Зеленый флуоресцентный белок (GFP) - белок-партнер для биосинтеза и выделения пептидов из клеток Escherichia coli тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Скосырев, Виталий Сергеевич

• Скосырев, Виталий Сергеевич
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Скосырев, Виталий Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

Глава

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Саркотоксин IA

1.1.1. Саркотоксин IA представитель семейства цекропинов

1.1.2. Структура и физические свойства пептида

1.1.3. Биологическая роль и механизм действия пептида

1.1.4. Синтез и выделение пептида

1.2. Гибридные белки

1.2.1. Структура гибридного белка

1.2.2. Регуляция уровня экспрессии рскомбинантного белка в клетках Escherichia coli

1.3. Зеленый флуоресцентный белок

1.3.1. Структура белка и образование хромофора

1.3.2. Мутантные варианты GFP и их спектрофотометрические свойства

1.3.3. Физико-химические свойства белка

1.3.4. Экспрессия GFP

1.3.5. Выделение GFP

Глава

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИЛ. Материалы

II.2. Методы исследования Н.2.1. Создание генно-инженерных конструкций П.2.2. Продукция гибридных белков в клетках Е. coli П.2.3. Выделение, ренатурация и очистка гибридных белков

II.2.4. Определение функциональной активности и количества продукта П.2.5. Ограниченный протеолиз И.2.6. Иммуноблотинг И.2.7. Аминокислотный и масс-спектрометрический анализ пептидов П.2.8. Синтез гибридного белка Sarc-Ob in vitro

Глава

III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

III. 1. Влияние структуры аминокислотного линкера на стабильность гибридного белка in vivo и in vitro

III. 1.1. Изучение процесса протеолитической деградации GFP-Ob in vitro

III. 1.2. Изучение процесса протеолитической деградации GFP-Ob in vivo

III.2. Изучение влияния свойств белка-партнера и положения целевого пептида на синтез полноразмерного гибрида Ш.2.1. Глутатион-8-трансфераза саркотоксин Ш.2.2. Саркотоксин обелин Ш.2.3. Зеленый флуоресцентный белок саркотоксин Ш.З. Разработка метода выделения низкомолекулярных полипептидов в составе гибридных белков на основе GFP Ш.3.1. Создание и синтез гибридных белков в клетках Е. coli Ш.3.2. Выделение EGFP-PDEy Ш.3.3. Выделение EGFP-Sarc, EGFP-Th и BCCP-EGFP Ш.4. Биосинтез и выделение рекомбинантного саркотоксина IA из клеток Е. coli Ш.4.1. Синтез рекомбинантного саркотоксина in vitro Ш.4.2. Очистка и характеристика рекомбинантного саркотоксина

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Зеленый флуоресцентный белок (GFP) - белок-партнер для биосинтеза и выделения пептидов из клеток Escherichia coli»

Низкомолекулярные полипеитиды - высокоактивные органические соединения, широко распространенные в живых организмах и выполняющие разнообразные, как правило, регуляторные функции. Для проявления функциональной активности достаточны следовые количества вещества. Однако для изучения физико-химических свойств и механизма действия пептидов требуются значительные количества высокоочищенного препарата. Низкое содержание пептидов в природных объектах требует разработки новых более продуктивных методов их получения. В настоящее время подавляющее большинство рекомбинантных белков и полипептндов получают культивированием генетически трансформированных микроорганизмов, чаще всего клеток Escherichia coli. Однако биосинтез низкомолекулярных пептидов в чужеродных клетках зачастую сопряжен с рядом трудностей: низкой устойчивостью гетерологичиых пептидов к действию внутриклеточных протеаз, а также сложностью их последующего выделения из грубого клеточного лизата.Отсутствие в клетке подходящих условий для образования упорядоченной структуры полипептида ведет к его частичной или полной деградации в процессе синтеза. Отсутствие репортерной и лиганд-связывающей активности осложняет подбор оптимальных условий для биосинтеза и выделения продукта. Более того, пептвды, обладающие антимикробным действием, могут оказывать отрицательное влияние на рост клеток-хозяев.Включение целевого полипептида в состав гибридного белка на основе высокоэкспрессируемого белка-партнера - одно из возможных решений проблемы получения полноразмерного продукта в чужеродных клетках. Белок-партнер обеспечивает не только суперэкснрессию целевого пептида, но и возможность его последующего выделения. Несмотря на очевидные преимущества включения пептида в состав гибридного белка, успех синтеза во многом определяется структурой молекулы гибридного белка (положением пептида в молекуле, структурой аминокислотного линкера) и свойствами белка-партнера. Эти обстоятельства придают актуальность изучению влияния структурообразующих элементов гибридного белка на общую стабильность молекулы, а также поиску оптимального белка-партнера, обеспечивающего высокую экспрессию, легкую идентификацию и эффективную очистку синтезируемого продукта.Зеленый флуоресцентный белок (GFP) из Aequorea victoria, широко используемый в качестве репортерного белка, соответствует требованиям, предъявляемым к белкупартнеру: устойчив к действию внутриклеточных протеаз и хаотропных- агентов, легко детектируется, экспрессируется с высокой эффективностью в различных организмах и клетках, в том числе в клетках Е. coli, экстрагируется органическими растворителями без потери функциональной активности. Эти свойства благоприятствуют использованию GFP не только в качестве репортерного белка, но и в качестве белка-партнера для биосинтеза и выделения низкомолекулярных полипептидов.Целью данной работы было изучение влияния структурообразующих элементов гибридного белка на общую стабильность гибридной молекулы и разработка нового эффективного метода выделения полипептидов. Были поставлены следующие задачи: - изучить влияние структуры аминокислотного линкера на стабильность гибридного белка in vivo и in vitro; - изучить зависимость эффективности биосинтеза целевого продукта от свойств используемого белка-партнера и положения пептида в молекуле гибрида; - разработать новый метод очистки полипептидов в составе гибрида, используя экстракционные свойства GFP; - разработать эффективный способ синтеза и выделения функционально активного антибактериального пептида саркотоксина IA из клеток Е. coli.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Скосырев, Виталий Сергеевич

ВЫВОДЫ

1. Установлено значительное влияние структуры линкерного пептида и формы накопления продукта в клетке на устойчивость гибридных белков к протеолитическому действию:

• аминокислотный состав линкера и его ближайшее окружение оказывают критическое влияние на стабильность гибридного белка in vitro (GFP-ОЬЗ);

• влияние линкера на стабильность гибридного белка in vivo нивелируется формой накопления (тела включения) синтезируемого продукта в клетке.

2. Выявлено определяющее значение положения целевого полииептида (саркотоксин) в молекуле гибридного белка и свойств белка-партнера па эффективность синтеза полноразмерного продукта.

3. Продемонстрирована целесообразность использования GFP в качестве белка-партнера для биосинтеза низкомолекулярпых полинептидов в клетках Escherichia coli.

4. На основе уникальных свойств GFP разработан эффективный метод очистки пептидов с использованием органической экстракции этанолом.

5. Показано, что эффективность экстракции зависит от структуры целевого пептида и не зависит от его положения в молекуле гибридного белка.

6. Впервые предложен эффективный способ получения биологически активного рекомбинантного антибактериального пептида - саркотоксина IA из клеток Escherichia coli.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В работе была продемонстрирована возможность использования зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве белка-партнера для эффективного синтеза низкомолекулярпых полнпептидов в клетках Е. coli. Все представленные в работе химерные конструкции на основе гена gfp хорошо экспрессировались. В условиях оптимальной температуры роста клеток (37°С) продукт экспрессии, как правило, аккумулировался в агрегированном виде. В составе тел включения, устойчивых к действию внутриклеточных протеолитических ферментов, преобладал полноразмерный гибридный белок. Продукт экспрессии растворимой фракции клеток был полностью деградирован но модулю пептида. Таким образом, включение продукта синтеза в состав тел включения является необходимым условием для получения полноразмерного целевого полииентида в клетках Е. coli.

Была установлена взаимосвязь между стабильностью синтезируемого белка и структурой аминокислотного линкера, соединяющего модули гибридного белка. Наличие потенциальных участков расщепления в составе вставки (GOb3 in vitro) ведет к деградации гибридного белка. Это обстоятельство требует более внимательного подхода к оценке аминокислотного состава вставки, особенно в случае, когда она кодируется произвольной нуклеотидной последовательностью, образованной в результате генно-инженерных манипуляций. Используя сильный промотор и белок-партнер, склонный к образованию в клетке нерастворимых агрегатов (тел включения), можно частично нивелировать влияние вставки на общую стабильность молекулы in vivo.

Исходя из результатов синтеза пептидов в составе гибридных белков на основе GFP, а также из результатов синтеза саркотоксина в составе гибридных белков на основе различных белков-партнеров, был разработан способ получения функционально активного пептида саркотоксина. Было обнаружено, что эффективность синтеза полноразмерного пептида в клетках Е. coli значительно зависит от положения молекулы пептида в составе гибрида, а также от свойств используемого белка-партнера. Только при использовании GFP в качестве белка-партнера был достигнут положительный результат. В результате выделения пептида из тел включения был получен высокоочищенный функционально активный препарат саркотоксина с относительно высоким конечным выходом продукта.

Было показано, что GFP может быть использован как белок-иартпер не только для биосинтеза гюлноразмерных гетерологичных полнпептидов в клетках Е. coli, но и, несмотря на отсутствие лиганд-связывающей активности, для высокоэффективного выделения продукта синтеза. Благодаря уникальной структуре GFP, обеспечивающей беспрепятственное перемещение молекулы в двухфазных системах, был разработан простой метод выделения низкомолекулярных полипентидов органической экстракцией. Было установлено, что эффективность экстракции продукта не зависит от положения молекулы GFP в гибридном белке, но значительно зависит как от количества функционально активного GFP, так и от структуры целевого полипептида. Оптимизация условий экстракции позволяет значительно увеличить конечный выход продукта с сохранением высокой степени очистки белка. Другие преимущества данного метода: низкая стоимость используемых химических компонентов, скорость выделения, визуализация всех этапов выделения и т.д. позволяют использовать этот метод не только для получения аналитических, но и препаративных количеств вещества.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Скосырев, Виталий Сергеевич, 2005 год

1. Briggs JD. Humoral immunity in lepidopterous larvae. J Exp Zool. 1958; 138: 155-88.

2. Boman HG. Peptide antibiotics and their role in innate immunity. Annu.Rev.Immunol 1995; 13:61-92.

3. Hultmark D, Steiner H, Rasmuson T, Boman HG. Insect immunity. Purification and properties of three inducible bactericidal proteins from hemolymph of immunized pupae of Hyalophora cecropia. Eur J Biochem 1980; 106: 7-16.

4. Steiner H, Hultmark D, Engstrom A, Bennich H, Boman HG. Sequence and specificity of two antibacterial proteins involved in insect immunity. Nature 1981; 292: 246-8.

5. Okada M, Natori S. Primary structure of sarcotoxin I, an antibacterial protein induced in the hemolymph of Sarcophaga peregrina (flesh fly) larvac. J Biol Chcm 1985; 260: 71747.

6. Okada M, Natori S. Purification and characterization of an antibacterial protein from haemolymph of Sarcophaga peregrina (flesh-fly) larvae. Biochem J 1983; 211: 727-34.

7. Hopp TP, Woods KR. Prediction of protein antigenic determinants from amino acid sequences. Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A 1981; 78: 3824-8.

8. Travers P, Blundell TL, Sternberg MJ, Bodmer WF. Structural and evolutionary analysis of HLA-D-region products. Nature 1984; 310: 235-8.

9. Tanford C. The hydrophobic effect and the organization of living matter. Science 1978; 200:1012-8.

10. Ivvai H, Nakajima Y, Natori S, Arata Y, Shimada I. Solution conformation of an antibacterial peptide, sarcotoxin IA, as determined by 1H-NMR. Eur J Biochem 1993; 217:639-44.

11. Matsumoto N, Okada M, Takahashi II et al. Molecular cloning of a cDNA and assignment of the C-terminal of sarcotoxin I A, a potent antibacterial protein of Sarcophaga peregrina. Biochem J 1986; 239: 717-22.

12. Aly R, Granot D, Mahler-Slasky Y, Halpern N, Nir D, Galun E. Saccharomyces cerevisiae cells harboring the gene encoding sarcotoxin IA secrete a peptide that is toxic to plant pathogenic bacteria. Protein Expr Purif\999; 16: 120-4.

13. Okada M, Natori S. Mode of action of a bactericidal protein induced in the haemolymph of Sarcophaga peregrina (flesh-fly) larvae. Biochcm J 1984; 222: 119-24.

14. Okada M, Natori S. Ionophore activity of sarcotoxin I, a bactericidal protein of Sarcophaga peregrina. Biochcm J \ 985; 229: 453-8.

15. Kimelberg HK, Papahadjopoulos D. Interactions of basic proteins with phospholipid membranes. Binding and changes in the sodium permeability of phosphatidylserine vesicles. J Biol Chcm 1971; 246: 1142-8.

16. Imai M, Inoue K, Nojima S. Effect of polymyxin В on liposomal membranes derived from Escherichia coli lipids. Biochim.Biophys Acta 1975; 375: 130-7.17.