Динамика клеточных популяций гемоцитов асцидии Halocynthia Purpurea в ответ на тканевое повреждение тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Сухачев, Александр Николаевич

• Сухачев, Александр Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Сухачев, Александр Николаевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Системное положение асцидий и их роль в эволюции иммунитета

1.2. История изучения циркулирующих клеток асцидий

1.3. Характеристика циркулирующих клеток различных популяций асцидии Н.ригригеа

1.4. Типирования гемоцитов асцидий с использованием градиентов плотности и моноклональных антител

1.5. Регенерация и обновление клеток

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Сбор экспериментальных животных

2.2. Иммунологические реагенты

2.3. Получение гемолимфы

2.4. Подсчет числа гемоцитов в гемолитической жидкости

2.5. Культуральная среда

2.6. Фракционирование гемоцитов асцидии Halocynthia purpurea

2.7. Оценка кислородного метаболизма гемоцитов асцидии Halocynthia purpurea

2.8. Оценка влияния лектинов на способность гемоцитов поглощать нейтральный красный

2.9. Определение гемагглютинирующей активности гемолимфы

2.10. Исследование динамики клеточных популяций в ходе репаративных процессов

2.11. Оценка пролиферативной активности гемоцитов с помощью метода проточной цитометрии

2.12. Оценка связывания моноклональных антител к адгезионным молекулам человека с гемоцитами асцидий

2.13. Конфокальная микроскопия

2.14. Количественное определение цитокинов методом иммуноферментного анализа

2.15. Исследование морфологии гемоцитов с помощью световой микроскопии

2.16. Статистические методы

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Морфологическая характеристика гемоцитов асцидии Halocynthia purpurea

3.1.1. Изучение препаратов клеток гемолимфы асцидии Н.ригригеа

3.1.2. Использование метода проточной цитометрии для типирования циркулирующих клеток асцидии Н.ригригеа

3.1.3. Использование метода градиентного центрифугирования для типирования циркулирующих клеток асцидии Н.ригригеа

3.2. Функциональная характеристика гемоцитов асцидии Halocynthia purpurea

3.2.1. Продукция активных форм кислорода

3.2.2. Оценка влияния лектинов растительного и животного происхождения на функциональную активность гемоцитов

3.3. Исследование динамики клеточных популяций асцидии в ответ на повреждения покровов

3.3.1. Изучение динамики клеточных популяций гемоцитов асцидии Н.ригригеа с использованием метода проточной цитометрии

3.3.2. Изучение пролиферативной активности гемоцитов асцидии Н.ригригеа в ответ на повреждение покровов

3.3.3. Оценка экспрессии поверхностных молекул гемоцитами асцидии Н.ригригеа в норме и в ответ на повреждение покровов

3.4. Исследование функциональной активности гемоцитов асцидии в ответ на повреждения покровов

3.4.1. Изучение продукции цитокино-подобных факторов

3.4.2. Изучение способности гемоцитов к синтезу активных форм кислорода в ответ на тканевое повреждение

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Динамика клеточных популяций гемоцитов асцидии Halocynthia Purpurea в ответ на тканевое повреждение»

Актуальность работы. Проблема регенерации уже длительное время является одной из наиболее актуальных проблем клеточной биологии, иммунологии и фундаментальной медицины. Во всем мире идет интенсивное изучение процессов восстановления, что можно объяснить чрезвычайной важностью процессов регенерации для решения многих вопросов теоретической биологии и репаративной медицины [2, 3, 4, 6, 77, 87, 154]. При этом способность к регенерации является универсальным свойством всех живых организмов. Однако степень выраженности этой способности у разных групп очень отличается по механизмам, формам и продолжительности. Несмотря на большую актуальность данной проблемы и масштаб исследований, на сегодняшний день нет единого общепринятого подхода к процессу регенерации, и, что не менее важно, к его регуляции. Тем не менее, благодаря использованию современных методов клеточной и молекулярной биологии, биологии развития, иммуногистохимии, клеточные основы репаративного процесса млекопитающих исследуется довольно быстрыми темпами [2, 3, 4, 88]. В гораздо меньшей степени это пока относится к регуляции репаративных процессов на уровне организма, пока только в общих чертах описано значение нервной и иммунной систем для инициации репаративного процесса [4], а также роль тканеспецифических факторов в ходе репарации. При этом основные исследования направлены на изучение процесса репарации у млекопитающих, обладающих очень сложной системой тканей и многофакторными регуляторными процессами. При этом млекопитающие составляют довольно молодой в филогенетическом плане класс, поэтому его изучение не может в полной мере раскрыть процесс становления механизмов регуляции регенерационных процессов и указать их древние, ключевые, а потому наиболее чувствительные к воздействию точки.

По этой причине представляется актуальным рассмотрение взаимосвязей защитных и репаративных реакций на разных эволюционных уровнях, начиная с самых древних форм, с целью проследить этапы становления комплексной защитно-репаративной реакции, формирование процесса взаимодействия иммунной и репаративной систем в разных таксонах и тем самым взглянуть на проблему в целом. Модель древнейших из ныне живущих низших хордовых животных (асцидии) очень удобна с той точки зрения, что они являются самыми древними из ныне живущих хордовых животных, обладают всеми четыремя классическими типами тканей, обладают циркуляторной системой, выполняющей как транспортные, так и защитно-репаративные функции, и при этом по общей степени сложности и интегративности тканевых систем существенно уступают млекопитающим. При этом асцидии, как все многоклеточные животные, обладают реакциями врожденного иммунитета и активно защищаются от проникновения патогенов во внутреннюю среду. Одновременно эти организмы обладают и системами репарации и регенерации [24, 79, 117]. При этом вопрос о наличии у асцидий механизмов приобретенного иммунитета остается открытым, однако есть основания предполагать наличие некоторых элементов системы приобретенного иммунитета, первые этапы её формирования [145]. Механизмы защитных реакций асцидий имеют много общих черт с реакциями, свойственными большинству беспозвоночных. С другой стороны, некоторые ответные реакции асцидий на введение чужеродных антигенов очень схожи с реакциями врожденного иммунитета позвоночных. Не случайно асцидии являются одним из главных модельных объектов по изучению этапов становления и механизмов аллораспознования, системы распознавания "своё" — "не своё" в целом [60].

Изучение динамики клеточных популяций очень часто включает глубокий анализ системы циркулирующих форменных элементов. На сегодняшний день разные исследователи выделяют от 3 до 9 различных популяций циркулирующих клеток у асцидий, выделенных как правило с помощью классических гистологических и гистохимических методов исследования [70, 104, 105, 120, 133, 135]. Лишь единичные работы предусматривают использование моноклональных антител против поверхностных антигенов и маркеров циркулирующих клеток человека [46, 82]. Тем не менее, единая общепризнанная классификация гемоцитов асцидий, основанная на гистогенетических связях, в настоящее время отсутствует. Неясным остается вопрос о способности циркулирующих клеток асцидий к пролиферации, что важно для понимания процесса становления системы стволовых клеток в высших таксонах позвоночных, механизмов их адгезии и миграции в очаг тканевого повреждения.

Цель работы: изучение динамики клеточных популяций асцидии Halocynthia purpurea в ответ на тканевое повреждение.

Задачи работы:

1. На основании морфологического анализа описать основные популяции гемоцитов H.purpurea, предложить их классификацию и изучить функциональные характеристики;

2. Оценить возможность использования и информативность применения метода проточной цитометрии для типирования неокрашенных циркулирующих клеток асцидий;

3. Исследовать способность циркулирующих гемоцитов к пролиферации в ответ на тканевое повреждение;

4. Изучить динамику клеточных популяций и экспрессии ими поверхностных маркеров в ответ на тканевое повреждение.

Научная новизна. Впервые проведено исследование различных популяций гемоцитов асцидии H.purpurea с применением методов проточной цитометрии и конфокальной микроскопии. Выявлена способность морулярных клеток к автофлуоресценции, что может служить основным критерием оценки относительного содержания клеток данной популяции в гемолимфе. С использованием двух методов оценки впервые показан факт пролиферации циркулирующих клеток асцидий в норме и в ответ на тканевое повреждение. Для исследования циркулирующих клеток беспозвоночных впервые были использованы трехпараметрические гистограммы, что позволило оценить клеточный состав гемолимфы и её отдельных фракций. Впервые была проведена оценка возможности использования моноклональных антител к адгезионным молекулам для типирования гемоцитов в норме и в ответ на тканевое повреждение.

Теоретическая и практическая значимость результатов работы.

Основным научным значением работы является важный теоретический результат, описывающий динамику и кинетику клеточных популяций асцидий в ответ на тканевое повржедение. Полученные результаты свидетельствуют о наличии у низших хордовых циркулирующих клеток-предшественников, способных к пролиферации и дифференцировке в различные морфотипы гемоцитов асцидий. Полученные новые данные о морфологии гемоцитов асцидий и экспрессии их поверхностных маркеров, обладающих антигенным перекрестом с ключевыми адгезионными молекулами стволовых клеток млекопитающих. Существенным теоретическим и практическим результатом является адаптация метода проточной цитометрии для изучения циркулирующих клеток беспозвоночных без использования моноклональных антител.

Полученные результаты найдут применение в фундаментальных сравнительно-гистологических и сравнительно-иммунологических исследованиях, в биологии стволовых клеток, в лекционных курсах по общей и сравнительной иммунологии, сравнительной гистологии и другим дисциплинам. Методические разработки могут быть использованы для изучения защитных реакций различных таксонов беспозвоночных и позвоночных животных.

Положения, выносимые на защиту.

1. Определены основные популяции циркулирующих клеток асцидии Н.ригригеа.

2. Циркулирующие гемоциты асцидии способны к пролиферации и отвечают повышением её уровня на тканевое повреждение.

3. Функциональная активность циркулирующих клеток асцидий (способность к эндоцитозу, продукции активных форм кислорода, синтезу цитокино-подобных факторов) меняется в ответ на тканевое повреждение.

4. Моноклональные антитела к адгезионным молекулам человека связываются с перекрестно-реагирующими детерминантами гемоцитов асцидий; уровень связывания меняется в ответ на травму.

Реализация работы. Результаты работы легли в основу 6 полноформатных статей и 12 тезисов докладов.

Личный вклад в проведенное исследование. Личный вклад автора в выполненную работу включал самостоятельное проведение большинства исследований, разработку и адаптацию ряда методов исследования, а также интерпретацию полученных результатов. Вклад соавторов ограничивался помощью в постановке и освоению новых методов исследования, технической поддержке при работе с аппаратурой и предоставлением в распоряжение автора ряда реактивов.

Апробация работы. Основные положения работы доложены и обсуждены на Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), Всероссийской конференции с международным участием «Водные и наземные экосистемы: проблемы и перспективы исследований» (Вологда, 2008), Всероссийской симпозиуме по биологии клетки в культуре на тему "Культивируемые клетки как основа клеточных технологий" (Санкт-Петербург, 2009), Международной научной конференции "Молодь -медицин! майбутнього" (Одесса, 2010), совместном заседании отделов иммунологии и общей и частной морфологии НИИЭМ СЗО РАМН (Санкт-Петербург, 2011).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 149 страницах текста и состоит из обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения собственных результатов, их обсуждения и выводов. Работы проиллюстрированы 47 рисунками и фотографиями и 10 таблицами. Библиографический указатель содержит 154 работы, в том числе 20 работ отечественных авторов и 134 - зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Сухачев, Александр Николаевич

выводы

1. Циркулирующие гемоциты асцидии Halocynthia purpurea включают 5 основных популяций клеток: лимфоцитоподобные гемобласты; гиалиновые амебоциты, содержащие минимальное число гранул при окрашивании по Маллори; крупные макрофагоподобные клетки, способные к фагоцитозу и содержащие гранулы; гранулоциты, содержащие многочисленные гранулы; морулярные клетки, содержащие крупные, заполненные плотным содержимым вакуоли.

2. Использование метода проточной цитометрии обеспечивает разделение основных популяций циркулирующих клеток асцидии Halocynthia purpurea: морулярных клеток, гранулоцитов, макрофагоподобных клеток и общей популяции гиалиновых амебоцитов и гемобластов. Установлена автофлуоресценция морулярных клеток.

3. Гемоциты асцидии Halocynthia purpurea способны к спонтанной и фагоцитоз-индуцированной продукции активных форм кислорода, поглощению красителя нейтральный красный, изменению уровня экспрессии мембранных рецепторов в ответ на тканевое повреждение и секреции молекул, обладающих антигенным перекрестом с TNFa, IFNy и IL-10 человека. Растворимые бактериальные липополисахариды не изменяют уровня кислородного метаболизма. Установлена необходимость кооперации клеток для повышения уровня продукции активных форм кислорода.

4. По результатам иммунохимического анализа с гемоцитами асцидии Halocynthia purpurea связываются моноклональные антитела к CD29, CD34, CD54, CD62P, CD90, CD117 человека. Не обнаружено взаимодействия с антителами к CD 15, CD62L, CD94 и CD 166.

5. С использованием метода проточной цитометрии показано, что у интактных животных менее 4% циркулирующих гемоцитов асцидии Halocynthia purpurea находились в синтетической фазе клеточного цикла, в то время как через 24 ч после тканевого повреждения их доля возрастала в 3 раза, а через 48 ч — в 5 раз.

6. Тканевое повреждение вызывает через 24 ч изменения состава циркулирующих гемоцитов асцидии Halocynthia purpurea, уровня экспрессии их поверхностных маркеров.

135

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Сухачев, Александр Николаевич, 2011 год

1. Ахмадиева A.B., Шукалюк А.И., Александрова Я.Н., Исаева В.В. Стволовые клетки в бесполом размножении колониальной ацидии Botryllus tuberatus (Tunicata: Ascidiacea) // Биология моря 2007. - Т.ЗЗ., №3. - С. 217222.

2. Бабаева А.Г. Иммунологические механизмы регуляции восстановительных процессов // М. Медицина 1972. - 200 с.

3. Бабаева А.Г. Клеточные основы регенерации у млекопитающих // М. Наука 1984.-216 с.

4. Бабаева А.Г. Регенерация и система иммуногенеза // М. Медицина 1985 - 256 с.

5. Биология стволовых клеток и клеточные технологии // Под общ. ред. М.А.Пальцева. М.: ОАО Издательство "Медицина", издательство "Шико". - Т. 1. - 2009. - 272 с.

6. Горышина E.H., Чага О.Ю. Сравнительная гистология тканей внутренней среды с основами иммунологии // М. Изд-во Ленингр. Ун-та, -1990-320 с.

7. Егоров А. М., Осипов А. П., Дзантиев Б. Б., Гаврилова Е.М. Теория и практика иммуноферментного анализа // Москва: Высшая школа -1991

8. Заварзин A.A. Очерки эволюционной гистологии крови и соединительной ткани. Избр. труды // М.; Л.: Изд-во АН СССР.- 1953.- Т.4.-720 с.

9. Иванова-Казас О.М. Кровь и соединительная ткань асцидии Dendrodoa grossularia // сб. памяти акад. A.A. Заварзина изд. АН СССР -1948.-С. 163-173.

10. Лакин Г.Ф. Биометрия // М. Высшая школа 1990. - 352 с.

11. Лилли Р. Патологическая техника и практическая гистохимия /под редакцией Г.Н. Гостеева. М.:Мир, 1969. 648 с.

12. Пирс Э. Гистохимия /под редакцией Д.А. Сонкин, Н.А. Райская. М.: Ин.Литература, 1962. 964 с.

13. Полевщиков А.В., Киселева Е.П. Метод автоматизированного учета НСТ-теста // Клин. лаб. диагностика.-1994.- №4,- С.27-29.

14. Саркисов Д. С. Регенерация и ее клиническое значение, М.¡Медицина, 1970.- 428 с.

15. Сибиряк С.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Черешнев В.А. Оценка апоптоза в иммунологических исследованиях: Краткое методическое руководство: Екатеринбург, 2008. 60 с.

16. Фримель Г. Иммунологические методы. М. Медицина, 1987 — 472с.

17. Чага О.Ю. Клетки крови асцидии Styela (Goniocarpa) rustica. I. Гистологический анализ // Цитология. 1998. - Т. 40, №1. - С. 31-44.

18. Чага О.Ю. Клетки крови асцидии Styela (Goniocarpa) rustica. IT. Цитохимический анализ// Цитология. 1998. - Т. 40, №1. - С. 45-57.

19. Чага О.Ю. Морфология и гистохимия клеток крови асцидии Molgula citrina II Цитология. 1980. - Т. 22, №3. - с. 287-295.

20. Шапошникова Т.Г., Чага О.Ю. Исследование структуры митотического цикла гемоцитобластов у асцидии Molgula citrina II Цитология. 1984. - Т. 26, №10. - С. 1119-1123.

21. Abe Y., Tokuda М., Ishimoto R., Azumi К., Yokosawa H. A unique primary structure, cDNA cloning and function of a galactose-specific lectin from ascidian plasma // Eur. J. Biochem. 1999. - Vol. 261, №1. - P. 33.

22. Akita N., Hoshi M., Hemocytes Release Phenoloxidase upon Contact Reaction, an Allogeneic Interaction, in the Ascidian Halocynthia roretzi // Cell structure and function 1995.- Vol. 20, №1.- P.81-87.

23. Arizza V., Parrinello N., Schimmenti S. In vitro release of lectins by Phallusia mamilata hemocytes 11 Dev. Comp.Immunol. 1991.- Vol.15, № 4. -P.219-226.

24. Auger H., Sasakura Y., Joly J.S., Jeffery W.R. Regeneration of oral siphon pigment organs in the ascidian Ciona intestinalis II Dev. Biol. — 2010. — Vol. 339, №2.-P. 374-389.

25. Azumi K., Kuribayashi F., Kanegasaki S., Yokosawa H. Zymosan induces production of superoxide anions by hemocytes of the solitary ascidian Halocynthia roretzill Comp. Biochem. Physiol. C. Toxicol. Pharmacol. 2002. -Vol. 133, №4. - P. 567-574.

26. Azumi K., Yokosawa H., Ishii S. Lipopolysaccharide induces release of a metallo-protease from hemocytes of the ascidian Halocynthia roretzi II Dev. Comp. Immunol. 1991. - Vol. 15, № 1-2. - P. 1-7.

27. Bailarín L, Cima F, Sabbadin A. Morula cells and histoincompatibility in the colonial ascidian Botryllus schlössen // Zool. Sei. -1995. Vol. 12. - P. 757764.

28. Bailarín L., Cima F. Cytochemical properties of Botryllus schlössen haemocytes: indications for morpho-functional characterisation // Eur. J. Histochem. 2005. - P. 255-264.

29. Bailarín L., Cima F., Sabbadin A. Calcium homeostasis and yeast phagocytosis in hemocytes of the colonial ascidian Botryllus schlosseri/IComp. Biochem. Physiol. A. Physiol. 1997. - Vol. 118, №1. - P.153-158.

30. Bailarín L., Cima F., Sabbadin A. Phagocytosis in the colonial ascidian Botryllus schlossery II Dev. Comp. Immunol. 1994. - Vol. 18. - P.467-481.

31. Ballarin L., Cima F., Sabbadin A. Phenoloxidase and cytotoxicity in the compound ascidian Botryllus schlosserill Dev. Comp. Immunol. 1998. - Vol. 22. - P. 479^92.

32. Ballarin L., Franchini A., Ottaviani E., Sabbadin A. Morula Cells as the Major Immunomodulatory Hemocytes in Ascidians: evidences From the Colonial Species Botryllus schlosserill Biol. Bull. 2001. - Vol. 201. - P.59-64.

33. Ballarin L., Menin A. Franchi N., Bertoloni G., Cima F., Morula cells and non-self recognition in the compound ascidian Botryllus schlosseri II ISJ -2005.-Vol. 2. P. 1-5

34. Bollner T., Beesley P.W., Thorndyke M.C. Substance P- and cholecytokinin-like immunoreactivity during post-metamorphic development of the central nervous system in the ascidian Ciona intestinalis II Cell Tissue Res. -1993. Vol. 272. - P. 545-552.

35. Bollner T., Howalt S., Thorndyke M.C., Beesley P.W. Regeneration and post-metamorphic development of the central nervous system in the protochordate Ciona intestinalis: A study with monoclonal antibodies // Cell Tissue Res. 1995.-Vol. 279.-P. 421^132.

36. Borenfreund E., Puerner J.A. Toxicity determined in vitro by morphological alterations and neutral red absorption // Toxicol. Lett. 1984-Vol. 24.-P. 119-124.

37. Brockes J.P. Amphibian limb regeneration: Rebuilding a complex structure // Science 1997. - Vol. 276. - P. 81-87.

38. Brown F.D., Keeling E.L., Le A.N., Swalla BJ. Whole body regeneration in a colonial ascidian, Botrylloides Violaceus II J. Of Exper. Zoology. 2009. - V. 312B. - P.885-900.

39. Burighel P., Cloney R.A. Urochordata: ascidiacea. In: Harrison R, Ruppert E, editors. Microscopic anatomy of invertebrates: hemichordata, chaetognatha and the invertebrate chordates // New York: Wiley. 1997. - P. 221347.

40. Cammarata M., Arizza V., Parrinello N. et al. Phenoloxidase-dependent cytotoxic mechanism in ascidian (Styela plicata) hemocytes active against erythrocytes and K562 tumor cells// Eur. J. Cell. Biol. 1997. - Vol. 74, №3. - P. 302-307.

41. Cammarata M., Parrinello N., Arizza V. Gradient density separated Phullusiu mumilluta hemocytes: lectin release in microculture // J. Ex. Zoo. — 1993. Vol. 266. - P. 319-327.

42. Candia Carnevali M.D. Regeneration in echinoderms: repair, regrowth, cloning // 1SJ. 2006. - Vol. 3. - P. 64-76.

43. Cima F., Ballarin L., Gasparini F., Burighel P. External amebocytes guard the pharynx entry in a tunicate (Ascidiacea) // Dev. Comp. Immunology -2006. Vol. 30. - P.463^72.

44. Cima F., Perin A., Burighel P., Ballarin L., Morpho-functional characterization of haemocytes of the compound ascidian Botrylloid.es leachi (Tunicata, Ascidiacea) // Acta. Zool. 2001. - Vol.82. - P. 261-274.

45. Cima F., Sabbadin A., Ballarin L., Cellular aspects of al Precognition in the compound ascidian Botryllus schlosseri II Dev. Comp. Immunology 2004. -Vol. 28.-P. 881-889.

46. Cooper D., Barondes S. God must love galectins; He made so many of them // Glycobiology. 1999. - Vol. 9. - P. 979-984.

47. Coteur G., Warnau M., Jangoux M., Dubois P. Reactive oxygen species (ROS) production by amoebocytes of Asterias rubens (Echinodermata) // Fish and Shellfish Immunology 2002.- Vol.12, №3.- P.187-200.

48. Dan-Sohkawa M., Morimoto M., Kaneko H. In vitro reactions of coelomocytes against sheep red blood cells in the solitary ascidian Halocynthia roretzill Zool. Sci. 1995. - Vol.12, №4. - P. 411-417.

49. Davidson B., Swalla B.J. A molecular analysis of ascidian metamorphosis reveals activation of an innate immune response // Development. -2002. Vol. 129, №20. - P. 4739-4751.

50. De Leo G., Parrinello N., Parrinello D. Encapsulation response of Ciona intestinalis (Ascidiacea) to intratunical erythrocyte injection. II. The outermost inflamed area // J. Invertebr. Pathol. 1997. - Vol. 69. - P. 14-23.

51. Dehal P., Satou Y., Campbell R., Chapman J., Degnan B., De Tommaso A. The draft genome of Ciona intestinalis: insights into chordate and vertebrate origins // Science. 2002. - Vol. 298. - P. 2157-2167.

52. Dent J.N. Limb regeneration in larvae and metamorphosing individuals of the South African clawed toad // J Morphol. 1962. - Vol. 110. - P. 61-77.

53. Drickamer K. Two distinct classes of carbohydrate-recognition domains in animal lectins// J. Biol. Chem. 1988. - Vol. 263, №20. - P. 9557-9560.

54. Echeverri K., Tanaka E.M. Proximodistal patterning during limb regeneration // Dev Biol. 2005. - Vol. 279. - P. 391-401.

55. Feizi T. Carbohydrate-mediated recognition systems in innate immunity // Immunol. Rev. -2000. Vol. 173. - P. 79-88.

56. Frizzo A., Guidolin L., Ballarin L., Sabbadin A. Purification and partial charaterization of phenoloxidase from the colonial ascidian Botryllus schlosseri II Mar. Biol. 1999. -Vol.135.- P. 483-488.

57. Fuke M. Cell types involved in allogeneic contact reactions of the solitary ascidian, Halocynthia roretzi // Zool. Sci. 2001. - Vol.18. - P. 195-205.

58. Fuke M., Fukumoto M. Correlative fine structural, behavioral and histochemical analisys of ascidian blood cells // Acta Zool. 1993. - Vol. 74. - P. 61-71.

59. Fuke M.T. "Contact reaction" between xenogeneic or allgeneic coelomic cells of solitary ascidians //Biol. Bull. 1980. - Vol. 158. - P. 304-315.

60. Fuke M.T. Studies on the coelomic cells of some Japanese ascidians// Bull. Mar. Biol. St. Asamushi Tohoku Univ. 1979. - Vol. 16. - P. 143-159.

61. Hahn U.K., Bender R.C., Bayne C.J. Production of reactive oxygen species by hemocytes of Biomphalaria glabrata: carbohydrate-specific stimulation //Dev. Comp. Immunol. 2000.- Vol.24.- P.531-541.

62. Hall P. A., Watt F. M. Stem cells: the generation and maintenance of cellular diversity // Development 1989. - Vol. 106. - P. 619-633.

63. Hauton C., Smith V.J. In vitro cytotoxicity of crustacean immunostimulants for lobster (Homarus gammarus) granulocytes demonstrated using the neutral red uptake assay // Fish Shellfish Immunol. 2004 - Vol. 17-P.65-73.

64. Hirose E, Shirae M, Saito Y.Colony specificity in the xenogeneic combinations among four Botrylloides species (urochordata, ascidiacea) // Zoolog Sci. 2002. - Vol.19, №7. - P. 747-53.

65. Hirose E., Saito Y., Watanabe H. Generation of the tunic cuticle in the compound ascidian Botrylloides simodensisll Dev. Comp. Immunol. 1995. - Vol. 19, №2.-P. 143-151.

66. Hirose E., Saito Y., Watanabe H. Subcuticular rejection: An advanced mode of the allogeneic rejection in the compound ascidians, Botryllus sigmodensis and B. fuscusll Biol. Bull. 1997. - Vol. 192. - P. 53-61.

67. Hirose E., Shirae M., Saito Y. Ultrastructures and classification of circulating hemocytes in 9 Botryllid ascidians (Chordata: Ascidiacea) // Zool. Science 2003. - Vol. 20. - P.647-656

68. Hirose E., Yoshida T., Akiyama T., Ito S., Iwanami Y., Pigment cells representing polychromatic colony color in Botrylloides simodensis (Ascidiacea, Urochordata): cell morphology and pigment substances // Zool. Sci. -1998. Vol. 15.-P. 489-497.

69. Hori H., Osawa S. Origin and evolution of organisms as deduced from 5S ribosomal RNA sequences // Mol. Biol. Evol. -1987. Vol. 5. - P. 445-472.

70. Hyslop L.A., Armstrong L., Stojkovic M., Lako M. Human embryonic stem cells: biology and clinical implications // Expert Rev. Mol. Med. 2005. -Vol. 7.-P. 1-21.

71. Iten L.E., Bryant S.V. Stages of tail regeneration in the adult newt, Notophtalmus viridescens IIJ Exp Zool. 1976. - Vol. 196. - P. 283-292.

72. Iwanaga S., Lee B.L., Recent advances in the innate immunity of invertebrate animals // J. Biochem. and Molec. Biol. 2005. - Vol. 38, №2. -P.128-150

73. Karalaki M., Fili S., Philippou A, Koutsilieris M. Muscle regeneration: cellular and molecular events // In Vivo. 2009. - Vol. 23, №5. -P.779-796.

74. Kawamura K., Sugino Y. M. Cell adhesion in the process of asexual reproduction of tunicates // Microsc. Res. Tech. 1999. - Vol. 44. - P. 269-278.

75. Kawamura K., Sunanaga T. Hemoblasts in colonial tunicates: are they stem cells or tissue-restricted progenitor cells? // Dev. Growth Differ. — 2010. -Vol. 52, №1.-P. 69-76.

76. Kawamura K., Tachibana M., Sunanaga T. Cell proliferation dynamics of somatic and germ line tissues during zooidal life span in the colonial tunicate Botryllus primigenus II Dev. Dyn. 2008. - Vol. 237. - P. 1812-1825.

77. Kelly K.L., Cooper E.L., Rafitos D.A. A humoral opsonin from the solitary urochordate Styela clava I I Dev. Comp. Immunol. -1993. Vol. 17, №1. -P. 29-39.

78. Khalturin K., Becker M., Rinkevich B., Bosch T.C. Urochordates and the origin of natural killer cells: identification of a CD94/NKRP1- related receptor in blood cells of Botryllus II Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2003. - Vol. 100, №2. - P. 622-627.

79. Kustin K .D.S. Levine, G.C. McLeod, W.A. Curby The blood of ascidia nigra: blood cell frequency distribution, morphology, and the distributionand valence of vanadium in living blood cells 11 Biol. Bull. 1976. — Vol. 150. - P. 426-441.

80. Laird D.J., De Tomaso A.W. Predatory stem cells in the non-zebrafish chordate, Botryllus schlossert II Zebrafish. 2005. - Vol. 1, № 4. - P.357-361.

81. Laird D.J., De Tomaso A.W., Weissman I.L. Stem cells are units of natural selection in a colonial ascidian // Cell 2005. - V. 123. - P. 1351-1630.

82. Lajtha L. G. Stem cell concepts // Differentiation 1979. - Vol. 14. -P. 23-34.

83. Lipari, L., Cammarate, M., Arizza, V., Parrinello, D. Citotoxic activity of Styela plicata hemocytes agaist mammalian cell targets: I Properties of the in vitro reaction agaist erythrocytes // Anim. Biol. 1995. - Vol. 4. - P. 131-137.

84. Mochii M., Taniguchi Y., Shikata I. Tail regeneration in the Xenopus tadpole II Dev Growth Diff. 2007. - Vol. 49. - P. 155-161.

85. Mochizuki K., Nishimiya-Fujisawa C., Fujisawa, T. Universal occurrence of the vasa-related genes among metazoans and their germ line expression in Hydra // Dev. Genes. Evol. 2001. - Vol. 211. - P.299-308.

86. Mochizuki K., Sano H., Kobayashi S., Nishimiya-Fujisawa, C., Fujisawa, T. Expression and evolutionary conservation of nanos-related genes in Hydra // Dev. Genes. Evol. 2000. - Vol. 210. - P. 591-602.

87. Morgan T.H. Experimental studies of the regeneration of Planaria maculate II Arch Entw Mech Org. 1898. - Vol. 7. - P. 364-397.

88. Morgan T.H. Regeneration. The Macmillan Company, New York1901.

89. Nonaka M., Azumi K., Ji X. Opsonic complement component C3 in the solitary ascidian, Halocynthia roretzill J. Immunol. 1999. - Vol. 162. - P.387-391.

90. Ohtake S., Abe T., Shishikura F., Tanaka K. The phagocytes in hemolymph of Halocynthia roretzi and their phagocytic activity// Zool. Sei. -1994. Vol. 11, №5. - P. 681-691.

91. Oka H., Watanabe H. Vascular budding, a new type of budding in Botryllus II Biol. Bull. 1957. - Vol. 112. - P. 225-240.

92. Pancer Z., Gershon H., Rinkevich B. Coexistence and possible parasitism of somatic and germ cell lines in chimeras of the colonial urochordate Botryllus schlössen II Biol. Bull. 1995. - Vol. 189. - P. 106-112.

93. Parinello N., Arizza V., Cammarata M., Parinello D.M. Cytotoxic activity of Ciona intestinalis (Tunicata) hemocytes: properties of the in vitro reaction against erythrocyte targets// Dev. Comp. Immunol. 1993. - Vol.17, №3. -P. 19-27.

94. Parinello N., Cammarata M., Arizza V. Univacuolar refractile hemocytes from the tunicate Ciona intestinalis are cytotoxic for mammalian erythrocytes in vitroll Biol. Bull. 1996. - Vol.190, № 3. - P.418-425.

95. Parinello N., Cammarata M., Lipari L., Arizza V. Sphingomyelin inhibition of Ciona intestinalis (Tunicata) cytotoxic hemocytes assayed against sheep erythrocytes // Dev. Comp. Immunol. 1995. - Vol. 19, №1. - P. 31-41.

96. Parinello N., Patricolo E., Canicatti C. Inflammatory-like reactions in the tunic of Ciona intestinalis (Tunicata). I Encapsulation and tissue injury// Biol. Bull. 1984. - Vol.167. - P.229-273.

97. Parrinello N. Cytotoxic activity of tunicate hemocytes // Prog. Mol. Subcell Biol.-1996.-Vol. 15.-P. 190-217.

98. Parrinello N., Arizza V., Chinnici C., Parrinello D., Cammarata M., Phenoloxidases in ascidian hemocytes: characterization of the prophenoloxidase activating system // Comp. Biochem. Physiol. 2003 - Vol. B, №135. - P.583-591

99. Parrinello N., Patricolo E. Erythrocyte agglutinins in the blood of certain ascidians //Experientia. -1975. Vol. 31. - P. 1092-1093.

100. Peddie C.M., Smith V.J. In vitro spontaneous cytotoxic activity against mammalian target cells by hemocytes of the solitary ascidian, Ciona intestinalis!7 J. Exp. Zool. 1993. - Vol.267. - P.616-623

101. Pinto M.R., Chinnici C.M., Kimura Y., Melillo D., Marino R., Spruce L.A., et al. CiC3-la mediated Chemotaxis in the deuterostome invertebrate Ciona intestinalis (Urochordata) // J. Immunol. 2003. Vol. 171. - P. 5521-5528.,

102. Poget S. F., Legge G. B., Proctor M. R. et al. The structure of tunicate C-type lectin from Polyandrocarpa misakiensis compexed with D-galactose// J. Mol. Biol. 1999. - Vol.290. - P.867-879.

103. Quesenberry M., Ahmed H., Marsh A., Vasta G.R. A fucose-binding lectin from Clavelina picta contains carbohydrate-recognition domains homologous to vertebrate serum mannose-binding proteins// Dev. Comp. Immunol. 1997. - Vol. 21. - P. 88.

104. Rafitos D.A., Fabbro M., Nair S.V. Exocytosis of a complement component C3-like protein by tunicate hemocytes// Dev. Comp. Immunol. 2004. -Vol. 28.-P. 181-190.

105. Raftos D.A., Hutchinson A. Cytotoxity reactions in the solitary tunicate Styelaplicata/IDev. Comp. Immunol. 1995. - Vol.19, № 6. - P. 463-471.

106. Raftos D.A., Stillman D.L., Cooper E.L. Chemotactic responses of tunicate (Urochordata, Ascidiacea) hemocytes in vitro II J. Invertebr. Pathol. -1998.-Vol. 72.-P. 44-49.

107. Ramalingam K., Ravindranath M. Histochemical significance of green metachromasia to toluidine blue // Histochemie. 1970. - Vol. 24. - P. 322-327.

108. Rinkevich B. Aspects of the incompatibility nature in botryllid ascidians // Anim. Biol. 1992. - Vol. 1. - P. 17-28.

109. Rinkevich Y., Rosner A., Rabinowitz C., Lapidot Z., Moiseeva E. , Rinkevich B. Piwi positive cells that line the vasculature epithelium, underlie whole body regeneration in a basal chordate // Dev. Biol. 2010. - Vol. 345, № 1. P. 94-104.

110. Rinkevich, Y., Paz, G., Rinkevich, B., Reshef, R. Systemic bud induction and retinoic acid signaling underlie whole body regeneration in the urochordate Botrylloides leachi II PLoS Biol. — 2007. Vol. 5. - e71.

111. Robinson W.E., Acxjdelo M.I., Kustin K. Tunichrome content in the blood cells of the tunicate, ascidla callo& stimpson, as an indicator of vanadium distribution II Camp. Biochem. Physiol. 1984. - Vol. 78A. - № 4. - P. 667-673.

112. Rowley A.F. The blood cells of the sea squirt, Ciona intestinalis: morphology, differential counts and in vitro phagocytosis activity// J. Invertebr. Pathol. 1981. -Vol. 37. -P. 91-100.

113. Rowley, A. F. Ultrastructural and cytochemical studies on the blood cells of the sea squirt, Ciona intestinalis. I. Stem cells and amoebocytes. // Cell Tissue Res. 1982,- Vol. 223. - P.403-414.

114. Rychel A.L., Swalla B.J. Anterior regeneration in the hemichordate Ptychodera flava II Dev Dyn. 2008. - Vol. 237. - P. 3222-3232.

115. Saito Y., Hirose E., Watanabe H. Colony specificity in botryllid ascidians // Int. J Dev. Biol. 1994. - Vol. 38. - P. 237-247.

116. Sánchez Alvarado A. Regeneration in the metazoans: Why does it happen? // Bioessays 2000. - Vol. 22. - P. 578-590.

117. Sasaki N., Ogasawara M., Sekiguchi T., Kusumoto S., Satake H. Tolllike Receptors of the Ascidian Ciona intestinalis II J. of biol. chemestry — 2009. -Vol. 284, № 40. P. 27336-27343.

118. Sawada T., Fujikura Y., Tomonaga S., Fukumoto T. Classification and characterization of ten types of hemocytes in the tunicate Halocynthia roretzill Zool. Sci. 1991. - Vol. 8, № 5. - P. 939-950.

119. Sawada T., Zhang J., Cooper E.L. Classification and characterization of hemocytes in Styela clavall Biol. Bull. 1993. - Vol. 184. - P. 87-96.

120. Scofield V.L., Schlumpberger J.M., West L.A., Weismann I.L. Protochordate allorecognition is controlled by a MHC-like gene system// Nature. -1982. Vol. 295, № 5849. - P. 499-502.

121. Sharon N, Lis H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules // Glycobiology. 2004. - Vol. 14. - P. 53-62.

122. Shibata N., Umesono Y., Orii H., Sakurai T., Watanabe K., Agata K. Expression of vasa (vas)-related genes in germ line cells and totipotent somatic stem cells of planarians // Dev. Biol. 1999. - V. 206. - P.73-87.

123. Shimizu-Nishikawa K., Takahashi J., Nishikawa A. Intercalary and supernumerary regeneration in the limbs of the frog, Xenopus laevis II Dev Dyn. -2003. Vol. 227. - P. 563-572.

124. Shirae M., Saito Y., A Comparison of Hemocytes and Their Phenoloxidase Activity among Botryllid Ascidians II Zool. Science. 2000. -Vol.17.-P. 881-891.

125. Smith M. J. The blood cells and tunic of the ascidian Halocynthia aurantium (Pallas). I. Hematology, tunic morphology, and partition of cells between blood and tunic// Biol. Bull. 1970. - Vol. 138. - P. 354-378.

126. Sasaki N., Ogasawara M., Sekiguchi T., Kusumoto S., Satake H. Tolllike Receptors of the Ascidian Ciona intestinalis II J. of biol. chemestry — 2009. -Vol. 284, № 40. P. 27336-27343.

127. Sawada T., Fujikura Y., Tomonaga S., Fukumoto T. Classification and characterization of ten types of hemocytes in the tunicate Halocynthia roretzW Zool. Sci. 1991. - Vol. 8, № 5. - P. 939-950.

128. Sawada T., Zhang J., Cooper E.L. Classification and characterization of hemocytes in Styela clavall Biol. Bull. 1993. - Vol. 184. - P. 87-96.

129. Scofield V.L., Schlumpberger J.M., West L.A., Weismann I.L. Protochordate allorecognition is controlled by a MHC-like gene system// Nature. -1982. Vol. 295, № 5849. - P. 499-502.

130. Sharon N, Lis H. History of lectins: from hemagglutinins to biological recognition molecules // Glycobiology. 2004. - Vol. 14. - P. 53-62. 1

131. Shibata N., Umesono Y., Orii H., Sakurai T., Watanabe K., Agata K. Expression of vasa (vas)-related genes in germ line cells and totipotent somatic stem cells of planarians // Dev. Biol. 1999. - V. 206. - P.73-87.

132. Shimizu-Nishikawa K., Takahashi J., Nishikawa A. Intercalary and supernumerary regeneration in the limbs of the frog, Xenopus laevis II Dev Dyn. -2003. Vol. 227. - P. 563-572.

133. Shirae M., Saito Y., A Comparison of Hemocytes and Their Phenoloxidase Activity among Botryllid Ascidians II Zool. Science. 2000. -Vol.17.-P. 881-891.

134. Smith M. J. The blood cells and tunic of the ascidian Halocynthia aurantium (Pallas). I. Hematology, tunic morphology, and partition of cells between blood and tunic// Biol. Bull. 1970. - Vol. 138. - P. 354-378.

135. Smith V.J., Peddie C. M., Cell Cooperation During Host Defense in the Solitary Tunicate Ciona intestinalis (L) // Biol. Bull.- 1992.-Vol. 183. P.211-219

136. Smith V. J., Soderhall K., A comparison of phenoloxidase activity in the blood of marine invertebrates // Dev. Comp. Immunol. 1991. - Vol. 15. - P. 251-261.

137. Stoick-Cooper C.L., Weidinger G., Riehle K.J., Hubbert C., Major M.B., Fausto N., Moon R.T. Distinct Wnt signaling pathways have opposing roles in appendage regeneration // Development 2007. - Vol. 134. - P. 479-489.

138. Stoner D., Weissman I. L. Somatic and germ cell parasitism in a colonial ascidian: possible role for a highly polymorphic allorecognition system // Proc. Natl. Acad. Sci. 1996. - Vol. 93. P. 15254-15259.

139. Stuermer C., Langhorst M., Wiechers M., Legler D., Hannbeck von Hanwehr S., Guse A., Plattner H. PrPc capping in T cells promotes its association with the lipid raft proteins reggie-1 and reggie-2 and leads to signal transduction // FASEB J. 2004.

140. Sunanaga T., Saito Y., Kawamura K. 2006. Postembryonic epigenesis of Vasa-positive germ cells from aggregated hemoblasts in the colonial ascidian, Botryllus primigenus // Dev Growth Differ. 2006. - Vol. 48. - P. 87-100.

141. Suzuki T., Takagi T., Furukohri M. Et al. A calcium-dependent, galactose-binding lectin from the tunicate Polyandrocarpa misakiensisll J. Biol. Chem. 1990. - Vol. 265. - P. 1274-1281.

142. Taneda Y, Saito Y and Watanabe H. Self or non-self discrimination in ascidians // Zool Science. 1985. - Vol.2. - P. 433-442.

143. Thorndyke M.C., Chen W.C., Beesley P.W., Patruno M. Molecular approach to echinoderm regeneration // Microsc Res Tech. 2001. - Vol. 55. - P. 474-485.

144. Tiozzo S., Brown F.D., De Tomaso A.W. Regeneration and stem cells in ascidians. In: Bosch TCG, editor. Stem cells from hydra to man // Dordrecht, Netherlands 2008. - P. 95-112.

145. Tomaso A., Anthony De Tomaso: Finding the origins of adaptive immunity // JEM 2008. - Vol. 205, № 2 - P. 264-265

146. Tomaso A.W., Nyholm S.V., Palmeri K.J., Ishizuka K.J., Ludington W.B., Mitchel K., Weissman I.L. Isolation and characterization of a protochordate histocompatibility locus // Nature 2005 - Vol. 438 № 7067. - P. 454-459.

147. Weissman I.L. Stem Cells: Units of development, units of regeneration, and units in evolution // Cell 2000. - Vol. 100. - P. 157-168.

148. Wong M.D., Jin Z., Xie T. Molecular mechanisms of germline stem cell regulation // Annu Rev Genet. 2005. - Vol. 39. - P. 173-195.

149. Wright R., Urochordates. In "Invertebrate blood cells, Vol.2" Ed by NA Ratcliffe, AF Rowley, // Academic press, New York. 1981. - P. 565-626

150. Wright R.K. Protochordate immunity. I. Primary immune response of the tunicate Ciona intestinalis to vertebrate erythrocytes // J. Invertebr. Pathol. -1974.-Vol. 24.-P. 29-36.

151. Wright R.K., Cooper E.L. Protochordate immunity II. Diverse hemolymph lectins in the solitaru tunicate Styela clavall Comp. Biochem. Physiol. B. - 1984. - Vol. 79, № 2. - P. 269-277.

152. Yokoyama H., Ogino H., Stoick-Cooper C.L., Grainger R.M., Moon R.T. Wnt/beta-catenin signaling has an essential role in the initiation of limb regeneration // Dev Biol. 2007. - Vol. 306. - P. 170-178.

153. Yun Y.R., Won J.E., Jeon E., Lee S., Kang W., Jo H., Jang J.H., Shin U.S., Kim H.W. Fibroblast growth factors: biology, function, and application for tissue regeneration // Tissue Eng. 2010. - P. 218142.