Роль поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 в координации процесса эксцизионной репарации оснований ДНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Суханова, Мария Владиславовна

• Суханова, Мария Владиславовна
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Суханова, Мария Владиславовна

ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. РОЛЬ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ-1 В КООРДИНАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССОВ В ОТВЕТ НА ПОВРЕЖДЕНИЕ ДНК (ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР )

1.1. ФЕРМЕНТЫ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИЕ МЕТАБОЛИЗМ ПОЛИ(АОР-РИБОЗЫ)

В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТП

1.1.1. СЕМЕЙСТВО ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗ, ПРЕДСТАВЛЕНIЮЕ В ВЫСШИХ ЭУКАРИОТАХ. СТРОЕНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1И

1.1.2. СИНТЕЗ И ДЕГРАДАЦИЯ ПОЛИ(АОР-РИБОЗЫ) В КЛЕТКЕЫ

1.2. ФУНКЦИОНИРОВАНИЕ ПОЛИ(АБР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 ПРИ РЕПАРАЦИИ ПОВРЕЖДЕНИЙ ДНК

1.2.1. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ФУНКЦИИ

ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 НА УРОВНЕ КЛЕТКИ И ОРГАНИЗМА

1.2.2. ВОВЛЕЧЕНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В ПРОЦЕСС ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ ДНК ЭУКАРИОТ

1.2.2.1. ОСНОВНЫЕ ПУТИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ

ДНК В КЛЕТКАХ ЭУКАРИОТ

1.2.2.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 НА РЕПАРАЦИЮ ДНК, СОДЕРЖАЩЕЙ РАЗЛИЧНЫЕ ТИПЫ ПОВРЕЖДЕНИЙ

1.2.3.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 С БЕЛКАМИ И ДНК-ИН ГЕРМЕДИАТАМИ В ПРОЦЕССЕ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ

1.2.3.4. ИЗМЕНЕНИЕ СТРУКТУРЫ ХРОМАТИНА В ПРОЦЕССЕ РЕПАРАЦИИ ДНК ЗА СЧЕТ I ЮЛИ(АОР-РИБОЗИЛ)ИРОВАНИЯ ГИСТОНОВ

1.2.3. РОЛЬ АКТИВАЦИИ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ 1 11РИ МАССИРОВАННОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ДНК, ПРИВОДЯЩЕМ К АПОПТОТИЧЕСКОЙ

ИЛИ НЕКРОТИЧЕСКОЙ ГИБЕЛИ КЛЕТКИ

1.2.4. МОДЕЛЬ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В КЛЕТОЧНЫХ ПРОЦЕССАХ, ИНДУЦИРУЕМЫХ

ГЕНОТОКСИЧЕСКИМ ВОЗДЕЙСТВИЕМЗЙ

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. МАТЕРИАЛЫ

2.1.1. РЕАКТИВЫ, РАДИОАКТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ,

ПРЕПАРАТЫ НУКЛЕОТИДОВ

2.1.2. БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ШТАММЫ И ПЛАЗМИДНЫЕ ДНК

2.1.3. ОЛИГОДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕОТИДЫ

2.1.4. ФЕРМЕНТЫ

2.2. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1. ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА РЕКОМБИНАНТНОЙ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ I ЧЕЛОВЕКА, ЭКСПРЕССИРОВАН1ЮЙ

В КЛЕТКАХ E.COU

2.2.1. ВВЕДЕНИЕ [32Р]-МЕТКИ В 5'-КОНЕЦ ОЛИГОНУКЛЕОТИДА

2.2.3. ФОРМИРОВАНИЕ ДНК-ДУПЛЕКСОВ

2.2.4. ГЕЛЬ-ЭЛЕКТОФОРЕЗ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ И БЕЛКОВ

2.2.5. АНАЛИЗ ВЛИЯНИЯ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО) ПОЛИМЕРАЗЫ 1, АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 1 И ФЛЭП-ЭНД011УКЛЕАЗЫ 1 НА Д1IK-СИПТЕЗИРУЮЩУЮ АКТИВНОСТЬ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ р

2.2.6. АНАЛИЗ ЭНДОНУКЛЕАЗНОЙ И ЭКЗОНУКЛЕАЗНОЙ АКТИВНОСТИ АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

2.2.7. АНАЛИЗ АКТИВНОСТИ ФЛЭП-ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

2.2.8. АНАЛИЗ РЕПАРАЦИИ ДНК-ДУПЛЕКСОВ, КАТАЛИЗИРУЕМОЙ БЕЛКАМИ ЯДЕР1 ЮГО ЭКСТРАКТА ИЗ СЕМЕННИКОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

2.2.9. АНАЛИЗ И11ТЕРМЕДИАТА ДНК-ЛИГАЗА-[32Р]АМР В ЯДЕРНОМ ЭКСТРАКТЕ

2.2.10. ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ И БЕЛКОВ ЯДЕРНОГО ЭКСТРАКТА ИЗ СЕМЕННИКОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ФОТОРЕАКЦИОННОСПОСОБ11ЫМИ, ПРЕДСИНТЕЗИРОВАН11ЫМИ

Д Н К-СТ РУ КТУ РА МИ

2.2.11. АНАЛИЗ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 С ДНК-СТРУКТУРАМИ, ИМИТИРУЮЩИМИ ИНТЕРМЕДИАТЫ РЕПАРАЦИИ ДНК

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ (УСТАНОВЛЕНИЕ РОЛИ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 В КООРДИНАЦИИ ПРОЦЕССА ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ ДНК)

3.1. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ПОЛИ(АБР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ

С ДНК-ИНТЕРМЕДИАТАМИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ, СОДЕРЖАЩИМИ ОДНОНУКЛЕОТИДНУЮ БРЕШЬ ИЛИ

ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЙ РАЗРЫВ

3.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АБР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 НА СИНТЕЗ ДНК, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ р

3.2.1. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 НА СИНТЕЗ Д1IK, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ р ПРИ ЗАСТРАИВАНИИ ОДЫОНУКЛЕОТИДЫОЙ БРЕШИ

3.2.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 НА СИНТЕЗ ДНК С ВЫТЕСНЕНИЕМ ЦЕПИ, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ

3.2.3. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ

Д1 IK-ПОЛ ИМ ЕРАЗЫ р С ФОТОРЕАКЦИОННОСПОСОБНЫМИ Д11К-ИНТЕРМЕДИТАМИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ, СОДЕРЖАЩИМИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЙ РАЗРЫ В

3.3. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ

ПОЛИ(А1)Р-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 И АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 1 В ПРОЦЕССЕ СИНТЕЗА ДНК,

КАТАЛИЗИРУЕМОГО ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ р1±

3.3.1. ВЛИЯНИЕ АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 1 СИНТЕЗ Д1IK, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ р, ПРИ НАЛИЧИИ НЕКАНОНИЧЕСКОЙ И КАНОНИЧЕСКОЙ ПАРЫ ОСНОВАНИЙ НА З'-КОНЦЕ ОДНОЦЕПОЧЕЧНОГО РАЗРЫВА

3.3.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ I НА СИНТЕЗ ДНК, КАТАЛИЗИРУЕМЫЙ ДНК-ПОЛИМЕРАЗОЙ В, В ПРИСУТСТВИИ

АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ

3.3.3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ДНК-ПОЛИМЕРАЗЫ Р С ИНТЕРМЕДИАТАМИ РЕПАРАЦИИ ДНК, СОДЕРЖАЩИМИ ОДНОЦЕПОЧЕЧНЫЙ РАЗРЫВ, В ПРИСУТСТВИИ АПУРИНОВОЙ/АПИРИМИДИНОВОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ 1 И

ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ I

3.4. ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ

ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1,ЕЕ АПОПТОТИЧЕСКОГО 24 КДА-ФРАГМЕНТА И БЕЛКОВ ЯДЕРНОГО ЭКСТРАКТА ИЗ СЕМЕННИКОВ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА В ПРОЦЕССЕ РЕПАРАЦИИ ДНК ПО ДЛИННОЗАПЛАТОЧНОМУ И КОРОТКОЗАПЛАТОЧНОМУ ПУТИ

3.4.1. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛИМЕРАЗЫ 1 И ЕЕ 24 КДА-ФРАГМЕНТА 1IA РЕПАРАЦИЮ ДПК-ДУПЛЕКСОВ ПО КОРОТКОЗАПЛАТОЧНОМУ И

ДЛИННОЗАПЛАТОЧНОМУ ПУТИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ

3.4.2. ВЛИЯНИЕ ПОЛИ(АОР-РИБОЗО)ПОЛ ИМ ЕРАЗЫ 1 И ЕЕ 24 КДА-ФРАГМЕНТА НА ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ БЕЛКОВ ЯДЕРНОГО ЭКСТРАКТА С ДНК-ИНТЕРМЕДИАТАМИ ЭКСЦИЗИОННОЙ РЕПАРАЦИИ ОСНОВАНИЙ

3.4.3. ВЛИЯНИЕ 24 КДА-ФРАГМЕНТА НА РЕПАРАЦИЮ ДНК ПО

ДЛИ11НОЗАПЛАТОЧ1 ЮМУ ПУТИИЗ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль поли(ADP-рибозо)полимеразы 1 в координации процесса эксцизионной репарации оснований ДНК»

Исследование процесса репарации ДНК эукариог является важной фундаментальной задачей современной молекулярной биологии. В процессе жизнедеятельности организма геном постоянно подвергается воздействию генотоксических агентов, как экзогенного, так и эндогенного происхождения (1). Системы, обеспечивающие восстановление поврежденной структуры ДНК, играют ключевую роль в поддержании стабильности генома (2). Одним из основных механизмов, который направлен па восстановление исходной структуры ДНК при повреждении оснований, является эксцизиоппая репарация оснований (ЭРО) (3). На данный момент достигнут значительный прогресс в изучении структуры ферментов системы ЭРО, охарактеризованы отдельные стадии и реконструированы основные пути этого процесса. Установлено, что существует два альтернативных пути ЭРО: короткозаплаточный (включение одного нуклеотидного звена) и длиннозаплаточный (включение нескольких нуклеотидных звеньев (3). Показано, что в реконструированных системах ЭРО репарация поврежденных оснований может осуществляться за счет активности нескольких ферментов, катализирующих основные стадии этого процесса, такие как удаление поврежденного основания ДНК, расщепление ДНК с 5'-стороны апуринового/апиримидинового (АП-сайта), репарационный синтез и восстановление фосфодиэфирной связи в реакции лигирования (3). Функции этих ферментов строго координированы, и систему ЭРО зачастую рассматривают как взаимосогласованный, функциональный ансамбль (4). Представление о механизме функционирования ЭРО в живых клетках постоянно расширяется. К настоящему времени обнаружено, что помимо ферментов, катализирующих основные этапы репарации, в этом процессе задействованы белковые факторы, которые могут способствовать сборке комплекса ферментов на сайте повреждения, модулировать активность ферментов и обеспечивать сопряжение ЭРО с другими клеточными процессами, индуцируемыми в ответ на повреждение генома (5). Поэтому исследование функциональной роли факторов репарации, способствует более полному пониманию молекулярного механизма, обеспечивающего координацию и регуляцию ферментативной системы ЭРО в клетке.

Объектом нашего исследования является ядерный белок поли(АЭР-рибозо)полимераза 1 (PARP1), которая связывается с одноцепочечными и двуцепочечными разрывами ДНК, образующимися как при воздействии генотоксических соединений, так и при функционировании ферментов во время репарации ДНК (6).

Ферментативная активность PARP1 проявляется при связывании с разрывом ДНК, когда в присутствии NAD+ данный фермент катализирует синтез поли(АОР-рибозы), осуществляя ковалентную модификацию ряда клеточных белков, участвующих в метаболизме ДНК, в том числе собственную (7). Ковалентпое присоединение поли(АОР-рибозы), разветвленного отрицательно заряженного полимера, к молекуле белка приводит к диссоциации комплекса белок-ДНК (6, 7). Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1 приводит к подавлению ее ДНК-связывающей активности и рассматривается как механизм, обеспечивающий регуляцию взаимодействия этого фермента с разрывами ДНК (6, 7). Поврежденные основания и одноцепочечные разрывы ДНК являются основным типом повреждений, которые индуцируют синтез поли(АБР-рибозы) in vivo, что предполагает взаимосвязь активации PARP1 и процесса ЭРО (8). Инактивация PARP1 in vivo и подавление поли(АОР-рибозил)ирования приводит к нестабильности генома, которая обусловленна нарушением репарационных процессов в клетке (9). На основании ряда экспериментальных данных, полученных при исследовании функционирования PARP1 в репарации ДНК, было выдвинуто предположение о том, что взаимодействие PARP1 с разрывами ДИК происходит до сборки комплекса ЭРО, и доступ ферментов репарации к сайту повреждения ДНК обеспечивается только в результате г10ли(АБР-рибозил)ирования PARP1 (7). С другой стороны, методами дигибридного анализа и иммунопреципитации было установлено, что PARP1 образует белок-белковые контакты с ферментами и факторами ЭРО, такими как ДНК-лигаза III, ДИК-полимераза Р и XRCC1 (10). Таким образом, функционирование ферментов системы ЭРО происходит в тесном взаимодействии с PARP1, поскольку данный белок взаимодействует не только с интермедиатами репарации ДНК, но и ферментами и факторами, функционирующими в процессе ЭРО. Несмотря на большой интерес к исследованию PARP1, многие детали, касающиеся функции этого белка в репарации ДНК, остаются невыясненными. До сих пор остается открытым вопрос о роли PARP1 в координации функциональной активности ферментов, катализирующих отдельные этапы ЭРО. В процессе репарации формируются ДНК-структуры, содержащие одноцепочечные разрывы, и при связывании с ДНК-разрывами PARPI может модулировать различные этапы этого процесса. Поэтому исследование взаимодействия PARP1 со структурами, формирующимися в процессе репарации ДНК, в сочетании с анализом влияния PARP1 на активность ферментов ЭРО, может дать дополнительную информацию о молекулярном механизме функционального вовлечения PARP1 в процесс репарации. В этом случае метод фотоаффинной модификации, является одним из наиболее информативных подходов для исследования динамических, многокомпонентных систем, к которым относится комплекс ферментов ЭРО. Использование фотореакционноспособных ДНК-структур, моделирующих ДНК-интермедиаты различных этапов процесса репарации, позволяет фиксировать относительно нестабильные комплексы белков и факторов ЭРО с ДНК в процессе репарации (11). Кроме того, данный подход позволяет исследовать белок-пуклеиновые или опосредованные через ДНК белок-белковые взаимодействия, как в реконструированных системах из отдельных компонентов, так и в многокомпонентных системах на уровне ядерных или клеточных экстрактов. (11). Применение этого метода в сочетании с изучением влияния PARP1 на активность ферментов системы ЭРО, представляется весьма актуальным для выяснения роли этого белка в координации функционирования репаративного ансамбля.

Целью настоящей работы являлось установление роли поли(АОР-рибозо)полимеразьт 1 (PARP1) в координации процесса экецизионной репарации оснований.

В ходе работы планировалось решить следующие задачи: исследовать взаимодействие PARP1 с ДНК-дуплексами, моделирующими интермедиаты короткозаплаточного и длиннозаплаточного пути ЭРО методом фотоаффинной модификации; исследовать функциональное взаимодействие PARP1 и апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 (АРЕ1) в процессе синтеза ДНК, катализируемого ДНК-полимеразой Р (Pol р); исследовать функциональное взаимодействие PARP1, ее апоптотического 24 кДа-фрагмента (р24) и белков ядерного экстракта из семенников крупного рогатого скота в процессе репарации ДНК по длиннозаплаточпому и короткозаплаточному пути ЭРО.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Суханова, Мария Владиславовна

выводы

1. Методом фотоаффинной модификации обнаружено эффективное взаимодействие PARP1 с ДНК-интермедиатами короткозаплаточного и длиннозаплаточного путей эксцизионной репарации оснований (ЭРО), которое не зависит от типа группировки (фосфат или фуранофосфат) на 5'-краю бреши/разрыва. Показана конкуренция PARP1 с ДНК-полимеразой р (Pol Р) за взаимодействие с ДНК-интермедиатами ЭРО, содержащими одноцепочечный разрыв.

2. Изучено функциональное взаимодействие PARP1, апуриновой/апиримидиновой эндонуклеазы 1 (АРЕ1) в процессе синтеза ДНК, катализируемого Pol Р, па субстратах, содержащих однонуклеотидную брешь или одноцепочечный разрыв с канонической либо неканонической парой оснований на З'-конце разрыва.

• Выявлено, что PARP1 снижает эффективность реакции синтеза ДНК при застраивании однонуклеотидной бреши и ипгибирует синтез с вытеснением цепи, катализируемый Pol р.

• Показано, что АРЕ1 стимулирует активность Pol Р в синтезе ДНК с вытеснением цепи. При некомплементарности оснований на З'-конце разрыва АРЕ1 выщепляет 3'-концевой нуклеотидный остаток, обеспечивая последующее эффективное удлинение праймера, катализируемое Pol р.

• Обнаружено, что PARP1 подавляет стимулирующее влияние АРЕ1 на активность Pol р на структурах с одноцепочечный разрывом. Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1 ослабляет ее ингибирующее влияние, указывая на определяющую роль этого белка в регуляции ДНК-синтезирующей активности Pol Р в длиннозаплаточном пути репарации.

3. Исследовано функциональное взаимодействие PARP1, ее фрагмента 24 кДа (р24) и белков ядерного экстракта при репарации ДНК по длиннозаплаточному и короткозаплаточному пути ЭРО.

• С использованием ДНК-дуплексов, содержащих фотоактивные нуклеотидные остатки на З'-конце праймера в составе однонуклеотидной бреши, разрыва или разрыва со "свисающим" 5'-концом (флэп), выявлены конкурентные взаимоотношения между PARP1, р24 и белками экстракта за взаимодействие с ДНК-интермедиатами ЭРО.

• Показано, что PARP1 или р24 не оказывают существенного влияния на восстановление структуры ДНК по короткозаплаточному пути, однако ингибируют репарацию ДНК по длиннозаплаточному пути ЭРО. Установлено, что оба белка подавляют синтез ДНК с вытеснением запирающей цепи и активность флэп-эндонуклеазы 1 (FEN1).

• Установлено, что в длиннозаплаточном пути ЭРО синтез ДНК, катализируемый белками экстракта, выполняется преимущественно по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши". FEN1 выщепляет один нуклеотид с 5'-конца одноцепочечного разрыва и формирует новую однонуклеотидную брешь, которая застраивается под действием Pol (3. Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1, приводящее к подавлению ДНК-связывающей активности этого фермента, необходимо для эффективного синтеза ДНК по указанному механизму.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе настоящей работы проводилось изучение механизма влияния поли(АОР-рибозо)полимеразы 1 на процесс эксцизионной репарации оснований высших эукариот. В клетках эукариот поврежденные основания и одноцепочечные разрывы ДНК, репарируются посредством эксцизионной репарации оснований (ЭРО), протекающей двумя путями в зависимости от длины ресинтезируемого участка ДНК. ДНК, содержащие разрывы в цепи, возникают как промежуточные продукты обоих путей ЭРО (3). Предполагается, что PARP1 эффективно связывается с одноцепочечными разрывами ДНК и, следовательно, может влиять на процессы, протекающие с формированием таких структур (б, 8). В ходе исследования, направленного на изучение взаимодействия PARP1 с ДНК-дуплексами, имитирующими интермедиаты репарации ДНК, были получены данные, касающиеся взаимодействия PARP1 и ферментов репарации в присутствии PARP1 с З'-копцом разрыва на различных этапах эксцизионной репарации оснований. Методом фотоаффинной модификации, как в реконструированных системах ЭРО, так и в ядерном экстракте, было выявлено, что PARP1 взаимодействует с фотореакционноспособиыми ДНК-дуплексами, моделирующими интермедиаты различных этапов длиннозаплаточного и короткозаплаточного пути ЭРО. Кроме того, показано, что PARP1 конкурирует с ДНК-полимеразой Р, АРЕ1 и белками ядерного экстракта за взаимодействие с ДНК-интермедиатами, содержащими одноцепоченый разрыв, что указывает на возможность ингибирования активности ферментов ЭРО с помощью PARP1. Поэтому особый интерес представляют результаты исследования влияния PARP1 и поли(АВР-рибозил)ирования, механизма, обеспечивающего диссоциацию ее комплексов с ДНК, на репарацию ДНК по длиннозаплаточному и короткозаплаточному пути ЭРО. Возможным следствием взаимодействия PARP1 с 3'-концом однонуклеотидной бреши или одноцепочечного разрыва может быть регуляция репарационного синтеза ДНК. Согласно существующей на данный момент модели функционирования ферментативной системы ЭРО, ДНК-полимераза р играет ключевую роль в обеспечении репарационного синтеза ДНК (92, 157), поэтому был проведен детальный анализ влияния PARP1 на синтез ДНК, катализируемый Pol р. Нами обнаружено, что PARP1 снижает эффективность реакции синтеза ДНК при застраивании однонуклеотидной бреши и ингибирует синтез с вытеснением запирающей цепи. Активность Pol Р в реакции синтеза ДНК с вытеснением цепи восстанавливается только при поли(АОР-рибозил)ировании PARPl. По-видимому, взаимодействие PARP1 с разрывом ДНК, формирующимся после встраивания нуклеотида в брешь, приводит к вытеснению ДНК-полимеразы (3 с З'-конца инициирующего праймера и блокированию дальнейшего синтеза с вытеснением цепи, характерного для "длиннозаплаточного" пути репарации. Согласно литературным данным, при длиннозаплаточном пути, синтез ДНК может катализировать Pol р или ДНК-полимераза 6 (или s) (90). Pol р не обладает собственной 3'—экзонуклеазной активностью и с низкой эффективностью выполняет синтез на протяженных участках ДНК, поэтому традиционно сложилось представление о том, что Pol Р значительно уступает репликативным ДНК-полимеразам 8/с, как в точности, так и в эффективности при синтезе ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО (157, 161). Однако в ходе нашего исследования были получены данные, свидетельствующие в пользу того, что Pol Р может эффективно осуществлять репарационный синтез ДНК в длиннозаплаточном пути при участии АРЕ1. Нами впервые было показано, что АРЕ1 стимулирует активность Pol Р на ник-содержащих ДНК-структурах, увеличивая эффективность реакции синтеза ДНК. Кроме того, вьпцепляя З'-концевой остаток dNMP в составе неканонической пары основания за счет своей 3'—>5' экзонуклеазной активности, АРЕ1 может осуществлять коррекцию ошибочно встроенных нуклеотидов в процессе синтеза ДНК, катализируемого Pol р. На основании этих данных можно предположить, что точность и эффективность репарационного синтеза ДНК, катализируемого Pol р, может обеспечиваться за счет функционирования данной полимеразы в комплексе с АРЕ1. Однако следует отметить, что PARP1 мешает продуктивному функционированию Pol Р и АРЕ1 в реакции синтеза ДНК, поскольку при анализе ДНК-синтезирующей активности Pol Р при одновременном присутствии АРЕ1 и PARP1 было выявлено, что PARP1 подавляет синтез ДНК, осуществляемый Pol Р в присутствии с АРЕ1, и 3'—>5' экзонуклеазную активность АРЕ1. Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1, ослабляет се ингибирующее действие, однако не приводит к восстановлению эффективности реакций, которые катализируют Pol р и АРЕ1. Таким образом, PARP1 кардинально влияет на способность АРЕ1 повышать эффективность и точность синтеза ДНК, катализируемого Pol р. Поэтому можно предположить, что поли(АОР-рибозил)ирование PARP1, обуславливающее диссоциацию комплекса PARP1 с ДНК, является необходимым условием для реализация Pol Р-зависимого синтеза ДНК с активным участием АРЕ1.

Несомненно, что кроме анализа влияния PARP1 на синтез ДНК, важно было выяснить роль этого белка в ЭРО на стадиях, следующих за синтезом ДНК. Поэтому был проведен анализ влияния PARP1 на репарацию ДНК по длиннозаплаточному и короткозаплаточному пути ЭРО в ядерном экстракте из семенников крупного рогатого скота. Было обнаружено, что PARP1 практически не оказывает влияния на синтез ДНК при заполнении однонуклеотидной бреши и лигирование одноцепочечного разрыва, то есть на восстановление интактной структуры ДНК по короткозаплаточному пути ЭРО. Известно, что при корогкозаплаточной репарации синтез ДНК при заполнении однонуклеотидной бреши катализирует Pol Р, а последняя стадия - лигирование разрыва происходит с участиехМ ДНК-лигазы III в комплексе с XRCC1 (91-93, 177). Таким образом, Pol Р и ДНК-лигаза III способны проявлять функциональную активность в присутствии PARP1. Следует отметить, что согласно современной модели функционирования PARI3! в ЭРО, предполагается, что связывание PARP1 с разрывом в ДНК полностью блокирует репарационный процесс, и только в результате поли(АОР-рибозил)ирования обеспечивается диссоциация комплексов PARP1 с ДНК и доступ к сайту повреждения ферментов репарации (6, 108). В свою очередь нами показано, что в короткозаплаточном пути ЭРО поли(АОР-рибозил)ирование PARP1 не является необходимым условием для эффективного функционирования ферментов, катализирующих репарацию по этому пути. В то же время, PARP1 ингибирует длиинозаплаточный путь ЭРО. Более детальный анализ выявил, что PARP1 подавляет синтез ДНК с вытеснением запирающей цепи и активность FEN1, которая осуществляет процессинг "свисающего" 5'-конца ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО. Поли(АОР-рибозил)ирование частично снимает ингибирующее влияние PARP1 на активность ферментов, катализирующих реакции в длиннозаплаточном пути репарации. По-видимому, в длиннозаплаточном пути ЭРО модификация PARP1 имеет принципиальное значение для эффективного протекания процесса.

Нами было установлено, что в исследуемом экстракте синтез ДНК в длиннозаплаточном пути преимущественно выполняется по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши", который ранее был обнаружен при исследовании функционирования Pol Р в присутствии FEN1 на ник-содержащих структурах ДНК в системе, реконструированной из рекомбинантных белков (169). В этом случае, после заполнения однонуклеотидной бреши за счет активности Pol р, FEN1 выщепляет один пуклеотид с 5'-конца одноцепочечного разрыва и формирует новую однонуклеогидную брешь. Таким образом, создавая субстрат с однонуклеотидной брешью, на котором Pol р проявляет максимальную каталитическую эффективность, FEN1 стимулирует активность Pol р (169). Поскольку в нашей работе впервые показано, что синтез ДНК по механизму "трансляции однонуклеотидной бреши" осуществляется с участием белков ядерного экстракта, это говорит о возможности существования раннее не описанного способа синтеза ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО in vivo. Именно Pol Р является наиболее подходящим кандидатом для выполнения синтеза ДНК по этому механизму в живой клетке. Таким образом, Pol Р может играть ключевую роль в обеспечении синтеза ДНК в длиннозаплаточном пути ЭРО, и ее партнерами в этом процессе могут быть FEN1, формирующая ДНК-субстрат, на котором Pol Р работает более эффективно, а также АРЕ1, функционирующая как корректирующая экзонуклеаза. В тоже время, поли(АОР-рибозил)ирование PARP1, приводящее к подавлению ДНК-связывающей активности этого фермента, по-видимому, необходимо для реализации длиннозаплаточного пути репарации с участием Pol р в качестве основной полимеразы.

На настоящий момент не установлено, какая именно полимераза - Pol р или ДНК-полимераза 5/s, играет ключевую роль в длиннозаплаточном пути репарации, однако предполагается, что заполнение однонуклеотидной бреши всегда катализирует Pol р, а при дальнейшем синтезе с вытеснением цепи может происходить переключение синтеза ДНК от Pol р к PCNA-зависимым ДНК-полимеразам 5(или г) (3, 5, 158). Возможно, что взаимодействие PARP1 с одноцепочечным разрывом в ДНК может способствовать переключению синтеза ДНК от Pol Р к синтезу, катализируемому ДНК-полимеразой 5, так как известно, что ДНК-полимераза 5, в отличие от других репликативиых ДНК-полимераз с и а, способна выполнять синтез ДНК в присутствии PARP1 (118, 176). По-видимому, модификация PARP1 будет способствовать реализации Pol Р-зависимого синтеза ДНК, поскольку эффективное протекание длиннозаплаточной репарации, когда синтез ДНК осуществляется за счет активности Pol Р, возможно только при снижении ДНК-связывающей активности PARP1 за счет ее поли(АОР-рибозил)ирования.

Полученные данные позволили предложить модель координации ЭРО с помощью PARP1 (рис. 3.33). Согласно этой модели, PARP1 может вовлекаться в ЭРО на этапе образования однонуклеотидной бреши. На этом этапе представляется возможным, функционирование Pol р в комплексе с PARP1, в этом случае Pol Р встраивает нуклеогид в З'-конец праймера и за счет лиазной активности удаляет 5'-dRP остаток. Связывание PARP1 с одноцепочечным разрывом после заполнения бреши, возможно, способствует посадке ДНК-лигазы III, которая лигирует разрыв, завершая короткозаплаточный путь ЭРО (путь 1). В том случае, когда 5'-сШ.Р-остаток не удаляется за счет лиазной активности Pol р реализуется длиннозаплаточный путь, в котором синтез ДНК может осуществляться с участием Pol р или PCNA-зависимых ДНК-полимераз (5/s). По-видимому, взаимодействие PARP1 с ник-содержащими ДНК-интермедиатами длиннозаплаточного пути ЭРО способствует вытеснению Pol (3 с З'-конца разрыва и посадке ДНК-полимеразы 8. Таким образом, в процессе длиннозаплаточной репарации может происходить переключение синтеза Д1IK за счет активности Pol (3 к синтезу, катализируемому PCNA-зависимой ДНК-полимеразой 6 (путь 4). Поли(АОР-рибозил)ирование PARP1 и последующая диссоциация ее комплекса с ДНК может способствовать реализации Pol [3-зависимого синтеза ДНК при участии АРЕ1 (путь 2) или FEN1 (путь 3).

Короткозаплаточный путь

PAHW Рй (5

-г-гтТ^гт

54 3'I

-3-5'

54

3'-*

-1-Я? Г | ,,

5'п I"'1 г г г3' 3'-^' ' 5*

UWB,,

---т—О

-а1-I I ■ > ci

54

3'—'

-ГП--3' 5'

АЮЕ1

51—

-3' -5'

5' .1 I I I ! J 1 ; т-г 3' ■■ ■ g'

Длин нсаагитаточн ый путь

РуяАРЕ! aH*L—- 3'

ПопЧАСР-еибвжп*!™™» PARPI NAD-

2'I- ------

Р<хр I

5-ГТПГ-1 -т -----3

З' '-1. ■—5'

5'i I [ 1— i / I I 3' у ■ * ' ?■ т 1 ■ 5'

PoJ p

PARPI

3'.5' Pol!

3'

-3' L 5'

Pol

53': '-1 l~>

54 L i i i-т-г —--3' i<

5'.

3^—-1 . ■ • 5"

3' ' ; i i ■ ' ' ' ■ 5'

Рис, 3.33. Гипотетическая модель координации процесса ЭРО с помощью PARP1.

Таким образом, взаимодействуя с ДНК-интермедиатами репарации, PARP1 может обеспечивать передачу ДНК-субстрата от одного белка к другому в процессе ЭРО, способствовать связыванию определенных ферментов, функционирующих на данном этапе репарации и регулировать композицию участников репарационного процесса.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Суханова, Мария Владиславовна, 2008 год

1. Lindahl Т. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature 1993. V. 362. P. 709.

2. Sharer O.D. Chemistry and biology of DNA repair // Angew. Chem. Int. Ed. 2003. V. 42. P. 2946-2974.

3. Lindahl T. Suppression of spontaneous mutagenesis in human cells by DNA base excision-repair //Mutat. Res. 2000. V. 462. P. 129-135.

4. Wilson S.H., Kunkel T.A. Passing the baton in base excision repair // Nat. Struct. Biol. 2000. V. 7. P. 176-178.

5. Fan J., Wilson III D.M. Protein-protein interactions and posttranslational modifications in mammalian base excision repair//Free Radio. Biol. Med. 2005. V. 38. P. 1121-1138.

6. Lindahl Т., Satoh M.S., Poirier G.G., Klangland A. Post-translational modification of poly(ADP-ribose) polymerase induced by DNA strand breaks // Trends Biochem. Sci. 1995. V. 20. P.405-411.

7. D'Amours D., Desnoyers S., D'Silva I., Poirier G.G. Poly(ADP-ribosyl)ation reactions in the regulation of nuclear functions //Biochem. J. 1999. V. 342. P. 249-268.

8. Dantzer F., Атё J.С., Schreiber V., Nakamura J., Mdnissier de Murcia M.J., de Murcia G. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 activation during DNA damage and repair// Methods Enzymol. 2006. V. 409. P. 493-510.

9. Shall S.S., de Murcia G. Poly(ADP-ribose) polymerase-1: what have we learned from the deficient mouse model? // Mutat. Res. 2000. V. 460. P. 1-15.

10. Dantzer F., Schreiber V., Niedergang С., Trucco C., Flatter E., De La Rubia G., Oliver J., Rolli V., Menissier de Murcia J., de Murcia G. Involvement of poly(ADP-ribose) polymerase in base excision repair //Biochimie. 1999. V. 81. P. 69-75.

11. Khodyreva S.N., Lavrik O.I. Photoaffinity labeling technique for studying DNA replication and DNA repair//Curr. Med. Chem. 2005. V. 12. P. 641-655.

12. Bernstein C., Bernstein II., Payne C.M., Garewal H. DNA repair/pro-apoptotic dual-role proteins in five major DNA repair pathway: fail-safe protection against carcinogenesis // Mutat. Res. 2002. V. 511. P. 145-178.

13. Althaus F.R., Kleczowska H.E., Malanga M., Muntener C.R., Pleschke J.M., Ebner M., Auer B. Poly ADP-ribosylation: a DNA break signal mechanism // Mol. Cell Biochem. 1999. V. 193. P. 5-11.

14. Hassa P.O., Haenni S.S., Elser M., Hottiger M.O. Nuclear ADP-ribosylation reactions in mammalian cells: where are we today and where are we going? // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2006. V. 70. P. 789-829.

15. Ngaewaa P.A., Fuertesb М.Л., Valladaresa В., Alonsob C., Perez J.M. Poly(ADP-Ribose)polymerases: homology, structural domains and functions, novel therapeutical application //Prog. Biophys. Mol. Biol. 2005. V. 88. P. 143-172.

16. Desmarais Y., Menard L., LagueuxJ., Poirier G. Enzymological properties of poly(ADP-ribose polymerase: characterization of automodification sites and NADase activity // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V. 1078. P. 179-186.

17. A me J.C., Rolli V., Schreiber V., Niedergang C., Apion F., Decker P., Midler S., Iioger Т., Menissier de Murcia J., de Murcia G. PARP-2, a novel mammalian DNA damage-dependent poly(ADP-ribosc)polymerase// J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 17860-17868.

18. Sallmann F.R., Vodenicharov M.D., Wang Z.Q., Poirier G.G. Characterization of sPARP-1 //J. Biol. Chem. 2000. V. 275 P. 15504-15511.

19. A me J.C., Spenlehauer C., de Murcia G. The PARP superfamily //2004. BioEssays. V. 26. P. 1-12.

20. Ogata N., Ueda K, Kawaichi M., Hayaishi O. Poly(ADP-Ribose) synthetase, a main acceptor of poly(ADP-ribose) in isolated nuclei //J. Biol. Chem. 1981. V. 256. P. 41354137.

21. Yamanaka II., Penning C.A., Willis E.H., Wasson D.B., Carson D.A. Characterization of human poly(ADP-ribose) polymerase with autoantibodies //./. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 3879-3883.

22. Virag L., Szabo C. The Therapeutic potential of poly(ADP-Ribose) polymerase inhibitors //Pharmacol. Rev. 2002. V. 54. P. 375-429.

23. Kameshita I., Matsuda M., Nishikimi M., Ushiro H., Shiznta Y. Reconstitution and poly(ADP-ribosyl)ation of proteolytically fragmented poly(ADP-ribose) synthetase //./. Biol. Chem. 1986. V. 261. P. 3863-3868.

24. Nishikimi M, Ogasawara K, Kameshita I, Taniguchi T, Shizuta Y. Poly(ADP-ribose) synthetase. The DNA binding domain and the automodification domain // J. Biol Chem. 1982. V. 257. P. 6102-6105.

25. Kaufmann S.H., Desnoyers S., Ottaviano Y, Davidson N.E., Poirier G.G. Specific proteolytic cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: an early marker of chemo-therapy-induced apoptosis // Cancer Res. 1993. V. 53. P. 3976-3985.

26. BorkP., Hofmann K., Bucher P., Neuwald A.F., Altschul S.F, Koonin E. V. Superfamily of conserved domains in DNA damage-responsive cell cycle checkpoint proteins // FASEB J. 1997. V. 11. P. 68-76.

27. Alvarez-Gonzalez R., Watkins T.A., Gill P.K., Reed J.L., Mendoza-Alvarez H. Regulatory mechanisms of poly(ADP-ribose) polymerase // Mol. Cell. Biochem. 1999. V. 193. P. 1922.

28. Tanuma S., Yagi Т., Johnson G.S. Endogenous ADP-ribosylation of high mobility group proteins 1 and 2 and histone HI following DNA damage in intact cells //Arch. Biochem. Biophys. 1985. V. 237. P. 38-42.

29. Gradwohl G., Mazen A., de Murcia G. Poly(ADP-ribose) polymerase forms loops with DNA // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1987. V. 148. P. 913-919.

30. Huang K., Tidyman W.E., Le K.U., Kirsten E., Кип E„ Ordahl C.P. Analysis of nucleotide sequence-dependent DNA binding of poly(ADP-ribose) polymerase in a purified system // Biochemistry. 2004. V. 43. P. 217-223.

31. Lonskaya I., Potaman V.N., Shlyakhtenko L.S., Oussatcheva E.A., Lyubchenko Y.L, Soldatenkov V.A. Regulation of poly(ADP-ribose) polymerase-1 by DNA structure-specific binding// J. Biol. Chem. 2005. V. 280. P. 17076-17083.

32. Ruf A., Rolli V., de Murcia G., Schulz G.E. The mechanism of the elongation and branching reaction of poly(ADP-ribose)polymerase as derive form crystal structures and mutagenesis //1998. J. Mol. Biol. V. 278. P. 57-65.

33. Ikejima M., Marsischky G„ Gill D.M. Direction of elongation of poly(ADP-ribose) chains. Addition of residues at the polymerase-proximal terminus //./. Biol. Chem. 1987. V. 262. P. 17641-17650.

34. Kawaichi M., Ueda K., Hayaishi O. Initiation of poly(ADP-ribosyl)-histone synthesis by poly(ADP-ribose) synthetase //J. Biol. Chem. 1980. V. 255. P. 816-819.

35. Ueda K., Kawaichi M., Okayama H., Hayaishi O. Poly(ADP-ribosyl)ation of nuclear proteins. Enzymatic elongation of chemically synthesized ADP-ribose-histone adducts // ./. Biol. Chem. 1979. V. 254. P. 679-687.

36. Alvarez-Gonzalez R. 3'-Deoxy-NAD+ as a substrate for poly(ADP-ribosc)polymerase and the reaction mechanism of poly(ADP-ribose) elongation //J. Biol. Chem. 1988. V. 263. P. 17690-17696.

37. Rolli V., O'Farrell M., Menissier de Murcia J., de Murcia G. Random mutagenesis of the poly(ADP-ribose) polymerase catalytic domain reveals amino acids involved in polymer branching //Biochemistry. 1997. V. 36. P. 12147-12154.

38. Miwa M., Saikawa N., Yamaizumi Z, Nishimura S., Sugimura T. Identification of 2'-l"-ribosyl-2"-(or 3"-)(r"-ribosyl). adenosine-5,,5",5"'-tris(phosphate) as a branch linkage // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1979. V. 76. P. 595-599.

39. Mendoza-Alvarez H., Alvarez-Gonzalez R. Biochemical characterization of mono(ADP-ribosyl)ated poly(ADP-ribose) polymerase //Biochemistry. 1999. V. 38. P. 3948-3953.

40. Alvarez-Gonzalez R., Jacobson M.K. Characterization of polymers of adenosine diphosphate ribose generated in vitro and in vivo // Biochemistry. 1987. V. 26. P. 32183224.

41. Kiehlbauch C.C., Aboul-Ela N. Jacobson E.L., Ringer D.P., Jacobson M.K. High resolution fractionation and characterization of ADP-ribose polymers // Anal. Biochem. 1993. V. 208. P. 26-34.

42. Mendoza-Alvarez PI., Alvarez-Gonzalez R. Poly(ADP-ribose) polymerase is a catalytic dimmer and the auto modification reaction is intermolecular //J. Biol. Chem. 1993. V. 268.,P. 22575-22580.

43. Bauer P.I., Buki KG., Накат A., Kim E. Macromolecular association of ADP-ribosyl transferase and its correlation with enzymic activity //Biochem. J. 1990. V. 270. P. 17-26.

44. Pion E., Bombarda E., Stiegler P., Ullmann G.M., Mely Y., de Murcia G., Gerard D. Poly(ADP-ribose)polymerase-l dimerizes at a 5' recessed DNA end in vitro: a fluorescence study // Biochemistry. 2003. V. 42. P. 12409-12417.

45. Kirslen E., Кип E., Mendeleyev J., Ordahl C.P. Activity assays for poly-ADP ribose polymerase//Methods Mol. Biol. V. 287. P. 137-149.

46. Zahradka P., Ebisuzaki K. A shuttle mechanism for DNA-protein interactions. The regulation of poly(ADP-ribose) polymerase //Eur. J. Biochem. 1982. V. 127. P. 579-585.

47. Oka J., Ueda K., Hayaishi О., Komura H., Nakanishi K. ADP-ribosyl protein lyase. Purification, properties and identification of the product//1984. J. Biol. Chem. V. 259. P. 986-995.

48. Alvarez-Gonzalez R., Althaus F.R. Poly(ADP-ribose) catabolism in mammalian cells exposed to DNA-damaging agents //Mutat. Res. 1989. V. 218. P. 67-74.

49. Brochu G., Duchaine C., Thibeault L., Lagueux J., Shah G.M., Poirier G.G. Mode of action of poly(ADP-ribose) glycohydrolase // Biochim. Biophys. Acta. 1994. V. 1219. P. 342-350.

50. Davidovic L, Vodenicharov M., Affar E.B., Poirier G.G. Importance of poly(ADP-ribose) glycohydrolase in the control of poly(ADP-ribose) metabolism // Exp. Cell. Res. 2001. V. 268. P. 7-13.

51. Bauer P.I., Buki KG., Кип E. Evidence for the participation of histidine residues located in the 56 kDa C-terminal polypeptide domain of ADP-ribosyl transferase in its catalytic activity //FEBSLett. 1990. V. 273. P. 6-10.

52. Kim H., Jacobson M.K, Rolli V., Menissier de Murcia J., Reinbolt J., Simonin F., Ruf A., Schulz G., de Murcia G Photoaffinity labelling of human poly(ADP-ribose) polymerase catalytic domain //Biochem. J. 1997. V. 322. P. 469-475.

53. Juarez-Salinas H., Sims J.L., Jacobson M.K. Poly(ADP-ribose) levels in carcinogen treated cells //Nature. 1979. V. 282. P. 740-741.

54. Malanga M., Althaus F.R. Poly(ADP-ribose) molecules formed during DNA repair in vivo //J. Biol. Chem. 1994. V. 269 P. 17691-17696.

55. Rankin P.W., Jacobson M.K., Mitchell V.R., Busbee D.L. Reduction on nicotinamide adenine dinucleotide levels by ultimate carcinogens in human lymphocytes // Cancer Res. 1980. V. 40. P. 1803-1807.

56. Goodwin P.M., Lewis P.J., Davies M.I., Skidmore C.J., Shall S. The effect of gamma radiation and neocarzinostatin on NAD and ATP levels in mouse leukaemia cells // Biochim. Biophys. Acta. 1978. V. 543. P. 576-582.

57. James M.R., Lehmann A.R. Role of poly(adenosine diphosphate ribose) in deoxyribonucleic acid repair in human fibroblast // Biochemistry. 1982. V. 21. P. 40074013.

58. Berger N.A. Poly(ADP-ribose) in the cellular response to DNA damage // Radiat. Res. 1985. V. 101. P. 4-15.

59. Park S.D., Kim C.G., Kim M.G. Inhibitors of poly(ADP-ribose) polymerase enhance DNA strand breaks, excision repair and sister chromatid exchanges induced by alkylating agents //Environ. Mutagen. 1983. V. 5. P. 515-525.

60. Ktipper J.H., de Murcia G., Biirkle A. Inhibition of poly(ADP-ribosyl)ation by overexpressing the poly(ADP-ribose) polymerase DNA-binding domain in mammalian cells//./. Biol. Chem. 1990. V. 265. P. 18721-18724.

61. Menissier de Murcia J., Niedergang C., Trucco C., Ricoul M., Dutrillaux В., Mark M., Oliver F.J., Masson M., Dierich A., LeMeur M., Walztinger C„ Chambon P., de Murcia

62. G. Requirement of poly(ADP-ribose) polymerase in recovery from DNA damage in mice and in cells //Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. V. 94. P. 7303-7307.

63. Wang Z.Q., Auer В., Stingl L., Berghammer H., Haidacher D., Schwciger M., Wagner E.F. Mice lacking ADPRT and poly(ADP-ribosyl)ation develop normally but are susceptible to skin disease // Genes Dev. 1995. V. 9. P. 509-520.

64. Trucco C., Oliver F.J., de Murcia G., Menissier-de Murcia J. DNA repair defect in poly(ADP-ribose) polymerase-deficicnt cell lines // Nucleic Acids Res. 1998. V. 26. P. 2644-2649.

65. Ding R„ Pommier Y., Kang V.H., Smulson M. Depletion of poly(ADP-ribose) polymerase by antisense RNA expression results in a delay in DNA strand break rejoining // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 12804-12812.

66. Slevnsner Т., Ding R., Smulson M., Bohr V.A. Inhibition of gene-specific repair of alkylation damage in cells depleted of poly(ADP-ribose) polymerase// Nucleic Acids Res. 1994. V. 22. P. 4620-4624.

67. Ding R., Smulson M. Depletion of nuclear poly(ADP-ribose) polymerase by antisense RNA expression: influences on genomic stability, chromatin organization, and carcinogen cytotoxicity //Cancer Res. 1994. V. 54. P. 4627-4634.

68. Shieh W.M., Ame J.C., Wilson M.V., Wang Z.O., Koh D.W., Jacobson M.K., Jacobson E.L. Poly(ADP-ribose) polymerase null mouse cells synthesize ADP-ribose polymers//./. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 30069-30072.

69. Kupper J.H., MiXller M„ Btirkle A. Trans-dominant inhibition of poly(ADPribosyl)ation potentiates cancinogen-induced gene amplification in SV40-transformed Chinese hamster cells //Cancer Res. 1996. V. 56. P. 2715-2717.

70. Chatterjee S., Hirschler N.V., Petzold S.J., Berger S.J., Berger N.A. Mutant cells defective in poly(ADP-ribose) synthesis due to stable alterations in enzyme activity or substrate availability // Exp. Cell Res. 1989. V. 184. P. 1-15.

71. Witmer M. V., Aboul-Ela N., Jacobson M.K., Stamato T.D. Increased sensitivity to DNA-alkylating agents in CHO mutants with decreased poly(ADP-ribose) polymerase activity //Mutat. Res. 1994. V. 314. P. 249-260.

72. Wang Z.O., Stingl L., Morrison C., Jantsch M., Los M., Schulze-Osthoff K, Wagner E.F. PARP is important for genomic stability but dispensable in apoptosis // Genes Dev. 1997. V. 11. P. 2347-2358.

73. Seeberg E., Eide L., Bjoras M. The base excision repair pathway // Trends Biochem. Sci. 1995. V. 20. P. 391-397.

74. Krokan H.E., Standal 11, Slupphaug G. DNA glycosylases in the base excision repair of DNA //Biochem. J. 1997. V. 325. P. 1-16.

75. Wilson III D.M., Barsky D. The major human abasic endonuclcase: formation, consequences and repair of abasic lesions in DNA // Mutat. Res. 2001. V. 485. P. 283307.

76. Frosina G., Fortini P., Rossi O., Carrozzino F., Raspaglio G., Cox L.S., Lane D.P., Abbondandolo A., Dogliotti E. Two pathways for base excision repair in mammalian cells //J. Biol. Chem. 1996. V. 271. P. 9573-9578.

77. Matsumoto Y., Kim K. Excision of deoxyribose phosphate residues by DNA polymerase p during DNA repair //Science. 1995. V. 269 P. 699-702.

78. Sobol R. W, Horton J.K., Kuhn R., Gu H., Singhal R.K., Prasad R., Rajewsky K, Wilson S.H. Requirement of mammalian DNA polymerase-beta in base-excision repair // Nature. 1996. V. 379. P. 183-186.

79. Cappelli E., Taylor R., Cevasco M., Abbondandolo A., Caldecott K, Frosina G. Involvement of XRCC1 and ligase III gene products in base excision repair // 1997. J. Biol. Chem. V. 272. P. 23970-23975.

80. Matsumoto Y., Kim K, Bogenhagen D.F. Proliferating cell nuclear antigen-dependent abasic site repair in Xenopus laevis oocytes: an alternative pathway of base excision DNA repair//Mol. Cell. Biol. 1994. V. 14. P. 6187-6197.

81. Sattler U., Frit P., Salles В., Calsou P. Long-patch DNA repair synthesis during base excision repair in mammalian cells // EMBO Rep. 2003. V. 4. P. 363-367.

82. Klungland A., Lindahl T. Second pathway for completion of human DNA base excision-repair: reconstitution with purified proteins and requirement for DNAse IV (FEN1) // EMBO J. 1997. V. 16 P. 3341-3348.

83. Dianov G.L., Prasad R., Wilson S.II., Bohr V.A. Role of DNA Polymerase beta in the Excision Step of Long Patch Mammalian Base Excision Repair//,/. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 13741-13743.

84. Dianov G., Bischoff C., Piotrowski J., Bohr V.A. Repair pathways for processing of 8-oxoguanine in DNA by mammalian cell extracts//./. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 3381133816.

85. Fortini P., Parlanli E., Sidorkina O.M., Laval J., Dogliotti E. The type of DNA glycosylase determines the base excision repair pathway in mammalian cells // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 15230-15236.

86. Kubota Y, Nash R.A., Klungland A., Schar P., Barnes D.E., Lindahl T. Reconstitution of DNA base excision-repair with purified human proteins: interaction between DNA polymerase p and XRCC1 protein // EMBO J. 1996. V. 15. P. 6662-6670.

87. Bennett S.E., Sung J.S., Mosbaugh D.W. Fidelity of uracil-initiated base excision DNA repair in DNA polymerase beta-proficient and deficient mouse embryonic fibroblast cell extracts //J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 42588-42600.

88. Pascucci В., Stucki M„ Jonsson Z.O., Dogliotti E., Hubscher U. Long patch base excision repair with purified human proteins. DNA ligase I as patch size mediator for DNA polymerases delta and epsilon//J. Biol. Chem. 1999. V. 274 P. 33696-33702.

89. Satoh M.S., Lindahl T. Role of poly(ADP-ribose) formation in DNA repair // Nature. 1992. V. 356 P. 356-358.

90. Satoh M.S., Poirier G.G., Lindahl T. NAD+-dependent repair of damaged DNA by human cell-extracts //./. Biol. Chem. 1993. V. 268. P. 5480-5487.

91. Dantzer F., de La Rubia G., Menissier-de Murcia J., Hostomsky Z., de Murcia G., Schreiber V. Base excision repair is impaired in mammalian cells lacking poly(ADP-ribose) polymerase-1 //Biochemistry. 2000. V. 39. P. 3559-7569.

92. Vodenicharov M.D., Sallmann F.R., Satoh M.S., Poirier G.G. Base excision repair is efficient in cells lacking poly(ADP-ribose) polymerase 1 // Nucleic Acids Res. 2000. V.28. P. 3887-3896.

93. Sanderson R.J., Lindahl T. Down-regulation of DNA repair synthesis at DNA single-strand interruptions in poly(ADP-ribose) polymerase-1 deficient murine cell extracts // DNA Repair. 2002. V. 1. P. 547-558.

94. Allinson S.L., Dianova /./., Dianov G.L. Poly(ADP-ribose) polymerase in base excision repair: always engaged, but not essential for DNA damage processing // Acta Biochim. Pol. 2003. V. 50. P. 169-179.

95. Caldecott K.W., Aoufouchi S., Johnson P., Shall S. XRCC1 polypeptide interacts with DNA polymerase P and possibly poly(ADP-ribose) polymerase, and DNA ligase III is novel molecular'nick-sensor' in vitro //Nucleic Acids Res. J996. V. 24. P. 4387-4394.

96. Khamisy S.F., Masutani M., Suzuki II, Caldecott K. W. A requirement for PARP-1 for the assembly or stability of XRCC1 nuclear foci at sites of oxidative DNA damage // Nucleic Acids Res. 2003. V. 31. P. 5526-5533.

97. Pleschke J.M., Kleczkowska H.E., Strohm M„ Althaus F.R. Poly(ADP-ribose) binds to specific domains in DNA damage checkpoint proteins //J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 40974-40980.

98. Eki Т., Hurwitz J. Influence of poly(ADP-ribose) polymerase on the enzymatic synthesis of SV40 DNA //J. Biol. Chem. 1991. V. 266. P. 3087-3100.

99. Okano S., ban L., Caldecott K.W., Mori Т., Yasui A. Spatial and temporal cellular responses to single-strand breaks in human cells //Mol. Cell. Biol. 2003. V. 23. P. 39743981.

100. Ohashi Y., Itaya A., Tanaka Y, Yoshihara K., Kamiya Т., Matsukage A. Poly(ADP-ribosyl)ation of DNA polymerase beta in vitro // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1986. V. 140. P. 666-673.

101. Lavrik O.I., Prasad R., Sobol R.W., Horton J.K., Ackerman E.J., Wilson S.H. Photoafflnity labeling of mouse fibroblast enzymes by a base excision repair intermediate //J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 25541-25548.

102. Cistulli C., Lavrik O.I., Prasad R., Нои E., Wilson S.H. AP endonuclease and poly(ADP-ribose) polymerase-1 interact with the same base excision repair intermediate // DNA Repair. 2004. V. 3. P. 581-591.

103. Lebedeva N.A., Rechkunova N.I., Khodyreva S.N., Favre A., Lavrik O.I. Photoafflnity labelling of proteins in bovine testis nuclear extract // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. V. 297. P. 714-721.

104. Srivastava D.K., Berg В. J., Prasad R., Molina J. Т., Beard W.A., Tomkinson A.E., Wilson S.H. Mammalian abasic site base excision repair//J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 2120321209.

105. Parsons J.L., Dianova /./., Allinson S.L., Dianov G.L. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 protects excessive DNA strand breaks from deterioration during repair in human cell extracts //FEBSJ. 2005. V. 272. P. 2012-2021.

106. Malanga M., Pleschke J.M., Kleczkowska H.E., Althaus F.R. Poly(ADP-ribose) binds to specific domains of p53 and alters its DNA binding functions // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. P. 11839-11843.

107. Wesierska-Gadek J., Schmid G. Poly(ADP-ribose) polymerase-1 regulates the stability of the wild-type P53 protein //Cell. Mol. Biol. Lett. 2001. V. 6. P. 117-140.

108. Mendoza-Alvarez K, Alvarez-Gonzalez R. Regulation of P53 sequence specific DNA-binding by covalent poly(ADP-ribosyl)ation // J. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 3642536430.

109. Ran Z., Rayel В., Rommelaere J., Faisst S. Parvovirus H-l-induced cell death: influence of intracellular NAD consumption on the regulation of necrosis and apoptosis // Virus Res. 1999. V. 65. P. 161-174.

110. Leist M., Single В., Castoldi A.F., Kuhnle S., Nicotera P. Intracellular adenosine triphosphate (ATP) concentration: a switch in the decision between apoptosis and necrosis //J. Exp. Med. 1997. V.185. P. 1481-1486.

111. Скулачев В.П. Явления запрограмированной смерти. Организм // СОЖ. 2001. Т. 7. С. 2-6.

112. Kaufmann S.H., Desnoyers S., Ottaviano Y., Davidson N.E., Poirier G.G. Specific proteolytic cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase: an early marker of chemotherapy induced apoptosis // Cancer Res. 1993. V. 53. P. 3976-3985.

113. Germain M„ Affar E.B., D Amours D., Dixit V.M., Salvesen G.S., Poirier G.G. Cleavage of automodified poly(ADP-ribose) polymerase during apoptosis. Evidence for involvement of caspase-7 // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 28379-28384.

114. Kim J.W., Kim K, Kang K, Joe C.O. Inhibition of homodimerization of poly(ADP-ribose) polymerase by its C-terminal cleavage products produced during apoptosis // J. Biol. Chem. 2000. V. 275. P. 8121-8125.

115. D Amours D., Sallmann F.R., Dixit V.M., Poirier G.G. Gain-of- function of poly(ADPribose) polymerase-1 upon cleavage by apoptotic proteases: implications for apoptosis//./. Cell. Sci. 2001. V. 114. P. 3771-3778.

116. Yung T.M., Satoh M.S. Functional competition between poly(ADP-ribose) polymerase and its 24-kDa apoptotic fragment in DNA repair and transcription//./. Biol. Chem. 2001. V. 276. P. 11279-11286.

117. Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye-binding //Anal. Biochem. 1976. V. 72. P. 248-254.

118. Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory Manual (2nd ed.)

119. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold spring Harbor, N.Y. 1989.

120. Nash R., Lindahl T. DNA Ligases: DNA replication in eukaryotic cells // Cold Spring

121. Harbor Laboratory Press, N.Y. 1996. P. 575-580.

122. Carey J. Gel retardation // Meth. Enzymol. 1991. V. 208. P. 103-117.

123. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики М.: Мир 1979.

124. Sobol R. W., Prasad R., Evenski A., Baker A., Yang X.P., Horton J.K., Wilson S.H. Thelyase activity of the DNA repair protein р-polymerase protects from DNA-damageinduced cytotoxicity //Nature. 2000. V. 405. P. 807-810.

125. Singhal R.K., Wilson S.H. Short gap-filling synthesis by DNA polymerase p is processive //J. Biol Chem. 1993. V. 268. P. 15906-15911.

126. Chagovetz A.M., Sweasy J.В., Preston B.D. Increased activity and fidelity of DNA polymerase p on single nucleotide gapped DNA //J. Biol. Chem. 1997. V. 44. P. 2750127504.

127. Beard W.A., Wilson S.H. Structure and mechanism of DNA polymerase p //2006. V. 106. P. 361-382.

128. Podlutsky A.J., Dianova I.I., Podust V.N., Bohr V.A., Dianov G.L. Human DNA polymerase p initiates DNA synthesis during long-patch repair of reduccd AP sites in DNA //EMBO./. 2001. V. 20. P. 1477-1482.

129. Osheroff W.P., Jung H.K., Beard W.A., Wilson S.H., Kunkel T.A. The fidelity of DNA polymerase beta during distributive and processive DNA synthesis //,/. Biol. Chem. 1999. V. 274. P. 3642-3650.

130. Griesenheck J., Oei S.L., Mayer-Kuckuk P., Ziegler M., Buchlow G., Schweiger M. Protein-protein interaction of the human poly(ADP-ribosyl)transferase depends on the functional state of the enzyme // Biochemistry. 1997. V. 36. P. 7297-7304.

131. Lindahl Г., WoodR.D. Quality control by DNA repair //Science. 1999. V. 286. P. 18971905.

132. Chou K.M., Cheng Y.C. An exonucleolytic activity of human apurinic/apyrimidinic endonuclease on 3' mispaircd DNA //Nature. 2002. V. 415. P. 655-659.

133. Jiricny J. An APE that proofreads // Nature. 2002. 415. 593-594.

134. Bennett R.A., Wilson III D.M., Wong D., Demple B. Interaction of human apurinic endonuclease and DNA polymerase beta in the base excision repair pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1997. V. 94. P. 7166-7169.

135. Copeland W.C., Chen M.S., Wang T.S. Human DNA polymerases a and P are able to incorporate anti-HIV deoxynucleotides into DNA // J. Biol. Chem. 1992. V. 267. P. 21459-21464.

136. Harrington J.J., Lieber M.R. The characterization of a mammalian DNA structure specific endonuclease // EMBO J. 1994. V. 13. P. 1235-1246.

137. Liu Y„ Beard W.A., Shock D.D., Prasad R., Hou E.W, Wilson S.H. DNA polymerase p and flap endonuclease 1 enzymatic specificities sustain DNA synthesis for long patch base excision repair//./ Biol. Chem., 2005. V. 280. P. 3665-3674.

138. Horton J.K., Srivastava D.K., Zmudzka B.Z., Wilson S.H. Strategic down-regulation of DNA polymerase beta by antisense RNA sensitizes mammalian cells to specific DNA damaging agents //Nucleic Acids Res. 1995. V. 23. P. 3810-3815.