Особенности экспериментального легочного мелиоидоза, вызванного штаммами Burkholderia pseudomallei с различным антигенным составом тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат медицинских наук Перепелицына, Светлана Валерьевна

• Перепелицына, Светлана Валерьевна
• кандидат медицинских наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат медицинских наук Перепелицына, Светлана Валерьевна

Список сокращений Введение

Глава 1. Клиника, лабораторная диагностика и патогенез ме- 13 лиоидозной инфекции

1.1. Клинические проявления и особенности лабораторной диаг- 13 ностики мелиоидоза

1.2. Основные факторы патогенности Burkholderiapsendomallei 28 Собственные исследования

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Штаммы возбудителя мелиоидоза, питательные среды, лабо- 40 раторные животные

2.2. Аэрогенное заражение животных возбудителем мелиоидоза

2.3. Техника исследования биологического материала

2.4. Определение активности ферментов возбудителя мелиоидоза

2.5. Иммунохимический анализ антигенных комплексов и от- 43 дельных биополимеров возбудителя мелиоидоза

2.6. Анализ экспрессии генов цитокинов

2.7. Статистическая обработка результатов исследований

Глава 3. Экспериментальный легочный мелиоидоз, вызванный штаммами В. pseudomallei с различным антигенным составом

3.1. Моделирование легочного мелиоидоза и сравнительная ха- 48 рактеристика экспериментальных моделей инфекции

3.2. Особенности диссеминации антигенных вариантов В. pseudo- 51 mallei при легочном мелиоидозе

3.3. Патоморфология экспериментального мелиоидоза крыс, вы- 55 званного типичным и атипичным штаммами возбудителя

3.4. Особенности взаимодействия антигенных вариантов В. рзеи- 60 с1ота11е1 с клетками системы мононуклеарных фагоцитов экспериментальных животных

3.5.Сравнительная характеристика процессов активации клеток 62 иммунной системы экспериментальных животных, инфицированных штаммами В. рБеис1ота1Ш и В. thailandensis

Глава 4. Изучение активности внеклеточных ферментов возбу- 68 дителя мелиоидоза на различных стадиях инфекционного процесса

4.1. Ферментативная активность вирулентного штамма В. рБеи- 68 ¿ота11е1 при различных формах экспериментальной инфекции

4.2. Активность экстрацеллюлярных ферментов штамма В. рБеи- 72 с1ота1Ш, дефектного по продукции Аг8, при экспериментальном мелиоидозе

Глава 5. Анализ антигенной изменчивости В. ряеийотсйШ при 76 различных формах экспериментальной инфекции

5.1. Вариабельность антигенного состава типичных и атипичных 76 штаммов В. рБеийотаИегъ ходе инфекционного процесса

5.2 Твердофазный иммуноферментный анализ в лабораторной диагностике экспериментального мелиоидоза, вызванного штаммами с различным антигенным составом Заключение

Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности экспериментального легочного мелиоидоза, вызванного штаммами Burkholderia pseudomallei с различным антигенным составом»

Актуальность

В последние годы интерес исследователей к мелиоидозу значительно возрос, что объясняется расширением ареала инфекции, связанным с изменяющимися климатическими условиями, глобальным потеплением и другими природными факторами, способствующими появлению этой опасной инфекции на ранее неэндемичных территориях и формированию вторичных очагов [85, 86].

Материалы научной периодики последнего времени свидетельствуют о заметном подъеме заболеваемости мелиоидозом в эндемичных по данной инфекции регионах мира - странах Юго-Восточной Азии (Вьетнам, Камбоджа, Малайзия, Сингапур, Таиланд), северных областях Австралии, Индии, Китае [79, 80, 210, 215, 216]. Спорадические случаи заболевания регистрируются в тропических областях Америки и Африки, Филиппин, Мексики, Папуа Новой Гвинеи [88, 158, 173]. Так, например, в Таиланде причиной 20 % всех случаев бактериальной пневмонии и 40 % летальных исходов от острой септицемии является мелиоидозная инфекция [156]. Приведенные сведения свидетельствуют о том, что в указанных регионах мелиоидоз занимает одно из ведущих мест в структуре инфекционной патологии и смертности.

Для России мелиоидоз не является эндемичным заболеванием и относится к числу «экзотических инфекций». Однако, наличие обширных экономических и культурных контактов со странами Юго-Восточной Азии, Индостана, Центральной Америки и Южной Америки, Африки, а также существование эндемичных очагов В. р8еис1ота1Ш на сопредельных территориях (Иран, Китай), требует готовности медицинской и ветеринарной служб страны к возможным случаям появления этого заболевания.

Мелиоидоз отличается многообразием клинических проявлений, поэтому даже в эндемичных регионах первичный диагноз редко бывает верным. До подтверждения бактериологическим методом, больных мелиоидо-зом зачастую лечат под диагнозом лихорадки, флегмоны, фарингита, пневмонии, туберкулеза, артрита, холецистита, малярии [132, 217]. Легочная форма этого заболевания занимает особое место, так как характеризуется тяжелым течением и высокой летальностью. Не исключено, что больные с мелиоидозной пневмонией, интенсивно выделяющие инфект в окружающую среду, представляют эпидемическую опасность [68, 84, 182].

О том, что органы дыхания могут являться первичными воротами инфекции при мелиоидозе в естественных условиях, накоплено достаточно фактов. Указанный механизм заражения рассматривают как равнозначный или второй по значению после чрескожного. Вероятно, этим можно объяснить тот факт, что в странах Юго-Восточной Азии легочный мелиоидоз -наиболее распространенная форма заболевания, хотя чаще всего путь инфицирования не был установлен [82, 100, 131,160, 176]:

Вторая возможная причина появления больных с легочной формой мелиоидоза - аварийные ситуации в специализированных учреждениях научного или иного профиля, осуществляющих работу с возбудителем. По различным оценкам, 65-80 % внутрилабораторной заболеваемости составляют аэрогенные инфекции, вызванные соответствующими возбудителями, в том числе В. pseudomallei и В. mallei [155, 180]. В таких случаях неизбежно появление больных с легочными формами инфекции, сопровождающимися, как правило, тяжелой клинической картиной.

И, наконец, третий аспект проблемы - преднамеренное создание бактериального аэрозоля. Возбудитель мелиоидоза по многим свойствам отвечает требованиям, предъявляемым к вероятным биологическим поражающим агентам (БПА) [145, 207, 212]. Анализ материалов Второй обзорной конференции стран - участниц Конвенции (1986 г.), первого в США симпозиума по биотерроризму (1999 г.), позволяет оценить реальность возникновения такой ситуации, а возможные последствия подобных акций легко прогнозируются.

Указанные обстоятельства объясняют необходимость разработки средств защиты от легочного мелиоидоза, которые, как известно, должны базироваться на знании особенностей механизма развития заболевания.

Эти вопросы в определенной степени решены для инфекции, вызванной типичными по антигенному составу штаммами возбудителя мелиоидоза, однако, не изучены при использовании для заражения микроба с измененной антигенной структурой. Ранее было установлено, что утрата возбудителем мелиоидоза одного из признаков, детерминирующего патогенность — поверхностного биомолекулярного комплекса, обозначенного как антиген 8 (Аг8) [34], с которым связывают антифагоцитарную активность микроба, приводит к авирулентности возбудителя для относительно резистентных к мелиоидозу белых мышей и крыс при парентеральных способах инфици рования [1,4]. Однако, при аэрогенном заражении Аг8" вариантами микроба, данные экспериментальные модели проявляли чувствительность к инфекции, что определило целесообразность проведения дальнейших исследований особенностей развития и протекания инфекционных процессов, вызванных атипичными формами микроба [1, 2, 4]. Исследования такого рода, по нашему мнению, представляют как теоретический интерес в плане оценки патогенетической роли отдельных факторов вирулентности микроба и исследования механизмов адаптации микробных клеток атипичных штаммов в условиях макроорганизма, так и имеют важное практическое значение, поскольку могут дать сведения, необходимые для дальнейшего совершенствования тактики защитных мероприятий, в том числе схемы лабораторной диагностики заболевания.

Цель работы - изучение особенностей течения экспериментального легочного мелиоидоза при аэрогенном заражении штаммами ВигккоЫепа рзеис1ота1Ш с различным антигенным составом.

Задачи исследования:

1. Разработать экспериментальную модель легочного мелиоидоза на белых крысах при аэрозольном заражении штаммом В. р$еис1ота1Ш, дефектным по синтезу Аг8.

2. Дать сравнительную характеристику легочной инфекции, вызванной типичным и атипичным штаммами мелиоидозного микроба. Сформулировать основные закономерности механизма развития легочного мелиоидоза у белых крыс при аэрогенном заражении дефектным по Аг8 штаммом В. ряеис1ота11е1.

3. Провести сравнительный анализ продукции внеклеточных гидролаз типичными и атипичными штаммами В. р$еис1ота1Ы на различных стадиях инфекционных процессов у экспериментальных животных, зараженных подкожным и аэрогенным методами.

4. Исследовать вариабельность антигенного состава типичных и атипичных штаммов В. р$еис1ота11ец изолированных от животных с различным клиническим течением и на отдельных стадиях заболевания.

5. Оценить эффективность имеющихся средств иммунодиагностики для исследования проб биологического материала от животных, экспериментально инфицированных типичным и атипичным по антигенной структуре штаммами возбудителя.

Научная новизна. В ходе выполнения диссертационной работы впервые:

1. Разработана экспериментальная модель легочного мелиоидоза на белых крысах с атипичным течением острой формы заболевания и доброкачественным исходом.

2. Получены новые сведения о механизмах развития легочного мелиоидоза белых крыс, вызванного штаммами возбудителя с различной антигенной структурой: охарактеризованы патологоанатомические и патоморфологические изменения макроорганизма при инфекционном процессе, исследованы особенности диссеминации атипичного штамма возбудителя мелиоидоза в ходе экспериментальной инфекции, изучены особенности взаимодействия микроба с клетками системы мононуклеарных фагоцитов в легких экспериментальных животных.

3. Получены новые сведения об особенностях экспрессии генов цито-кинового ответа клеток иммунной системы экспериментальных животных в ходе инфекционного процесса, вызванного штаммами В. рзеис1ота1Ш различной вирулентности и В. 1ИаИапс1еп818.

4. Показано значение секретируемых микробом гидролаз различной субстратной специфичности на развитие экспериментальной аэрогенной инфекции, вызванной штаммом В. ряеи(1ота1Ш с атипичной антигенной структурой.

5. Показаны различия в уровне продукции отдельных поверхностных антигенов у штаммов В. р8еийота11е1, выделенных в различные сроки от экспериментальных животных (белых крыс и морских свинок) с различными способами инфицирования и клиническими формами.

6. По материалам проведенных исследований получен патент на изобретение № 2257413 «Штамм бактерий В. 1каИапс1ет18 — авирулент-ный имитатор возбудителя мелиоидоза» (зарегистрирован 27.07.2005г.).

Практическая ценность.

1. Определены технические и биологические условия воспроизведения на белых крысах легочного мелиоидоза в острой форме с атипичным течением и доброкачественным исходом заболевания. Экспериментальная модель могут быть использованы для решения различных вопросов биологии возбудителя и проблем прикладного характера, связанных с разработкой средств специфической профилактики и совершенствованием лабораторной диагностики. Материалы исследования составили основу «Методических рекомендаций по экспериментальному моделированию легочного мелиоидоза, вызванного атипичным штаммом Pseudomonas pseudomallei» (утверждены директором Волгоградского НИПЧИ 23.12.2001)

2. Установлено, что утрата мелиоидозным микробом способности синтезировать Аг8 не приводит к полной потере возбудителем вирулентности при аэрогенном способе инфицирования, а течение заболевания, вызванного атипичными вариантами возбудителя, определяют продуцируемые микробом экзоферменты. Выявленные особенности инфекционного процесса могут явиться основой для коррекции тактики диагностических и профилактических мероприятий при легочной форме мелиоидоза.

3. Показана эффективность тест-системы иммуноферментной для обнаружения, антигенов мелиоидоза, разработанной в Волгоградском научно-исследовательском институте, для исследования проб биологического материала от животных, экспериментально инфицированных типичным и атипичным по антигенной структуре штаммами возбудителя.

4. Совокупность полученных результатов может быть использована для планирования дальнейших исследований по изучению патогенетической роли отдельных биополимеров возбудителя мелиоидоза.

5. Материалы исследования вошли в «Практическое пособие для подготовки врачей-бактериологов и эпидемиологов по вопросам противодействия^ биотерроризму» (Волгоград, 2004 г.).

Диссертация выполнена в рамках 8 плановых научноисследовательских тем ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная экспериментальная модель легочного мелиоидоза белых крыс с использованием аэрозоля штамма В. ряеис1ота1Ш 10016-1, дефектного по синтезу Аг8, позволяет исследовать особенности течения мелиоидозной инфекции, вызванной атипичными вариантами возбудителя.

2. Продукция клетками В. р$еис1ота1Ш обладающего антифагоцитарной активностью антигена 8 и внеклеточных протеаз является определяющим фактором диссеминации микроба в организме аэрогенно инфицированных животных и соответствующих патоморфологиче-ских изменений в органах и тканях макроорганизма.

3. Продукция внеклеточных гидролитических ферментов клетками атипичных по антигенной структуре вариантов В. рБеийотсЛЫ является ведущим фактором, определяющим способность возбудителя к выживанию в инфицированном макроорганизме.

4. Анализ экспрессии генов цитокинов ТЫ- и ТЬ2-профилей клеточного ответа может быть информативным инструментом исследования процессов стимуляции различных звеньев иммунной системы при анализе особенностей течения инфекции, вызванной штаммами В. ряеис1ота11е1 различной вирулентности.

5. Вариабельность экспрессии мажорных поверхностных антигенов у культур В. ряеис1ота1Ы, выделенных от животных с различными клиническими формами инфекции, и увеличение уровня продукции антигенов 39, 42 и 90 - 120 Ша у изолятов В. р8еи<Лота1Ш от животных с развившейся острой формой инфекции свидетельствует о патогенетической значимости обозначенных биополимеров.

6. Тест-система иммуноферментная для обнаружения антигенов сапа и мелиоидоза эффективна для серологической диагностики инфекции, вызванной типичным и атипичным по антигенной структуре штаммами возбудителя.

Апробация работы.

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международной научно-практической конференции «Problems of biological and ecological safety» (Оболенск, 2000), IV межгосударственной научно-практической конференции «Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней» (Саратов, 2003), VII Межгосударственной научно-практической' конференции государств-участников СНГ «Чрезвычайные ситуации, международного значения в общественном здравоохранении- в решениях Санкт-Петербургского саммита- «Группы восьми» и санитарная охрана территорию государств-участников Содружества Независимых Государств» (Оболенск, 2006), VIH' Межгосударственной, научно-практической конференции государств-участников СНГ «Международные медико-санитарные правила и реализация глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями в- государствах-участниках СНГ» (Саратов; 2007), научных конференциях ФГУЗ ВолгоградНИПЧИ 2003 - 2007 гг.

Структура и объём диссертации

Диссертация-изложена на 116 листах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 219 работ, в том числе 46/отечественных и 173 иностранных авторов. Работа иллюстрирована 5 таблицами-и 12 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Перепелицына, Светлана Валерьевна

выводы

1. Разработана экспериментальная модель острой формы легочного мелиоидоза с доброкачественным течением у белых крыс с использованием аэрозоля штамма В. р8еис1ота1Ш 100-16-1, дефектного по синтезу Аг8.

2. К особенностям процесса диссеминации типичного вирулентного штамма В. рБеис1ота11е1 в организме белых крыс при аэрогенном способе инфицирования следует отнести локализацию микроба в трахее, легких, затем - в регионарных лимфоузлах, развитие бактериемии на 2-3 сутки и последующее интенсивное размножение клеток возбудителя во внутренних органах.

3. Показано, что при аэрогенном инфицировании животных сублетальными дозами В. р8еис1ота1Ш 100-16-1 (Аг8~) возбудитель преимущественно локализуется в месте аппликации (трахея) и регионарных лимфоузлах. Слабо выраженная бактериемия обнаруживается у 40 % животных; размножение возбудителя в органах системы мононукле-арных фагоцитов отсутствует.

4. Выявлены особенности патоморфологической картины инфекционного процесса у белых крыс при заражении дефектным по Аг8 штаммом возбудителя мелиоидоза В. рБеис1ота11е1 100-16-1, заключающиеся в отсутствии специфических мелиоидозных гранулём в печени и селезёнке во все сроки наблюдения и преобладании продуктивных процессов в легочной ткани, направленных на отграничение и рассасывание очагов воспаления.

5. Установлена ведущая роль внеклеточных гидролитических ферментов в развитии острого лёгочного мелиоидоза с доброкачественным течением у белых крыс, вызванного антигенным вариантом В. рвеи-с1ота1Ш 100-16-1. Выявлено, что протеолитическая активность клеток атипичного штамма возрастает более чем в 10 раз, а гемолитическая — более чем в 20 раз в 1 -2 сутки инфекционного процесса, при этом коллагеназная и эластазная активность клеток атипичного штамма сохраняется вплоть до терминальной стадии заболевания.

6. Показано, что профили экспрессии цитокиновых генов, характерные для полноценного ТЫ-типа клеточного ответа наблюдаются только при инфицировании животных штаммом В. 1каПапс1ет18 и мутант-ным штаммом возбудителя мелиоидоза со сниженой вирулентностью. Инфекционный процесс, вызванный вирулентным штаммом В. рйеийотаИег, характеризуется ранним снижением продукции цито-кинов и возрастанием количества мРНК 1Ь-10 к поздним срокам наблюдения.

7. Выявлена вариабельность и отличия экспрессии ряда поверхностных антигенов у культур типичного вирулентного штамма В. рБеи-(1ота1Ш 100 и дефектного по продукции антигена 8 штамма В. рэеи-с1ота1Ш 100-16-1, выделенных от экспериментальных животных при различных способах инфицирования и клинических формах инфекции:

8. Показано, что «Тест-система иммуноферментная для/ обнаружения антигенов сапа; и мелиоидоза», разработанная в; Волгоградском? на- . учно-исследовательском противочумном институте; эффективна для выявления дефектных по Аг8 штаммов возбудителя мелиоидоза в пробах , биологического материала от экспериментальное инфицированных животных.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Лёгочная форма мелиоидоза - один из наиболее распространённых клинических вариантов инфекции, который характеризуется тяжестью, высокой летальностью и трудностью лечения. Есть основания считать, что лёгочная ткань имеет повышенную чувствительность к возбудителю мелиоидоза, а в совокупности с тем, что входными воротами для инфекта является весь дыхательный тракт, а не отдельные участки, понятна та легкость, с которой происходит аэрогенное заражение людей и животных в природных и экспериментальных условиях [31].

Указанные обстоятельства объясняют необходимость разработки адекватных мер защиты, которые, как известно, должны базироваться на знании особенностей механизма развития заболевания. Эти вопросы интенсивно разрабатываются в научных лабораториях ряда стран, объектом исследования в которых являются типичные вирулентные штаммы В. р8еис1ота11е1. Вместе с тем, допускается, что мелиоидозный микроб может персистировать в изменённых формах (например, клоны с измененной антигенной структурой), способных вызывать атипичное клиническое течение инфекции [1,4, 15]. Ранними исследованиями установлено, что утрата способности продуцировать поверхностный Аг8 приводит к авирулентно-сти возбудителя для резистентных к мелиоидозу белых мышей и крыс [34]. Однако, при аэрогенном способе инфицирования, белые крысы оказались чувствительными к заражению. Это определило целесообразность изуче

4 ния экспериментальной мелиоидозной инфекции, возникающей после аэрогенного заражения дефектным по Аг8 штаммом В. рзеис1ота11е1 с целью анализа особенностей течения вызываемой им инфекции, что, возможно, может послужить основой для корректировки тактики лечебных, профилактических и диагностических мероприятий при мелиоидозе.

В связи с вышеизложенным было проведено сравнительное изучение патогенетического действия штаммов возбудителя мелиоидоза с раз-• личным антигенным составом при аэрогенном заражении экспериментальных животных. В качестве биологической модели использовались белые крысы. Экспериментально установленная величина ЛД50 при заражении животных атипичным штаммом В. ряеис1ота11е1 100-16-1, составила 1,2 х 105 ж.м.к., что значительно превышало тот же показатель для исходного штамма В. ряеис1ота11е1 100 (ЛД5о =3x10 ж.м.к.). При заражении белых крыс равноэффективными дозами типичного и атипичного (Аг8 ) штаммов возбудителя мелиоидоза наблюдали существенные различия в клинил ческом течении заболевания. Если у животных, заражённых дозой 4x10 : ж.м.к. штаммов В. ряеис1отаЦе1100, возникала острая форма лёгочного мелиоидоза, приводящая через 5-7 сут к 100 % гибели животных, то у крыс, зараженных штаммом В. рзеис1ота1Ш 100-16-1 в той же дозе наблюдали доброкачественное течение острой инфекции, ограничивающееся в основном поражением легких без выраженных признаков септицемии, заканчивающееся выздоровлением до 90% особей.

При заражении экспериментальных животных большими дозами (1x10 ж.м.к.) атипичного штамма В. ряеис1ота11е1 100-16-1, лёгочный ме-лиоидоз протекал по такой же схеме, как и при инфицировании вирулент-: ным штаммом возбудителя. Характеризовался обширной обсемененностью практически всех органов (даже более интенсивной, чем у типичного штамма) и выраженными некротическими измененими в печени.

Иммунохимический анализ на наличие Аг8 у культур В. ряеис1ота11е1 100-16-1, выделенных от павших животных, показал отсутствие реверсии изолятов к исходному фенотипу.

Исследования динамики распространения клеток штамма дикого типа и его антигенного варианта в макроорганизме показали существенные различия. К особенностям процесса диссеминации вирулентного штамма в организме белых крыс можно отнести следующее: локализация микроба в трахее, легких, затем - в регионарных лимфоузлах, развитие бактериемии на 2-3 сутки, попадание в органы системы мононуклеарных фагоцитов и последующее интенсивное размножение клеток возбудителя во внутренних органах с максимальными показателями обсемененности к моменту гибели животных. У больных животных специфическая микрофлора выделялась не только из крови и мочи, но и из слюны.

При небольших дозах заражения (4x10 ж.м.к.) штаммом В. рБеи-. с1ота11е1 100-16-1 закономерность распространения клеток была иной. В течение пяти дней после заражения возбудитель локализовался в месте аппликации инфекта и регионарных лимфоузлах, что указывало на его более низкую инвазивность. Бактериемия была слабо выражена и обнаруживалась у 40 % животных лишь в терминальной стадии заболевания, при этом, в моче возбудитель не выявлялся. Несмотря на наличие элементов воспаления в печени, размножение возбудителя в органах системы мононуклеарных фагоцитов отсутствовало. При доброкачественном течении острой инфекции выраженные патоморфологические изменения наблюдались . только в лёгких, что подтверждалось соответствующими исследованиями.

Таким образом, диссеминация клеток штамма В. рзеис1ота11е1 10016-1 (Аг8") у белых крыс при лёгочном мелиоидозе определялась дозой заражения, что естественно. А отсутствие Аг8, по—видимому, не оказывало существенного влияния на этот процесс при больших заражающих дозах.

Сравнительное изучение патоморфогенеза мелиоидозной инфекции, вызванной полноценным и дефектным по Аг8 штаммами, показало значительные отличия в ее морфологических проявлениях. При аэрогенном заражении штаммом В. рБеис1ота1Ш 100 у белых крыс развивалась острая « лёгочная форма мелиоидоза, для которой было характерно: резкое расстройство гемодинамики в виде полнокровия и гемморагий; выраженные дистрофические процессы в паренхиматозных органах; наличие типичных, преимущественно экссудативного характера, гранулём в печени и селезёнке с выраженными дегенеративными изменениями в составляющих их клетках. В лёгочной ткани патология характеризовалась обширными воспалительными очагами, где преобладали процессы альтерации, экссудации, некроза и деструкции. Резко выраженная гипоплазия, а у некоторых животных аплазия лимфоидной ткани в селезёнке свидетельствовала о подавлении инфектом иммунных процессов и неспособности организма-хозяина сопротивляться инфекции.

Патоморфологическая картина у белых крыс, заражённых дефектным по Аг8 штаммом возбудителя мелиоидоза В. pseudomallei 100-16-1 в дозе 4.8 х 10 м.к., была иной по сравнению с изменениями внутренних органов животных, инфицированных полноценным штаммом. Отличия заключались в отсутствии специфических мелиоидозных гранулём в печени и селезёнке во все сроки исследования; в особенностях проявления воспаления в лёгких, где продуктивные процессы, направленные на отграничение и рассасывание очагов, превалировали над деструктивными; иммуно-морфологических изменениях в селезёнке, которые отражали напряжённость иммунных процессов и соответственно способность организма бороться с инфекцией.

Выявленные особенности патоморфологических изменений легочной ткани аэрогенно инфицированных животных в целом согласуются с известными картинами патоморфогенеза легочной формы мелиоидоза людей [47, 64, 68, 81, 134, 188], что свидетельствует в пользу адекватности выбранных экспериментальных моделей.

Электронно-микроскопические исследования показали, что дефектные по Аг8 клетки В. pseudomallei были подвержены завершённому фагоцитозу, в отличие от клеток вирулентного штамма. Отсутствие экспрессии Аг8 клетками В. pseudomallei 100-16-1 сопровождалось выраженным снижением процесса капсулообразования in vivo. Следует отметить роль капсульных полисахаридных антигенов патогенных буркхольдерий, которые, как было отмечено ранее, являются ведущим фактором устойчи-. вости микробов к воздействию ферментного комплекса фаголизосом клеток макроорганизма [171, 187]. При этом, штаммы В. pseudomallei и В. mallei, дефектные по продукции биополимеров капсулы, демонстрировали значительное снижение вирулентности для различных экспериментальных моделей, и, как следует из данных электронно-микроскопических исследований, были более подвержены завершенному фагоцитозу [76, 95, 167].

Таким образом, полученные результаты подтверждают значение касульного Аг8 в развитии комплекса патоморфологических изменений при различных клинических формах проявления мелиоидозной инфекции , и свидетельствуют о значимости данного антигена в реализации патогенных свойств В. pseudomallei.

Учитывая отличия в патогенезе легочного мелиоидоза, вызванного типичным и мутантным штаммами В. pseudomallei, возникает вопрос о механизмах реализации патогенных свойств штаммом В. pseudomallei 100-161, лишенным одного из главных факторов вирулентности. Естественно было предположить активацию у микроба других патогенетических значимых механизмов, определяющих способность инфекта противостоять действию различных звеньев иммунной системы макроорганизма и колонизи-, ровать органы и ткани организма-хозяина. В первую очередь, мы обратили внимание на способность клеток микроорганизма продуцировать комплекс внеклеточных гидролаз, которые, как известно, выполняют функцию адаптации возбудителя мелиоидоза к изменяющимся условиям обитания [4].

Секретируемые В. pseudomallei ферменты демонстрируют протеоли-тическую и гемолитическую активность, выраженный дермонекротиче-ский эффект [35]. Характерной особенностью экзопротеаз В. pseudomallei является способность гидролизовать компоненты соединительной ткани эластин и коллаген, при этом особое место в развитии патологических явлений при мелиоидозе отводят эластазе Mr 29.5 kDa, которая существенно влияет на процесс инвазии микроба, а также обладает выраженной,способностью расщеплять эластин лёгочной ткани. Вероятно, этим фактором можно объяснить высокий тропизм мелиоидозного микроба к лёгким [15, 21,115].

Для оценки роли экстрацеллюлярных ферментов в патогенезе ме-лиоидозной инфекции были изучены количественные показатели активности комплекса протеаз у типичного и лишенного Аг8 штаммов возбудите, ля, изолированных на разных стадиях развития экспериментального ме-лиоидоза, при различных способах заражения.

У культур В. pseudomallei 100, выделенных от белых крыс при подкожном заражении дозой lx 106 ж.м.к., протеолитическая активность повышалась в 2 - 4 раза в период острой фазы заболевания (2-3 сут), а к 5 суткам показатели протеолиза снижались до исходных величин. Активность комплекса внеклеточных ферментов в отношении ряда субстратов (эритроциты, коллаген, эластин) in vitro уменьшалась, хотя дермонекротическое воздействие in vivo, при этом, несколько возрастало.

При подкожном заражении белых крыс штаммом В. pseudomallei 100 в более высокой дозе (5 х 10 ж.м.к.) отмечали значительное увеличение активности бактериальных ферментов, причём динамика данного увеличения соответствовала стадиям развития инфекционного процесса. После 48-часового периода адаптации, по мере развития патологических явлений в макроорганизме, наибольшие показатели активности ферментов были зарегистрированы на 3 - 4 сутки, в разгар заболевания. о

При подкожном заражении белых крыс дозой 5x10 ж.м.к. штаммом В. pseudomallei 100-16-1, лишенным Аг8, динамика ферментативной ак-. тивности возбудителя соответствовала слабовыраженной картине патоло-гоанатомических изменений внутренних органов и их незначительной бактериальной обсеменённости: протеолитическая и гемолитическая активности практически не отличались от исходного уровня, эластазная и колла-геназная активности заметно снижались, а дермонекротическая активность увеличивалась незначительно, примущественно у культур, выделенных в первые сутки.

Таким образом, анализ активности внеклеточных ферментов типичных и атипичных культур возбудителя мелиоидоза при подкожном заражении показал, что полноценный по антигенному составу штамм при благоприятных для микроба условиях реализует весь потенциал патогенетических механизмов и активизирует все факторы патогенности, которые способствуют повышению инвазии микробных клеток на ранних стадиях развития заболевания. При этом утрата возбудителем мелиоидоза Аг8 не компенсируется значительным усилением ферментативной активности, так как, возможно, уже в первые часы после заражения происходит интенсивное блокирование бактерий клетками СМФ.

При аэрогенном заражении белых крыс штаммом В. pse.udoma.llei 100 о , дозой 4x10 культуры, выделенные от животных имели в 5 раз более высокий уровень протеолитической активности, чем исходный штамм. Гемолитическая, эластазная и коллагеназная активности возрастали незначительно. Максимальный уровень активности бактериальных ферментов отмеча-' ли в разгар заболевания, начиная с 3 суток. Дермонекротической пробы, в отличие от культур, выделенных при подкожном заражении, имели не только зону воспаления, но и зону некроза диаметром до 5 мм.

Нарастание ферментативной активности изолятов при аэрогенном о заражении белых крыс дозой 4x10 ж.м.к. штамма В. р8е^ота1Ш 100-161, дефектного по продукции Аг8, было более выраженным. Имея и без того более высокий по сравнению с типичным штаммом исходный уровень ] протеолитической и гемолитической активностей, на 2 сут после заражения изоляты более чем в 5 раз повышали протеолитическую активность и в 7-10 раз - гемолитическую. Также наблюдали резкое повышение коллагеназной и эластазной активностей, обеспечивающих полный гидролиз субстратов. Динамика изменения дермонекротической пробы соответствовала таковой при заражении типичным вирулентным штаммом.

Увеличение аспирационной дозы при заражении белых крыс штаммом В. рзеийотаИеЬ 100-16-1 до 7107ж.м.к., привело к существенному увеличению протеазной (в 10 раз), гемолитической (в 20 раз) активностей уже на 1 — 2 сутки после инфицирования. В эти же сроки коллагеназная и эластазная активности достигали максимума и сохранялись вплоть до терминальной стадии заболевания.

Таким образом, как в условиях аэрогенного, так и подкожного заражения активировался комплекс внеклеточных энзимов. Штамм В. рзеи-с1ота1Ы 100-16-1 (Аг8"), обладающий заметно большей исходной протео-литической и гемолитической активностью, чем вирулентный штамм В. р8еис1ота11е1 100, продемонстрировал более выраженное возрастание способности экстрацеллюлярных ферментов гидролизовать соответствующие субстраты при аэрогенном заражении. Данный факт свидетельствует о том, что механизм проявления вирулентных свойств возбудителя может быть реализован только в условиях благоприятных для жизнедеятельности патогенных микроорганизмов, которые, в частности, существуют в лёгочной ткани и, таким образом, способ заражения атипичным штаммом В. ръеи-с1ота11е1 100-16-1(Аг8") определяет течение и исход инфекционного процесса в эксперименте.

Учитывая существенную разницу в ферментативной активности при аэрозольном заражении у типичного штамма и штамма, лишенного Аг8, можно рассматривать активизацию внеклеточных энзимов у последнего как один из компенсаторных механизмов реализации патогенности.

Важная роль поверхностных антигенов и секреторных протеаз В. рвеис1отаПе1 в патогенезе мелиоидоза подтверждается также результатами сравнительного изучения процессов активации клеток иммунной системы экспериментальных животных,' инфицированных штаммами В. рБеи-с1ота11е1 и В. ЖаИапс1еп818 различной вирулентности. При выполнении данного раздела исследований мы использовали полноценный в антигенном отношении вирулентный штамм возбудителя мелиоидоза, дефектный по продукции экзопротеаз инсерционный мутант В. р8еис1ота1Ы 56770 99/10 и близкий возбудителю мелиоидоза в антигенном отношении, но авиру-лентный для различных биологических моделей, В. МаИапс1еп515.

Учитывая, что цитокины являются важнейшими иммунорегулятор-ными детерминантами, определяющими характер течения инфекции, были проанализированы различия в экспрессии- генов цитокинов ТЫ (ШЫ-у) и ТЪ2 (1Ь-4, 1Ь-10) - профилей иммунного ответа и макрофаг-стимулирующего интерлейкина 12 (1Ь-12) у белых мышей при экспериментальной инфекции, вызванной соответствующими штаммами.

Известны два основных типа цитокинового ответа при развитии инфекции. ТЫ-цитокиновый профиль, ключевыми компонентами которого являются П^-у, 1Ь-2, ЮТ-Р, и последующая индукция макрофаг-стимулирующего 1Ь-12, приводит к активации профессиональных фагоцитов и возрастанию резистентности макроорганизма к инфекционному агенту, тогда как ТЬ2-цитокиновый ответ, характеризующийся преимущественной продукцией 1Ь-4,1Ь-5,1Ь-6,1Ь-10 и 1Ь-13, напротив, ведет к снижению активности клеточного звена иммунитета [208].

Для сравнительного анализа особенностей клеточного иммунного ответа макроорганизма на инфекцию, вызванную штаммами буркхольде-рий с различным патогенетическим потенциалом использовали полуколичественный метод оценки уровня соответствующих матричных РНК в реакции обратной транскрипции с последующей амплификации (ОТ-ПЦР) [200, 201, 222].

Полученные при выполнении данного раздела результаты свидетельствовали о существенных различиях в экспрессии генов цитокинов при инфекции мышей, вызванной штаммом В. pseudomallei дикого типа, мутантом, недостаточным по продукции экзопротеаз и авирулентным В. thailandensis. Профили экспрессии цитокиновых генов, характерные для полноценного Thl-типа клеточного ответа наблюдались лишь у животных, инфицированных В. thailandensis, и, в несколько меньшей мере, при заражении мутантным штаммом возбудителя мелиоидоза. Инфекционный про: цесс, вызванный В. pseudomallei 100, напротив, характеризовался ранним снижением продукции цитокинов, стимулирующих клеточное звено иммунитета (IFN-y, IL-12), и возрастанием количества мРНК EL-10 к поздним срокам наблюдения, что, по-видимому, является свидетельством ингиби-рования различных звеньев межклеточных взаимодействий и процессов фагоцитоза. Ключевая роль проинфламматорных цитокинов и IL-12 в формировании определенного уровня устойчивости макроорганизма к ме-лиоидозной инфекции отмечалась неоднократно [118, 150, 190]; обнаруженные нами различия в экспрессии данных цитокинов у животных, ин-' фицированных вирулентным штаммом и вариантом, дефектным по продукции экзопротеаз, таким образом, еще раз подтверждают значимость последних в патогенезе мелиоидозной инфекции. Отметим также очевидную перспективность использования данного методического подхода для изучения особенностей патогенеза буркхольдериозов и иммунного ответа макроорганизма на молекулярном уровне.

Изменения экспрессии поверхностных биополимеров клетки является одним из важнейших адаптационных механизмов различных бактериальных патогенов в ходе инфекционного процесса. Выраженные изменения антигенного спектра инфекта при персистировании в организме-хозяине были отмечены у Legionella pneumophila [125], видов Streptococcus [148], Escherichia [151], Salmonella [103], Mycobacterium [113], Neisseria [137] и ряда других грамположительных и грамотрицательных патогенов.

В данном аспекте возбудитель мелиоидоза является пока еще весьма малоизученным видом. Хотя, судя по некоторым данным, антигенная изменчивость В. pseudomallei, проявляющаяся в ходе инфекционного процесса, представляет собой, скорее правило, чем исключение. Так, в исследовании структуры и антигенных свойств ЛПС клинических изолятов возбудителя мелиоидоза было отмечено, что в процессе персистенции микроба в организме больных имеет место заметное изменение антигенного спектра данной поверхностной структуры [55]. Вообще, судя по данным анализа геномной организации патогенных буркхолдерий, эти микроорганизмы обладают разнообразными генетическими механизмами контроля изменения уровня экспрессии селективно значимых поверхностных антигенных комплексов. Упомянем здесь, в частности, механизмы регуляции ^ экспрессии значимых в патогенетическом отношении биополимеров В. pseudomallei и В. mallei, связанные с изменениями соответствующих регу-ляторных геномных последовательностей [73, 172].

Нами было проведено изучение изменений в уровне продукции отдельных поверхностных антигенов у штаммов В. pseudomallei, выделенных в различные сроки от экспериментальных животных (белых крыс и морских свинок) с различными способами инфицирования и клиническими формами заболевания. Для анализа продукции поверхностных антигенов использовали иммуноблоттинг с IgG адсорбированной кроличьей сыворотки к комплексу Аг8 В. pseudomallei. Был исследован антигенный спектр тотальных лизатов клеток, а также препаратов клеточных мембран штаммов В. pseudomallei.

Иммуноблоттинг суммарных клеточных антигенов В. pseudomallei 100 и его авирулентного производного В. pseudomallei 100-16-1, выделенных из легких белых крыс с различными клиническими формами аэрогенной инфекции с использованием IgG адсорбированной кроличьей сыворотки к комплексу Аг8, показал значительное повышение уровня продукции антигена 200 kDa (основного структурного компонента комплекса Аг8) у штамма дикого типа, изолированного от животного с развившейся острой формой легочной инфекции. Отметим также, что культура штамма В. pseudomallei 100-16-1, выделенная от животного с доброкачественным течением инфекции, сохраняла дефект продукции антигена 200 kDa.

Иммуноблоттинг препаратов клеточных мембран культур выявил увеличение уровня продукции мембранных белков 27, 42 и 90 kDa и заметное снижение экспрессии мембранного белка 110 kDa у культур штамма В. pseudomallei 100 от животных с острой формой инфекции.

Штамм В. pseudomallei 100-16-1 (Аг8"), изначально характеризовался сниженным уровнем продукции, мембранных антигенов 42 и 90 kDa и отсутствием экспрессии белка 110 kDa. У культур В. pseudomallei 100-16-1, выделенных от животного с доброкачественным течением аэрозольной инфекции, наряду с существенным снижением продукция белка размером 39 kDa, наблюдали появление выраженной экспрессии белка 42. При острой инфекции после подкожного заражения этим же штаммом картина была несколько иной: значительно увеличивалась продукция белков размером 39, 42 и выявлялась экспрессия антигена 90 kDa. Отличия от типичного штамма заключались только в отсутствии экспрессии продукции белка * 110 kDa.

Во многом сходные результаты были получены при анализе изменений продукции антигенов клеточных мембран у культур В. pseudomallei 100, выделенных от инфицированных внутрибрюшинно белых крыс. Нами было отмечено увеличение уровня продукции мембранных протеинов 27, 39, 42 и 90 - 120 kDa у культур штамма, выделенных от животных с развившейся острой формой инфекции.

Заключительным этапом исследований была оценка эффективности использования имеющегося коммерческого иммунодиагностического препарата «Тест-системы иммуноферментной для обнаружения антигенов сапа и мелиоидоза» для исследования проб биологического материала, взятых в различные сроки от животных, экспериментально инфицированных типичным и атипичным по антигенной структуре штаммами возбудителя.

В пробах органов от животных с острой аэрогенной формой заболевания, зараженных типичным штаммом В. р8вис1ота11е1 100, детекция антигенов была положительной, начиная со 2 суток и далее в течение всего срока наблюдения. При моделировании острой формы инфекции с под. кожным заражением, положительные пробы отмечены в более поздние сроки, на 7 - 9 сутки наблюдения.

Анализ проб от животных с острой и хронической формами мелиоидоза, вызванного штаммом В. ряеийотсЛШ 100-16-1 показал, что в случае аэ-рогенно инфицированных животных с развившейся в дальнейшем острой формой заболевания, положительные результаты ТИФА также отмечались в ранние сроки (3 сутки и далее).

Таким образом, «Тест-система иммуноферментная для обнаружения антигенов сапа и мелиоидоза» может использоваться для детекции атипич-. ного вариантов возбудителя мелиоидоза, лишенных Аг8, в пробах биологического материала при экспериментальной инфекции.

Список литературы диссертационного исследования кандидат медицинских наук Перепелицына, Светлана Валерьевна, 2009 год

1. Алексеев В.В, Кивокурцева Т.Ю., Замараева C.B. Экологические аспекты механизма адаптации возбудителя мелиоидоза // Поволжский экологический вестник. Волгоград, 2002. - В.9. - С. 203 - 204.

2. Алексеев В.В., Тихонов Н.Г., Вязьмина Т.Н. Патогенез, патологическая анатомия и патологическая морфология мелиоидоза // Ме-лиоидоз: Сб. науч.тр. Волгоград, 1995. - С.91 - 119.

3. Аксёнов М.Ю., Гинсбург A.JI. Диагностика инфекционных заболеваний с помощью метода полимеразной цепной реакции // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 1993. - №4. -С. 3-8.

4. Антонов Ю.В., Илюхин В.И., Поповцева Л.Д. Чувствительность псевдомонад к современным антибактериальным препаратам // Антибиотики и химиотерапия. 1991. - Т.36, № 1. - С. 14 - 16.

5. Антонов В.А., Ткаченко Г.А., Алтухова В.В. и др. Использование ПЦР для идентификации Burkholderia mallei Н Мол. генет., мик-робиол., и вирусол. 2004. - № 1. - С. 12 - 17.

6. Ашмарин И.П., Воробьев A.A. Статистические методы в микробиологических исследованиях. Ленинград: Гос изд-во мед. лит. 1962.- 181 с.

7. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдо-монозы // М.: Медицина. 1990. - 138 с.

8. Вертиев Ю.В. // Журнал микробиол., эпидемиол., иммунобиол.-1987. № 3. - С.86-93.

9. Викторов Д.В., Пивень Н.Н., Смирнова В.И. Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций // Материалы Российской научной конференции Волгоград, 1992. - 82 с.

10. Вязьмина Т.Н., Тихонов H.F., Лесовой B.C. Патоморфология экспериментального мелиоидоза в зависимости от антигенного строения возбудителя // Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций. Волгоград, 1992. - 84 с.

11. Изучение особенностей патогенеза экспериментального лёгочного при заражении штаммами B.pseudomallei, обладающими различными свойствами. Отчёт о НИР (заключительный) / Волгоградский н.-и. противочумный институт. Руководители Алексеев

12. B.В., Вязьмина Т.Н. Волгоград, 1998. - ГР 01.9.50001.341. - 48 с.

13. Илюхин В.И., Авчукова Л.В. Гемолизины патогенных псевдомонад // Особо опасные инфекционные заболевания;, диагностика, профилактика и биологические свойства возбудителей. Сб. на-уч.тр. Волгоград, 1990. - Вып.4. - С. 89 - 91.

14. Илюхин В.И., Батманов В.П. Клиника и лечение мелиоидоза // Мелиоидоз: Сб. науч.тр. Волгоград, 1995. - С.142 - 147.

15. Илюхин В.И., Замараев B.C., Батманов В.П. и др. Мелиоидоз // Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней. -Саратов, 1998 Т.2 - С.115 - 143.

16. Илюхин В.И., Сенина Т.В., Плеханова Н.Г. Burkholderia thailan-densis: биологические свойства, идентификация и таксономическая позиция // Мол. генет., микробиол., вирусол. 2002. - №1.1. C.7-11.

17. Илюхин В.И., Храпова П.Н., Замараев B.C. Диагностика возбудителей опасных инфекционных болезней // Сап Саратов, 1998 -Т.2.-С. 101 - 114.