Биоконверсия послеспиртовой барды в белковый кормовой продукт тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Мордвинова, Екатерина Михайловна

• Мордвинова, Екатерина Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Мордвинова, Екатерина Михайловна

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Обзор литературы.

1.1. Продукция микробной биомассы.

1.1.1. Микроорганизмы - продуценты микробной биомассы.

1.1.2. Характеристика белоксодержащей биомассы.

1.2. Структура и свойства целлюлозосодержащих субстратов.

1.2.1. Целлюлоза.

1.2.2, Гемицеллюлоза, лигнин и другие, основные компоненты растительной биомассы.

1.3. Ферментативное расщепление целлюлозы.

1.4. Микробная деструкция лигнинцеллюлозы.

1.5. Биосинтез ферментов целлюлазного комплекса у бактерий рода Cellulomonas.

1.6. Регуляция синтеза целлюлаз у бактерий рода Cellulomonas.

1.7. Оптимальные условия для продукции целлюлаз и клеточной массы при глубинном культивировании продуцентов.

1.7.1. Время культивирования.

1.7.2. Влияние рН и температуры.

1.7.3. Роль ростовых факторов для культуры и синтеза ферментов.

1.7.4. Значение дозы посевного материала для роста клеток и синтеза ферментов.

1.7.5. Влияние углеводов на синтез целлюлаз.

1.7.6. Влияние различных источников азота на синтез целлюлаз.

1.7.7. Эффект Твина 80.

1.8. Послеспиртовая барда. Ее характеристика и способы утилизации.

ГЛАВА 2. Объекты и методы исследования.

2.1. Штаммы, использованные в работе.

2.2. Питательные среды.

2.2.1. Агаризованная среда для проведения селекционных работ, поддержания и хранения культуры

Cellulomonas effusa.

2.2.2. Питательные среды для глубинного культивирования Cellulomonas effusa.

2.2.3. Питательные среды для определения целлюлолитической активности Cellulomonas effusa (ПС-2, ФС-1 и агаризованная среда с Na-КМЦ).

2.2.4. Питательные среды для получения мутации устойчивости к дезоксиглюкозе.

2.3.Хранение, поддержание и глубинное культивирование культуры Cellulomonas effusa.

2.3.1. Культивирование на колбах и в лабораторном ферментере объемом 3 литра.

2.3.2. Получение посевного материала I и II генераций для культивирования в промышленных аппаратах объемом 30 и 100 м

2.4. Приготовление фиксированных мазков.

2.5. Методика проведения мутагенеза для Cellulomonas effusa на растущей культуре.

2.6. Методика получения мутантов, резистентных к дезоксиглюкозе.

2.7. Определение содержания сырого протеина.

2.8. Определение сырой клетчатки.

2.9. Определение целлюлолитической активности.

2.10. Определение редуцирующих веществ методом Бертрана.

2.11. Определение ксиланов в культуральной жидкости.

2.12. Определение титра клеток культуры Cellulomonas effusa.

2.13. Определение содержания влаги и содержания сухих веществ.

2.14. Контроль стерильности питательных сред.

2.15. Определение аминокислотного состава.

2.16. Оптимизация ферментационной питательной среды.7,

2.17. Статистическая обработка данных.

ГЛАВА 3. Результаты и обсуждение.

3.1. Схема экспериментальных исследований.

3.2. Технология культивирования культуры

Cellulomonas effusa в лабораторных условиях.

3.2.1. Подбор состава посевной питательной среды для культивирования Cellulomonas effusa и времени выращивания посевного материала.

3.2.2. Посевной материал II генерации.

3.2.3. Оптимизация ферментационной питательной среды.

3.2.4. Предобработка целлюлозосодержащего сырья.

3.3. Разработка метода определения целлюлолитической активности у культуры Cellulomonas effusa.

3.3.1. Подбор питательных сред для разработки методики определения целлюлолитической активности методом с красителем конго-красным.

3.3.2. Подбор оптимальных параметров проведения анализа по определению целлюлолитической активности.

3.4. Получение мутантов с увеличенной целлюлолитической активностью.

3.4.1. Получение мутантов культуры Cellulomonas effusa с помощью мутагена N-метилмочевины (NMM).

3.4.2. Проверка вариантов и отбор мутантов с повышенной целлюлолитической активностью.

3.4.3. Получение мутантов резистентных к дезоксиглюкозе.

3.5. Биоконверсия целлюлозных компонентов послеспиртовой барды с помощью мутантного штамма К-27 DGR в микробный белок.

3.5.1. Выращивание культуры Cellulomonas effusa К-27 DGR в лабораторном ферментере на послеспиртовой барде, обработанной на гидродинамической установке.

3.5.2. Выращивание культуры Cellulomonas effusa K-27DGR в промышленном аппарате объемом 30 м на послеспиртовой барде.

3.5.3. Выращивание культуры Cellulomonas effusa K-27DGR в промышленном аппарате объемом 100 м3 на послеспиртовой барде.

3.6. Аппаратурно-технологическая схема процесса получения кормового белка на основе послеспиртовой барды.

ЭКОНОМИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ПРИМЕНЕНИЯ НОВОЙ ТЕХНОЛОГИИ БИОКОНВЕРСИИ ПОСЛЕСПИРТОВОЙ БАРДЫ В КОРМОВОЙ ПРОДУКТ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Биоконверсия послеспиртовой барды в белковый кормовой продукт»

В последние годы получение новых видов энергии и топлива становится первоочередной задачей для всех стран мира. Биоэтанол (этанол), один из основных видов биотоплива, получают из сахарной свеклы, сахарного тростника, кукурузы, зерновых культур, картофеля и других видов углеродсодержащих растительных субстратов. Мировая потенциальная потребность в биоэтаноле составляет 2 млрд. тонн в год. В настоящее время в мире производится 32 млн. тонн этанола: из них 20 млн. тонн — топливный этанол, 8 млн. тонн — этанол для химической промышленности, 4 млн. тонн — для пищевой промышленности. Химическим синтезом производят 7% этанола, брожением — 93%. Получение спирта методами брожения сопровождается образованием в процессе производства послеспиртовой барды. Так, например, типовой завод по производству этанола мощностью 42000 дал/сут должен утилизировать, перерабатывать или реализовывать ежесуточно порядка 4500-5000 тонн жидкой барды. По экспертным оценкам, в настоящее время, в России годовой объем производимой барды составляет примерно 700 млн. дал, причем из них перерабатывается не более 5%. Невостребованную барду большинство предприятий стараются слить в близлежащие водоемы либо на поля, что серьезно ухудшает экологическую ситуацию вокруг спиртзаводов. Проблема усложняется тем, что барда - это скоропортящаяся жидкость (влажность около 80%) и при температуре 15-30°С становится зараженной посторонней микрофлорой в течение нескольких часов.

Вопрос переработки послеспиртовой барды сегодня становится не менее важной и экономически привлекательной задачей, чем производство самого спирта. Организация переработки барды в эффективный белково-витаминный продукт будет способствовать организации нового высокорентабельного бизнеса производства кормовых продуктов, спрос на которые в мире превосходит предложение.

Можно выделить две основные технологические схемы, которые используются при переработке барды:

Схемы с выпарными станциями для получения «Сухой барды (DDGS)»; Схемы с получением кормовых дрожжей.

Технология «упаривания фугата» в выпарных станциях самая распространенная в мире. Данная технология предлагается, например, шведской компанией «Альфа-Лаваль», датской фирмой «Atlas-Stord», рядом китайских и российских компаний. Однако стоимость выпарных станций и соответственно всего оборудования для утилизации достаточно высокая, процесс выпарки требует значительных энергетических затрат. Не полностью решаются экологические проблемы, т.к. для утилизации «выпара» требуются стационарные очистные сооружения. Все это отрицательно сказывается на себестоимости готовой продукции - сухой барды («DDGS»), главным недостатком которого является несбалансированность получаемого продукта по сырому протеину, так как максимальное его содержание в сухой барде не превышает 24 %. Также высокое содержание клетчатки в сухой барде - до 20%, существенно ограничивает круг его потребителей.

Вторая группа объединяет технологии, предусматривающие предварительную утилизацию Сахаров барды путем культивирования на ней кормовых дрожжей.

Однако, используемые дрожжи рода Candida относятся к условно-патогеннным микроорганизмам с высоким уровнем микологической опасности. Известны случаи заболевания птицы кандидозом при введении в ее рацион питания кормовых дрожжей.

Поэтому исследования по решению проблемы трансформации целлюлозосодержащих компонентов послеспиртовой барды в микробный протеин с использованием непатогенных нетоксичных бактерий является весьма актуальным.

Дели и задачи исследования. Целью работы является разработка технологии переработки послеспиртовой барды в богатый белком кормовой продукт путем культивирования бактерий Cellulomonas effusa. Для достижения поставленной цели в ходе работы решались следующие задачи: 1 .Разработать технологию культивирования Cellulomonas effusa в лабораторных условиях на целлюлозосодержащих субстратах;

2.Разработать оперативный, удобный метод определения целлюлолитической активности у культуры Cellulomonas effusa для проведения селекционных работ;

3.Получить мутанты с увеличенной целлюлолитической активностью;

4. Разработать технологию выращивания культуры Cellulomonas effusa в промышленных условиях на целлюлозосодержащих субстратах с получением белково-витаминного кормового продукта с использованием мутантного штамма;

5.Разработать аппаратурно-технологическую схему производства кормового белка на основе послеспиртовой барды.

Научная новизна.

- Модифицирована оригинальная методика определения целлюлолитической активности для одновременной проверки большого числа клонов при проведении селекционных работ.

- После обработки исходного штамма мутагеном N-метилмочевиной получен мутантный штамм, характеризующийся повышенным синтезом целлюлолитических ферментов.

- Получен мутантный штамм К-27 DGR , резистентный к 5 мг/мл дезоксиглюкозы, с ослабленным эффектом катаболитной репрессии, и характеризующийся повышенным синтезом целлюлолитических ферментов.

- Впервые в России при микробной переработке послеспиртовой барды использовали непатогенные, не спорообразующие бактерии рода Cellulomonas, которые эффективно осуществляют биоконверсию целлюлозосодержащих субстратов в микробный протеин.

Практическое значение работы.

- Проведена апробация новой технологии переработки послеспиртовой барды и промышленная наработка белково-витаминного кормового продукта «Мультиприн» на спиртовых заводах в г. Ливны (ОАО «Этанол») и в г. Бутурлиновка (ООО Спиртзавод «Пираква»).

- Разработанные методики, штаммы, питательные среды и технология ферментации могут быть использованы для организации на спиртовых заводах линий по переработке барды с получением различных кормовых продуктов.

- Разработана аппаратурно-технологическая схема производства кормового белка на основе послеспиртовой барды.

- Показано, что с помощью разработанной технологии может быть получен высокобелковый кормовой продукт «Мультиприн».

Апробация работы.

Работа выполнялась в Московском Государственном Университете

Инженерной Экологии.

Результаты диссертационной работы докладывались: на 11-ой Пущинской международной школе-конференции молодых ученых: Биотехнология — наука XXI век, Пущино, 2008 г.; на 2-й Биотехнологической выставкеярмарке РосБиоТех - 2008. Результаты работы, представленные на РосБиоТех - 2008, удостоены серебряной медали.

Публикации.

По материалам работы опубликовано 4 печатные работы, из них 2- тезисы в научных конференциях, 2 - статьи в журналах. Также получено положительное решение о выдаче патента (заявка № 2007113000/15(014124)). Находится на рассмотрении заявка на изобретение «Переработка спиртовой барды в кормовой продукт». Данные работы выполнены с соавторами Сергеевой А.В., Бирюковым В.В., Мироновым В.А., Акопяном В.Б., Туляковой Т.В., Рухманом А.А. и др.

Соискателем были выполнены поставленные задачи исследований, основные экспериментальные исследования, разработаны методики. В определении биохимических характеристик принимали участие Ревякина Т.В., Петрищева О.А. Обсуждение результатов проводилось совместно с Сергеевой А.В., Бирюковым В.В. Вклад соискателя в работу является определяющим.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Мордвинова, Екатерина Михайловна

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Модифицирована оригинальная методика определения активности эндоглюканаз для селекции культуры Cellulomonas, позволяющая одновременно тестировать большое количество вариантов. Установлены оптимальные параметры проведения анализа по определению эндоглюканазной активности.

2. Разработана питательная среда для получения посевного материала I генерации. Показана целесообразность использования посевной среды II генерации с добавлением целлюлозосодержащего субстрата (как стартера синтеза целлюлаз) для эффективной биоконверсии послеспиртовой барды в кормовой продукт. Подобрана и оптимизирована ферментационная среда на основе барды для культивирования Cellulomonas effusa в лабораторных и промышленных условиях.

3. Показано, что щелочная предобработка ферментационной питательной среды наиболее результативна для обеспечения лучшей утилизации целлюлозосодержащих субстратов за счет разрыхления целлюлозной структуры. Подщелачивание барды до рН 9-10 перед тепловой обработкой позволяет увеличить содержание белка в кормовом продукте на 7-8%.

4. Продемонстрировано, что предобработка подщелоченной (рН=10) послеспиртовой барды на гидродинамической установке в течение 15 минут способствует при культивировании Cellulomonas effusa дополнительному (10-12%) образованию микробного белка в культуральной жидкости. При этом эффективность деструкции целлюлозы культурой увеличилась на 7,5%.

5. Получен мутант Cellulomonas effusa К-27 после мутагенеза с N-метилмочевиной, у которого активность эндоглюканаз на 40% выше, чем у исходного штамма.

6. Полученный штамм К-27 DGR, устойчивый к 5мг/мл дезоксиглюкозы, с ослабленным эффектом катаболитной репрессии, характеризуется активностью эндоглюканаз 9><10"3 Ед/мл, что в 3,8 раз превышает таковую у исходного штамма.

7. Разработан отъемно-доливной способ переработки послеспиртовой барды культурой Cellulomonas effusa К-27 DGR в лабораторном ферментере. Полученная белково-кормовая добавка, характеризуется содержанием 45,1% сырого протеина и 4,7% клетчатки.

8. Проведены промышленные испытания биоконверсии послеспиртовой барды на действующих спиртовых заводах ОАО «Этанол» в г. Ливны в

-5 аппарате объемом 30 м и ООО Спиртзавод «Пираква»» в г.Бутурлиновка в аппарате 100 м . Полученный препарат «Мультиприн» содержит 45-54% сырого протеина, 5,6-5,7% клетчатки, незаменимые аминокислоты и микро- и макроэлементы.

9. Предложена безотходная технология переработки нативной послеспиртовой барды без ее предварительного разделения на фракции с использованием мутантного штамма Cellulomonas effusa К-27 DGR, в результате которой получается обогащенный микробным белком кормовой продукт.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Мордвинова, Екатерина Михайловна, 2009 год

1. Бирюков В.В. Основы промышленной биотехнологии. / В.В. Бирюков.-М.: КолосС, 2004. 296 е.: ил. - (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений).

2. Грачева И.М. Технология ферментных препаратов. / И.М. Грачева.-2-еизд., перераб. и доп. М.: Агропромиздат, 1987.-335с.: ил.- (Учебники и учеб. пособия для студентов высш. учеб. заведений).

3. ГОСТ 13496.2-91. Корма, комбикорма, комбикормовое сырье. Методы анализа.- М.: ИПК Издательство стандартов, 2002.- с. 19-25.

4. Евилевич А.З. Безотходное производство в гидролизной промышленности / А.З. Евилевич, Е.И. Ахмина, М.Н. Раскин. М.: Лесная промышленность, 1982.- с. 4-40.

5. Йиргенсонс Б. Природные органические макромолекулы. М.: Наука, 1965.-с. 556

6. Калунянц, К.А. Современные способы ферментативного гидролиза целлюлозосодержащих материалов / К.А. Калунянц, Е.Ф. Шаненко, Л.В. Зайцева // Итоги науки и техники: Сер. Химия и технология пищевых продуктов.- М.: ВИНИТИ, 1988.-Т.1.- с. 187.

7. Клесов А.А. Ферментативное превращение целлюлозы / А.А. Клесов // Итоги науки и техники: Сер. Биотехнология. М.: ВИНИТИ, 1983.-т. 1.-е. 63150

8. Клесов А.А. Ферментативный катализ / А.А. Клесов М.: Изд-во Московского Университета, 1984. -т.2. - 216 с.

9. Клесов А.А. Ферменты целлюлазного комплекса / А.А. Клесов // Проблемы биоконверсии растительного сырья. М.: МГУ, 1986. - с. 95-136.

10. Комов В.П. Биохимия / В.П. Комов, В.Н. Шведова. М.: Дрофа, 2004. -640 с.

11. Кретович B.JI. Введение в энзимологию. / В.Л. Кретович. М.: Наука, 1974.-352 с.

12. Леденев, В.П. Казнить нельзя помиловать. /В.П. Леденев // Ликероводочное Производство и Виноделие.-2007.-№9.-с.10-11

13. Ленинджер А. Основы биохимии / А. Ленинджер; под общ. ред. В.А. Энгельгарда, Л.М. Варшанского. В 3-х томах.- М.: Мир, 1986. - с. 1051

14. Лобанок А.Г. Микробиологический синтез белка на целлюлозе / А.Г. Лобанок, В.Г. Бабицкая. Минск: Наука и техника, 1976. -с. 230

15. Марьяновская Ю. В. Микробиологическая деструкция целлюлозосодержащих отходов / Ю.В. Марьяновская, Н.Н. Севастьянова // Учён. зап. института СХПР НовГУ.- 2006.- Т. 14.- в. 3.-Ч.2

16. Никитин В.М. Химия древесины и целлюлозы / В.М. Никитин, А.В. Оболенская, В.П. Щеголев М.: Лесная промышленность, 1978.- с. 367

17. Пименова М.Н. Руководство к практическим занятиям по микробиологии (малый практикум) / М.Н. Пименова, Н.Н. Гречушкина, Л.Г. Азова. Под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во Московского Университета, 1971.- с. 223

18. Практикум по биохимии: Учеб. пособие / Под ред. С.Е. Северина, Г.А. Соловьевой. — 2-е изд., перераб. и доп. М.: Изд-во МГУ, 1989.- 509 с.

19. Роговин З.А. Химия целлюлозы / З.А. Роговин М.: Химия, 1972.- с. 520

20. Родионова, Н.А. Ферментативное расщепление целлюлозы / Н.А. Родионова // Сб.: Целлюлазы микроорганизмов (ред В.Л. Кретович). М.: Наука, 1981.- с. 4-40.

21. Семенов С.М. Лабораторные среды для актиномицетов и грибов / С.М. Семенов. Справочник.- М.: Агропромиздат, 1990.- с. 240

22. Синицын А.П. Биоконверсия лигноцеллюлозных материалов / А.П. Синицын, А.В. Гусаков, В.М. Черноглазое. Учебное пособие. М.: Изд-во МГУ,1995.- с. 224

23. Фисинин В.И. Рекомендации по применению сухой послеспиртовой барды в рационах сельскохозяйственной птицы / В.И. Фисинин, И.А. Егоров,

24. Н.Н. Паньков, Ш.А. Иманкулов и др. под редакцией В.И. Фисинина, И.А. Егорова, П.Н. Панькова.Сергиев Посад: ВНИТИП,1998 с. 21

25. Шлегель Г. Общая микробиология / Г. Шлегель.- М.: Мир, 1972.- с.471

26. Aiba S. Kinetics / S. Aiba, A.E. Humphrey, N.F. Miller // Biochemical Engineering. 2ndEdition.-New York: Academic Press, 1973.-P.92-127

27. Allen, A.L. Cellulase production in continuous and fedbatch culture by Trichoderma reesei MCG 80. / A.L. Allen , R.E. Andreotti //Biotechnol. Bioeng. Symp.-1982- V.12.- P.451-459.

28. Araujo, A. Characterization of cellulolytic enzyme components from Aspergillus terreus and its mutant derivatives. / A. Araujo , J. D'Souza // J. Ferment. Technol.-1986.-V.64.- P.463-467.

29. Biely, P. Microbial xylanolytic systems. / P. Biely // Trends in Biotechnol.-1985.-V.3.-P. 286-290.

30. Boyer, M.H. Carboxymethylcellulase from Erwinia chrysanthemi. Production and regulation of extracellular carboxymethylcellulase. / M.H. Boyer, J.P. Chambost, M. Magnan, J. Cattaneo // J. Biotechnol.- 1984.-V.1.-P. 229-239.

31. Boze, H. Production of food and fodder yeasts. / H. Boze, G. Moulin, P. Galzy // Crit. Rev. Biotechnol.-1992.-V. 12. P.65-86.

32. Breuil, C. Production and localization of cellulases and (3-glucosidase from the thermophilic fungus Thielavia terrestris. / C. Breuil, G.Wojtczak, J.N. Saddler // Biotechnol. Lett.- 1986.-V.8.-P. 673.

33. Brown, J.A. Enhanced enzyme production by the cellulolytic fungus Penicillium pinophilum, mutant strain NTG III/6. / J.A. Brown , S.A. Collin , T.M. Wood // Enzyme Microb. Technol.- 1987.-V.9.-P.176-180.

34. Brown, R.M. Cellulose biosynthesis: model for understanding the assembly of biopolymers./ R.M. Brown, I.M. Saxena // Plant Physiol.Biochem.-2000.-V.38(l).-P.57-67.

35. Chaudhary, P. Purification and characterization of xylanases from Cellulomonas sp. N.C.I.M 2353. / P.Chaudhury, D.N.Deobagkar / /Biotechnol. Appl. Biochem.-1997.-V.25(2).-P. 127-133.

36. Choi, W.Y. Isolation of a cotton wool degrading strain of Cellulomonas: mutants with altered ability to degrade cotton wool. / W.Y. Choi, K.D. Haggett, N.W. Dunn// Aust. J. Biol. Sci.- 1978.-V.31-P.553-564.

37. Chosson, J. Inhibition of cellulolytic activity by lactate in a Cellulomonas uda species. / J. Chosson //Biotechnol. Bioeng. -1987.- V.29 (6).-P.767-769.

38. Choudhury, N. Use of a combined Cellulomonas and Trichoderma cellulose preparation for cellulose saccharification. / N. Choudhury, N.W.Dunn, P.P. Gray // Biotech. Letters-1981 .-V.3(9).-P.493-496.

39. Dekker, R. F. H. Enzymic saccharification of sugarcane bagasse pretrated by autohydrolysis- steam explosion. / R.F.H. Dekker, A. F. A. Wallis // Biotechnol. Bioeng.-1983-V.25-P. 3027-3048.

40. Desai, J.D. Production of cellulase and beta-glucosidase by shake culture of Scytalidium lignicola. / J.D. Desai, N.P. Patel // J. Ferment. Technol.-1982.-V. 60.-P.117-124.

41. Emtiazi, G. Production of thermostable a-Amylase and Cellulase from Cellulomonas sp. / G. Emtiazi, I. Nahvi // Journal of Microbiology and Biotechnology.-2004.- V. 14(6).-P. 1196-1199.

42. Eriksson, K.E. Endo-l,4-/?-gluconases of Sporotrichum pulverulentum. / K.E. Eriksson, B. Petterson // Methods Enzymol.-1988.-V.160.-P. 368-376.

43. Fan, L.T. Mechanism of the enzymatic hydrolysis of cellulose effect of major structural features of cellulose on enzymatic hydrolysis/ L.T. Fan, Y.H. Lee, D.H. Beardmore // Biotechnol.Bioeng.-1980.- V.22.-P. 177-199.

44. Feldman, K.A. Isolation of the cellulase enzymes from the thermophilic fungus Thermoascus aurantiacus and regulation of enzyme production. / K.A. Feldman, J.S. Lovett, G.T. Tsao // Enzym. Microb. Technol.- 1988.-V.10.-P.262-272.

45. Fennington, G. Enhanced cellulase production in mutants of Thermomonospora curvata. / G. Fennington, D. Lupo, F. Stutzenberger // Biotechnol. Bioeng.- 1982.-V.24.-P. 2487-2497.

46. Giuliano, C. Conversion of cellulose to sugars by resting cells of a mesophilic anaerobe Bacteriodes cellulosolvens. / C. Giuliano, A.W. Khan //Biotechnol. Bioeng.- 1985.-V.27.-P.980-983.

47. Gokhale, D.V. Production of cellulolytic enzymes by mutants of Aspergillus niger NCIM 1207. / D.V. Gokhale, U.S. Puntambekar, D.N. Deobagkar, J.F. Peberdi //Enzyme Microbial Technol.- 1988.-V.10.-P. 442-445.

48. Golovchenko, N. P. Isolation and characterization of a lichenan-degrading hydrophobic endoglucanase of Clostridium thermocellum. / N. P. Golovchenko, R.N. Singh, G. A. Velikodvorskaya, V.K. Akimenko // Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1993.-V.39.-P.7-79.

49. Groleau, D. Cellulolytic activity of the rumen bacterium Bacteroides succinogenes. / D. Groleau, C.W. Forsberg //Can. J. Microbiol.- 1981.-V.27(5).-P. 17-530.

50. Haggett, K.D. Mutants of Cellulomonas which produce increased levels of /?-glucosidase. / K.D. Haggett, W.Y. Choi, N.W. Dunn //Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1978.-V.6.-P.189-191.

51. Haggett, K.D. Crystalline cellulose degradation by a strain of Cellulomonas and its mutant derivatives. / K.D. Haggett, P.P. Gray, N.W. Dunn //Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.- 1979^-V. 8.-P.183-190.

52. Hitchner, E. V. Use of a cellulase-derepressed mutant of Cellulomonas in the production of a single-cell protein product from cellulose. / E.V. Hitchner, J.M. Leatherwood // Appl. Environmen. Microbiol.-1980.-V. 39(2).-P. 382-386.

53. Ishaque, M. Cellulase complex of mesophilic Streptomyces strain. / M. Ishaque, D. Kluepfel //Can. J. Microbiol.- 1980.-V.26.-P. 183-189.

54. Joglekar, A.V. Studies on cellulose production by Penicillum funicolusum strain in an instrumented fermenter. / A.V. Joglekar, M.C. Srinivasan, A.C. Manchandra, V.V. Vogdand, N.G. Karanth // Enzyme Microbiol. Technol.-1982.-V.5.-P.22-24.

55. Kassim, E.A. Cellulase production by a strain of Myrothecium sp. / E.A. Kassim//J. Ferment. Technol.- 1982.-V.60.-P.381-383.

56. Kassim, E.A. Cellulase activity of Rhisopus species. / E.A. Kassim // Egypt. J. Microbiol. Special Issue-1984.-P. 171-178.

57. Khan, A.W. Use of charcoal to minimize end product ingibition in enzymatic hydrolysis of cellulose./ A.W. Khan, A. Chin, S. Baird // Biotechnol. Lett.-1985.-V. 7(6).- P.447-450.

58. Kim, B.H. Grown and cellulolytic activity of Cellulomonas flavigena. / B.H. Kim, W.T. Wimpenny//Can. J. Microbiol.-1981.-V.27.-P.1260-1264.

59. Kluepfel, D. Characterization of cellulose and xylanase activities of Streptomyces lividans. / D. Kluepfel, F. Schareck, F. Mondou, R. Morosoli //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1986.-V.24.-P.230-234.

60. Lansford, M.G. The cellulase system of Cellulomonas fimi. / M.G. Lansford, N.R. Gilkes, D.G. Kilburn, R.C. Miller, R.A.J. Warren // J. Gener. Microbiol.-1984.-V. 130.-P. 11367-1376.

61. Lin, E. Identification of a celE-binding protein and its potential role in induction of the celE gene in Thermomonospora fusca. / E. Lin, D.B. Wilson // J. Bacteriol.-1988.-V.170.- P.3843-3846.

62. Lindner, W.A. Carboxymethylcellulase from Sclerotium rolfsii. / W.A. Lindner//Methods Enzymol.- 1988.-V.160.-P. 376-382.

63. Litchfield, J.H. Single-cell biomass. / J.H. Litchfield // Sciense 1983.-V.219 (4585).-P.740-746.

64. Ljungdahl, L.G. A yellow affinity substance involved in the cellulolytic system of Clostridium thermocellum. / L.G. Ljungdahl, B. Petterson, K.E. Eriksson //Curr. Microbiol.- 1983.-V.9.-P. 195-200.

65. Lynd, L.R. Microbial Cellulose Utilisation: Fundamentals and Biotechnology. / L.R. Lynd, P.J. Weimer, H. Van Zyl Willem, I.S. Pretorius //Microbiol, and Molecul. Biol. Reviews.-2002.-P.506-577.

66. MacKenzie, C.R. Streptomyces flavogriseus cellulose: evaluation under various hydrolysis conditions. /C.R. MacKenzie, D. Bilous, K.G. Johnson //Biotechnol. Bioeng.- 1984.-V.26.-P.590-594.

67. MacKenzie, C.R. Induction of cellulolytic and xylanolytic enzyme systems in Streptomyces spp. / C.R. MacKenzie, D. Bilous, H. Schneider, K.G. Johnson //Appl. Environ Microbiol.- 1987.-V. 53(12).-E\2835-2839.

68. Macris, B. J. Solid state fermentation of straw with Neurospora crass a for CMC-ase and /?-glucosidase production. / B.J. Macris, D. Kekos, X. Evangelidou, M. Galiotou-Panayotou, P. Sodis //Biotechnol. Lett.-1987.-V.9.-P.661-664.

69. Macris, B. J. Production and cross-synergistic action of cellulolytic enzymes from certain fungi mutants grown on cotton and straw. / B.J. Macris, M. Paspaliari, D. Kekos // Biotechnol. Lett.- 1985.-V.7.-P.369-372.

70. Malek, M.A. Bacterial cellulases and saccharification of lignocellulosic materials./ M.A. Malek, N.A. Chowdhury, Q.M. Yousuf, N. Choudhury // Enzyme Microbiol. Technol.-1988.-V.10.-P.750-753.

71. Mandels, M. Application of cellulases. / M. Mandels // Biochemical Society Transactions. -1985.- V.13.-P.414-416.

72. Marchessault, R.H. Cellulose / R.H. Marchessault, P.S. Sundararajan // In G.O. Aspinall (ed.), The Polysaccharides.- New York: Academic Press, 1993.-V.2.-P.ll-15.

73. Margaritis, A. Xylanase, CM-cellulase and avicelase production by the thermophilic fungus Sporotrichum thermophile. / A. Margaritis, R. Merchant, M. Yaguchi //Biotech. Lett.- 1983.-V.5.-P.265-270.

74. Margaritis, A. Optimization of fermentation conditions for thermostable cellulase production by Thielavia terrestris. / A. Margaritis, R.F. Merchant //. J. Indust. Microbiol- 1986.-V.1.-P.149-150.

75. McCleary, В. V. Purification of P-glucosidase from Aspergillus niger. / B.V. McCleary, J.Harrington //Methods Enzymol.- 1988.-V.160.-P.575-582.

76. Mes-Hartree, M. The nature of inhibitory materials present in pretreated lignocellulosic substrates which inhibit the enzymatic hydrolyses of cellulose. / M. Mes-Hartree, J.N.Saddler//Biotechnol. Letters.-1983.-V. 5 (8).-P. 531-536.

77. MesHartree, M. Influence of growth substrate on production of cellulase enzymes by Trichoderma harzianum E58. / M. MesHartree, C.M. Hogan, J.N. Saddler//Biotechnol. Bioeng.- 1988.-V.31.-P.725-729.

78. Moloney, A.P. Tsolaion and characterization of the endoglucanases of Talaromyces emersonii. / A.P. Moloney, S.I. McCrae, T.M. Wood, M.P. Coughlan // Biochem. J.- 1985.-V.225.-P.365-374.

79. Murao, S. Cellulases of Aspergillus aculeatus. / S. Murao, R. Sakamoto, M. Arai // Methods Enzymol.- 1988.-V.160.-P.274-299.

80. Nakamura, K. Isolation and identification of crystalline cellulose hydrolysing bacterium and its enzymic properties. / K. Nakamura, K. Kitamura // J. Ferment. Technol.- 1982.-V. 60.-P. 343-348.

81. Nakamura, K. Cellulases of Cellulomonas uda. / K. Nakamura, K. Kitamura // Meth. Enzymol.-1988.-V. 160 (1).-P.211-216.

82. Ohmiya, K. Isolation and properties of P -glucosidase from Ruminococcus albus. / K. Ohmiya, M. Shirai, Y. Kurachi, S. Shimizu //J. Bacteriol.-1985.-V.161.-P. 432-434.

83. Ohmiya, K. Purification and properties of endo-(l—»4)- p -D-glucanase from Ruminococcus albus. / K. Ohmiya, K. Maeda, S. Shimizu //Methods Enzymol.-1987.-V.160.-P. 247-299.

84. Panda, T. Effect of culture phasing and a polysaccharide on production of xylanase by mixed culture of Trichoderma reesei Dl-6 and Aspergillus wentii PT2804. / Т. Panda, V.S. Bisaria, Т.К. Ghose //Biotechnol. Bioeng.- 1987.-V.29.-P.868-871.

85. Peiris, S.P. Comparison of the xylanolytic and cellulolytic activities of Cellulomonas. / S.P. Peiris, P.A.D. Rickard, N.W. Dunn // Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol.-1982.-V. 14.-P. 169-173.

86. Poulsen, O.M. Growth of Cellulomonas sp. ATCC 21399 on different polysaccharides as sole carbon source. Induction of extracellular enzymes. / O.M. Poulsen, L.W. Petersen //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1988.-V.29(5).-P.480-484.

87. Poulsen, О. M. Growth and enzyme production of Cellulomonas sp. ATCC 21399 on microcrystalline cellulose. Effects of increasing concentration of a mineral medium. / O.M. Poulsen, L.W. Petersen //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1989.-V.30(5).-P.535-539.

88. Poulsen, О. M. Degradation of microcrystalline cellulose: Synergism between different endoglucanascs of Cellulomonas sp. ATCC 21399. / O.M. Poulsen, L.W. Petersen //Biotechnol. Bioengineer.-1998.-V.39(l).-P.121-123.

89. Poutanen, K. The hydrolysis of steamed birchwood hemicellulose by enzymes produced by Trichoderma reesei and Aspergillus awamori. / K. Poutanen, J. Puis, M. Linko //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1986.-V. 23.-P.487-490.

90. Rajoka, M.I. Influence of various fermentation variables on exo-glucanase production in Cellulomonas flavigena. / M.I. Rajoka // Elec. Journal of Biotechnology ISSN: 0717-3458.- 2004.- No. 3, Vol.7.

91. Rajoka, M.I. Double mutants of Cellulomonas biazotea for production of cellulases and hemicellulases following growth on straw of a perennial grass. / M.I. Rajoka // World J. of Microbiol, and Biotechnol.- 2005.- V.21(6-7).-P. 1063-1066.

92. Rajoka, M.I. Cellulase and hemicellulase production by Cellulomonas flavigena NIAB 441. / M.I. Rajoka, K.A. Malik // Biotechnol. Lett.-1984.-V.6(9).-P.597-600.

93. Rajoka, M.I. Cellulase production by Cellulomonas biazotea cultured in media containing different cellulosic substrates. / M.I. Rajoka, K.A. Malik //Bioresource Technology.-1997.-V.59( 1 ).-P.21 -27.

94. Rapp, P. Cellulose degradation and monitoring of viscosity decrease in cultures of Cellulomonas uda grown on printed newspaper. / P. Rapp, H. Reng, D.C. Hempel, F. Wagner // Biotechnol. Bioeng. -1984.-V.26(10).-P.1167-1175.

95. Rapp, P. Production and properties of xylan-degrading enzymes from Cellulomonas uda. / P. Rapp, F. Wagner //Appl. Environ. Microbiol.-1986.-V.51 (4).-P.746-752.

96. Ray, A.K. Optimization of fermentation for cellulose production by Bacillus subtilis CY5 and Bacillus circulans TP3 isolated from fish gut. / A.K. Ray, A. Bairagi, K.S. Ghosh, S.K. Sen //Acta Ichthyologica et piscatorial.-2007.- V.37(l).-P.47-53.

97. Reese, E.T. Rolling with the times: production and applications of Trichoderma reesei cellulases. / E.T. Reese, M. Mandels // An. Rep. Ferm. Proc.-1984.-V. 7.-P.1-20.

98. Rickard, P.A.D. Glycosidases of Cellulomonas. / P.A.D. Rickard ., J.A. Ide , M.I. Rajoka//Biotechnol. Lett.-1981.-V.3 (9).-P.487-492.

99. Robson, L.M. Cloning of the Bacillus subtilis DLG beta-1,4-glucanase gene and its expression in Escherichia coli and B. subtilis. / L.M. Robson, G.H. Chambliss // J. Bacteriol.-1986.-V.165(2).-P.612-619.

100. Rodriguez, H. Regulation of cellulolytic activity in Cellulomonas sp. Ilbc./ H. Rodriguez, F. Alea, E. Kyslikova. //Bioresource Technol.-1996.-V.55.-P.79-82.

101. Rodriguez, H. Regulation of xylanase activity in Cellulomonas sp. Ilbc. / H. Rodriguez, F. Alea // Acta Biotechnologica.-2004.-V.12(4).-P.337-343.

102. Rodriguez, H. The localization and activity of Cellulomonas xylanase on sugar cane bagasse pith. / H. Rodriguez, A. Enriquez, O. Volfova //Can. J. Microbiol.-1985.-V. 31.-P.754-756.

103. Rodriquez, H. Formation and localization of cellulases in Cellulomonas culture on bagasse. / H. Rodriquez, O. Volfova //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1984.-V.19.-P. 134-138.

104. Saddler, J. N. Regulation of cellulase synthesis in Acetivibrio cellnlolyticus. / J. N. Saddler, A.W. Khan, S.M. Martin // Microbios.-1980.-V.28.-P.97-106.

105. Sami, A.J. Production of free and substrate-bound cellulases of Cellulomonas flavigena. / A.J. Sami, M.W. Akhtar, N.N. Malik, B.A. Naz // Enzyme Microbiol. Technol.-l 988.-V. 10.-P.626- 631.

106. Sarkar, C. Utilization of bagasse by bacteria. / C. Sarkar, K.A. Prabhu // J. Fermentat. Technol.-1982.-V.60(4).-P.297-303.

107. Schell, M.A. Purification and characterization of an endoglucanase from Pseudomonas solanacearum. / M.A. Schell //Appl. Environ Microbiol.-1987.-V.53.-P.2237-2241.

108. Senior, D.G. Xylanase production by Trichoderma harzianum E58./ D. J. Senior, P. R. Mayers, J. N. Saddler // Appl. Microbiol. Biotechnol.-V.32.-137-142.

109. Sharma, A. Effects of aromatic compounds on hemicellulose-degrading enzymes in Aspergillus japonicus. / A. Sharma, O. Milstein, Y. Vered, J. Gressel, H.M. Flowers // Biotechnol. Bioeng.-1985.-V.27.-P.1095-1101.

110. Sharma, P. Limitation of congo-red staining techniques for the detection of cellulolytic activities. / P. Sharma, S. Pajni, N. Dhillon, D.V. Vadehra, D.K. Dube // Biotechnol. Lett.-1986.-V.8(8).-P.579-580.

111. Shepherd, M.G. Cellulases from Thermoascus aurantiacus. / M.G. Shepherd, A.L. Cole, C.C. Tong // Methods Enzymol.-1988.-V.160.-P.300-307.

112. Stewart, B.J. Derepressed synthesis of cellulase by Cellulomonas. / B.J. Stewart, J.M. Leatherwood//J. Bacteriol.-1976.-V.128(2).-P.609-615.

113. Stoppok, W. Formation, Location, and Regulation of Endo-l,4-P-Glucanases and 3-Glucosidases from Cellulomonas uda. / W. Stoppok, P. Rapp, F. Wagner //Appl. Environ Microbiol.-1982.-V.44(l).-P.44-53.

114. Tamada, M. Continuous cellulase production by immobilized Sporotrichum cellulophilum and continuous saccharification of bagasse. / M, Tamada, N. Kasai, I. Kaetsu//Biotechnol. Bioeng.- 1987.-V.29.-P.697-702.

115. Teeri, T.T. Crystalline cellulose degradation: new insight in to the function of cellobiohydrolases./ T.T. Teeri // Trends Biotechnol.-1997.-V.15.-P.160-167.

116. Tomme, P. Characterization of CenC, an enzyme from Cellulomonas jimi with both endo- and exoglucanase activities. / P. Tomme, E. Kwan, N.R. Gilkes, D.G. Kilbum, R.A.J. Warren//J. Bacteriol.-1996.-V.178(14).-P.4216-4223.

117. Trivedi, S.M. Saccharification of cellulosic wastes by high strength cellulase system of mix-shake cultivated Scytalidium lignicola and Trichoderma longibrachiatum. / S.M. Trivedi, R.M. Ray // J. Fermen. Technol.-1985.-V.63.-P.299-304.

118. Waldron, C.R. Isolation and characterization of a cellulolytic actinomycete Microbispora bispora. / C.R. Waldron, C.A. Becker-Vallone, D.E. Eveleigh // Appl. Microbiol. Biotechnol.-1986.-V.24.-P.477-486.

119. Waldron, Jr.C.R. Saccharification of cellulosics by Microbispora bispora. / Jr.C.R. Waldron,D.E. Eveleigh //Appl. Microbiol. Biotechnol.-1986.-V.24.-P.487-492.

120. Wilson, D.B. Cellulases of Thermomonospora fusca. / D.B. Wilson // Methods Enzymol.-1988.-V.160.-P.314-323.

121. Wilson, D. B. Genetics and properties of cellulases. / D. B. Wilson, D. C. Irwin // Adv. Biochem. Eng. Biotechnol.-1999.-V. 65.-P.1-21.

122. Whittle, D.J. Molecular cloning of a Cellulomonas fimi cellulase gene in Escherichia coli. / D.J. Whittle, D.G. Kilburn, R.A.J. Warren, R.C.Jr. Miller // Gene.-1982.-V.17.-P. 139-145.

123. Wood, T.M. Purification and some properties of the extracellular (P-D-glucosidase) of the cellulolytic fungus Trichoderma koningii. / T.M. Wood, S.I. McCrae // J. Gen. Microbiol.- 1982.-V.128.-P.2973-2982.

124. Wood, W. E. 1984. Cyclic AMP levels during induction and repression of cellulase biosynthesis in Thermomonospora curvata. / W. E. Wood, D. G. Neubauer, F. J. Stutzenberger//J. Bacteriol.-1984.-V.160.-P. 1047-1054.

125. Yasui, T. |3-xylosidase and (3-glucosidase of Chaetomium trilaterate. / T. Yasui, K. Matsuo //Methods Enzymol.-1988.-V.160.-P.696-700.

126. Yasui, T. Inducers for xylanase production by Cryptococcus flavus. / T. Yasui, B.T. Nguyen, K. Nakanishi // J. Ferment. Technol.-1984.-V.62.-P.353-359.

127. Yoshikawa, T. Biogenesis of multiple cellulase components of Pseudomonas fluorescens var. cellulose. Effects of culture conditions on the multiplicity of cellulose. / T. Yoshikawa, H. Suzuki, K. Nisizawa //J. Biochem.-1974.-V.3.-P.531-540.139