Экспрессия синтетических генов антибактериальных пептидов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Мартемьянов, Кирилл Анатольевич

• Мартемьянов, Кирилл Анатольевич
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мартемьянов, Кирилл Анатольевич

I. ВВЕДЕНИЕ.

И. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Антибактериальные пептиды

1.1. Открытие и разнообразие антибактериальных пептидов.

1.2. Классификация антибактериальных пептидов.

1.3. Структура антибактериальных пептидов.

1.4. Механизм антибактериального действия.

1.5. Биосинтез антибактериальных пептидов и организация их генов.

2. Клонирование и экспрессия генов . ;

2.1. Подходы к конструированию синтетических генов.

2.2. Прокариотические системы экспрессии генов in vivo.

2.3. Прокариотические системы экспрессии генов in vitro.

2.4. Клонирование и экспрессия генов антибактериальных пептидов.

Резюме.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

III. МАТЕРИАЛЫ.

1. Оборудование.

2. Реактивы.

3. Буферные растворы и среды.

4. Бактериальные штаммы.

5. Олигонуклеотиды.

IV. МЕТОДЫ.

1. Синтез и очистка олигонуклеотидов.

2. РРЬС-хроматография.

3. Обессоливание и концентрирование ДНК.

4. Фосфорилирование олигонуклеотидов.

5. Электрофорез белков и пептидов в полиакриламидном геле.

6. Электрофорез нуклеиновых кислот.

7. Авторадиография и флюорография.

8. Приготовление компетентных клеток.

9. Трансформация компетентных клеток.

10. Выделение ДНК плазмид.

11. Рестрикция ДНК.

12. Дефосфорилирование 5' концов ДНК.

13. Отжиг олигонуклеотидов и лигирование.

14. Полимеразная цепная реакция.

15. Определение нуклеотидной последовательности.

16.1п укго транскрипция/трансляция в Б-ЗО экстракте.

17. Индукция т экспрессии генов.

18. Разрушение клеток и приготовление Б-100 экстракта.

19. Выделение гибридных белков.

20. Расщепление белка по метионину.

21. Обнаружение антибактериальной активности.

V. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Конструирование генов.

1.1. Выбор антибактериальных пептидов.

1.2. Экспериментальный подход к синтезу генов антибактериальных пептидов.

2. Синтез и клонирование генов антибактериальных пептидов.

2.1. Получение олигодезоксирибонуклеотидов.

2.2. Сборка и клонирование генов пептидов.

3 Прямая экспрепссия генов антибактериальных пептидов.

3.1. Создание генетических конструкций.

3.2. In vivo экспрессия генов пептидов в E.coli.

3.3. In vitro экспрессия генов антибактериальных пептидов в бесклеточной системе трансляции.

4 Экспрессия химерных генов антибактериальных пептидов.

4.1. Разработка метода мультимеризации генов.

4.2. Генетческие конструкции для экспрессии химерных генов антибактериальных пептидов.

4.3 In vivo экспрессия генов химерных белков.

4.4. In vitro экспрессия генов химерных белков.

4.4.1. Экспрессия тандемно повторенного гена цекропина.

4.4.2. Экспрессия химерного гена GFP-тандемно повторенный цекропин.

5. Биосинтез белка в полностью бесклеточной системе.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия синтетических генов антибактериальных пептидов»

Возможность существования живых организмов неразрывно связана с их способностью защищать собственную внутренную среду от влияния повреждающих факторов. Все высшие организмы, в частности, способны защищать себя от естественной и патогенной флоры бактерий.

Организация иммунной системы, выполняющей эту функцию, у представителей разных форм организмов отличается. Общим для всех многоклеточных организмов оказывается существование наиболее древнего звена, так называемой неспецифической иммунной системы, выполняющей роль перманентной защиты организма от инвазии (Medzhitov and Janeway, 1997). Среди множества белковых факторов, выполняющих эту функцию наиболее общими являются пептиды с выраженной антибактериальной активностью, называемые антибактериальными пептидами. Несмотря на то, что эти агенты были открыты менее 20 лет назад, к настоящему времени неоспоримым фактом можно считать их существование у всех животных и растений. Данные пептиды обладают широким спектром антибактериальной и фунгицидной активности, что делает их универсальными защитными агентами.

Вследствии очевидной важности антибактериальных пептидов для обеспечения жизнеспособности организмов, несомненным является все возрастающий интерес к изучению принципов их организации и особенностей действия. Возможной практической стороной результатов таких исследований могло бы оказаться применение антибактериальных пептидов для лечения и профилактики различных заболеваний.

Уникальность антибактериальных пептидов среди прочих антимикробных агентов заключается в том, что информация об их структуре кодируются ДНК, а сами пептиды синтезируются в виде предшественников белок - синтезирующим аппаратом клетки на рибосомах. Следовательно, существует возможность синтезировать такие пептиды биосинтетическим путем. В последнее время все больше обращают на себя внимание попытки получать пептиды используя технологию рекомбинантных ДНК. Несмотря на очевидные преимущества этого способа, существуют многочисленные трудности, препятствующие его реализации. Для осуществления биологического синтеза антибактериальных пептидов необходимо получение генов этих пептидов, изучение факторов, влияющих на их целенаправленную экспрессию и создание эффективных экспрессионных систем.

Целью настоящей работы является разработка способов биосинтетического производства пептидов, включающая в себя решение таких задач, как: синтетическое получение генов антибактериальных пептидов, создание экспрессионных конструкций для них, изучение факторов, влияющих на уровень экспрессии синтетических генов пептидов и их биосинтетическое производство.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Мартемьянов, Кирилл Анатольевич

VI. выводы

1. Сконструированы, синтезированы и клонированы гены антибактериальных пептидов: магаинина, бомбинина и цекропина.

2. Разработан эффективный метод получения тандемных повторов генов на основе полимеразной цепной реакции. Метод успешно применен для мультимеризации гена цекропина.

3. Для генов антибактериальных пептидов созданы генетические конструкции позволяющие осуществлять их эффективную экспрессию в системах in vivo и in vitro.

4. В системе экспрессии E.coli получены гибридные белки, содержащие антибактериальные пептиды. Показано образование функционально активных антибактериальных пептидов: магаинина и цекропина при отщеплении их от белка- носителя.

5. Изучены факторы влияющие на эффективность целенаправленной экспрессии пептидов in vitro. При экспрессии гена цекропина в бесклеточной системе сопряженной транскрипции/ трансляции показано образование препаративных количеств активного пептида.

6. Экспериментально осуществлен основной биосинтетический путь от химического синтеза гена до биосинтеза белка, в полностью бесклеточных условиях.

6. Заключение.

Предложенный подход может быть использован для прямой in vitro экспрессии полипептидов и белков, нестабильных в живых клетках или являющихся крайне цитотоксичными. С использованием этого метода можно напрямую экспрессировать ПЦР амплифицированные гены, геномные фрагменты или непосредственно единичные копии генов в составе всей геномной ДНК. С помощью такого подхода можно также тестировать синтезированные белки без необходимости совершать операции по клонированию.

Следует отметить перспективность использования линейных ДНК матриц для программирования бесклеточного биосинтеза белка. Выгодной особенностью является то, что такие матрицы могут быть получены при помощи ПЦР. Это, в свою очередь, устраняет необходимость осуществлять трудоемкие операции по клонированию. К тому же такие фрагменты ДНК легко видоизменять в зависимости от требований конкретной ситуации и учета специфики системы экспрессии, т.е. при использовании набора мегапраймеров можно вводить и/или изменять регуляторные элементы, обеспечивающие эффективную экспрессию таких генов в любых бесклеточных системах.

Получение матрицы при помощи ПЦР позволяет легко вводить различные элементы, стабилизирующие мРНК и определять место окончания транскрипции. Создание и экспрессия генов гибридных белков и мутантов - эти задачи тоже удобно решаются используя ПЦР при получении линейных матриц для бесклеточных систем.

Таким образом, биосинтетическое производство полипептидов в полностью бесклеточных условиях представляется наиболее универсальным подходом к экспрессии генов, в то время как использование традиционных подходов, вовлекающих стадии in vivo, зачастую позволяет достигать более эффективного синтеза белков, но требует значительных усилий по индивидуальному подбору оптимальных условий при экспрессиии разных генов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мартемьянов, Кирилл Анатольевич, 1999 год

1. Остерман ДА. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование (практическое пособие).-М. .Наука, 1981, 288с.

2. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот,- М.:Наука, 1985.-536с.

3. Пратт Дж. Сопряженные прокариотические бесклеточные системы транскрипции-трансляции,- Транскрипция и трансляция. Методы. Под ред. Б.Хеймса, С.Хиггинса -М. Мир, 1987.-400с.

4. Спирин А.С. Экспрессия генов в бесклеточных системах в препаративном масштабе.-Биоорганическая химия 1992, 18, с.1394-1402.

5. Фонтана А. Фрагментация полипептидов химическими методами. Практическая химия белка. Под ред. А.Дарбре. -М.: Мир, 1989, 623с.

6. Balbas P., Soberon X., Merino E., Zurita E., Lomeli H., Valle F., Flores N., Bolivar F. Plasmid vector pBR322 and its special-purpose derivatives- a review.- Gene, 1986, 50, p.3-40.

7. Baranov V.I., Morozov I.Yu., Ortlepp S.A., Spirin A.S. Gene expression in a cell-free system on the preparative scale.- Gene 1989, 84, p.463-466.

8. Bechinger B., ZasloffM., Opella S.J. Structure and interactions of magainin antibiotic peptides in lipid bilayers: a solid-state nuclear magnetic resonance investigation.- Biophys. J. 1992, 62, p. 1214.

9. Bechinger B. Structure and functions of channel-forming peptides: magainin, melittin and alamethicin.- J. Membr. Biol. 1997, 156, p. 197-211.

10. Berger S.L. Rescue of a failed polymerase chain reaction catalyzed by vent or deep vent DNA polymerase with 10% dimethylsulfoxide.- Anal. Biochem., 1994, 222(1), p.290-293

11. Bevins C.L., ZasloffM. Peptides from frog skin.- Annu. Rev. Biochem., 1990, 59, p.395-414.

12. Boe F., Masson J.M. Selective cloning of a defined number of tandem DNA repeats in Eshcherihia coli- Nucl. Acids Res., 1996, 24(12), p.2450-2451.

13. Boman H.G., Hultmark D. Cell-free immunity in insects.-Annu. Rev. Microbiol., 1987, 41, p.103-126.

14. Boman H.G., Faye I., Gudmudson G. Cell-free immunity in Cecropia. A model system for antibacterial proteins.- Eur.J.Biochem., 1991, 201, p.23-31.

15. Boman H. Cecropins: antibacterial peptides from insects and pigs.- Phylogenetic Perspectives in Immunity: The Insect-Host Defense, 1994, ed. J. Hoffman, p.24-37, Austin, TX: Landes Biomed.

16. Boman H. Peptide antibiotics and their role in innate immunity.-Annu. Rev. Immunol., 1995, 13, p.61-92.

17. Broekaert W.F., Terras F.R., Cammue B.P., Osborn R.W. Plant defensins: novel antimicrobial peptides as components of the host defense system.- Plant Physiol. 1995, 108, p. 1353-1358.

18. Cabiaux V., Agerberth B., Johansson J., Homble F., Goormaghtigh E., Ruysschaert J.M. Secondary structure and membrane interaction of PR-39, a Pro+Arg-rich antibacterial peptide. -Eur. J. Biochem. 1994, 224, p. 1019-1027.

19. Callaway J.E., Lai J., Haselbeck B., Baltaian M., Bonnesen S.P., Weickmann J., Wilcox G., Lei S.P. Modification of the C terminus of cecropin is essential for broad spectrum antimicrobial activity.- Antimicrob. Agents Chemother. 1993, 37, p. 1614-1619.

20. Casimiro D.R., Toy-Palmer A., Blake R.C. 2d, Dyson H.J. Gene synthesis, high level expression, and mutagenesis of Thiobacillus ferrooxidans Rusticyanin: His 85 is a ligand to the blue copper center. Biochemistry., 1995, 34, p.6640-6648.

21. Casteels P., Ampe C., Jacobs F., Vaeck M., Tempst P. Apidaecins: antibacterial peptides from honeybees.- EMBO J. 1989, 8, p. 2387- 2391.

22. Casteels P., Ampe C., Riviere L. Isolation and characterisation of abaecin, a major antibacterial response peptide in the honeybee (Apis mellifera).- Eur.J.Biochem, 1990, 187, p.381-386.

23. Chaconas G., van de Sande J.H. 5'-32P Labeling of DNA and RNA restriction fragments, Methods Enzymol., 1980, 65, p. 75.

24. Chetverin A.B., Spirin A.S. Replicable RNA vectors: prospects for cell-free gene amplification, expression and cloning.- Progress in Nucleic Acid Research and Molecular Biology 1995, 51, p.225-270.

25. Christensen B., Fink J., Merrifield R.B., Mauzerall D. Chanell forming properties of cecropins and related model compounds incorporated into planar lipid membranes. -Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1988, 88, p.3792-3797.

26. Clark J.M. Novel non-templated nucleotide addition reactions catalyzed by procaryotic and eucaryotic DNA polymerases. Nucleic Acids Res., 1988, 16(20), p.9677-9686

27. Cline J., Braman J.C., Hogrefe H.H. PCR fidelity of pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases.- Nucleic Acids Res., 1996, 24(18):3546-3551

28. Collins J. Cell-free synthesis of proteins coding for mobilization functions of wlei and transposition functions of TN3 Gene, 1979, 6, p.29-42.

29. Cruciani R.A., Barker J.L., Zasloff M., Chen H.C., Colamonici 0. Antibiotic magainins exert cytolitic activity against transformed cell lines through channel formation. Proc.Natl.Acad.Sci.USA., 1991, 88, p.3792-3796.

30. Data A.K. Efficient amplification using 'megprimer' by asymmetric polymerase chain reaction. -Nucleic Acids Res., 1995, 23(12), p.4530-4531.

31. Davis J., Thompson D., Beckler G.S. Large scale dialysis reactions using E.coli S30 extract systems.- Promega Notes 1996, 56, p. 14-21.

32. DeBoer H.A., Kastelin R.A. Biased codon usage: an exploration of its role in optimization of translation. In: Maximizing Gene Expression, 1986, Butterworths

33. Del Sal G., Manfioletti G., Scheider C. A one-tube plasmid DNA preparation suitable for sequencing.-Nucl. Acids Res., 1988, 16, p.9878.

34. Elits D., Iwagami S.G., Smith M. Hyperexpression of a synthetic gene encoding a high potential iron sulfur protein.- Protein Engineering., 1994, 7(9), p. 1145-1150.

35. Erlich H.A., Gelfand D.H., Saiki R.K. Specific DNA amplification.- Nature, 1988, 331, p.461-462.

36. Falla T.J., Karunaratne D.N., Hancock RE.W. Mode of action of the antimicrobial peptide indolicidin.- J. Biol. Chem. 1996, 271, 19298-19303.

37. Faucon J.F., Dufouncq J., Lussan C. The self-association of melittin and its binding to lipids: an intrinsic fluorescence polarization study. -FEBS Lett., 1979, 102, p. 187-190.

38. Frank R.W., Gennaro R, Schneider K., Przybylski M., Romeo D. Aminoacid sequences of 2 proline-rich bactenecins antimicrobial peptides of bovine neutrophils.- J. Biol. Chem. 1990, 265, p. 18871-18874.

39. Ganz T., Rayner J.R., Valore E.V., Tumolo A., Talmadge K., Fuller F. The structure of the rabbit macrophage defensin genes and their organ- specific expression.- J. Immunol. 1989, 143, p.1358- 1365.

40. Garen A. Sense and nonsense in the genetic code.- Science. 1968, 160, p. 149-159.

41. Gazit E., Miller I.R., Biggin P.C., Sansom M.S.P., Shail Y. Structure and orientation of the mammalian antibacterial peptide cecropin PI within phospholipid membranes.- J. Mol. Biol. 1996, 258, p. 860-870.

42. Giovannini M.G., Poulter L., Gibson B.W., Williams D.H. Biosynthesis and degradation of peptides derived from Xenopus laevis prohormones.- Biochem. J. 1987, 243, p.113-120.

43. Glover D.M. (ed.) DNA cloning: a practical approach, 1985, IRL Press, Oxford-NY, v.l.

44. Gold L.M., Schweiger M. Synthesis of phage specific a- and (3-glucosyl transferases directed by T-even DNA in vitro.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1969, 62, p.892-898.

45. Hancock R.E.W., Lehrer R. Cationic peptides: a new source of antibiotics. Trends in Biotech., 1998, 16, p.82-88.

46. Hanning G., Makrides S.C. Strategies for optimizing heterologous protein expression in Eshcherichia coli- Trends in Biotechnol. 1998, 16, p.54-60.

47. Hara S., Yamakawa M. Production in Escherichia coli of moricin, a novel type antibacterial peptide from the silkworm, Bombyx mori Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1996, 220(3), p.664-669

48. Harwig S.S., Waring A., Yang H.J., Cho Y., Tan L., Lehrer R.I. Intramolecular disulfide bonds enhance the antimicrobial and lytic activities of protegrins at physiological sodium chloride concentrations.-Eur. J. Biochem. 1996, 240, p.352-357.

49. Haught C., Davis G.D., Subramanian R., Jackson K.W., Harrison R.G. Recombinant production and purification of novel antimicrobial peptide in Eshcherichia coli Biotech. Bioeng. 1998, 57, p.55-61.

50. Hemat F., McEntee K. A rapid and efficient PCR- based method for synthesizing high-molecular-weight multimers of oligonucleotides.- Biochem. Biophys. Res. Commun., 1994, 205, p.475-481.

51. Hill C.P., Yee J., Selsted M.E., Eisenberg D. Crystal structure of defensin HNP-3, an amphiphilic dimer: mechanisms of membrane permeabilisation. -Science, 1991, 251, p. 1481-1485.

52. Hultmark D. Immune reactions in Drosophila and other insects a model for innate immunity -Trends Genet., 1993, 9, p. 178-183.

53. Ikemura T. Codon usage and tRNA content in unicellular and multicellular organisms -Mol. Biol. Evol., 1985, 2(1), p. 13-34

54. Ivanov I., Tam J., Wishart P., Jay E. Chemical synthesis and expression of the human calcitonin gene.- Gene., 1987, 59, p.223-230.

55. Jermutus L., Ryabova L.A., Pluckthun A. Recent advances in producing and selecting functional proteins by using cell-free translation.- Curr. Oppin. Biotechnol. 1998, 9, p. 534-548.

56. Kagan B.L., Selsted M.E., Ganz T., Lehrer R.I. Antimicrobial defensin peptides form voltagedependent ion-permeable channels in planar lipid bilayer membranes.- Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1990, 87, p.210-214.

57. Kato T., Suzuki S., Nishioka K., Yamamoto K. A method to construct a gene that encodes a repetitive amino acid sequence by polymerse chain reaction.- Analytical Biochem., 1994, 220, p.428-429.

58. Ke S., Madison E.L. Rpid and efficient site directed mutagenesis by single-tube 'megaprimer' PCR method.- Nucleic Acids Res., 1997, 25(16), p.3371-3372.

59. Kudlicki W., Kramer G., Hardesty B. High efficiency cell-free synthesis of protein : Refinement of the coupled transcription/ translation system.- Anal. Biochem., 1992, 206, p. 389-393.

60. Kuliopulos A., Shortle D., Talalay P. Isolation and sequencing of the gene encoding delta 5-3-ketosteroid isomerase of Pseudomonas testosteronr. overexpression of the protein.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1987, 84, p.8893-8897.

61. Laemmli D.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.- Nature, 1970, 227, p.680-685.

62. Lederman M. & Zubay G. DNA directed peptide synthesis. A comparison of T2 and Escherichia coli DNA-directed peptide synthesis in two cell-free systems.- Biochem. Biophys. Acta, 1967, 149, p.253-258.

63. Lee J.Y., Boman A., Sun C.X., Andersson M, Jornvall H., Mutt V., Boman H.G. Antibacterial peptides from pig intestine: isolation of a mammalian cecropin.- Proc Natl Acad Sei USA, 1989, 86(23), p.9159-9162

64. Lee I.H., Zhao C., Cho Y., Harwig S.S.L., Cooper E.L., Lehrer R.I. Clavinins, a-helical antimicrobial peptides from tunicate hemocytes. FEBS Lett.- 1997, 400, p. 158-162.

65. Lehrer R.I., Ganz T., Szklarek D., Selsted M.E. Modulation of the in vitro candicidal activity of human neutrophil defensin by target cell metabolism and divalent cations.- J. Clin. Invest. 1988, 81, p. 1829-1835.

66. Lehrer R.I., Rosenman M., Harwig S.S.S.L., Jackson R., Eisenhauer P. Ultrasensitive assay for endogenous antimicrobial polypeptides.-Journal of Immunological Methods., 1991, 137, p.167-173.

67. Lehrer R.I., Ganz T. Defensins endogenous antibiotic peptides from human leukocytes.- In Secondary Metabolites: Their Function and Evolution. Ciba Foundation Symposia. 1992, No 171, ed.D.J. Chadwick, J. Whelan, p.276-293. Chichester, Wiley.

68. Lehrer R.I., Lichtenstein A.K., Ganz T. Defensins antimicrobial and cytotoxic peptides of mammalian cells.- Annu. Rev. Immun., 1993, 11, p. 105-128.

69. Ludtke S.J., He K., Wu Y., Huang H.W. Cooperative membrane insertion of magainin correlated with its cytolytic activity. Biochim. Biophys. Acta. 1994, 1190, p. 181-184.

70. Makrides S.C. Strategies for achieving high-level expression of genes in Escherichia coli -Microbiol. Rev. 1996, 60, p.512-538.

71. Matsuzaki K., Murase O., Tokuda H., Funakoshi S., Fujii N., Miyajima K. Orientational and aggregational states of magainin 2 in phospholipid bilayers.- Biochemistry 1994, 33, p.3342-3349.

72. McPherson M.J., Quirke P., Taylor G R. PCR A practical approach. 1996, Oxford, IRL-Press (ed. Rickwood D., Harnes B.D.).

73. Medzitov R., Janeway C.A. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system recognition.-Cell, 1997, 91, p.295-298.

74. Mitra R.D., Silva C.M., Youvan D.C. Fluorescense resonance energy transfer between blue-emitting and red-shifted excitation derivatives of the green fluorescent protein.- Gene, 1996, 173, p.13-17.

75. Morikawa N., Hagiwara K., Nakajiama T. Brevenin-1 and -2, unique antimicrobial peptides from the skin of the frog Rcma brevipoda porsa, Biochem. Biophys. Res. Commun.- 1992, 189, p.184-190.

76. Nakajima K., Yaoita Y. Construction of multiple-epitope tag sequence by PCR for sensitive Western blot analysis.- Nucl. Acids Res., 1997, 25, p.2231-2232.

77. Narang S.A., Brousseau R., Hsiung H.M., Michniewicz J.J. Chemical synthesis of deoxyoligonucleotides by the modified triester method.- Methods Enzymol., 1980, 65(1), p.610-620.

78. Newton C.R., Graham A., Heptinstall L.E., Powell S.J., Summers C., Kalsheker N, Smith J.C., Markham A.F. Analysis of any point mutation in DNA. The amplification refractory mutation system (ARMS).-Nucleic Acids Res., 1989, 17(7), p.2503-2516.

79. Nihrenberg M.W., Matthaei J.H. The dependence of cell-free protein synthesis in E.coli upon naturally occurring or synthetic polynucleotides.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1961, 47, p. 15881602.

80. Nihrenberg M.W. Cell free protein synthesis directed by messenger RNA.- In Methods in enzymology, ed. S.P. Colowick and N.O. Kaplan, 1963, 6, p. 17-23 (New York and London. Academic press).

81. Nilsson B., Abrahmsen L., Uhlen M. Immobilization and purification of enzymes with staphylococcal protein A gene fusion vectors. EMBO J., 1985a, 4(4), p. 1075-1080.

82. Nilsson B., Holmgren E., Josephson S., Gatenbeck S., Philipson L., Uhlen M. Efficient secretion and purification of human insulin-like growth factor I with a gene fusion vector in Staphylococci Nucleic Acids Res., 1985b, 25, 13(4), p.1151-1162

83. Ofverstedt L.G., Hammarstrom K., Balgobin N., Hjerton S., Pettersson U., Chattopadhyaya J. Rapid and quantitive recovery of DNA fragments from gels by displacement electrophoresis (isotachophoresis).-Biochim. Biophys. Acta., 1984, 782, p. 120-126.

84. Ohsaki Y., Gazdar A.F., Chen H.C., Johnson B.E. Antitumor activity of magainin analogues against human lung cancer cell lines.- Cancer Res. 1992, 52, p.3534-3538.

85. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Gross L.A., Tsien R.Y., Remington S.J. Crystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein.- Science, 1996, 273, p. 1392-1395.

86. Piers K.L., Brown M.H., Hanckock R.E.W. Recombinant procedures for small antimicrobial cationic peptides in bacteria.- Gene, 1993, 134, p.7-13.

87. Piers K.L., Hanckock R.E. The interaction of a recombinant cecropin/melitin hybrid peptide with the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa.-Mo\. Microbiology, 1994, 12(6), p.951-958.

88. Pine M.J. Response of intracellularproteolysis to alteration of bacterial protein and the implication in metabolic regulation.- J. Bacteriol. 1967, 93, p. 1527- 1533.

89. Potter P. Directional PCR cloning of multiple repeat sequences.-BioTechniques, 1996, 21(2), p. 198-200.

90. Prendergast F.G., Mann K.G. Chemical and physical properties of Aequorin and the green fluorescent protein isolated from Aequorea forskalea. -Biochemistry, 1978, 17(17), p.3448-3453.

91. Prince J.T., McGrathK.P., DiGirolamo C.M., Kaplan D.L. Construction, cloning and expression of synthetic genes encoding spider dragline silk.- Biochemistry, 1995, 34, 10879-10885.

92. Prodromou C., Pearl L.H. Recursive PCR: a novel technique for total gene synthesis.- Protein Engineering., 1992, 5(8), p.827-829.

93. Radermacher S.W., Schoop V.M., Schluesener H.J. Bactenecin, a leukocytic antimicrobial peptide, is cytotoxic to neuronal and glial cells.- J. Neurosci. Res. 1993, 36, p. 657-662.

94. Romeo D., Skerlavaj B., Bolognesi M., Gennaro R. Structure and bactericidal activity of an antibiotic dodecapeptide purified from bovine neutrophils.- J. Biol. Chem. 1988, 263, p.9573-9575.

95. Ryabova L.A., Desplancq D., Spirin A.S., Pluckthun A. Functional antibody production using cell-free translation: effects of protein disulfide isomerase and chaperones Nat Biotechnol., 1997, 15(1), p.79-84

96. Samakovlis C., Kylsten P., Kimbrell D.A., Engstrom A., Hultmark D. The andropin gene and its product, a male specific antibacterial peptide in Drosophila melanogaster.- EMBO J. 1991, 10, p. 163-169.

97. Sambrook J., Fritisch E.F., Maniatis T. Molecular cloning. A laboratory manual.- Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, ppl500.

98. Selsted M.E., Brown D.M., DeLange R.J., Lehrer R.I. Primary structures of MCP-1 and MCP-2, natural peptide antibiotics of rabbit lung macrophages.- J.Biol. Chem.,1983, 258, p. 1448514489.

99. Schagger H., VonJagow G. Tricine- Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrilamide Gel Electrophoresis of proteins in the range from 1 to lOOkDa.-Analytical Biochemistry., 1987, 166, p.368-379.

100. Shatzman A.R. Approaches to the expression of foreign genes.- In Recombinant DNA Principles and Methodologies. 1998, ed. J.J. Green, V.B. Rao, p.551-559 (Marcel Dekker, New York, Basel, Hong Kong).

101. Shi J., Ross C.R., Leto T.L., Blecha F. PR-39, a proline-rich antibacterial peptide that inhibits phagocyte NADPH oxidase activity by binding to Src homology 3 domains of p47 phox- Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, p.6014-6018.

102. Simmaco M., Barra D., Chiarini F., Noviello L., Melchiorri P., Kreil G., Richter K. A family of bombinin-related peptides from the skin of Bombina variegata. -Eur. J .Biochem., 1991, 199, p.217-222.

103. Simmaco M., Mignorna G., Barra D., Bossa F. Novel antimicrobial peptides from skin secretion of the European frog Rana esculenta. FEBS Lett. 1993, 324, p.159- 161.

104. Simmaco M., Mignorna G., Barra D. Antimicrobial peptides from skin secretions of Rana esculenta The Journal of Biological Chemistry, 1994, 269, p. 11956-11961.

105. Simmaco M., Mignogna G., Canofeni S., Miele R., Mangoni ML., Barra D. Temporins, antimicrobial peptides from the European red frog Rana temporaria.- Eur. J. Biochem. 1996, 242, p.788-792.

106. Sipos, D., Andersson,M. And Ehrenberg, A. The structure of the mammalian antibacterial peptide cecropin PI in solution, determined by proton-NMR- Eur.J.Biochem., 1992, 209, p. 163169.

107. Spirin A.S. Ribosome preparation and cell-free protein synthesis. In; The Ribosome: Structure, Function and Evolution (W. Hill, A. Dahlberg, R. Garret, P. Moore, D. Schlessinger and J. Warner, eds.) 1990, ASM Press, Washington, p.56-70.

108. Spirin A.S. Cell-Free Protein Synthesis Bioreactor.- In Frontiers of Bioprocessing II (Todd P., ed.), 1992, p. 31-43.

109. Steiner H., Hultmark D., Engstrom A., Bennich H., Boman H.G. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity.- Nature, 1981, 292, p.246-248.

110. Strub J.M., Hubert P., Nullans G., Aunis D., Metz-Boutigue M.H. Antibacterial activity of secretolytin, a chromogranin B- derived peptide (614-626), is correlated with peptide structure.-FEBS Lett. 1996a, 379, p. 273-278.

111. Studier F.W., Rosenberg A.H., Dunn J.J., Dubendorff J.W. Use of T7 RNA polymerase to direct expression of cloned genes.-Meth.Enzymol., 1990, 185, p.60-89.

112. Sulter-Crazzolara C., Unsicker K. Improved expression of toxic proteins in Kcoli.-Biotechniques 1995, 19, p.202-204.

113. Sun S.C., Asling B., Faye I.,. Organization and expression of the immunoresponsive lysozyme gene in the giant silk moth, Hyalophora cecropia. -Journal of Biological Chemistry., 1991, 267, p.6644-6649

114. Tang X., Nakata Y., Li H., Zhang M., Gao H., Fujita A., Sakatsume O., Ohta T., Yokoyama K. The optimization of preparations of competent cells for transformation of E.coli Nucleic Acids Res., 1994, 22, p.2857- 2858.

115. Terwilliger T.C. Construction of a synthetic variant of the bacteriophage fl gene V by assembling oligodeoxynucleotides corresponding to only one strand of DNA.- Gene., 1988, 71, p.41-47.

116. Uhlen M., Guss B., Nilsson B., Gotz F., Lindberg M. Expression of the gene encoding protein A in Staphylococcus aureus and coagulase-negative staphylococci.- J. Bacteriol., 1984, 159(2), p.713-719.

117. Uhlman E. Analternative approach in gene synthesis: use of long self-priming oligodeoxynucleotides for the construction of double-stranded DNA.- Gene., 1988, 71, p.29-40.

118. Umezawa H. Structures and activities of protease inhibitors of microbial origin.- Methods Enzymol., 1976, 45, p.678-695.

119. Urritia R., Cruciani R.A., Barker J.L. Spontaneous polimerisation of the antibiotic peptide magainin-2.- FEBS Lett., 1989, 247, p. 17-21.

120. Vogelstain B., Gillespie D. Preparative and analitical purification of DNA from agarose.-Proc.Natl.Acad.Sci., 1979, 76, p.615-619.

121. Vouille V., Amiche M., Nicolas P. Structures of genes for dermaseptins B, antimicrobial peptides from frog skin. Exon 1- encoded prepropeptide is conserved in genes for peptides of highly structures and activities.- FEBS Lett. 1997, 414, p.27-32.

122. Westerhoff H.V., Hendler R.V., Zaslof M., Juretic D. Interactions between a new class of eucariotic antimicrobial agents and isolated rat liver mitochondria.- Biochim. Biophys. Acta 1989, 975, p.361-369.

123. Winder D., Gunzburg W.H., Erfle V., Salmons B. Expression of antimicrobial peptides has an antitumour effect in human cells.- Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998, 242, p.608-612.

124. Xanthopopoulos K G., Lee J.Y., Gan R., Kockum K., Faye I., Boman H.G. The structure of the gene for cecropin B, an antibacterial immune protein from Hyalophora cecropia-Eur.J.Biochem., 1988, 172, p.371-376.

125. Xie W., Qiu Q., Wu H., Xu X. Expression of cecropin CMIV fusion protein in E.coli under T7 promoter.-Biochem. Mol. Biol. Int. 1996, 39, p.487-492.

126. Yanishch-Perron C., Vieira J., Messing J. Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. -Gene, 1985, 33(1), p. 103-119.

127. Yarns S., Rosen J.M., Cole A.M., Diamond G. Production of active bovine tracheal antimicrobial peptide in milk of transgenic mice.- Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93, p. 1411814121.

128. Yon J., Fried M. Precise gene fusion by PCR- Nucleic Acids Res., 1989, 17(12), p.4895.

129. Zabeau M., Stanley K.K. Enhanced expression of cro-beta-galactosidase fusion proteins under the control of the PR promoter of bacteriophage lambda. EMBO J., 1982, 1(10), p. 1217-1224.

130. Zanetti M., Gennaro R., Romeo D. Cathelicidins: a novel protein family with a common proregion and a variable C-terminal antimicrobial domain.- FEBS Lett. 1995, 374, p. 1-5.

131. Zasloff M. Magainins, a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin: isolation, characterization of two active forms, and partial cDNA sequence of a precursor. -Proc Natl Acad Sci U S A., 1987, 84(15), p.5449-5453.

132. Zucht H.D., Raida M., Adermann K, Magert H.J., Forssman W.G. Casocidin-I: a casein-aS2 derived peptide exhibits antibacterial activity.-FEBS Lett., 1995, 372, p. 185-188.1. VIII. БЛАГОДАРНОСТИ

133. Выражаю свою глубокую признательность моим научным руководителям: Анатолию Тимофеевичу Гудкову за неоценимый вклад в осуществление этой работы и мудрые советы, Александру Сергеевичу Спирину за внимательное отношение к работе и бесценные обсуждения.

134. Безгранично признателен Валентине Александровне Неладновой за великолепную техническую помощь.