 1352.6

798-811 1697.9 1697.8 798-811 1697.9 1697.8

798-811ь 1713.9 1713.8 798-811ь 1713.8 1713.8

812-828 2117.2 2117.2 812-828 2117.2 2117.2

834-883 5562.0 5561.7 834-883 5561.3 5561.7

884-889 744.4 744.4 884-889 744.4 744.4

915-924 1133.6 1133.6 915-924 1133.6 1133.6

940-944° 678.4 678.4 940-944° 678.4 678.4

945-971а 3305.6 3305.6 945-971а 3305.5 3305.6

972-978 783.5 783.5 972-978 783.5 783.5

979-1001 2309.3 2309.2 979-1001 2309.2 2309.2

1002-1025 2693.3 2693.3 1002-1025 2693.3 2693.3

1031-1044 1754.9 1754.9 1031-1044 1755.0 1754.9

1045-1077° 4066.1 4066.1 1045-1077° 4066.0 4066.1

1047-1054 866.5 866.5 1047-1054 866.5 866.5

1055-1065 1524.7 1524.7 1055-1065 1524.7 1524.7

1068-1077 1129.6 1129.6 1068-1077 1129.6 1129.6

1078-1087 1035.5 1035.5 1078-1087 1035.5 1035.5

1088-1098 1315.7 1315.7 1088-1098 1315.7 1315.7

1099-1125 3089.5 3089.5 1099-1125 3089.4 3089.5

1181-1189 1056.5 1056.5 1181-1189 1056.5 1056.5

1190-1202 1533.7 1533.8

1190-1203 1689.8 1689.8 1190-1203 1689.8 1689.8

1204-1213 1014.5 1014.5

1214-1227 1532.8 1532.8

а Цистеин, модифицированный акриламидом. ь Окисленный метионин.

с Содержит одну или две несращепленные связи трипсином.

Жирным шрифтом отмечены пептиды, содержащие потенциальные сайты N

гликозилирования.

пептиду, была чрезвычайно мала, особенно в случае АПФ легких, поэтому отнесение этого сайта к негликозилированным было сомнительным.

Анализ масс-спектров с помощью программы GlycoMod выявил ряд пиков, соответствующих возможным гликозилированным пептидам в составе двух АПФ. Поскольку

поиск возможных гликопептидов с использованием GlycoMod основан на сравнении экспериментальных молекулярных масс пептидов с теоретическими, в результате было получено несколько ложных гликопептидов с достаточно экзотическими структурами гликанов. Такие гликопептиды в дальнейшем анализе не рассматривались, а рассматривались только гликаны, которые соответствовали структурам, зарегистрированным в базе данных ишСагЬКВ. Результаты представлены в Таблицах 2-3. Видно, что в ряде случаев экспериментальные массы могли быть отнесены к гликопептидам, содержащим один и тот же потенциальный сайт гликозилирования, несущий разные структуры гликанов. Так, например, для Asn82 в составе АПФ из семенной жидкости возможны две структуры гликанов (Таблица 2), а для Asn117 уже пять возможных вариантов гликана, отличающихся количеством антенн, присутствием в составе гликана фукозы, степенью сиалирования или природой сиаловой кислоты (Ы-ацетил-нейраминовая или Ы-гликолил-нейраминовая). В ряде случаев одна и та же наблюдаемая масса могла быть отнесена к гликопептидам, содержащим разные сайты гликозилирования, что отображено в таблицах 2 и 3.

Тем не менее, можно полагать, что в молекулах АПФ из семенной жидкости гликозилированы остатки аспарагина 82, 117, 416, 648, 666, 685 и 731 (итого семь сайтов гликозилирования, что соответствует данным о том, что АПФ из семенной жидкости содержит семь олигосахаридных цепей [39]), их расположение на поверхности АПФ отмечено на Рис 16. Не исключено также гликозилирование сайта Asn480 (Таблица 2). В молекулах АПФ из легких гликозилированы остатки аспарагина 117, 648, 666, 685, а также, возможно, Asn480 (Таблица 3). Таким образом, оба АПФ, по-видимому, содержат гликозилированные остатки Asn117, 666 и 685, данные сайты гликозилирования отмечены на Рис 16. Ранее сообщалось, что в АПФ из почек человека гликозилированы Asn82, 117 и480 [40], а в молекулах АПФ в составе плазмы гликозилированы Asn480, 666 и 685 [41]. Эти данные коррелируют с полученными нами данными для фермента из легких (Таблица 3), которые, как известно, являются основным поставщиком АПФ в кровь [42,137].

К сожалению, в гидролизатах АПФ не были выявлены пептиды, содержащие потенциальный сайт гликозилирования Asn25, входящий в состав эпитопов связывания мАт ВВ9, 3А5 и i1A8, для которых были продемонстрированы значительные отличия в связывании с АПФ из разных источников (Рис.14, A). Однако были выявлены пептиды, содержащие потенциальные сайты гликозилирования 666 и 731, входящие в эпитопы связывания мАт, эффективность связывания которых с АПФ из разных тканей также значительно различалась (Рис.14, A). При этом только в составе гидролизата АПФ из легких был обнаружен негликозилированный пептид, содержащий Asn731 (Таблица 1), в то время как для АПФ из семенной жидкости показано возможное присутствие соответствующего

69

гликозилированного пептида (Таблица 2). Таким образом, вероятно, что наблюдаемые различия в эффективности связывания мАт 1В8 и 3F10, в эпитоп связывания которых входит Asn731, а также мАт 1В3, эпитоп которого располагается очень близко, обусловлены наличием или отсутствием гликана в этом сайте.

Поскольку пептид, содержащий Asn666, был все же найден среди негликозилированных пептидов в составе гидролизатов АПФ из семенной жидкости и легких (Таблица 1), хотя интенсивность соответствующих пиков на масс-спектрах и была чрезвычайно мала, этот сайт в составе названных ферментов следует считать частично гликозилированным. Вероятные различия гликозилирования этого сайта в составе АПФ из разных тканей представлены в Таблицах 2-3 и иллюстрированы на Рис.17. Несмотря на большую вариабельность представленных структур, особенно для АПФ из семенной жидкости, следует отметить, что в АПФ из семенной жидкости предполагается присутствие в сайте Asn666 гликанов комплексного и гибридного типов (Таблицы 2, Рис.17), а в АПФ легких отмечено присутствие высокоманнозного гликана (Нех)4+(Маи)э(01°КА°)2 в составе гликопептида I1e656-Lys670 (Таблица 3, Рис.17). Таким образом, именно структура гликана в сайте N гликозилирования Asn666 может определять эффективность связывания мАт, в эпитопы которых входит этот сайт, а именно, мАт 1Е10 и 4Е3 (Рис.14 A).

Таким образом, мы впервые получили данные по вероятному гликозилированию АПФ из семенной жидкости и легких, следствием которого является различная топография поверхности АПФ из легких (из эндотелиальных клеткок) и АПФ из семенной жидкости (из эпителиальных клеток). То есть мы фактически доказали тканевую специфичность АПФ, которая была продемонстрирована двумя разными способами - иммунологически по связыванию широкой панели моноклональных антител против АПФ и данными масс-спектрометрии.

Тканевая специфичность, в свою очередь, может приводить к вероятным различиям в ответе этих ферментов на ингибирование эндогенными ингибиторами и на влияние эффекторов на их конформацию.

Таблица 2. Вероятные №гликозилированные пептиды и гликановые структуры в АПФ из семенной жидкости человека

Сайты К-гликозилирования Пептиды Найденные ш/г Теоретические ш/г Потенциальные структуры гликанов

АБП82 01и74-А^90 3972.7 3973.7 (Нех)2(НехКА°)2(Еи°)1+(Мап)э(01°КА°)2и/или (Нех)1(НехКА°)2(Би°)2+(Мап)3(а1°КА°)2

3931.7 3932.7 (Нех)э(НехКА°)1(Еи°)1+(Мап)э(а1°КА°)2

Аг§ 108-Аг§120 3493.4 3494.5 (Нех)2(НехКА°)2(КеиА°)1+(Мап)3(С1°КА°)2и/или (Нех)1(НехКА°)2(Би°)1(КеиА°)1+(Мап)3(01°КА°)2

АБП117 3509.5 3510.5 (Нех)2(НехКА°)2(КеиА°)1+(Мап)3(С1°КА°)2и/или (Нех)2(НехКА°)2(КеиО°)1+(Мап)3(С1°КА°)2

3202.4 3203.4 (Нех)2(НехКА°)2+(Мап)3(а°КА°)2

01п109-Аг§120 5469.1 5469.1 (Нех)5(НехКА°)5(Би°)1(КеиА°)4+(Мап)3(01°КА°)2

АБП416 Уа1414-ЬуБ427 3288.5 3288.5 (Нех)1(НехКА°)3+(Мап)3(аША°)2

АБП648 ТЬг630-Ьу8655 5885.2 5885.4 (Нех)5(НехКА°)4(КеиА°)1+(Мап)3(01°КА°)2и/или (Нех)4(НехКА°)4(Би°)1(КеиА°)1+(Мап)3(01°КА°)2

5559.3 5560.3 (Нех)2(НехКА°)2(Би°)2(КеиА°)2+(Мап)3(01°КА°)2

Авп661-ЬуБ670 3245.4 3245.3 (Нех)3(НехКА°)2(КеиА°)1+(Мап)3(01°КА°)2и/или (Нех)2(НехКА°)2(Би°)1(КеиА°)1+(Мап)3(01°КА°)2

2920.2 2921.2 (Нех)1(НехКА°)2(КеиА°)1+(Мап)3(С1°КА°)2

АБП666 3082.3 3083.3 (Нех)2(НехКА°)2 (КеиА°)1+(Мап)3(С1°КА°)2и/или (Нех)1(НехКА°)2(Би°)1(КеиА°)1+(Мап)3(01°КА°)2

3285.3 3286.4 (Нех)2(НехКА°)3(КеиА°)1+(Мап)3(01°КА°)2и/или (Нех) 1 (НехКА°)3 (Би°) 1 (КеиА°)1+(Мап)3(С1°КА°)2

АБП661- Аг§ 676 3102.4 3103.4 (Нех)1(НехКА°)1+(Мап)3(а°КА°)2и/или

(НехКА°)1(Еи°)1+(Мап)э(01°КА°)2

Asn685 Lys677-Lys689 Pheб78- Arg б90 27б5.3 3258.3 3489.5 2765.3 3259.4 3490.5 (Hex)2+(Man)3(GlcNAc)2 (Hex) i (HexNAc) 1 (Fuc) 1 (NeuGc)l+(Man)3(GlcNAc)2 (Hex)2(HexNAc)2 (NeuAc)l+(Man)3(GlcNAc)2

Asn731 Ile 714- Arg 749 5884.5 5885.5 (Hex)4(HexNAc)2+(Man)з(GlcNAc)2и/или (Hex)3(HexNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2

Asn41б Ile408- Lys 427 (Hex)2(HexNAc)2(Fuc)1+(Man)3(GlcNAc)2

Asn480 и/или Asn480- Arg500 4059.8 4060.8 (HexNAc)3(Fuc)l+(Man)3(GlcNAc)2

Asnббб Ile 656-Lys670 (Hex)4(HexNAc)з(Fuc)l+(Man)з(GlcNAc)2и/или (Hex)3(HexNAc)3 (Fuc)2+(Man)3(GlcNAc)2

Таблица 3. Вероятные Ы-гликозилированные пептиды и гликановые структуры в АПФ из легких человека

Сайты К-гликозилирования Пептиды Найденные ш/г Теоретические ш/г Потенциальные структуры гликанов

Авп117 Аг§108-Аг§120 01п109-Аг§120 3349.4 5469,1 3349.4 5469,1 (Нех)2(НехКА°)2(Еи°)1+(Мап)3(01°КА°)2и/или (Нех)1(НехКА°)2(Еи°)2+(Мап)3(01°КА°)2 (Нех)5(НехКА°)5(Еи°)1(КеиА°)4+(Мап)3(01°КА°)2

АБП648 ТЬг630-Ьу8655 5885.4 5885.4 (Нех)5(НехКА°)4(КеиА°)1+(Мап)э(01°КА°)2и/или (Нех)4(НехКА°)4(Еи°)1(КеиА°)1+(Мап)3(01°КА°)2

АБП666 11е656-Ьув670 3305.5 3305.5 (Нех)4+(Мап)э(а1°КА°)2

АБП685 Ьув677-ЬуБ689 РЬе678-Ьу8689 и/или РЬе678-Аг§690 2765.3 3490.5 2765.3 3490.5 (Нех)2+(Мап)3(01°КА°)2 (Нех)1(НехКА°)5+(Мап)3(01°КА°)2 (Нех)2(НехКА°)2(КеиА°)1+(Мап)3(01°КА°)2

Авп117 АБП685 и/или 01п109-Ьув126 РЬе678-Аг§690 4237,8 4237,8 (Нех)3(НехКА°)3(Еи°)1+(Мап)3(01°КА°)2 (Нех)5(НехКА°)4(Еи°)1+(Мап)3(01°КА°)2

АБП480 АБП666 и/или Авп480-ЬуБ489 Авп661-ЬуБ670 2468.1 2468.0 2468.1 (Нех)3+(Мап)3(01°КА°)2 (НехКА°)2+(Мап)3(01°КА°)2

АБП82 С1и74-Лг§89 (Нех)3(НехКА°)3(Еи°)1+(Мап)3(01°КА°)2и/или (Нех)2(НехКА°)3(Еи°)2+(Мап)3(01°КА°)2

Лsn117 и/или С1п109-Аг§120 4182,8 4182,8 (Нех)3(НехКА°)3(Еи°)1+(Мап)3(01°КА°)2и/или (Нех)2(НехКА°)3(Еи°)2+(Мап)3(01°КА°)2

АБП666 АБп661-Аг§676 (Нех)3(НехКА°)4(Ри°)1+(Мап)3(01°КА°)2

Рис. 16. Структуры N и ^ доменов АПФ с указанием потенциальных сайтов N гликозилирования и эпитопов связывания моноклональных антител. Доменная структура человеческого №домена была основана на PDB P2C6N и C-домена - на основе PDB Ю86. Эпитопы связывания на поверхностях доменов были отмечены в соответствии с [56-58, 66,7172,75]. Эпитопы для некоторых мАт (12 из 17) показаны кружками с обеих сторон доменов. Потенциальные участки ^гликозилирования, 9 на N домене и 6 на ^ домене, отмечены зеленым; Asn494 на ^домене не видно, а Asn1196 нет в использованной структуре ^домена. Сайты гликозилирования, которые могут быть по-разному гликозилированы в семенной жидкости и легком, показаны красными стрелками. Некоторые аминокислотные остатки показаны цифрами в соответствии с [38] для ориентации.

АПФ из семенной жидкости

С-домен

Рис. 17. Вероятные отличия в структуре гликанов в сайте гликозилирования Asn666 в АПФ человека из легких и семенной жидкости.

6.4 Сравнительная оценка влияния компонентов биологических жидкостей на конформацию поверхности ангиотензин-превращающего фермента из легких и

семенной жидкости

Могут ли различия в конформациях АПФ из семенной жидкости и из легких привести к различному регулированию функций этих ферментов в организме? Мы не подтвердили ингибирующее действие альбуминов на активность АПФ, но допускали, что компоненты крови и, в частности, альбумин, могут образовывать комплексы с АПФ, влияя на конформацию фермента и, возможно, на скорость шеддинга с клеточной мембраны. Принимая во внимание, что концентрация альбумина в семенной жидкости (1 мг/мл) в 50 раз меньше, чем в крови [138], было очень заманчиво предположить, что в 50 раз более высокая концентрация АПФ в семенной жидкости, объясняется только 50-кратно меньшей концентрацей альбумина. Возможность образования комплексов альбумина с АПФ мы оценивали по изменению эффективности связывания мАт с АПФ.

Мы оценили влияние инактивированной плазмы крови человека (т.е. многокомпонентый состав), инактивированной семенной жидкости (также многокомпонентный состав), а также очищенных альбуминов человека и быка на связывание панели мАт с очищенными АПФ из легкого и семенной жидкости (рис.18). Инактивацию плазмы и семенной жидкости проводили путем 40 минутного нагревания при 65 С для инактивации АПФ. Во всех экспериментах остаточная активность АПФ составляла менее 1% от исходной активности. Все инактивированные образцы центрифугировали при 12000g в течение 10 мин для освобождения от денатурированных белков.

Влияние инактивированной плазмы крови человека на связывание мАт с двумя типами АПФ отличалось (Рис. 18, А). Из представленных данных видно, что инактивированная плазма оказала влияние на связывание мАт Ш12 с АПФ из обоих источников, что показывает наличие в плазме крови компонентов, влияющих на поверхность АПФ в районе эпитопа связывания этого мАт (рис. 16). Мы не обнаружили изменений связывания других мАт с АПФ из легких в присутствии плазмы, но добавление инактивированной плазмы к АПФ из семенной жидкости привело к понижению связывания 4-х мАт - ВВ9, i1A8, Ш12, 6A12 к N домену фермента с АПФ, причем эпитопы связывания ВВ9, i1A8 пересекаются, как и эпитопы связывания Ш12, 6A12 (рис. 16).

го

X

ш о

X

>у

ю .0

ш -л ГО о*

^ ш

? е § <

Ч О

I £

го с; с

Ё

О)

О

250 -| 200 -150 -10050 0

250 200 150 100 50 0

250 200 150 100 50 0

250 200 150 100 50 0

А

АПФ из семенной жидкости

—тее

АПФ из легкого