Молекулярно-генетическая характеристика заболеваний с нарушением целостности митохондриальной ДНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Бычков Игорь Олегович

• Бычков Игорь Олегович
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Бычков Игорь Олегович

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Строение и функции митохондрий и дыхательной цепи

1.2 Общая характеристика митохондриальных заболеваний

1.2.1 Митохондриальные заболевания, ассоциированные с патогенными вариантами в митохондриальном геноме

1.2.2 Митохондриальные заболевания, ассоциированные с патогенными вариантами в ядерном геноме

1.3 Общая характеристика синдромов нарушения целостности мтДНК, классификация

1.4 Основные гены, ответственные за поддержание целостности мтДНК

1.4.1 Ген РОЮ

1.4.2 Ген Т^К

1.4.3 Ген БвиОК

1.4.4 Ген ТК2

1.4.5 Ген ТУИР

1.5 Синдромы, ассоциированные с единичными делециями мтДНК

1.6 Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) для анализа мтДНК

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Объекты исследования

2.2 Методы исследования

2.2.1 Сбор крови и выделение ДНК

2.2.2 ПЦР

2.2.3 Секвенирование нового поколения

2.2.4 Биоинформатический анализ и классификация вариантов неясной клинической значимости

2.2.5 Методика экспрессии минигена

2.2.6 ПЦР длинных фрагментов для анализа делеций мтДНК

2.2.7 Количественная ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ)

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Характеристика генетической гетерогенности ЗНЦМ

3.2 Характеристика клинических фенотипов в исследованной выборке

3.3 Характеристика больных с вариантами в гене РОЬО

3.3.1 Клиническая характеристика больных в возрастной группе 1-12 лет

3.3.2 Клиническая характеристика больных в возрастной группе 12-40 лет

3.3.3 Клиническая характеристика больных в возрастной группе старше 40 лет

3.3.4 Спектр и частоты вариантов в гене РОЬО

3.3.5 Анализ распределения вариантов по функциональным кластерам полимеразы гамма

3.3.6 Неописанные ранее варианты в гене РОЬО

3.4 Характеристика больных с вариантами в гене TWNK

3.4.1 Клиническая характеристика пациентов с вариантами в гене TWNK

3.4.2 Спектр и частоты вариантов в гене TWNK

3.4.3 Неописанные ранее варианты в гене TWNK

3.5 Характеристика больных с вариантами в гене TK2

3.5.1 Клиническая характеристика больных с вариантами в гене ТК2

3.5.2 Спектр и частоты вариантов в гене TK2

3.5.3 Неописанные ранее генетические варианты в гене TK2

3.6 Характеристика больных с вариантами в гене D0U0K

3.6.1 Клиническая характеристика пациентов с вариантами в гене D0U0K

3.6.2 Спектр и частоты вариантов в гене D0U0K

3.6.3 Неописанные ранее генетические варианты в гене D0U0K

3.7 Характеристика больных с более редкими формами заболеваний с нарушением целостности мтДНК

3.7.1 Редкая форма митохондриального заболевания, ассоциированная с вариантами в гене ¥ЕХЬ4

3.7.2 Редкая форма митохондриального заболевания, ассоциированная с вариантами в гене МРУ17

3.7.3 Редкая форма митохондриального заболевания, ассоциированная с вариантами в гене RRM2B

3.7.4 Редкая форма митохондриального заболевания, ассоциированная с вариантами в гене TYMP

3.7.5 Редкая форма митохондриального заболевания, ассоциированная с вариантами в гене ОРА3

3.8 Классификация неописанных ранее генетических вариантов в генах ЗНЦМ в соответствии с критериями ЛСМС

3.9 Разработка методологии количественного и качественного анализа мтДНК

3.9.1 Сравнение количества мтДНК в выборке здоровых контролей в возрасте до 2 лет и старше 2 лет

3.9.2 Количественный анализ мтДНК в группе больных с ЗНЦМ

3.9.3 Качественный анализ мтДНК. Определение делеций мтДНК и уровня гетероплазмии

3.10 Диагностические рекомендации

3.11 Алгоритм диагностики заболеваний с нарушением целостности мтДНК

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Практические рекомендации

Список публикаций по теме диссертации

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активные формы кислорода

АТФ - аденозинтрифосфат

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ЗНЦМ -заболевания с нарушением целостности мтДНК

МЗ - митохондриальные заболевания

мтДНК - митохондриальная ДНК

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЦР-РВ - ПЦР в реальном времени

СДМ - синдром деплеции митохондриальной ДНК

AHS (от англ. Alpers-Huttenloher syndrome) - синдром Альперса-Хуттенлохера

adPEO (от англ. autosomal dominant progressive external ophthalmoplegia)

аутосомно-доминантная прогрессирующая наружная офтальмоплегия

arPEO (от англ. autosomal recessive progressive external ophthalmoplegia)

аутосомно-доминантная прогрессирующая наружная офтальмоплегия

IOSCA (от англ. infantile-onset spinocerebellar ataxia) - синдром младенческой

спиномозжечковой атаксии

KSS - (от англ. Kearns-Sayre syndrome) - синдром Кернса-Сейера

MCHS (от англ. Myocerebrohepatopathy spectrum) - синдром

миоцереброгепатопатии

MELAS - (от англ. mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes) - синдром митохондриальной энцефаломиопатии с лактат-ацидозом и инсультоподобными эпизодами

MERRF - (от англ. myoclonic epilepsy with ragged red fibers) - синдром, сочетающий миоклоническую эпилепсию с «красными рваными волокнами» в мышцах MIRAS - (от англ. mitochondrial recessive ataxia spectrum) - синдром, объединяющий спектр митохондриальных рецессивных атаксий MNGIE (от англ. Mitochondrial neurogastrointestinal encephalopathy syndrome) -синдром митохондриальной нейрогастроинтестинальной энцефаломиопатии

NARP - (от англ. neuropathy, ataxia and retinitis pigmentosa) - синдром, сочетающий нейропатию, атаксию и пигментный ретинит

NGS - (от англ. next generation sequencing) - секвенирование нового поколения PEO (от англ. progressive external ophthalmoplegia) - прогрессирующая наружная офтальмоплегия

PS - (от англ. Pearson syndrome) синдром Пирсона

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическая характеристика заболеваний с нарушением целостности митохондриальной ДНК»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность работы

Митохондриальные заболевания (МЗ) - одна из самых разнообразных и активно изучаемых групп наследственных болезней человека. Описано около 350 генов, патогенные варианты в которых ассоциированы с МЗ [Rahman J., Rahman S. 2018, Stenton S. L., Prokisch H. 2018]. Общая частота МЗ оценивается на данный момент как 1:3225 человек [Tan J. et al. 2020, Ferreira C. R. et al. 2019].

В данной работе рассматривается группа МЗ, ассоциированная с дефектами в ядерных генах, ответственных за поддержание целостности митохондриальной ДНК (мтДНК). Данные заболевания имеют характерные вторичные молекулярные дефекты в пораженных тканях и органах - снижение количества мтДНК (деплеция мтДНК) и/или множественные делеции мтДНК.

Всего на сегодняшний день описано более 25 ядерных генов, патогенные варианты в которых приводят к нарушению целостности мтДНК. Данные гены ответственны за репликацию мтДНК (POLG, POLG2, TWNK, TFAM, RNASEH1, MGME1, DNA2), метаболизм митохондриальных нуклеотидов (TK2, DGUOK, SUCLA2, SUCLG1, ABAT, TYMP, RRM2B, SLC25A4, AGK, MPV17, DTYMK), коммуникацию митохондрий (OPA1, OPA3, MFN2, FBXL4), сборку и деградацию белков митохондрий (GFER, SPG7, AFG3L2), модификации митохондриальной рРНК (MRM2) и транспорт через внутреннюю мембрану митохондрий (SLC25A21, SLC25A10) [Viscomi C., Zeviani M. 2019, El-Hattab A. W. et al. 2018, Garone C. et al. 2017, Boczonadi V. et al. 2018, Punzi G. et al. 2018].

Диагностика МЗ с нарушением целостности мтДНК (ЗНЦМ) осложняется перекрыванием фенотипов, большой генетической гетерогенностью и схожестью с другими наследственными заболеваниями не митохондриальной этиологии. Исследуемая группа заболеваний обладает широким клиническим разнообразием и включает такие полярные фенотипы, как младенческие митохондриальные гепатопатии с острым течением и ранним летальным исходом и взрослые формы изолированной прогрессирующей наружной офтальмоплегии (PEO), практически не влияющие на продолжительность жизни больных.

В лабораторной диагностике ЗНЦМ используются методы измерения копийности мтДНК, а также методы поиска множественных делеций мтДНК в пораженных тканях. Значительное снижение количества мтДНК в различных тканях наблюдается преимущественно у больных с ранними формами ЗНЦМ, а у взрослых больных обнаруживаются множественные делеции мтДНК в мышечной ткани. Показано, что количество мтДНК у больных с ЗНЦМ снижено до 72% от возрастного контроля в образцах крови, до 33% в мышечной ткани и до 8% в ткани печени [Dimmock D. et а1. 2010]. Таким образом, выявление деплеции или делеций мтДНК может сузить группу генов для анализа при молекулярно-генетическом исследовании либо быть использовано при определении патогенности выявленных вариантов и подтверждения диагноза МЗ.

В данной работе представлена молекулярно-генетическая и клиническая характеристика выборки из 109 российских больных с ЗНЦМ и разработка методологии по качественному и количественному анализу мтДНК. Определение спектра, частот патогенных вариантов и специфических клинических подгрупп позволит оптимизировать алгоритм и повысить эффективность молекулярно-генетической диагностики ЗНЦМ в России. Особенно актуальным является характеристика новых, ранее не описанных в России фенотипов ЗНЦМ, некоторые из которых, как например, ГЮ-ассоциированная миопатия, в настоящее время имеют экспериментальную таргетную терапию. Внедрение в практику методологии качественного и количественного анализа мтДНК также значительно повышают эффективность диагностики и дифференциальной диагностики больных с ЗНЦМ.

Степень разработанности темы исследования

По литературным данным ЗНЦМ занимают существенную долю всех МЗ. Частота некоторых форм ЗНЦМ в отдельных странах может доходить до 1 на 5000 человек, однако в России до настоящей работы описано лишь 13 больных с ЗНЦМ [Цыганкова П.Г. 2012]. Эталоном молекулярно-генетической диагностики ЗНЦМ за рубежом является комбинация методов секвенирования нового поколения и анализ характерных вторичных молекулярных дефектов в пораженных тканях -

деплеции и множественных делеций мтДНК. Для некоторых форм ЗНЦМ активно разрабатываются и успешно применяются различные экспериментальные таргетные терапии. На данный момент в РФ отсутствует информация о представленности различных форм ЗНЦМ в общем спектре МЗ, а также отсутствуют практические рекомендации по молекулярно-генетическому исследованию данных заболеваний, что существенно затрудняет диагностику ЗНЦМ.

Цель исследования: изучить молекулярно-генетические и клинические особенности заболеваний с нарушением целостности мтДНК на выборке больных из РФ и оптимизировать методы и алгоритмы лабораторной диагностики данной группы митохондриальных заболеваний.

Задачи исследования:

1. Оценить вклад различных генов, участвующих в поддержании целостности мтДНК в развитие заболеваний с нарушением целостности мтДНК у российских больных.

2. Изучить спектр и частоты генетических вариантов в генах, участвующих в поддержании целостности мтДНК на выборке из 109 больных с установленным молекулярно-генетическим диагнозом заболеваний с нарушением целостности мтДНК.

3. Охарактеризовать основные клинические подгруппы заболеваний с нарушением целостности мтДНК и выделить ключевые симптомы для направления на исследование генов, ассоциированных с данными заболеваниями.

4. Изучить вариации числа копий и длин молекул мтДНК в норме и при патологии в зависимости от возраста. Разработать методики количественного и качественного анализа мтДНК, необходимые для повышения эффективности диагностики заболеваний с нарушением целостности митохондриальной ДНК.

5. На основе выявленных молекулярно-генетических особенностей и основных клинических симптомов предложить способы оптимизации лабораторной диагностики заболеваний с нарушением целостности мтДНК.

Методология и методы исследования

Теоретической основой данного исследования послужили отечественные и зарубежные научные работы в области изучения митохондриальных заболеваний. Выборка для данного исследования сформирована из больных с подтвержденным диагнозом МЗ и условно здоровых индивидуумов, подписавших информированное согласие на участие в исследовании и обработку персональных данных. Проведение данного исследования одобрено этическим комитетом ФГБНУ «МГНЦ».

В работе использованы следующие методы: полимеразная цепная реакция (ПЦР), прямое автоматическое секвенирование по Сэнгеру, массовое параллельное секвенирование, электрофорез ДНК в агарозном и полиакриламидном геле, методы молекулярного клонирования, анализ РНК, методы статистической обработки данных, количественная ПЦР в реальном времени, биоинформатические методы анализа патогенности вариантов.

Положения, выносимые на защиту

1. Показана высокая представленность ЗНЦМ среди всех МЗ. Доля больных с патогенными вариантами в исследуемой группе генов в выборке российских больных с МЗ (п=590) составила 18,5% (п=109).

2. Основными генами, патогенные варианты в которых, приводят к ЗНЦМ в исследуемой выборке являются РОЮ (58% случаев), ТШК (14%), БОПОК (13%), ТК2 (8%). В данных генах выявлены частые варианты и «горячие» экзоны, характерные для российских больных. В гене РОЬО 35% всех выявленных патогенных аллелей составил миссенс-вариант c.2243G>C (p.Trp748Ser). В совокупности с двумя другими частыми патогенными вариантами c.1399G>A (р.А1а467Т^) и с.911Т>0 (р.Ьеи304Л^) - 49%. На долю трёх повторяющихся вариантов в гене ТШК (с.1196Л>0 (р.Лвп3998ег), с.11990>Т (р.Л^400Ьеи) и с.1523Л>0 (р.Туг508СуБ)) приходится 57% выявленных патогенных аллелей в данном гене. Вариант с.30>Л (р.МеШ) в гене ВОЦОК составляет 54% выявленных патогенных аллелей. Поиск данных вариантов лёг в основу

рекомендаций по первому этапу молекулярно-генетической диагностики ЗНЦМ в РФ.

3. Основными клиническими формами ЗНЦМ являются синдром Альперса (12% случаев), синдром миоцереброгепатопатии (16%), взрослые формы рецессивных митохондриальных атаксий (18%) и прогрессирующая наружная офтальмоплегия (14%).

4. Разработанные методологики количественного и качественного анализа мтДНК на основе мультиплексной ПЦР-РВ и ПЦР длинных фрагментов могут быть эффективно использованы на первом этапе диагностики ЗНЦМ. Предложена оптимизация алгоритма молекулярно-генетической диагностики частых форм ЗНЦМ в РФ.

Научная новизна результатов исследования

В ходе настоящей работы впервые в России на большой группе больных с ЗНЦМ (п=109) проведено исследование спектра и частот патогенных вариантов.

Впервые в России описаны больные с патогенными вариантами в генах ^2 (п=9) и TWNK (п=14) и установлен молекулярно-генетический диагноз у больных с доминантной формой прогрессирующей наружной офтальмоплегии. Также впервые в России охарактеризованы особенности спектра патогенных вариантов при взрослых формах .РО£С-обусловленной патологии (п=31). На основе выявленных генетических и клинических особенностей предложена оптимизация алгоритма молекулярно-генетической диагностики данной группы заболеваний.

В исследуемой группе генов охарактеризован 41 ранее не описанный вариант, что значительно расширяет международные базы данных по мутациям человека, учитывая крайне низкую частоту встречаемости данной патологии.

Впервые в России разработана и введена в практику методология качественного и количественного анализа мтДНК, повышающая эффективность диагностики ЗНЦМ.

Теоретическая и практическая значимость

Определение характерного для РФ спектра и частот патогенных вариантов в группе ЗНЦМ позволило оптимизировать в ФГБНУ «МГНЦ» лабораторную диагностику данной группы МЗ.

Введенные в практическую деятельность ФГБНУ «МГНЦ» методы количественного и качественного анализа мтДНК эффективно применяются в дифференциальной диагностике исследуемой группы заболеваний. Обнаружение нарушения целостности мтДНК в пораженных тканях позволяет сузить группу генов для молекулярно-генетического исследования, а также служит дополнительным критерием патогенности при интерпретации вариантов неясной клинической значимости. В случае обнаружения лишь одного патогенного аллеля при подозрении на рецессивный фенотип из данной группы заболеваний, определение качественного или количественного дефекта мтДНК потенциирует поиск второго аллеля более сложными молекулярно-генетическими методами (анализ РНК, полногеномное секвенирование).

Степень достоверности результатов

Основные положения научно-квалификационной работы базируются на материалах первичной документации и полностью им соответствуют. Выводы научно-квалификационной работы Бычкова И.О. соответствуют поставленным задачам. Результаты, получены автором с использованием современных методов (ПЦР-РВ, секвенирование по Сэнгеру, массовое параллельное секвенирование), что свидетельствует о решении поставленных задач. Для анализа результатов привлечено достаточное количество литературы. Выводы объективно и полноценно отражают результаты проведенных исследований.

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на международной конференции по генетике человека «European Society of Human Genetics Conference», Берлин, 6 - 9 июня 2020 г. и международной конференции «Mitochondria and human disease», Стокгольм, 16 - 18 сентября 2019 г.

Работа одобрена этическим комитетом и прошла экспертную комиссию, рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета 24.1.168.01 (Д 001.016.01) при ФБГНУ «МГНЦ».

Личный вклад автора в проведение исследования

Автор изучил данные отечественной и зарубежной научной и медицинской литературы по теме диссертации. Автор принимал непосредственное участие в планировании экспериментов, проведении молекулярно-генетических исследований, анализе клинических и лабораторных данных, а также статистической обработке полученных результатов. Соискатель участвовал в валидации замен, выявленных методом секвенирования нового поколения, проводил анализ полной кодирующей последовательности генов и тесты на частые патогенные варианты. Соискателем лично разработана методика на основе мультиплексной ПЦР в реальном времени для анализа мтДНК. Соискатель лично провёл биоинформатический и функциональный анализ вариантов неясной значимости. Написание всех глав диссертационной работы выполнены автором самостоятельно.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Работа соответствует областям исследования специальности 1.5.7. -Генетика (медицинские науки) - «Генетика человека. Медицинская генетика. Наследственные болезни. Процессы репликации. Популяционная генетика. Генетическая структура популяций. Молекулярные основы наследственности. Мутационная изменчивость».

Публикации

Материалы диссертации представлены в 5 печатных работах соискателя, в том числе 5 статей в журналах (SCOPUS и WoS), рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук.

Структура и объем диссертации

Диссертация имеет следующую структуру: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы. Работа представлена на 158 страницах машинописного текста,

содержит 23 таблицы и 41 рисунок. Список литературы включает в себя 1 31 источник.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Строение и функции митохондрий и дыхательной цепи.

Митохондрии - важнейшие органеллы, содержащиеся практически во всех эукариотических клетках. Основная функция митохондрий - синтез аденозинтрифосфата (АТФ) в процессе окислительного фосфорилирования, проходящего в дыхательной цепи [Harris D. A., Das A. 1991]. Помимо синтеза АТФ, митохондрии участвуют во множестве других процессов, таких как: бета-окисление жирных кислот, цикл трикарбоновых кислот, синтез гема, синтез пуринов и пиримидинов, метаболизм фолиевой кислоты и витамина В12 и метаболизм кардиолипина [Rawat S., Stemmler T. L. 2011, Rustin P. et al. 1997]. Кроме того, митохондрии активно участвуют в процессе апоптоза, выработке активных форм кислорода, продукции тепла и регулировании тока ионов кальция [Chipuk J. et al. 2006].

Митохондрии - двухмембранные органеллы. Внутренняя мембрана образует складки - кристы, на которых расположены комплексы дыхательной цепи митохондрий (рисунок 1). Дыхательной цепью митохондрий называется цепь последовательных окислительно-восстановительных реакций, при которых электроны перемещаются от исходного донора молекулы NAD-H к терминальному акцептору кислороду. Процесс передачи электрона проходит при участии белковых молекул-переносчиков, встроенных во внутреннюю мембрану митохондрий и образующих дыхательные комплексы [Letts J. A., Sazanov L. A. 2017]. Выделяемая при этом процессе энергия используется для транспортировки протонов в межмембранное пространство. Перемещение протонов по электрохимическому градиенту из межмембранного пространства в цитоплазму происходит через фермент АТФ-синтазу, использующую их энергию на синтез молекулы АТФ из АДФ и фосфата.

В функционировании митохондрий участвуют около 1500 различных белков [Pagliarini D. J. et al. 2008]. Большинство из них кодируется ядерным геномом, а 13, являющиеся структурными субъединицами комплексов дыхательной цепи -

митохондриальным. Так же митохондриальный геном содержит гены митохондриальных тРНК, рРНК и малых пептидов.

Комплекс I Комплекс II Комплекс III Комплекс IV Комплекс V

Цитохром С

Рисунок 1. Строение дыхательной цепи митохондрий. Переведено из [Letts J. A., Sazanov L. A. 2017]. Комплекс I - NADH-дегидрогеназа, комплекс II -сукцинатдегидрогеназа, комплекс III - убихинол-цитохром с-редуктаза, комплекс IV - цитохром с-оксидаза, комплекс V - АТФ-синтаза.

Для митохондриального генома характерно несколько особенностей:

1) Т.к. в митохондрии присутствует множество копий мтДНК, патогенный вариант может присутствовать либо во всех её копиях (термин гомоплазмия), либо в их части (термин гетероплазмия). Уровень гетероплазмии оказывает прямое модифицирующее влияние на первичный генетический дефект и фенотип больного.

2) Митохондриальный геном постоянно реплицируется, вне зависимости от клеточного цикла.

3) Гены мтДНК транскрибируются в виде полицистронных транскриптов без интронов и далее подвергаются процессингу.

4) Митохондрии являются крайне динамичными органеллами и постоянно делятся и сливаются между собой. Данный процесс имеет важное значение для поддержания их гомеостаза и целостности мтДНК.

5) мтДНК имеет более высокую частоту возникновения патогенных вариантов, чем ядерный геном и накапливает их с возрастом.

6) Некоторые варианты в гомоплазмическом состоянии формируют гаплогруппы, которые наследуются по материнской линии.

1.2 Общая характеристика митохондриальных заболеваний

Термин МЗ включает в себя множество различных заболеваний, сопровождающихся нарушением функций митохондрий и производства энергии [Gorman G. S. et al. 2016]. МЗ являются наиболее распространенной группой наследственных болезней обмена веществ с минимальной частотой среди взрослых 12,5 на 100000 и 4,7 на 100000 среди детей [Gorman G. S. et al. 2015, Skladal D. et al. 2003]. Причинами МЗ являются патогенные варианты как в митохондриальных, так и в ядерных генах. На данный момент описано более 350 генов, нарушение функции которых, приводят к МЗ [Rahman J., Rahman S. 2018, Frazier A. E. et al. 2019].

МЗ могут манифестировать в любом возрасте с широкого спектра симптомов различной тяжести. Пример широкой фенотипической гетерогенности МЗ ярко продемонстрирован при недостаточности комплекса I, когда такие полярные фенотипы, как изолированное поражение глаз при оптической нейропатии Лебера и тяжёлый младенческий синдром Ли с некротической энцефалопатией могут быть вызваны одним и тем же патогенным вариантом [Miyaue N. et al. 2019]. С другой стороны, синдром Ли, с которым ассоциированы варианты более чем в 90 генах, отражает широкую генетическую гетерогенность МЗ. Исторически, при классификации МЗ выделялись различные синдромальные фенотипы, характеризующиеся несколькими преобладающими симптомами (например, синдром Альперса-Хуттенлохера характеризуется прогрессирующей энцефалопатией с регрессом психомоторного развития, рефрактерной эпилепсией и специфическим поражением печени). Но, с увеличением количества выявляемых пациентов с МЗ, стало очевидно, что фенотипический спектр МЗ представляет собой скорее континуум, нежели отдельные фенотипы.

Основными симптомами МЗ могут являться:

1) Со стороны мышечной системы: миопатия, мышечная гипотрофия или атрофия, мышечная дистония, слабость лицевой мускулатуры.

2) Со стороны нервной системы: задержка, регресс моторного развития, атаксия, бульбарный синдром, пирамидные симптомы, экстрапирамидные нарушения, полинейропатия, тремор, птоз, офтальмопарез, офтальмоплегия, атрофия зрительного нерва, пигментная дегенерация сетчатки, нейросенсорная тугоухость, судороги.

3) Со стороны сердечно-сосудистой системы: нарушение сердечного ритма, гипертрофическая и дилатационная кардиомиопатия.

4) Со стороны эндокринной системы: сахарный диабет, нарушение экзокринной функции поджелудочной железы, гипопаратиреоз.

5) Со стороны печени: фиброз, микро- и макровизикулярный стеатоз, нарушение дольково-балочной системы, холестаз, острая печеночная недостаточность, цирроз печени.

6) Со стороны желудочно-кишечного тракта: диарея и псевдообструкция.

7) Со стороны мочевыделительной системы: атония мочевого пузыря, тубулопатия.

Среди лабораторных и радиологических признаков МЗ выделяют:

1) Повышение концентрации лактата в крови, в особенности после нагрузки глюкозой. Однако, диагностическую ценность имеет только наличие высокого и постоянного лактат-ацидоза. Многие детские и взрослые формы МЗ протекают с нормальной концентрацией лактата в крови, по крайней мере на ранних стадиях заболевания.

2) Повышение концентрации метаболитов цикла Кребса в моче. Примерно у половины больных с МЗ младенческого и детского возраста наблюдаются вторичные нарушения в цикле трикарбоновых кислот: повышение в моче кетоновых тел, 3-гидроксибутирата, фумаровой, изовалериановой кислот, 4-гидроксифениллактата, лактата, пирувата. Анализ спектра органических кислот в

моче используется как дополнительный диагностический критерий, а также может быть применим для контроля лечения.

3) Четко очерченные гиперинтенсивные в Т2-режиме симметричные очаги в подкорковых ядрах на МРТ головного мозга характерны для многих форм МЗ. Особенно часто данное поражение встречается при синдроме Ли. Базальные ганглии чрезвычайно чувствительны к нарушениям энергетического обмена, также часто у пациентов наблюдаются аналогичные очаги в стволе мозга, ножках мозга, мозжечке. Часто возникают и другие патологии головного мозга: пороки развития, лейкоэнцефалопатия, инфаркты.

4) Гистохимические и биохимические изменения в мышечной ткани, отражающие нарушения в работе ДЦМ, являются ярким диагностическим критерием МЗ. Лабораторные тесты, выявляющие данные изменения, уже более 20 лет используются при диагностике МЗ, особенно в группах пациентов взрослого возраста. Мышечная ткань может вовлекаться в патологический процесс при патогенных вариантах как в мтДНК, так и в ядерной ДНК и служит отличным материалом для изучения всего спектра МЗ [Alston C. L. et al. 2017]. Характерным гистохимическим признаком МЗ является наличие «красных рваных волокон» с аномальным расположением митохондрий при модифицированной окраске по Гомори образцов мышечной ткани. Также гистохимически оценивается активность комплексов ДЦМ - цитохром-с-оксидазы и сукцинат дегидрогеназы.

5) Для диагностики группы ЗНЦМ используются также различные тесты, выявляющие характерный вторичный молекулярный дефект - делеции или деплецию мтДНК. Для этой цели в последнее время применяются методы массового параллельного секвенирования, ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ), ПЦР длинных фрагментов мтДНК или капельная цифровая ПЦР (Droplet digital PCR).

1.2.1 Митохондриальные заболевания, ассоциированные с патогенными вариантами в митохондриальном геноме

Данная группа МЗ является преобладающей и составляет 80% от всех первичных МЗ [Gorman G. S. et al. 2016]. Помимо точковых патогенных вариантов в мтДНК, причинами МЗ довольно часто являются единичные делеции различной протяженности в гетероплазмическом состоянии [Adam M. et al.]. Более 300 патогенных вариантов в мтДНК описано на данный момент в базе данных https://www.mitomap.org.

Для МЗ, ассоциированных с патогенными вариантами в митохондриальном геноме, характерен материнский тип наследования и феномен гетероплазмии. Уровень гетероплазмии для определенного варианта может варьировать как среди родственников, так и в различных тканях одного больного, изменяясь со временем. Для некоторых патогенных вариантов уровень гетероплазмии должен превысить определенный порог, необходимый для проявления симптомов заболевания. Для тяжелых форм заболеваний этот порог составляет 70-80%, однако он может значительно отличаться в зависимости от варианта. Вариабельность симптоматики зачастую демонстрируется на примере варианта m.3243A>G, который при уровне гетероплазмии <10% приводит к диабету с глухотой, при уровне ~50% приводит к синдрому MELAS (от англ. mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis and stroke-like episodes - синдром митохондриальной энцефаломиопатии с лактат-ацидозом и инсультоподобными эпизодами), а при уровне >90% к синдрому Ли [Pickett S. J. et al. 2018, Grady J. 2018]. С другой стороны, описаны случаи, когда высокий уровень гетероплазмии или гомоплазмия ассоциированы с мягким фенотипом или его отсутствием [Stendel C. et al. 2020].

Генетическая классификация МЗ, ассоциированных с патогенными вариантами в митохондриальном геноме представлена в таблице 1.

Таблица 1

Генетическая классификация МЗ, ассоциированных с патогенными вариантами в

митохондриальном геноме

Классификация Фенотипы и варианты в мтДНК

Перестройки (делеции и дупликации) • Хроническая прогрессирующая наружная офтальмоплегия (CPEO) • Синдром Кернса-Сейера (KSS) • Диабет и глухота

Точковые варианты в белок-кодирующих генах • Оптическая нейропатия Лебера (LHON) (m.11778G>A, m.14484T>C, m.3460G>A) • Нейрогенная слабость с/без атаксией и пигментной дегенерацией сетчатки (NARP) (m.8993T>G, m.8993T>C)

Варианты в генах тРНК • Синдром MELAS (m.3243A>G, m.3271T>C, m.3251A>G) • Синдром MERRF (m.8344A>G, m.8356T>C) • CPEO (m.3243A>G, m.4274T>C) • Миопатия (m.14709T>C, m.12320A>G) • Кардиомиопатия (m.3243A>G, m.4269A>G) • Диабет и глухота (m.3243A>G, m.12258C>A) • Энцефаломиопатия (m. 1606G>A, m.10010T>C) • Несиндромальная сенсонейральная глухота (m.7445A>G)

Варианты в генах рРНК • Несиндромальная глухота индуцированная аминогликозидами (m.1555A>G)

1.2.2 Митохондриальные заболевания, ассоциированные с патогенными вариантами в ядерном геноме

Основные гены, участвующие в биогенезе митохондрий и ассоциированные с МЗ, можно разделить на 3 большие группы:

1) Гены кодирующие компоненты дыхательной цепи митохондрий, либо участвующие в их трансляции и сборке.

2) Гены, участвующие в поддержании целостности мтДНК. Данные гены в основном кодируют белки, участвующие в репликации и репарации мтДНК и белки, ответственные за метаболизм митохондриальных нуклеотидов. Нарушение их функции приводит к вторичным количественным или качественным изменениям мтДНК.

3) Гены, участвующие в метаболизме кофакторов, токсичных соединений и поддержании гомеостаза митохондрий.

Генетическая классификация МЗ, ассоциированных с патогенными вариантами в ядерном геноме представлена в таблице 2.

Таблица 2

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Бычков Игорь Олегович, 2021 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Rahman J., Rahman S. Mitochondrial medicine in the omics era // The Lancet. - 2018.

- T. 391, № 10139. - C. 2560-2574.

2. Stenton S. L., Prokisch H. Advancing genomic approaches to the molecular diagnosis of mitochondrial disease // Essays in biochemistry. - 2018. - T. 62, № 3. - C. 399 -408.

3. Tan J., Wagner M., Stenton S. L., Strom T. M., Wortmann S. B., Prokisch H., Meitinger T., Oexle K., Klopstock T. Lifetime risk of autosomal recessive mitochondrial disorders calculated from genetic databases // EBioMedicine. - 2020. - T. 54. - C. 102730.

4. Ferreira C. R., van Karnebeek C. D., Vockley J., Blau N. A proposed nosology of inborn errors of metabolism // Genetics in Medicine. - 2019. - T. 21, № 1. - C. 102-106.

5. Viscomi C., Zeviani M. MtDNA-maintenance defects: syndromes and genes // J Inherit Metab Dis. - 2017. - T. 40, № 4. - C. 587-599.

6. El-Hattab A. W., Craigen W. J., Wong L.-J. C., Scaglia F. Mitochondrial DNA Maintenance Defects Overview // GeneReviews®[Internet]University of Washington, Seattle, 2018.

7. Garone C., D'Souza A. R., Dallabona C., Lodi T., Rebelo-Guiomar P., Rorbach J., Donati M. A., Procopio E., Montomoli M., Guerrini R., Zeviani M., Calvo S. E., Mootha V. K., DiMauro S., Ferrero I., Minczuk M. Defective mitochondrial rRNA methyltransferase MRM2 causes MELAS-like clinical syndrome // Hum Mol Genet. -2017. - T. 26, № 21. - C. 4257-4266.

8. Boczonadi V., King M. S., Smith A. C., Olahova M., Bansagi B., Roos A., Eyassu F., Borchers C., Ramesh V., Lochmuller H., Polvikoski T., Whittaker R. G., Pyle A., Griffin H., Taylor R. W., Chinnery P. F., Robinson A. J., Kunji E. R. S., Horvath R. Mitochondrial oxodicarboxylate carrier deficiency is associated with mitochondrial DNA depletion and spinal muscular atrophy-like disease // Genet Med. - 2018. - T. 20, № 10.

- C. 1224-1235.

9. Punzi G., Porcelli V., Ruggiu M., Hossain M. F., Menga A., Scarcia P., Castegna A., Gorgoglione R., Pierri C. L., Laera L., Lasorsa F. M., Paradies E., Pisano I., Marobbio C. M. T., Lamantea E., Ghezzi D., Tiranti V., Giannattasio S., Donati M. A., Guerrini R., Palmieri L., Palmieri F., De Grassi A. SLC25A10 biallelic mutations in intractable epileptic encephalopathy with complex I deficiency // Hum Mol Genet. - 2018. - T. 27, № 3. - C. 499-504.

10. Dimmock D., Tang L. Y., Schmitt E. S., Wong L. J. Quantitative evaluation of the mitochondrial DNA depletion syndrome // Clin Chem. - 2010. - T. 56, № 7. - C. 111927.

11. Цыганкова П. Г. Молекулярно-генетическая характеристика болезней дыхательной цепи митохондрий у детей; Медико-генетический научный центр Российской академии медицинских наук, 2012.

12. Harris D. A., Das A. Control of mitochondrial ATP synthesis in the heart // Biochemical Journal. - 1991. - T. 280, № 3. - C. 561-573.

13. Rawat S., Stemmler T. L. Key players and their role during mitochondrial iron-sulfur cluster biosynthesis // Chemistry-A European Journal. - 2011. - T. 17, № 3. - C. 746753.

14. Rustin P., Bourgeron T., Parfait B., Chretien D., Munnich A., Rötig A. Inborn errors of the Krebs cycle: a group of unusual mitochondrial diseases in human // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. - 1997. - T. 1361, № 2. - C. 185197.

15. Chipuk J., Bouchier-Hayes L., Green D. Mitochondrial outer membrane permeabilization during apoptosis: the innocent bystander scenario // Cell Death & Differentiation. - 2006. - T. 13, № 8. - C. 1396-1402.

16. Letts J. A., Sazanov L. A. Clarifying the supercomplex: the higher-order organization of the mitochondrial electron transport chain // Nature structural & molecular biology. -2017. - T. 24, № 10. - C. 800-808.

17. Pagliarini D. J., Calvo S. E., Chang B., Sheth S. A., Vafai S. B., Ong S.-E., Walford G. A., Sugiana C., Boneh A., Chen W. K. A mitochondrial protein compendium elucidates complex I disease biology // Cell. - 2008. - T. 134, № 1. - C. 112-123.

18. Gorman G. S., Chinnery P. F., DiMauro S., Hirano M., Koga Y., McFarland R., Suomalainen A., Thorburn D. R., Zeviani M., Turnbull D. M. Mitochondrial diseases // Nature reviews Disease primers. - 2016. - T. 2, № 1. - C. 1-22.

19. Gorman G. S., Schaefer A. M., Ng Y., Gomez N., Blakely E. L., Alston C. L., Feeney C., Horvath R., Yu-Wai-Man P., Chinnery P. F. Prevalence of nuclear and mitochondrial DNA mutations related to adult mitochondrial disease // Annals of neurology. - 2015. -T. 77, № 5. - C. 753-759.

20. Skladal D., Halliday J., Thorburn D. R. Minimum birth prevalence of mitochondrial respiratory chain disorders in children // Brain. - 2003. - T. 126, № 8. - C. 1905-1912.

21. Frazier A. E., Thorburn D. R., Compton A. G. Mitochondrial energy generation disorders: genes, mechanisms, and clues to pathology // Journal of Biological Chemistry. - 2019. - T. 294, № 14. - C. 5386-5395.

22. Miyaue N., Yamanishi Y., Tada S., Ando R., Yabe H., Nagai M., Nomoto M. Repetitive brainstem lesions in mitochondrial DNA 11778G> A mutation of Leber hereditary optic neuropathy // Eneurologicalsci. - 2019. - T. 14. - C. 74.

23. Alston C. L., Rocha M. C., Lax N. Z., Turnbull D. M., Taylor R. W. The genetics and pathology of mitochondrial disease // The Journal of pathology. - 2017. - T. 241, № 2. -C. 236-250.

24. Adam M., Ardinger H., Pagon R., Wallace S., Bean L., Stephens K., Amemiya A. Mitochondrial DNA Deletion Syndromes--GeneReviews® //.

25. Pickett S. J., Grady J. P., Ng Y. S., Gorman G. S., Schaefer A. M., Wilson I. J., Cordell H. J., Turnbull D. M., Taylor R. W., McFarland R. Phenotypic heterogeneity in m. 3243A> G mitochondrial disease: the role of nuclear factors // Annals of clinical and translational neurology. - 2018. - T. 5, № 3. - C. 333-345.

26. Grady J. mtDNA heteroplasmy level and copy number indicate disease burden in m. 3243A> G mitochondrial disease. EMBO Mol. Med // Book mtDNA heteroplasmy level and copy number indicate disease burden in m. 3243A> G mitochondrial disease. EMBO Mol. Med / Editor, 2018.

27. Stendel C., Neuhofer C., Floride E., Yuqing S., Ganetzky R. D., Park J., Freisinger P., Kornblum C., Kleinle S., Schöls L. Delineating MT-ATP6-associated disease: From

isolated neuropathy to early onset neurodegeneration // Neurology Genetics. - 2020. - T. 6, № 1.

28. Wedatilake Y., Brown R. M., McFarland R., Yaplito-Lee J., Morris A. A., Champion M., Jardine P. E., Clarke A., Thorburn D. R., Taylor R. W. SURF1 deficiency: a multicentre natural history study // Orphanet journal of rare diseases. - 2013. - T. 8, № 1. - C. 1-13.

29. Rajakulendran S., Pitceathly R. D., Taanman J.-W., Costello H., Sweeney M. G., Woodward C. E., Jaunmuktane Z., Holton J. L., Jacques T. S., Harding B. N. A clinical, neuropathological and genetic study of homozygous A467T POLG-related mitochondrial disease // PLoS One. - 2016. - T. 11, № 1. - C. e0145500.

30. Remes A., Hinttala R., Kärppä M., Soini H., Takalo R., Uusimaa J., Majamaa K. Parkinsonism associated with the homozygous W748S mutation in the POLG1 gene // Parkinsonism & related disorders. - 2008. - T. 14, № 8. - C. 652-654.

31. Uusimaa J., Hinttala R., Rantala H., Päivärinta M., Herva R., Röyttä M., Soini H., Moilanen J. S., Remes A. M., Hassinen I. E. Homozygous W748S mutation in the POLG1 gene in patients with juvenile-onset Alpers syndrome and status epilepticus // Epileps ia. - 2008. - T. 49, № 6. - C. 1038-1045.

32. Moraes C. T., DiMauro S., Zeviani M., Lombes A., Shanske S., Miranda A. F., Nakase H., Bonilla E., Werneck L. C., Servidei S. Mitochondrial DNA deletions in progressive external ophthalmoplegia and Kearns-Sayre syndrome // New England Journal of Medicine. - 1989. - T. 320, № 20. - C. 1293-1299.

33. Moraes C. T., Shanske S., Tritschler H. J., Aprille J. R., Andreetta F., Bonilla E., Schon E. A., DiMauro S. mtDNA depletion with variable tissue expression: a novel genetic abnormality in mitochondrial diseases // American journal of human genetics. -1991. - T. 48, № 3. - C. 492.

34. Hirano M., Garcia-de-Yebenes J., Jones A. C., Nishino I., DiMauro S., Carlo J. R., Bender A. N., Hahn A. F., Salberg L. M., Weeks D. E. Mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy syndrome maps to chromosome 22q13. 32-qter // The American Journal of Human Genetics. - 1998. - T. 63, № 2. - C. 526-533.

35. Saada A., Shaag A., Mandel H., Nevo Y., Eriksson S., Elpeleg O. Mutant mitochondrial thymidine kinase in mitochondrial DNA depletion myopathy // Nature genetics. - 2001. - T. 29, № 3. - C. 342-344.

36. Mandel H., Szargel R., Labay V., Elpeleg O., Saada A., Shalata A., Anbinder Y., Berkowitz D., Hartman C., Barak M. The deoxyguanosine kinase gene is mutated in individuals with depleted hepatocerebral mitochondrial DNA // Nature genetics. - 2001.

- T. 29, № 3. - C. 337-341.

37. Naviaux R. K., Nguyen K. V. POLG mutations associated with Alpers' syndrome and mitochondrial DNA depletion // Annals of Neurology: Official Journal of the American Neurological Association and the Child Neurology Society. - 2004. - T. 55, № 5. - C. 706-712.

38. Young M. J., Copeland W. C. Human mitochondrial DNA replication machinery and disease // Current opinion in genetics & development. - 2016. - T. 38. - C. 52-62.

39. Saneto R. P., Naviaux R. K. Polymerase gamma disease through the ages // Dev Disabil Res Rev. - 2010. - T. 16, № 2. - C. 163-74.

40. Woodbridge P., Liang C., Davis R., Vandebona H., Sue C. POLG mutations in A ustralian patients with mitochondrial disease // Internal medicine journal. - 2013. - T. 43, № 2. - C. 150-156.

41. Bugiardini E., Poole O. V., Manole A., Pittman A. M., Horga A., Hargreaves I., Woodward C. E., Sweeney M. G., Holton J. L., Taanman J.-W. Clinicopathologic and molecular spectrum of RNASEH1-related mitochondrial disease // Neurology Genetics.

- 2017. - T. 3, № 3.

42. Schicks J., Synofzik M., Schulte C., Schöls L. POLG, but not PEO1, is a frequent cause of cerebellar ataxia in Central Europe // Movement disorders. - 2010. - T. 25, № 15. - C. 2678-2682.

43. Rahman S. Mitochondrial disease and epilepsy // Developmental Medicine & Child Neurology. - 2012. - T. 54, № 5. - C. 397-406.

44. Hikmat O., Naess K., Engvall M., Klingenberg C., Rasmussen M., Tallaksen C. M., Brodtkorb E., Ostergaard E., de Coo I. F. M., Pias-Peleteiro L., Isohanni P., Uusimaa J., Darin N., Rahman S., Bindoff L. A. Simplifying the clinical classification of polymerase

gamma (POLG) disease based on age of onset; studies using a cohort of 155 cases // J Inherit Metab Dis. - 2020.10.1002/jimd.12211.

45. Harding B. N. Progressive neuronal degeneration of childhood with liver disease (Alpers-Huttenlocher syndrome): a personal review // Journal of child neurology. - 1990.

- T. 5, № 4. - C. 273-287.

46. Visser N., Braun K., Van den Bergh W., Leijten F., Willems C., Ramos L., van den Bosch B., Smeets H., Wokke J. Juvenile-onset Alpers syndrome: interpreting MRI findings // Neurology. - 2010. - T. 74, № 15. - C. 1231-1233.

47. Wiltshire E., Davidzon G., DiMauro S., Akman H. O., Sadleir L., Haas L., Zuccollo J., McEwen A., Thorburn D. R. Juvenile Alpers disease // Archives of neurology. - 2008.

- T. 65, № 1. - C. 121-124.

48. Isohanni P., Hakonen A. H., Euro L., Paetau I., Linnankivi T., Liukkonen E., Wallden T., Luostarinen L., Valanne L., Paetau A. POLG1 manifestations in childhood // Neurology. - 2011. - T. 76, № 9. - C. 811-815.

49. Hikmat O., Tzoulis C., Chong W. K., Chentouf L., Klingenberg C., Fratter C., Carr L. J., Prabhakar P., Kumaraguru N., Gissen P. The clinical spectrum and natural history of early-onset diseases due to DNA polymerase gamma mutations // Genetics in Medicine. - 2017. - T. 19, № 11. - C. 1217-1225.

50. Farnum G. A., Nurminen A., Kaguni L. S. Mapping 136 pathogenic mutations into functional modules in human DNA polymerase y establishes predictive genotype-phenotype correlations for the complete spectrum of POLG syndromes // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Bioenergetics. - 2014. - T. 1837, № 7. - C. 1113-1121.

51. Lee Y.-S., Kennedy W. D., Yin Y. W. Structural insight into processive human mitochondrial DNA synthesis and disease-related polymerase mutations // Cell. - 2009.

- T. 139, № 2. - C. 312-324.

52. Euro L., Farnum G. A., Palin E., Suomalainen A., Kaguni L. S. Clustering of Alpers disease mutations and catalytic defects in biochemical variants reveal new features of molecular mechanism of the human mitochondrial replicase, Pol y // Nucleic acids research. - 2011. - T. 39, № 21. - C. 9072-9084.

53. Nurminen A., Farnum G. A., Kaguni L. S. Pathogenicity in POLG syndromes: DNA polymerase gamma pathogenicity prediction server and database // BBA clinical. - 2017. - T. 7. - C. 147-156.

54. Winterthun S., Ferrari G., He L., Taylor R., Zeviani M., Turnbull D., Engelsen B., Moen G., Bindoff L. A. Autosomal recessive mitochondrial ataxic syndrome due to mitochondrial polymerase y mutations // Neurology. - 2005. - T. 64, № 7. - C. 12041208.

55. Hakonen A. H., Heiskanen S., Juvonen V., Lappalainen I., Luoma P. T., Rantamäki M., Van Goethem G., Löfgren A., Hackman P., Paetau A. Mitochondrial DNA polymerase W748S mutation: a common cause of autosomal recessive ataxia with ancient European origin // The American Journal of Human Genetics. - 2005. - T. 77, № 3. - C. 430-441.

56. Horvath R., Hudson G., Ferrari G., Fütterer N., Ahola S., Lamantea E., Prokisch H., Lochmüller H., McFarland R., Ramesh V. Phenotypic spectrum associated with mutations of the mitochondrial polymerase y gene // Brain. - 2006. - T. 129, № 7. - C. 1674-1684.

57. Saneto R. P., Naviaux R. K. Polymerase gamma disease through the ages // Developmental disabilities research reviews. - 2010. - T. 16, № 2. - C. 163-174.

58. Korhonen J. A., Pham X. H., Pellegrini M., Falkenberg M. Reconstitution of a minimal mtDNA replisome in vitro // The EMBO journal. - 2004. - T. 23, № 12. - C. 2423-2429.

59. Spelbrink J. N., Li F.-Y., Tiranti V., Nikali K., Yuan Q.-P., Tariq M., Wanrooij S., Garrido N., Comi G., Morandi L. Human mitochondrial DNA deletions associated with mutations in the gene encoding Twinkle, a phage T7 gene 4-like protein localized in mitochondria // Nature genetics. - 2001. - T. 28, № 3. - C. 223-231.

60. Shutt T. E., Gray M. W. Bacteriophage origins of mitochondrial replication and transcription proteins // Trends in Genetics. - 2006. - T. 22, № 2. - C. 90-95.

61. Morino H., Pierce S. B., Matsuda Y., Walsh T., Ohsawa R., Newby M., Hiraki-Kamon K., Kuramochi M., Lee M. K., Klevit R. E. Mutations in Twinkle primase-helicase cause

Perrault syndrome with neurologic features // Neurology. - 2014. - T. 83, № 22. - C. 2054-2061.

62. Peter B., Farge G., Pardo-Hernandez C., Tangefjjord S., Falkenberg M. Structural basis for adPEO-causing mutations in the mitochondrial TWINKLE helicase // Human molecular genetics. - 2019. - T. 28, № 7. - C. 1090-1099.

63. Longley M. J., Humble M. M., Sharief F. S., Copeland W. C. Disease variants of the human mitochondrial DNA helicase encoded by C10orf2 differentially alter protein stability, nucleotide hydrolysis, and helicase activity // Journal of Biological Chemistry.

- 2010. - T. 285, № 39. - C. 29690-29702.

64. Holmlund T., Farge G., Pande V., Korhonen J., Nilsson L., Falkenberg M. Structure -function defects of the twinkle amino-terminal region in progressive external ophthalmoplegia // Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Molecular Basis of Disease. -2009. - T. 1792, № 2. - C. 132-139.

65. Goffart S., Cooper H. M., Tyynismaa H., Wanrooij S., Suomalainen A., Spelbrink J. N. Twinkle mutations associated with autosomal dominant progressive external ophthalmoplegia lead to impaired helicase function and in vivo mtDNA replication stalling // Human molecular genetics. - 2009. - T. 18, № 2. - C. 328-340.

66. Tyynismaa H., Mjosund K. P., Wanrooij S., Lappalainen I., Ylikallio E., Jalanko A., Spelbrink J. N., Paetau A., Suomalainen A. Mutant mitochondrial helicase Twinkle causes multiple mtDNA deletions and a late-onset mitochondrial disease in mice // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2005. - T. 102, № 49. - C. 17687 -17692.

67. Jüllig M., Eriksson S. Mitochondrial and submitochondrial localization of human deoxyguanosine kinase // European journal of biochemistry. - 2000. - T. 267, № 17. - C. 5466-5472.

68. Ronchi D., Garone C., Bordoni A., Gutierrez Rios P., Calvo S. E., Ripolone M., Ranieri M., Rizzuti M., Villa L., Magri F. Next-generation sequencing reveals DGUOK mutations in adult patients with mitochondrial DNA multiple deletions // Brain. - 2012.

- T. 135, № 11. - C. 3404-3415.

69. Freisinger P., Fütterer N., Lankes E., Gempel K., Berger T. M., Spalinger J., Hoerbe A., Schwantes C., Lindner M., Santer R. Hepatocerebral mitochondrial DNA depletion syndrome caused by deoxyguanosine kinase (DGUOK) mutations // Archives of neurology. - 2006. - T. 63, № 8. - C. 1129-1134.

70. Labarthe F., Dobbelaere D., Devisme L., De Muret A., Jardel C., Taanman J.-W., Gottrand F., Lombés A. Clinical, biochemical and morphological features of hepatocerebral syndrome with mitochondrial DNA depletion due to deoxyguanosine kinase deficiency // Journal of hepatology. - 2005. - T. 43, № 2. - C. 333-341.

71. Taanman J.-W., Padet S., Chassagne M., Mayen5on M., Clerc-Renaud P., Mandon G., Zabot M.-T., Lachaux A., Bozon D. Kinetic properties of mutant deoxyguanosine kinase in a case of reversible hepatic mtDNA depletion // Biochemical Journal. - 2007. -T. 402, № 2. - C. 377-385.

72. Garone C., Taylor R. W., Nascimento A., Poulton J., Fratter C., Domínguez-González C., Evans J. C., Loos M., Isohanni P., Suomalainen A. Retrospective natural history of thymidine kinase 2 deficiency // Journal of medical genet ics. - 2018. - T. 55, № 8. - C. 515-521.

73. Lopez-Gomez C., Levy R. J., Sanchez-Quintero M. J., Juanola-Falgarona M., Barca E., Garcia-Diaz B., Tadesse S., Garone C., Hirano M. Deoxycytidine and deoxythymidine treatment for thymidine kinase 2 deficiency / / Annals of neurology. - 2017. - T. 81, № 5. - C. 641-652.

74. Domínguez-González C., Madruga-Garrido M., Mavillard F., Garone C., Aguirre-Rodríguez F. J., Donati M. A., Kleinsteuber K., Martí I., Martín-Hernández E., Morealejo-Aycinena J. P. Deoxynucleoside therapy for thymidine kinase 2-deficient myopathy // Annals of neurology. - 2019. - T. 86, № 2. - C. 293-303.

75. Pacitti D., Levene M., Garone C., Nirmalananthan N., Bax B. E. Mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy: into the fourth decade, what we have learned so far // Frontiers in genetics. - 2018. - T. 9. - C. 669.

76. Garone C., Tadesse S., Hirano M. Clinical and genetic spectrum of mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy // Brain. - 2011. - T. 134, № 11. - C. 3326 -3332.

77. Giordano C., Sebastiani M., De Giorgio R., Travaglini C., Tancredi A., Valentino M. L., Bellan M., Cossarizza A., Hirano M., d'Amati G. Gastrointestinal dysmotility in mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy is caused by mitochondrial DNA depletion // The American journal of pathology. - 2008. - T. 173, № 4. - C. 1120 -1128.

78. Marti R., Spinazzola A., Tadesse S., Nishino I., Nishigaki Y., Hirano M. Definitive diagnosis of mitochondrial neurogastrointestinal encephalomyopathy by biochemical assays // Clinical chemistry. - 2004. - T. 50, № 1. - C. 120-124.

79. Pitceathly R., Rahman S., Hanna M. Single deletions in mitochondrial DNA -molecular mechanisms and disease phenotypes in clinical practice // Neuromuscular Disorders. - 2012. - T. 22, № 7. - C. 577-586.

80. Grady J. P., Campbell G., Ratnaike T., Blakely E. L., Falkous G., Nesbitt V., Schaefer A. M., McNally R. J., Gorman G. S., Taylor R. W. Disease progression in patients with single, large-scale mitochondrial DNA deletions // Brain. - 2014. - T. 137, № 2. - C. 323-334.

81. Menshikova E. V., Ritov V. B., Fairfull L., Ferrell R. E., Kelley D. E., Goodpaster B. H. Effects of exercise on mitochondrial content and function in aging human skeletal muscle // The Journals of Gerontology Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. - 2006. - T. 61, № 6. - C. 534-540.

82. Malik A. N., Czajka A. Is mitochondrial DNA content a potential biomarker of mitochondrial dysfunction? // Mitochondrion. - 2013. - T. 13, № 5. - C. 481-492.

83. Moslemi A.-R., Tulinius M., Holme E., Oldfors A. Threshold expression of the tRNA lys A8344G mutation in single muscle fibres // Neuromuscular Disorders. - 1997. - T. 6, № 7. - C. 450.

84. Wong L. C., Perng C., Hsu C., Bai R., Schelley S., Vladutiu G., Vogel H., Enns G. Compensatory amplification of mtDNA in a patient with a novel deletion/duplication and high mutant load // Journal of medical genetics. - 2003. - T. 40, № 11. - C. e125 -e125.

85. Giordano C., Iommarini L., Giordano L., Maresca A., Pisano A., Valentino M. L., Caporali L., Liguori R., Deceglie S., Roberti M. Efficient mitochondrial biogenesis drives

incomplete penetrance in Leber's hereditary optic neuropathy // Brain. - 2014. - T. 137, № 2. - C. 335-353.

86. Schaefer A. M., McFarland R., Blakely E. L., He L., Whittaker R. G., Taylor R. W., Chinnery P. F., Turnbull D. M. Prevalence of mitochondrial DNA disease in adults // Annals of Neurology: Official Journal of the American Neurological Association and the Child Neurology Society. - 2008. - T. 63, № 1. - C. 35-39.

87. Phillips N. R., Sprouse M. L., Roby R. K. Simultaneous quantification of mitochondrial DNA copy number and deletion ratio: a multiplex real-time PCR assay // Scientific reports. - 2014. - T. 4, № 1. - C. 1-7.

88. Rodriguez-Enriquez S., Kai Y., Maldonado E., Currin R. T., Lemasters J. J. Roles of mitophagy and the mitochondrial permeability transition in remodeling of cultured rat hepatocytes // Autophagy. - 2009. - T. 5, № 8. - C. 1099-1106.

89. Veltri K. L., Espiritu M., Singh G. Distinct genomic copy number in mitochondria of different mammalian organs // Journal of cellular physiology. - 1990. - T. 143, № 1. - C. 160-164.

90. Shanske S., Wong L.-J. C. Molecular analysis for mitochondrial DNA disorders // Mitochondrion. - 2004. - T. 4, № 5-6. - C. 403-415.

91. Mourier T., Hansen A. J., Willerslev E., Arctander P. The Human Genome Project reveals a continuous transfer of large mitochondrial fragments to the nucleus // Molecular biology and evolution. - 2001. - T. 18, № 9. - C. 1833-1837.

92. Calvignac S., Konecny L., Malard F., Douady C. J. Preventing the pollution of mitochondrial datasets with nuclear mitochondrial paralogs (numts) // Mitochondrion. -2011. - T. 11, № 2. - C. 246-254.

93. Zhang Z., Gerstein M. Identification and characterization of over 100 mitochondrial ribosomal protein pseudogenes in the human genome ☆ // Genomics. - 2003. - T. 81, № 5. - C. 468-480.

94. Andreu A. L., Martinez R., Marti R., Garcia-Arumi E. Quantification of mitochondrial DNA copy number: pre-analytical factors // Mitochondrion. - 2009. - T. 9, № 4. - C. 242-246.

95. Guo W., Jiang L., Bhasin S., Khan S. M., Swerdlow R. H. DNA extraction procedures meaningfully influence qPCR-based mtDNA copy number determination // Mitochondrion. - 2009. - T. 9, № 4. - C. 261-265.

96. Myers M. B., Mittelstaedt R. A., Heflich R. H. Using $X174 DNA as an exogenous reference for measuring mitochondrial DNA copy number // Biotechniques. - 2009. - T. 47, № 4. - C. 867-869.

97. Malik A. N., Shahni R., Rodriguez-de-Ledesma A., Laftah A., Cunningham P. Mitochondrial DNA as a non-invasive biomarker: accurate quantification using real time quantitative PCR without co-amplification of pseudogenes and dilution bias // Biochemical and biophysical research communications. - 2011. - T. 412, № 1. - C. 1-7.

98. Biino G., Santimone I., Minelli C., Sorice R., Frongia B., Traglia M., Ulivi S., Di Castelnuovo A., Gögele M., Nutile T. Age-and sex-related variations in platelet count in Italy: a proposal of reference ranges based on 40987 subjects' data // PloS one. - 2013. -T. 8, № 1. - C. e54289.

99. Biino G., Gasparini P., D'Adamo P., Ciullo M., Nutile T., Toniolo D., Sala C., Minelli C., Gögele M., Balduini C. L. Influence of age, sex and ethnicity on platelet count in five Italian geographic isolates: mild thrombocytopenia may be physiological // British journal of haematology. - 2011. - T. 157, № 3. - C. 384-387.

100. Segal J. B., Moliterno A. R. Platelet counts differ by sex, ethnicity, and age in the United States // Ann Epidemiol. - 2006. - T. 16, № 2. - C. 123-30.

101. Kueviakoe I. M., Segbena A. Y., Jouault H., Vovor A., Imbert M. Hematological reference values for healthy adults in togo // ISRN Hematol. - 2011. - T. 2011. - C. 736062.

102. Mengel-From J., Thinggaard M., Dalgard C., Kyvik K. O., Christensen K., Christiansen L. Mitochondrial DNA copy number in peripheral blood cells declines with age and is associated with general health among elderly // Hum Genet. - 2014. - T. 133, № 9. - C. 1149-59.

103. Knez J., Winckelmans E., Plusquin M., Thijs L., Cauwenberghs N., Gu Y., Staessen J. A., Nawrot T. S., Kuznetsova T. Correlates of Peripheral Blood Mitochondrial DNA Content in a General Population // Am J Epidemiol. - 2016. - T. 183, № 2. - C. 138 -46.

104. Banas B., Kost B. P., Goebel F. D. Platelets, a typical source of error in real-time PCR quantification of mitochondrial DNA content in human peripheral blood cells // Eur J Med Res. - 2004. - T. 9, № 8. - C. 371-7.

105. Urata M., Koga-Wada Y., Kayamori Y., Kang D. Platelet contamination causes large variation as well as overestimation of mitochondrial DNA content of peripheral blood mononuclear cells // Ann Clin Biochem. - 2008. - T. 45, № Pt 5. - C. 513-4.

106. Timmermans E. C., Tebas P., Ruiter J. P., Wanders R. J., de Ronde A., de Baar M. P. Real-time nucleic acid sequence-based amplification assay to quantify changes in mitochondrial DNA concentrations in cell cultures and blood cells from HIV-infected patients receiving antiviral therapy // Clin Chem. - 2006. - T. 52, № 6. - C. 979-87.

107. Bendl J., Stourac J., Salanda O., Pavelka A., Wieben E. D., Zendulka J., Brezovsky J., Damborsky J. PredictSNP: robust and accurate consensus classifier for prediction of disease-related mutations // PLoS Comput Biol. - 2014. - T. 10, № 1. - C. e1003440.

108. Schwarz J. M., Cooper D. N., Schuelke M., Seelow D. MutationTaster2: mutation prediction for the deep-sequencing age // Nat Methods. - 2014. - T. 11, № 4. - C. 361-2.

109. Pejaver V., Urresti J., Lugo-Martinez J., Pagel K. A., Lin G. N., Nam H.-J., Mort M., Cooper D. N., Sebat J., Iakoucheva L. M., Mooney S. D., Radivojac P. MutPred2: inferring the molecular and phenotypic impact of amino acid variants // bioRxiv. -2017.10.1101/134981. - C. 134981.

110. Lopez-Ferrando V., Gazzo A., De La Cruz X., Orozco M., Gelpi J. L. PMut: a web-based tool for the annotation of pathological variants on proteins, 2017 update // Nucleic acids research. - 2017. - T. 45, № W1. - C. W222-W228.

111. Jaganathan K., Kyriazopoulou Panagiotopoulou S., McRae J. F., Darbandi S. F., Knowles D., Li Y. I., Kosmicki J. A., Arbelaez J., Cui W., Schwartz G. B., Chow E. D., Kanterakis E., Gao H., Kia A., Batzoglou S., Sanders S. J., Farh K. K. Predicting Splicing from Primary Sequence with Deep Learning // Cell. - 2019. - T. 176, № 3. - C. 535-548 e24.

112. Waterhouse A., Bertoni M., Bienert S., Studer G., Tauriello G., Gumienny R., Heer F. T., de Beer T. A. P., Rempfer C., Bordoli L., Lepore R., Schwede T. SWISS-MODEL:

homology modelling of protein structures and complexes // Nucleic Acids Res. - 2018. -T. 46, № W1. - C. W296-W303.

113. Richards S., Aziz N., Bale S., Bick D., Das S., Gastier-Foster J., Grody W. W., Hegde M., Lyon E., Spector E., Voelkerding K., Rehm H. L., Committee A. L. Q. A. Standards and guidelines for the interpretation of sequence variants: a joint consensus recommendation of the American College of Medical Genetics and Genomics and the Association for Molecular Pathology // Genet Med. - 2015. - T. 17, № 5. - C. 405 -24.

114. Filatova A. Y., Vasilyeva T. A., Marakhonov A. V., Voskresenskaya A. A., Zinchenko R. A., Skoblov M. Y. Functional reassessment of PAX6 single nucleotide variants by in vitro splicing assay // Eur J Hum Genet. - 2019. - T. 27, № 3. - C. 488 -493.

115. Livak K. J., Schmittgen T. D. Analysis of relative gene expression data using realtime quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method // Methods. - 2001. - T. 25, № 4. - C. 402-8.

116. Rahman S., Copeland W. C. POLG-related disorders and their neurological manifestations // Nature Reviews Neurology. - 2019. - T. 15, № 1. - C. 40-52.

117. Hanisch F., Kornhuber M., Alston C. L., Taylor R. W., Deschauer M., Zierz S. SANDO syndrome in a cohort of 107 patients with CPEO and mitochondrial DNA deletions // Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry. - 2015. - T. 86, № 6. - C. 630-634.

118. Parada-Garza J. D., López-Valencia G., Miranda-García L. A., Pérez-García G., Ruiz-Sandoval J. L. MRI findings in SANDO variety of the ataxia-neuropathy spectrum with a novel mutation in POLG (c. 3287G> T): A case report // Neuromuscular Disorders. - 2020. - T. 30, № 7. - C. 590-592.

119. Peter B., Farge G., Pardo-Hernandez C., Tangefjord S., Falkenberg M. Structural basis for adPEO-causing mutations in the mitochondrial TWINKLE helicase // Hum Mol Genet. - 2019. - T. 28, № 7. - C. 1090-1099.

120. Nikali K., Suomalainen A., Saharinen J., Kuokkanen M., Spelbrink J. N., Lonnqvist T., Peltonen L. Infantile onset spinocerebellar ataxia is caused by recessive mutations in

mitochondrial proteins Twinkle and Twinky // Hum Mol Genet. - 2005. - T. 14, № 20. -C. 2981-90.

121. Kurbatov S.A. T. P. G., Mollaeva K.Yu., Bychkov I.O., Itkis Y.S., Zabnenkova V.V., Umakhanova Z.R., Geybatova L.G., Zakharova E.Yu. Infantile and early childhood onset of mitochondrial myopathy due to mutations in the TK2 gene with a phenotype of spinal muscular atrophy 5q: the first cases in Russia. // Neuromuscular Diseases. - 2019. - T. 9, № 3. - C. 67-76.

122. Dimmock D., Zhang Q., Dionisi-Vici C., Carrozzo R., Shieh J., Tang L. Y., Truong C., Schmitt E., Sifry-Platt M., Lucioli S. Clinical and molecular features of mitochondrial DNA depletion due to mutations in deoxyguanosine kinase // Human mutation. - 2008. -T. 29, № 2. - C. 330-331.

123. Ballout R. A., Al Alam C., Bonnen P. E., Huemer M., El-Hattab A. W., Shbarou R. FBXL4-related mitochondrial DNA depletion syndrome 13 (MTDPS13): a case report with a comprehensive mutation review // Frontiers in genetics. - 2019. - T. 10. - C. 39.

124. El-Hattab A. W., Wang J., Dai H., Almannai M., Staufner C., Alfadhel M., Gambello M. J., Prasun P., Raza S., Lyons H. J. MPV17-related mitochondrial DNA maintenance defect: New cases and review of clinical, biochemical, and molecular aspects // Human mutation. - 2018. - T. 39, № 4. - C. 461-470.

125. Keshavan N., Abdenur J., Anderson G., Assouline Z., Barcia G., Bouhikbar L., Chakrapani A., Cleary M., Cohen M. C., Feillet F. The natural history of infantile mitochondrial DNA depletion syndrome due to RRM2B deficiency // Genetics in Medicine. - 2020. - T. 22, № 1. - C. 199-209.

126. Курбатов С., Федотов В., Цыганкова П., Захарова Е., Липовка С. Дифференциальная диагностика митохондриальной нейрогастроинтестинальной энцефаломиопатии. Первое клиническое описание в России // Нервно-мышечные болезни. - 2015. - T. 5, № 2.

127. Corazza G., Pagan C., Hardy G., Besson G., Lombes A., Seguy D., Acquaviva-Bourdain C., Bouhour F., Gaignard P., Slama A. MyoNeuroGastroIntestinal encephalopathy: natural history and means for early diagnosis // Gastroenterology. -2019. - T. 156, № 5. - C. 1525-1527. e4.

128. Oliveira M. T., Pontes C. d. B., Ciesielski G. L. Roles of the mitochondrial replisome in mitochondrial DNA deletion formation // Genetics and molecular biology. - 2020. -T. 43, № 1.

129. Viscomi C., Zeviani M. MtDNA-maintenance defects: syndromes and genes // Journal of inherited metabolic disease. - 2017. - T. 40, № 4. - C. 587-599.

130. Theunissen T. E., Nguyen M., Kamps R., Hendrickx A. T., Sallevelt S. C., Gottschalk R. W., Calis C. M., Stassen A. P., De Koning B., Hartog M.-D. Whole exome sequencing is the preferred strategy to identify the genetic defect in patients with a probable or possible mitochondrial cause // Frontiers in genetics. - 2018. - T. 9. - C. 400.

131. Souza P., Bortholin T., Teixeira C. A. C., Seneor D. D., Marin V. D. G. B., Dias R. B., Farias I. B., Badia B., Silva L. H. L., Pinto W. Leigh syndrome caused by mitochondrial DNA-maintenance defects revealed by whole exome sequencing // Mitochondrion. - 2019. - T. 49. - C. 25-34.