Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.10, кандидат наук Воронкова Анастасия Сергеевна

• Воронкова Анастасия Сергеевна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Воронкова Анастасия Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Структура и функции митохондрий

1.2. Митохондриальная биоэнергетика

1.3. Окислительное фосфорилирование и электрон-транспортная цепь митохондрий

1.4. Генерация активных форм кислорода

1.5. Митохондриальная ДНК

1.6. Эволюционная значимость мтДНК

1.7. Гаплогруппы мтДНК

1.8. Этиология заболеваний энергообмена

1.9. Первичные митохондриальные заболевания

1.9.1. Митохондриальные энцефаломиопатии

1.9.2. Вторичные митохондриальные заболевания

1.9.3. Гипоксия в патогенезе митохондриальных заболеваний

1.10. Существующий диагностический комплекс

1.10.1. Морфологические критерии

1.10.2. Молекулярно-генетические критерии

1.11. Функциональная оценка митохондриальных нарушений

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Секвенирование митохондриальной ДНК

2.1.1 Дизайн праймеров

2.1.2. Сбор биоматериала и выделение ДНК

2.1.3. Амплификация ДНК-фрагментов и оценка их качества

2.1.4. Реакция секвенирования

2.1.5. Разделение продуктов секвенирования с помощью капиллярного электрофореза

2.1.6. Анализ результатов секвенирования

2.1.6.1. Первичная обработка данных

2.1.6.2. Аннотация генетических вариантов мтДНК 38 2.1.6.3 Ресурсы, использованные для анализа неклассифицированных вариантов 39 2.1.6.4. 1п silico инструменты для предсказания структуры белка

2.2. Анализ экспрессии митохондриальных генов

2.2.1. Разработка панели

2.2.2. Сбор биоматериала и выделение РНК

2.2.3. Пробоподготовка и работа с анализатором nCounter

2.2.4. Первичная обработка данных

2.2.5. Глубокий анализ генных сетей

2.2.6. Статистическая обработка материала

2.3. Патоморфологическое исследование мышечных биоптатов

2.4. Клиническое обследование пациентов и негенетические лабораторные показатели

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Анализ особенностей митохондриальной ДНК 49 3.1.1 Базовые характеристики мтДНК пациентов в исследуемой выборке

3.1.2. Результаты поиска подтвержденных мутаций мтДНК

3.1.3. Частые варианты в исследованной выборке пациентов 55 3.1.3.1. Взаимосвязь вариантов A10732T и C12562G с клинической картиной пациентов

3.1.4. Аннотация вариантов и расчет индекса патогенности

3.1.5. Зависимость клинической картины от гаплогруппы пациента

3.1.5.1. Гаплогруппа ИВУ

3.1.5.2. Гаплогруппа Т

3.1.5.3. Гаплогруппа U

3.1.5.4. Гаплогруппа J

3.1.5.5. Обсуждение взаимосвязи элементов клинической картины с

гаплогруппой пациентов

3.2. Анализ экспрессии митохондриальных генных сетей

3.2.1. Оценка качества анализа экспрессии генов

3.2.2. Построение тепловой карты экспрессии генов

3.2.3. Визуализация данных с помощью диаграмм рассеяния

3.2.4. Статистический анализ экспрессии генов

3.2.5. Глубокий анализ генных сетей

3.2.5.1. Вовлеченность в процессы митохондриальной

жизнедеятельности

3.2.5.2. Вовлеченность в метаболические процессы

3.2.5.3. Вовлеченность в передачу сигнала

3.2.5.4. Поиск общих регуляторов

3.2.5.5. Вовлеченность в патологические процессы

3.2.6. Корреляции с особенностями митохондриальной ДНК

3.2.7. Корреляции с ультраструктурными нарушениями мышечной ткани

143

3.2.8. Корреляции с клинической картиной 146 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 149 ВЫВОДЫ 151 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 153 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 154 ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

166

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Диагностическое значение определения особенностей митохондриальной ДНК при энцефаломиопатиях у детей»

Актуальность проблемы и степень разработанности темы

Собирательный термин «митохондриальные заболевания» означает клинически гетерогенную группу нарушений, вызванных дефектами дыхательной цепи митохондрий и ассоциированных с мутациями в митохондриальных генах. Согласно данным на 2017 год, распространенность митохондриальных заболеваний составляет один случай на 5000 человек населения, причем точечные мутации составляют ~ 50% всех патогенных мутаций митохонондриальной ДНК (мтДНК) [1]. Один из 500 новорожденных является бессимптомным носителем патогенных мутаций мтДНК, а каждый четвертый новорожденный несет вариант мтДНК неизвестной клинической значимости [2]. Каждый из таких вариантов может являться определяющим фактором при развитии заболевания.

Рассматривая митохондриальные заболевания в целом, можно сказать, что это хронический недостаток клеточной энергии. В зависимости от степени нарушения митохондриального аппарата, симптомы могут включать мышечную слабость, болевые синдромы, трудности глотания и желудочно-кишечные расстройства, болезни сердца, печени, сахарный диабет, респираторные осложнения, судороги, проблемы со зрением и слухом, ацидоз, задержку развития, восприимчивость к инфекциям [1]. В частности, к болезням, вызываемым мутациями митохондриальных генов, относятся наследственная атрофия зрительных нервов Лебера, синдром NARP, синдром MERRF, синдром MELAS, синдром Кернса-Сейра, синдром Пирсона [3].

Диагностика митохондриальной дисфункции вызывает значительные затруднения в связи с многообразием проявлений митохондриальных нарушений, мозаичности их распределения в тканях организма и сложности их методического выявления. Большинство митохондриальных заболеваний не являются синдромальными и обладают перекрывающимися неспецифическими симптомами. Наиболее распространенной формой являются митохондриальные энцефаломиопатии. Данные литературы о

взаимосвязи вариантов мтДНК с клинической картиной митохондриальных энцефаломиопатий противоречивы. Также на данный момент не существует общепринятого биоинформатического алгоритма, позволяющего оценить влияние индивидуальных особенностей мтДНК на фенотипические характеристики.

Кроме непосредственного влияния мутаций в мтДНК на структуру и функции комплексов респираторной цепи митохондрий, они также могут служить эпигенетическими факторами, определяющими уровень транскрипционной и трансляционной активности клетки, её жизненный цикл и взаимодействие с окружением [4]. Фундаментальные представления о значимости вариаций мтДНК для фенотипа на клеточном, тканевом и организменном уровнях сильно ограничены, а исследования часто противоречивы в своих выводах.

Таким образом, анализ современного состояния области митохондриальных болезней в целом, и энцефаломиопатий в частности, а также их генетических детерминант, показывает актуальность углубленного изучения индивидуальных изменений мтДНК при этих нарушениях и создания алгоритма для оценки их диагностической значимости.

Цель исследования

Определение диагностически значимых изменений митохондриальной ДНК при наследственных заболеваниях, проявляющихся в форме энцефаломиопатий.

Задачи исследования

1. Выявить основные варианты изменений митохондриальной ДНК при клинически выраженных энцефаломиопатиях и разработать подходы к их систематизации.

2. Оптимизировать биоинформатический алгоритм оценки изменений митохондриальной ДНК, имеющих клиническую значимость.

3. Выявить взаимосвязь особенностей митохондриальной ДНК и клинической картины пациентов с энцефаломиопатиями.

4. Провести оценку функциональных изменений митохондриального аппарата на основе анализа экспрессии митохондриальных генных сетей при первичных и вторичных митохондриальных нарушениях.

5. Выявить взаимосвязь функциональных изменений митохондриального аппарата с особенностями митохондриальной ДНК и клинической картиной пациентов с энцефаломиопатиями.

Научная новизна исследования

Выявлены основные варианты изменений митохондриальной ДНК при клинически выраженных энцефаломиопатиях, описано распределение гаплогрупповых полиморфизмов и диагностически значимых вариантов.

Впервые описаны две частых мутации A10732T (21% пациентов) и C12562G (26% пациентов), доказана их взаимосвязь с митохондриальными энцефаломиопатиями в целом, а также с отдельными клиническими симптомами.

Разработан показатель «индекс патогенности митохондриальной ДНК», представляющего собой комплексную биоинформатическую характеристику вариантов мтДНК пациента и доказана эффективность его оценки.

Впервые описаны корреляции гаплогрупповых характеристик с элементами клинической картины энцефаломиопатий. Также показана значимость оценки гаплогрупповой принадлежности пациента.

Впервые проведена функциональная оценка состояния митохондриального аппарата с помощью анализа экспрессии митохондриальных генных сетей при энцефаломиопатиях. Проведено сравнение паттернов экспрессии с нервно-мышечными заболеваниями немитохондриального генеза и выявлены основные критерии для дифференциальной диагностики.

Установлена зависимость между функциональным состоянием митохондриального аппарата, характеристиками мтДНК и клинической картиной пациентов с митохондриальными энцефаломиопатиями.

Теоретическая и практическая значимость исследования

Разработан диагностический набор для секвенирования митохондриальной ДНК, который позволяет выявлять максимальное число индивидуальных генетических изменений при митохондриальных энцефаломиопатиях.

Показана эффективность биоинформатического алгоритма анализа мтДНК, учитывающего персональные характеристики пациента, а также разработан показатель «индекс патогенности митохондриальной ДНК». Это позволит интегрировать результаты молекулярно-генетического анализа в диагностику в тех случаях отсутствия мутаций, достоверно ассоциированных с заболеванием.

Подтверждена информативность диагностической панели оценки экспрессии генов митохондриальных сетей для оценки функциональных изменений, ассоциированных с нарушениями мтДНК, а также для дифференциальной диагностики нервно-мышечных заболеваний различного генеза.

Методология и методы исследования

Диссертационная работа представляет собой лабораторное молекулярно-генетическое исследование биологического материала когорты пациентов детского возраста с митохондриальными энцефаломиопатиями с целью выяснения внутриклеточных основ патогенеза данной нозологической формы.

Объект исследования: периферическая венозная кровь и биопсийный материал скелетной мышцы пациентов детского возраста с клиническими признаками митохондриальных энцефаломиопатий.

Предмет исследования: молекулярно-генетические характеристики (точечные варианты митохондриальной ДНК, паттерны экспрессии митохондриальных генов) течения митохондриальных энцефаломиопатий и их взаимосвязь с основными диагностическими клинико-лабораторными параметрами.

Дизайн исследования, в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной медицинской ассоциации (1964), отражен в протоколе, одобренном локальным этическим комитетом Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации. В исследовании использовались методы секвенирования и анализа экспрессии генов, а также статистические и биоинфоматические инструменты анализа данных.

Положения, выносимые на защиту:

1. При клинически выраженных энцефаломиопатиях необходима комплексная оценка изменений митохондриальной ДНК, включающая анализ как гаплогрупповых полиморфизмов, так и вариантов с неизвестной клинической значимостью.

2. Доказана клинико-лабораторная эффективность оценки разработанного автором показателя «индекс патогенности митохондриальной ДНК», представляющего собой комплексную биоинформатическую характеристику мтДНК.

3. Гаплогрупповая принадлежность может быть ассоциирована с отдельными элементами клинической картины пациента, а также связана с конкретными генетическими вариантами.

4. Анализ экспрессии генов является эффективным инструментом как для функциональной оценки изменений мтДНК, так и для дифференциальной диагностики нервно-мышечных заболеваний.

5. Установлены диагностически значимые паттерны генной экспрессии при митохондриальных энцефаломиопатиях, а также корреляции этих паттернов с возрастом дебюта и характером течения заболевания.

Степень достоверности

Достоверность результатов исследования определяется достаточным объемом и корректным формированием (репрезентативностью) изучаемых выборок, применением принципов, технологий и методов доказательной медицины, высокой информативностью современных методов обследования, адекватностью математических методов обработки данных поставленным задачам. Сформулированные выводы и практические рекомендации аргументированы и логически вытекают из результатов исследования.

Практическое использование результатов исследования

Результаты исследования внедрены в практическую деятельность отделения клинической генетики НИКИ педиатрии им. академика Ю.Е. Вельтищева ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России, а также могут быть рекомендованы для применения при медико-генетическом консультировании в медицинских учреждениях. Основные положения диссертационной работы используются в научно-преподавательской деятельности кафедры клинической лабораторной диагностики ФДПО ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава Росси.

Публикации и апробация работы

Основные положения диссертационной работы отражены в 10 публикациях, в том числе 7 - в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ и 3 - в зарубежных рецензируемых изданиях.

Результаты работы доложены и обсуждены на конференции «1п!егпайопа1 Conference оп Вюшагкег Research in Clinical Medicine» (Париж, 2018), а также на первом московском саммите «Hamstring tech^togies» (Москва, 2017).

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Структура и функции митохондрий

Митохондрия — это высокоспециализированная органелла, присутствующая практически во всех эукариотических клетках и продуцирующая клеточную энергию путём окисления органических соединений. Митохондрии выполняют четыре основных функции в клетке, которые могут иметь значение для рассмотрения патофизиологии болезни. Во-первых, они продуцируют большую часть клеточной энергии в виде АТФ; во-вторых, они генерируют и регулируют активные формы кислорода; в-третьих, митохондрии аккумулируют существенную часть цитозольного кальция; и в-четвертых, они регулируют клеточный апоптоз путем изменения проницаемости своих мембран [5]. Согласно последним исследованиям митохондриальный аппарат также играет важную роль в дифференцировке стволовых клеток, регуляции клеточного цикла, врожденном иммунном ответе на патогены и стресс [6].

Митохондрии схожи размером с бактериями, что составляет около 1 мкм. Они обладают двумембранной структурой: внешней и внутренней мембранами, заключающими межмембранное пространство. Внешняя мембрана пронизана 2-3 нм порами, через которые свободно транспортируются небольшие молекулы и ионы (весом до 5 кДа) [7]. Также, наружная мембрана снабжена рецепторными молекулами для распознавания крупных белков и некоторыми ферментами. Благодаря особым структурам, встроенным в мембрану, митохондрии могут перемещаться по клетке, используя элементы цитоскелета, и локализоваться в зонах наибольшего энергопотребления [8].

Характерной особенностью строения митохондрий является структура их внутренней мембраны. Она компактизована в виде крист - обращенных в матрикс складок, что позволяет увеличить поверхность внутренней мембраны в несколько раз. Внутренняя мембрана отгораживает основное пространство

органеллы - матрикс, в котором находятся белки цикла Креббса, митохондриальная ДНК и РНК, белки домашнего хозяйства и т.п. В то время как наружная митохондриальная мембрана имеет пористую структуру и практически свободно пропускает ионы и небольшие незаряженные молекулы, внутренняя митохондриальная мембрана является непроницаемым барьером для всех ионов и молекул, которые могут быть транспортированы через нее с помощью специальных белков-переносчиков, что создает электрохимический потенциал внутренней мембраны [7].

1.2. Митохондриальная биоэнергетика

Энергетический баланс в клетках животных основан на доступности АТФ - универсальной формы химической энергии. Получение этой молекулы возможно двумя основными путями: субстратным фосфорилированием в жидкой фазе и мембранным фосфорилированием с использованием энергии трансмембранного градиента протонов Н+. Таким образом, процесс полностью зависит от доступности восстановительных эквивалентов НАДН. Митохондрии реализуют оба этих пути. Первый происходит на начальных стадиях окисления субстрата в цитоплазме и заключается в гликолизе или Р-окислении [9].

При гликолизе происходит расщепление глюкозы до двух молекул пирувата, НАД+ восстанавливается до НАДН, а также образуется молекула АТФ. Далее пируват транспортируется в митохондрию с помощью пируватдегидрогеназы, декарбоксилируется и соединяется с коэнзимом А, превращаясь в ацетил-КоА, НАДН + Н+ и СО2. Затем ацетил-КоА принимает участие в цикле трикарбоновых кислот, промежуточном этапе между гликолизом и электронной транспортной цепью митохондрий. В процессе цикла Кребса происходит окисление органических кислот с выделением 2 молекул СО2, трех НАДН + Н+, одной ФАДН2 и одной молекулы ГТФ (или АТФ). Компоненты ЦТК у эукариот находятся в свободном состоянии в матриксе митохондрий, лишь сукцинат-убихинон-оксиредуктаза (комплекс II

электрон-транспортной цепи, ЭТЦ) закреплена на внутренней мембране. На стадии окисления сукцината восстановительный эквивалент перемещается ферментом на другой свой сайт - сайт связывания убихинона [10].

Жирные кислоты гидролизуются в матриксе митохондрии путем Р-окисления с образованием нескольких (в зависимости от структуры субстрата) ацетил-КоА, НАДН + Н+ и ФАДН2. Далее два восстановительных эквивалента переносятся на убихинон, и все дальнейшие процессы происходят на кристах внутренней мембраны органеллы [6].

1.3. Окислительное фосфорилирование и электрон-транспортная цепь

митохондрий

Последняя стадия клеточного дыхания заключается в окислительном фосфорилировании через ЭТЦ на внутренней мембране митохондрий. Во время этого процесса происходит окисление НАДН + Н+ и ФАДН2 до НАД+ и ФАД+ соответственно, создается трансмембранный градиент протонов Н+, что запускает АТФ-синтазу и, в конечном итоге, служит энергией для выработки этим ферментом АТФ [7].

Система окислительного фосфорилирования состоит из пяти биохимически (а в некоторых случаях, и физически) связанных друг с другом белковых комплексов. Комплекс I, НАДН-убихинон-оксидоредуктаза, катализирует отщепление двух электронов от НАДН, которые, перемещаясь по структурам комплекса, в конечном счете, попадают на молекулу убихинона

[9].

Комплекс II, сукцинатдегидрогеназа, напрямую не связан с остальными компонентами ЭТЦ, не входит он и в респирасомы - супрамолекулярные конгломераты из комплексов окислительного фосфорилирования. Однако, сукцинатдегидрогеназа играет важнейшую роль в переносе электронов. Она катализирует окисление сукцината до фумарата, а высвободившиеся электроны направляет на убихинон, восстанавливая его до убихинола [7].

Комплекс III, или убихинол-цитохром С-оксидоредуктаза, окисляет восстановленный убихинон и восстанавливает цитохром С. При этом, происходит «вертикальный» перенос четырех протонов в межмембранное пространство, осуществляемый за счет циклического окисления и восстановления хинонов в самом комплексе [7].

Комплекс IV, или цитохром С оксидаза, является терминальным ферментом аэробной ЭТЦ. Она катализирует перенос электронов на кислород с образованием воды, последовательно окисляя четыре молекулы цитохрома С и принимая четыре электрона. Освободившиеся четыре протона цитохром С оксидаза перекачивает через внутреннюю мембрану [8].

Таким образом, комплексы I, III, IV, извлекают протоны из восстановительных эквивалентов и выбрасывают их в межмембранное пространство, создавая трансмембранный потенциал. При достижении разности потенциала между двумя сторонами >220 мВ, активируется комплекс V, или АТФ-синтаза. В её структуре содержится два полуканала, по которым проходит протонный ток, а также каталитический центр, который активируется в результате изменения конформации белка [6].

Эффективность, с которой восстановительные эквиваленты конвертируются ЭТЦ в АТФ, называется эффективностью «сцепления» комплексов цепи между собой. Она определяется эффективностью выкачивания протонов комплексами I, III, IV из матрикса, эффективностью преобразования протонного градиента в АТФ комплексом V и иными протонными трансмембранными токами, не связанными с этими событиями. Вариабельность комплексов ЭТЦ часто связывают с эффективностью сцепления. Соответственно, структура этих белков может влиять на соотношение получаемых с пищей калорий, выработки тепловой энергии, потребление кальция, генерацию активных форм кислорода и пр. [11]

1.4. Генерация активных форм кислорода

Активные формы кислорода (АФК) - обобщенная группа различных молекул и свободных радикалов, которые объединяет их происхождение из

молекулярного кислорода. Основными формами являются пероксид H2O2,

_2 _

супероксид O , гидроксил радикал OH и синглетный кислород.

В небольших количествах АФК выполняют роль медиаторов при внутриклеточном сигналлинге [12]. Однако при их гиперпродукции наступает окислительный стресс, который чаще всего приводит к запуску апоптотических механизмов [13]. Клетка снабжена многоуровневой системой антиоксидантной защиты, которая включает в себя ферменты (супероксиддисмутаза, каталаза и др.) и низкомолекулярные соединения (глутатион, витамин С и пр.). Многие участники цикла трикарбоновых кислот и окислительного фосфорилирования также обладают антиоксидантным свойствами [6] .

Митохондрии являются главным источником АФК: по разным данным утечка из электрон-транспортной цепи составляет от 1 до 5% электронов, в основном это происходит между III и IV комплексами [11]. Любое нарушение митохондриального редокс потенциала приводит к значительному увеличению продукции АФК. Ряд факторов окружающей среды, таких как курение, цианиды, грибные токсины, пестициды и т.п., а также многие фармпрепараты могут модулировать митохондриальный биогенез [14]. Эти факторы способны в той или иной степени ингибировать окислительное фосфорилирование и увеличивать продукцию активных форм кислорода, которые повреждают митохондриальную ДНК, постепенно снижая способность клетки аккумулировать энергию [15]. Кроме того, повышенный уровень АФК также влияет на сцепленность компонентов ЭТЦ. Измененная биоэнергетика митохондрий в свою очередь влияет на чувствительность к калориям и их переработку, что в конце концов может приводить к ряду метаболических заболеваний [16].

Сегодня общепринята точка зрения, что повышенный уровень АФК является патогенным фактором, который снижает эффективность работы тканей и органов и расходует энергетический потенциал организма [17]. Описаны многочисленные свидетельства повреждения активными формами кислорода митохондриальной ДНК [18] [19] [20]. Действительно, молекулы мтДНК в комплексе с шаперонными белками закреплены на внутренней стороне крист, и таким образом, экспонированы для воздействия образующихся в ЭТЦ радикалов [15]. При этом известно, что репарационная система ДНК митохондрий обладает низкой специфичностью и эффективностью, во многом схожа с бактериальной [21]. При накоплении критического количества мутаций мтдНК, обычно запускается митохондриальный путь апоптоза [5]. Кроме того, свободно-радикальная (или иначе называемая, митохондриальная) теория является одной из главных теорий старения на данный момент [12].

1.5. Митохондриальная ДНК

Митохондрии обладают собственным автономным геномом, который представлен несколькими копиями (100 - 10 000 на клетку, что зависит от её энергетического потребления) суперспирализованной двуцепочечной кольцевой ДНК. У человека объем мтДНК составляет ~16 569 пар нуклеотидов [22]. Каждая копия мтДНК окружена собственным комплексом белков, т.е. представляет собой нуклеоид, как и ядерный геном. Нуклеоид включает в себя не только шапероны, но и многое необходимое для матричных операций (полимеразы, активаторы репликации и транскрипции, хеликазы и др.). Митохондриальные нуклеоиды ассоциированы со внутренней мембраной органеллы и равномерно распределены вдоль крист [23].

Известно, что цепи двуцепочечной молекулы митохондриальной ДНК имеют асимметричное распределение по нуклеотидам Г/Ц, т.е. различаются по молекулярному весу [24]. Строение митохондриального генома крайне консервативно, всего он содержит 37 генов, 28 из них - на тяжелой (Н-цепи),

9 - на легкой (L-цепи). Все полипептиды, синтезируемые на мтДНК являются субъединицами электронно-транспортной цепи окислительного фосфорилирования. Семь генов (MTND1, MTND2, MTND4L, MTND4, MTND5, и MTND6) кодируют субъединицы респираторного комплекса I (НАДФ дегидрогеназы или НАДФ убиквинон оксидоредуктазы); 1 ген (MTCYB) кодирует компоненты комплекса III (убиквинон цитохром С оксидаза); 3 гена (MTCO1, MTCO2 и MTCO3) кодируют составляющие комплекса IV (цитохром С оксидазы, или COX); и два гена (MTATP6 и MTATP8) кодируют субъединицы респираторного комплекса V (АТФ-синтазы) [25]. На рисунке 1.1 схематично изображено строение мтДНК.

Рисунок 1

Функциональная карта митохондриального генома.

По сравнению с ядерным, митохондриальный геном высоко эффективен - около 93% его являются кодирующими генами. Большинство генов -смежные и разделены одной-двумя некодирующими парами нуклеотидов. Некоторые гены могут перекрываться между собой, к примеру гены субъединиц АТФ-синтазы МТАТР6 и МТАТР8. В мтДНК существует только один принципиально некодирующий участок - контрольный регион (Б-петля); он же является самым вариабельным [8].

Согласно последним данным, митохондриальный протеом состоит из ~1700 белков (причем около 200 из них задействовано в ЭТЦ) [26]. Очевидно, что значительная часть митохондриальных белков кодируется в ядре: большая часть белков системы окислительного фосфорилирования, компоненты транспорта белков в митохондрии, митохондриальные транслоказы, а также факторы, необходимые для транскрипции, трансляции и репликации мтДНК [26]. Кроме того, существует нуклеарное влияние на динамику митохондриальных сетей [4].

1.6. Эволюционная значимость мтДНК

Эукариотические клетки появились около 2 миллиардов лет назад как результат эндосимбиотического процесса [27]. На тот момент первичные энергетические ресурсы Земли истощились, и прокариотические организмы оказались на грани вымирания. Однако те из них, кто смогли вступить во взаимодействие с окислительными альфа-протеобактериями, обрели прото-митохондриальный аппарат и успешно выживали за счет нового источника энергии. В связи с такими переменами, рост и деление ядра стали зависеть от митохондриальной энергии и доступности калорий. Это вызвало необходимость создания системы по регуляции экспрессии ядерных генов и их репликации в зависимости от доступа к калорийному сырью, опосредованной через митохондриальный генетический аппарат. В результате структура ядерного хроматина была модифицирована и стала чувствительна к процессам с высокоэнергетическими посредниками: фосфорилирование с

помощью АТФ, ацетилирование с помощью ацетил-коэнзима А, деацетилирование с НАД и метилирование с Б-аденозилметионином [28].

В то же время решалась и обратная задача - развитие механизма модуляции митохондриального роста и репликации. Это сложнейший процесс, включающий успешную миграцию митохондриальных генов в ядро и транспорт синтезируемых белков обратно в митохондрию, длился более миллиарда лет [9]. В результате практически все митохондриальные гены (примерно полторы тысячи) были распределены по различным хромосомам, а в самой органелле осталось лишь 37 генов. Все полипептиды, синтезируемые с мтДНК являются субъединицами электронно-транспортной цепи окислительного фосфорилирования [7].

Тот факт, что основная часть митохондриальных генов разбросана по ядерному геному, определял необходимость развития инструмента координации их экспрессии для наиболее эффективного обеспечения ядра энергией. По мнению современного научного сообщества, этот фактор явился одной из главных движущих сил создания межхромосомной системы регуляции транскрипции [4].

На протяжении последующих 1,2 миллиардов лет структура ядра и цитозоля эволюционировала, становясь все более совершенной, в то время как митохондрии стали отвечать исключительно за продукцию энергии. В конце концов, эта эволюция стала ключом к появлению многоклеточности, развитию огромного спектра организмов, в том числе и человека. При этом все последующие этапы развития тканей и органов различных видов и адаптация их к условиям окружающей среды продолжали своими корнями уходить в базовые биоэнерго-эпигенетические взаимоотношения [21].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Воронкова Анастасия Сергеевна, 2018 год

- ЮН1

м

Рисунок 3.35. Гены, уровень экспрессии которых значимо различается между группами пациентов, вовлеченные в цикл трикарбоновых кислот.

Цикл трикарбоновых кислот и дыхательная цепь митохондрий

В группе пациентов с мышечными дистрофиями повышена экспрессия белков цикла трикарбоновых кислот: CPT1A, FH, GSR, а также DLAT - фермента из группы ацилтрансфераз, входящего в состав пируватдегидрогеназного комплекса и катализирующего реакцию переноса атома водорода и ацетильной группы (CH3-CO) кофермента А от тиаминдифосфата на окисленную форму липоиллизиновых групп с образованием ацетилтиоэфира липоевой кислоты [92].

По данным литературы, с функцией ЦТК ассоциирован и FXN - ген фратаксина, который, как принято считать, играет ключевую роль в образовании железосерных кластеров и выведении железа из околомитохондриального пространства [102], что обуславливает также его антиоксидантные свойства.

Как уже обсуждалось в предыдущем разделе, при дистрофиях повышена экспрессия и всех основных субъединиц дыхательной цепи. Предположительно, это связано с усилением пролиферации митохондрий, что является адаптацией к гипоксическим условиям. При этом у пациентов с мтЭМП аномально повышена экспрессия факторов сборки комплекса IV COX10 и COX15, а также нескольких субъединиц АТФ-синтазы, что, вероятно, ассоциировано с патологическим увеличением количества гиперплазированных дисфункциональных митохондрий. Скорее всего, нарушение функции дыхательной цепи и патологическое повышение уровня АФК происходит при десинхронизации работы именно этих двух финальных акцепторов электронов.

Уровень окислительного катаболизма у пациентов с врожденными миопатиями и митохондриальными миопатиями близок. Различия наблюдаются только в транскрипции IV (выше при мтЭМП) и V (выше при ВМ) комплексов. Здесь следует отметить значимость предварительной визуализации данных в виде тепловых карт и диаграмм рассеяния. Оперируя лишь значениями, полученными с помощью нескольких статистических критериев, невозможно выявить тенденции и глобальные паттерны генной экспрессии. Отсутствие достоверных различий в экспрессии генов белков ЭТЦ и ЦТК указывает на необходимость поиска

регуляторных элементов, как выше, так и нижестоящих относительно исследованных нами, и необходимость дальнейшего изучения экспрессии экспандированных генных сетей.

Биосинтез гема и убихинона

В метаболизме гема и убихинона задействовано четыре гена, которые значимо сильнее экспрессируются у пациентов с мышечными дистрофиями: FXN, CYCS, ETFA и COQ2, а также COX15, экспрессия которого выше при митохондриальных ЭМП.

COQ2 - кодирует непосредственно кофермент Q, или убихинон. Кофермент Q является компонентом цепи переноса электронов, принимает участие в переносе электронов с NADH-дегидрогеназного комплекса (комплекс I) и сукцинатдегидрогеназного комплекса (II) на комплекс III. В своей восстановленной форме убихинон является мощным антиоксидантом. Кроме того, кофермент Q восстанавливает антиоксидантную активность витамина Е - альфа-токоферола [103].

CYCS - цитохром С является переносчиком электронов от комплекса III (кофермент Q - цитохром С редуктазы) на комплекс IV (цитохром С - оксидазу). Этот белок содержит гем в своем активном центре, таким образом, является важнейшим участником метаболизма гема. При определённых условиях он может отсоединяться от мембраны митохондрии, переходить в раствор в межмембранном пространстве и активировать апоптоз [99].

ETFA - электротрансферный флавопротеин, полипептид альфа. Участник первичного этапа митохондриального бета-окисления жирных кислот. Переносит электрон от первичных флавопротеин-дегидрогеназ к мембранным флавопротеин-убиквинон-оксиредуктазам. НАДФН-зависимый флавопротеин переносит электрон от восстановленного НАДФН на терминальный фермент - цитохром Р-450, восстанавливая железо гема последнего. Кроме того, НАДН-дегидрогеназа

катализирует окисление НАДН и восстановление убихинона. Переносчиком водорода в этом случае также является ЕТЕА [104].

Фратаксин ЕХИ помимо своих антиоксидантных свойств является важным участником железосерных кластеров и метаболизма железа. Мутации в этом гене могут приводить к такому тяжелому нарушению работы этой системы, как атаксия Фридрейха [105].

СОХ15 является фактором сборки цитохром С оксидазы, а также известен как гем А синтаза, поскольку играет ключевую роль в биосинтезе гема А. Кроме того, СОХ15 вместе с ферредоксином и ферредоксинредуктазой составляет моно-оксигеназу, катализирующую гидроксилирование метильной группы на молекуле протогема [106].

Усиление синтетических процессов, ассоциированных с работой метаболических и окислительно-восстановительных процессов в митохондрии, свидетельствует о повышение пролиферативной активности клетки, направленной на компенсацию гипоксического состояния при мышечных дистрофиях. При мтЭМП наблюдается повышение экспрессии фактора СОХ15, однако на наш взгляд, это событие связано с усилением активности IV комплекса, а не с направленностью клеточного потенциала на биосинтез гема. Кроме того, усиление фактора сборки этого комплекса может быть ассоциировано с процессом слияния митохондрий и образования К^, повышенного при мтЭМП. Учитывая, что комплекс СОХ при патологиях подавляется последним из всех ферментов окислительного фосфорилирования, изменение его активности может отражать наличие и степень нарушений в предшествующих звеньях.

3.2.5.3. Вовлеченность в передачу сигнала

1. Сигналлинг шТОЯ. Вовлечены гены СУТЬ, ИБиЕУ1, ИБиЕУ2, ШЕ-1А,

5 2

р=9.47341 е- , коэффициент сходства Жаккара 2.12766 е- ;

2. Са2+ сигналлинг. Вовлечены гены СУС8, СУТЬ, ИБиЕУ1, ИБиЕУ2, р=

4 2

5.57147 е- , коэффициент сходства Жаккара: 1.50376 е- ;

3. Сигналлинг Б1ЯТ3. Вовлечены гены 8ВИА, ИБиЕУ1, ИБиЕУ2, р=1.63704 е-

4 коэффициент сходства Жаккара 2.63158 е-2.

Сигнальный путь шТОЯ

Нарушения пути метаболизма глюкозы, в т.ч. цикла трикарбоновых кислот и окислительного фосфорилирования, могут приводить к усиленной выработке аденозинмонофосфата (АМФ) [99]. Чаще всего это происходит при повышенном энергопотреблении клетки, например, при серьезных физических нагрузках. Однако при патологии митохондриального аппарата глюкоза усваивается недостаточно эффективно, в связи с чем клетка, теоретически, может воспринимать базовый уровень физической активности как чрезмерный. В результате усиливается синтез элементов респираторной цепи, наблюдаемый в группе пациентов с мтЭМП.

АМФ-активируемая протеинкиназа АМРК в результате нарастания концентрации АМФ изменяет энергетический баланс клетки. Она ингибирует синтез жирных кислот и активирует их окисление, т.е., переводит клетку в энергосберегающее состояние. В частности, АМРК является регулятором шТОЯ -мишени рапамицина млекопитающих, протеинкиназы серин-треониновой специфичности (рис.3.36) [107]. АМРК ингибирует транскрипцию ЯРТОЯ, регуляторного ассоциата шТОЯ. С другой стороны, АМФ-активируемая протеинкиназа фосфорилирует ТБС2, который в свою очередь ингибирует ЯНЕВ -активатор шТОЯ и ЯРТОЯ. В результате этих событий активность шТОЯ падает, и соответственно снижается пролиферативный потенциал клетки [104]. Похожий механизм запускает и индуцируемый гипоксией фактор НШ-1А, активируя такие блокаторы ЯНЕВ, как ТБС1 и ВМР3 [108].

Са2+ сигналлинг

Предположительно, при нарушении работы митохондрий происходит сдвиг молекулярного восприятия базовых физических нагрузок. Аномальная реакция может проявляться на уровне синаптической нервно-мышечной передачи. В частности, при долгосрочной избыточной мышечной нагрузке нейромедиатор глутамат в большом количестве накапливается с внешней стороны клетки и вызывает поступление внутрь мощного потока ионов кальция через КМОА-

рецепторы. Кальциевая перегрузка (рис.3.38) приводит к повреждению митохондриальной кальций-транспортной системы, а также к увеличению экспрессии проапоптотических генов и снижению активности антиапоптотических факторов [109]. В норме кальций запускает киназные каскады: кальций/кальмодулин-зависимую протеинкиназу, фосфоинозитид-3-киназу, митоген-активируемую киназу (MAPK1 и MAPK3). Каскад фосфорилирования, в итоге, достигает AKT1, mTOR и CREB, которые интенсифицируют экспрессию генов, ответственных за клеточную пролиферацию, и ингибируют проапоптотические факторы GSK3B, BAD, FOXO1 [110]. При кальциевой перегрузке происходит запуск митохондриального пути клеточного апоптоза, что обуславливает нарушения работы скелетных мышц на тканевом уровне [111]. Отдельно стоит отметить, что кальциевая эксайтотоксичность - патологический процесс гибели нейронов в результате гиперактивации NMDA-рецепторов - может вызывать ишемический каскад и развитие патологии высшей нервной деятельности, которая является частым симптомом у пациентов с мтЭМП [112].

Сигнальный путь SIRT3

Некоторые из измененных генов участвуют в сигналлинге SIRT3 - НАД-зависимой деацетилазы. Митохондриальный сиртуин 3 отвечает за деацетилирование гистоновых белков, регулируя плотность упаковки мтДНК, и соответственно, процессы транскрипции и трансляции (см. рис.3.37) [113]. Сегодня семейство сиртуинов рассматривается как один из важнейших факторов длительности жизни, так как они напрямую влияют на активность работы респираторной цепи митохондрий и продукцию АФК [94]. В нашем исследовании у пациентов с мтЭМП увеличена экспрессия таких мишеней SIRT3, как SDHA, SDHB, ACAD8 и MT-CYB, а у пациентов с миодистрофиями - ALDH18A1, NDUFS6 и ATP5E. Судя по всему, нарушения при рассматриваемых заболеваниях запускают внутриклеточный каскад, затрагивающий в том числе и генную сеть сиртуинов. Направление этого каскадного процесса и его фенотипический результат требуют дальнейшего изучения.

Реализация описанных выше сигнальных каскадов согласно полученным данным происходит схоже у пациентов с нервно-мышечными заболеваниями различного генеза. Вероятно, краеугольное различие лежит в масштабах этой реализации и её направленности. Однако белки, отвечающие за первичные этапы данных каскадов, находятся вне митохондриальных генных сетей. Анализ экспрессии сетей каждого из регуляторов заслуживает отдельного масштабного исследования. Предполагаемые общие регуляторы для отдельных групп генов из рассматриваемой выборки будут приведены в следующем разделе.

Рисунок 3.36. Активация АМРК и шТог в результате недостаточности глюкозы.

С477Т - долгожительство

■ \ч I -

окисление жирных КИСЛОТ

с 5 белковый фоллинг

белковый сшгтез

Рисунок 3.37. Сигналлинг БШТЗ

Рисунок 3.38. Нарушение кальциевого баланса

3.2.5.4. Поиск общих регуляторов

1. NFE2L2 является регулятором 9 генов (рис.3.39), р=7.57753 е-6, коэффициент сходства Жаккара 1.67910 е" ;

2

2. NRF1 является регулятором 8 генов (рис.40), р=1.85169 е- , коэффициент сходства Жаккара 4.90798 е ;

3. TFAM является регулятором 6 генов (рис.41), р=1.53690 е-9, коэффициент

-2

сходства Жаккара 7.50000 е ;

4. SOD2 является регулятором 5 генов (рис.42), р= 2.81856 е-6, коэффициент

-2

сходства Жаккара 4.16667 е ;

5. PARK2 является регулятором 4 генов (рис.43), р=9.61654 е-5, коэффициент

-2

сходства Жаккара 3.14961 е ;

Рисунок 3.39. Гены сети NFE2L2, различающиеся между группами пациентов с мышечными дистрофиями и митохондриальными энцефаломиопатиями

На рисунке изображены гены GSR, ABCB6, SDHB, CYCS, HIF-1A, FXN, NDUFV1,

C10orf2, CYTB.

Рисунок 3.40. Гены сети NRF1, различающиеся между группами пациентов с мышечными дистрофиями и митохондриальными энцефаломиопатиями.

На рисунке изображены гены ABCB6, SDHB, SDHA, CYCS, NDUFV1, NDUFS4,

POLG, CYTB

Рисунок 3.41. Гены сети TFAM, различающиеся между группами пациентов с мышечными дистрофиями и митохондриальными энцефаломиопатиями.

На рисунке изображены гены CYCS, ATP8, NDUFS4, CYTB, ND2, ATP6.

Рисунок 3.42. Гены сети SOD2, различающиеся между группами пациентов с мышечными дистрофиями и митохондриальными энцефаломиопатиями.

На рисунке изображены гены OPA1, FH, FXN, HIF-1A, CYTB.

Рисунок 3.43. Гены сети PARK2, различающиеся между группами пациентов с мышечными дистрофиями и митохондриальными энцефаломиопатиями

На рисунке изображены гены OPA1, HIF-1A, NDUFS3, NDUFS4.

Обсуждение

NFE2L2 - транскрипционный фактор типа лейциновых застежек-молний. В норме его содержание в клетке мало, так как он находится под контролем кластера белков, активно деградирующих его. Однако, при окислительном стрессе белки регуляторного кластера снижают свою активность, в результате чего концентрация NFE2L2 в цитоплазме повышается, и часть молекул транспортируется в ядро. Там фактор инициирует транскрипцию ряда генов антиоксидантов, в том числе и исследованных в работе [114].

NRF1 - транскрипционный фактор, активирующий ряд ключевых метаболических генов, регулирующих клеточный рост; ядерных генов, ответственных за дыхательную цепь митохондрий, а также митохондриальную транскрипцию и репликацию, том числе ABCB6, SDHB, SDHA, CYCS, NDUFV1, NDUFS4, POLG, CYTB. Белок NRF1 совместно с NRF2 координирует работу ядерного и митохондриального геномов [100].

TFAM - митохондриальный транскрипционный фактор А, активирует биогенез основных белков дыхательной цепи, а также участвует в репликации мтДНК [112].

SOD2 - марганец-зависимая супероксиддисмутаза 2. Этот белок трансформирует супероксидный радикал, побочный продукт митохондриальной электронно-транспортной цепи, в перекись водорода и двухатомный кислород. Экспрессия данного фактора была исследована в работе, однако достоверных различий между группами пациентов не выявлено [94].

PARK2 - убиквитин-лигаза, играющая ключевую роль в убиквитинировании. Этот процесс заключается в ковалентном присоединении одного или нескольких мономеров убиквитина к белку-мишени, что приводит к его протеолитической деградации. В частности, PARK2 распознает и направляет поврежденные митохондрии по пути их расщепления. Кроме того, этот фактор увеличивает

выживаемость клеток за счет подавления митохондриального и немитохондриального путей апоптоза [61].

Выявленные общие регуляторы генов, экспрессия которых значимо различалась между разными группами пациентов, служат еще одним подтверждением активации молекулярного ответа на окислительный стресс, который характерен для скелетной мышечной ткани при разных типах нервно-мышечных заболеваний. Все рассмотренные факторы, за исключением SOD2, не были представлены в исследовательской панели, однако заслуживают дальнейшего изучения.

Мы предполагаем, что для повышения диагностической эффективности анализа экспрессии генов следует совершить переход от исследования генов, непосредственно связанных с функционированием митохондриальной дыхательной цепи (таких как субъединицы дыхательных комплексов) к регуляторам более широкой направленности внутриклеточного сигналлинга. При выявлении количественных соотношений между этими двумя типами молекул, диагностическая панель может быть сведена к меньшему количеству генов, что является преимуществом с точки зрения биоинформатического анализа данных. При этом информативность получаемых данных повысится, поскольку они будут индицировать запуск внутриклеточных каскадов, которые на фенотипическом уровне отражаются в отсутствии или избыточности какого-либо структурного элемента митохондриального аппарата.

3.2.5.5. Вовлеченность в патологические процессы

1. Апоптоз. Вовлечены гены DIABLO, CYTB, OPA1, NDUFV1, NDUFV2, CYCS

р=7.29295 е-7, коэффициент сходства Жаккара 3.52113 е-2;

2. Гипоксия. Вовлечены гены CYTB, NDUFV1, NDUFV2, HIF-1A, р=3.89863 е-5,

-2

коэффициент сходства Жаккара 2.48447 е- ;

Апоптоз

Хорошо известно, что высокореакционные АФК, образующиеся в митохондриях всех аэробных клеток, являются важнейшим триггером апоптоза. В физиологических условиях их деструктивное действие сдерживается многоуровневой системой антиоксидантов. Однако при дисбалансе образования и утилизации АФК, клетка может предрасполагаться к программируемому лизису [108]. Показано, что при разных формах индуцированного апоптоза выявлены снижения активности элементов антиоксидантной защиты клеток [115]. Митохондриальный апоптотический путь развивается с участием белков Bak, Bax и некоторых других (рис. 3.44). Олигомеризуясь и встраиваясь в мембрану органеллы, эти молекулы образуют поры. В результате, нарушается осмотический баланс внутренней плазмы митохондрий, внутрь поступает большое количество молекул кальция, а в цитоплазму клетки из мембраны высвобождаются молекулы цитохрома С. В результате запускается клеточный аутолизис [116]. На сегодняшний день нет однозначного ответа на вопрос, что первично: окислительный стресс или апоптотический каскад, однако между этими процессами несомненно существует тесная взаимосвязь.

Согласно полученным нами данным, у пациентов с митохондриальными миопатиями повышена экспрессия гена DIABLO, который связывает антиапототический фактор и запускает каспазные каскады, приводящие к гибели клетки. DIABLO поступает в цитозоль вместе с цитохромом С, таким образом, активируясь только в стрессовых условиях [117].

У пациентов с мышечными дистрофиями и врожденными миопатиями экспрессия проапототических генов снижена, в то время как активна система пролиферации митохондрий. Возможно, низкий уровень апоптоза является одним из элементов патогенеза этих заболеваний.

Гипоксия

Около 25% белков клетки являются кислород зависимыми. При гипоксии некоторые из них активируются, а другие теряют свою активность. К последним относятся и пролилгидроксилазы PHD, дестабилизирующие фактор HIF-1A. Этот фактор является ключевым физиологическим сенсором уровня кислорода в большинстве клеток млекопитающих, сегодня известно более 100 генов, работу которых он регулирует, и этот список продолжает пополняться [54]. Согласно данным литературы, HIF-1A осуществляет протективную функцию, опосредуя адаптацию к гипоксическим условиям через митохондриальную функцию (рис.3.45) [118]. Он усиливает внутриклеточные каскады фосфорилирования, воздействуя на киназы Akt и МАРК (Егк), а также увеличивает ДНК-связывающую активность NF-kB [53].

Существуют также данные о том, что при гипоксии у клеток повышается резистентность к апоптозу [119]. В некоторых исследованиях показана обратная направленность взаимосвязи HIF-1A от NF-kB: последний способен активироваться в гипоксических и прооксидантных условиях и запускать широкий спектр внутриклеточных пролиферативных механизмов, в том числе активируя HIF [13]. В то время как разрушительное влияние АФК считается классической теорией старения, в современных исследованиях все чаще появляются указания на взаимосвязь высоких уровней АФК с долгожительством [53]. К примеру, среди носителей разобщающих генотипов мтДНК, таких как гаплогруппа J, чаще встречаются долгожители по сравнению с другими гаплогруппами [34]. Это связывают именно с NF-kB-зависимой активацией HIF-1A, которая происходит при ухудшении сопряжения переноса электронов по ЭТЦ и фосфорилирования АДФ, что приводит к повышению уровня свободных радикалов.

Когда клетка оказывается в условиях кислородной недостаточности, она испытывает шоковое состояние. Приостанавливаются все матричные и метаболические процессы, за исключением таких факторов как HIF-1A и семейства белков теплового шока HSP. Транскрипция и трансляция этих белков усиливается

за счет их стабилизации в цитоплазме и активации ими участников собственного синтеза [54]. Долгосрочная гипоксия приводит к постепенному увеличению концентрации факторов выживания клетки, и как результат, к гипертрофии, стабильному усилению биогенеза митохондрий, работы дыхательной цепи и анаэробному гликолизу [52]. Такая адаптация, вероятно, наблюдается у пациентов с мышечными дистрофиями: у них, по сравнению с пациентами с мтЭМП, повышена экспрессия многих белков ЦТК и дыхательной цепи, а также факторов транскрипции и деления митохондрий.

В группе пациентов с митохондриальными ЭМП экспрессия гипоксического фактора HIF-1A значительно выше, чем в группах пациентов с мышечными дистрофиями и врожденными структурными миопатиями. Однако полученные нами данные об экспрессии митохондриальных генных сетей свидетельствуют в пользу того, что канонический механизм, запускаемый фактором HIF-1A, некорректно реализуется при митохондриальных миопатиях: из всех многочисленных индукторов митохондриального биогенеза и структурных белков усиливается экспрессия лишь факторов сборки цитохром С оксидазы, АТФ-азы и фактора слияния митохондрий OPA1. С одной стороны, это может быть связано с комплексным поражением митохондриального генетического аппарата, который был показан при секвенировании мтДНК этих больных. Также, возможно, активация ядерных генов, ответственных за синтез митохондриальных белков, происходит только при поступлении соответствующего сигнала в ядро из самой органеллы, что невозможно при патологии мтДНК. В результате, компенсаторные механизмы при гипоксии не запускаются, происходит накопление продуктов неполного окисления, развивается ацидоз и повреждение лизосом, что в итоге приводит к апоптозу.

Однако, учитывая последние научные данные, стоит рассматривать и возможность иного сценария. Пролилгидроксилазы ингибируются при гипоксии за счет того, что они используют кислород как косубстрат для убиквитирования молекул HIF. При этом ингибирование PHD может развиваться и по

неканоническому пути, за счет воздействия активных форм кислорода на Fe2+ в составе активного центра PHD. Подобный механизм стабилизации HIF-1A в клетке получил название негипоксической гипоксии [61]. При секвенировании мтДНК пациентов с мтЭМП в нашем исследовании были получены косвенные свидетельства того, что система утилизации АФК в митохондриях таких пациентов нарушена, в связи с чем и наблюдается повышенный мутационный уровень. Данные о сниженном уровне экспрессии системы антиоксидантов также подтверждают это предположение. Таким образом, наиболее вероятно, при мтЭМП имеет место негипоксическая активация HIF-1A. В краткосрочной перспективе это не сопровождается активной пролиферацией митохондрий, как в случае МД. Однако при сравнении клинического фенотипа пациентов с мтЭМП и ВМ с МД становится очевидно, что общая направленность внутриклеточных процессов, в том числе и апоптоза нефункциональных миоцитов, обеспечивает более мягкое протекание заболевания и более оптимистичный клинический прогноз.

цитоплазма

ЙИЙГ1

повреждение митохондрий

межмембранное пространство

и

матрпкс

кальмо

ДУЛИН

м I гтохо ндриальная дисфункция

респираторная цепь

продукция АТФ

/ .* ^^^^ ^^^^^

САУ1 1 ■ 1АХ

СЖМ11

И51

0*>А1

Увеш шепие М1 похон дрий

апоптоз

Рисунок 3.44. Гиперплазия митохондрий и апоптоз при окислительном стрессе.

Н1Г1А I, *

« •»« 11« |«НМН1<< ((М|<ММ1(НН|||КНМ .<Н1 ««!(««<

<55

снижение рН клетки

Н+ N04

М1|)0|

деградация Д11К

е \ раяр!

ЧАО-

апоптоз

ЩК

респираторная цепь

продукция АТФ

метаболизм глюкозы

некроз

Рисунок 3.45. Схематичное изображение пути развития гипоксии.

00000101018902000000010101018800000001010101010001

3.2.6. Корреляции с особенностями митохондриальной ДНК

Из 48 человек, для которых была проанализирована экспрессия 213 генов, биоматериал 29-ти подвергся секвенированию мтДНК. Результаты секвенирования были сопоставлены с количественными характеристиками мРНК исследовательской панели.

Как видно из таблицы 3.18, число вариантов-кандидатов, обнаруженных у пациентов, положительно коррелировало с уровнем экспрессии генов ABCB7, ACAT1, ALDH5A1, CYP11B2, CYP27B1, HADH, HADHB, MT-ATP6, MT-ND3, PCCB, SLC25A19, SLC25A20, SLC25A4, SUCLA2, SUOX, TMLHE и отрицательно - с генами HSPA1A, HSPA6, HSPA9, PINK1, RNASEL, SARDH.

Между общим индексом патогенности выявлены положительные корреляции с экспрессией генов COX15, DIABLO, MT-ATP6, MT-ATP6, OPA1 и отрицательная корреляция с геном HSPA13.

Для максимального индекса патогенности выявлены положительные корреляции с генами C10orf2, COX15, OPA1.

Обсуждение

Положительные корреляции с числом вариантов-кандидатов мтДНК (ВК) выявлены для генов, ассоциированных с метаболическими процессами, такими как ЦТК (PCCB, ALDH5A1, SUCLA2, SUOX и пр.), бета-окисление жирных кислот (HADH), биосинтез альдостерона (CYP11B2, CYP27B1) и др. Также с возрастанием числа ВК усиливается транскрипция ряда представителей семейства анионных транспортеров SLC. Со значениями индексов патогенности положительно коррелируют уровни экспрессии генов комплексов дыхательной цепи, фактора OPA 1 (ответственного за слияние митохондрий), а также проапоптотических факторов DIABLO и RNASEL.

В то же время, чем выше число ВК или значение ИП, тем слабее экспрессируются белки теплового шока, HSP-семейство. Как известно, они

активируются в ответ на стрессовые условия для клетки: при термических воздействиях, ультрафиолетовом облучении, заживлении ран, гипоксии.

Таким образом, наши данные свидетельствуют о том, что клетка не воспринимает интенсифицированный мутагенез мтДНК как угрозу своей жизнедеятельности; также не отмечено и гипоксических реакций с повышением числа ВК. Положительные корреляции показателей изменения мтДНК с апоптотическими тригеррами позволяют предположить, что нарушения работы митохондрий могут носить пороговый характер, т.е. до момента критического снижения эффективности энергообмена внутриклеточные репаративные механизмы не активны. При достижении такого порога, вероятно, клетка находится уже в нежизнеспособном состоянии, в результате чего запускается программа её гибели. Единовременная детекция повышения экспрессии факторов слияния митохондрий и проаптотических факторов, вероятно связана с тем, что в части клеток мышечного биоптата, который был использован для выделения анализируемой РНК, параллельно происходят следующие стадии патологического процесса: образование RRF и гибель таких клеток.

В дополнение к вышеперечисленным взаимосвязям, наблюдается отрицательная корреляция числа ВК с количеством транскриптов гена PINK1, который, как считается, служит для защиты клетки от митохондриальной дисфункции, в частности он запускает аутофагию поврежденных митохондрий [120]. Возможно, при допороговом уровне митохондриальной патологии происходит фоновая адаптация к снижению функции органеллы: усиливаются метаболические процессы, синтез наиболее подверженных патологии комплексов дыхательной цепи COX и АТФ-азы.

Таблица 3.18. Статистические характеристики корреляционных связей между числом вариантов-кандидатов мтДНК и уровнем экспрессии митохондриальных генных сетей.

Ген Число вариантов-кандидатов мтДНК

Критерий Спирмена Критерий Пирсона

коэф. корр. р коэф. корр. р

ABCB7 0,248 0,194 -0,415 0,025

ACAT1 0,397 0,033 -0,411 0,027

ALDH5A1 0,388 0,038 0,311 0,101

CYP11B2 0,487 0,007 0,494 0,006

CYP27B1 0,394 0,035 -0,084 0,665

HADH 0,439 0,017 0,449 0,015

HADHB 0,457 0,013 -0,466 0,011

HSPA1A -0,344 0,068 -0,404 0,03

HSPA6 -0,309 0,102 -0,372 0,047

HSPA9 -0,4 0,031 0,393 0,035

MT-ATP6 0,512 0,005 0,4 0,031

MT-ND3 0,474 0,009 0,334 0,076

PCCB 0,376 0,044 0,371 0,048

PINK1 -0,368 0,049 -0,405 0,029

RNASEL -0,392 0,036 -0,394 0,035

SARDH -0,416 0,025 -0,314 0,097

SLC25A19 0,431 0,02 0,402 0,031

SLC25A20 0,468 0,01 0,404 0,03

SLC25A4 0,508 0,005 0,454 0,013

SUCLA2 0,369 0,049 0,366 0,051

SUOX 0,208 0,278 0,444 0,016

TMLHE 0,374 0,046 -0,379 0,042

Таблица 3.19. Статистические характеристики корреляционных связей между общим индексом патогенности мтДНК и уровнем экспрессии митохондриальных генных сетей.

Ген Общий индекс патогенности

Критерий Спирмена Критерий Пирсона

коэф. корр. р коэф. корр. р

С0Х15 0,421 0,023 0,364 0,052

ЫАВЬО 0,424 0,022 0,376 0,044

ИБРА13 -0,384 0,04 -0,378 0,043

МТ-АТР6 0,428 0,02 0,369 0,049

МТ-АТР6 0,437 0,018 0,418 0,024

0РА1 0,383 0,041 0,279 0,143

БиОХ 0,272 0,153 0,41 0,027

Таблица 3.20. Статистические характеристики корреляционных связей между максимальным индексом патогенности и уровнем экспрессии митохондриальных генных сетей.

Ген Максимальный индекс патогенности

Критерий Спирмена Критерий Пирсона

коэф. корр. р коэф. корр. р

С10ог/2 0,414 0,026 0,33 0,08

С0Х15 0,38 0,042 0,248 0,195

0РА1 0,357 0,057 0,383 0,04

3.2.7. Корреляции с ультраструктурными нарушениями мышечной ткани

Положительные корреляции наблюдаются между процентным содержанием скоплений RRF и экспрессией генов ОРА1, АС, АТ1, ИШ-1А, МТ-АТР6, МТ-АТР6, МТ-Ш4, МТ-ЫБ5, ЫБиРАП, а отрицательные - с АВСВ7, АС02, СУР11А1, СУР11В2, СУР27А1, СУР27В1, ШРА12А, ШРА12В, РАЫК2, РОЬО.

Со значением митохондриального индекса положительно коррелирует экспрессия HIF-1A, DIABLO, а отрицательно - ABCB7, ACAD8, COQ2, CYCS, HSPA12B, PANK2.

Таблица 3.21. Статистические характеристики корреляционных связей между процентным содержанием рваных красных волокон (RRF) и уровнем экспрессии митохондриальных генных сетей.

Ген Процентное содержание RRF

Критерий Спирмена Критерий Пирсона

коэф. корр. р коэф. корр. р

ABCB7 -0,096 0,621 0,398 0,033

ОРА1 0,371 0,048 0,26 0,174

ACAT1 0,396 0,034 0,364 0,052

ACO2 -0,056 0,038 0,399 0,032

CYP11A1 -0,397 0,231 -0,304 0,108

CYP11B2 -0,381 0,247 -0,207 0,28

CYP27A1 -0,065 0,856 0,384 0,04

CYP27B1 -0,047 0,039 -0,13 0,501

HIF-1A 0,423 0,047 0,256 0,003

HSPA12A -0,277 0,146 -0,372 0,047

HSPA12B -0,554 0,002 -0,482 0,008

MT-ATP6 0,388 0,06 0,199 0,3

MT-ATP6 0,371 0,022 -0,544 0,002

MT-ND4 0,409 0,031 -0,084 0,666

MT-ND5 0,123 0,488 0,384 0,04

NDUFA11 0,41 0,027 -0,415 0,025

PANK2 0,412 0,026 0,433 0,019

POLG -0,052 0,048 -0,398 0,033

Таблица 3.22. Статистические характеристики корреляционных связей между митохондриальным индексом и уровнем экспрессии митохондриальных генных сетей.

Ген Митохондриальный индекс

Критерий Спирмена Критерий Пирсона

коэф. корр. р коэф. корр. р

ABCB7 -0,419 0,024 0,268 0,16

ACAD8 -0,405 0,029 0,365 0,052

COQ2 -0,429 0,02 0,405 0,029

CYCS -0,391 0,036 0,383 0,04

HIF-1A 0,413 0,026 0,311 0,101

HSPA12B -0,466 0,011 -0,384 0,04

DIABLO 0,375 0,045 0,388 0,038

PANK2 -0,374 0,046 0,41 0,027

Обсуждение

При изучении взаимосвязей экспрессии митохондриальных генных сетей с ультраструктурными нарушениями мионов, прослеживается картина, схожая с корреляционными связями особенностей мтДНК. С увеличением количества скоплений пораженных гигантских митохондрий, а также степени их поражения, увеличивается экспрессия, в первую очередь, фактора слияния органелл ОРА1, а также проапоптотических факторов и чувствительного к уровню свободных радикалов ИШ-1А. Кроме того, усиливается экспрессия ангиотензинового рецептора АТ1 и субъединиц двух последних комплексов респираторной цепи, что скорее всего вызвано скачком активности фактора, индуцируемого гипоксией.

В то же время, отрицательные корреляции RRF и митохондриального индекса с уровнем мРНК генов, ответственными за внутриклеточный метаболизм и пролиферацию митохондрий, косвенно указывает на ингибирование этих

процессов в пораженных клетках, что, возможно, является промежуточной стадией клеточной гибели.

Важным моментом является факт отсутствия прямых корреляций между индексами патогенности и иными характеристиками мтДНК и гистологическими данными об ультраструктурных нарушениях митохондрий. Именно анализ данных об экспрессии митохондриальных генных сетей позволил во многом восполнить этот пробел и частично восстановить картину патогенеза митохондриальных энцефаломиопатий на внутриклеточном и тканевом уровнях. Особую клинико-диагностическую значимость представляет возможность подтверждения результатов иммуногистохимического исследования с помощью молекулярно-генетических маркеров: так в исследовании был подтвержден диагноз, поставленный с помощью инструментария ИГХ, и общая направленность внутриклеточных процессов в пораженной мышечной ткани.

3.2.8. Корреляции с клинической картиной

Положительные корреляции с возрастом дебюта заболевания выявлены для генов DIABLO, NDUFA12, NDUFA4, отрицательные - для ACADS, ВШР1, CYCS, CYP11A1, FXN, МТ-АТР6, МТ-АТР6, МТ^В, TSFM.

Степень тяжести состояния пациента положительно коррелировала с уровнем экспрессии ВШР1, DIABLO, РС, и отрицательно - с ACADM, СОХ15, CYP27B1, ETFB, FXN, МТ-АТР6, МТ-АТР6, МТ^4, PANK2.

Обсуждение

Как видно из полученных данных, при более высоком уровне экспрессии фактора апоптоза DIABLO и IV комплекса дыхательной цепи наблюдается более ранний дебют и сравнительно более тяжелое течение заболевания. Уровень экспрессии комплексов АТФ-азы, напротив, отрицательно коррелирует с тяжестью состояния пациента и возрастом дебюта. Предположительно, эти явления связаны с реализацией патологического механизма действия свободных радикалов, накапливающихся в результате дезорганизации финальных стадий окислительного

фосфорилирования, комплексов IV и V. В результате сниженного биосинтеза факторов пролиферации и антиоксидантов (АСАБМ, С0Х15, СУР27В1, ЕТРВ, РХЫ, РАИК2) клетки с большим количеством пораженных митохондрий подвергаются запрограммированной клеточной гибели.

Таким образом, анализ экспрессии генов и дальнейший анализ генных сетей позволяют во многом прояснить патогенез нарушений митохондриального аппарата у пациентов с различными типами нервно-мышечных заболеваний. Исследование количественных характеристик матричных РНК, ассоциированных с работой митохондрий, могут быть использованы как для дифференциальной диагностики, так и для подтверждения результатов иных лабораторных методов, таких как иммуногистохимический анализ мышечного биоптата. Кроме того, анализ экспрессии генов является важнейшим инструментом для функциональной оценки индивидуальных особенностей мтДНК.

Таблица 3.23. Статистические характеристики корреляционных связей между возрастом дебюта заболевания и уровнем экспрессии митохондриальных генных сетей.

Ген Возраст дебюта

Критерий Спирмена Критерий Пирсона

коэф. корр. р коэф. корр. р

АСАББ -0,394 0,035 -0,325 0,085

ВШР1 -0,493 0,007 -0,461 0,012

СУСБ -0,41 0,027 -0,362 0,053

СУР11А1 -0,394 0,035 0,419 0,024

БМВЮ 0,361 0,055 0,386 0,039

РХЫ -0,319 0,092 -0,395 0,034

МТ-АТР6 -0,327 0,083 -0,368 0,049

МТ-АТР6 -0,377 0,044 -0,357 0,057

МТ-СУВ -0,419 0,024 0,431 0,019

ЫВиРА12 0,402 0,031 0,323 0,087

NDUFA4 0,236 0,217 0,418 0,024

TSFM -0,41 0,027 -0,283 0,137

Таблица 3.24. Статистические характеристики корреляционных связей между тяжестью состояния пациента и уровнем экспрессии митохондриальных генных сетей.

Ген Степень тяжести состояния

Критерий Спирмена Критерий Пирсона

коэф. корр. р коэф. корр. р

ACADM -0,355 0,059 0,393 0,035

ВШР1 0,409 0,028 -0,125 0,519

СОХ15 -0,18 0,35 -0,372 0,047

СУР27В1 -0,213 0,268 0,474 0,009

DIABLO 0,322 0,089 -0,474 0,009

ETFB -0,398 0,032 0,106 0,586

FXN -0,005 0,978 -0,334 0,076

МТ-АТР6 -0,442 0,016 -0,084 0,664

МТ-АТР6 -0,464 0,011 0,105 0,587

МТ^4 -0,093 0,632 -0,373 0,046

PANK2 -0,191 0,321 0,512 0,005

РС 0,431 0,02 -0,028 0,886

149

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

На сегодняшний день проблема диагностики несиндромальных энцефаломиопатий, в том числе их дифференциальной диагностики с другими формами нервно-мышечных заболеваний, в нашей стране и за рубежом сохраняет высокую актуальность, количество неуточненных и некорректных диагнозов велико, окончательных строгих клинико-лабораторных критериев не выработано. В последние годы, в связи со все большим внедрением в клиническую практику молекулярно-генетических исследований, секвенирование митохондриальной ДНК значительно увеличило эффективность диагностики мтЭМП.

В настоящей работе определены основные типы изменений мтДНК на достаточно большой выборке пациентов (58 детей). Результаты подтвердили актуальность разработки биоинформатического алгоритма оценки индивидуальных особенностей мтДНК: достоверно ассоциированных с энцефаломиопатиями мутаций не выявлено ни у одного пациента. При этом, было описано два новых варианта A10732T и C12562G, встречающихся у 21% и 26% пациентов соответственно. Данные варианты были выявлены у неродственных пациентов с различными гаплогруппами, что дает основание говорить об их ассоциации с исследованной нозологической формой.

Анализ клинико-лабораторных показателей у исследованных пациентов позволил выявить ряд новых корреляций между ними и частыми вариантами A10732T и C12562G, а также гаплогрупповыми особенностями. Кроме того, разработанный нами показатель «индекс патогенности мтДНК» является эффективным клинико-лабораторным инструментом оценки состояния митохондриального аппарат пациента.

Опыт функциональной оценки изменений работы митохондрий на основе анализа экспрессии генов является уникальным для России и редким для зарубежных исследований. При этом, такие возможности визуализации и анализа данных как тепловые карты и диаграммы рассеяния показали себя в нашем

исследовании как эффективные инструменты дифференциальной диагностики нервно-мышечных заболеваний различного генеза.

Анализ экспрессии генов позволил выявить функциональные нарушения системы утилизации АФК, апоптоза и адаптации к гипоксии и окислительному стрессу при митохондриальных энцефаломиопатиях. Для лабораторной диагностики особый интерес представляют обнаруженные нами закономерности между функциональными изменениями митохондриального генетического аппарата и элементами клинической картины мтЭМП.

151

ВЫВОДЫ

1. Причиной развития митохондриальных энцефаломиопатий могут являться не только точечные мутации, но и комплексное поражение митохондриальной ДНК, требующее лабораторного определения потенциально патогенных вариантов, а также гаплогрупповых полиморфизмов.

2. У пациентов с клинически выраженными митохондриальными энцефаломиопатиями выявлено два часто встречающихся варианта: А10732Т (21% пациентов) и С125620 (26% пациентов). Данные варианты обнаружены у пациентов с неродственными гаплогруппами и не встречаются в контрольной группе, то есть ассоциированы с заболеванием.

3. Доказана клинико-лабораторная эффективность оценки разработанного автором показателя «индекс патогенности митохондриальной ДНК», представляющего сумму баллированных характеристик вариантов мтДНК пациента, таких как расположение в геноме, тип замены, влияние на экспрессию гена, последствия для аминокислотной структуры белка.

4. Гаплогруппы митохондриальной ДНК и и Т обладают протективными в отношении клинических проявлений митохондриальных энцефаломиопатий свойствами: выявлена отрицательная корреляция между принадлежностью к гаплогруппе И, мигренью и умственной отсталостью; а наличие гаплогруппы Т отрицательно коррелирует с нарушениями физического развития, нервно-мышечным симптомокомплексом и повышением лактатдегидрогеназы в крови.

5. Показана эффективность построения тепловых карт и точечных диаграмм рассеяния экспрессии митохондриальных генных сетей для дифференциальной диагностики нервно-мышечных заболеваний с первичными и вторичными митохондриальными нарушениями.

6. На основании оценки транскрипционной активности генов, ассоциированных с работой митохондрий, у пациентов с митохондриальными энцефаломиопатиями выявлены нарушения внутриклеточной системы утилизации АФК, адаптации к окислительному стрессу, гипоксии, физическим нагрузкам.

7. Установлена положительная корреляция уровня экспрессии генов DIABLO и IV комплекса дыхательной цепи с более ранним дебютом, а также с более тяжелым течением митохондриальной энцефаломиопатии. Уровень экспрессии комплексов АТФ-азы, напротив, отрицательно коррелирует с тяжестью состояния пациента и возрастом дебюта.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. При отсутствии данных о мутациях в ядерной или митохондриальной ДНК, достоверно ассоциированных с митохондриальными энцефаломиопатиями, рекомендуется проводить комплексную оценку полной последовательности мтДНК, включая определение потенциально патогенных вариантов, а также гаплогрупповых полиморфизмов.

2. Варианты A10732T и C12562G рекомендуется использовать как диагностические маркеры митохондриальных энцефаломиопатий.

3. Индекс патогенности митохондриальной ДНК необходимо оценивать при дифференциальной диагностике первичных и вторичных митохондриальных нарушений.

4. Гаплогруппы митохондриальной ДНК U и T рекомендуется использовать как предиктивные маркеры развития нарушений работы головного мозга, нарушений физического развития, комплекса нервно-мышечных проявлений и нарушений гликолиза при митохондриальных энцефаломиопатиях.

5. Анализ экспрессии генов рекомендуется применять для функциональной оценки нарушения работы митохондрий, а также для прогнозирования течения митохондриальных энцефаломиопатий.

1. Damas J. Mitochondrial DNA rearrangements in health and disease--a comprehensive study / Damas J., Samuels D. and Carneiro J. // Hum Mutat. - 2014. -

35(1). - 1-14

2. Gorman G. Mitochondrial diseases / Gorman G., Chinnery P. and DiMauro S. // Nat Rev Dis Primers. - 2016. - 2 - 16080

3. Qi T. Evidence for mitochondrial genetic control of autosomal gene expression / Qi T. Kassam I., Lloyd-Jones L. // Hum Mol Genet. - 2016. - 25(24). - 6

4. Wallace D. Mitochondrial energetics and therapeutics / Wallace D., Fan W. and Procaccio V. // Annu Rev Pathol. - 2010. - 5 - 297-348

5. Hallberg B.. Making proteins in the powerhouse / Hallberg B. and Larsson N. // Cell Metab. - 2014. - 20(2). - 226-240

6. Area-Gomez E. Mitochondrial genetics and disease / Area-Gomez E. and Schon E. // J Child Neurol. - 2014. - 29(9). - 1208-1215

7. Wallace D. Mitochondria, bioenergetics, and the epigenome in eukaryotic and human evolution / Wallace D. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. - 2009. - 74 -383-393

8. Schon E. Human mitochondrial DNA: roles of inherited and somatic mutations / Schon E., DiMauro S. and Hirano M. // Nat Rev Genet. - 2012. - 13(12). - 878-890

9. Marcuello A. Human mitochondrial variants influence on oxygen consumption / Marcuello A., Martinez-Redondo D. and Dahmani Y. // Mitochondrion. - 2009. - 9(1). - 27-30

10. Herst P. Functional Mitochondria in Health and Disease / Herst P., Rowe M. and Carson G. // Front Endocrinol (Lausanne). - 2017. - 8 - 296

11. Minchenko O. Effect of hypoxia on the expression of nuclear genes encoding mitochondrial proteins in U87 glioma cells / Minchenko O., Riabovol O. and Tsymbal D. // Ukr Biochem J. - 2016. - 88(3). - 54-65

12. Wallace D. Bioenergetics and the epigenome: interface between the environment and genes in common diseases / Wallace D. // Dev Disabil Res Rev. - 2010. - 16(2). -114-119

13. Wallace D. Energetics, epigenetics, mitochondrial genetics / Wallace D. and Fan W. // Mitochondrion. - 2010. - 10(1). - 12-31

14. Turco A. Dietary fat differentially modulate the mRNA expression levels of oxidative mitochondrial genes in skeletal muscle of healthy subjects / Turco A., Guescini M. and Valtucci V. // Nutr Metab Cardiovasc Dis. - 2014. - 24(2). - 198-204

15. Wong L. Current molecular diagnostic algorithm for mitochondrial disorders / Wong L., Scaglia F. and Graham B. // Mol Genet Metab. - 2010. - 100(2). - 111-117

16. Wallace D.. The pathophysiology of mitochondrial disease as modeled in the mouse / Wallace D. and Fan W. // Genes Dev. - 2009. - 23(15). - 1714-1736

17. Shen L. Evaluating mitochondrial DNA in cancer occurrence and development / Shen L., Fang H. and Chen T. // Ann N Y Acad Sci. - 2010. - 1201 - 26-33

18. Georgieva E. Mitochondrial Dysfunction and Redox Imbalance as a Diagnostic Marker of "Free Radical Diseases" / Georgieva E., Ivanova D. and Zhelev Z. // Anticancer Res. - 2017. - 37(10). - 5373-5381

19. Wallace D. Bioenergetics in human evolution and disease: implications for the origins of biological complexity and the missing genetic variation of common diseases / Wallace D. // Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. - 2013. - 368(1622). - 20120267

20. Holt I. Human mitochondrial DNA replication / Holt I. and Reyes A. // Cold Spring Harb Perspect Biol. - 2012. - 4(12). -

21. Li H. Physiology and pathophysiology of mitochondrial DNA / Li H., Liu D. and Lu J. // Adv Exp Med Biol. - 2012. - 94 - 39-51

22. Wallace D. Bioenergetic origins of complexity and disease / Wallace D. // Cold Spring Harb Symp Quant Biol. - 2011. - 76 - 1-16

23. Wallace D. Mitochondrial DNA mutations in disease and aging / Wallace D. // Environ Mol Mutagen. - 2010. - 51(5). - 440-450

24. Fox T. Mitochondrial protein synthesis, import, and assembly / Fox T. // Genetics.

- 2012. - 192(4). - 1203-1234

25. Wallace D. Why do we still have a maternally inherited mitochondrial DNA? Insights from evolutionary medicine / Wallace D. // Annu Rev Biochem. - 2007. - 76

- 781-821

26. Wallace D. Mitochondrial DNA genetics and the heteroplasmy conundrum in evolution and disease / Wallace D. and Chalkia D. // Cold Spring Harb Perspect Biol.

- 2013. - 5(11). - a021220

27. Peralta S. Mitochondrial transcription: lessons from mouse models / Peralta S., Wang X. and Moraes C. T. // Biochim Biophys Acta. - 2012. - 1819(9-10). - 961-969

28. Brotherton P., Haak W. and Templeton J. Neolithic mitochondrial haplogroup H genomes and the genetic origins of Europeans / Brotherton P., Haak W. and Templeton J. // Nat Commun. - 2013. - 4 - 1764

29. Larsen S. Increased intrinsic mitochondrial function in humans with mitochondrial haplogroup H / Larsen S., Diez-Sanchez C. and Rabol R. // Biochim Biophys Acta. -2014. - 1837(2). - 226-231

30. www.phylotree.org

31. Mitchell S. Characterization of mitochondrial haplogroups in a large population-based sample from the United States / Mitchell S., Goodloe R. and Brown-Gentry K. // Hum Genet. - 2014. - 133(7). - 861-868

32. Lorente L. Severe septic patients with mitochondrial DNA haplogroup JT show higher survival rates: a prospective, multicenter, observational study / Lorente L., Iceta R. and Martin M. M. // PLoS One. - 2013. - 8(9). - e73320

33. Hart A. The Other Genome: A Systematic Review of Studies of Mitochondrial DNA Haplogroups and Outcomes of HIV Infection and Antiretroviral Therapy / Samuels D Hart A, Hulgan T // AIDS Rev. - 2013. - 15(4). - 15

34. Tavira B. Mitochondrial DNA haplogroups and risk of new-onset diabetes among tacrolimus-treated renal transplanted patients / Tavira B., Gomez J. and Diaz-Corte C. // Gene. - 2014. - 538(1). - 195-198

35. Bedford F. Sephardic signature in haplogroup T mitochondrial DNA / Bedford F. // Eur J Hum Genet. - 2012. - 20(4). - 441-448

36. Wallace D. A mitochondrial paradigm of metabolic and degenerative diseases, aging, and cancer: a dawn for evolutionary medicine / Wallace D. // Annu Rev Genet.

- 2005. - 39 - 359-407

37. Wallace D. Leber Hereditary Optic Neuropathy: Exemplar of an mtDNA Disease / Wallace D. and Lott M. // Handb Exp Pharmacol. - 2017. - 240(- 339-376

38. Schurr T. Genetic background and climatic droplet keratopathy incidence in a Mapuche population from Argentina / Schurr T., Dulik M. and Cafaro T. // PLoS One. - 2013. - 8(9). - e74593

39. www.omim.org

40. Николаева Е.А. Гетерогенность митохондриальных заболеваний, обусловленных дефектами комплекса i дыхательной цепи / Николаева Е.А. // Рос. вестн. перинатологии и педиатрии. - 2015. - 60(3). - 5

41. Picard M. The rise of mitochondria in medicine / Picard M., Wallace D. and Burelle Y. // Mitochondrion. - 2016. - 30 - 105-116

42. Parikh S. Diagnosis and management of mitochondrial disease: a consensus statement from the Mitochondrial Medicine Society / Parikh S., Goldstein A. and Koenig M. K. // Genet Med. - 2015. - 17(9). - 689-701

43. Copeland W. Defects in mitochondrial DNA replication and human disease / Copeland W. // Crit Rev Biochem Mol Biol. - 2012. - 47(1). - 64-74

44. Koenig M. Presentation and diagnosis of mitochondrial disorders in children / Koenig M. // Pediatr Neurol. - 2008. - 38(5). - 305-313

45. DiMauro S. The clinical maze of mitochondrial neurology / DiMauro S., Schon E. and Carelli V. // Nat Rev Neurol. - 2013. - 9(8). - 429-444

46. Баранич Т.И. Митохондриальные нарушения при врожденных миопатиях / Баранич Т.И. Харламов Д.А., Глинкина В.В., Брыдун А.В. // Рос. вестн. перинатологии и педиатрии. - 2014. - 59(3). - С. 57

47. Баранич Т.И. Митохондриальные нарушения при прогрессирующих мышечных дистрофиях / Баранич Т.И. Харламов Д.А., Грознова О.С. // Рос. вестн. перинатологии и педиатрии. - 2014. - 59(1). - С. 16

48. Щербо Д.С. Биомаркеры персонализированной медицины / Щербо Д.С. Щербо С.Н., Котвицкий А.Д., Кралин М.Ю. // Медицинский алфавит. - 2015. -1(2). - С. 4

49. Глинкина В.В. Индивидуальные особенности митохондрий и их роль в тканевой адаптации к патологическим процессам / Глинкина В.В. Сухоруков В.С. // Морфология. - 2014. - 145(3). - С. 45

50. Lee S. Regulation of life span by mitochondrial respiration: the HIF-1 and ROS connection / Lee S., Hwang A. // AGING. - 2011. - 3(3). - 6

51. Yee Koh M. HIF-1 regulation: not so easy come, easy go / Yee Koh M., Spivak-Kroizman T. R. and Powis G. // Trends Biochem Sci. - 2008. - 33(11). - 526-534

52. Иллариошкин С.Н. Алгоритм диагностики митохондриальных энцефаломиопатий / Иллариошкин С.Н. // Нервные болезни. - 2007. - Т. 3- С. 45

53. Яблонская М.И. Диагностика митохондриальных заболеваний у детей / Яблонская М.И. Николаева Е.А., Харабадзе М.Н. // Рос. вестн. перинатологии и педиатрии. - 2015. - 60(4). - С. 36

54. Сухоруков В.С. Влияние дисфункции митохондрий на клинические провявления наследственных миопатий / Сухоруков В.С. Харламов Д. А. // Рос. вестн. перинатологии и педиатрии. - 2013. - 58(4). - С. 85-88

55. Hollandl M. Second generation sequencing allows for mtDNA mixture deconvolution and high resolution detection of heteroplasmy / Hollandl M., McQuillan R. and O'Hanlon A. // Croatian Medical Journal. - 2011. - 52(3). - 299-313

56. Kaddissi S. Mitochondrial gene expression, antioxidant responses, and histopathology after cadmium exposure / Al Kaddissi S., Legeay A. and Elia A. C. // Environ Toxicol. - 2014. - 29(8). - 893-907

57. Wang J. An integrated approach for classifying mitochondrial DNA variants: one clinical diagnostic laboratory's experience / Wang J., Schmitt E. S. and Landsverk M. L. // Genet Med. - 2012. - 14(6). - 620-626

58. Li R.. Effect of ambient PM(2.5) on lung mitochondrial damage and fusion/fission gene expression in rats / Li R., Kou X. and Geng H. // Chem Res Toxicol. - 2015. -28(3). - 408-418

59. Леонтьева И.В. Кардиомиопатии при врожденных нарушениях метаболизма у детей / Леонтьева И.В., Николаева Е.А. // Рос. вестн. перинатологии и педиатрии. - 2016. - 61(2). - С. 10

60. Neupert W. Mitochondrial Gene Expression: A Playground of Evolutionary Tinkering / Neupert W. // Annu Rev Biochem. - 2016. - 85- 65-76

61. Suzuki T. A complete landscape of post-transcriptional modifications in mammalian mitochondrial tRNAs / Suzuki T. // Nucleic Acids Res. - 2014. - 42(11). -7346-7357

62. Cvijanovich N. Differential expression of the nuclear-encoded mitochondrial transcriptome in pediatric septic shock / Cvijanovich N. et al. // Critical Care. - 2014. - 18(623). - 13

63. Gomez-Carballa A. Indian signatures in the westernmost edge of the European Romani diaspora: new insight from mitogenomes / Gomez-Carballa A., Pardo-Seco J. and Fachal L. // PLoS One. - 2013. - 8(10). - e75397

64. He S. Mitochondrial-related gene expression profiles suggest an important role of PGC-1alpha in the compensatory mechanism of endemic dilated cardiomyopathy / He S., Tan W. // Exp Cell Res. - 2013. - 319(17). - 2604-2616

65. Kelly R. Mitochondrial DNA haplotypes define gene expression patterns in pluripotent and differentiating embryonic stem cells / Kelly R. D., Rodda A. E., Dickinson A., et al. // Stem Cells. - 2013. - 31(4). - 703-716

66. Lott M. mtDNA Variation and Analysis Using Mitomap and Mitomaster / Lott M., Leipzig J. and Derbeneva O. // Curr Protoc Bioinformatics. - 2013. - 44. - 21-26

67. https://mitomap.org/

68. http://www.hmtdb.uniba.it/hmdb/

69. http://mamit-trna.u-strasbg.fr/human.asp

70. http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/

71. http://provean.jcvi.org/

72. http://sift.jcvi.org/

73. http://folding.biofold.org/i-mutant/

74. http://snps.biofold.org/phd-snp/

75. http://www.pantherdb.org/

76. Bumgarner RE. Direct multiplexed measurement of gene expression with color-coded probe pairs. / Bumgarner RE, Geiss GK, Birditt B, Dahl T, // Nat Biotechnol. -2008. - 26(3). - 8

77. Bandelt H. The case for the continuing use of the revised Cambridge Reference Sequence (rCRS) and the standardization of notation in human mitochondrial DNA studies / Bandelt H., Kloss-Brandstatter A. and Richards M. // J Hum Genet. - 2014. -59(2). - 66-77

78. Behar D. A "Copernican" reassessment of the human mitochondrial DNA tree from its root / Behar D., Van Oven M. and Rosset S. // Am J Hum Genet. - 2012. - 90(4). -675-684

79. Tranah G. Mitochondrial DNA sequence associations with dementia and amyloid-beta in elderly African Americans / Tranah G., Yokoyama J. and Katzman S. // Neurobiol Aging. - 2014. - 35(2). - 442 e441-448

80. Zaragoza M. Mitochondrial cardiomyopathies: how to identify candidate pathogenic mutations by mitochondrial DNA sequencing, MITOMASTER and phylogeny / Zaragoza M., Brandon M. and Diegoli M. // Eur J Hum Genet. - 2011. -19(2). - 200-207

81. Vinothkumar K. Architecture of mammalian respiratory complex I / Vinothkumar K., Zhu J. and Hirst J. // Nature. - 2014. - 515(7525). - 80-84

82. Zamudio-Ochoa A. The Pet309 pentatricopeptide repeat motifs mediate efficient binding to the mitochondrial COX1 transcript in yeast / Zamudio-Ochoa A., CamachoVillasana Y. and Garcia-Guerrero A. E. // RNA Biol. - 2014. - 11(7). - 953-967

83. Falk M. Mitochondrial Disease Sequence Data Resource (MSeqDR): a global grass-roots consortium to facilitate deposition, curation, annotation, and integrated analysis of genomic data for the mitochondrial disease clinical and research communities / Falk M., Shen L. and Gonzalez M. // Mol Genet Metab. - 2015. - 114(3). - 388-396

84. Schon E. Therapeutic prospects for mitochondrial disease / Schon E., DiMauro S. and Hirano M. // Trends Mol Med. - 2010. - 16(6). - 268-276

85. Bussard K. Understanding Mitochondrial Polymorphisms in Cancer / Bussard K. and Siracusa L. // Cancer Res. - 2017. - 77(22). - 6051-6059

86. Edwards J. Quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) damage and error rates by real-time QPCR / Edwards J. // Mitochondrion. - 2009. - 9(1). - 31-35

87. Strange H. Effect of disrupted mitochondria as a source of damage-associated molecular patterns on the production of tumor necrosis factor a by splenocytes from dogs / Strange H, Friedenberg G // American Journal of Veterinary Research. - 2016.

- 77(6). - 9

88. M. Bestwick. Accessorizing the human mitochondrial transcription machinery / M. Bestwick and G. Shadel // Trends Biochem Sci. - 2013. - 38(6). - 283-291

89. J. Jiang, Increased mitochondrial ROS formation by acetaminophen in human hepatic cells is associated with gene expression changes suggesting disruption of the mitochondrial electron transport chain / J. Jiang, J. Briede and D. Jennen // Toxicol Lett. - 2015. - 234(2). - 139-150

90. Kim H. SOD2 and Sirt3 Control Osteoclastogenesis by Regulating Mitochondrial ROS / Kim H., Lee Y. and Kim H. // J Bone Miner Res. - 2017. - 32(2). - 397-406

91. Andreu A. Quantification of mitochondrial DNA copy number: pre-analytical factors / Andreu A., Martinez R. and Marti R. // Mitochondrion. - 2009. - 9(4). - 242246

92. Cline D. Mitochondrial DNA damage and its consequences for mitochondrial gene expression / Cline S. D. // Biochim Biophys Acta. - 2012. - 1819(9-10). - 979-991

93. Salehi M. Gene expression profiling of mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) complex I in Friedreich ataxia (FRDA) patients / Salehi M., Kamalidehghan B. and Houshmand M. // PLoS One. - 2014. - 9(4). - e94069

94. Samuels D. Recurrent tissue-specific mtDNA mutations are common in humans / Samuels D., Li C. and Li B. // PLoS Genet. - 2013. - 9(11). - e1003929

95. Carling P. The implications of mitochondrial DNA copy number regulation during embryogenesis / Carling P., Cree L. and Chinnery P. // Mitochondrion. - 2011. - 11(5).

- 686-692

96. Khalifeh S. Complexity of Compensatory Effects in Nrfl Knockdown: Linking Undeveloped Anxiety-Like Behavior to Prevented Mitochondrial Dysfunction and Oxidative Stress / Khalifeh S., Oryan S. and Khodagholi F. // Cell Mol Neurobiol. -2016. - 36(4). - 553-563

97. Brooks-Wilson A. Inherited common variants in mitochondrial DNA and invasive serous epithelial ovarian cancer risk / Brooks-Wilson A., Earp A., Cook L, Le N. // BMC Research Notes. - 2013. - 6(425). - 6

98. Clark E. Selected missense mutations impair frataxin processing in Friedreich ataxia / Clark E., Butler J. and Isaac C. // Ann Clin Transl Neurol. - 2017. - 4(8). - 575584